CN110804101A - B群脑膜炎球菌相关融合蛋白、疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种B群脑膜炎球菌相关融合蛋白、疫苗及其制备方法与应用。该融合蛋白包括SEQ ID NO:1所示的B01片段及SEQ ID NO:2所示的A19C片段；其中所述B01和A19C分别为B群脑膜炎球菌fHBP的变体1的全长片段以及变体2的结构域C片段。采用该融合蛋白制备得到的疫苗，相对于现有疫苗具有更好的免疫原性，免疫动物后能得到更高滴度的抗体，其抗原谱比现有的疫苗更广、能够覆盖更多类型的变体菌株。

Description

B群脑膜炎球菌相关融合蛋白、疫苗及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种B群脑膜炎球菌相关融合蛋白、疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
B群脑膜炎球菌(Neisseria.meningitidis,MenB)的荚膜多糖组分是一个α(2→8)N-乙酰神经氨酸(多唾液酸)的同线性聚合物和自身抗原，与α(2→8)唾液酸苷化的人糖蛋白相似，如胎儿中神经细胞的粘附分子。同样，许多脑膜炎球菌的脂多糖结构有一个末端N-乳糖结构和一个人细胞发现的脂糖类似。目前对MenB疫苗开发主要集中于非荚膜多糖免疫原，尤其是纯化后重组蛋白形式的膜蛋白或外膜囊泡(OMVs)。新的MenB疫苗发现方法，包括基因组采集、蛋白质组学和免疫学途径，已经鉴定出多个用于免疫预防MenB疾病的新疫苗靶标。这些疫苗靶标包括转铁结合蛋白、NHA(肝素结合蛋白，也称GNA 2132)，fHBP(人类因子H结合蛋白，也称为LP2086或GNA 1870)，FetA(铁调控的外膜蛋白)，NadA(黏附素A，也称为GNA 1994)，和其他的蛋白。fHBP是目前MenB最有前景的一种疫苗抗原，它几乎在所有MenB菌株的细胞膜上表达，为一种脂蛋白。fHBP是一种序列高度多样性的表面抗原，可被分为3个变体，每个变体内的氨基酸序列保守性为89-100％，而每个变体间的序列相似性只有59％左右，尤其是变体1(V1)和其他2个变体之间没有明显的交叉保护反应。
fHBP的一个重要功能是它可结合人补体因子(fH)。fH与细菌表面结合会加速C3/C5转化酶衰退，这会降低旁路途经激活，且有助于生物体的活力，从而避免非免疫人血清或血液补体介导的杀伤。fHBP作为一个疫苗抗原，抗fHBP抗体即可直接激活经典补体途径溶菌，也可阻止fH与细菌表面结合。
已有学者对fHBP的结构和抗原表位作了较为深入的研究。fHBP包含A、B、C这3个结构域，结构域A在3个变体中具有高度保守性。V1均表达一个位于结构域B的抗原表位，V2和V3的抗原表位主要位于结构域C中，且在V2和V3的结构域C中仅有个别氨基酸差异。已有近12种抗fHBP的单克隆抗体(MAbs)被研究出，而且大多数MAbs对fH与fHBP或细菌表面的结合有明显抑制作用，从而使得细菌对旁路途径介导的溶菌更为敏感。
目前已上市的2种MenB蛋白疫苗产品中fHBP均以单变体的形式单独或与非fHBP蛋白融合表达。产品针对性预防欧美地区流行性MenB菌株，而对其他的变体菌株并不具有广泛的覆盖性。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种制备方法简单、可刺激机体产生针对不同变体菌株的抗体的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白及其制备方法。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
一种融合蛋白，其包括SEQ ID NO:1所示的B01片段及SEQ ID NO:2所示的A19C片段；
其中所述B01和A19C分别为B群脑膜炎球菌fHBP的变体1的全长片段以及变体2的结构域C片段。
本发明还提供一种表达如上所述的融合蛋白的编码基因。
本发明还提供一种如上所述融合蛋白的制备方法，具体技术方案如下：
一种如权利要求如上所述的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将如上所述的重组质粒转化至宿主细胞中，鉴定，筛选鉴定正确的阳性菌株，将所述鉴定正确的阳性菌株转化至表达细胞；培养。
本发明还提供了一种重组质粒，具体技术方案如下：
一种重组质粒，包含有如上所述的编码基因。
本发明还提供一种重组菌株，具体技术方案如下：
一种重组菌株，转化有如上所述的重组质粒。
本发明还提供一种B群脑膜炎球菌疫苗，具体技术方案如下：
一种B群脑膜炎球菌疫苗，包括如上所述的融合蛋白。
本发明还提供一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，具体技术方案如下：
一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，由如上所述的疫苗免疫动物而制备得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所述的融合蛋白，通过将fHBP的变体1(V1)与变体2(V2)的结构域C的部分序列进行融合，制备得到包含上述多肽片段的融合蛋白，该蛋白易表达、能够正确折叠。该用融合蛋白获得的抗体对三种fHBP变异体的不同菌株均具有良好的杀菌活性，且该重组融合蛋白能够与常规的佐剂联合制备疫苗。采用该融合蛋白制备得到的疫苗，相对于现有疫苗具有更好的免疫原性，免疫动物后能得到更高滴度的抗体，其抗原谱比现有的疫苗更广、能够覆盖更多类型的变体菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中融合蛋白的结构示意图；
图2为本发明一个实施例中Ni-柱纯化的融合蛋白pET28a-B01-A19C的SDS-PAGE检测图；泳道1为菌体破碎后上清；泳道2为菌体破碎后沉淀；泳道3为流穿液；泳道4和5为50mM咪唑洗脱；泳道6为蛋白marker；泳道7为100mM咪唑洗脱；泳道8和9为250mM咪唑洗脱；图中泳道1和8箭头所指为目的蛋白；
图3为本发明一个实施例中融合蛋白pET28a-B01-A19C的Western Blot检测检测图；泳道1为JAR5单抗与阴性对照反应结果；泳道2为JAR4单抗与阴性对照反应结果；泳道3为重组融合蛋白与JAR5单抗反应结果；泳道4为重组融合蛋白与JAR4单抗反应结果；
