CN105949308A - 一种鳗鲡致病菌单链抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鳗鲡致病菌单链抗体及其应用，其括如SEQ ID NO 01所示的氨基酸序列。本发明的鳗鲡致病菌单链抗体的抑制率高，能提高鳗鲡机体体液和细胞免疫水平，免疫保护作用明显，大大降低了鳗鲡的死亡率，并能够通过人工被动免疫用于治疗鱼类疾病或应急预防。

Description

一种鳗鲡致病菌单链抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鳗鲡致病菌单链抗体及其应用。

背景技术

我国是水产养殖大国，水产品年总量约占世界总量的70％。由于环境的污染及水产养殖业本身的高密度、集约化生产，导致养殖病害时有发生，每年造成近百亿元的经济损失，其中细菌性疾病造成的危害和损失尤为严重。福建省是渔业大省，近年来全省渔业经济年总产值约1500亿元，在全国占有重要地位，主要的养殖鱼类大黄鱼、鳗鱼、鲆鱼等名贵经济鱼类，但由细菌性疾病造成的损失也尤为严重。目前，化学药物和抗生素是治疗鱼类细菌性疾病常用且较为有效的方法，但具有很多弊端，如导致药物和抗生素在水产品中的残留，病原生物耐药性增强剂水域生态污染等。因此在寻求病害防治的其它途径时，免疫防病技术已引起了人们的高度重视，也是世界各国公认的优先发展方向之一。

目前，免疫防治方法主要使用免疫增强剂以及接种疫苗的方法来提高水产动物的免疫力。其中鱼类免疫增强剂主要通过增强非特异免疫应答而发挥作用，如促进补体、溶菌酶、凝集素、α-巨球蛋白、巨噬细胞活化因子和干扰素的合成，活化巨噬细胞、嗜中性粒细胞、非特异性细胞毒性细胞的吞噬杀菌能力。接种疫苗能够有效激发鱼体特异性免疫应答，具有较好的免疫保护作用，是防治鱼类传染性疾病的有效措施，也是从根本上解决水产品化学药物残留以及病原耐药性的有效途径之一。近年来，国内外对鱼类疫苗的究取得了较大的进展。至2011年，针对二十多种不同的水产病原，一些国家和地区准发许可证的疫苗已超过100种，在鱼类病害的防治中发挥了极其重要的作用，大大减少了抗菌素等化学药物在养殖鱼类方面的使用量。根据现有疫苗的获得方法，用于免疫防治的鱼类疫苗可大致分为灭活疫苗、活疫苗和基因工程疫苗等。然而无论是免疫增强剂还是接种疫苗，均属于人工主动免疫，然而其过程时间较长，一般只适用于预防。而对于在养殖中爆发性的病害，以及对那些免疫系统尚未发育完全的幼苗，人工主动免疫适应性受到限制。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种鳗鲡致病菌单链抗体。

本发明的另一目的在于提供上述鳗鲡致病菌单链抗体的应用。

本发明的原理如下：

本发明的具体技术方案如下：

一种鳗鲡致病菌单链抗体，包括如SEQ ID NO 01所示的氨基酸序列。

一种编码上述鳗鲡致病菌单链抗体的基因序列，包括如SEQ ID NO 02所示的核苷酸序列。

一种表达上述鳗鲡致病菌单链抗体的质粒，为一负载包括SEQ ID NO 02所示的核苷酸序列的原核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述原核表达载体为pGEX-4T-2。

一种表达上述鳗鲡致病菌单链抗体的大肠杆菌，该大肠杆菌转化有上述原核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，该大肠杆菌为JM109。

进一步优选的，所述原核表达载体为pGEX-4T-2。

一种表达上述鳗鲡致病菌单链抗体的质粒，其特征在于：为一负载包括SEQ ID NO02所示的核苷酸序列的真核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述真核表达载体为pPIC9K。

一种表达上述鳗鲡致病菌单链抗体的毕赤酵母，该毕赤酵母转化有上述真核表达载体。

在本发明的一个优选实施方案中，该毕赤酵母为GS115。

进一步优选的，所述真核表达载体为pPIC9K。

本发明的有益效果是：本发明的鳗鲡致病菌单链抗体的抑制率高，能提高鳗鲡机体体液和细胞免疫水平，免疫保护作用明显，大大降低了鳗鲡的死亡率，并能够通过人工被动免疫用于治疗鱼类疾病或应急预防。

附图说明

图1为本发明实施例1中IgH抗体基因、IgL抗体基因和scFv基因PCR扩增产物的鉴定结果图。1-3：IgH基因PCR扩增产物；4-6：IgL基因PCR扩增产物；7-9：scFv基因PCR扩增产物。

图2为本发明实施例1中生物淘洗中噬菌体扩增图。

图3为本发明实施例1中特异性噬菌体抗体基因组电泳图。M为Marker，1-10号为筛选得到的抗体基因约750bp。

图4为本发明实施例1中5号噬菌斑重链与轻链氨基酸序列比对图。

图5为本发明实施例2中单链抗体OMP-Scfv扩增结果图。M：Marker；1：原核引物扩增产物约750bp；2：真核引物扩增产物约750bp。

图6为本发明实施例2中目的基因的双酶切结果图。M：Marker；1：双酶切原核表达目的基因OMP-Scfv产物约750bp：2：双酶切原核表达载体pGEX-4T-2产物约4900bp：3：双酶切真核表达目的基因OMP-Scfv产物约750bp：4：双酶切真核表达载体pPIC9K产物约为9300bp。

图7为本发明实施例2中重组质粒电泳检测结果图。M：Marker；1-1～9：重组质粒pGEX-4T-2-OMP-Scfv克隆子约750bp：2-1～9：重组质粒pPIC9K-OMP-Scfv克隆子约750bp。

