CN102028941A - 一种b群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法。系采用搭桥PCR构建含有B群脑膜炎球菌V1变异型全长FHBP蛋白和V2变异型的位于C结构域的一段抗原表位的融合基因片段,克隆入pET30a(+)载体后,IPTG诱导表达,表达产物经层析柱纯化,获得的融合蛋白纯度达到90%以上。该融合蛋白在经SDS-PAGE及Western鉴定分析、蛋白含量等测定后作为半成品疫苗。根据半成品疫苗蛋白浓度,以生理盐水稀释至150mg/ml,同时与氢氧化铝佐剂制成所需的B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。免疫小鼠后,能引起较高的FHBP特异抗体和血清杀菌抗体,显示该疫苗能对B群脑膜炎球菌起到较好的预防作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,更具体的说,本发明涉及一种B群脑膜炎重组蛋白嵌合疫苗。同时,本发明还涉及所述疫苗的制备方法。
背景技术
流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是由奈瑟氏脑膜炎球菌(Nesseria meningitidis)引起的急性呼吸道传染病,流脑是细菌性脑脊髓膜炎中唯一能造成流行的疾病,引起相当高的病死率和致残率。流脑呈世界范围分布,全世界流脑的平均年发病率为1~10/10万,在流行地区流行期间其年发病率可达500/10万以上。流脑从病原体的发现至今已超过100年,目前在世界上许多国家仍未能得到有效控制,仍是世界范围的一个严重公共健康问题。
脑膜炎疫苗是全球儿童常规接种的细菌性疫苗之一。目前,该类疫苗的使用形式主要是采取多糖或者多糖结合蛋白疫苗两种形式。由于A、C、W、Y群多糖疫苗的应用,有效地降低了脑脊髓膜炎的发病率。而 B群脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis group B, MenB)荚膜多糖结构因与人体神经细胞黏附分子同源,而不能激发有效的保护性免疫,因此其多糖不能有效预防B群脑膜炎奈瑟菌的感染。因此,发展通用的蛋白质疫苗势在必行。
能作为候选疫苗的具有免疫原性的蛋白质需具备以下特点:在大多数菌株中都表达且结构保守;可诱生杀菌抗体或保护性抗体。现有技术中,研制与应用的有B群外膜囊泡(OMV)疫苗,其主要包括单价的VA-MENGOC-BC(古巴)、MenBvac(挪威)、MENZBTM(新西兰),以及荷兰研制出的6价 PorA OMV疫苗,此类疫苗有其局限性,只能保护特定型别的B群Nm。瑞士诺华公司(Novartis)研制的5CVMB疫苗三种主要的抗原为GNA2132、GNA1870、NadA,另外的两种抗原为GNA1030、GNA2091,但是此类疫苗也具有菌株的保护性差异。另外诺华公司研制的FHBP蛋白疫苗,方法是对FHBP进行氨基酸的替换和删除,已经开始二期临床试验。
当前,国内外B群Nm疫苗研究主要集中于一些特别的外膜蛋白上。其中脑膜炎球菌外膜上,与脑膜炎球菌致病性密切相关的FHBP(Factor H-binding Protein),是一外膜脂蛋白。由于具有较高的保守性成为了最有希望的MenB候选疫苗抗原之一。FHBP即为为H因子结合蛋白。因子H是补体替代途径的关键调节子,它在因子I介导的C3b裂解为灭活片段iC3b过程中发挥辅助因子作用。也促进替代途径C3转化酶C3bBb 的衰变。FHBP和因子H结合可下调替代途径,从而有利于脑膜炎奈瑟菌生存。根据FHBP氨基酸的差异,可以将MenB分为V1、V2、V3三个FHBP变异型,变异型内高度保守而变异型间差异较大,针对FHBP的抗体在变异型内具有保护作用。分析FHBP氨基酸序列发现,FHBP包含有三个结构域ABC,A结构域在三个变型中是一致的,抗V1的抗体由B结构域诱导产生,而抗V2或V3的抗体由位于C结构域174-216位的氨基酸诱导产生。因此,由V1变异型的全长FHBP和V2变异型位于C结构域的一段抗原表位组成的融合蛋白(FHBP-C2)能诱发机体产生针对所有MenB的保护性抗体。
本发明利用基因工程的手段,构建表达纯化了一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。此融合蛋白(FHBP-C2)大小约为37KD,能诱导机体产生高效价的抗体,并且此抗体能诱发补体依赖的杀菌反应。另外,由于该蛋白能在大肠杆菌中表达,例如BL21,因而有利于大规模培养制备。
发明内容