图4为本发明一个实施例中小鼠免疫血清IgG滴度检测结果；图中柱状图反映的是经包被的三种变体蛋白检测的不同免疫组血清抗体水平。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及一种融合蛋白，其包括SEQ ID NO:1所示的B01片段及SEQ ID NO:2所示的A19C片段；
其中所述B01和A19C分别为B群脑膜炎球菌fHBP的变体1的全长片段以及变体2的结构域C片段。
在一些实施方式中，所述B01的C端与所述A19C的N端相连。
在一些实施方式中，所述B01和A19C之间还具有连接肽。
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸数目为1～30个；可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个；优选5～20个。
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸是不具有除连接以外的额外功能(例如蛋白定位、酶切位点等)的无意义多肽。
在一些实施方式中，所述连接肽为柔性连接肽。连接肽通常是柔性的，可以减少融合蛋白与目的蛋白之间的空间位阻，从而更有利于蛋白正确折叠。
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自Gly、Ser、Pro、Ala以及Glu中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自GSGGG。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种表达如上所述的融合蛋白的编码基因。
在一些实施方式中，所述编码基因中包含：
a).SEQ ID NO:3所示的B01片段的编码基因及SEQ ID NO:4所示的A19C片段的编码基因；或
b).与a)的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与a)的核苷酸序列不同的序列。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种重组质粒，包含有如上所述的编码基因。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种重组细胞，其转化有如上所述的重组质粒。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种如上所述的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将如上所述的重组质粒转化至宿主细胞中，鉴定，筛选鉴定正确的阳性菌株，将所述鉴定正确的阳性菌株转化至表达细胞；培养。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种B群脑膜炎球菌疫苗，包括如上所述的融合蛋白。
在一些实施方式中，所述B群脑膜炎球菌疫苗还包括佐剂。
在一些实施方式中，所述佐剂为铝盐佐剂、脂质体、MF59、单磷酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN以及Poly(I：C)中的至少一种。优选地，所述佐剂为氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，或者氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐与适用于人体的其他佐剂的组合物。其中，虽然弗氏佐剂不能用于人用疫苗中，但应当理解的是，其可以作为用于科研中小鼠试验的B群脑膜炎球菌疫苗的佐剂。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，其由如上所述的疫苗免疫动物而制备得到。
免疫对象可以选择包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。
其中，对本发明所涉及的名词，解释如下：
佐剂：是与抗原同时或预先注射到动物体内，可非特异性地增强机体对该抗原的免疫应答的物质，或称为非特异性免疫增强剂。
铝盐佐剂：以铝盐作为材料，通过传统工艺制备的一种佐剂，主要包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾3种，目前常用的铝盐佐剂为氢氧化铝和磷酸铝。
脂质体佐剂：由类脂质组成的人造细胞膜样小球体，主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构。可包括多种疫苗，并有效地引入细胞内，延长在体内停留时间，减少疫苗用量、降低毒副作用，提高免疫功能。
TLR类佐剂：以Toll样受体的配体为基准开发的一类新型疫苗佐剂，如细菌脂多糖是TLR4的配体，鞭毛蛋白是TLR5的配体，细菌或病毒的非甲基化CpG序列为TLR9的配体，以及其他具有佐剂活性TLR配体也包括在内。
MF59：一种由角鲨烯、山梨糖醇三油酸酯(Span85)、吐温80和柠檬酸缓冲液组成的水包油乳剂。
MPL：单磷酰脂质A，为TLR4配体，是已成功开发的TLR类佐剂中的一种。
CpG-ODN：人工合成含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤二核酸的寡聚脱氧核苷酸序列，为TLR9配体。
Poly(I:C)：为一段人工合成的双链RNA分子类似物，是TLR3配体。
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
Native-PAGE：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
ELISA：酶联免疫吸附测定。
SBA：杀菌活性检测。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
1、设计B群脑膜炎球菌fHBP嵌合蛋白
将V1的基因全长与V2的结构域C的编码基因进行融合，两者间加一个Linker，为GSGGGG(氨基酸序列)，即B01-Linker-A19C。由于本发明中采用的A19C的编码基因与B01有部分序列相似，因此采用双酶切连接的方式将其进行连接(如图1所示)。
