CN102277369B - 一种改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体，以聚羟乙基丙烯酰胺为骨架结构，聚羟乙基丙烯酰胺的侧链取代基R为NH2(CH2)n1N(CH2)n2NH2，n1为1-5，n2为1-5。在制备过程中，先利用原子转移自由基聚合制备聚羟乙基丙烯酰胺，然后利用三氟乙酸乙酯对小分子修饰剂的伯胺进行保护，再将其接到聚羟乙基丙烯酰胺，最后脱保护即得到转基因子载体。阳离子化的聚羟乙基丙烯酰胺易于细胞内化，能保护DNA免受DNA酶的降解，从而进入细胞内，然后释放DNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种转基因载体及其制备方法，更具体地说，涉及一种改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体及其制备方法。
背景技术
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。应用于基因治疗的载体主要有病毒载体(viral vector)和非病毒载体(nonviral vector)两种。病毒载体在基因治疗中取得了一些突破性进展，但是在临床应用过程中，其免疫原性和潜在致癌性等仍然是其难以克服的重大隐患。非病毒载体作为基因递送的另一条途径，被人们广泛研究，包括裸DNA、脂质体、阳离子高聚物等。
阳离子高聚物作为非病毒载体的一种，它既存在非病毒载体的特点(即低毒性，低免疫原性和低致癌性)，还有自身的优势--易于制备和携带目的基因能力高，这些更加有利于其作为转基因载体的应用。常见的阳离子高聚物能够通过强静电作用能够有效缩合DNA，形成的聚电解质复合物(PECs)较为稳定。这些PECs易于细胞内化，从内涵体中逃逸，并能保护DNA免受DNA酶的降解。因此，阳离子高聚物成为非病毒基因载体的重要组成部分，但是阳离子高聚物作为基因载体应用时，仍呈现出了一些问题，例如生物相容性差、有毒性、生物降解性低以及转染效率低等。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生物相容性好、毒性小、稳定性高的阳离子高聚物作为非病毒型转基因载体进行使用。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备上述阳离子高聚物的方法。
本发明的目的还在于提供一种上述阳离子高聚物的应用。
本发明的上述目的通过下述技术方案予以实现。
本发明的一种改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体，以聚羟乙基丙烯酰胺为骨架结构，聚羟乙基丙烯酰胺的侧链取代基R为NH2(CH2)n1N(CH2)n2NH2，n1为1-5，n2为1-5，其分子式如下：
其中n1优选1-3，更优选为3，n2优选1-3，更优选为3；n为羟乙基丙烯酰胺的聚合度。
本发明的一种制备改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体的方法，按照下述步骤进行：
(1)先将单体和催化剂氯化亚铜溶解在溶剂中，在除氧和除湿的条件下，再将配体N，N，N’，N”，N”-五甲基二乙基三胺和引发剂配体α-溴异丁酸乙酯加入体系中，进行原子转移自由基聚合反应，将反应产物进行透析和冻干，即得聚羟乙基丙烯酰胺；
(2)将步骤(1)制备的聚羟乙基丙烯酰胺、无水氯化锂、三乙胺和对甲苯磺酰氯放入溶剂中进行反应，待反应结束后，提取产物；
(3)利用三氟乙酸乙酯对小分子修饰剂的伯胺进行保护，然后将步骤(2)制备的产物、伯胺受到保护的小分子修饰剂和三乙胺混合均匀反应，使小分子修饰剂通过仲胺连接到步骤(2)制备的产物上，最后对受到保护的伯胺进行脱保护，即得到改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体。
在进行原子转移自由基聚合时，催化剂氯化亚铜和配体N，N，N′，N″，N″-五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)的摩尔比在(1-1.5)∶(1-1.5)；催化剂氯化亚铜和引发剂配体α-溴异丁酸乙酯的摩尔比在(1-1.5)∶(1-1.5)；在反应时，可以通过增加单体用量、延长反应时间的方式提高单体的聚合度n，一般聚合度n为5-150，优选50-150，可以根据单体和引发剂的摩尔比例计算理论聚合度，在聚合反应后根据核磁共振谱图中聚合前双键、聚合后单键两处的积分面积计算聚合度：[聚合后单键峰积分面积/(聚合前双键峰积分面积+聚合后单键峰积分面积)]×理论聚合度；所述反应时间优选至少8小时，更加优选8-24小时；聚合时的反应温度可以是室温(即20-25℃)，也可根据该聚合反应的需要适宜提高温度至30℃以上，优选40-80℃，更加优选60-80℃；为保证聚合的效果，整个反应系统需要除氧和除湿，因此需要通入惰性气体(例如氮气、氦气、氩气)进行排氧并维持在聚合过程中系统的无氧；还可以选择Schlenk反应管，在加入反应物后，用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气和水份。
