CN102181464A - 一种改性葡聚糖转基因载体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改性葡聚糖转基因载体及其制备方法，其中采用既有伯胺又有仲胺的小分子，通过先保护分子的伯胺，将仲胺与葡聚糖分子侧链反应，将整个小分子通过化学键链接到葡聚糖主链上，最后再将保护的伯胺集团还原，最终使葡聚糖分子与同时带有伯胺与仲胺的小分子键接（伯胺与仲胺都带有正电）。这一改性有效改善葡聚糖作为转基因载体的效率和性能，可作为高效靶向非病毒基因载体用于基因治疗，实现提高葡聚糖载体基因转染效率，延长体内循环时间的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种转基因载体及其制备方法，更具体地说，涉及一种改性葡聚糖转基因载体及其制备方法。
背景技术
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。应用于基因治疗的载体主要有病毒载体(viral vector)和非病毒载体(nonviral vector)两种。病毒载体在基因治疗中取得了一些突破性进展，但是在临床应用过程中，其免疫原性和潜在致癌性等仍然是其难以克服的重大隐患。非病毒载体作为基因递送的另一条途径，被人们广泛研究，包括裸DNA、脂质体、阳离子高聚物等。
阳离子高聚物作为非病毒载体的一种，它既存在非病毒载体的特点(即低毒性，低免疫原性和低致癌性)，还有自身的优势——易于制备和携带目的基因能力高，这些更加有利于其作为转基因载体的应用。常见的阳离子高聚物能够通过强静电作用能够有效缩合DNA，形成的聚电解质复合物(PECs)较为稳定。这些PECs易于细胞内化，从内涵体中逃逸，并能保护DNA免受DNA酶的降解。因此，阳离子高聚物成为非病毒基因载体的重要组成部分，但是阳离子高聚物作为基因载体应用时，仍呈现出了一些问题，例如生物相容性差、有毒性、生物降解性低以及转染效率低等。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生物相容性好、毒性小、稳定性高的阳离子高聚物作为非病毒型转基因载体进行使用。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备上述阳离子高聚物的方法。
本发明的目的还在于提供一种上述阳离子高聚物的应用。
本发明的上述目的通过下述技术方案予以实现。
本发明的改性葡聚糖转基因载体，以葡聚糖分子为主链，取代基为氢原子或者NH2(CH2)n1NH(CH2)n2NH2，n1为1-5，n2为1-5，其分子式如下：
其中n1优选1-3，更优选为3，n2优选1-3，更优选为3。葡聚糖数均分子量优选为四万。
一种制备改性葡聚糖转基因载体的方法，按照下述步骤进行：利用三氟乙酸乙酯对小分子修饰剂的伯胺进行保护，然后将葡聚糖、伯胺受到保护的小分子修饰剂和N，N’-羰基二咪唑混合均匀反应，使小分子修饰剂通过仲胺连接到葡聚糖的羟基上，最后对受到保护的伯胺进行脱保护，最终使葡聚糖分子与小分子修饰剂键接，即得到改性葡聚糖转基因载体。
在上述制备方法中，所述小分子修饰剂是既有伯胺又有仲胺的小分子，分子式为NH2(CH2)n1NH(CH2)n2NH2，其中n1为1-5，n2为1-5。n1优选1-3，更优选为3，n2优选1-3，更优选为3，如二氨基二丙基胺。
在上述制备方法中，利用三氟乙酸乙酯对小分子修饰剂的伯胺进行保护时，一般在80～90℃下进行回流反应至少24小时，以保证伯胺的保护效果；此外，反应体系使用的溶剂为极性溶剂，如水、乙腈。
在上述制备方法中，将葡聚糖、小分子修饰剂和N，N’-羰基二咪唑混合均匀反应时，一般在60～90℃下反应至少24小时，葡聚糖的用量大于小分子修饰剂，以保证小分子修饰剂能够键接到葡聚糖分子上；同时为保证反应的效率，小分子修饰剂与N，N’-羰基二咪唑的摩尔比是1∶1或者小分子修饰剂稍过量；可以选择在反应结束后，采用透析方式进行提纯；此外，反应体系使用的溶剂可为极性溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)。
在上述制备方法中，采用溶液体积为25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，然后将产物在70-80℃下悬蒸，并且在去离子水中透析，冻干，即得到改性葡聚糖转基因载体。
本发明使用的葡聚糖具有可生物降解性和较好的生物相容性，其主链由α-1，6配糖链及少量的α-1，3配糖链作为支链，并且易溶于水和电解质溶液中。它可以吸附在红细胞和血小板表面，增加它们的电负性，于是降低红细胞的团聚。阳离子化的葡聚糖可以提高它的这种效率，所以，可以在葡聚糖上面接一些其他小分子而使其带有正电，使葡聚糖阳离子化，阳离子化的葡聚糖能够通过强静电作用有效缩合DNA，形成的聚电解质复合物较稳定。阳离子化的葡聚糖易于细胞内化，能保护DNA免受DNA酶的降解，从而进入细胞内，然后释放DNA。在小分子的选择上，本发明采用既有伯胺又有仲胺的小分子(即NH2(CH2)n1NH(CH2)n2NH2，n1为1-5，n2为1-5)，通过先保护分子的伯胺，将仲胺与葡聚糖分子侧链反应，将整个小分子通过化学键链接到葡聚糖主链上，最后再将保护的伯胺集团还原，最终使葡聚糖分子与同时带有伯胺与仲胺的小分子键接(伯胺与仲胺都带有正电)。用400MHz高分辨超导核磁共振仪Varian UNITY plus-400检测样品氢谱，可知图中a(δ＝2.8)、b(δ＝2.6)、c(δ＝1.7)处特征峰的存在，证实了通过葡聚糖的羟基与仲胺反应，将小分子(如二氨基二丙基胺)引入到葡聚糖分子链上。
本发明的改性葡聚糖可作为阳离子高聚物，当作转基因载体进行使用，这一改性有效改善葡聚糖作为转基因载体的效率和性能，可作为高效靶向非病毒基因载体用于基因治疗，实现提高葡聚糖载体基因转染效率，延长体内循环时间的作用。
附图说明
