CN106659799A - 用于制备针对因肠致病性细菌引起的感染的广谱疫苗的包含表达内置的多个表位的分子构建体的基本单元的糖缀合物疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表达内置的多个表位的新的糖缀合物抗原和旨在用于保护哺乳动物的多价糖缀合物疫苗，特别是用于保护人类群体免受肠致病性细菌的影响和/或免受因人诺如病毒引起的病毒胃肠道感染的影响，所述肠致病性细菌为例如革兰氏阳性厌氧细菌艰难梭菌和革兰氏阴性细菌伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、弗氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、铜绿假单胞菌。

Description

用于制备针对因肠致病性细菌引起的感染的广谱疫苗的包含 表达内置的多个表位的分子构建体的基本单元的糖缀合物 疫苗
本发明涉及表达内置的多个表位的新的糖缀合物抗原和旨在用于保护哺乳动物的多价糖缀合物疫苗，特别是用于保护人类群体免受肠致病性细菌的影响和/或免受因人诺如病毒引起的病毒胃肠道感染的影响，所述肠致病性细菌为例如革兰氏阳性厌氧细菌艰难梭菌(Clostridium difficile)和革兰氏阴性细菌伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、大肠杆菌(Escherichia Coli)、霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)、弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi A)、宋氏志贺氏菌(Shigellasonnei)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerasuis)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、肠杆菌(Enterobacter)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
艰难梭菌是产生对人类为致病性的两种外毒素(肠毒素A和细胞毒素B)的孢子形成革兰氏阳性杆菌。
艰难梭菌是发达国家老年住院患者中抗生素相关感染性腹泻的主要原因(Simor等人,2002)。艰难梭菌相关疾病(CDAD)的症状范围从腹泻到严重结肠炎、中毒性巨结肠、败血症和死亡。近年来，疾病发病率、严重程度和复发率的增加主要是由于与流行性医院爆发相关的高毒性菌株的出现以及对常用抗生素的抗性的增加(Rupnik等人，2009)。
能够中和艰难梭菌肠毒素A和细菌毒素B(该病原体的两种毒素)的预防性疫苗被报道为在工业发展下的候选疫苗实例(Donald R.等人，2013)。
毒素A和B分别是308kDa和270kDa的非常大的蛋白质，其在结构上相关，共享介导细胞毒性葡萄糖基转移酶的细胞内摄取和递送的同源功能结构域。
毒素A(肠毒素)由2,710个AA组成，并在其序列中显示223个Lys残基(8.22％阳离子性)；毒素B(细胞毒素)由2,366个AA组成，并在其序列中显示156个Lys残基(6.59％阳离子性)(参见参考网址：http://www.uniprot.org/uniprot/P16154和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AGG91548.1)。
尽管这两种毒素在“体内”模型中的效力和效果各不相同，但过去在动物模型中的研究表明它们都促成天然感染中的疾病(Lyerly等人，1985)。此外，用毒素A和毒素B的疫苗接种(但不用单独的任一个进行免疫接种)在感染的仓鼠模型中赋予保护(Libby J.M.等人，1982)。
体液免疫应答控制CDAD的能力的识别促进了将使用含有抗毒素A和B抗体的汇集的人免疫球蛋白的被动免疫治疗成功用于治疗严重的CDAD(Salcedo J.等人，1997)。此外，在使用A和B抗-毒素单克隆抗体结合标准抗生素治疗的I期临床试验中实现了CDAD复发的减少(Lowy I.等人，2010)。
此外，在三名患有慢性复发性CDAD的小型研究中，使用福尔马林灭活的A和B类毒素抗原的研究性疫苗防止CDAD复发(Sougioultzis S.等人，2005)。
总的来说，这些观察结果提供了基于艰难梭菌毒素A和基于艰难梭菌毒素B的疫苗防止CDAD的验证并鼓励其进一步发展。如上所述，现在在临床试验中存在两种候选疫苗，其基于两种重组/福尔马林处理的类毒素蛋白A和B。
用于开发基于针对艰难梭菌类毒素的单一特异性的疫苗的策略(通过福尔马林处理或通过DNA重组技术解毒)被良好地记载，如上所述。还有被良好记载的是使用艰难梭菌重组肠毒素A(rARU)作为用于被制备为单一缀合物的弗氏志贺氏菌(S.flexneri)2a型、大肠杆菌K1和肺炎球菌14型的荚膜Ps的每一种的载体蛋白的研究(Pavliakova D.等人，2000)。显然，由于注射的载体蛋白质(即艰难梭菌肠毒素A的重组重复单元)的总量(而非异质性)(对于各缀合物Pn14-rARU、SF-rARU和K1-rARU分别为1.29μg、3.9μg和8.08μg的rARU)，单一的三种缀合物的同时施用不可避免地导致宿主的免疫系统的过载这是。
最近，该两种毒素的结构部分已被用作用于艰难梭菌的Ps II抗原的无毒载体(Romano M.等人，2014)。虽然艰难梭菌还产生三种不同的荚膜Ps，但证据指向两种毒素作为有效战斗病理学的靶，如在白喉和破伤风感染的历史病例中的。
然而，这些以前的工作没有报道关于制备用于在人类宿主(特别是儿童)中诱导针对来自抗生素抗性肠致病性细菌的几种碳水化合物抗原的免疫(多特异性)(同时使用最小量的载体蛋白来减少疫苗对宿主免疫系统的抗原性负荷，同时保持通过施用单价缀合物可定性实现的特异性免疫原活性和体内保护)的广谱肠疫苗的可能性。然而，与单价抗体相比，动物模型不允许在由本发明的多种抗原诱导的抗体滴度的定量方面得出结论，因为本领域的专家公知的是，只有人类婴儿可以可靠地区分缀合物实体的不同模型的最终不同的辅助T-依赖性活性。
本发明的作者现已获得了多表位分子构建体作为用于制备多表位糖缀合物疫苗的基本单元，所述多表位糖缀合物疫苗用作用于保护人群免受肠致病性细菌影响的广谱肠疫苗。事实上，本发明的作者集中于目前对于已经变成抗生素抗性的几种肠道病原体报道的紧迫问题：革兰氏阳性厌氧细菌艰难梭菌和革兰氏阴性细菌伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、弗氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、铜绿假单胞菌。由于它们的与日俱增的抗生素抗性，因这组细菌引起的肠道感染可能经常导致败血症，从而导致宿主死亡。
因此，本发明的目的是由包含共价结合至来自肠致病性细菌的不同血清学特异性的最少三个碳水化合物结构的辅助T-依赖性载体解毒的蛋白的基本单元组成的抗原性多价分子构建体，所述辅助T-依赖性载体解毒的蛋白选自来自艰难梭菌的肠类毒素A和细胞类毒素B，所述碳水化合物结构选自细菌多糖或解毒的脂多糖(例如SAEP-解毒的LPS或类内毒素)，其中每个碳水化合物结构包含至少一个由最少5至12个单糖残基(优选最少8至12个单糖残基)组成的重复基本表位，其中至少1摩尔的载体蛋白共价结合至少1摩尔的类型特异性或群特异性碳水化合物结构，或共价结合碳水化合物结构的总量，所述总量被认为是所述至少三种类型特异性或群特异性碳水化合物的总和。优选地，通过分子质量测定和NMR波谱评估所述糖残基，所述重复基本表位通过与类型特异性或群特异性多克隆或单克隆抗体的反应性(通过测定它们在抑制它们的同源性多糖-抗体参考系统中的各自MIC50值)进行抗原性评估。