原子转移自由基聚合反应后，反应体系中一般留有非反应产物组份，因此需要进行提纯，故可选择将反应产物在去离子水中透析(即提纯)，冻干即得所得产物。
在上述步骤(2)中，聚羟乙基丙烯酰胺、无水氯化锂、三乙胺、对甲苯磺酰氯反应以使对甲苯磺酰氯能够接到聚羟乙基丙烯酰胺上，其中无水氯化锂和三乙胺的摩尔比在(1-1.5)∶(1-1.5)，聚羟乙基丙烯酰胺的用量大于对甲苯磺酰氯的用量以促使更多的对甲苯磺酰氯连接到聚羟乙基丙烯酰胺上，所述反应时间优选至少20小时，更加优选20-48小时；所述反应温度为5-25℃，优选8-25℃，更加优选20-25℃；待结束后，可用先用冰水沉淀，然后用去离子水和异丙醇冲洗，即得聚羟乙基丙烯酰胺-对甲苯磺酰氯。
在上述制备方法中，所述小分子修饰剂是既有伯胺又有仲胺的小分子，分子式为NH2(CH2)n1NH(CH2)n2NH2，其中n1为1-5，n2为1-5。n1优选1-3，更优选为3，n2优选1-3，更优选为3，如二氨基二丙基胺。
在上述制备方法中，利用三氟乙酸乙酯对小分子修饰剂的伯胺进行保护时，一般在80～90℃下进行回流反应至少24小时，以保证伯胺的保护效果；此外，反应体系使用的溶剂为极性溶剂，如水、乙腈；在反应之后，可用二氯甲烷冲洗，先除去上清液，然后在乙酸乙酯中重结晶进行提纯。
在上述制备方法中，将步骤(2)制备的产物(即聚羟乙基丙烯酰胺PHEAA与对甲苯磺酰氯TsCl的接枝产物)、小分子修饰剂和三乙胺混合均匀反应时，一般在60～90℃下反应至少24小时，优选75-85℃。其中步骤(2)制备的产物的用量大于小分子修饰剂，以保证小分子修饰剂能够键接到分子上；同时为保证反应的效率，小分子修饰剂与三乙胺的摩尔比是1∶1或者小分子修饰剂稍过量；可以选择在反应结束后，采用透析方式进行提纯；此外，反应体系使用的溶剂可为极性溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)。
在上述制备方法中，采用溶液体积百分数为25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，然后将产物在70-80℃下悬蒸，并且在去离子水中透析，冻干，即得到改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体。
本发明使用的聚羟乙基丙烯酰胺具有可生物降解性和较好的生物相容性，并且易溶于水和电解质溶液中。阳离子化的聚羟乙基丙烯酰胺可以提高其效率，所以，可以在聚羟乙基丙烯酰胺上面接一些其他小分子而使其带有正电，使其阳离子化，阳离子化的聚羟乙基丙烯酰胺能够通过强静电作用有效缩合DNA，形成的聚电解质复合物较稳定。阳离子化的聚羟乙基丙烯酰胺易于细胞内化，能保护DNA免受DNA酶的降解，从而进入细胞内，然后释放DNA。在小分子的选择上，本发明采用既有伯胺又有仲胺的小分子(即NH2(CH2)n1NH(CH2)n2NH2，n1为1-5，n2为1-5)，通过先保护分子的伯胺，将仲胺与聚羟乙基丙烯酰胺分子侧链反应，将整个小分子通过化学键链接到聚羟乙基丙烯酰胺主链上，最后再将保护的伯胺集团还原，最终使聚羟乙基丙烯酰胺分子与同时带有伯胺与仲胺的小分子键接(伯胺与仲胺都带有正电)。
利用400MHz高分辨超导核磁共振仪Varian UNITY plus-400检测样品氢谱，由附图1-3所示：(1)从附图1核磁谱图中8.124ppm(聚合前双键)和7.745ppm(聚合后单键)两处峰说明已经成功制备聚羟乙基丙烯酰胺，根据这两处的积分面积可计算HEAA聚合度；(2)从附图2核磁谱图可看出5.0ppm处的羟基峰在反应之后已经没有了，说明对甲苯磺酰氯(TsCl)已经接到聚羟乙基丙烯酰胺(PHEAA)上；(3)从附图3中可以看出，化学位移2.78、1.83、2.93三处的峰值分别代表了小分子修饰剂(即NH2(CH2)n1NH(CH2)n2NH2，n1为3，n2为3)中的三种碳上的氢原子，说明小分子修饰剂已经接枝到聚合物上。
本发明的改性聚羟乙基丙烯酰胺可作为阳离子高聚物，当作转基因载体进行使用，这一改性有效改善聚羟乙基丙烯酰胺作为转基因载体的效率和性能，可作为高效靶向非病毒基因载体用于基因治疗，实现提高聚羟乙基丙烯酰胺载体基因转染效率，延长体内循环时间的作用。由附图4所示的凝胶电泳图，从左到右依次是：第一道是裸DNA，第二道到第九道复合质量比依次是1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，可以看出聚合物与质粒在1∶1的情况下就完全复合住了，充分说明了改性后的聚羟乙基丙烯酰胺载体已经接上了小分子修饰剂，并能有效实现转染。
附图说明
图1是聚羟乙基丙烯酰胺的核磁共振谱图。
图2是聚羟乙基丙烯酰胺-对甲苯磺酰氯的核磁共振谱图。
图3是本发明的改性聚羟乙基丙烯酰胺的核磁共振谱图。
图4是PGL3质粒与改性聚羟乙基丙烯酰胺复合后的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
