KR20160093719A - 항원 키메라, 항원 조성물, 백신, 이의 제조 방법 및 카세트 - Google Patents

항원 키메라, 항원 조성물, 백신, 이의 제조 방법 및 카세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항원과 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머로 된 융합 단백질; 및 상기 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머를 포함하는 키메라 항원을 제공하며, 상기 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머는 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 및 E. coli 이열성 장독소 B 서브유닛 (LTB)로부터 선택되는 하나이고, 상기 다량체는 펜타머이고, 상기 키메라 항원에서 상기 융합 단백질과 상기 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머의 몰 비는 1:4이다. 본 발명에서, 보다 강력한 항원을 제조하기 위해, 점막 면역 보강제 단백질이 펜타머를 형성할 수 있는 특징을 이용해, 키메라 구조를 제조한다. 아울러, 항원의 면역원성 강화 효과를 개선하기 위해, 점막 면역 보강제 단백질을 이용해 면역 효과를 향상시킨다. 또한, 본 발명의 재조합 항원과 함께 형성된 키메라 단백질 항원은, 분비형 IgA를 생산하고 점막 면역의 발휘를 유도하도록, 점막을 자극한다.

Description

항원 키메라, 항원 조성물, 백신, 이의 제조 방법 및 카세트 {ANTIGEN CHIMERA, ANTIGEN COMBINATION, VACCINE, METHOD OF PREPARING SAME, AND KIT THEREOF}
본 발명은 면역학 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 점막 면역 항원, 백신 및 이의 제조 방법과 카세트에 관한 것이다.
점막 면역 시스템은 호흡기, 위장관 및 비뇨관의 점막 하부와, 일부 외분비선에 위치한 림프 조직 내부에 널리 분포되어 있으며, 특이적인 국소 면역 기능이 이루어지는 주요 장소이다.
신체 관련 감염은 95% 이상이 점막에서 발생하거나 또는 점막을 통한 체내 침입을 통해 발생하므로, 점막은 병원체가 체내 침입하기 위한 가장 큰 입구이다. 현재, 주요 감염성 질환, 즉, 인플루엔자, 결핵, 비저 및 살모넬라증과 같은, 동물의 삶과 건강에 매우 유해한 질환과 방제하기 매우 어려운 질환들은, 점막 침입을 통한 질환이거나 또는 점막-관련 질환에 속하며, 그로 인한 점막 손상과 점막 기능 장애는 종종 병원성 기회 감염 또는 심지어 종양 발생에 중요한 기전이 되기도 한다.
점막 면역 시스템은 병원체 침입을 막는 신체의 제1선 면역 장벽으로서, 독특한 구조와 기능을 가진 이러한 독립적인 면역 시스템은 병원체의 군락 형성 및 침입을 예방하는데 긍정적인 수단을 가지고 있다. 전통적인 전신 면역 시스템과는 다르게, 점막 면역 시스템은 점막 상피 또는 점막하 고유층 (lamina propria)에 분포된 많은 수의 면역 세포와 면역 분자들로 구성된 미만성 림프 조직, 또는 하나의 또는 복수의 집합된 림프 여포로 형성된 점막-조합형 림프 조직을 포함한다. 신체의 림프 조직의 50% 이상과 면역 세포의 80% 이상이 점막 면역 시스템에 집중되어 있다. 또한, 점액성 분비물에 함유된 항체는 주로 분비형 sIgA와 sIgM 항체이다. 점막 면역 시스템은 그 기능에 따라 2가지로 나뉠 수 있다: 유도 부위 (inductive site)와 작용 부위 (effective site). 유도 부위와 작용 부위 간의 소통은 주로 림프구의 회귀 (homing)를 통해 이루어진다. 점막 면역 시스템의 주 기능은 점막으로 흡입 또는 섭취된 굉장히 많은 수의 다양한 항원을 인지하여 반응하는 것이다. 점막 면역 시스템은 많은 수의 유해 항원에 대해 면역 반응을 낮추거나 또는 이에 대한 허용성을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 유해 항원 또는 병원체에 대한 고도로 효율적인 체액성 면역과 세포성 면역을 구축하여 효과적인 면역 거부 또는 제거를 수행할 수 있다.
점막 면역은 이론적으로는 점막 감염에 통해 병인성 기능을 유발하는 병원체를 예방하기 위한 가장 효과적인 면역화 경로인데, 그 이유는 다른 방식의 면역화에서는 백신으로 유의한 점막성 면역 반응을 유발하기 어렵기 때문이다. 그러나, 지금까지, 허가되었거나 임상 실험 중인 대부분의 백신은 여전히 면역화에 주사 경로를 채택하고 있고, 극소수만 점막 면역 경로를 이용한다. 그 이유는, 국소 점막 면역 특이 항체를 검출하기 어려운 점 외에도, 점막 면역 백신 제품의 개발을 괴롭히는 주된 문제는 신체의 숙주 방어 기능에서, 점막 면역 시, 주사를 통해 면역화하는 방식에서와 같이 항원의 체내 투입 수준을 정확하게 조절할 수 없다는 것이다. 경구 또는 국소 투여 후, 항원이 점막 표면에 도달한 다음, 점액 분비에 의해 희석되고, 점액 겔 흡수, 프로테아제/뉴클레아제 가수분해를 거쳐, 내막 장벽을 통과하게 될 것이다. 항원은 매우 극소량만 점막을 통해 체내로 흡수되어, 유효한 점막 면역 반응을 일으킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 수용성 항원과 점막성 작용 (mucosal function)이 없는 항원은 점막으로 흡수되는 비율이 낮으며, 이중 일부는 장에서 면역 허용성 현상을 유발할지도 모른다. 낮은 점막 흡수율을 해결하기 위한 가장 효과적인 방법은 천연 점막성 병원체의 특징을 모방하고, 효과적인 점막 보강제를 적용하고, 아울러 체내 점막 표면에 조합되는 수준을 높이는 것이다 (바람직하게는 선택적으로 M 세포에 부착). 이에 여전히 보다 효과적인 점막 백신이 요구되고 있다.