图8为本发明实施例2中重组质粒pGEX-4T-2-OMP-Scfv蛋白表达检测图。M：蛋白Marker；1：pGEX-4T-2空载体诱导表达；2：重组质粒pGEX-4T-2-OMP-Scfv诱导表达。

图9为本发明实施例2中真核诱导表达第三天产物的SDS-PAGE结果图。M：Marker；1：空白对照，3-2～12为不同酵母阳性克隆子诱导表达产物，其中目的蛋白约27KD。

图10为本发明实施例2中酵母诱导表达产物的Western Blot检测分析M：Marker；1：空白对照；3-2～9为第三天时2至9号酵母阳性克隆子诱导表达产物，目的蛋白约27KD。

图11为本发明实施例3中淋巴细胞转化刺激指数检测结果图。*表示与对照组相比有显著性差异，**表示极显著差异；#表示与OMP组之间有显著性差异，##表示极显著差异。

图12为本发明实施例3中血清溶菌酶水平检测结果图。*表示与对照组相比有显著性差异，**表示极显著差异；#表示与OMP组之间有显著性差异，##表示极显著差异。

图13为本发明实施例3中血清抗体水平检测结果图。*表示与对照组相比有显著性差异，**表示极显著差异；#表示与OMP组之间有显著性差异，##表示极显著差异。

图14为本发明实施例3中鳗鲡免疫保护率的测定结果图。

图15为本发明实施例3中淋巴细胞转化刺激指数检测结果图。*表示与对照组相比有显著性差异，**表示极显著差异。

图16为本发明实施例3中血清溶菌酶水平检测结果图。*表示与对照组相比有显著性差异，**表示极显著差异。

图17为本发明实施例3中血清抗体水平检测结果图。*表示与对照组相比有显著性差异，**表示极显著差异

图18本发明实施例3中鳗鲡免疫保护率的测定结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1鳗鲡免疫球蛋白单链T7噬菌体抗体库的构建及抗重组外膜蛋白特性抗体的筛选及检测

利用RT-PCR和RACE等分子克隆方法对编码鳗鲡IgH和IgL的cDNA分别进行克隆与分析，并根据其重链、轻链可变区基因序列，扩增VH和VL抗体基因库，利用SOE PCR方法经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体(ScFv)基因库，进而与T7噬菌体载体连接，构建鳗鲡T7噬菌体抗体库。利用已经构建的T7-Scfv噬菌体抗体库对具有免疫交叉保护的嗜水气单胞菌重组外膜蛋白单链抗体进行筛选。抗体库经4轮淘洗后，得到的10株抗体噬菌斑，对噬菌斑进行ELISA阻断实验，从而得知抗体活性分别为68.2％、71.7％、77.7％、77.5％、81.7％、78.4％、77.7％、72.6％、72.8％、68.4％。对获取的10株有活性的抗体噬菌斑提取基因组后进行PCR和测序分析，最终选取抗体活性较高、同源性较好的特异性抗体基因命名为OMP-Scfv。

1.噬菌体抗体库的构建

1.1欧洲鳗鲡脾脏总RNA的提取及cDNA的合成

提取欧洲鳗鲡脾脏总RNA：

称取100mg欧洲鳗鲡脾脏组织，用液氮研磨成粉末状，加到含有1mL Trizol的无核酸酶离心管中；充分混匀后，于室温静置5min；4℃，12000g离心10min；吸出粉红色上清液于另一离心管中，然后加200μL氯仿，振荡混匀后，室温静置2-3min；4℃，12000g离心15min；取上清(无色水相层)于一新的离心管中，加500μL异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，4℃，12000g离心10min；弃上清，离心管底部及管壁上成凝胶状的沉淀用1mL 75％乙醇洗涤，4℃，7，500g离心5min；弃上清，沉淀于室温下晾干，加入75μL DEPC处理水溶解沉淀；用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用紫外分光光度计检测RNA溶液的浓度和纯度。

cDNA模板制备：

在0.5mL的PCR管中，加入3μg总RNA，1μL oligo(dT)，加无RNase水至5μL，混合均匀。70℃下，2min。冰上放置2min。往管中加入如下反应体系：2μL 5×RT buffer，1μL dNTPmix(10mM)，1μL DTT(20mM)，1μL MMLV逆转录酶(200U/μL)。混合均匀。42℃，90min。将cDNA第一条链溶解于无菌双蒸水中，72℃，7min，然后-20℃保存。

1.2欧洲鳗鲡重链轻链可变区的PCR扩增：

设计并合成鳗鲡重链可变区基因的简并引物(5'端引物：5'CCGGAATTCTGTTGAACTCACACAGCCAGGCTCTAT 3'(SEQ ID NO 08)；3'端引物：5'ACCCGAGCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCWGWRGWNACNGTGACTTTGGTCCCCT 3'(SEQ ID NO 09))和轻链可变区简并引物(5'端引物：5'TCGGGCGGTGGTGGCTCGGGTGGCGGCGGATCAGATGTAGTTTTGACCCAGTCTCCGT 3'(SEQ ID NO10)；3'端引物：5'CCCAAGCTTTCCAACTGACAGTTTTGTGCCG 3'(SEQ ID NO 11))。以cDNA为模板，分别扩增IgH抗体基因和IgL抗体基因。在25μL反应体系中，加入以下PCR反应组分(表1)。

