CN103014065A - 一种基因载体材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因载体材料及其制备方法和应用，该基因载体材料为多聚糖6-羟基位接枝多胺形成的聚合物，所述方法包括：(1)将多聚糖用酰化试剂酰化，制备酰化中间体；(2)将所述酰化中间体与多胺反应，获得所述基因载体材料。本发明还公开了所述基因载体材料在制备基因转染体系中的应用。本发明的基因载体材料能被细胞表面的甘露糖受体特异性识别，具有良好的肝脏靶向性；且具有低毒性和较高的基因转染效率；在针对该受体的体内外转染中均具有很好的研究及应用前景。

Description

一种基因载体材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因治疗技术领域，尤其涉及一种基因载体材料及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的的生物医学技术。纠正的途径可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。

自1990年第一例基因治疗的尝试后，基因疗法在肿瘤、免疫缺陷疾病、AIDS等难以攻克的疾病中多有研究及应用。基因疗法多依靠固定的基因转染体系将所需要的目的基因转染至目标细胞中以表达所需产物。基因转染体系主要有病毒载体转染体系和非病毒载体转染体系，客观来讲，两种体系都有自身的优缺点。

病毒载体转染体系以其转染的高效性在当前的研究中有着广泛的应用。但是随着研究的深入，在临床应用及研究中，病毒载体的安全性越来越遭受怀疑，病毒载体在应用中出现的免疫源性、组织富集性等问题以及在临床试验中出现的严重副反应使研究者的目光开始转向另一种转染体系——非病毒载体转染体系。

非病毒转染体系以其存在较低的毒性和免疫原性、较容易合成获取而为研究者所青睐，但是低下的转染效率是非病毒载体无法逾越的瓶颈，使得非病毒载体在基因治疗中的应用受到了极大的限制。

因此，基因治疗中，载体的安全性和合成载体的低运转效率等问题是目前的主要局限。

肝脏疾病是临床常见病、多发病，严重危害人体健康。肝脏主要由肝实质细胞（PC）、窦状上皮细胞（SEC）、枯否细胞（KC）、肝星状细胞（HSC）组成，其中占肝细胞约20%的SEC细胞和占肝细胞约15%的KC细胞表面都大量表达甘露糖受体。

甘露糖受体是一类广泛存在于抗原呈递细胞表面的受体，其功能表现在抗原呈递细胞（APC）的抗原呈递和T细胞传递上。甘露糖受体属于C型凝集素家族，是一类钙依赖型的受体，该受体含多糖识别的结构域（Carbohyrate Recognition Domain，CRD），主要有存在于巨噬细胞表面的巨噬细胞甘露糖受体CD206，存在于Langerhans细胞上的Langerin(CD207)，存在于树突状细胞上的DC-SIGN（Dendritic cell specificICAM-3 grabbing non-integrin），以及存在于肝窦内表皮细胞上的甘露糖受体。针对树突状细胞上的特异性受体DC-SIGN，研究表明甘露糖对其有特异性结合，且其结合程度随着寡糖链的增加而增加。

针对肝脏疾病的治疗方案是需基于高治疗指数和肝脏靶向的给药系统，为了实现肝脏靶向的给药要求，构建能传递至肝细胞内的基因传递系统为当务之急。

发明内容

本发明提供了一种基因载体材料，该基因载体材料能被细胞表面的甘露糖受体特异性识别，具有良好的肝脏靶向性；且毒性低，基因转染效率高。

一种基因载体材料，它为多聚糖6-羟基位接枝多胺形成的聚合物。

若无特殊说明，本发明所述多聚糖6-羟基位是指多聚糖分子中各个单糖的6-羟基位。

为能被细胞表面的甘露糖受体特异性识别，所述多聚糖优选为壳聚糖、葡甘露聚糖或甘露聚糖。多聚糖的分子量优选为10~200kDa，该分子量范围之外的多聚糖长度不适宜，会降低基因载体材料的转染效率。