점막 면역을 위한 항원의 면역원성을 개선하기 위해, 본 발명은, 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머와 항원으로 된 융합 단백질, 및 상기 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머를 포함하며, 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머가 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB)와 E. coli 이열성 장독소 (heat-labile enterotoxin) B 서브유닛 (LTB)으로부터 선택되는 하나이고, 다량체가 펜타머이며, 키메라 항원에서, 융합 단백질 : 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머의 몰 비가 1:4이며, 키메라 항원이 안정적인 pH는 >pH7.0이며, 바람직하게는 pH 8.0인, 키메라 항원을 제공한다. CTB와 LTB 둘다 매우 효과적인 점막 면역 보강제로서, 안정적인 펜타머를 형성할 수 있다. 이러한 특성을 이용하여 제조되는 키메라 항원은 자체 점막 면역 보강제 특성을 유지할 뿐만 아니라 항원의 체적을 증가시켜, 항원 제시 세포 (APC)에 의해 쉽게 흡수되게 할 수 있으며, 또한 점막 면역 시스템과 전신 면역의 자극을 향상시킬 수 있다. 또한, 키메라 항원의 안정성은 pH와 밀접하게 관련있다. 본 발명에서, 키메라 항원가 안정적이기 위한 pH는 >7.0이며, 바람직하게는 pH 8.0이다. 이 조건에서, 키메라 항원, 특히 CTB 펜타머로부터 형성되는 키메라 항원은 가장 효과적으로 점막 면역 작용을 강화할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 키메라 항원의 CTB와 LTB는 본래의 천연 구조를 취하거나 또는 펜타머를 형성할 수 있는 돌연변이이다. 당화가 이루어지는 진핵생물에서 발현되는 CTB 및 LTB와 비교해, 원핵세포 발현 벡터에 의해 발현되는 CTB와 LTB 및 이들의 돌연변이는 천연 구조를 가지며, 항원에 대한 면역 반응을 보다 효과적으로 자극할 수 있으며, 본래의 보강제 기능을 발휘할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 키메라 항원에서 항원은 10 - 100kD, 바람직하게는 16kD - 65kD 범위의 분자량을 가진다. 항원은, 10-100kD 범위에서, CTB 또는 LTB가 올바른 구조로 잘 폴딩되게 할 수 있다. 항원의 분자량이 너무 낮으면, CTB 또는 LTB에 의해 영향을 받을 수 있으며, 그래서 융합 단백질은 스스로 융합 단백질의 다량체를 형성하도록 할 수 있으며, 따라서 올바르게 폴딩될 수 없다. 분자량이 너무 크면, 입체 방해가 발생되어, LTB 또는 CTB 펜타머의 형성을 간섭할 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 항원은 점막 면역에 적합한 항원, 특히 점막 경로를 통해 인간 또는 동물의 신체에 감염하는 병원체로부터 유래되는 항원, 비제한적인 예로, 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) 항원, 장티푸스 항원, 인플루엔자 HA 항원일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 헬리코박터 필로리 항원은 헬리코박터 필로리 우레아제 B 서브유닛 (UreB), 헬리코박터 필로리 세포독소 관련 유전자 A (CagA) 및 호중구 활성화 단백질 (NAP)로부터 선택되는 1종 이상이다. 이들 항원은 면역원성이 강하며, 무독성이므로, 백신에 훌륭한 항원 후보 물질이다.
본 발명의 일 구현예에서, 용합 단백질은 항원과 점막 면역 보강제 단백질 모노머 사이에 위치되는 3개의 G4S (Gly-Ser-Ser-Ser-Ser) 링커를 포함한다. 이러한 가요성 링커의 첨가는, 리폴딩에 의한 재생시, 항원 단백질과 CTB 또는 LTB 간의 단백질 상호작용을 피할 수 있어, 올바른 구조를 형성하는데 기여할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 키메라 항원를 포함하며, 키메라 항원가 안정적인 pH가 >pH7.0이며, 바람직하게는 pH 8.0인, 항원 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 전술한 항원 조성물과 백신에 적합한 부형제를 포함하는 백신을 제공한다. 바람직하게는, 백신은 경구 백신, 코 투여용 백신 또는 직장 투여용 백신이다.
또한, 본 발명은, 상기한 융합 단백질을 발현하는 벡터와 상기한 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머를 발현하는 벡터를 포함하는, 항원 조성물 제조용 카세트를 제공한다. 바람직하게는, 벡터는 모두 원핵세포 발현 벡터이다.
또한, 본 발명은, 키메라 항원의 제조 방법으로서, 전술한 카세트에서, 벡터를 이용해 융합 단백질과 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머를 각각 발현시킨 다음, 이들 2종의 단백질을 조합하여, 재생 방법을 통해 키메라를 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 재생 방법이, 상기 2종의 단백질을 우레아 및 다이티오트레이톨 (또는 머캅토에탄올)을 함유하는 리폴딩 용액 (refolding solution)에 함께 위치시켜, 재생하는 단계를 포함하는, 키메라 항원의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 리폴딩 용액내 우레아의 농도는 1.0M - 2.5M이다. DTT 또는 머캅토에탄올의 농도는 0.2mM - 1.0mM이다.
또한, 본 발명은 재생에 의한 키메라 제조 방법으로서, 키메라는, (1) 단백질 및 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머로 된 융합 단백질, 및 (2) 상기 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머를 포함하며, 상기 키메라는 (1)의 융합 단백질의 단백질 모노머와 (2)의 단백질 모노머가 융합되어 다량체를 형성함으로써, 형성되며,
상기 방법은,
상기 (2)의 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머를 6 M - 9 M 우레아, 바람직하게는 8 M 우레아를 함유하는 pH 3.0 - 4.0의 완충액내에서 0.5 - 3시간 동안, 바람직하게는 1시간 동안 예비-리폴딩하는 단계; 및
상기 (1)의 융합 단백질과 상기 (2)의 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머를, 키메라 형성을 위해, 1.0M - 2.5M 우레아 및 0.2mM - 1.0 mM DTT 또는 머캅토에탄올을 함유한 리폴딩 용액에서 리폴딩하는 단계를 포함하는, 재생에 의한 키메라 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 리폴딩 용액의 pH는 >7.0이고, 더 바람직하게는 상기 리폴딩 용액의 pH는 8.0이다.
본 발명은 리폴딩 용액에서 우레아 및 DTT (또는 머캅토에탄올)를 소정의 농도로 유지하도록 정하는데, 이는 다량체를 형성할 수 있는 모노머 단백질들로 된 호모-펜타머가 자체적으로 형성되는 것을 효과적으로 방지할 수 있다. 또한, 소정의 pH 조건 하에서는, 키메라의 형성이 촉진될 수 있으며, 키메라 조립이 효과적으로 개선될 수 있어, 통상적인 재생 공정에서 발생하는 낮은 조립 효율 문제를 효과적으로 극복할 수 있다. 재생 방법은 본원에 기술된 백신 분야로 한정되지 않으며 키메라 단백질 제조가 필요한 여러 분야들에서 활용될 수 있다.
도 1은 콜레라 독소 (CT)에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 형태 투시도이다.
도 2는 CTB 호모-펜타머에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 형태 투시도이다.
도 3은 CTB-UreB 융합 단백질에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 투시 다이아그램이다.
도 4는 CTB-UreB / 4CTB 키메라 단백질에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 형태 투시도이다.