表1PCR分组反应

混合均匀后，在热循环仪上按照下列程序进行PCR反应：

IgH反应条件为：①94℃变性4min；

②4个循环：94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸1min；

③4个循环：94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min；

④30个循环94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min；

⑤72℃延伸10min；

⑥4℃10min停止。

IgL反应条件为：①94℃预变性2min；

②38个循环：94℃变性30s，50.3℃退火30s，72℃延伸1min；

③72℃延伸10min；

④4℃10min停止。

PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，使用胶回收试剂盒对特异扩增条带进行纯化。

1.3欧洲鳗鲡重链轻链ScFv单链抗体基因库的构建

在25μL反应体系中，取提纯的IgH抗体基因52ng IgL抗体基因50ng作为模板(已知IgH抗体基因片段长度406bp，IgL抗体基因片段长度390bp)，含H₂O，2μL dNTP，0.4μL Ps酶，5μL 5×Ps-Hs Buffer，总体积为25μL，混匀后进入拼接循环。使IgH和IgL基因通过编码连接肽(Gly4 Se r)3连接。

反应条件为:①94℃预变性2min；

②7个循环：94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min；

③72℃延伸10min；

④4℃5min停止

在上述反应体系中，补加IgH 5′端引物和IgL3′端引物各1μL，再次PCR扩增。

反应条件为:①94℃预变性2min；

②38个循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；

③72℃延伸10min；

④4℃10min停止

使用胶回收试剂盒，对SOE PCR扩增的scFv基因库进行胶纯化回收。

1.4欧洲鳗鲡T7噬菌体抗体库的构建

ScFv基因库EcoRI和Hind III双酶切

在40μl反应体系中，用30units EcoRI和Hind III对ScFv基因进行双酶切，使用胶回收试剂盒回收酶切产物，重溶于10μl水中。

重组子T7select10-3b/ScFv的连接

将EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的ScFv基因与EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的T7Select10-3噬菌体载体的2个臂按1∶4的摩尔数比混合,T4DNA连接酶16℃连接4h。

T7噬菌体抗体库的体外包装

连接反应产物5μL与T7噬菌体包装提取物25μL混合，室温包装2h，加入270μL LB液体培养基，终止反应，建立T7噬菌体原始抗体库，取少量噬菌体稀释，铺板测定包装效率。随机选取10个噬斑,接种于宿主菌BLT5403，增殖后提取DNA,加VH 5′端引物和VL 3′端引物，PCR扩增scFv基因，计算scFv基因插入率。将宿主菌BLT5403接种于3mL含Amp的M9TB液体培养基中,37℃180r/min摇床培养，至OD值约为0.8，接种包装产物，继续培养至发生溶菌，加入5mol/L NaCl并10000g离心10min去杂质,加入50％PEG 8000并10000g离心10min沉淀噬菌体,LB液体培养基重悬沉淀,取少量噬菌体稀释，铺板测定抗体库的滴度。

2.噬菌体抗体库的筛选

将纯化后的外膜蛋白OMP作为抗原，对其进行包被。对抗原OMP用碳酸盐包被液稀释至50μg/ml，取100μl加入酶标板空，37℃孵育1h后4℃包被18-24h，即对抗原包被完成。第二天对包被产物进行生物淘洗，步骤如下：

1)弃孔中溶液，每孔加入250μl PBS-T洗板3次，2min/次，将酶标板倒扣于干净吸水纸以吸干液体；

2)每孔加入200μl封闭液(1％BSA，PBS配制)，37℃静置1h，弃孔中溶液后重复步骤1；

3)加入10μl鳗鲡T7-Scfv文库噬菌体液和90μl TBS-T，混匀后室温静置50min；

4)弃孔中溶液后，用PBS-T洗板5次，2min/次；

5)将T7 Elution Buffer每孔200μl加入孔中，常温反应20min；

6)将孔中溶液取出移入1.5ml离心管，向管中加入15μl Kcl饱和溶液，混匀平衡8000rpm离心3min，取上清(T7-Scfv噬菌体液)；

7)取30μl上清液和剩余上清分别进行噬菌体扩增(方法参加3.1.2.1)；

8)培养结束后向培养皿中加入T7 Extraction Buffer，使其刚刚覆盖噬菌体表层，约3ml/皿，4℃浸提过夜；

9)回收浸提液，每管加入1/5体积的氯仿，混匀平衡后，离心，上清液即为淘洗阳性克隆种子，加入甘油(使其终浓度为8％的)，-80℃保存。

10)重复上述淘洗过程3-5次，直至步骤7中的噬菌斑个数为个位数。此时将噬菌斑单个分离在离心管中。将筛选得到的特异性噬菌体抗体命名为T7-OMP。

3.特异性噬菌体抗体活性检测

通过ELISA阻断实验检测免疫球蛋白单链抗体噬菌体库T7-OMP的抗体活性。具体操作步骤如下：

1)将OMP作为抗原进行包被，封闭及洗涤步骤同上；

2)实验孔中加入T7-OMP噬菌体(阻断)稀释液，阴性对照孔和空白对照孔中加入等量培养基，37℃作用1h；

3)弃孔中溶液，每孔加入250μl PBS-T洗板3次，2min/次，将酶标板倒扣于干净吸水纸以吸干液体；

4)向试验孔和空白对照孔中加入1OOμl l:1000稀释的兔抗IgM血清，阴性对照孔中加入未经免疫的兔血清，37℃作用1h。重复(3)；

5)每孔加入山羊抗免(l:6000)IgG 100μl，37℃作用1h。重复(3)；

6)将OPD底物溶液每孔100μl加入其中，显色8min；

7)将50μl终止液加入孔中，混匀。立即用酶标仪测定A₄₅₀值。

8)抑制率按下列公式计算出：抑制率(％)＝[1-(试验孔A_450-阴性对照A₄₅₀)/(对照孔A_450-阴性对照A₄₅₀)]x100％。

4.特异性噬菌体抗体编码基因序列克隆与分析

将淘洗得到的具有抗体活性的噬菌斑进行分离后，取10μl噬菌体转移至含100μl10mM EDTA(pH8.0)的1.5ml离心管中，用枪头上下吹打使其散开，置于漩涡震荡仪上混匀，65℃水浴裂解10min，将离心管平衡后，室温14000rpm高速离心3min，用移液枪吸取上清，即为噬菌体DNA，命名为OMP-Scfv。