根据本发明的肠致病性细菌是已经变得抗生素抗性的肠病原体，例如：革兰氏阳性厌氧细菌艰难梭菌和革兰氏阴性细菌伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、弗氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、铜绿假单胞菌。
根据本发明的优选实施方案，通过化学方法，例如福尔马林处理，如历史上已知用于白喉和破伤风类毒素的，或通过DNA重组技术，将来自艰难梭菌的类毒素蛋白肠类毒素A和细胞类毒素B解毒。
在根据本发明的分子构建体中，两种类毒素蛋白质中的每一种可以支持最少三种具有不同抗原性的多糖(例如衍生自细菌荚膜多糖的寡糖或多糖)或最少三种具有不同抗原性的解毒脂多糖(或LPS，内毒素)。
然而，用LPS以此方式获得的分子构建体导致毒性，因为LPS的脂质A部分活性地存在于分子结构中，并且可以通过与CD14和TLR4样受体的相互作用激活LPS典型的促炎细胞因子级联。为了追求并实现类毒素-LPS缀合物实体的安全使用，LPS结构因此必须进行解毒。
这可以通过以下方式实现：
1)切割掉脂质A部分，或
2)通过使用合成的抗内毒素肽(SAEP)的特定策略来饱和脂质A结合位点，以获得保留其完整的呈胶束样结构形式的超分子抗原库的类内毒素(或称为SAEP-解毒的LPS，SAEP-解毒的内毒素)(WO 2004/052394 A1)。
后一种解毒方法是本发明上下文中的优选实施方案。具体地，源自给定物种特异性(免疫型)内毒素(脂多糖)的类内毒素根据Rustici等人(Science 259:361-365,1993)报道的科学概念以及在美国专利6,951,652和美国专利7,507,718中报道的先前公开的分子细节中制备。
因此，类内毒素是由SAEP、合成的抗内毒素肽和LPS(内毒素)的等摩尔复合物组成的分子实体，其在与艰难梭菌类毒素(A或B)的多表位缀合物的形式中满足化学方程：
类毒素-(LPS)3+3SAEP→类毒素-(类内毒素)3
(也参见实施例3)。
根据本发明的分子构建体的优选实施方案，荚膜多糖抗原可以选自包含大肠杆菌K型(1,2,5,12,13)、伤寒沙门氏菌(Vi抗原)、霍乱弧菌0139和艰难梭菌的组。
作为革兰氏阳性细菌的艰难梭菌的特征还在于涉及至少三种不同Ps结构(PsI，PsII和PsIII)的碳水化合物荚膜。
根据本发明的分子构建体的另一个实施方案，所述两种类毒素蛋白质用作辅助T-依赖性载体，用于特异于弗氏志贺氏菌2a、霍乱弧菌01、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌0157/101/111、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌1型和猪霍乱沙门氏菌的解毒脂多糖(优选SAEP解毒的LPS或类内毒素)的糖缀合物。
根据本发明的分子构建体诱导针对两种载体蛋白(艰难梭菌的肠类毒素A和细胞类毒素B)的血清学特异性，并且诱导针对与该两种载体蛋白的每一个结合的至少三种携带的碳水化合物结构(简称为Ps或LPS/类内毒素)的每一种的血清学特异性，以使得相对特异性抗体显示针对艰难梭菌的同源天然毒素(肠毒素A和细胞毒素B)的中和活性，以及针对伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌(其它优选的碳水化合物抗原来自弗氏志贺氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，霍乱沙门氏菌，宋氏志贺氏菌和来自艰难梭菌本身)的杀菌活性。
根据上述，作为非限制性系列实例，作者已经制备了以下分子构建体：
-与伤寒沙门氏菌(Vi)、猪霍乱沙门氏菌(0139)和大肠杆菌(K1)的Ps共价结合的肠类毒素A；
-与伤寒沙门氏菌(Vi)、猪霍乱沙门氏菌(0139)和大肠杆菌(K1)的相同的三种Ps共价结合的细胞类毒素B；
-与肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和痢疾沙门氏菌的LPS/类内毒素共价结合的肠类毒素A；
-与肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和痢疾沙门氏菌的相同的三种LPS/类内毒素共价结合的细胞类毒素B。
本发明还涉及用于疫苗中的上述抗原性多价分子构建体，其用于保护受试者免受由于选自艰难梭菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌或其组合的至少一种肠致病性细菌的感染。
在优选的实施方案中，单一的抗原性多价分子构建体或不同抗原性多价分子构建体的组合可以用于疫苗的制备。
本发明的另一个目的是疫苗制剂，其包含在生理学上可接受的载体中的至少一种如上所述的抗原性多价分子构建体，任选地与药学上可接受的佐剂或赋形剂一起。
抗原性分子构建体可以具有载体抗原和携带的抗原的均质或混合模式。术语载体抗原指来自艰难梭菌的类毒素蛋白肠类毒素A或细胞类毒素B；术语携带的抗原指结合至该两种载体蛋白质中的每一种的碳水化合物结构(简称为荚膜Ps或LPS/类内毒素)。术语均质或混合是指携带的抗原相对于载体抗原的来源(即所有载体和携带的抗原来源于艰难梭菌；携带的抗原来源于相同或不同的肠病原体)。
根据本发明疫苗制剂的优选实施方案，每种载体抗原和/或携带的抗原的剂量范围为0.1至100μg，优选为1-10μg。
优选地，所述疫苗制剂还包含矿物或化学合成或生物学佐剂。矿物或化学合成或生物佐剂可与本申请中公开的分子构建体一起使用，以受益于可有效降低人中的最佳免疫原性剂量的任何免疫增强，从而进一步减少载体蛋白的总量。特别地，在用于人类的根据本发明的疫苗制剂中的优选无机佐剂选自磷酸铝(AlPO4)和氢氧化铝；优选的有机佐剂选自基于角鲨烯的佐剂，例如MF59，QF 21，Addavax；优选的生物抗原选自细菌抗原单磷酰脂质A，海藻糖二糖霉菌酸(trehalose dicorynomycolate)(Ribi's佐剂)。
在用于兽医学领域的疫苗制剂中，弗氏佐剂(完全或不完全)是优选的。佐剂的剂量可以是0.1-1mg/剂量，优选为0.5mg/剂量。
更优选地，这样的制剂适合于通过皮下或肌内或皮内或经皮途径施用。方便地，这样的施用可以通过常规的注射器注射或无针工具进行。
根据本发明的疫苗制剂可以根据需要单次或多次施用的方案施用，按照医生、儿科医生或兽医指导。
本发明还涉及如上所定义的广谱多价疫苗制剂，其用于医学人类或兽医领域，用于保护受试者免受由于选自下述的至少一种肠致病性细菌引起的感染：艰难梭菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌或其组合。优选地，所述待治疗的受试者属于儿科和老年群体。
这样的疫苗(例如：Ps和LPS所来源于的革兰氏阴性肠细菌的物种特异性)的实际配制可以取决于区域流行病学，以使得每个三联抗原缀合物(尽管总是使用来自艰难梭菌的两个载体蛋白肠类毒素A和细胞类毒素B中的一个或两个)根据选定的区域流行病学将有意携带特异性Ps或LPS/类内毒素抗原。