도 5는 본 발명의 구현예에 따른 PET-28a-CTB-X 플라스미드를 이중 절단한 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플들은 다음과 같다: M: DL 10000 DNA 마커; 레인 1,2,3: PET-28a-CTB-UreB 이중 절단; 레인 4,5,6: PET-28a-CTB-CagA 이중 절단; 레인 7: PET-28a -CTB-NAP 이중 절단;
도 6은 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-UreB 융합 단백질에 대한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플들은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7: IPTG로 유도한 후 PET-28a-CTB-UreB/BL21-DE3 균체 (thallus);
도 7은 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-CagA 융합 단백질과 CTB-NAP 융합 단백질에 대한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1, 2, 3 및 4: IPTG로 유도 후 PET-28a-CTB-CagA/BL21-DE3 균체; 레인 5, 6, 7 및 8: IPTG로 유도 후 PET-28a-CTB-NAP/BL21-DE3 균체;
도 8은 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-UreB 융합 단백질의 정제에 대한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1: SP HP에서 피크 용출 전에 수집된 샘플; 레인 2 및 3: SP HP로부터 용출된 피크 샘플; 레인 4: SP HP에서 피크 용출 후 수집한 샘플;
도 9A는 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질의 정제에 대한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1, 2, 3 및 4: QHP에서 용출된 피크;
도 9B는 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질의 안정성 검사를 위한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1 - 7은 각각 pH 9.0, 8.0, 7.0, 6.0, 5.0, 4.0, 3.0 조건에서 처리된 샘플;
도 10은 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-CagA 융합 단백질의 정제에 대한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1, 2, 3 및 4: QHP에서 용출된 피크;
도 11A는 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-CagA/4CTB 키메라 단백질의 정제에 대한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1, 2 및 3: SP HP로부터 용출된 피크;
도 11B는 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-CagA/4CTB 키메라 단백질의 안정성 검사에 대한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1 - 7: 각각 pH 9.0, 8.0, 7.0, 6.0, 5.0, 4.0, 3.0의 조건 하에 처리된 샘플;
도 12는 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-NAP 융합 단백질의 정제에 대한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1: 봉입체 (inclusion body) (8M 우레아 중의); 레인 2, 3 및 4: QHP로부터 용출된 피크;
도 13은 본 발명의 구현예에 따라 제조된 CTB-NAP/4CTB 키메라 단백질의 정제에 대한 단백질 전기영동 결과 사진으로, 각 레인의 샘플은 다음과 같다: M: 사전 염색된 단편들로서 단백질 마커; 레인 1, 2 및 3: QHP로부터 용출된 피크;
도 14는 본 발명의 구현예에 따른 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질로 마우스를 면역화함으로써 수득된 혈청 특이 IgG 측정 결과를 나타낸 것이다;
도 15는 본 발명의 구현예에 따른 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질로 마우스를 면역화함으로써 수득되는 장 점막 특이 sIgA 측정 결과를 나타낸 것이다;
도 16은 본 발명의 구현예에 따른 CTB-CagA/4CTB 키메라 단백질로 마우스를 면역화함으로써 수득된 혈청 특이 IgG 측정 결과를 나타낸 것이다;
도 17은 본 발명의 구현예에 따른 CTB-CagA/4CTB 키메라 단백질로 마우스를 면역화함으로써 수득되는 장 점막 특이 sIgA 측정 결과를 나타낸 것이다;
도 18은 본 발명의 구현예에 따른 CTB-NAP/4CTB 키메라 단백질로 마우스를 면역화함으로써 수득된 혈청 특이 IgG 측정 결과를 나타낸 것이다;
도 19는 본 발명의 구현예에 따른 CTB-NAP/4CTB 키메라 단백질로 마우스를 면역화함으로써 수득되는 장 점막 특이 sIgA 측정 결과를 나타낸 것이다;
도 20은 본 발명의 구현예에 따른 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질로 마우스를 면역화한 다음 HP SS1으로 면역화된 마우스를 기회감염함으로써 수득되는 혈청 특이 IgG 측정 결과를 나타낸 것이다;
도 21은 본 발명의 구현예에 따른 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질로 마우스를 면역화한 다음 HP SS1으로 면역화된 마우스를 기회감염함으로써 수득되는 장 점막 특이 sIgA 항체 측정 결과를 나타낸 것이다;
도 22는 본 발명의 구현예에 따른 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질로 면역화한 다음 HPSS1으로 기회감염한 마우스의 위 조직에 대한 병리학적 조직 단편 결과를 나타낸 것으로, A: CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질 그룹에서 마우스의 위 조직에 대한 대표적인 병리학적 조직 단편 (x250); B: UreB 그룹에서 마우스의 위 조직에 대한 대표적인 병리학적 조직 단편 (x250); C: UreB 그룹에서 마우스의 위 조직에 대한 대표적인 병리학적 조직 단편 (x400);
도 23A 및 23B는 각각 UreB-CTA2/5CTB 및 CTB-UreB/4CTB의 조립 효율을 비교하기 위한 전기영동 결과로서, 레인 1은 비교예 1의 실험 결과이고, 레인 2는 본 발명에 따른 실시예의 실험 결과이다.
본 발명을 보다 명확하게 설명하기 위해, 본 발명의 하기 다양한 바람직한 구현예들 뿐만 아니라 구현예들의 기술적인 효과들을 상세히 기술한다.
본 발명은 면역원성이 강화된 항원과 이의 제조 방법을 제공한다. 한편, 면역 반응은 점막 보강제를 사용함으로써 강화시키며; 다른 한편으로, 펜타머 CTB 또는 LTB를 형성하는 특징을 이용해, 점막 면역 보강제 효과를 개선시킬 뿐만 아니라 항체의 크기를 증가시켜, APC에 의해 쉽게 흡수되게 하며, 따라서, 면역 반응이 더 쉽게 발생되게 한다. 나아가, 본 발명자들은 리폴딩 용액내 우레아 및 DTT (또는 "우레아 및 머캅토에탄올")을 특정 농도로 유지하도록 선택하여, 펜타머를 형성할 수 있는 모노머로 된 호모-펜타머가 형성되는 것으로 효과적으로 방지할 수 있으며, 따라서 키메라 형성에 기여하여 키메라 조립 효율을 개선시킬 수 있다. 통상적인 재생 조건에서 이루어지는 키메라의 조립 효율이 낮은 문제가 효과적으로 해결된다.
본 발명의 측면은 면역 보강제, 항원의 선정 및 리폴딩 방법 등의 여러가지 측면들로부터 상세하게 설명될 것이다.
면역 보강제
항원의 면역원성을 강화하기 위해, 본 발명에서는 항원과 함께 사용하여 새로운 항원 조성물을 형성하기 위해, 각각 LTB 또는 CTB를 선택하였다.
콜레라 독소는 A 서브유닛과 5개의 B 서브유닛 (도 1 참조) 구성 성분들로 구성된 강력한 점막 면역 보강제이다. 5개의 B 서브유닛은 서로 비-공유 결합하여, 매우 콤팩트하고 안정적인 실린더-형태의 펜타머를 형성한다 (도 2). B 서브유닛 모노머들은 양쪽 사이드 상에 3개의 역-평행 시트로 된 측쇄를 가지고 있다. 펜타머에서, 인접 모노머들을 시트와 다수의 염 결합을 통해 서로 상호작용하며, 따라서 B-서브유닛 펜타머는 가장 안정적인 단백질 복합체 중 하나가 된다. CTA는 콜레라 독소의 활성 부위인 반면, CTB는 무독성이며, 이의 주 기능은 포유류 장 상피 세포 상의 시알산 강글리오사이드 (GM1)에 조합하여, CTA가 세포로 들어가 면역 반응을 일으키게 하는 것이다. CTB는, 아울러, GM1 결합에 의해 보조되는 장관으로의 경구 백신 흡수율을 개선시킬 수 있어, 강력한 면역원성을 가지며, 또한, CTB는 소장 점막 세포에서 타이트 정션 또는 폐쇄대 (zonula occludens) 구조에 특이적으로 작용하여, 투과성을 높이고, 소장 점막에서의 경구 백신의 소화를 방지하고, 항원성을 유지할 수 있으며, 따라서, 신체에서 만들어지는 항체의 역가를 높일 수 있고, 그래서, 우수한 면역 반응이 신체에서 형성될 수 있다. 오늘날, CTB는 지금까지 가장 효과적이고 안전한 점막 면역 보강제 중 하나로 간주된다.