将单体HEAA(5mmol，575.5mg)和催化剂CuCl(9.9mg，0.1mmol)加入Schlenk管中，用5mL乙醇/水溶液溶解。用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将引发剂PMDETA(21ml，0.1mmol)和配体EBMP(15ml，0.1mmol)溶解于1ml乙醇/水溶液中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真空密封，在60℃水浴中搅拌反应10小时，用去离子水稀释反应产物，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。即可得到聚羟乙基丙烯酰胺(PHEAA，理论聚合度为50)；
称取PHEAA(5mmol，575mg)和无水氯化锂(5mmol，约212mg)用20mlN，N-二甲基乙酰胺(DMAC)溶解，在8℃下，分别将11ml三乙胺和对甲苯磺酰氯(TsCl，40mmol，7.626g)用11ml和15ml的DMAC溶解，并且分别将溶液滴入PHEAA和无水氯化锂的溶液中，并在8℃下反应48小时；反应结束后，先用600ml冰水沉淀，然后用200ml的去离子水冲洗2-3次，再用200ml异丙醇冲洗3次左右；即得PHEAA-g-TsCl；
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与15ml乙腈加入烧杯中，并与二氨基二丙基胺混合均匀，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
将PHEAA-g-TsCl(540mg)和三氟二氨基二丙基胺(1.584mg)用二甲基亚砜(DMSO，20ml)溶解，并加入5ml三乙胺，在80℃，通氮气的条件下反应72小时，将所得产物聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-三氟二氨基二丙基胺用透析袋(截留分子量为3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析3天；用溶液体积的25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，然后将产物在80℃下悬蒸，并且在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天冻干，即得到聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-二氨基二丙基胺(PHEAA-g-DPA)。
将得到的最终产物PHEAA-g-DPA 1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成PHEAA-g-DPA/DNA复合物，复合质量比为8/1，静置30分钟后，将复合物溶液分别加入到已培养至指数生长期的COS-7和HepG-2细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：COS-7为1.21×107RLU/mg protein；HepG-2为0.97×106RLU/mg protein。
实施例2
将单体HEAA(10mmol，1.151g)和催化剂CuCl(9.9mg，0.1mmol)加入Schlenk管中，用8mL乙醇/水溶液溶解。用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将配体PMDETA(21ml，0.1mmol)和引发剂EBMP(15ml，0.1mmol)溶解于1ml乙醇/水溶液中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真空密封，在60℃水浴中搅拌反应10小时，用去离子水稀释反应产物，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。即可得到聚羟乙基丙烯酰胺(PHEAA，理论聚合度为100)；
称取PHEAA(5mmol，575mg)和无水氯化锂(5mmol，约212mg)用20mlN，N-二甲基乙酰胺(DMAC)溶解，在8℃下，分别将11ml三乙胺和对甲苯磺酰氯(TsCl，40mmol，7.626g)用11ml和15ml的DMAC溶解，并且分别将溶液滴入PHEAA和无水氯化锂的溶液中，并在8℃下反应48小时；反应结束后，先用600ml冰水沉淀，然后用200ml的去离子水冲洗2-3次，再用200ml异丙醇冲洗3次左右；即得PHEAA-g-TsCl；
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与15ml乙腈加入烧杯中，并与二氨基二丙基胺混合均匀，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