在本发明的一个具体实施方案中，疫苗制剂包含至少两种不同的抗原性分子构建体，其中来自艰难梭菌的两种蛋白肠类毒素A和细胞类毒素B各自可用作艰难梭菌的三种多糖(PsI，PsII和PsIII)的载体蛋白，使得两种组合的三个一组的缀合抗原将代表限于艰难梭菌的感染的特异性疫苗，其中由该两种蛋白质类毒素诱导的抗毒性活性可以与局部和全身性抗荚膜活性平行，从而导致由宿主免疫系统清除细菌。
这样的单一-三个一组的分子构建体还被配制为含有两种类型的抗原分子模型的组合多价组合物，用于实现最宽的抗原谱，例如：
-与伤寒沙门氏菌(Vi)、猪霍乱沙门氏菌(0139)和大肠杆菌(K1)的Ps共价结合的肠类毒素A，其与共价结合于相同的三种Ps抗原的细胞类毒素B组合；
-与伤寒沙门氏菌(Vi)、猪霍乱沙门氏菌(0139)和大肠杆菌(K1)的Ps共价结合的肠类毒素A或细胞类毒素B，其与共价结合于肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和痢疾沙门氏菌的三种类内毒素抗原的细胞类毒素B或肠类毒素A组合。
最近有关实验证据通过将肠细菌作为诺如病毒感染的刺激因子表明，人和小鼠诺如病毒在体外并且可能在体内感染B细胞。已经提出这种生物协同作用是基于诺如病毒可以变得感染性并在人中发展流行性和散发性胃肠炎的机制(Jones M.K.等人,Science,346:755-759,2014)。
与这些观察一致，经历抗生素治疗以消耗肠道微生物群的鼠宿主由作者报道的实验中显示小鼠诺如病毒复制的显著减少。
根据这个证据，本申请的作者得出了使用本文公开的疫苗组合物靶向抗生素抗性肠致病性细菌的不断扩展的世界以可能地限制负责急性胃肠炎的诺如病毒复制和并行地肠道细菌感染的原理。
诺如病毒性胃肠炎是一种普遍的和潜在严重的疾病，其特征在于恶心、呕吐、腹部痉挛、腹泻和偶尔发烧的急性发作。诺如病毒是高度感染性的，并且容易从人到人或通过污染的环境传播。流行病爆发发生在社区环境中，特别是医院、酒店、学校、日托设施和疗养院，对家庭、医疗保健系统和企业造成的社会经济成本不断上升。当病毒袭击时，军事单位受到显著影响，因为爆发影响战斗准备。在老年人、儿童和免疫受损个体(在其中感染可导致严重的并发症并且甚至可导致死亡)中报道了严重的临床结果。据估计，在全世界，诺如病毒导致五个病毒性胃肠炎病例中的一个。估计每年有3亿诺如病毒感染的病例导致大约26万人死亡，大多在低收入国家。诺如病毒被分类为至少5个基因组和至少40个基因型；最近在儿童和老年人中评估了它们在选定地理区域的分布情况，年轻儿童(≤5岁)的发病率为1,475例/100,000人/年，老年人(≥65岁)的发病率为585例/100,000人/年(Chan M.等人,Scientific Reports,2015)。随着时间的推移，诺如病毒通过抗原漂移逃避天然免疫，这允许它们逃避响应早期感染产生的抗体。
因此，本发明的另一方面是提供用于预防和/或治疗肠致病性细菌的广谱多价疫苗制剂，其随后可以并行地靶向由人类诺如病毒引起的病毒性胃肠道感染。
最近开发诺如病毒疫苗的努力集中在由病毒衣壳(外壳)的分子构建的病毒样颗粒(VLP)上。在I期临床试验中，一种多价VLP疫苗引起抗体产生，但没有赋予针对所测试的病毒株的免疫力。然而，在最近的一项研究中，Lindesmith及其同事(2015年)就针对疫苗VLP和代表不包含在疫苗中的病毒的VLP的抗体表征了来自十个多价VLP疫苗临床试验参与者的血清标本。研究人员发现，VLP疫苗可以迅速引发针对广泛范围的疫苗和非疫苗VLP(包括它们以前不能遇到的代表人类诺如病毒的两个VLP)的抗体应答。总体而言，针对参与者先前暴露于的诺如病毒株的抗体主导免疫应答。这些发现可以鼓励基于诺如病毒的疫苗的开发，假设这种方法可以克服诺如病毒通过抗原漂移逃避免疫的能力。在任何情况下，这将是导向于最终包含在感染阶段期间的病毒的策略(而不是一旦它仍然在屏蔽它的肠致病性细菌中阻断在基部的病毒复制)，其中病毒颗粒扩散出容纳它的细菌细胞，如本申请的作者通过使用靶向肠致病性细菌的广谱疫苗所提出的。最终，这两种策略(例如，使用靶向诺如病毒及其细菌宿主的两种疫苗)的伴随和/或平行使用可以构成用于实现人宿主的广谱抗病毒保护的有力工具。
本发明还涉及用于制备根据本发明的抗原性多价分子构建体的缀合方法(其采用在专利EP 1501542中公开的相同化学方法)，其中所述至少三种碳水化合物结构中的每一个通过经由氧化的O-脱氢解偶联和形成与烷基二胺间隔基的亚胺还原键的还原胺化化学活化至单官能性或多官能性，然后衍生化为活性酯，这样的酯衍生的碳水化合物结构最终并同时通过形成酰胺键偶联至来自艰难梭菌的多官能性载体蛋白细胞类毒素B或肠类毒素A的氨基，所述碳水化合物结构选自：
-伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、艰难梭菌和大肠杆菌的荚膜多糖，或
-来自艰难梭菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的脂多糖；
其中至少一摩尔的载体蛋白与至少一摩尔的碳水化合物结构反应，考虑这样的总量是由至少三个类型特异性或群特异性碳水化合物结构中的每一个的摩尔总和组成的量。优选地，所述碳水化合物结构在其相应的二胺丁酸衍生物中被化学活化，并且活性酯是琥珀酰亚胺酯。
作为实例，根据申请人公开的方法，将三个一组的来自伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和霍乱弧菌的荚膜的多糖化学活化至它们的同源Ps-DAB(二胺丁酸衍生物)根据EP 1501542的权利要求1中由申请人公开的方法进行，而多官能性载体蛋白质是来自艰难梭菌的肠类毒素A和细胞类毒素B。
或者，用于制备本发明的抗原性多价分子构建体的缀合方法使用EP 1501542的权利要求8中公开的化学法，涉及来自艰难梭菌的多官能性载体蛋白细胞类毒素B或肠类毒素A的氨基与至少三个不同碳水化合物结构的经由形成亚胺还原键的还原胺化的同时偶联(或逐步偶联)，所述碳水化合物结构选自：
-伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、艰难梭菌和大肠杆菌的荚膜多糖
-来自伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的脂多糖
这样的碳水化合物结构在具有或不具有间隔基的情况下通过经由氧化的O-脱氢解偶联被在先活化至单官能性或多官能性；
其中至少一摩尔的载体蛋白与至少一摩尔的碳水化合物结构反应，考虑这样的总量是由至少三个类型特异性或群特异性碳水化合物结构中的每一个的摩尔总和组成的量。
根据本发明，提及载体蛋白和特定碳水化合物抗原的术语摩尔包括一般测量单位(摩尔)或其分数(即微摩尔或纳摩尔或皮摩尔，全部代表其分数)。
当根据本发明的缀合方法涵盖脂多糖时，它们应是解毒的。因此，缀合方法进一步包括将所述脂多糖解毒的附加步骤，所述解毒可选择地通过以下进行：a)在进行偶联反应之前或之后切割掉脂质A部分、或b)在进行偶联反应之前或之后通过使用合成的抗内毒素肽(SAEP，如SAEP2，参见Rustici等人，Science 259：361-365,1993)的特定策略来饱和脂质A结合位点。
优选地，这样的解毒脂多糖通过美国专利6,951,652(参见第16页和权利要求1)和美国专利7,507,718(参见第33-34页和权利要求17)中的相同作者公开的上述后一程序获得，以获得保留超分子胶束样LPS结构的最佳抗原性特征的相应类内毒素，用于相对免疫原性质的最佳表达。