2、技术方法
1)PCR分别扩增2个变体相应的基因：采用高保真DNA聚合酶将B01全长和A19的结构域C编码基因分别扩增出来，且这2个PCR产物均包含各自的限制性内切酶识别位点。模板为直接合成在pPUC57质粒上的基因：
含有V1(B01)的基因片段为：
ATGAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGCGGCGGTGTCACCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGA TGCACTAACTGCGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCCCTGACATTGGAAGACTCCATTTCCCAAAAC GGAACACTGACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTTAATACGGGCAAATTGA AGAACGACAAGGTCAGCCGTTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGCAGCTCATTACCTTGGAGAGCGG AGAGTTCCAAGTGTACAAACAAAGCCATTCCGCCTTAACCGCCCTTCAGACCGAGCAAGAACAAGATCCAGAGCAT TCCGAGAAGATGGTTGCGAAACGCCGGTTCAGAATCGGCGACATAGCGGGCGAACATACATCTTTTGACAAGCTTC CCAAAGACGTCATGGCGACATATCGCGGGACGGCGTTCGGTTCAGACGATGCCGGCGGAAAACTGACCTATACTAT AGATTTTGCTGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCGGAACTCAATGTCGATCTGGCCGTC GCCTATATCAAGCCGGATGAAAAACACCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTTCTTTACAACCAAGACGAGAAAGGCA GTTACTCCCTCGGTATCTTTGGCGAAAAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCGGAAGTGGAAACCGCAAACGGCAT ACACCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAA(下划线部分对应SEQ ID NO:3)
含有V2(A19)的基因片段为：
ATGAGCAGCGGAGGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCGCGGGGCTTGCCGATGCACTAACCGCACCGCTCGACCATAAAGACAAAAGTTTGCAGTCTTTGACGCTGGATCAGTCCGTCAGGAAAAACGAGAAACTGAAGCTGGCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTCAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGGTCAGCCGCTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGCAGCTCATTACCTTGGAGAGCGGAGAGTTCCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCTGACGGCAAAGCCGAGTATCACGGCAAAGCATTCAGCTCCGACGATGCTGGCGGAAAACTGACCTATACCATAGATTTCGCCGCCAAACA GGGACACGGCAAAATCGAACACCTGAAAACACCCGAGCAAAATGTCGAGCTTGCCGCCGCCGAACTCAAAGCAGAT GAAAAATCACACGCCGTCATTTTGGGCGACACGCGCTACGGCAGCGAAGAAAAAGGCACTTACCACCTCGCCCTTT TCGGCGACCGCGCCCAAGAAATCGCCGGCTCGGCAACCGTGAAGATAGGGGAAAAGGTTCACGAAATCGGCATCGC CGGCAAACAGTAG(下划线部分对应SEQ ID NO:4)
所用引物为：(下划线为相应的限制性内切酶识别序列)
V1F：
5’-GGAATTCCATATGGGTCCTGACAGCGACCGCTTGCAGCAACGCCGCGTCACCGCCGACATCGGCAC-3’
V1R：
5’-CGGGATCCCTGCTTGGCGGCAAGACCG-3’
V2CF：
5’-CGGGATCCGGAGGCGGCGGTGCCAAACAGGGACACGGCAAAATC-3’
V2CR：
5’-CCGCTCGAGCTACTGTTTGCCGGCGATGCCGA-3’
PCR条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸0.5-1min，循环30次，最后68℃延伸5min。将获得的PCR产物经DNA电泳检测，并采用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR正确的产物进行纯化回收。
PCR扩增体系：
10×buffer 5μL，dNTP 5μL，MgCl2 2μL，DNA模板100ng，引物F1.5μL，引物R1.5μL，KOD-plus-neo1μL，ddH2O补足至50μL。
2)双酶切2个变体基因和表达载体pET28a，并分别酶切产物。即分别采用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切B01、BamHI和XhoI双酶切A19C、NdeI和XhoI双酶切pET28a，均于37℃酶切反应1h。经DNA检测后，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切产物分别进行纯化回收，并测定回收产物的DNA浓度；