LTB 역시 효과적인 점막 면역 보강제이다. E. coli 이열성 장독소 (LT)는 장독소성 E. coli 세포에서 주변 세포질 (periplasm)로 분비되는 이열성 주변 세포직 외독소이다. LT는 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성을 가진 A 서브유닛과 강글리오사이드와 조합되는 B 서브유닛으로 구성된 AB5 타입의 단백질 헥사머로서, A 서브유닛은 독성의 주 유닛이고, B 서브유닛은 면역원성과 보강제 기능을 가지고 있다. LT는 면역원성 뿐만 아니라 효과적인 점막 보강제 기능을 가져, 후보 항원에 대한 신체 IgA 및 IgG 반응을 현저하게 강화할 수 있으며, 후보 항원에 대한 신체 면역 허용성은 낮추고 이에 대한 장기 기억을 유도할 수 있다. 이에, 점막 보강제 LTB는 점막 보강제로서 널리 논의되고 있다.
본 발명은 항원과 CTB 또는 LTB 모노머로 된 융합 단백질과 대응되는 CTB 또는 LTB 모노머 단백질을 포함하는 재조합 항원 조성물을 제공한다. 5개의 CTB 또는 LTB 모노머의 비-공유성 결합 특징을 이용함으로써, 융합 단백질과 4개의 대응되는 모노머 CTB 또는 LTB 복합체로 된 키메라 구조를 형성할 수 있으며, 따라서 항원의 유효 체적을 증가시켜 APC에 의해 쉽게 흡수될 수 있다. 한편, CTB 및 LTB는 후보 항원에 대한 신체의 면역 허용성을 낮출 수 있으며, 따라서 면역을 형성하는데 효과적으로 작용할 수 있는, 강력한 면역 보강제로 알려져 있다. 항원과 5개의 CTB 또는 LTB 모노머로 된 키메라 단백질이 형성되므로, 높은 효능을 가진 항원이 형성되어, 전체 항원 조성물의 면역원성이 강화된다.
항원
점막 면역 기능을 더 잘 수행하기 위해, 비제한적인 예로, 헬리코박터 필로리 항원, 장티푸스 항원 및 인플루엔자 HA 항원 등의, 점막을 통해 감염되는 병원체의 항원이 본 발명에서 바람직하다. 본 발명에서 제조되는 키메라 항원을 이용함으로써, 항원의 면역원성을 강화할 수 있으며, 그래서 보다 효과적인 백신 개발에 도움을 줄 것이다.
이하, 헬리코박터 필로리는 예로서 사용되며, 본 발명의 검증된 기술적 해법과 기술적 효과가 상세히 기술된다.
헬리코박터 필로리 (HP)는, 1983년에 호주 학자인 마샬과 웨렌에 의해 인간 위 점막으로부터 최초로 분리된, 위 상피 세포 표면에 기생하는 미세-호기성 (micro-aerobic) 그람 음성 박테리아이다. HP는 산성 환경에서 군락을 형성하여 생존할 수 있으며, 신체에 염증과 면역 반응을 일으키고 위 점막 장벽에 손상을 일으켜, 위 상피 세포의 세포자살과 증식 간의 불균형을 야기한다. HP는 인간 위장 질환에서 중요한 병원체로서, 만성 위염, 위 궤양 및 십이지장 궤양의 주 요인이다. 1994년, WHO는 이 박테리아가 위암과 밀접한 관련이 있으며, A 클래스의 발암원으로 이를 적시하였다. HP는 전세계적으로 유병률이 가장 높은 박테리아 중 하나로서, 아시아인은 90%가, 유럽인은 60%가 HP에 감염된 것으로 보고되어 있어, HP 감염의 예방 및 치료가 전세계적인 관심의 초점이 되고 있다.
현재, 임상적으로, HP 감염을 치료하기 위해 이중 또는 삼중 항생제 치료가 일반적으로 사용된다. 그러나, 명백하게는, 다음과 같은 문제가 있다: 1) 약물-내성 균주의 출현; 2) 재발 및 재-감염되기 쉬움; 3) 높은 유해 반응과 고 비용; 4) 집단 방제 효과를 달성하기 어렵고, HP의 전파 및 감염을 효과적으로 방제하기 어려움. 따라서, HP 감염에 대한 확실한 예방 및 방제 효과를 가진 백신을 개발하는 것이 매우 중요하다. 현재 연구 중인 HP 백신 대부분은 전-세포 백신, 서브유닛 백신 (유전자 조작된 백신), 생 벡터 백신 및 DNA 백신이다. 실험 대부분은, 전-세포 HP 또는 전체 박테리아 용혈물 또는 HP-독성 단백질, 예를 들어 우레아제, 공포화 세포독소 (vacuolating cytotoxin), CagA, 호중구-활성화 단백질 단독 또는 접종을 위한 여러가지 보강제와의 조합물을, 동물 모델에서 이용하는데, 이들 모두 예방적인 반응을 유발할 수 있다.
예방 백신은 신체의 면역 반응에 의해 작용하며, 그래서 신체를 면역화하기 위해 검증된 HP 항원을 선택함으로써, 신체를 예방적인 면역 반응을 형성하도록 자극할 수 있으며, 따라서, 백신은 HP의 감염으로부터 신체를 보호하는 역할을 수행할 수 있다. HP의 병 발생과 관련된 심도깊은 기술적인 연구를 통해, 유전자 조작 균주의 구축과 적용은 유효한 항원 스크리닝에 우호적인 환경을 제공할 뿐만 아니라, HP 감염의 예방 및 박멸은 결정적 단계에 접어든다.
헬리코박터 필로리 백신의 제조를 예로 들어보면, 본 발명자는 헬리코박터 필로리 우레아제, 헬리코박터 필로리 CagA 단백질 및 헬리코박터필로리 NAP를 헬리코박터 필로리의 유효 항원으로서 선호한다. 본 발명은 유전자 생물조작 기법을 적용하여, HP 항원과 CTB로 된 3종의 융합 단백질 (CTB-X (X = UreB, CagA, NAP))을 제조하였으며 (도 3 참조), 5개의 CTB가 비-공유 결합하는 특징을 이용하여, 키메라 구조 CTB-X (X = UreB, CagA, NAP)-4CTB가 형성되어, 따라서, HP 항원과 5개의 CTB 모노머로 된 키메라 단백질을 통해 보다 강력한 효능을 가진 항원을 만들고, 관련괸 동물 면역원성 검증 실험을 수행하였다.