参照pGEX-4T-2作为表达型载体多酶切位点序列，设计带有酶切位点的单链抗体Scfv的PCR扩增上下游引物如下：

F1(SEQ ID NO 03：5'GGAATTCCCGTTGAACTCACACAGCCAGGCTCTAT3')，

R1(SEQ ID NO 04：

5'CGATGCGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCCAACTGACAGTTTTGTGCCG3')以OMP-Scfv基因片段为扩增模板，以F1、R1为扩增引物，进行PCR，PCR反应程序如下：94℃ 4min；(94℃30s，58℃ 30s，72℃ 1min)30个循环；72℃ 10min，4℃ 5min。通过1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，拍照后用Promega胶回收试剂盒对目的条带进行回收。将电泳检测符合目的条带大小的PCR产物送到上海生工进行测序，将返回的序列进行序列分析。

5.结果与讨论

5.1 IgH抗体基因、IgL抗体基因及scFv基因PCR扩增产物的鉴定

以cDNA第一链为模板，扩增IgH抗体基因和IgL抗体基因，两者分子大小约为400bp，与理论估计值大小一致。scFv基因，分子大小约为700 bp，与理论估计值大小一致(如图1所示)。

5.2鳗鲡噬菌体抗体库生物淘洗结果

以嗜水气单胞菌外膜蛋白OMP(氨基酸序列如SEQ ID NO 05所示)作为抗原，对T7-Scfv噬菌体抗体库进行筛选，图2为淘洗中噬菌体扩增图，通过淘洗，筛选的特异性T7-Scfv抗体噬菌斑不断减少，最后挑取10株噬菌斑进行免疫活性分析。

5.3鳗鲡特异性噬菌体抗体活性检测

对10株筛选的特异性噬菌体抗体T7-Scfv通过ELISA阻断实验进行抗体活性检测，用酶标仪测A450值，阳性对照孔A450为0.544，阴性对照孔吸光值A450为0.095,1-10号十株特异性噬菌体抗体A450值分别为0.238、0.222、0.195、0.196、0.177、0.192、0.195、0.218、0.217、0.237。通过公式：抑制率(％)＝[1-(试验孔A450-阴性对照A450)/(对照孔A450-阴性对照A450)]x1O0％，分别计算10株特异性噬菌体抗体的抑制率，分别为：68.2％、71.7％、77.7％、77.5％、81.7％、78.4％、77.7％、72.6％、72.8％、68.4％。

5.4特异性噬菌体抗体基因克隆及其序列分析

使用噬菌体基因组提取试剂盒将淘洗得到的10株特异性噬菌体抗体的基因组进行提取，通过PCR检测与1％凝胶电泳得到如图3的结果，目的条带T7-Scfv的大小约约750bp，图中目的条带大小尽管出现差异，但条带都在750bp上下，将图中750bp上下的目的条带进行回收后，与T载体连接，送上海生工生物有限公司进行测序。将10株筛选得到的抗体基因进行测序，其中1号、3号、5号、6号和9号抗体能够测出序列并能正确翻译成氨基酸，其他5株不能正常翻译，其中5号与重链和轻链的同源性分别为76％和85％(图4)命名为OMP-Scfv。

实施例2特异性抗外膜蛋白单链抗体的原核表达及真核表达

将筛选得到的特异性抗体基因OMP-Scfv作为克隆模板，对其进行原核表达和真核表达。选取pGEX-4T-2作为原核表达载体，根据目的基因和表达载体质粒图谱选取ECORⅠ与NOTⅠ为酶切位点，引物设计时在3’端目的基因与酶切位点之间加入HIS标签，以备后续的纯化实验，组建重组载体pGEX-4T-2-OMP后将测序争取的菌体使用IPTG作为诱导剂进行诱导表达，将以包涵体存在的表达蛋白使用离心型Ni亲和层析柱进行纯化，使用梯度浓度的尿素-PBS溶液进行复性后冻干备用。构建单链抗体pPIC9K酵母表达质粒，通过线性化后电击转入酵母细胞，使用终浓度为0.5％的甲醇进行诱导表达。

1.OMP-Scfv单链抗体基因的原核表达

根据实施例1筛选获得的特异性抗体OMP-Scfv基因序列，以pGEX-4T-2为表达载体，构建pGEX-4T-2-Scfv表达载体，在大肠杆菌进行原核表达与及纯化，获得的重组蛋白-20℃冰箱保存。

2.单链抗体基因真核表达载体的构建

实验选取穿梭质粒pPIC9K作为真核表达载体，根据实施例1获得的OMP-Scfv序列及pPIC9K质粒图谱，选取ECOR Ⅰ与NOT Ⅰ作为酶切位点，设计上、下游引物为F2(SEQ ID NO06)与R2(SEQ ID NO 07)。

F2(5'GTAGAATTCAAAAGAGTTGAACTCACACAGCCAGGCTCTAT3')

R2(5'ATTCGCGGCCGCATGGTGATGGTGATGATGTCCAACTGACAGTTTTGTGCCG3')

对单链抗体OMP-Scfv进行PCR扩增，与T载体的链接，转化大肠杆菌JM109，与真核表达载体pPIC9K进行链接，再将其转化大肠杆菌JM109进行菌落PCR和测序，将测序正确的菌株扩大培养后使用试剂盒提取重组载体pPIC9K-OMP-Scfv的质粒备用。