3)先将双酶切回收的B01、A19C进行等摩尔质量混合，在T4连接酶作用下于24℃反应1h，再将适量的pET28a双酶切产物加入上述的连接反应液中，反应体系定容至20μL，于24℃继续反应过夜。取适量连接产物通过热激法转化至克隆菌株E.coli DH5α中，涂布抗性平板，37℃倒置孵育过夜；
4)挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，挑选鉴定正确的阳性克隆进行扩大培养，再采用质粒小提试剂盒从菌液中提取重组质粒。
5)采用限制性内切酶NdeI和XhoI对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，即于37℃反应30min后进行DNA检测，再将鉴定正确的重组质粒送至测序公司进行测序鉴定；测序得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:5所示，蛋白序列如SEQ ID NO:6所示。
6)将构建正确的重组质粒转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)。挑取单菌落扩大培养，于37℃、200rpm培养至OD600达到0.8，加入终浓度为1mM IPTG，诱导培养4h，收集菌体；
7)采用SDS-PAGE检测该融合蛋白是否成功表达；
8)Ni-柱亲和层析纯化融合蛋白，即将收集的菌体的用适量的裂解缓冲液悬匀，并经超声破碎处理，使细胞破碎释放胞内蛋白，离心后的上清进行Ni-柱上样、漂洗和洗脱后收集样品，并经SDS-PAGE检测；检测结果如图2所示。
9)Western Blot检测蛋白抗原特性，即先采用Native-PAGE胶电泳融合蛋白，再转至PVDF膜上，经封闭、一抗、酶标二抗结合、显色后拍照检测。这里以单克隆抗体JAR4和JAR5【厂家：NIBSC，09/170(JAR4)，13/216(JAR5)】作为一抗。Western Blot结果如图3所示。
10)疫苗制备：在无菌条件下，分别将多肽与弗氏佐剂(第1次免疫用完全弗氏佐剂，第2次免疫用不完全弗氏佐剂)以体积比1:1混合、3个等量的变体蛋白混匀后与弗氏佐剂以体积比1:1混合，且确保3个等量变体蛋白的总质量和融合蛋白的质量同等，于冰浴条件下进行超声乳化；
11)小鼠免疫：4-6周龄小鼠40只，分为4组，分别用阴性对照(PBS)、多肽、多肽-弗氏佐剂3个变体蛋白混合-弗氏佐剂免疫，除了对照组，每只小鼠的免疫剂量中蛋白含量为10μg。在第0周和第4周各免疫1剂，共免疫2剂，腹腔注射，且在最后一次免疫后的第2周进行眼球采血；
12)常规ELISA检测血清抗体滴度，即先用等量的纯化后蛋白(融合蛋白、3个等量变体蛋白混合液)分别包被96孔板，封闭后，依次加入不同稀释倍数的一抗血清孵育、酶标二抗孵育、加入酶检测底物、结果判读与数据分析；滴度检测结果如图4所示。
13)SBA检测血清的杀菌活性：先将MenB菌株涂布于巧克力平板上，于37℃、5％CO2条件下培养过夜，将单菌落接种于Mueller-Hinton培养基中将菌液初始OD620控制在0.05-0.08，于37℃摇床培养至OD620达到0.23-0.24，并测定菌活力。所有所需被测试的小鼠血清先于56℃加热灭活30min，每孔中总体积为50μL，包括25μL连续两倍稀释的测试血清、12.5μL细菌工作液和12.5μL兔补体。对照包括：与补体血清孵育的血清、与细菌孵育的免疫血清、以及与灭活的补体。加入补体后，立即去10μL对照涂布于Mueller-Hinton琼脂平板上，于37℃孵育1h。每个样品各取7μL点在Mueller-Hinton琼脂平板上，于37℃孵育18h。实验结果如表1所示。
表1：小鼠血清(n＝5/组)对不同fHBP变异体菌株的杀菌活性(SBA)
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州微超生物科技有限公司
<120> B群脑膜炎球菌相关融合蛋白、疫苗及其制备方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 248
<212> PRT
<213> Neisseria.meningitidis
<400> 1
Val Thr Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser
20 25 30
Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His
85 90 95
Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His
100 105 110
Ser Glu Lys Met Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala
115 120 125
Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr
130 135 140
Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr
145 150 155 160
Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His
165 170 175
Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys
180 185 190
Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn
195 200 205
Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala
210 215 220
Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His
225 230 235 240
His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245
<210> 2
<211> 82
<212> PRT
<213> Neisseria.meningitidis
<400> 2
Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln
1 5 10 15
Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His
20 25 30
Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr
35 40 45
Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser
50 55 60
Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly
65 70 75 80
Lys Gln
<210> 3
<211> 744
<212> DNA
<213> Neisseria. meningitidis
<400> 3
gtcaccgccg acatcggcac ggggcttgcc gatgcactaa ctgcgccgct cgaccataaa 60
gacaaaggtt tgaaatccct gacattggaa gactccattt cccaaaacgg aacactgacc 120
ctgtcggcac aaggtgcgga aaaaacttat ggaaacggcg acagccttaa tacgggcaaa 180
ttgaagaacg acaaggtcag ccgtttcgac tttatccgtc aaatcgaagt ggacgggcag 240
ctcattacct tggagagcgg agagttccaa gtgtacaaac aaagccattc cgccttaacc 300
gcccttcaga ccgagcaaga acaagatcca gagcattccg agaagatggt tgcgaaacgc 360
cggttcagaa tcggcgacat agcgggcgaa catacatctt ttgacaagct tcccaaagac 420
gtcatggcga catatcgcgg gacggcgttc ggttcagacg atgccggcgg aaaactgacc 480
tatactatag attttgctgc caaacaggga cacggcaaaa tcgaacattt gaaatcgccg 540
gaactcaatg tcgatctggc cgtcgcctat atcaagccgg atgaaaaaca ccatgccgtc 600
atcagcggtt ccgttcttta caaccaagac gagaaaggca gttactccct cggtatcttt 660
ggcgaaaaag cccaggaagt tgccggcagc gcggaagtgg aaaccgcaaa cggcatacac 720
catatcggtc ttgccgccaa gcag 744
<210> 4
<211> 249
<212> DNA
<213> Neisseria. meningitidis
<400> 4
gccaaacagg gacacggcaa aatcgaacac ctgaaaacac ccgagcaaaa tgtcgagctt 60
gccgccgccg aactcaaagc agatgaaaaa tcacacgccg tcattttggg cgacacgcgc 120
tacggcagcg aagaaaaagg cacttaccac ctcgcccttt tcggcgaccg cgcccaagaa 180
atcgccggct cggcaaccgt gaagataggg gaaaaggttc acgaaatcgg catcgccggc 240
aaacagtag 249
<210> 5
<211> 1047
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
atgggtcctg acagcgaccg cttgcagcaa cgccgcgtca ccgccgacat cggcacgggg 60
cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120
ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa 180
acttatggaa acggcgacag ccttaatacg ggcaaattga agaacgacaa ggtcagccgt 240
ttcgacttta tccgtcaaat cgaagtggac gggcagctca ttaccttgga gagcggagag 300
ttccaagtgt acaaacaaag ccattccgcc ttaaccgccc ttcagaccga gcaagaacaa 360
gatccagagc attccgagaa gatggttgcg aaacgccggt tcagaatcgg cgacatagcg 420
ggcgaacata catcttttga caagcttccc aaagacgtca tggcgacata tcgcgggacg 480
gcgttcggtt cagacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ctatagattt tgctgccaaa 540
cagggacacg gcaaaatcga acatttgaaa tcgccggaac tcaatgtcga tctggccgtc 600
gcctatatca agccggatga aaaacaccat gccgtcatca gcggttccgt tctttacaac 660
caagacgaga aaggcagtta ctccctcggt atctttggcg aaaaagccca ggaagttgcc 720
ggcagcgcgg aagtggaaac cgcaaacggc atacaccata tcggtcttgc cgccaagcag 780
ggatccggag gcggcggtgc caaacaggga cacggcaaaa tcgaacacct gaaaacaccc 840
gagcaaaatg tcgagcttgc cgccgccgaa ctcaaagcag atgaaaaatc acacgccgtc 900
attttgggcg acacgcgcta cggcagcgaa gaaaaaggca cttaccacct cgcccttttc 960
ggcgaccgcg cccaagaaat cgccggctcg gcaaccgtga agatagggga aaaggttcac 1020
