CN102485274A

CN102485274A - Plga微球作为核酸疫苗载体的制备方法及应用

Info

Publication number: CN102485274A
Application number: CN2010105676968A
Authority: CN
Inventors: 孔维; 吴永革; 陈妍; 周现峰
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2010-12-01
Filing date: 2010-12-01
Publication date: 2012-06-06

Abstract

本发明公开了一种PLGA微球作为基因疫苗载体的制备方法和应用。通过动物免疫实验证实了这种微球可以作为基因疫苗载体。1.微球为核壳结构，表面的聚合物包含聚乙烯亚胺、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、葡聚糖、壳聚糖、聚赖氨酸、FeCl₃和FeCl₂几种聚合物，可以通过静电、疏水相互作用、氢键与核酸疫苗作用，浓缩核酸疫苗成为致密状态，减少其体内降解。2.该微球具有磁性，免疫注射后，在外界强磁场的作用下，增加其在肌肉组织中的分布，弥补与靶细胞接触有限的缺陷。3.长时间强磁场诱导可以导致磁性微球/核酸疫苗复合物到达皮内，皮内含有丰富的抗原提呈细胞，可诱导更快更强有力的免疫反应。

Description

PLGA微球作为核酸疫苗载体的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术免疫制剂领域，涉及疫苗的载体系统及制备方法和应用，特别涉及利用PLGA微球作为基因疫苗载体，诱导强的体液和细胞免疫应答，用于传染性疾病的预防和治疗。

背景技术

基因疫苗既可诱导体液免疫，又可诱导细胞免疫，被称为疫苗的第三次革命。基因疫苗目前已被用来在临床前使用的多种病毒、细菌和寄生虫动物模型中激发保护性抗体和细胞介导的免疫应答，并且在防治癌症、变态反应和自身免疫性疾病方面进行了研究。然而，裸DNA在细胞内外及体内外不稳定，容易被核酸酶降解；其天生的负电荷限制了与负电荷的细胞膜接触而内在化。从而使得基因疫苗的免疫原性低下，需要大量的基因疫苗才能诱导足够的免疫应答。因此现在基因疫苗的瓶颈，就是载体问题。如何能够有效的将抗原基因基因释放到靶细胞内而又较少的产生副作用，即是要解决载体的效率、靶向性和安全性的问题。

目前应用的基因载体主要为病毒载体和非病毒载体，在临床试验研究中，有三分之二采用病毒载体。病毒载体存在诸多缺陷，如具有免疫原性及细胞毒性、缺少组织特异性、对装载外源基因大小有限制、有潜在的致瘤性，以及在重组过程中可产生活性的病毒颗粒等。传统的非病毒载体大部分为多聚阳离子聚合物和脂质体的衍生物，其最大的缺陷是基因转移效率低，尤其在体内。其原因是细胞对核酸的转运是一个扩散限制的过程。除了现在公认的细胞膜、内涵体释放和细胞核转运等三大屏障以外，，其体内应用更主要的屏障来源于：

a、注射剂量的核酸和靶组织靶细胞的有限接触；

b、和体内环境(比如补体系统、调理作用和免疫系统)相互作用快速失活。

这样，需要一种新型的基因载体，可以增强疫苗在体内的扩散能力，辅助抗原基因进入靶细胞，从而提高基因疫苗的免疫原性。

磁微球是有磁响应性的新型药物载体。已经有大量的报道，利用磁微球通过足够强的外磁场引导使负载药物在体内定向移动至靶区，达到提高药物治疗指数，降低药物不良反应。Lubbe等证实了磁微球的安全性和靶向性：他们将铁磁粒子(约100nm)经静脉注人体内后，在肿瘤部位的皮外提供0.8T的恒定磁场进行定位。结果证明：在大约一半的患者中铁磁粒子可成功地到达肿瘤部位，治疗中药物对器官毒性并未增加，也未引起主要检测指标的异常，测不到LD50。

因此，本发明利用磁微球作为基因疫苗的载体，利用其磁响应性的特点，增强了基因疫苗的免疫原性。其原理在于：

1.微球为核壳结构，表面的聚合物包含聚乙烯亚胺(PEI)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、聚赖氨酸(Polylysine)在内的几种聚合物，可以通过静电、疏水相互作用、氢键与核酸疫苗作用，浓缩核酸疫苗成为致密状态，减少其体内降解。