除了上述解毒方法之外，可以使用其它方法用于该目的，并且尤其可以考虑通过遗传工程化通过修饰导致脂质A合成的酶促途径的LPS解毒以及通过存在于脂质A结构中的酯连接的脂肪酸链的酶促或化学水解的解毒。
此外，在本发明的缀合方法的优选实施方案中，步骤a)的碳水化合物结构包含至少一个由如通过分子质量测定和NMR波谱法测定的最少5至12个单糖残基组成的重复基本表位，所述重复基本表位通过与类型特异性或群特异性多克隆或单克隆抗体的反应性通过测定它们在抑制其同源多糖-抗体参照系统中的各自MIC 50值而抗原性地评估。
代表本发明的最终目的的是可通过上述的缀合方法获得的抗原性多价分子构建体。
如可以推断的，上述公开的分子模型可以被进一步开发以每单个摩尔(或其分数)的蛋白质载体含有多于三个(例如四个或五个)不同的碳水化合物结构，这种可能性取决于分子构建体的三个主要参数：
a)载体蛋白的物理-化学特征，其结构应当具有最高可能量的赖氨酸残基(反应性-NH2基团的来源)；
b)不同碳水化合物结构的“特别”选择的多分散MW，具有最佳活化率同时限制偶联反应中空间位阻现象的负面影响，以及
c)用于活化不同碳水化合物结构和用于合成分子构建体的化学法的效率(用于碳水化合物结构的最佳活化中的高效率的优选化学法是在具有或不具有间隔基的情况下经由氧化的O-脱氢解偶联，而用于缀合反应中的高效率的优选化学法是通过碳水化合物结构和载体蛋白之间的经由活性酯的酰胺键形成；对于缀合反应还优选的是使用具有或不具有间隔基的O-脱氢解偶联氧化的碳水化合物结构与载体蛋白之间经由直接还原胺化的亚胺还原键的形成的化学法。
根据本发明使用的缀合方法预见了(至少三个)Ps或LPS(其因而可以具有无差别地(尽管均质地)低或高的MW)的多步活化，以便优化与载体蛋白的偶联产率。
本分子构建体的化学计量特征(蛋白质/Ps或蛋白质/LPS的w/w比率)(其进而与分子构建体的免疫剂量相关)通过国际专利申请PCT/EP2014/051670中公开的免疫化学方法进行。
这允许在本发明中确定Ps或LPS的定量的量的可能性，即使当具有非常相似的结构时，如果存在于相同的分子构建体中。
最后，本发明涉及将疫苗制剂中的载体蛋白质的量限制到如与更广泛抗原库的缀合物抗原相关的免疫原性可能的最小量，以控制可通过上文公开的缀合方法获得的分子构建体对宿主免疫系统的抗原性负荷。此策略与目前已知为“载体特异性免疫干扰”的临床现象的遏制一致，所述载体特异性免疫干扰涉及在给定的糖缀合物疫苗组合物中使用的载体蛋白的量，当考虑在哺乳动物宿主的免疫途径期间施用的其它疫苗的情况时(Dagan R.等人,2010；Lee L.H.and Blake M.S.,2012)。
在下面的实验部分中，将根据优选实施方案更详细地公开本发明。这样的实施方案应当被认为不限制本专利公开内容的保护范围，而仅仅是为了举例说明的目的。
实施例
实施例1：
i)具有载体蛋白肠类毒素A的包含伤寒沙门氏菌(Vi)、大肠杆菌(K1)和猪霍乱沙门氏菌(0139)的多糖的四价缀合物抗原的合成；
ii)具有载体蛋白细胞类毒素B的包含伤寒沙门氏菌(Vi)、大肠杆菌(K1)和猪霍乱沙门氏菌(0139)的多糖的四价缀合物抗原的合成。
三个Ps至同源Ps-DAB(二胺丁酸衍生物)的化学活化
此步骤根据上述专利EP1501542的权利要求1(步骤A1)中申请人公开的方法进行。使用国际申请号PCT/EP2014/051670中报道的1H-NMR波谱进行这样的活化的特定控制以及获得的活化Ps结构的特性。
Ps-DAB衍生物的 1 H-NMR分析
1.用于NMR分析的Ps和Ps-DAB衍生物的溶液
将3-4mg多糖样品(PS)或PS-DAB溶解在0.7ml D2O-磷酸盐缓冲液中并转移到5mmNMR管中。在D2O中制备的磷酸盐缓冲液的浓度为100mM，pH＝7。使用三甲基硅丙酸钠盐(TSPA)(CH3)3Si(CD2)2COONa用作内参。TSPA的浓度为1mM。
2.NMR设备
使用高场NMR波谱仪(600MHz)。使用具有能够以至少55G·cm-1的强度在z方向(平行于磁场)上产生梯度的z梯度线圈的高分辨率5mm探头。
3.NMR实验设置
在将样品引入磁体内之后，进行所有常规程序：调谐和匹配，匀场，90度脉冲校准。预饱和可用于压制残余HDO信号。为了良好的预饱和，光谱中心(O1)必须精确地设置在HDO信号上(约4.80ppm)，并且良好的匀场也是期望的。
在调节用于预饱和的参数之后，检查扩散梯度实验的参数。使用具有纵向涡流延迟的双极性梯度的受激回波脉冲序列。
4.DAB活化的指纹图谱
基团–CH2-NH2在3.08ppm
基团–CH2-NH-CH2-在3.17ppm
5.Ps上DAB活化的百分比
DAB活化的百分比在0.5-5.0％摩尔DAB/摩尔BRU(群特异性Ps的基本重复单元)的范围值中，最佳摩尔范围为1.5-3.0％。
Ps Vi、Ps 0139、Ps K1至其同源活性酯的衍生化作为Ps-DAB-MSE衍生物
此步骤根据欧洲专利EP 1501542的权利要求8中申请人公开的方法进行，在此将该专利作为参考资料。
将三个活化的(多官能性)Ps与(多官能性)载体蛋白肠类毒素A或细胞类毒素B的 同时偶联
根据在欧洲专利EP1501542的权利要求8中申请人公开的方法进行缀合物的化学合成，也称为偶联反应。然而，此程序在本文可以被认为是创新性的，因为三个偶联反应是同时进行的，而不是在该专利中的在一个偶联反应中进行的(或逐步的方法)。
这个程序可能优于每个Ps活化的抗原的逐步偶联，原因简单地在于缩短反应时间，因此改善了反应的效率，条件是三个活化的Ps处于在平衡时相当地竞争偶联反应的条件下(此特征包括相当的平均MW，相当的Ps-DAB活化的范围和蛋白质的反应基团与活化的Ps的反应基团之间的相当的化学计量比)。
反应的适当化学计量保持考虑琥珀酰亚胺酯相对于活化的三个Ps抗原和可用的载体蛋白的氨基的总量。优选设定化学计量以考虑不超过20-25％的在肠类毒素A或细胞类毒素B(作为实例)的结构中可用的氨基的反应性，以使蛋白质最佳地保存其抗原库。
肠类毒素A或细胞类毒素B(简称为类毒素)与Ps-DAB衍生物(Ps-DAB)的偶联反应与以下化学计量一致：
类毒素+4Ps-DAB(MSE)→类毒素-(Ps)3+Ps-DAB(MSE)
其中实体Ps-DAB(MSE)衍生物是指反应中三个类型特异性Ps结构的每一个的相等份的总和，从而产生对于携带的总共3摩尔类型特异性Ps的平均1摩尔蛋白质的缀合物，加上应有的过量的Ps-DAB(MSE)衍生物，如由平衡常数所规定的：
此方程是指由等份的DAB-活化的Ps抗原的总和得到的总活性酯(MSE)的浓度，其进而与存在于每个活化的Ps抗原中的通过1H-NMR波谱法定量的DAB接头的量是可比较的(在摩尔基础上Ps-DAB至Ps-DAB(MSE)的转化率≥98％)。
该化学方程为类毒素载体蛋白的完全糖基化提供了证据。此方程还显示缀合反应取决于两种试剂、亲核体(通过其Lys残基的ε-NH2基团的类毒素)和亲电体(Ps衍生物的酯基团的羰基部分)的浓度，因此被定义为SN2反应。
上述考虑与实验观察结果一致，即用类毒素作为载体蛋白获得的糖基化反应中的最高产率是反应中存在的100％的载体蛋白和约80％(w/w)的Ps-DAB-衍生物，它们的剩余部分是向右侧推动平衡所需的少量未偶联的Ps衍生物。