图1是葡聚糖-二氨基二丙基胺的核磁谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。下面实施例中使用的葡聚糖数均分子量是四万(Dextran T-40)，小分子修饰剂选用二氨基二丙基胺，N，N’-羰基二咪唑(CDI)
实施例1：
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与乙腈加入烧杯中，并将二氨基二丙基胺全部溶解，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
取三只10ml离心管，分别将葡聚糖、三氟二氨基二丙基胺、CDI用DMSO溶解，其中，葡聚糖(1mmol，162mg)、三氟二氨基二丙基胺(3mmol，0.9697g)、CDI(3mmol，486mg)用DMSO的量分别为1ml、4ml、5ml。然后，取50ml圆底烧瓶，将葡聚糖和三氟二氨基二丙基胺的溶液加入其中，再把CDI加入上述溶液中，在80℃下反应24小时后用去离子水透析三天，再用溶液体积25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，将反应产物进行悬蒸，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。1H-NMR分析产物结构：二氨基二丙基胺接枝率约为24％。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成Dextran-DPA/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.31×107RLU/mg protein。
实施例2：
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与乙腈加入烧杯中，并将二氨基二丙基胺全部溶解，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
取三只10ml离心管，分别将葡聚糖、三氟二氨基二丙基胺、CDI用DMSO溶解，其中，葡聚糖(1mmol，162mg)、三氟二氨基二丙基胺(6mmol，1.939g)、CDI(3mmol，486mg)用DMSO的量分别为1ml、4ml、5ml。然后，取50ml圆底烧瓶，将葡聚糖和三氟二氨基二丙基胺的溶液加入其中，再把CDI加入上述溶液中，在80℃下反应24小时后用去离子水透析三天，再用溶液体积25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，将反应产物进行悬蒸，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。1H-NMR分析产物结构：二氨基二丙基胺接枝率约为26％。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成Dextran-DPA/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.35×107RLU/mg protein。
实施例3：
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与乙腈加入烧杯中，并将二氨基二丙基胺全部溶解，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
取三只10ml离心管，分别将葡聚糖、三氟二氨基二丙基胺、CDI用DMSO溶解，其中，葡聚糖(1mmol，162mg)、三氟二氨基二丙基胺(9mmol，2.909g)、CDI(3mmol，486mg)用DMSO的量分别为1ml、6ml、5ml。然后，取50ml圆底烧瓶，将葡聚糖和三氟二氨基二丙基胺的溶液加入其中，再把CDI加入上述溶液中，在80℃下反应24小时后用去离子水透析三天，再用溶液体积25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，将反应产物进行悬蒸，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。1H-NMR分析产物结构：二氨基二丙基胺接枝率约为31％。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成Dextran-DPA/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.42×107RLU/mg protein。
实施例4：
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与乙腈加入烧杯中，并将二氨基二丙基胺全部溶解，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
取三只10ml离心管，分别将葡聚糖、三氟二氨基二丙基胺、CDI用DMSO溶解，其中，葡聚糖(1mmol，162mg)、三氟二氨基二丙基胺(3mmol，0.9697g)、CDI(6mmol，972mg)用DMSO的量分别为1ml、6ml、5ml。然后，取50ml圆底烧瓶，将葡聚糖和三氟二氨基二丙基胺的溶液加入其中，再把CDI加入上述溶液中，在80℃下反应24小时后用去离子水透析三天，再用溶液体积25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，将反应产物进行悬蒸，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。1H-NMR分析产物结构：二氨基二丙基胺接枝率约为34％。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成Dextran-DPA/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.54×107RLU/mg protein。