将PHEAA-g-TsCl(540mg)和三氟二氨基二丙基胺(1.584mg)用二甲基亚砜(DMSO，20ml)溶解，并加入5ml三乙胺，在80℃，通氮气的条件下反应72小时，将所得产物聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-三氟二氨基二丙基胺用透析袋(截留分子量为3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析3天；用溶液体积的25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，然后将产物在80℃下悬蒸，并且在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天冻干，即得到聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-二氨基二丙基胺(PHEAA-g-DPA)。
将得到的最终产物PHEAA-g-DPA 1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成PHEAA-g-DPA/DNA复合物，复合质量比为8/1，静置30分钟后，将复合物溶液分别加入到已培养至指数生长期的COS-7和HepG-2细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：COS-7为1.35×107RLU/mg protein；HepG-2为1.01×106RLU/mg protein
实施例3：
将单体HEAA(15mmol，1.7265g)和催化剂CuCl(9.9mg，0.1mmol)加入Schlenk管中，用11mL乙醇/水溶液溶解。用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将配体PMDETA(21ml，0.1mmol)和引发剂EBMP(15ml，0.1mmol)溶解于1ml乙醇/水溶液中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真空密封，在60℃水浴中搅拌反应10小时，用去离子水稀释反应产物，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。即可得到聚羟乙基丙烯酰胺(PHEAA，理论聚合度为150)；
称取PHEAA(5mmol，575mg)和无水氯化锂(5mmol，约212mg)用20mlN，N-二甲基乙酰胺(DMAC)溶解，在8℃下，分别将11ml三乙胺和对甲苯磺酰氯(TsCl，40mmol，7.626g)用11ml和15ml的DMAC溶解，并且分别将溶液滴入PHEAA和无水氯化锂的溶液中，并在8℃下反应48小时；反应结束后，先用600ml冰水沉淀，然后用200ml的去离子水冲洗2-3次，再用200ml异丙醇冲洗3次左右；即得PHEAA-g-TsCl；
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与15ml乙腈加入烧杯中，并与二氨基二丙基胺混合均匀，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
将PHEAA-g-TsCl(540mg)和三氟二氨基二丙基胺(1.584mg)用二甲基亚砜(DMSO，20ml)溶解，并加入5ml三乙胺，在80℃，通氮气的条件下反应72小时，将所得产物聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-三氟二氨基二丙基胺用透析袋(截留分子量为3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析3天；用溶液体积的25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，然后将产物在80℃下悬蒸，并且在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天冻干，即得到聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-二氨基二丙基胺(PHEAA-g-DPA)。
将得到的最终产物PHEAA-g-DPA 1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成PHEAA-g-DPA/DNA复合物，复合质量比为8/1，静置30分钟后，将复合物溶液分别加入到已培养至指数生长期的COS-7和HepG-2细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：COS-7为1.42×107RLU/mg protein；HepG-2为1.20×106RLU/mg protein
实施例4：