2.免疫注射后，在外界强磁场的作用下，改善其在体内分布区域小的缺陷，增加与靶组织和靶细胞接触的机会。

3.长时间强磁场可以导致磁性微球-核酸疫苗复合物到达皮内，皮内含有丰富的抗原提呈细胞，可诱导更快更强有力的免疫反应。

4.磁转染的快速转染动力学，减少了核酸酶对基因疫苗的降解和对载体的调理素作用，有利于提高基因在细胞中的表达，从而诱导强力的免疫反应。

这种研究基因疫苗佐剂的新思路，到目前为止，在国际上仍旧是独一无二的。

发明内容

本发明将PLGA磁微球包装基因疫苗进行肌肉注射后，结合外加强磁场给药，能够诱导强的体液和细胞免疫应答，能用于传染性疾病的预防和治疗。

本发明的目的是提供了一种用于预防性和治疗性基因疫苗的载体系统及其制备方法及其应用：

(I)具有强磁性的四氧化三铁内核的强磁性的纳米微粒的制备：将FeCl₃和FeCl₂的溶液按照摩尔比1∶2混合(Fe²⁺略微过量)，在氮气氛下，60℃水浴30min后，快速加一定浓度的氨水，恒温继续反应30min。反应完毕后，利用商用永磁铁吸附生成的Fe₃O₄黑色颗粒，倾去上层清液，用高纯水多次洗涤，其反应方程式：Fe²⁺+2Fe³⁺+8OH^-→Fe₃O₄+4H₂O；

向所得到的磁流体沉淀中加入含有聚合物的水溶液，重悬磁流体后放置30min，然后磁分离。重复3次后，定容于pH7.2的PBS中。

(II)聚合物的选择：包含聚乙烯亚胺(PEI)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、聚赖氨酸(Polylysine)等。

(III)磁微球与核酸疫苗的结合：在固定的缓冲体系里(1×TAE)，核酸疫苗的质量恒定，向里面加入不同质量的磁性纳米颗粒，其中磁性纳米颗粒与DNA(w/w)的质量比为大于0小于等于4，4℃放置30min。

经过BALB/c动物实验表明，该给药系统能够显著提高特异性抗体水平，同时Th1型细胞因子的水平也得到相应的提高，并且在低抗原剂量的条件下增强细胞免疫应答(CTL)。

本发明提供的结合了核酸疫苗的磁微球具有以下优点：

(i)在DNA(RNA)/磁性微球中，核酸疫苗以浓缩的状态存在。

(ii)在生理盐水里，DNA(RNA)/磁性微球外观呈黑色的悬浊液；粒径处于亚微米水平，且单分散性好，稳定性好，磁响应性能好。

(iii)表面电势低，细胞毒性小，适用于体内应用。

磁性微球作为基因疫苗载体，成分简单，制备方便，稳定，安全无毒。不仅适用于基因疫苗，也可以适用于负电荷的蛋白疫苗，因此通用性强。可望为传统疫苗、基因疫苗的研究与应用提供一种新型的免疫载体。

附图说明

图1：为本发明采用JEOL JEM-2010透射电子显微镜拍的PLGA磁性颗粒电镜照片：pH＝10、离子强度I＝0.5M、50℃条件下合成的Fe₃O₄纳米颗粒。没有进行染色，是防止遮盖了小粒径的氧化铁纳米粒子的观察。纳米颗粒基本呈现球形的外观，大约在5-15nm左右。

图2：Fe₃O₄纳米颗粒的动态光散射的结果：在pH＝7.2的50mMPBS中显示了一个单峰的尺寸分布，范围在6～25nm，平均粒径10.5nm，符合高斯分布。

图3：Fe₃O₄纳米颗粒的表面Zeta电势的结果。在pH＝7.2的50mMPBS中，该纳米颗粒显示很高的表面电势(77.98±1.27mV)，能够很稳定的单分散存在，适合结合负电荷的基因疫苗或者蛋白疫苗。

图4：纳米磁微球对基因疫苗的体外结合实验。纳米磁微球对DNA的结合采用琼脂糖凝胶电泳进行分析。固定DNA的质量一定(100ng)，改变磁微球/DNA的比例。当磁微球/DNA(w/w)大于3∶1时，DNA完全阻滞于上样孔。