3.重组质粒pPIC9K-OMP-Scfv的电转化及检测

使用OMEGA质粒提取试剂盒提取pPIC9K空载体质粒及重组载体

pPIC9K-OMP-Scfv的质粒，测浓度后，采用SacⅠ快切酶分别对pPIC9K质粒和pPIC9K-OMP-Scfv质粒进行线性化单酶切。pPIC9K质粒反应体系(40μl)如下：4μl 10×FastBuffer；2μl Sac Ⅰ；24μl DNA(样品含量为10μg)；10μl无菌水。混匀后于PCR仪中进行扩增，扩增条件为：37℃ 40min；80℃ 20min；20℃ 5min。反应结束后进行1％琼脂糖电泳检测，将线性化了的条带进行胶回收，测浓度后-20℃保存。

制备毕赤酵母GS115的感受态细胞，具体步骤如下：

1)取出实验室保重的毕赤酵母GS115冰上溶解，使用灭菌接种环将融化的GS115划线于YPD固体培养基平板，培养箱中29℃过夜培养；

2)将准备好的装YPD液体培养基的管中加入单菌落，29℃230rpm摇床过夜培养；

3)次日，按1:100比例对GS115菌液继续培养，直至OD₆₀₀达到1.0-1.3；

4)将培养液平衡后，4℃ 5000rpm高速离心5min，倒掉上清液；

5)适量无菌水重悬细胞后，重复步骤4两次；

6)将1M山梨醇从向沉淀中加入20ml预冷的，重悬细胞后相同条件离心，弃上清；

7)加入200μl预冷的1M山梨醇重悬细胞，冰上备用。

取20ul线性化的pPIC9K质粒和pPIC9K-OMP-Scfv质粒分别加入80ul GS115感受态细胞中，轻轻混匀，移入0.2ml 4℃的预冷电转杯，冰上静置5min，擦干表边水后，放入BIO-RAD电转仪，选取毕赤酵母转化(参数为：1.5kV，5.8ms)，电击结束立即加入从4℃冰箱取出的1M的山梨醇0.5ml，轻轻混匀后转移到无菌离心管中，30℃静置1h，将溶液分200μl和400μl全部涂布于MD平板。30℃，培养2-3d，直至菌体长出。

酵母基因组提取试剂盒购自捷瑞，提取重组质粒pPIC9K-OMP-Scfv基因组，操作步骤如下：

1)取酵母菌液3ml于离心机上室温8000rpm高速离心1min，倒掉上清；

2)每管加0.2ml Lysis Y buffer，5μl Lyticase，混匀后30℃静置30min，8000rpm离心5min，弃上清；

3)每管加200μl TE溶液将沉淀混匀，依次加入Digestion Solution 300μl混匀，RNase A 4μl吹打混匀，55℃静置10min后加入4μl Proteinase K，55℃静置15min；

4)每管依次加入0.3ml Ext和0.3ml PB,充分混匀后12000rpm离心5min，此时溶液分层，DNA存在于底层溶液，用蓝枪头将底层溶液转移至安放好的GenClean中；

5)平衡后，8000rpm离心1min，弃废液；

6)每管加入Wash Solution 0.5ml，室温8000rpm高速离心1min，弃溶液；

7)重复步骤6一次；

8)将其置于离心机中室温12000rpm高速离心1min，将Wash Solution彻底除去；

9)将GenClean安置于无菌1.5ml离心管中，加入Elution Buffer(60℃水浴预热)50μl，37℃放置2min；

10)12000rpm离心1min，此时重组质粒pPIC9K-OMP-Scfv的基因组DNA已在离心管中，测浓度后标记保存于-20℃冰箱。

以F1、R1为引物，以提取的转化质粒为模板，通过PCR反应检测转化效果。PCR产物通过1％琼脂糖电泳进行检测。

4.毕赤酵母的表达及检测

挑取pPIC9K单菌落和重组质粒pPIC9K-OMP-Scfv单菌落分别接种于BMGY培养基中，培养箱中28℃ 230rpm扩大培养，直至OD₆₀₀为2.0-6.0；菌液平衡后，2000g离心5min，弃上清；将等量BMMY溶液重悬菌体，28℃ 230rpm诱导表达96h；每24h取去2ml菌液，同时补加终浓度为1％的甲醇。

使用上海生工的TCA沉淀试剂盒对蛋白样品进行浓缩，操作步骤如下：

1)将菌液2000g离心5min，取上清，即为蛋白质溶液；

2)取100μl蛋白质溶液，加入试剂一300μl，震荡混匀，4℃冰箱静置15min；

3)加入沉淀试剂二300μl，充分混匀后，4℃冰箱静置15min；

4)平衡后4℃15000rpm高速离心5min，此时底部形成蛋白质沉淀块；

5)离心结束后立即用枪头去除上清，并将离心管倒扣于滤纸上去除上清；

6)加入200μl PBS溶液溶解沉淀，标记保存。

首先将待测样品按照2.1.2.10中SDS-PAGE的方法进行检测，使用银染的方法对蛋白胶进行染色，银染操作步骤如下：

1)将蛋白胶出去后置于50ml固定液中，置于振荡器上2h；

2)弃固定液后加入50ml 35％的乙醇，振荡器上漂洗3次，每次20min，弃溶液；

3)将蛋白胶置于50ml敏化液中2.5min进行敏华，弃溶液；

4)加入50ml双蒸水进行漂洗，每次5min，振荡器上进行；

5)加入50ml银染色，振荡器上银染20min；

6)银染结束后用双蒸水漂洗两次，每次10s；

7)将蛋白胶置于50ml显色液中，约3min后显色清楚；

8)弃显色液后加入50ml终止液，振荡器上终止15min；

9)终止结束后将蛋白胶置于50ml双蒸水中漂洗，每次5分钟，振荡器上进行；

10)拍照保存。

将表达产物进行Western Blot检测，具体步骤如下：

1)使用欲染Marker进行SDS-PAGE蛋白电泳；

2)将滤纸折叠后，剪取与蛋白胶相同大小的干净滤纸8张，剪取同样大小的PVDF膜一张(PVDF膜用镊子夹，不能与手接触)，将PVDF膜于甲醇中2min，电转移缓冲液中浸泡5min；