在这种类型的反应中，溶剂影响反应速率，因为溶剂可以或可以不包围亲核试剂，因此阻碍或不阻碍其接近碳原子。极性非质子溶剂通常是用于此反应的比极性质子溶剂更好的溶剂，因为极性质子溶剂将通过溶剂的与亲核体的氢键合而溶剂化，从而阻止其以离去基团碰撞碳。具有低介电常数或受阻偶极末端的极性非质子溶剂将有利于SN2方式的亲核取代反应(优选的实例是：DMSO，DMF，四氢呋喃等)。
当考虑到反应是自发的(因此是放热的)时，影响Keq的反应温度是与所选择的溶剂的使用相容的最低温度，因此通常设定在4℃至20℃的温度。
除了上文详述的缀合化学法之外，可以使用其它化学法来实现多价缀合物抗原的合成；在这些之中，蛋白质(通过还原胺化)与氧化的Ps(通过O-脱氢解偶联)的直接偶联或使用可用于活化Ps和蛋白质的异源和化学互补的接头。
此外，除了使用导致通过蛋白质的多官能性和Ps组分的多官能性获得多价交联蛋白-PS缀合物的化学法的策略以外，可以考虑如基于在其末端还原基团处被活化用于随后偶联至载体蛋白的来源于荚膜Ps或LPS的脂质A剥除的寡糖的寡糖的本文公开的抗原性多价分子构建体的合成，如申请人在上述论文Porro M.等人in Molecular Immunology,23:385-391,1986中的另一个缀合物抗原模型中所示的。
最后，可以认为所公开的分子构建体通过使用“特别”的DNA重组技术在细菌或酵母细胞或其它工程改造的活细胞中的酶促糖基化来制备。
实施例2：
iii)具有载体蛋白细胞类毒素B的包含肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和痢疾沙门氏菌的LPS(脂多糖)的四价缀合物抗原的合成；
iv)具有载体蛋白肠类毒素A的包含肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和痢疾沙门氏菌的LPS(脂多糖)的四价缀合物抗原的合成。
三个LPS至同源LPS-DAB衍生物(二胺丁酸衍生物)的化学活化
将三个LPS在它们的O-抗原碳水化合物部分中化学衍生至相应的-DAB衍生物(参见下面的图，其显示在作为LPS分子的最亲水部分的O-抗原碳水化合物部分内的DAB活化区域)。“核心”结构难以被活化，因为它非常接近疏水区(脂质A)，其是负责LPS的胶束样结构的相当kriptic型的结构(kriptic structure)，还也负责LPS的生物毒性(例如局部和全身炎症，TNF-和IL6-介导的，随后为致热原性)以及抗原性和免疫原性的最佳表达。在本申请的优选实施方案中，然后通过与SAEP的高亲和力结合选择性阻断LPS的生物毒性，这保留了LPS的与其超分子胶束样结构相关的这样的最佳特征。
DAB活化的步骤根据在上述专利EP1501542的权利要求1(步骤A1)中申请人公开的方法进行。使用国际申请号PCT/EP2014/051670中报道的1H-NMR波谱进行这样的活化的特定控制以及获得的活化Ps结构的特性。
关于-DAB衍生物的1H-NMR分析如以上对于实施例1所报告的进行。
下图代表肠杆菌科的一般LPS结构，其具有DAB活化的定位位点(与载体蛋白缀合所必需的)和必要的生物解毒，优选通过SAEP(合成的抗内毒素肽)进行，其允许实现解毒，同时LPS保留其超分子胶束样抗原结构)。
肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和痢疾沙门氏菌的LPS至其同源活性酯的衍 生化作为LPS-DAB-MSE衍生物
此步骤根据欧洲专利EP 1501542的权利要求8中申请人公开的方法进行。
将三个活化的(多官能性)LPS与(多官能性)载体蛋白肠类毒素A的同时偶联
上面在实施例1中报告的化学方程式也适用于类毒素和LPS衍生物的缀合物：
类毒素+4LPS-DAB(MSE)→类毒素-(LPS)3+LPS-DAB(MSE)
以使得：
此方程是指由等份的DAB-活化的LPS抗原的总和得到的总活性酯(MSE)的浓度，其进而与存在于每个活化的LPS抗原中的通过1H-NMR波谱法定量的DAB接头的量是可比较的(在摩尔基础上LPS-DAB至LPS-DAB(MSE)的转化率≥98％)。
根据在欧洲专利EP1501542的权利要求8中申请人公开的方法进行缀合物的化学合成，也称为偶联反应。然而，此程序在本文可以被认为是创新性的，因为三个偶联反应是同时进行的，而不是在该专利中的在一个偶联反应中进行的(或逐步的方法)。这个程序可能优于每个Ps活化的抗原的逐步偶联，原因简单地在于缩短反应时间，因此改善了反应的效率，条件是三个活化的Ps处于在平衡时相当地竞争偶联反应的条件下(此特征包括相当的平均MW，相当的LPS-DAB活化的范围和蛋白质的反应基团与活化的LPS的反应基团之间的相当的化学计量比)。然而，以这种方式获得的分子构建体导致毒性，因为LPS的脂质A部分活性地存在于分子结构中。为了追求并实现类毒素-LPS缀合物实体的安全使用，LPS结构因此必须经历可选择地通过切割掉脂质A部分或通过使用合成的抗内毒素肽(SAEP)的特定策略的脂质A结合位点的饱和来进行的解毒。后一种解毒方法是本发明上下文中的优选实施方案(参见下一个实施例3)。
实施例3：从它们的同源肠类毒素A-LPS(内毒素)/细胞类毒素B-LPS(内毒素)缀合物制备肠类毒素A-类内毒素缀合物和细胞类毒素B-类内毒素缀合物
类内毒素是能够诱导针对其同源LPS的特异性免疫活性的无毒性抗原，所述同源LPS是暴露于革兰氏(-)细菌表面上的天然主要毒性抗原。
一本全面的、可公开获得的教科书(其详细列出了来自革兰氏阴性细菌的内毒素抗原的许多科学方面)是由Kevin L.Williams编辑的“Endotoxins”,Informa Health CareUSA Inc.,publisher,New York(2007)。
类内毒素是由SAEP(合成的抗内毒素肽)与LPS(内毒素)的脂质A部分的等摩尔复合物组成的分子实体：
类毒素-(LPS)3+3SAEP→类毒素-(类内毒素)3
源自给定物种特异性(免疫型)的内毒素(脂多糖)的类内毒素根据Rustici等人(Science 259:361-365,1993)报道的科学概念在美国专利6,951,652和美国专利7,507,718中报道的先前公开的分子细节中制备。
类内毒素的免疫学活性涉及具有经由免疫学中被称为调理吞噬(OP或巨噬细胞和PMC中的抗体介导的细菌吞噬)的机制和直接的杀细菌(DB，抗体介导的细菌细胞壁的裂解)(两种机制均由补体途径的活化介导)的生物活性(杀菌效应)的IgG(主要)和IgM同种型的多克隆抗体。
类内毒素是动物模型中的辅助T-依赖性抗原，但尚未在人类婴儿(其中免疫系统直到2岁以上才完全发育)中经历。由于这个原因，在本申请中考虑了与辅助T-依赖性载体蛋白(如上述报告的艰难梭菌的两种类毒素蛋白)的缀合，用于制备所需的疫苗产品。
因此，肠类毒素A或细胞类毒素B与选定的物种特异性LPS(内毒素)的缀合物已在美国专利号5,010,627(参见第33-34页和权利要求17)中一般性报道的条件下与SAEP2(Rustici等人,Science 259:361-365,1993)反应，以便实现类毒素缀合的LPS的解毒，从而形成相对同源的类毒素缀合的类内毒素。
制备了以下类毒素缀合的类内毒素：
-共价缀合至甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的类内毒素的肠类毒素A；
-共价缀合至甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的类内毒素的细胞类毒素B；