多胺分子具有带正电荷的氨基，有利于与具有带负电荷的磷酸基的DNA或RNA结合，从而增强所述基因载体材料携带基因的能力，提高基因转染效率。

本发明所述多胺优选为精胺、亚精胺或腐胺，这些化合物在生物体中发挥重要功能，毒性较低。所述多胺的接枝率优选为6~27%。

本发明还提供了所述基因载体材料的制备方法，包括：

（1）将多聚糖用酰化试剂酰化，制备酰化中间体；

（2）将所述酰化中间体与多胺反应，获得所述基因载体材料。

由于多胺难以直接与羟基反应而接枝到多聚糖上，因此，本发明利用酰化试剂对多聚糖6-羟基位进行酰化，再通过酰化的羟基与多胺反应，制备所述基因载体材料。所述酰化试剂优选为羰基二咪唑、二环已基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺。

优选地，步骤（1）和（2）中的反应均在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选为三氯甲烷、四氢呋喃或二甲基亚砜。有机溶剂能将反应原料、反应中间体、反应产物充分溶解并形成均一稳定溶液，提供良好的反应环境，促使反应进行完全。

其中，步骤（1）中，所述酰化试剂与多聚糖中活性羟基的摩尔比优选为3:1~18:1；所述酰化的反应时间为10~60min，反应温度为25~60℃。合理的酰化时间及温度保证了多聚糖的酰化程度。

步骤（2）中，所述多胺与酰化试剂的摩尔比优选为1:1~3:1；反应时间为12~48h，反应温度为25~60℃。较长的反应时间保证了反应充分进行。

经步骤（2）反应获得的反应物经透析纯化后即获得所述的基因载体材料。为维持较高的活性，优选将该基因载体材料低温冻干并保存在0~4℃下，冻干后的固体型基因载体材料经复溶后也能在4℃下保存较长时间。

本发明还提供了所述基因载体材料在制备基因转染体系中的应用，所述应用包括：

将所述基因载体材料与目的基因混合，经孵育后制备得到所述基因转染体系。

所述基因载体材料与基因的氮磷比优选为1:1~40:1，在这一比例范围内，所述基因载体材料能充分结合DNA，从而达到携载基因的效果。

为达到更好的孵育效果，所述基因载体材料与基因加到缓冲液中进行混合，所述缓冲液优选为pH为7.2~7.4的磷酸缓冲液。所述孵育的时间为10~30min，合理的孵育时间确保了所述基因转染体系的形成。

所述基因转染体系可加入到细胞中，完成目的基因在细胞内的转染；也可直接注射到动物体内，完成目的基因的肝脏靶向累积。

所述细胞优选为细胞表面的甘露糖受体较高表达的细胞，更优选为肝肿瘤细胞、巨噬细胞、树突状细胞中至少一种。所述转染时间优选为24~48h。不同氮磷比下结合获得的所述基因转染体系在不同细胞内的转染效率会有所差异。

所述基因转染体系对动物体种类无过多限制，优选为C57/BL6小鼠、BALB/c小鼠、DBA/2小鼠中的一种，靶向累积时间优选为1~4h。不同氮磷比下结合获得的所述基因转染体系都能将基因特异靶向动物肝脏，但效果会有所差异。

本发明基因载体材料适用于包括编码虫荧光素酶、绿色荧光蛋白、半乳糖苷酶等报告基因在内的功能基因，也适用于其他各种实验所需的功能基因及功能性信使RNA、小干扰RNA等。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明的制备方法操作简便，采用的反应试剂及得到的产物无毒无污染，且成本低廉，具有较好的推广性；反应中无须加入特殊的催化剂，反应条件温和，副产物少且纯化简单；能通过改变试剂比例控制反应产物的接枝效率，具有良好的可控性；可广泛应用于科学研究及生产；

（2）本发明的基因载体材料能被细胞表面的甘露糖受体特异性识别，具有良好的肝脏靶向性；且具有低毒性和较高的基因转染效率；在针对该受体的体内外转染中均具有很好的研究及应用前景。