3)将滤纸、PVDF膜与蛋白胶以“三明治”结构进行排列，置于BIO-RAD电转印仪中，从下至上依次为：4层滤纸、PVDF膜、蛋白胶、4层滤纸，将滤纸用电转移缓冲液浸湿，且中间不能有气泡产生；

4)设置参数(2.5A，25V，10min)，进行转染；

5)取出PVDF膜，此时膜上清晰出现Marker条带，将PVDF膜置于BSA封闭液中，37℃震荡1h；

6)加入PBST洗涤3次，每次5分钟，振荡器上进行；

7)加入一抗稀释液，37℃震荡1h，重复步骤6；

8)加入羊抗兔稀释液，37℃震荡1h，PBST振荡洗涤5次，每次5分钟；

9)每10ml DAB溶液中加入10μl 30％的H₂O₂，混匀后加入PVDF膜中，当抗原区呈现明显的褐色时终止反应，加入双蒸水进行洗涤，拍照。

5.结果与讨论

5.1单链抗体基因OMP-Scfv的扩增

将分析得出的特异性抗体OMP-Scfv分别使用以pGEX-4T-2为表达载体的原核扩增引物F1、R1与以pPIC9K为表达载体的真核扩增引物F2、R2对其进行扩增，扩增产物的条带如图5所示。

5.2重组载体的构建

将目的基因OMP-Scfv与原核表达载体pGEX-4T-2通过ECORⅠ与NOTⅠ快切酶同时进行双酶切，将目的基因OMP-Scfv与真核表达载体pPIC9K通过ECORⅠ与NOTⅠ快切酶同时进行双酶切，酶切电泳结果如图6所示：目的基因OMP-Scfv的条带大小约为750bp，原核表达载体pGEX-4T-2的条带大小约为4900bp，真核表达载体pPIC9K的条带大小约为9300bp。将相应的目的条带割胶回收后进行连接。

将重组质粒样品进行测序，由测序结果可知重组质粒pGEX-4T-2-OMP-Scfv与重组质粒pPIC9K-OMP-Scfv的序列重合，目的片段长均为735bp(如SEQ ID NO 02所示)，编码245个氨基酸(如SEQ ID NO 01所示)，预测目的蛋白分子量为25KD，等电点为8.57。由于载体pGEX-4T-2中包含GST标签，其分子量为26KD，设计引物时为便于纯化在下游引物处加入六个his，计算得出重组质粒pGEX-4T-2-OMP-Scfv的蛋白分子量约为53KD。

将测序正确的重组质粒pGEX-4T-2-OMP-Scfv与pPIC9K-OMP-Scfv转化进入表达菌株E.coli BL21，通过1％凝胶电泳检测得到如图7。目的条带都在750bp附近，与理论值相符。

5.3单链抗体基因OMP-Scfv的原核表达

将重组质粒pGEX-4T-2-OMP-Scfv转化进入表达菌株BL21后，将电泳检测条带大小正确的菌株进行诱导表达，使用终浓度为1mM的IPTG对重组质粒诱导5小时后，进行SDS-PAGE电泳检测，结果分析表明在53KD左右有明显的蛋白条带，与预测蛋白分子量大小一致，即蛋白成功表达(图8)。

5.4单链抗体基因OMP-Scfv的真核表达

将重组质粒点击转化进入毕赤酵母后，用终浓度为0.5％的甲醇进行诱导表达，分别对第三天的诱导产物进行SDS-PAGE电泳检测，发现在27KD处有明显的蛋白条带，与预期分子量相符(如图9所示)。经Western Blot检测表明27KD的蛋白条带为新增诱导表达的单链抗体基因OMP-Scfv表达产物(如图10所示)。

实施例3注射单链抗体和重组外膜蛋白对鳗鲡免疫保护作用

1.材料与方法

1.1实验动物

将购买的1000尾欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)，体重50g左右，分为6组，每组150尾并养殖于水产学院养殖试验场，其中100尾用于检测攻毒后免疫保护效果，其余用于各项免疫指标水平测定，水温23-28℃，保持氧气充足，每天按时喂养和清除排泄物，暂养1周。

1.2菌株培养

将实验室保种的嗜水气单胞菌(B11，表达重组外模蛋白OMP，其氨基酸序列如SEQID NO 05所示)接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，28℃过夜培养；次日，挑取单菌落加入到TSB胰蛋白胨大豆肉汤中，28℃230rpm继续培养；培养结束后将培养液4℃ 5000rpm高速离心5min，倒掉上清；用0.01M的PBS(pH＝7.4)以同样条件洗涤2次，菌体溶解于PBS中；调节溶液使其OD595nm＝0.5，此时菌落数为5.0×10⁸cfu/ml；将菌液中加入终浓度为0.4％的甲醛溶液(灭火菌体)，混匀，4℃静置24h；将灭火菌体取少量涂布于TSA平板，28℃培养24h-48h，无菌落生长时即为灭活菌液；将灭火菌液同样条件用PBS洗3次，重新调节OD，使菌落数为5.0×10⁸cfu/ml，，此时为B11灭活菌液，4℃保存备用(不可长时间放置)。

1.3鳗鲡免疫注射

将已冻干的大肠杆菌表达纯化的单链抗体Scfv蛋白样品粉末溶解于0.01M的PBS(pH＝7.4)溶液中，使蛋白终浓度为2mg/ml；将酵母菌表达的Scfv蛋白样品经50％的饱和硫酸铵沉淀后，0.01M的PBS(pH＝7.4)透析后使蛋白终浓度为2mg/ml；将已冻干的纯化蛋白样品OMP粉末溶解于0.01M的PBS(pH＝7.4)溶液中，使蛋白终浓度为2mg/ml；另取0.01M的PBS(pH＝7.4)和B11灭活菌液分别作为阴性对照和阳性对照。鳗鲡免疫注射前24h停止投喂食物，注射前加入适量丁香酚麻醉鱼体，注射时使用1ml注射器，每尾鳗鲡注射样品0.2ml，注射结束后立即将鳗鲡放入养殖池。