本发明的目的在于针对现实状况的迫切需要,利用基因工程的手段,提供一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。同时,本发明还提供一种所述重组蛋白嵌合疫苗的制备方法。该方法所建立的质粒的构建、蛋白的分离纯化方法,可以制备数种脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。
本发明的目通过下述技术方案予以实现。
* 除非另有说明,本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
A.本发明提供了一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗,该疫苗由下列成分组成:含有基因工程表达并纯化的B群脑膜炎球菌FHBP融合蛋白75000μg / ml,氢氧化铝佐剂1mg / ml。
其中,①B群脑膜炎球菌FHBP融合蛋白由B群脑膜炎球菌FHBP蛋白V1变异型全长氨基酸序列和V2变异型位于C结构域的一段抗原表位通过Gly-Pro-Gly连接肽融合而成;② 按照FHBP蛋白的趋异性可以将B群脑膜炎球菌分为三个变异型,该重组蛋白疫苗是由变异型V1的全长FHBP与变异型V2的位于174-216位的一段氨基酸(C2)连接而成,中间是一段连接肽Gly-Pro-Gly。
该疫苗选自下述任一氨基酸序列:① SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;②在严谨的杂交条件下与编码① 的氨基酸酸序列杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列;SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列,克隆入pET30a(+)载体后,导入大肠杆菌BL21, IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western鉴定分析,镍离子亲和层析柱纯化,获得的融合蛋白,该融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明对所述的B群脑膜炎球菌蛋白嵌合疫苗进行了蛋白含量的检测,检测结果如下:
半成品蛋白含量 >50000μg/ml;
成品蛋白含量为75mg/ml;
杀菌力试验:杀菌抗体滴度达到1:32。
B.本发明提供了一种所述的B群脑膜炎球菌蛋白嵌合疫苗的制备方法,该方法采用下述顺序的步骤:
(1)采用基因工程的方法,搭桥PCR构建含有V1的全长FHBP和V2变异型的位于C结构域的一段抗原表位的融合基因片段,中间是一段连接肽基因,即为SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列,克隆入pET30a(+)载体后,IPTG诱导表达;
(2)表达产物经SDS-PAGE及Western鉴定分析,镍离子亲和层析柱纯化,获得的蛋白纯度达到90%以上;分子量的大小约为37kD,可以判定为FHBP-C2融合蛋白,具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;该抗原组分在测定蛋白含量后作为半成品疫苗;
(3)根据半成品疫苗蛋白浓度,以生理盐水稀释至150mg/ml,同时与AL(OH)3以对倍(V/V)混合,制成实验性蛋白疫苗,并对其进行检测;其半成品蛋白含量〉50000μg/ml,成品蛋白含量为75mg/ml;该疫苗即为所需的脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。
本发明所提出的质粒的构建、蛋白的分离纯化方法还可用于制备数种脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。
与现有技术相比,本发明具有下述突出的优点:
(1)保护率高: 本发明研制的B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗,虽然仅含有FHBP-C2一个免疫原性的强的蛋白亚单位,但是具有抗三个变异型菌株的抗原表位,因此可以诱发机体产生针对所有MenB的保护性抗体。
(2)有效性高:将本发明研制的人用脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗免疫小鼠,ELISA结果检测显示本蛋白疫苗能够产生很高的抗体效价。充分说明本蛋白疫苗由于含有一个免疫原性较强的蛋白亚单位,因此能够诱导机体产生较强的免疫应答效果。