共价缀合至甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的类内毒素的CRM197作为良好建立的辅助T-依赖性载体蛋白可用于控制动物模型中的免疫实验。
实施例4：包含缀合至载体蛋白肠类毒素A的伤寒沙门氏菌(Vi)，大肠杆菌(K1)和猪霍乱沙门氏菌(0139)的多糖的四价缀合物抗原与包含缀合至载体蛋白细胞类毒素B的肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和痢疾沙门氏菌的LPS/类内毒素的四价缀合物抗原的组合。
通过以适合用于在实施例8中报告的动物模型中的免疫原性研究的剂量联合两种类型的分子模型来制备该组合。
实施例5：包含与载体蛋白肠类毒素A或细胞类毒素B缀合的伤寒沙门氏菌(Vi)，大肠杆菌(K1)和猪霍乱沙门氏菌(0139)的多糖的抗原性多价分子构建体的物理化学分析
已经使用Sepharose 4B-CL上的GPC分析(凝胶渗透色谱法)进行实施例1的抗原性多价分子构建体的物理分析。高分子量(HMW)多价抗原的纯化简单地通过从Kd＝0.00至Kd＝0.30收集和合并洗脱级分来获得。
分子构建体的基本单元的聚合物作为交联分子实体获得，利用Ps抗原的多官能性(基于摩尔约2％的DAB活化，如通过1H-NMR波谱证实的)和多官能性的载体蛋白(通过TNBS反应测定，包含序列的整个2,710个AA的结构内的约104个反应性氨基/摩尔类毒素A，从毒素A的天然223个Lys残基中保留的+1氨基末端AA；通过TNBS反应测定，在包含序列的整个2,366AA的结构内的约85个反应性氨基/摩尔类毒素B，从毒素B的天然156个Lys残基保留的+1氨基末端AA)。
鉴于上述，所分析的缀合物表现为多分散的、单体至聚合的分子实体，其包含化学方程式中报告的分子构建体的基本单元，其中HMW衍生自包含肠内毒素A(MW＝3.08x105)或细胞类毒素B(MW＝2.70x105)和三个Ps/LPS抗原中的每一个的平均MW＝105(或总共约3.0x105)的基本聚合单元，导致每基本单元综合平均MW为6.10x105；因此，这种基本结构的几个交联单元达到几百万并主要在Sepharose 4B-CL柱的Vo下洗脱。
载体蛋白与三个类型特异性Ps中的每一个之间的w/w比为约3.6(下表1)；此w/w比产生大约1.0的平均摩尔比(R)蛋白/类型特异性Ps，对应于1摩尔蛋白质/摩尔类型特异性Ps的平均比率，也通过化学方程式显示。因此，实验获得的交联的分子实体相应于由基本单元的几个聚合单元构成的分子模型，该基本单元仅由携带总共三摩尔类型特异性Ps(每个类型特异性Ps一摩尔)的一摩尔载体蛋白组成。
实施例6：抗原性多价分子构建体肠类毒素A-PsVi、PsK1、Ps0139或细胞类毒素B-PsVi、PsK1、Ps0139的免疫化学分析
通过抑制性ELISA分析GPC纯化的分子构建体，以确定四种血清不同的多克隆抗体(PAb)的血清学特异性，和确定构建体的每种抗原的定性和定量存在，如国际专利申请PCT/EP2014/051670中公开的。
通过使用抑制性ELISA，通过实验确定的参数MIC50(作为同源参照Ps-Ab反应抑制剂的选择的碳水化合物抗原的最小抑制浓度)，进行用于测试其定量当量的碳水化合物抗原的化学滴定和免疫化学滴定之间的比较，以便评价和关联免疫化学方法相对于化学方法在这种分子构建体的分析控制中的精确性和准确性。
实施例7：测定活化或多价缀合形式的碳水化合物抗原的浓度：化学滴定与免疫化学滴定的比较
根据上文相对于抑制性ELISA报道的方法获得的免疫化学滴度与根据在国际专利申请PCT/EP2014/051670的特定部分中报道的方法获得的化学滴度相比；通过在使用已知的化学滴定的碳水化合物抗原量通过抑制性ELISA建立的参考标准曲线的线性部分上插值来确定活化或缀合形式的三个碳水化合物特异性抗原中的每一个的未知样品的免疫化学滴度。
然后将用于上述每种分子构建体的定性和定量免疫化学分析的相同方法用于表征含有两个分子构建体的联合的多价疫苗的最终制剂，每个分子构建体由用作载体蛋白的艰难梭菌的两种类毒素的三个一组Ps/LPS(类内毒素)缀合物构建，以获得示例性的4价或8价疫苗的完整表征。
实施例8：与多价分子构建体的化学计量相关的疫苗制剂
这种用于肠道疫苗的广谱制剂可以通过使用本发明的分子构建体安全地制备，其允许减少用于携带这样数量的缀合的Ps和LPS(类内毒素)抗原的蛋白质载体的使用。具体参考含有包括最普遍的、流行病学显著的特异性Ps和LPS/(类内毒素)的8价制剂的肠道疫苗的示例性制剂，根据上面在详细描述基于携带Ps/LPS(类内毒素)的肠内毒素A和细胞类毒素B的分子构建体以及两者的组合的各种实施例中报道的方法，合成了下列分子构建体(表1)，并作为优选实施方案的扩展示例进行分析。
根据本申请中报道的程序制备和配制的并且由所得分子构建体的化学计量所定义这种8价肠道疫苗中所示的两种载体蛋白质类毒素(每种表达内置的多个表位)的总量符合相对于每个分子构建体的剂量的以下摩尔组成，所述分子构建体含有两种载体蛋白类毒素(分别为MW＝308K和270K)的每一种的约1μg和三个选择的DAB活化的类型特异性的Ps/LPS(类内毒素)抗原(基于两种不同的分析标准平均MW＝100K，即通过在校准的滤膜上的分子过滤估计平均尺寸以及通过GPC估计平均尺寸，在所有情况下使用参考碳水化合物分子如各种MW的葡聚糖)。
表1
在示例的分子构建体中，蛋白质与Ps/LPS的(w/w)比的平均值为：3.61±0.39(10.8％)，对应于(摩尔/摩尔)比的平均值1.26±0.14(11.1％)。
计算和比较基于摩尔的缀合物抗原的特征的概念是基本的，因为免疫系统在摩尔基础上加工抗原，如自然界在转化物质的每个化学或生物化学反应中所做的，因此是指抗原的MW。
因此，根据每种类型特异性Ps/LPS抗原的平均MW和蛋白质载体类毒素的平均MW，缀合物抗原的摩尔比通过选择其抗原成分而改变。对于辅助T-依赖性的可能最佳表达，最优选的是载体蛋白和每种类型特异性Ps抗原之间的摩尔比等于或高于1.0。除了此摩尔参数之外，考虑插入在蛋白质和每种类型特异性碳水化合物抗原之间的共价键的平均量也是重要的，其平行于类型特异性多糖的活化速率，因为此杂合分子区域被实验提出负责缀合分子的获得性辅助T-依赖性质(Arndt和Porro，1991)。
然而，如国际专利申请PCT/EP2014/051670中所详述的，通过解决参与上述化学方程式中报道的化学平衡的试剂的量，可以根据不同的化学计量的合成来合成分子构建体，这可以导致不同化学计量的分子构建体，其中分子构建体中辅助T-依赖性载体蛋白的量可以根据这种分子构建体在人群的不同年龄组中的免疫原性的最佳表达来最佳选择。在上述示例的两种包含一至两个分子构建体(各自携带三个类型特异性Ps/LPS)的4价至8价制剂中，分别地，每种载体蛋白质类毒素的总量为约1μg，而缀合的类型特异性Ps/LPS(类内毒素)的量为约0.3μg。
因此，上述报道的实施方案的目的是提供以下事实的证据：所公开的具有内置表位的多价抗原性分子构建体可以在宽范围的化学计量参数中合成，以便随后在哺乳动物宿主中(特别是在人类中)适当地限定构建体的最佳剂量，甚至当考虑通过这样的广谱疫苗制剂免疫的不同年龄组(从婴儿到老年人)时也如此。
下表2显示了通过使用相同的合成化学反应对于上述概念获得的不同分子模型，尽管对于参与平衡的试剂使用不同的“特别”选择的化学计量。