1.4免疫指标测定

1.4.1血细胞和血清的采集

鳗鲡免疫注射后，外膜蛋白注射组和B11灭活组分别在免疫后的14d、21d、28d、42d时丁香酚麻醉后采样，而酵母菌重组表达的单链抗体和大肠杆菌表达的单链抗体分别在免疫后的第7d采样，每组分别采集8尾鳗鲡样品，采集的样品包血细胞和血清。采用断尾取血，滴一滴鳗鲡血入装有0.5ml RPMI 1640细胞培养液、5μl肝素钠和1滴鳗鲡血的1.5ml离心管消毒后带入细胞培养房进行处理。离心管平衡后4℃ 3000rpm高速离心10min，倒掉上清；加入0.5ml细胞培养液RPMI 1640相同条件润洗2遍后弃上清，从底部血细胞中吸取7μl入装有250μl RPMI 1640细胞培养液的1.5ml离心管中，标记保存于4℃冰箱备用。剩余的鳗鲡血液滴入1.5ml无菌离心管中，室温倾斜放置3h后，4℃过夜静置。将4℃静置过夜的血液轻轻取出后，4℃ 10000rpm高速离心5min，用移液枪吸取绿色上清入新的1.5ml无菌离心管中，标记保存于-80℃冰箱。

1.4.1血清溶菌酶活性测定

使用南京建成公司的溶菌酶检测试剂盒检测血清、粘液、肝脏和肾脏中溶菌酶含量，检测方法按照本课题组郭松林老师改良后的方法进行，改良后的检测方法适用于大批量检测。具体操作方法如下：首先，将应用菌液、标准品应用液和待测样品32℃水浴10min；之后，将标准品应用液和待测样品(各两个平行)加入酶标板中，每孔加入10μl；最后，设置酶标仪程序，准备测量30s和4m30s时530nm处的吸光值，用排枪加入100μl应用菌液后立即测量30s和4m30s时OD530nm值。根据公式计算溶菌酶浓度，计算公式为：样品溶菌酶浓度(U/ml)＝(样品孔OD4m30s－样品孔OD30s)/(标准品应用液孔OD4m30s－标准品应用液孔OD30s)×标准品应用液浓度(200U/ml)。

1.4.1血清抗体水平测定

使用间接ELISA法对血清的抗体效价进行测定，步骤如下：

测定PBS对照组和B11灭活免疫组中血清效价时，将嗜水气单胞菌B11用包被稀释液稀释为1.0×10⁸cfu/ml，100μl/孔加入酶标板，45℃过夜包被，直至菌液干燥；测定外膜蛋白OMP组血清效价时，将OMP蛋白粉末用包被稀释液稀释为100μg/ml，100μl/孔加入酶标板，30℃1h后，4℃过夜包被；

空白对照孔加入100μl包被稀释液进行包被；

加入PBST洗板3次，每次洗板5min，每孔加入200μl；

将封闭液(1％BSA/PBST)每孔200μl加入板中，37℃培养箱静置2h，将溶液倒掉后，重复步骤②；

一抗：使用PBS将待测鳗鲡血清2-5-2-11倍比稀释，每个样品两个平行，100μl/孔，空白对照和阴性对照均加入包被液，30℃孵育1h后，重复步骤②；

二抗：将实验室保存的兔抗鳗鲡IgM(1:2000)取出后，用PBS进行稀释，每孔100μl加入到空白对照和阴性对照和待测样品中，30℃孵育1h后，重复步骤②；

三抗：将购买的羊抗兔酶标抗体(1：8000)取出后，用PBS进行稀释，每孔加入100μl，PBST洗板4次，5min/次；

显色：每孔加入50μl OPD底物溶液(临用前加入30％的H2O2)，显色7-10min(阴性对照孔变为淡黄色时终止显色)；

终止：每孔加入2M的浓H2SO4 50μl终止显色；

终止后立即在酶标仪上检测OD492nm值，通过公示(样品OD492nm-空白对照OD492nm)/(阴性对照OD492nm-空白对照OD492nm)得出的最大比值(比值≥2时有效)所对应的稀释倍数即为抗体效价。酵母表达抗体以及大肠杆菌表达抗体水平测定是以50倍鳗鲡免疫血清进行包被，其他方法同上。

1.4.1血细胞淋巴转化水平测定

取2.58ml RPMI 1640细胞培养液，加入0.3ml含灭活补体的鳗鲡血清，使其含量为10％，加入终浓度为20μg/ml的ConA，每孔50μl加到细胞培养板中。同时，取2.7ml RPMI1640细胞培养液，加入0.3ml含灭活补体的鳗鲡血清，使其含量为10％。细胞培养板每孔加入50μl。之后，在加入两种培养基的空中分别加入50μl血细胞，每个样品两个重复，合计每孔100μl。将细胞培养板封闭后置于25℃培养48h，之后，每孔加入5mg/ml的MTT 15μl，将细胞培养板封闭后置于25℃生化培养箱中继续培养4h。培养结束后将细胞培养板平衡后1000rpm离心10min，超净工作台上用灭菌纸巾吸干上清后(不要吸出沉淀)，每孔加入200μlDMSO，用枪头充分混匀后(颗粒完全溶解且无气泡产生)，酶标仪上测定OD570nm值。据公式计SI值＝(某一样品加ConA后OD570nm平均值/同一样品不加ConA OD570nm平均值)-1技算样品全血细胞刺激指数(SI)值。