(3)安全性好:该融合蛋白相对分子质量相对较小,只保留了具有抗原性的蛋白亚单位;因此副反应大大降低,具有更好的安全性。
附图说明
图1是PCR产物的电泳图谱;图中泳道1表示成功扩增出目的基因FHBP,大小约为750bp 。
图2是酶切产物的电泳图谱;图中泳道1、2表明融合基因FHBP-C2成功的克隆到了表达载体pET-30-a上,大小约为900bp 。
图3是第二峰3号管的SDS-PAGE(14%)电泳图谱,出现一条带,大小为37KD。
图4 是3号管的Western Blot结果,采用脑膜炎球菌诊断血清作为一抗,可见出现一条特异性条带,根据电泳中条带位置的分子量的大小,可明确为FHBP-C2融合蛋白。
图5是血清IgG的效价图,两次免疫血清IgG滴度15849,实验组小鼠的抗体水平较PBS对照组有显著性差异(P<0.05),转阳率达到100%。证明FHBP-C2能后有效地诱导机体产生特异性的IgG抗体。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明作进一步详细说明。应当理解,所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明,并不用于限定本发明的保护范围。
实施例1
—— 基因工程菌的构建
采用基因工程的方法,搭桥PCR构建含有B群脑膜炎球菌V1变异型全长FHBP蛋白和V2变异型的位于C结构域的一段抗原表位的融合基因片段,中间是一段连接肽基因,即为SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列,克隆入pET30a(+)载体后,转化大肠杆菌DH5α菌株。单克隆扩增,提质粒用BamHⅠ/EcoR I双酶切鉴定,筛选阳性克隆,测序。经鉴定序列准确,融合基因成功的克隆到pET-30-a中。将测序正确的重组质粒pET30-a- FHBP-C2转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取单克隆,接种于5ml LB培养基,37℃培养过夜。再以1%接种量接种到5ml LB培养基中,OD600值达0.4~0.6时,加入IPTG至终浓度100mg/ml,诱导后每小时取样,14%SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况,结果显示诱导剂浓度达到100mg/ml,诱导时间为6个小时,蛋白表达量最高,选取表达量最高的的单菌落作为发酵用的工程菌种子。
实施例2
——发酵方法
将高表达的工程菌接种到五个三角瓶(每个瓶中300mlLB培养基),过夜培养,至OD值达到1.2时,接种到含15L LB培养基的发酵罐中,优化发酵条件,控制PH在7.0,连续培养约4小时,溶氧控制在20%—30%,每过一个小时测其PH和OD值,并通过补加浓氨水调节PH,OD值达到2时,逐级补料,OD值达到4.5时左右时,开始加诱导剂15ml,诱导后6个小时开始收菌。
实施例3
——目的蛋白的纯化
将表达优势菌株发酵扩大培养,收集菌体超声破菌。分别用TE+300mMNacl,TE+1%Triton-x-100,TE+3M尿素依次洗涤,然后先后过CM离子柱和Q-HP离子柱,纯度达90%以上,经SDS-PAGE电泳分析以及Wesrernblot,分子量的大小约为37kD,确定目的蛋白是FHBP-C2融合蛋白。其具SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,目的蛋白经TE+5%甘油+50mMNacl溶液(PH8.0)透析24h复性,超滤浓缩;该抗原组分在测定蛋白含量后作为半成品疫苗。如表1所示,处理后的包涵体液先后过CM柱和Q-HP柱后,采用试管共收集到三个峰。
实施例4
——实验性重组蛋白嵌合疫苗的制备
根据半成品疫苗蛋白浓度,以生理盐水稀释至150mg/ml,同时与AL(OH)3以对倍(V/V)混合,制成实验性蛋白疫苗,该疫苗即为所需的B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。
本发明对所述的B群脑膜炎球菌蛋白嵌合疫苗进行蛋白含量的检测,检测结果如下:
其半成品蛋白含量 > 50000μg/ml;
成品蛋白含量为75mg/ml;
杀菌力试验:杀菌抗体滴度达到1:32。
实施例5
——基因工程菌的构建b
根据GenBank中登录的脑膜炎球菌FHBP以及合成的基因C2以及SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列设计两对引物:
P1: GGATCCCTGACCACTGCCCTGATTC
P2: GCCCGGGCCGGCAACTTCCTGGGCTTG
P3: TTCAACGGGGCCCGGGCGCCAAACAG
P4: GAATTCGCTGCCGTAGCGCGTGTC
本发明的C2是人工合成的,是变异型V2的具有免疫效应的一段抗原表位,它位于FHBP的C结构域,因此命名为C2。以Men B基因组为模板,以P1和P2为上下游引物PCR扩增目的基因(FHBP),预变性94℃ 5min,98℃ 10 s,59℃ 30s,72℃ 1 min,共35个循环。1%琼脂糖电泳,回收目的片段(FHBP)。然后以此目的片段(FHBP)和合成的基因C2为模板,以P1、P2、P3、P4为引物,搭桥PCR扩增融合目的基因(FHBP-C2) 其具有SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列,反应条件:预变性94℃ 5min,98℃ 10s,58℃ 30s,72℃ 1 min,共30个循环。1%琼脂糖电泳,回收目的片段(FHBP-C2,具有SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列)。目的片段(FHBP-C2,具有SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列)及表达载体pET-30-a经Bam HⅠ和EcoR I双酶切后,用DNALigationKit(TaKaRa)16℃连接8h,转化大肠杆菌DH5α菌株。单克隆扩增,提质粒用BamHⅠ/EcoR I双酶切鉴定,筛选阳性克隆,测序。经鉴定序列准确。将测序正确的重组质粒pET30-a- FHBP-C2转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取单克隆,接种于5ml LB培养基,37℃培养过夜。再以1%接种量接种到5ml LB培养基中,OD600值达0.4~0.6时,加入IPTG至终浓度100mg/ml,诱导后每小时取样,14%SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况,结果显示诱导剂浓度达到100mg/ml,诱导时间为6个小时,蛋白表达量最高。
实施例6
——对所述的重组蛋白嵌合疫苗的免疫原性分析
取小鼠若干只,分为三个实验组,分别为实验组9只,阳性对照和阴性对照各7只,注射剂量为50ug/只。在小鼠的皮下注射,第二次免疫一周后取血,分离血清,检测血清抗体的滴度,其结果见表二。检测结果表明实验组小鼠100%地出现了抗脑膜炎球菌抗体的阳转。采用ELISA试剂盒检测抗B群脑膜炎球菌抗体的滴度,结果可见免疫后实验组小鼠100%出现了抗相应细菌抗原抗体的阳转。
实施例7
——血清抗体的杀菌力实验分析结果
参照Frash等的方法,将新鲜培养的B群脑膜炎奈瑟氏菌菌液与乳兔补体1:1混合,再以1:2比例加入到各稀释度的热灭活的待测血清中,混匀后37℃培养1h。最后加入TTC琼脂培养基,37℃过夜后观察结果,同时设有阳性血清(诊断血清)对照、补体阴性对照。判定结果时,以与补体阴性对照孔相比,50%以上杀菌率的血清最高稀释度为血清抗体杀菌滴度,其结果见表3。结果表明杀菌抗体滴度在免疫两次后即达到32,说明该蛋白疫苗能够诱导补体依赖的杀菌反应,从而对机体建立起有效的保护。
序列表
SEQUENCELISTING
SEQIDNO:1
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法
<160> 1
<170> PatentInversion3.5
<210> 1
<211> 870
<212> DNA
<213> Neisseriameningitidis(groupB)
<400> 1
ctgaccactgccctgattctgaccgcctgcagcagcggaggcggcggtgtcgccgccgac 60
atcggcgcggggcttgccgatgcactaaccgcaccgctcgaccataaagacaaaagtttg 120
cagtctttgacgctggatcagtccgtcaggaaaaacgagaaactgaagctggcggcacaa 180
ggtgcggaaaaaacttatggaaacggcgacagcctcaatacgggcaaattgaagaacgac 240