우레아제
군락 형성 및 감염 프로세스에서, HP 우레아제 (Ure)는 우레아를 분해하여, 위 산을 중화하는 작용을 하며, HP의 병원성에 중요하다. HP 우레아제는 군집 형성 요인이자 병독성 요인이다. 우레아제 유전자는 모든 HP 균주들에 공유적으로 소유되어 있으며, 강력한 우레아제 활성을 가진 단백질을 코딩한다. 우레아제는 HP 표면에 분포되어 있으며, 박테리아 전체 단백질 총량에 5 내지 10%를 차지한다. 현재, 우레아제의 유전자 크기는 약 7.5 kb이고, 총 9개의 ORF (open reading frame), 즉, UreA, UreB, UreC, UreD, UreE, UreF, UreG, UreH 및 UreI가 존재하는 것으로 밝혀져 있다. UreA와 UreB는 고도로 보존된 2종의 우레아제 구조 서브유닛으로, 이들은 HP 감염에 대한 PCR 검출에서 타겟 유전자로서, 그리고 후보 유전자 백신으로서 종종 선택된다.
UreB는 HP의 외막 항원의 주 성분으로서, 코딩된 569개의 아미노산 잔기에 의해 구성되며, HP에서 무독성이며 강력한 항원 특징과 상대적으로 보존적인 가장 강력한 예방 항원 단백질이다. HP의 발병 프로세스에서, 이것은 중요한 역할을 담당한다. 여러가지 균주들 간의 비교를 통해, 우레아제 B 서브유닛이 97.9% 이상의 상동성을 가지고 있는 것으로 확인되었는데, 이는 여러가지 HP 균주들에서 HP UreB 항원의 변이성이 최소화되어 있다는 것을 의미한다. 아울러, UreB의 주 활성 부위는 이의 세포 표면 상에 위치하며, 이의 큰 분자량과 입자 구조는 점막 면역화를 용이하게 하므로, 따라서 우레아제 분자는 백신 항원의 합리적인 선택 물질로서 사용할 수 있다. 한편, 생체내에서 HP 표면은 세포질 단백질에 대해 부착 특징으로 가지고 있어, 우레아제를 자기분해로부터 살아있는 세포의 표면으로 방출시킬 수 있으며, 이는 또한 HP 백신 연구에 있어 중요한 이론적인 토대가 된다. 실험을 통해, UreB 단백질 백신을 점막 면역화 경로를 통해 투여하면 신체의 예방적인 면역 반응을 유도 및 자극할 수 있다는 것이 입증되었는데, 이는 UreB가 HP 감염에 대한 중요한 예방 항원 후보라는 것을 의미한다. 또한, 이것은 유전자 조작된 백신에 바람직한 항원이며, 유의한 이점을 가진다.
다수의 문헌들을 통해, 고양이 위 헬리코박터 (Helicobacter Felis, Hf)로 이미 감염된 마우스를 재조합 유레아제 서브유닛 B (rUreB)를 이용한 경구 면역화하면, 마우스에서 HF 감염이 치료될 뿐만 아니라 마우스의 재-감염이 예방될 수 있는 것으로 확인되었다; Kleanthous 등은 마우스 면역화를 위해 rUreB + 점막 보강제 LT를 이용하였으며, 대조군과 비교해, 면역화된 마우스 그룹에서, 위내 우레아제 활성이 현저하게 줄어들었으며, 위 조직 정량 배양을 통해 HP의 97% 이상이 감소되었으며; Michetti 등은 여러가지 경구 투여량 (180mg, 60mg, 20mg, 4회/일)의 우레아제와 LT (5㎍)에 대한 임상 안전성 및 면역원성 실험을 수행하였는데, 모든 자원자들에서 허용적이었으며, 백신은 위내 HP의 군락 형성을 감소시킬 수 있었으며, 따라서 위염 정도가 줄어드는 것을 확인하였으며; Saldinger 등은 이미 HF로 감염된 BALB/c 마우스를 면역화하기 위해 rUreB와 조합하여 콜레라 독소 (CT)를 사용하였으며, 면역화 그룹의 마우스 모두에서 HF가 없어졌으며; 추가적인 분석을 통해, 비장 CD4+ T 세포의 증식, 혈청 IgG1 증가, IL-4 증가 및 IFN-γ 감소가 드러났으며, 이는 rUreB가 HP 제거를 도울 수 있는 Th2 CD4+ T 세포 증식을 유도할 수 있음을 뒷받침해준다. 몇몇 학자들은, UreB를 LT와 조합 사용하여 면역화함으로써 HP 감염된 자원자에 대한 I상 임상 실험을 수행하였는데, 이 역시 HP 감염의 강도를 현저하게 낮추는 것으로 확인되었다. Lee 등은, 인간을 제외한 다른 영장류를 대상으로 비슷한 실험을 수행하였으며, 역시 위내 HP의 강도 감소가 위염 수준의 저하를 보조할 수 있다는 것을 입증하였다. 그러나, Solnick는 우레아제를 이용한 경구 및 근육내 투여를 통한 레수스 원숭이의 면역화 실험과 후속적인 HP 기회감염 검사를 보고하였는데, UreB는 체액성 면역화를 유도할 순 있지만, HP 기회감염된 레수스 원숭이 모두 HP로 감염되었고, 박테리아 강도는 실험군과 대조군에서 통계학적으로 유의하지 않은 것으로 나타났다. 이러한 결과들은, 본 발명의 UreB 관련 HP 백신이 여전히 완벽하지 않으며, 추가적인 실험이 필요하다는 것을 시사해준다.
CagA 단백질
CagA 유전자는 역시 세포독소-관련 유전자로 알려져 있으며, 이의 유전자 발현 산물이 CagA 단백질이다. 이것은, 박테리아에 의해 분비되는 독소로서, 박테리아에서 숙주 세포로 IV형 분비 시스템 Cag PAI (pathogenicity island)에 의해 전달되며, 인산화되어 숙주 세포내 신호 전이에 관여하며, 세포골격 구조의 재정렬을 야기한다. 실험들을 통해, cagA 양성 HP가 HP의 병독성 균주이며, 위축성 위염, 위암 및 소화성 궤양과 기타 일반적인 위장 질환들과 밀접하게 관련되어 있다. 임상에서 분리된 HP 중 90% 이상에서 CagA 발현은 양성이었다. CagA 유전자를 가진 거의 모든 타입의 HP는 CagA 단백질을 발현하며, 측정가능한 항체 반응을 유도한다. 문헌에 따르면, CagA-양성 균주는 직접 또는 간접적으로 (NF-KB)를 통해 위 상피 세포가 IL-8을 분비하게 유도할 수 있으며, IL-8은 호중구 주화성과 활성화 과정에 중요한 역할을 수행하며, 위 점막 손상을 유발할 수 있다. 동물 실험에서, CagA 유전자와 CagA 단백질이 위염, 소화성 궤양, 특히 위암과 양호한 상관성이 있는 것으로 밝혀졌다. Marchetti 등은 재조합 CagA를 이용한 HP 감염 마우스의 면역화를 통해 마우스 모델에 적용한 바, 유도성 예방 면역 반응이 형성될 수 있으며, 예방율이 70%에 이른다는 것을 확인하였다. Crabtree 등은 재조합 CagA를 항원으로 사용하여, 위를 통해 HP 만성 감염 마우스를 면역화하였는데, HP가 성공적으로 제거되었으며, 마우스는 재-감염으로부터 효과적으로 예방되었다. HP 백신에 대한 예방 항원으로서 CagA는 실현가능성이 더 높지만, 이 항원에 대한 예방 효과는 CagA를 생산하는 균주로 한정되며, CagA를 생산하지 않는 균주에 대해서는 예방 효과가 형성되지 않을 것이라고 제시되어 있다. CagA 단백질에 대한 만족할만한 백신은 현재까지 없다는 것을 알 수 있다.