实施例5：
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与乙腈加入烧杯中，并将二氨基二丙基胺全部溶解，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
取三只10ml离心管，分别将葡聚糖、三氟二氨基二丙基胺、CDI用DMSO溶解，其中，葡聚糖(1mmol，162mg)、三氟二氨基二丙基胺(6mmol，1.939g)、CDI(6mmol，972mg)用DMSO的量分别为1ml、4ml、5ml。然后，取50ml圆底烧瓶，将葡聚糖和三氟二氨基二丙基胺的溶液加入其中，再把CDI加入上述溶液中，在80℃下反应24小时后用去离子水透析三天，再用溶液体积25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，将反应产物进行悬蒸，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。1H-NMR分析产物结构：二氨基二丙基胺接枝率约为37％。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成Dextran-DPA/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.68×107RLU/mg protein。
实施例6：
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与乙腈加入烧杯中，并将二氨基二丙基胺全部溶解，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
取三只10ml离心管，分别将葡聚糖、三氟二氨基二丙基胺、CDI用DMSO溶解，其中，葡聚糖(1mmol，162mg)、三氟二氨基二丙基胺(9mmol，2.909g)、CDI(6mmol，972mg)用DMSO的量分别为1ml、4ml、5ml。然后，取50ml圆底烧瓶，将葡聚糖和三氟二氨基二丙基胺的溶液加入其中，再把CDI加入上述溶液中，在80℃下反应24小时后用去离子水透析三天，再用溶液体积25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，将反应产物进行悬蒸，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。1H-NMR分析产物结构：二氨基二丙基胺接枝率约为42％。
将得到的最终产物1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成Dextran-DPA/DNA复合物，复合质量比为25/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.88×107RLU/mg protein。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，例如采用其他的小分子修饰剂如NH2(CH2)2NH(CH2)2NH2、NH2(CH2)3NH(CH2)2NH2、NH2CH2NH(CH2)2NH2，溶剂可以选用DMF，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种改性葡聚糖转基因载体，其特征在于，分子式如下：
R＝H或NH2(CH2)n1NH(CH2)n2NH2
其中以葡聚糖分子为主链，取代基R为氢原子或者NH2(CH2)n1NH(CH2)n2NH2，n1为1-5，n2为1-5。
2.根据权利要求1所述的一种改性葡聚糖转基因载体，其特征在于，所述n1为1-3，所述n2为1-3。
3.根据权利要求2所述的一种改性葡聚糖转基因载体，其特征在于，所述n1为3，所述n2为3。
4.一种制备改性葡聚糖转基因载体的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：利用三氟乙酸乙酯对小分子修饰剂的伯胺进行保护，然后将葡聚糖、伯胺受到保护的小分子修饰剂和N，N’-羰基二咪唑混合均匀反应，使小分子修饰剂通过仲胺连接到葡聚糖的羟基上，最后对受到保护的伯胺进行脱保护，最终使葡聚糖分子与小分子修饰剂键接，即得到改性葡聚糖转基因载体。
5.根据权利要求4所述的一种一种制备改性葡聚糖转基因载体的方法，其特征在于，所述小分子修饰剂是既有伯胺又有仲胺的小分子，分子式为NH2(CH2)n1NH(CH2)n2NH2，其中n1为1-5，n2为1-5。
6.根据权利要求5所述的一种一种制备改性葡聚糖转基因载体的方法，其特征在于，所述n1为1-3，所述n2为1-3。
7.根据权利要求4所述的一种一种制备改性葡聚糖转基因载体的方法，其特征在于，利用三氟乙酸乙酯对小分子修饰剂的伯胺进行保护时，一般在80～90℃下进行回流反应至少24小时，以保证伯胺的保护效果。
8.根据权利要求4所述的一种一种制备改性葡聚糖转基因载体的方法，其特征在于，将葡聚糖、小分子修饰剂和N，N’-羰基二咪唑混合均匀反应时，一般在60～90℃下反应至少24小时，葡聚糖的用量大于小分子修饰剂，以保证小分子修饰剂能够键接到葡聚糖分子上；同时为保证反应的效率，小分子修饰剂与N，N’-羰基二咪唑的摩尔比是1∶1或者小分子修饰剂稍过量；在反应结束后，采用透析方式进行提纯。
9.根据权利要求4所述的一种一种制备改性葡聚糖转基因载体的方法，其特征在于，采用溶液体积为25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，然后将产物在70-80℃下悬蒸，并且在去离子水中透析，冻干，即得到改性葡聚糖转基因载体。10.如权利要求1所述的改性葡聚糖转基因载体作为非病毒类转基因载体的应用。
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