图5：纳米磁微球对基因疫苗的体外结合曲线。通过对电泳的结果进行计算机模拟分析，我们获得了一个S型的体外结合曲线。

图6：毒性试验结果。单纯的磁微球具有一定的细胞毒性，其细胞毒性来源于其较高的表面电势可以和负电荷的细胞表面相互作用，从而导致细胞膜破裂，细胞内容物外泻，从而导致细胞死亡。但是有无磁场这种毒性没有统计上的差别，证明磁场本身没有附加的毒性。和DNA结合后，其毒性急剧降低，来源于其降低的表面电势，有利于体内应用。

图7：纳米磁微球的体外细胞瞬时转染的结果。通过对磁转染的转染动力学进行分析，用GFP(绿色荧光蛋白)作为报告基因。可以得出磁转染的两个优势：1)快速的转染动力学。在10分钟的转染下，磁转染就能达到和正常的化学转染[转染(Lipofectamine2000)和聚合物转染(PEI 25kDa)]同数量级的转染效果；2)加强低剂量下的转染能力。磁转染能够在基因剂量很低的条件下，诱导强的基因表达。

图8：HIV-1 P55 Gag特异性抗体分析。通过ELISA分析，磁转染在三个不同的时间点，三个不同的剂量下，诱导抗体的能力都明显优于未加磁场组和裸DNA直接注射组。磁转染不但能够增强抗体的水平，而且能够在降低的疫苗剂量下诱导强的抗体反应。

图9：HIV-1 P55 Gag特异性CTL分析。通过体外直接BALB/c P815细胞直接杀伤实验(LDH释放)，磁转染在三个不同的时间点，三个不同的剂量下，诱导CTL的能力都明显优于未加磁场组和裸DNA直接注射组。磁转染不但能够增强CTL的水平，而且能够在降低的疫苗剂量下诱导强的CTL反应。

图10：HIV-1 P55 Gag特异性IFN-γ分析。IFN-γ的特异性产生，能够间接的说明细胞免疫的情况。通过ELISPOT分析HIV-1特异性的IFN-γ分泌，磁转染不但能够增强IFN-γ的水平，而且能够在降低的疫苗剂量下诱导强的IFN-γ特异性分泌。

图11：HIV-1特异性抗体分析。通过ELISA分析，磁转染在三个不同的剂量下，诱导抗体的能力都明显优于未加磁场组和裸DNA直接注射组。磁转染不但能够增强抗体的水平，而且能够在降低的疫苗剂量下诱导强的抗体反应。

图12：HIV-1特异性CTL分析。通过体外直接BALB/c P815细胞直接杀伤实验(LDH释放)，磁转染在三个不同的剂量下，诱导CTL的能力都明显优于未加磁场组和裸DNA直接注射组。磁转染不但能够增强CTL的水平，而且能够在降低的疫苗剂量下诱导强的CTL反应。

图13：HIV-1特异性IFN-γ分析。IFN-γ的特异性产生，能够间接的说明细胞免疫的情况。通过ELISPOT分析HIV-1特异性的IFN-γ分泌，磁转染不但能够增强IFN-γ的水平，而且能够在降低的疫苗剂量下诱导强的IFN-γ特异性分泌。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进一步说明。

实施例1

PLGA磁微球的制备

将FeCl₃和FeCl₂的溶液按照摩尔比1∶2混合(Fe²⁺略微过量)，在氮气氛下，60℃水浴30min后，剧烈搅拌下向混合物中快速加入一定质量的氨水，继续在氮气氛下搅拌30min，在反应过程中，始终需要通氮除氧，并剧烈搅拌。反应完毕后，利用商用永磁铁吸附生成的Fe₃O₄黑色颗粒，倾去上层清液，用高纯水多次洗涤。其反应方程式：Fe²⁺+2Fe³⁺+8OH^-→Fe₃O₄+4H₂O

向所得到的磁流体沉淀中加入含有聚合物(PEI，PLGA，壳聚糖或者葡聚糖)的水溶液，重悬磁流体后放置30min，然后磁分离。重复3次后，定容于pH7.2的PBS中，待用。