NAP
Evans 등은 HP 수용성 추출물에서 한가지 타입의 NAP를 발견하였는데, 이것은 호중구를 생성 및 활성화할 수 있으며, 위장 상피 세포로의 호중구 부착을 촉매하며, 반응성 산소 대사산물을 방출하도록 호중구를 활성화할 수 있으며, 위장 점막의 염증 병변을 야기할 수 있다.
NAP는 고도로 보존되어 있다. 임상 실험들에서, NAP에 대한 특이 항체는 HP 감염 환자들의 혈청 샘플 중 60%에서 발견할 수 있는 것으로 밝혀졌다. NAP는 페리틴으로, 이를 코딩하는 유전자는 거의 모든 종류의 HP에서 검출할 수 있지만, 시험관내 발현 후 NAP 활성에는 큰 차이가 있다. 이것은 내피 세포 유착 분자 (ICAM-1)와 CD11a/CD18 및 CD11b/CD18을 통해 상호작용할 수 있으며, 그로 인해 백혈구와 내피 세포 간의 유착을 야기할 수 있다. 이것은 호중구의 산성 글리코스핑고리피드와 선택적으로 조합하는 기능과, 아울러 백혈구 기능을 조절하는 기능을 가지고 있으며, 무신 (mucin)과 조합하여 위 상피 세포에서 HP 군집화 가능성을 제공할 수 있다. 따라서, NAP는 HP의 유착 및 병인성 과정에 중요한 역할을 수행한다. Satin 등은 경구 면역화를 통해 정제된 재조합 NAP로 마우스 10마리를 면역화하였고, 그 결과 마우스 8마리에서 후천적인 예방 면역이 확인되었다. 이는, NAP가 HP 감염에 대한 백신의 효과적인 예방 항원으로 사용될 수 있다는 것을 시사해준다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 헬리코박터 필로리 항원과 CTB 모노머로 된 융합 단백질과 상기 CTB 모노머를 포함하는 재조합 헬리코박터 필로리 항원 조성물을 제공한다. CTB 모노머가 자신과 펜타머를 형성할 수 있는 특성을 이용함으로써, 항원의 크기는 커지고, APC에 의해 쉽게 흡수된다. 아울러, CTB는 훌륭한 면역 보강제이다. 따라서, 본 발명의 재조합 헬리코박터 필로리 항원 조성물은 헬리코박터 필로리 항원의 면역원성을 효과적으로 강화할 수 있으며, 이는 보다 효과적인 백신의 개발에 도움이 될 것이다.
추가적인 구현예에서, 항원은 헬리코박터 필로리 UreB 단백질, 헬리코박터 필로리 CagA 단백질 및 NAP 중 하나 이상으로부터 선택된다. 이들 항원은 모두 무독성이며, 면역원성이 높고, 현재 공지된 헬리코박터 필로리 항원들 중에서 상대적으로 보존적인 항원이며, 백신으로 사용하기 보다 적합하다.
항원 및 면역 보강제의 조합 방식 선정
일반적인 면역보강제는 일반적으로 항원과 직접 혼합한 다음 항원과 동시에 투여하여 면역 반응을 자극하도록 사용되지만, 항원의 면역원성을 강화하는 보강제의 작용은 이상적이지 않다. 본 발명에서는 항원과 점막 면역 보강제 단백질 모노머로 된 융합 단백질을 제조한 다음, 융합 단백질과 상기 점막 면역 보강제 단백질 모노머 간에 비-공유 결합을 통해 키메라 단백질로 제조하며, 따라서, 자체 점막 면역 보강제 특성은 유지될 뿐만 아니라 항원의 크기도 증가하여 항원-제시 세포에 의해 더 쉽게 흡수되게 된다.
융합 단백질을 제조하기 위해, 본 발명에서는 가요성 단백질 링커를 항원과 CTB (또는 LTB) 사이에 첨가하여, 융합 후 항원과 CTB (또는 LTB)의 폴딩이 서로 영향을 미치지 않도록 함으로써, 각각 올바른 구조가 형성될 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 3개의 G4S 링커를 선택하였다. 그러나, 본 발명은 이 링커의 사용으로 한정되지 않으며, 나선 형태의 링커 펩타이드 (A (EAAAK) nA) 및 글루코스 아우레우스 단백질 A (PA)와 같은 다른 링커도 본 발명에서 사용할 수 있다.
나아가, 2가지 파트, 특히 CTB (또는 LTB)의 구조 확보를 토대로, 펜타머의 적절한 형성이 이루어지는데 도움이될 수 있으며, 펩타머 형성 효율에 유익할 수 있다.
키메라 항원의 제조 방법
또한, 본 발명은 항원과 CTB (또는 LTB)로 된 융합 단백질을 발현하는 벡터와 동일한 점막 면역 보강제 단백질 CTB (또는 LTB)를 발현하는 벡터를 포함하는 카세트를 제공한다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 바와 같이, 발현 벡터는, 대상 단백질 외에도, 프로모터, 종결인자, 선택적인 마커 유전자 등과 같은 대상 단백질의 발현에 필수적인 요소들을 포함하여야 한다.
발현 벡터는, 바람직하게는 원핵세포 발현 벡터, 예를 들어, pET 시리즈와 같은 원핵세포 벡터이다. 원핵세포 발현 벡터를 이용하여 대상 단백질을 제조하는 방법과 시약들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이는 당해 기술 분야에 널리 사용되는 참조문헌, 예를 들어 Cold Spring Harbor Laboratory compiled "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ((US) J. Sambrook et al, translated by Huang PeiTang et al, Beijing, Science Press), "Cell Laboratory Manual" ((US) DL Spector et al. translated by Huang PeiTang et al, Beijing, Science Press) 등에서 확인할 수 있다.