gaaatcggca tcgccggcaa acagtag 1047
<210> 6
<211> 348
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 6
Met Gly Pro Asp Ser Asp Arg Leu Gln Gln Arg Arg Val Thr Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
50 55 60
Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg
65 70 75 80
Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu
85 90 95
Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr
100 105 110
Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met
115 120 125
Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr
130 135 140
Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr
145 150 155 160
Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp
165 170 175
Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro
180 185 190
Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys
195 200 205
His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys
210 215 220
Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala
225 230 235 240
Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu
245 250 255
Ala Ala Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Lys Gln Gly His Gly
260 265 270
Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala
275 280 285
Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp
290 295 300
Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe
305 310 315 320
Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly
325 330 335
Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
340 345

Claims (14)

1.一种融合蛋白，其特征在于，其包括SEQ ID NO:1所示的B01片段及SEQ ID NO:2所示的A19C片段；
其中所述B01和A19C分别为B群脑膜炎球菌fHBP的变体1的全长片段以及变体2的结构域C片段。
2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述B01的C端与所述A19C的N端相连。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述B01和A19C之间还具有连接肽。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为柔性连接肽。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列选自GSGGG。
6.一种表达如权利要求1～5任一项所述的融合蛋白的编码基因。
7.根据权利要求6所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因中包含：
a).SEQ ID NO:3所示的B01片段的编码基因及SEQ ID NO:4所示的A19C片段的编码基因；或
b).与a)的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与a)的核苷酸序列不同的序列。
8.一种重组质粒，其特征在于，包含有权利要求6或7所述的编码基因。
9.一种重组细胞，其特征在于，转化有权利要求8所述的重组质粒。
10.一种如权利要求1～5任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求8所述的重组质粒转化至宿主细胞中，鉴定，筛选鉴定正确的阳性菌株，将所述鉴定正确的阳性菌株转化至表达细胞；培养。
11.一种B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的融合蛋白。
12.根据权利要求11所述的B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，还包括佐剂。
13.根据权利要求12所述的B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述佐剂为铝盐佐剂、脂质体、MF59、单磷酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN以及Poly(I：C)中的至少一种。
14.一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，其特征在于，由权利要求10～13任一项所述的疫苗免疫动物而制备得到。
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