实施例2

PLGA磁微球的表征

固定体系的pH值和离子强度，利用快速滴加氨水的方法，可以确保Fe₃O₄ 纳米颗粒快速成核，稳定生长，有利于减小纳米颗粒的尺寸分布。利用透射电镜(TEM)可观测纳米颗粒的形貌并确定其尺寸。

如图2所示，Fe₃O₄纳米颗粒单分散性好，粒径分布符合高斯分布；

如图3所示，Fe₃O₄纳米颗粒表面电势呈很高的正电荷，可以结合并浓缩基因疫苗。

实施例3

PLGA磁微球的基因疫苗结合实验

在固定的缓冲体系里(1×TAE)，固定DNA疫苗的质量恒定，向里面加入不同质量的磁性纳米颗粒(w/w＝0.25，0.5～3.0，3.5，4.0)，4℃放置30min后，琼脂糖凝胶电泳的结果来筛选最好的(磁性颗粒/DNA)比例。当磁性纳米颗粒/DNA(w/w)大于3∶1时，DNA完全阻滞于上样孔(如图4)。通过对DNA进行电泳分析并用计算机模拟，可以得出纳米磁微球对基因疫苗的体外结合曲线(如图5)。

实施例4

PLGA磁微球的体外毒性实验

尽管Lubbe等证实了磁微球中磁粒子的安全性，认定磁性颗粒对器官毒性并未增加，也未引起主要检测指标的异常，测不到LD50。我们还是对磁微球的体外细胞毒性进行说明。我们用体外细胞增殖能力来检测了磁微球和磁场对细胞的毒性情况。在未和基因疫苗结合之前，磁微球在高剂量显示了明显的细胞毒性(图6)，我们认为其来源于其高的表面电势。和基因疫苗结合后，其毒性急剧下降(图6)证明了我们的假设，也为磁性微球作为疫苗载体的安全性做了进一步的研究证实。

实施例5

PLGA磁微球的体外细胞瞬时转染

我们用绿色荧光蛋白的质粒作为报告基因。在磁场作用下转染10分钟后，洗涤细胞，换成完全培养基。并用PEI(25kD，支链)和商业化转染试剂Lipofectamine2000作为对照，发现磁微球在磁场作用下可以快速有效的介导外源基因转染细胞(图7)。

实施例6HIV-1基因疫苗/磁微球复合物的免疫原性

(1)免疫动物

HIV-1gag基因疫苗用来免疫BALB/c鼠，设10个实验组(0.1μg，1μg，10μg和100μg裸DNA组，0.1μg，1μg和10μg基因疫苗/磁微球复合物不加磁场组和0.1μg，1μg和10μg基因疫苗/磁微球复合物外加磁场组)和一个阴性对照组，每组5只。采用下肢肌肉单点注射法进行免疫。每两周免疫一次，共免疫3次，每次免疫后一周尾静脉取血，收集血清样本用免疫印迹及ELISA检测抗-P24抗体产生情况。并于最后一次免疫14天后脱臼处死老鼠，提取被免疫和对照鼠的淋巴细胞，分别用CTL、ELISPOT实验进行细胞免疫测定。

(2)体液免疫效果分析

通过免疫印迹和酶联免疫吸附实验(ELISA)测定HIV-1gag基因疫苗/磁微球复合物在动物体内所诱导的抗-P24抗体水平。

以HIV-1的p24蛋白包被96孔板，用间接ELISA法测量不同稀释度血清的OD值，通过OD值来分析抗-P24抗体滴度。

从图8我们可以看出，基因疫苗磁转染后，0.1μg基因疫苗一针免疫后即有抗P24抗体产生；图中还反映出100μg裸DNA组与0.1μg剂量磁转染组在第三针免疫后抗体水平差别并不显著，这说明以0.1μg剂量免疫小鼠已足够引起较强的抗P24的抗体，并且磁转染能够在非常低的剂量下诱导抗体反应。