附图说明

图1为甘露聚糖的红外光谱图；

图2为本发明基因载体材料的红外光谱图；

图3为甘露聚糖的核磁共振氢谱图；

图4为精胺的核磁共振氢谱图；

图5为本发明基因载体材料的核磁共振氢谱图；

图6为不同氮磷比下结合的基因转染体系的肝脏靶向效果图；

图7为不同氮磷比下结合的基因转染体系对HepG2细胞的转染效率图；

图8为不同氮磷比下结合的基因转染体系对树突状细胞DC2.4的转染效率图；

图9为不同氮磷比下结合的基因转染体系对HepG2细胞的毒性评价图；

图10为不同氮磷比下结合的基因转染体系对树突状细胞DC2.4的毒性评价图；

图11为竞争抑制剂存在下HepG2细胞对基因转染体系的摄取率对比图。

具体实施方式

实施例1制备基因载体材料

（1）基因载体材料的制备

1）将25mg甘露聚糖（平均分子量为100kDa）溶解于13mL无水二甲基亚砜中，60℃搅拌至完全溶解；加入213mg的羰基二咪唑酰化30min，得到酰化的甘露聚糖溶液；

2）将798mg的精胺溶解于15mL无水二甲基亚砜中，缓缓加入酰化的甘露聚糖溶液，在室温下搅拌反应18h；

3）收集产物，以分子量为8000-12000WM透析袋透析48h，冻干成白色固定后置于4℃保存。

（2）元素分析

取获得的基因载体材料进行元素分析测试，结果如表1所示。计算可得精胺的接枝率为12.07%。

表1基因载体材料的元素分析表

（3）红外光谱分析

将甘露聚糖固体、本发明基因载体材料分别与溴化钾以质量比1:10于玛瑙研钵中研细混匀，进行红外光谱分析，获得两者的透光率，结果分别如图1与图2所示。

图1所示的为甘露聚糖的红外光谱图，图2所示的为基因载体材料的红外光谱图。图1中甘露聚糖的特征峰：特征氢键缔合的v_OH=3399.41cm^-1强宽峰变为图2中v_NH、v_OH=3383.98cm^-1的强尖峰，特征氢键缔合的v_C=O=1652.21cm^-1的变为游离的酰胺v_C=O=1701.39cm^-1，表明精胺已成功接枝到甘露聚糖上。推导其结构式如下所示：

其中A为精胺基团，n为自然数。

（4）核磁共振分析

将甘露聚糖、精胺与本发明基因载体材料分别溶于氘代水中，用核磁共振测定仪测定三种材料的质子化学位移，结果分别如图3、图4、图5所示。结果表明本发明基因载体材料已经成功合成。

实施例2肝脏靶向积累实验

（1）基因转染体系的制备

利用实施例1中获得的基因载体材料制备基因转染体系，具体步骤如下：

1）将基因载体材料用超纯水配制成浓度为4mg/mL的溶液，再经磷酸缓冲液（pH 7.4）分别稀释至浓度为0.236mg/mL、0.586mg/mL、1.172mg/mL；

2）将异硫氰酸酯标记的DNA用磷酸缓冲液（pH 7.4）配制成浓度为0.2mg/mL的溶液；

3）将步骤1）中的各稀释溶液分别与步骤2）的DNA溶液等体积混合（基因载体材料与基因的氮磷比分别为2:1、5:1、10:1），室温下孵育15min，制备得基因转染体系；

4）将获得的基因转染体系用磷酸缓冲液（pH 7.4）稀释5倍，备用。

（2）小鼠肝脏靶向积累实验

将基因转染体系通过尾静脉注射的方式注射入C57BL6小鼠体内，注射剂量为每只小鼠0.2mL。1h后取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏于荧光活体成像仪中观察。结果如图6所示，各注射小鼠中，高密度的荧光（红色）均集中在肝脏部位，表明各个氮磷比下结合获得的基因转染体系都能将基因特异性靶向到肝脏。