将单体HEAA(20mmol，2.302g)和催化剂CuCl(9.9mg，0.1mmol)加入Schlenk管中，用14mL乙醇/水溶液溶解。用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将配体PMDETA(21ml，0.1mmol)和引发剂EBMP(15ml，0.1mmol)溶解于1ml乙醇/水溶液中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真空密封，在60℃水浴中搅拌反应10小时，用去离子水稀释反应产物，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。即可得到聚羟乙基丙烯酰胺(PHEAA，理论聚合度为200)；
称取PHEAA(5mmol，575mg)和无水氯化锂(5mmol，约212mg)用20mlN，N-二甲基乙酰胺(DMAC)溶解，在8℃下，分别将11ml三乙胺和对甲苯磺酰氯(TsCl，40mmol，7.626g)用11ml和15ml的DMAC溶解，并且分别将溶液滴入PHEAA和无水氯化锂的溶液中，并在8℃下反应48小时；反应结束后，先用600ml冰水沉淀，然后用200ml的去离子水冲洗2-3次，再用200ml异丙醇冲洗3次左右；即得PHEAA-g-TsCl；
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与15ml乙腈加入烧杯中，并与二氨基二丙基胺混合均匀，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
将PHEAA-g-TsCl(540mg)和三氟二氨基二丙基胺(1.584mg)用二甲基亚砜(DMSO，20ml)溶解，并加入5ml三乙胺，在80℃，通氮气的条件下反应72小时，将所得产物聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-三氟二氨基二丙基胺用透析袋(截留分子量为3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析3天；用溶液体积的25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，然后将产物在80℃下悬蒸，并且在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天冻干，即得到聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-二氨基二丙基胺(PHEAA-g-DPA)。
将得到的最终产物PHEAA-g-DPA 1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成PHEAA-g-DPA/DNA复合物，复合质量比为8/1，静置30分钟后，将复合物溶液分别加入到已培养至指数生长期的COS-7和HepG-2细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：COS-7为3.58×107RLU/mg protein；HepG-2为1.51×106RLU/mg protein
实施例5：
将单体HEAA(30mmol，3.453g)和催化剂CuCl(9.9mg，0.1mmol)加入Schlenk管中，用17mL乙醇/水溶液溶解。用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除去反应体系中的氧气。将配体PMDETA(21ml，0.1mmol)和引发剂EBMP(15ml，0.1mmol)溶解于1ml乙醇/水溶液中，在氮气保护下用注射器转移到Schlenk管中。反应混合物经过反复冻融三次后，真空密封，在60℃水浴中搅拌反应10小时，用去离子水稀释反应产物，再用透析袋(截留分子量3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天后冻干。即可得到聚羟乙基丙烯酰胺(PHEAA，理论聚合度为300)；
称取PHEAA(5mmol，575mg)和无水氯化锂(5mmol，约212mg)用20mlN，N-二甲基乙酰胺(DMAC)溶解，在8℃下，分别将11ml三乙胺和对甲苯磺酰氯(TsCl，40mmol，7.626g)用11ml和15ml的DMAC溶解，并且分别将溶液滴入PHEAA和无水氯化锂的溶液中，并在8℃下反应48小时；反应结束后，先用600ml冰水沉淀，然后用200ml的去离子水冲洗2-3次，再用200ml异丙醇冲洗3次左右；即得PHEAA-g-TsCl；
取50ml圆底烧瓶，将三氟乙酸乙酯(ρ＝1.11g/ml，3.5g，约3.15ml)与水(152ml)加入烧瓶中，搅拌均匀，然后取25ml烧杯，将二氨基二丙基胺(ρ＝0.938g/ml，0.922g，约990ml)与15ml乙腈加入烧杯中，并与二氨基二丙基胺混合均匀，加入三氟乙酸乙酯的水溶液中，在85℃条件下，进行回流反应24小时，所得产物先每次用大约150ml左右的二氯甲烷冲洗三次，然后再用乙酸乙酯冲洗，最后进行干燥保存产物，即得三氟二氨基二丙基胺。