aaggtcagccgcttcgactttatccgtcaaatcgaagtggacgggcagctcattaccttg 300
gagagcggagagttccaagtgtacaaacaaagccattccgccttaaccgcccttcagacc 360
gagcaagtacaagattcggagcattcagggaagatggttgcgaaacgccagttcagaatc 420
ggcgatatagcgggtgaacatacatcttttgacaaacttcccgaaggcggcagggcgaca 480
tatcgcgggacggcattcggttcagacgatgccagtggaaaactgacctacaccatagat 540
ttcgccgccaagcagggacacggcaaaatcgaacatttgaaatcgccagaactcaatgtt 600
gacctggccgcctccgatatcaagccggataaaaaacgccatgccgtcatcagcggttcc 660
gtcctttacaaccaagccgagaaaggcagttactctctaggcatctttggcgggcaagcc 720
caggaagttgccggcccgggcgccaaacagggacacggcaaaatcgaacacctgaaaaca 780
cccgagcaaaatgtcgagcttgccgccgccgaactcaaagcagatgaaaaatcacacgcc 840
gtcattttgggcgacacgcgctacggcagc 870
SEQIDNO:2
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法
<160> 2
<170> PatentInversion3.5
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> Neisseriameningitidis(groupB)
<400> 2
Claims (8)
1.一种B群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗,其特征在于,该疫苗由下列成分组成:含有基因工程表达并纯度在90%以上的B群脑膜炎球菌FHBP融合蛋白75000μg / ml,氢氧化铝佐剂1mg / ml;
其中,B群脑膜炎球菌FHBP融合蛋白由B群脑膜炎球菌FHBP蛋白V1变异型全长氨基酸序列和V2变异型C结构域抗原表位通过Gly-Pro-Gly连接肽融合而成。
2.按照权利要求1所述的疫苗,其特征在于,该疫苗选自 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.按照权利要求2所述的疫苗,其特征在于,该疫苗选自下述核苷酸序列:在严谨的杂交条件下与编码的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
4.按照权利要求3所述的疫苗,其特征在于,具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.一种含有权利要求4的任意一项所述核苷酸序列的表达载体。
6.一种含有权利要求5的表达载体的宿主细胞。
7.一种B群脑膜炎球菌蛋白嵌合疫苗的制备方法,其特征在于,该方法采用下述顺序的步骤:
(1)采用基因工程的方法,搭桥PCR构建含有B群脑膜炎球菌FHBP V1变异型的全长氨基酸序列和FHBP V2变异型的C结构域融合而成的基因片段,克隆入pET30a(+)载体后,IPTG诱导表达;
(2)表达产物经SDS-PAGE及Western鉴定分析,镍离子亲和层析柱纯化,获得的蛋白纯度达到90%以上;分子量的大小约为37kD,与B群脑膜炎球菌抗血清特异结合,可以判定为FHBP-C2融合蛋白;该抗原组分在测定蛋白含量后作为半成品疫苗;
(3)根据半成品疫苗蛋白浓度,以生理盐水稀释至150mg/ml,同时与AL(OH)3以对倍(V/V)混合,制成实验性蛋白疫苗,并对其进行检测;其半成品蛋白含量>50000μg/ml,成品蛋白含量为75mg/ml;该疫苗即为所需的脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。
8.权利要求7所述的质粒的构建、蛋白的分离纯化方法在制备数种脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗中的应用。
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