在下文中，报道了用于本申请中的两种类毒素肠类毒素A和细胞类毒素B的一些考虑，因为它们是(或可以是)同源毒素的化学处理的衍生物。这种历史性的程序(用于历史性疫苗，如破伤风类毒素和白喉类毒素)是将毒素有意解毒用于作为免疫原的安全人类使用所必要的。在本申请中，我们已经认为纯化的类毒素的平均MW与其所衍生的毒素的平均MW相当。然而，在其它特征中，类毒素和毒素之间的显著差异存在于在化学解毒后保留在类毒素结构中的赖氨酸残基的残留伯氨基的量。相对于最初存在于同源毒素结构中的那些，在类毒素中将检测到平均47％至54％的反应性氨基，其在与活化的Ps/LPS抗原的偶联反应中作为亲核基团。当将两种类毒素的结构与巩固的历史的载体蛋白(如CRM197)的结构比较时，在偶联反应中作为亲核试剂竞争的能力方面，可以确定类毒素A具有约104氨基/摩尔(对于2,710AA，MW＝3.08x105)，而类毒素B具有约85氨基/摩尔(对于2,366AA，MW＝2.7x105)，使得它们的摩尔密度(其被定义为“摩尔亲核活性”)在肠类毒素A中为3.84％，在细胞类毒素B中为3.60％，这两个参数显著低于对于在给定的偶联反应中具有更高的作为亲核试剂的能力的CRM197(7.47％)的计算值(如在国际专利申请号PCT/EP2014/051670中详述的)。然而，考虑到两种蛋白质类毒素的MW的显著差异(在它们相对于CRM197的偏好中，基本上因子＝5.3和4.7)，对于在分子构建体中选择的每种携带的碳水化合物抗原，当愿意限制多价制剂中载体蛋白/剂量的量时，蛋白质载体的摩尔比可能有利于类毒素。事实上，在两种载体蛋白类毒素的相当重量剂量下，它们的摩尔数比CRM197低约5.0倍。因此，必须注意载体MW是影响缀合物的物理-化学特征的重要参数的事实，并且其可能限制获得用于T辅助细胞依赖性在宿主免疫系统中的最佳诱导的值≥1.0的类毒素/特异性Ps/LPS的摩尔比的可能性。
表2列出了为本申请中详述的工作合成的所有分子模型，代表用于此目的的各种化学计量，其取决于：i)所用载体蛋白的MW；ii)这种载体蛋白的摩尔亲核活性(表达-NH2基团的量/蛋白质的摩尔数)；iii)活化的Ps/LPS抗原的平均MW，和iv)Ps/LPS抗原(DAB-MSE基团随后与蛋白质的-NH2基团反应)的相应活化速率。示例的分子模型证明了所采用的化学法的灵活性以及载体蛋白可以以高于1.0和低于1.0的宽范围的多种重量和摩尔比存在于缀合物实体中的事实。特别地，当考虑糖缀合物中存在的每种类型特异性或群特异性Ps时，蛋白质/Ps的摩尔比范围为至少0.3至1.0，并且当考虑三种Ps的总和时，为至少0.3至1.0，每个Ps对最终存在于糖缀合物中的总量贡献约三分之一。
表2
实施例9：携带多糖(伤寒沙门氏菌，猪霍乱沙门氏菌，大肠杆菌)或LPS/类内毒素(甲型副伤寒沙门氏菌，痢疾沙门氏菌，肠炎沙门氏菌)的肠内毒素A和细胞类毒素B(源自艰难梭菌的同源毒素)的抗原性多价分子构建体在动物模型中的免疫学分析
使用来自艰难梭菌的两种蛋白质类毒素的两种缀合物已经历于用于主动免疫实验的鼠动物模型中。作为辅助T-依赖性控制免疫原，CRM 197的同源缀合物用于平行实验。
Ps-缀合物的疫苗制剂
组合PsVi、Ps0139和PsK1的肠类毒素A和细胞类毒素B缀合物。缀合物的化学计量特征显示如上表1所示的蛋白质/每个类型特异性Ps的平均比为3.61±0.39(w/w)。
LPS/类内毒素-缀合物的疫苗制剂
组合肠炎沙门氏菌、痢疾沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌的LPS的肠类毒素A和细胞类毒素B缀合物。缀合物的化学计量特征显示如上表1所示的蛋白质/每个类型特异性LPS/类内毒素的平均比为3.61±0.39(w/w)。
使用载体蛋白肠类毒素A和细胞类毒素B的Ps-缀合物和LPS(类内毒素)-缀合物的 组合广谱肠疫苗制剂
将PsVi、Ps0139和PsK1的肠类毒素A缀合物和肠炎沙门氏菌、痢疾沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌的LPS(内毒素)的细胞类毒素B缀合物组合用于此目的。
示例性疫苗的剂量和制剂
根据上表1中报道的分子构建体的化学计量，对于每个分子构建体中存在的每个Ps/LPS(类内毒素)缀合物和对于疫苗制剂中包含的每种类毒素(约3.0μg)，注射剂量为约1.0μg；当疫苗制剂含有用于相同或不同的三个一组的携带的Ps/LPS(类内毒素)抗原的组合的类毒素时(广谱疫苗)，剂量变为总蛋白量的约6.0μg；将AlPO4用作固定剂量为0.5mg/剂量(相当于约0.120mg明矾)的佐剂。如通过抑制性ELISA所估计的，每个多价分子构建体对矿物佐剂的吸附以≥80重量％发生。
动物
对于以下报道的每个免疫实验选择的每组动物含有10只雌性Balb/c小鼠。
途径
腹膜内。
免疫时间表
0、2、4周；在第0、2、4、6周出血。
基于高度纯化的Ps抗原在哺乳动物中不具有显著免疫原性并且在重复注射后不“加强”IgG同种型抗体的历史知识，省略了使用普通Ps抗原的对照免疫。
ELISA滴度
滴度表示为对于每个类型特异性Ps/LPS(类内毒素)和两种蛋白质类毒素相对于对照反应显示O.D.≥2.0的终点反应。从1/200稀释开始，以两倍的方式连续进行血清池稀释。
免疫结果
通过ELISA测定鼠血清池中的针对特异性Ps/LPS(类内毒素)或针对两种类毒素中每一种的IgG的几何平均滴度。SD在报告的几何平均值的±25％以内。除非另有说明，血清滴度之间的统计显著性(通过t检验确定)为<0.01。结果总结在下表3和4中。
同源毒素的体内中和
对于白喉毒素如Porro等人(1980)所述进行，对于艰难梭菌毒素如Pavliakova等人(2000)所述进行。
表3显示小鼠对涉及肠类毒素A和细胞类毒素B作为用于大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌的Ps抗原的载体蛋白的分子模型的免疫应答。
表3
表4显示小鼠对涉及肠类毒素A和细胞类毒素B作为用于肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌的LPS/类内毒素抗原的分子模型的免疫应答。
表4
上表3和4中描述的结果显示了对于两种多价分子构建体(类毒素-Ps和类毒素-类内毒素多价缀合物)的四种组分中的每一种的生物学功能性IgG同种型抗体的记忆诱导。
特别地，对于携带的Ps抗原的每一种，平行地观察到辅助T-依赖性抗原的典型和众所周知的行为和针对载体蛋白观察到的对免疫系统的任何增强活性。针对两种类毒素获得的增效作用和诱导的抗类毒素抗体的生物活性还强烈地支持这样的事实，即多价分子构建体具有作为人类抗原的潜力，用于预防由于同源毒素引起的毒性。收集了在第二次加强剂量后获得的血清GMT的以下结果，表示为相对于免疫前滴度的倍数增加，并在下表5中作为抗毒性滴度报告。
表5
虽然只关注一些具体实例，上述详细的结果支持用于在哺乳动物宿主中诱导针对艰难梭菌的载体蛋白肠类毒素A和细胞类毒素B以及针对携带的大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和携带的甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的类内毒素的免疫的广谱肠疫苗的制备和使用。基于上述，根据详细的分子构建体，艰难梭菌的荚膜Ps也可以被认为是由同源病原体的两种类毒素携带的Ps抗原。
如在实施例8和9中报道的广谱疫苗的制剂具有关于疫苗制剂的客观优点，其考虑了两种类毒素蛋白的每一种的六种不同Ps/LPS(类内毒素)缀合物中的每一种的简单和最终的联合：