(3)细胞免疫效果分析

于最后一次免疫14天后脱臼处死老鼠，提取被免疫和对照鼠的淋巴细胞，分别用CTL、ELISPOT实验进行细胞免疫测定。

a.特异性CTL反应。

检测基因疫苗免疫后用磁处理的Balb/c小鼠在体内产生的与CD8+T淋巴细胞相关的特异性CTL反应。免疫后的小鼠脾细胞作为效应细胞，加入与Balb/C小鼠MHC-I类分子特异性结合的短肽P7G(AMQMLKETI)共孵育的P815做为靶细胞；未加P7G-的P815作阴性对照。按一定比例混合上述脾细胞和靶细胞，测定靶细胞P815被裂解的比例，用来表征该疫苗在小鼠体内诱导的特异性CTL反应强度。结果如9。以MHC-I类分子特异性结合的短肽P7G(AMQMLKETI)共孵育的靶细胞P815被裂解的比例进行分析，可以得出结论，基因疫苗/磁微球复合物组(在任何计量下)与空白组相比产生了较强的特异性的CTL反应，加磁场组又明显优于未加磁场组。

b.ELISPOT实验

ELISPOT实验中斑点的个数可以反应在抗原特异性短肽刺激时T细胞分泌IFN-γ的能力，而分泌IFN-γ的能力可以作为测量细胞免疫水平的指标。HIV-1基因疫苗免疫后小鼠淋巴细胞产生对HIV-1相关抗原(如P24)的记忆。用P24中MHC class-I抗原决定簇小肽(AMQMLKETI，对BALB/c小鼠具有特异性)刺激被免疫小鼠脾细胞，应使其分泌细胞因子(如INF-γ)，从而反映出疫苗诱导的与CD8+T淋巴细胞相关的，对HIV-1 P24抗原的特异性细胞免疫反应。因此通过测定被免疫小鼠100万个脾细胞中能分泌INF-γ的淋巴细胞的数量，可以用于表示特异性细胞免疫反应强度。以免疫后的小鼠脾细胞为靶细胞，加入BALB/C小鼠MHC-I类分子特异性的短肽(P7G)作为刺激剂，未加P7G作对照。显色后取膜扫描，显微镜下读取阳性细胞点数，结果如图12所示。可以看出，基因疫苗免疫小鼠后磁处理可以产生较强的细胞免疫，这与CTL结果相吻合。

实施例7HIV-1gp基因疫苗/磁微球复合物的免疫原性

类似的，我们用HIV-1gp基因疫苗用来免疫BALB/c鼠，设10个实验组(0.1μg，1μg，10μg和100μg裸DNA组，0.1μg，1μg和10μg基因疫苗/磁微球复合物不加磁场组和0.μg，1μg和10μg基因疫苗/磁微球复合物外加磁场组)和一个阴性对照组，每组5只。采用下肢肌肉单点注射法进行免疫。每两周免疫一次，共免疫3次，每次免疫后一周尾静脉取血，收集血清样本用ELISA检测抗体产生情况。并于最后一次免疫20天后脱臼处死老鼠，提取被免疫和对照鼠的淋巴细胞，分别用CTL、ELISPOT实验进行细胞免疫测定。

从图11我们可以看出，和HIV基因疫苗磁转染后相似，0.1μg基因疫苗一针免疫后即有抗体产生。CTL结果如图12，可以得出结论，加磁场组与未加磁场组相比产生了较强的特异性的CTL反应。

ELISPOT结果如图13所示，可以看出，基因疫苗免疫小鼠后磁处理可以增强诱导Th1型细胞因子的分泌的能力，这对于乙肝慢性患者打破免疫耐受，意义重大。

Claims

1.PLGA微球作为核酸疫苗载体的应用，其特征包括：

2.权利要求1所述的核酸疫苗，是编码病原体抗原基因的DNA和/或RNA。

3.权利要求2所述的抗原，可以选自但不限于如下病原体：人免疫缺陷病毒、水痘带状疱疹病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、登革病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、脑膜炎病毒、沙门氏菌属(Salmonella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、疏螺旋体属(Borrelia)、衣原体属(Chlamydia)、博德特氏菌属(Bordetella)、链球菌属(Streptococcus)、支原体属(Mycoplasma)、分枝杆菌属(Mycobateria)、嗜血菌属(Haemophilus)、疟原虫属(Plasmodium)或弓形虫属(Toxoplasma)或者肿瘤相关抗原。

4.权利要求1所述的结合了核酸疫苗的磁微球用生理盐水悬浮，调节成1-100ng/ul的微球悬液，即可得注射剂型。

5.权利要求4中的微球悬液，可用作哺乳动物包括人的预防性核酸疫苗。

6.权利要求4中的微球悬液，可用作哺乳动物包括人的治疗性核酸疫苗。