实施例3基因转染效率及毒性评价实验

（1）制备基因转染体系

利用实施例1中获得的基因载体材料制备基因转染体系，具体步骤如下：

1）将基因载体材料用超纯水配制成浓度为4mg/mL的溶液，再经磷酸缓冲液（pH 7.4）分别稀释至浓度为0.059mg/mL、0.293mg/mL、0.411mg/mL、0.587mg/mL、1.174mg/mL、1.761mg/mL的溶液；

2）将编码虫荧光素酶的质粒pGl3-Control用磷酸缓冲液（pH 7.4）配制成浓度为0.1mg/mL的溶液；

3）将步骤1）中的各稀释溶液分别与步骤2）的质粒溶液等体积混合（基因载体材料与基因的氮磷比分别为1:1、3:1、5:1、7:1、10:1、20:1、30:1），室温下孵育15min，制备得基因转染体系；

4）将获得的基因转染体系用磷酸缓冲液（pH 7.4）稀释5倍，备用。

实施例4基因转染效率及毒性评价实验

下面以HepG2细胞和树突状细胞DC2.4为例，对本发明基因载体材料制备的基因转染体系的基因转染效率和细胞毒性进行评价。

（1）基因转染效率评价实验

下面以HepG2细胞为例，详细介绍试验步骤。步骤如下：

1）将HepG2细胞以5×10⁴个/孔接种在24孔板上（树突状细胞DC2.4的细胞浓度为1×10⁵个/孔），置于5%CO₂培养箱内，37℃下培养24h；

2）除去培养液，以磷酸缓冲液（pH 7.4）清洗两次，加入0.5mL不含胎牛血清的DMEM高糖培养液，加入实施例3中制备的基因转染体系溶液，每孔0.1mL，于培养箱内孵育6h；

3）更换含质量分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，继续培养18h；

4）除去培养液，以磷酸缓冲液（pH 7.4）清洗两次，每孔加入0.2mL报告基因细胞裂解液，室温下静止30min；

5）吸取0.1mL清液，加入0.1mL虫荧光素酶底物于化学发光仪下测定各实验组的相对光强度；

6）配制浓度为0.5mg/mL的蛋白质水溶液，用蒸馏水分别稀释至浓度25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，300μg/mL，400μg/mL，500μg/mL，以每孔20μL加入到96孔板中，每孔再加入200μL BCA工作液，595nm紫外测吸光度，绘标准曲线；

7）取实验组各孔上清液20μL，加入200μL BCA工作液于595nm紫外光测吸光度，利用标准曲线计算蛋白质浓度。

8）用以下公式计算HepG2细胞的虫荧光素酶活性，结果如图7所示。

树突状细胞DC2.4的虫荧光素酶活性检测结果如图8所示。

结果表明，当用基因载体材料与目的基因以氮磷比1:1~10:1结合获得的基因转染体系处理HepG2细胞或DC2.4细胞时，细胞内虫荧光素酶活性随氮磷比的增大而升高，当氮磷比为20:1时，细胞内虫荧光素酶活性保持不变。

（2）毒性评价实验

下面以HepG2细胞为例，详细介绍试验步骤。步骤如下：

1）将HepG2细胞以1×10⁴个/孔接种在96孔板上（树突状细胞DC2.4的细胞浓度为2×10⁴个/孔），置于5%CO₂培养箱内，37℃下培养24h；

2）除去培养液，以磷酸缓冲液（pH 7.4）清洗两次，加入0.1mL不含胎牛血清的DMEM高糖培养液，加入实施例3中制备的基因转染体系溶液，每孔0.02mL，于培养箱内孵育6h；

3）更换含质量分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，继续培养18h；

4）每孔加入20μL四甲基偶氮唑蓝溶液（浓度5mg/mL）孵育4h；

5）吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振摇10min，在酶标仪上于570nm下测定光密度值（OD值）。