A)通过使用具有内置多个表位的分子模型，实际上可以减少存在于广谱制剂中的载体蛋白的量(例如：仅使用两个三个一组的缀合物确实将蛋白质载体的量减少至存在于六个缀合物的联合制剂中的载体蛋白的量的1/3或33％)。
B)注射次数将减少到总共3次注射，除了所涉及的哺乳动物宿主的较低应激之外，还明显节省的材料和资源(对于六种个体类型特异性疫苗中的每一种，最少3次注射(一次引发剂量和两次加强剂量)，将导致总共18次注射)。
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Claims (21)

1.由包含共价结合至来自肠致病性细菌的不同血清学特异性的最少三个碳水化合物结构的辅助T-依赖性载体解毒的蛋白的基本单元组成的抗原性多价分子构建体，所述辅助T-依赖性载体解毒的蛋白选自来自艰难梭菌的肠类毒素A和细胞类毒素B，所述碳水化合物结构选自细菌多糖或解毒的脂多糖，其中每个碳水化合物结构包含至少一个由最少5至12个单糖残基组成的重复基本表位，其中至少1摩尔的载体蛋白结合至少1摩尔的所述至少三个碳水化合物结构的每一个或其摩尔总和。
2.权利要求1所述的抗原性多价分子构建体，其中所述肠类毒素A或细胞类毒素B源自通过优选通过福尔马林处理的化学方法或通过DNA重组技术解毒的艰难梭菌的天然同源毒素。
3.前述权利要求1-2中任一项所述的抗原性多价分子构建体，其中携带的所述不同血清学特异性的碳水化合物结构选自伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和艰难梭菌或其组合的荚膜多糖。
4.前述权利要求1-3中任一项所述的抗原性多价分子构建体，其中所述解毒的脂多糖是类内毒素。
5.权利要求1或4所述的抗原性多价分子构建体，其中携带的所述不同血清学特异性的碳水化合物结构选自肠致病性细菌的解毒的脂多糖/类内毒素，所述肠致病性细菌选自伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、宋氏志贺氏菌和猪霍乱沙门氏菌或其组合。
6.权利要求1-5中任一项所述的抗原性多价分子构建体，其选自：
-共价结合至伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌和大肠杆菌的荚膜多糖的肠类毒素A；
-共价结合至伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌和大肠杆菌的荚膜多糖的细胞类毒素B；
-共价结合至肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和痢疾沙门氏菌的解毒的脂多糖/类内毒素的肠类毒素A；
-共价结合至肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和痢疾沙门氏菌的解毒的脂多糖/类内毒素的细胞类毒素B。
7.前述权利要求中任一项所述的抗原性多价分子构建体，其用于疫苗，用于保护受试者免受因选自下述的至少一种肠致病性细菌引起的感染：艰难梭菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌或其组合。
8.一种疫苗制剂，其包含在生理学上可接受的媒介物中的至少一种如权利要求1-6中任一项所定义的抗原性多价分子构建体，任选地与药学上可接受的佐剂或赋形剂一起。
9.权利要求8所述的疫苗制剂，其中每种载体抗原和/或携带的抗原的剂量范围为0.1至100μg，优选为1至10μg。
10.权利要求8-9中任一项所述的疫苗制剂，其中所述佐剂选自：选自磷酸铝、氢氧化铝的矿物佐剂；选自基于角鲨烯的佐剂如MF59、QF21、Addavax的有机佐剂；和选自单磷酰基脂质A和海藻糖二糖霉菌酸的生物佐剂。
11.权利要求8-10中任一项所述的疫苗制剂，其中所述佐剂的量为0.1-1mg/剂量，优选0.5mg/剂量。
12.权利要求8-11中任一项所述的疫苗制剂，所述制剂适于通过皮下、肌内、皮内或经皮途径施用。
13.前述权利要求8-12中任一项所述的广谱多价疫苗制剂，其用于医学人类或兽医领域，用于保护受试者免受由于选自下述的至少一种肠致病性细菌引起的全身性和肠道感染：艰难梭菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、铜绿假单胞菌或其组合。
14.权利要求13所述的用于医学人类或兽医领域的广谱多价疫苗制剂，其中所述受试者属于人类群体。
15.权利要求14所述的用于医学领域的广谱多价疫苗制剂，其用于预防和/或治疗因人诺如病毒引起的病毒性胃肠道感染。
16.一种用于制备权利要求1-6中任一项所述的抗原性多价分子构建体的缀合方法，其包括以下步骤：
a)将至少三个抗原性不同的碳水化合物结构通过经由氧化的O-脱氢解偶联和形成与烷基二胺间隔基的亚胺还原键的还原胺化化学活化至单官能性或多官能性，然后衍生化为活性酯，所述碳水化合物结构选自：
-伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和艰难梭菌的荚膜多糖或
-来自伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、铜绿假单胞菌的脂多糖；
b)通过形成酰胺键将至少三个酯衍生的碳水化合物结构与来自艰难梭菌的多官能性载体蛋白肠类毒素A或细胞类毒素B的氨基同时偶联；
其中至少一摩尔的蛋白质载体与所述抗原性不同的碳水化合物结构中的每一个或其摩尔总数的至少一摩尔反应。
17.权利要求16所述的缀合方法，其中所述碳水化合物结构在其相应的二胺丁酸衍生物中被化学活化，并且活性酯是琥珀酰亚胺酯。
18.一种用于制备权利要求1-6中任一项所述的抗原性多价分子构建体的缀合方法，其包括将来自艰难梭菌的多官能性载体蛋白肠类毒素A或细胞类毒素B的氨基与至少三个抗原性不同的碳水化合物结构经由形成亚胺还原键的还原胺化同时偶联，所述碳水化合物结构选自：
-伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和艰难梭菌的荚膜多糖，或
-来自伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、铜绿假单胞菌的脂多糖；
这样的碳水化合物结构在具有或不具有分子间隔基的情况下通过经由氧化在邻位羟基中的O-脱氢解偶联被在先活化至单官能性或多官能性。
19.权利要求16-18中任一项所述的缀合方法，进一步包括将所述脂多糖解毒的附加步骤，所述解毒可选择地通过a)在进行偶联反应之前或之后切割掉脂质A部分、或b)在进行偶联反应之前或之后通过使用合成的抗内毒素肽(SAEP)的特定策略来饱和脂质A结合位点来进行；
其中至少一摩尔的蛋白质载体与所述抗原性不同的碳水化合物结构中的每一个或其摩尔总数的至少一摩尔反应。
20.权利要求16-19中任一项所述的缀合方法，其中步骤a)的碳水化合物结构包含至少一个由如通过分子质量测定和NMR波谱法测定的最少5至12个单糖残基组成的重复基本表位，所述重复基本表位通过与类型特异性或群特异性多克隆或单克隆抗体的反应性通过测定它们在抑制其同源多糖-抗体参照系统中的各自MIC50值而抗原性地评估。
21.可通过权利要求16-20中任一项所述的缀合方法获得的抗原性多价分子构建体。
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