키메라를 제조하는데 있어 기술적인 문제가 일부 존재한다. 융합 단백질과 키메라를 형성하기 전에 모노머들이 호모-펜타머를 형성하지 않도록 방지하는 방법은 키메라 수율에 중요한 사항이다. 일반적으로, 원핵세포를 이용해 발현되는 대부분의 단백질은 봉입체를 형성하므로, 세척 후 우레아 용액으로 용해하여야 한다. 우레아 용액에 의해 용해된 단백질은 기본적으로 변성된 상태이며, 이를 천연 형태로 수득하긴 어렵다. 그러나, 통례적인 리폴딩 공정은, 점차적으로 올바른 형태를 형성하게 리폴딩하기 위한, 점진적인 우레아 제거 과정이다. 우레아의 제거 공정에서, 다량체를 형성할 수 있는 모노머는, 융합 단백질의 모노머와 헤테로-다량체를 형성하기 보다는 스스로 호모-다량체를 자발적으로 형성하기 쉽다. 따라서, 키메라를 통상적인 방법으로 생산하는 경우, 수율이 매우 낮다.
본 발명자들은, 모노머 자체적으로 호모-펜타머를 형성하는 것을 효과적으로 방지할 수 있으며, 키메라의 형성을 촉진하고, 키메라의 조립 효율을 개선시킬 수 있도록, 리폴딩 용액내 우레아와 DTT (또는 "우레아 및 머캅토에탄올")를 특정 농도로 유지하도록 선택한다. 따라서, 통상적인 재생으로 인해 발생되는 조합 효율 저하 문제가 효과적으로 해결된다.
또한, 본 발명은 재생을 통한 키메라의 제조 방법을 제공하며, 여기서 키메라는 (1) 단백질과 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머로 된 융합 단백질, 및 (2) 상기 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머를 포함하며, (1)의 융합 단백질의 단백질 모노머와 (2)의 단백질 모노머가 융합에 의해 다량체를 형성함으로써 형성되며, 상기 방법은, (2)의 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머를 6M - 9M, 바람직하게는 8M 우레아를 포함하며 pH가 3.0 - 4.0인 완충액에서 0.5 - 3시간 동안 예비-리폴딩하는 단계; 및 키메라 형성을 위해 (1)의 융합 단백질과 (2)의 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머를 1.0M - 2.5M 우레아 및 0.2mM - 1.0 mM DTT 또는 머캅토에탄올을 포함하는 리폴딩 용액에서 리폴딩하는 단계를 포함한다.
본 발명에서는, 통상적인 리폴딩 용액과는 다르게, 특정 농도의 우레아와 환원제가 포함된 리폴딩 용액을 사용하므로, 융합 단백질과 단백질 모노머는 서서히 리폴딩 과정이 이루어지는 동안 바람직한 키메라로 재조립될 수 있다. 바람직한 프로세스에서는, 예비-리폴딩을 특정 pH 조건 하에 수행한 다음, 환원제의 존재 하에, 저 농도의 우레아 하에, 융합 단백질과 단백질 모노머를 서서히 리폴딩시키며, 그에 따라 키메라의 수율은 예상치못하게도 높게 달성된다.
대규모로 제조하는 경우, 수율은 생산 비율에 직접적으로 영향을 미칠 것이며, 심지어 대량 생산 가능성에 직접적으로 영향을 줄 것이다. 본 발명의 방법을 이용함으로써, 키메라 수율을 대량 생산을 위한 수준으로까지 높일 수 있다.
다음으로, 본 발명의 바람직한 구현예들이 구체적인 실시예에 대한 상세한 설명을 통해 하기에서 설명된다.
1. 항원 제조
1.1 실시예 1 CTB-UreB / 4CTB 제조:
1.1.1 재조합 조작 박테리아 구축: PET-28a-CTB-UreB BL21-DE3
1.1.1.1 융합 유전자 CTB-UreB 구축:
UreB의 DNA 서열은 HP 균주 MEL-HP27로부터 유래되며, CTB의 DNA 서열은 비브리오 콜레라 0395로부터 유래되며, 글리신/세린에 풍부하며 가요성 특성을 가진 (G4S)3 링커 서열 (이탤릭체 및 밑줄 침)은 UreB와 CTB 서열 사이로 융합 DNA 단편으로 도입하여, CTB-UreB 코돈을 합성한다.
이의 유전자 서열은 서열번호 1이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
1.1.1.2 발현 벡터 PET-28a-CTB-UreB의 구축:
발현 벡터 PET-28a와 HP UreB-CTB 융합 유전자 단편을 각각 NdeI 및 HindIII로 절단하였다. 대상 DNA 단편을 회수하여, 아가로스 겔 전기영동로부터 정제한 다음 라이게이션 반응을 수행하였다. 대상 단편 : 벡터의 몰 비는 1:3 내지 1:10으로, 라이게이션 반응은 16시간 동안 16℃에서 수행하였다. 라이게이션 반응 시스템은 다음과 같이 설계하였다:
Figure pct00003
1.1.1.3 E. coli의 컴피턴트 세포 준비 (CaCl2 방법)
글리세롤에서 보관한 -70℃ DH5α 박테리아로부터, 약간의 박테리아를 스트리킹 접종을 위해 취하였다. E. coli DH5α 수여 균주 콜로니 하나를 취하여, 5ml LB 배지가 든 커버링된 시험관에 접종하여, 10-12시간 동안 교반 (200rpm)하면서 37℃에서 배양하여, 종균 용액을 수득하였다. 종균 용액 5ml을 교반 (200rpm) 배양을 위해 신선한 LB 배지 100ml에 접종하였다. 배양 배지의 OD600이 0.4 - 0.9에 도달하면, 배양 배지 1.5ml을 위하여 에펜도르프 시험관에 넣고, 10분간 얼음 위에 둔 다음, 4℃에서 400rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 버렸다. 처음 2 단계를 다시 반복하여 세포를 수집하였다. 빙랭한 0.1 mol/L CaCl2 용액 300 ㎕를 조심스럽게 첨가하여 세포를 재-현탁하고, 얼음 위에 30분간 둔 다음 4000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하고, 상층액은 버리고, 미리 냉각시킨 0.1mol/L CaCl2 용액 100 ㎕을 조심스럽게 첨가하여 세포를 현탁시켜, 컴피턴트 세포를 수득하였다. 컴피턴트 세포를 추후에 사용하기 위해 보관하여야 하는 경우에는, 미리 냉각시킨 50% 글리세롤 30㎕와 0.1mol/L CaCl2 용액 70㎕ (글리세롤 최종 농도 15%)을 세포 재현탁을 위해 사용하였고, 향후 사용을 위해 이를 -70℃에서 보관하였다 (6개월간 보관 가능).
1.1.1.4 라이게이션 산물을 E. coli 컴피턴트 세포에 형질전환하였다
컴피턴트 세포 현탁물을 -70℃ 냉동고에서 취하여, 실온에서 해동하고, 해동 즉시 얼음 위에 두었다. 라이게이션 반응 용액 (50ng을 초과하지 않게 포함함, 부피는 10㎕ 이하임)을 여기에 첨가하고, 약하게 흔들면서 균일하게 혼합하였다. 얼음 위에 30분간 둔 혼합물을 열 쇼크를 위해 90초간 42℃ 수조에 둔 다음, 즉시 얼음 위에 두어 5분간 냉각시킨 다음, LB 액체 배지 800㎕를 시험관에 첨가하여 혼합하고, 37℃에서 150rpm으로 교반 배양하면서 1.5시간 배양하였다. 수득되는 배양물을 카나마이신 (Kan)이 함유된 스크리닝 플레이트에 도말하여, 37℃에서 밤새 배양하였다.