6）按以下公式计算HepG2细胞生存百分率以评价细胞毒性，结果如图9所示。

树突状细胞DC2.4的生存百分率检测结果如图10所示。

结果表明，经在各氮磷比下结合获得的基因转染体系处理的HepG2细胞和树突状细胞DC2.4存活率均较高。

通过基因转染效率与细胞毒性评价实验表明，利用本发明基因载体材料合成的基因转染体系对甘露糖受体较高表达的细胞均具有较高的基因转染效率，且对受体细胞毒性较低，安全性良好。

实施例4细胞摄取竞争性实验

（1）制备基因转染体系

1）将基因载体材料用超纯水配制成浓度为4mg/mL的溶液，再经磷酸缓冲液（pH 7.4）分别稀释至浓度为0.411mg/mL；

2）将异硫氰酸酯标记的DNA用磷酸缓冲液（pH 7.4）稀释成浓度为0.1mg/mL的溶液；

3）将步骤1）中的稀释溶液与步骤2）的DNA溶液等体积混合（基因载体材料与基因的氮磷比为3:1），室温下孵育15min，制备得基因转染体系；

4）将获得的基因转染体系用磷酸缓冲液（pH 7.4）稀释5倍，备用。

（2）肝肿瘤细胞HepG2上的摄取竞争性实验

1）将HepG2细胞以1×10⁵个/孔接种在24孔板上，置于5%CO₂培养箱内，37℃下培养24h；

2）除去培养液，以磷酸缓冲液（pH 7.4）清洗两次，分别加入0.5mL浓度为40mM、20mM、10mM的D-甘露糖、D-半乳糖的不含胎牛血清的DMEM高糖培养液和不加任何单糖的不含胎牛血清的DMEM高糖培养液（作为阳性对照组），在培养箱内孵育30min；

3）加入步骤（1）中制备的基因转染体系溶液，每孔0.1mL，于培养箱内孵育2h；

4）除去培养液，以磷酸缓冲液（pH 7.4）清洗三次，每孔加入0.2mL的报告基因细胞裂解液，室温下静止30min；

5）吸取0.1mL清液，于荧光488nm激发波长下测定细胞内绿色荧光强度，按以下公式计算细胞摄取异硫氰酸酯标记的DNA的百分含量。结果如图10所示。

结果显示，培养液中加入D-甘露糖的实验组中，HepG2细胞摄取的异硫氰酸酯标记的DNA的量随D-甘露糖浓度减小而增加，但都比阳性对照要少。而添加了D-半乳糖的实验组中，HepG2细胞对异硫氰酸酯标记的DNA的摄取无影响，与阳性对照相当。

表明本发明制备的基因载体材料确实通过甘露糖受体特异性结合到HepG2细胞表面，并将基因转染到受体细胞中，且该过程可以被同源糖类D-甘露糖而非D-半乳糖竞争抑制，说明本发明的基因载体材料与细胞表面结合具有受体特异性。

Claims (10)

1.一种基因载体材料，其特征在于，它为多聚糖6-羟基位接枝多胺形成的聚合物。

2.如权利要求1所述的基因载体材料，其特征在于，所述多聚糖为壳聚糖、葡甘露聚糖或甘露聚糖。

3.如权利要求2所述的基因载体材料，其特征在于，所述多聚糖的分子量为10～200kDa。

4.如权利要求1所述的基因载体材料，其特征在于，所述多胺为精胺、亚精胺或腐胺。

5.如权利要求1所述的基因载体材料，其特征在于，所述多胺的接枝率为6～27％。

6.一种权利要求1～5任一所述基因载体材料的制备方法，其特征在于，包括：

(1)将多聚糖用酰化试剂酰化，制备酰化中间体；

(2)将所述酰化中间体与多胺反应，获得所述基因载体材料。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酰化试剂为羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酰化试剂与多聚糖中活性羟基的摩尔比为3∶1～18∶1；所述酰化的反应时间为10～60min，反应温度为25～60℃。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述多胺与酰化试剂的摩尔比为1∶1～3∶1；反应时间为12～48h，反应温度为25℃～60℃。

10.如权利要求1～5任一所述基因载体材料在制备基因转染体系中的应用。

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