将PHEAA-g-TsCl(540mg)和三氟二氨基二丙基胺(1.584mg)用二甲基亚砜(DMSO，20ml)溶解，并加入5ml三乙胺，在80℃，通氮气的条件下反应72小时，将所得产物聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-三氟二氨基二丙基胺用透析袋(截留分子量为3500)在去离子水中透析，8小时换一次水，透析3天；用溶液体积的25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，然后将产物在80℃下悬蒸，并且在去离子水中透析，8小时换一次水，透析5天冻干，即得到聚羟乙基丙烯酰胺-接枝-二氨基二丙基胺(PHEAA-g-DPA)。
将得到的最终产物PHEAA-g-DPA 1mg溶于1ml超纯水中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成PHEAA-g-DPA/DNA复合物，复合质量比为8/1，静置30分钟后，将复合物溶液分别加入到已培养至指数生长期的COS-7和HepG-2细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：COS-7为5.23×107RLU/mg protein；HepG-2为1.62×106RLU/mg protein
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，例如采用其他的小分子修饰剂如NH2(CH2)2NH(CH2)2NH2、NH2(CH2)3NH(CH2)2NH2、NH2CH2NH(CH2)2NH2，溶剂可以选用DMF，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体，其特征在于，以聚羟乙基丙烯酰胺为骨架结构，聚羟乙基丙烯酰胺的侧链取代基R为NH2(CH2)n1N(CH2)n2NH2，n1为3，n2为3，n为50-150，其分子式如下：
2.一种制备如权利要求1所述的改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
(1)先将单体和催化剂氯化亚铜溶解在乙醇/水溶液中，在除氧和除湿的条件下，再将配体N，N，N’，N”，N”-五甲基二乙基三胺和引发剂配体α-溴异丁酸乙酯加入体系中，进行原子转移自由基聚合反应，将反应产物进行透析和冻干，即得聚羟乙基丙烯酰胺；
(2)将步骤(1)制备的聚羟乙基丙烯酰胺、无水氯化锂、三乙胺和对甲苯磺酰氯放入N，N-二甲基乙酰胺中进行反应，待反应结束后，提取产物；
(3)利用三氟乙酸乙酯对二氨基二丙基胺的伯胺进行保护，保护时是在乙腈中进行的；然后将步骤(2)制备的产物、伯胺受到保护的二氨基二丙基胺和三乙胺混合均匀进行反应，所述反应在二甲基亚砜中进行的，使二氨基二丙基胺通过仲胺连接到步骤(2)制备的产物上，最后对受到保护的伯胺进行脱保护，即得到改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体。
3.根据权利要求2所述的制备改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体的方法，其特征在于，在步骤(1)中，催化剂氯化亚铜和配体N，N，N′，N″，N″-五甲基二乙烯基三胺的摩尔比在(1-1.5)∶(1-1.5)；催化剂氯化亚铜和引发剂配体α-溴异丁酸乙酯的摩尔比在(1-1.5)∶(1-1.5)，所述反应时间为10小时，反应温度为60℃。
4.根据权利要求2所述的制备改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体的方法，其特征在于，在步骤(2)中，无水氯化锂和三乙胺的摩尔比为(1-1.5)∶(1-1.5)，聚羟乙基丙烯酰胺的用量大于对甲苯磺酰氯的用量以促使更多的对甲苯磺酰氯连接到聚羟乙基丙烯酰胺上，所述反应时间至少20小时，所述反应温度为5-25℃。
5.根据权利要求2所述的制备改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体的方法，其特征在于，在步骤(3)中，利用三氟乙酸乙酯对二氨基二丙基胺的伯胺进行保护时，在80～90℃下进行回流反应至少24小时；采用溶液体积百分数为25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护。
6.根据权利要求2所述的制备改性聚羟乙基丙烯酰胺转基因载体的方法，其特征在于，在步骤(3)中，将步骤(2)制备的产物、伯胺受到保护的二氨基二丙基胺和三乙胺混合均匀反应，步骤(2)制备的产物的用量大于二氨基二丙基胺，二氨基二丙基胺与三乙胺的摩尔比是1∶1或者二氨基二丙基胺稍过量，在60～90℃下反应至少24小时。
7.如权利要求1所述的改性聚羟基丙烯酰胺转基因载体在基因转染领域中的应用。
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