1.4.1免疫保护率的测定

从冰箱取出-80℃冰箱保存的嗜水气单胞菌划线后，挑取单菌落扩大培养后4℃5000rpm离心5min，弃上清，用PBS以相同条件洗涤两次后，将菌体溶解在PBS中，调节溶液浓度使OD595nm＝0.4即使菌落数为4×10⁸cfu/ml。外膜蛋白注射组和B11灭活组在免疫28d后进行嗜水气单胞菌B11活菌攻毒，而酵母和大肠杆菌表达的单链抗体分别在免疫7d后进行嗜水气单胞菌B11活菌攻毒。攻毒后分缸饲养，每天正常投喂及洗污，记录攻毒后14d内的鳗鲡死亡情况，根据公式(相对免疫保护率＝(1-免疫组死亡率/空白组死亡率)×100％)得出相应的免疫保护率。

2.结果与讨论

2.1原核表达重组蛋白OMP的免疫指标检测

2.1.1淋巴细胞转化水平检测

OMP组细胞刺激指数在免疫后不断上升，在21d时达到峰值。OMP组的刺激指数在14d时显著(P＜0.05)高于B11组和PBS组，OMP组细胞刺激指数在14d、21d和42d显著(P＜0.05)高于灭活组。除28d外，B11组与PBS组无显著差异(P＞0.05)(如图11所示)，表明OMP和B11灭活菌体均能提升鳗鲡细胞免疫应答水平。

2.1.2血清溶菌酶水平检测

OMP组和B11菌注射组血清溶菌酶活性均在21d时显著升高并达到峰值，与对照组有极显著差异(P＜0.01)。而且B11菌注射组在28d和42d的血清溶菌酶活性均高于对照组和OMP组(P＜0.01)(图12)，表明OMP和B11灭活菌体均能提升鳗鲡非特异性免疫应答水平。

2.1.3血清抗体水平检测

OMP组在免疫注射后表达水平持续上升，于28d达到峰值，42d也有较高的表达水平，与对照组相比均有显著性差异。B11菌注射后在14d、21d、28d以及42d均与对照组有显著差异(图13)，表明OMP和B11灭活菌体均能诱导鳗鲡产生特异性免疫应答反应。

2.2原核表达重组蛋白OMP的免疫保护率测定

嗜水气单胞菌B11攻毒后，PBS组、B11组和OMP组的存活率分别为11％、44％和67％，OMP组的免疫保护率为62.5％，B11的免疫保护率为37.5％，表明重组蛋白具有较好的免疫原性，具有较好的免疫保护作用(图14)。

2.3单链抗体基因原核表达和真核表达产物的免疫指标检测

2.3.1淋巴细胞转化水平检测

鳗鲡免疫后第7d后，与对照组相比原核单链抗体和酵母单链抗体的血细胞刺激指数均高于对照组水平，并且酵母单链抗体组要极显著高于对照组(P＜0.01)(图15)，表明单链抗体均能诱导鳗鲡血淋巴细胞的增殖与分化，提升细胞免疫水平。

2.3.2血清溶菌酶水平检测

鳗鲡免疫后第7d后，与对照组相比原核单链抗体和酵母单链抗体的溶菌酶活性均高于对照组水平，并且酵母单链抗体组要极显著高于对照组(P＜0.01)(图16)，表明单链抗体均能提升鳗鲡非特异性免疫应答水平。

2.3.3血清抗体水平检测

鳗鲡免疫后第7d后，与对照组相比原核单链抗体和酵母单链抗体的抗体水平有所升高，但未到达显著差异水平(P>0.05)(图17)，表明单链抗体能提升鳗鲡特异性免疫应答水平。

2.4单链抗体基因原核表达和真核表达产物的免疫保护率测定

嗜水气单胞菌B11攻毒后，PBS组、原核单链抗体和酵母单链抗体的存活率分别为21％、32％和57％，原核单链抗体的免疫保护率为13.9％，酵母单链抗体的免疫保护率为45.5％(图18)，结果表明酵母单链抗体具有一定的免疫保护作用，而原核单链抗体的免疫保护作用不大。

小结：

酵母表达的单链抗体、原核表达的单链抗体以及重组表达的外膜蛋白均能提高鳗鲡机体体液和细胞免疫水平，其中酵母单链抗体和重组外膜蛋白注射后对鳗鲡保护作用比较明显，免疫保护率为分别为45.5％和62.5％，而原核表达的单链抗体免疫保护作用较小。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种鳗鲡致病菌单链抗体，其特征在于：包括如SEQ ID NO 01所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述的鳗鲡致病菌单链抗体的基因序列，其特征在于：包括如SEQ ID NO 02所示的核苷酸序列。

3.一种表达权利要求1所述的鳗鲡致病菌单链抗体的质粒，其特征在于：为一负载包括SEQ ID NO 02所示的核苷酸序列的原核表达载体。

4.一种表达权利要求1所述的鳗鲡致病菌单链抗体的大肠杆菌，其特征在于：该大肠杆菌转化有权利要求3所述的原核表达载体。

5.如权利要求4所述的大肠杆菌，其特征在于：所述原核表达载体为pGEX-4T-2。

6.一种表达权利要求1所述的鳗鲡致病菌单链抗体的质粒，其特征在于：为一负载包括SEQ ID NO 02所示的核苷酸序列的真核表达载体。

7.如权利要求6所述的质粒，其特征在于：所述真核表达载体为pPIC9K。

8.一种表达权利要求1所述的鳗鲡致病菌单链抗体的毕赤酵母，其特征在于：该毕赤酵母转化有权利要求8所述的真核表达载体。

9.如权利要求8所述的毕赤酵母，其特征在于：该毕赤酵母为GS115。

10.如权利要求8或9所述的大肠杆菌，其特征在于：所述真核表达载体为pPIC9K。