1.1.1.5 융합 단백질 콜로니 구축 및 스크리닝:
형질전환된 DH5α 콜로니 하나를 취하여, 플라스미드를 추출하였다. 이중 절단한 후, 단편의 크기는 2067bp였으며 (도 5 참조), 이는 설계한 크기와 일치하였는데, 이는 재조합 플라스미드가 성공적으로 구축되었음을 나타낸다.
1.1.1.6 융합 단백질 조작된 균주의 구축과 스크리닝:
컴피턴트 박테리아 E. coli BL21-DE3 형질전환주를 제조하는 방법과, 재조합 박테리아의 플라스미드 추출 방법은 클로닝을 위한 박테리아 구축 및 스크리닝에서와 동일하였다.
Kan 함유성 스크리닝 플레이트에서 콜로니 하나를 취하여, LB 5ml이 든 시험관에 넣어, 37℃에서 150rpm으로 4시간 교반하면서 배양하였다. 그런 후, 유도를 위해 1mM IPTG를 첨가하였고, 발현 결과는 도 6에 나타낸다.
1.1.2 재조합 조작 박테리아 PET-28a-CTB-UreB/BL21 (DE3)의 발효
1.1.2.1 종균 활성화
종균 활성화에는 LB (트립톤 10 g/L; 효모 추출물 5g/L; NaCl 10g/L) 배지를 사용하며, 부피는 50mL이었다. 배지는 121℃에서 20분간 멸균 처리한 후, 냉각시켜, Kan (50mg/L)과 작동 종균 lot 박테리아 (각 50㎕)를 첨가하였다. 수득되는 산물을 37 ℃ ± 1 ℃에서 15-16시간 동안 인큐베이션하였다.
1.1.2.2 종균의 제조
종균 용액 3ml을 배지에 넣기 전에, 배지를 121℃에서 20분간 멸균 처리하였다. 종균은 2YT 배지 (트립토 16g/L, 효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L)를 이용해 총 부피 3 L로 포뮬레이션하였다. 수득되는 혼합물은 37±1℃에서 4-6시간 동안 배양하였다.
1.1.2.3 발효기를 이용한 발효
1.1.2.3.1 기본 배지
Figure pct00004
전술한 기본 배지를 정제수에 용해한 후, 수득되는 혼합물에 정제수를 50L가 되도록 첨가하였다.
1.1.2.3.2 피드 첨가물 (Feed supplement)
Figure pct00005
피드 첨가물은 상기 피드 공식에 따라 제형화하였다. 이를 정제수에 용해한 후, 정제수를 4L가 되도록 첨가하고, 사용하기 전에 121℃에서 20분간 멸균 처리하였다.
1.1.2.3.3 알칼리 첨가물
4M 소듐 하이드록사이드 1L를 제조하였다.
1.1.2.3.4 IPTG 용액
IPTG 5.0g을 멸균 정제수에 용해하고, 0.22 ㎛의 막으로 여과한 다음, 수득되는 용액을 향후 사용을 위해 2 - 8℃ 냉장고에 보관하였으며, 보관 기간은 24시간이었다.
1.1.2.3.5 배양 파라미터
발표기의 배양 파라미터 세트는 다음과 같다:
Figure pct00006
피드 첨가물
Figure pct00007
배양물의 OD600이 20 - 30이 되면, IPTG 용액을 첨가하여, 3시간 동안 계속 배양한 다음, 배양물을 발효기에서 취하였다.
1.1.2.3.4 원심분리
배양 완료 후, 발효 브로스를 미리 냉각시킨 저장 탱크로 이동시켰다. 발효 브로스를 15℃ 미만으로 냉각시킨 후, 시험관 타입의 원심분리기를 사용해 원심분리함으로써 세포를 회수하였다.
1.1.3 CTB-UreB/4CTB의 제조
1.1.3.1 CTB-UreB의 제조
(1) 봉입체 제조
박테리아 배양 완료 후, 발효 브로스를 미리 냉각시킨 저장 탱크로 이동시켰다. 발효 브로스를 15℃ 미만으로 냉각시킨 후, 시험관 타입의 원심분리기를 사용해 원심분리함으로써 세포를 회수하였다.
세포를 완충제: 50mM Tris-HCl, 0.5% Triton X-100, 150mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8.0에 1:10 (W/V) 비율로 재-현탁하였다. 현탁물을, 4℃에서 미리 냉각시킨 다음, 900 bar 고압 하에 균질화하여, 3번 박테리아를 파괴하였다. 14000g에서 20분간 원심분리한 후, 침전물을 수집하였다.
수집한 봉입체 침전물을 50 mM Tris-HCl, 0.5% Triton X-100, 2M 우레아, 1mM EDTA를 함유한 pH 8.0의 완충제를 1:10 (W/V) 비율로 사용해 3번 세척하고, 50mM Tris-HCl, 5mM DTT를 함유한 pH 8.0의 완충제로 1번 세척하였다. 세척 조건: 실온에서 30분간 교반, 20분간 6000g로 원심분리.
(2) CTB-UreB 단백질 변성
봉입체를, 50mM Tris-HCl, 8M 우레아, 10mM DTT, 10% 글리세롤을 함유한 pH 8.0의 봉입체 용해 용액을 사용해 용해한 다음, 4℃에서 밤새 교반하고, 12000rpm으로 30분간 원심분리한 후 상층액을 사용하기 위해 수집하였다.
(3) CTB-UreB 단백질 정제
DEAE 및 SPHP 크로마토그래피를 수행하여 정제된 CTB-UreB를 수득하였다.
DEAE 컬럼 정제
평형 완충제: 20mM Tris-HCl, 8M 우레아, 10mM DTT, 10% 글리세롤, pH8.0
용출 완충제: 20mM Tirs-HCl, 8M 우레아, 250mM NaCl, 10mM DTT, 10% 글리세롤, pH8.0
SPHP 정제
평형 완충제: 20mM PB + 8M 우레아 + 5mM DTT+10% 글리세롤, pH7.2
세척 완충제: 20mM PB, 8M 우레아, 30mM NaCl, 5mM DTT, 10% 글리세롤, pH7.2, 컨덕티비티 (conductivity) < 3.7ms/m
용출 완충제: 20mM PB, 8M 우레아, 0.3M NaCl, 5mM DTT, 10% 글리세롤, pH7.2
불순물 세척 완충제: 20mM PB, 8M 우레아, 1M NaCl, 5mM DTT, 10% 글리세롤, pH7.2
CTB-UreB 정제에 대한 전기영동 사진은 도 8에 나타낸다.
1.1.3.2. CTB-UreB/4CTB 제조
CTB 벌크 물질을 50mM Tris-HCl, 8M 우레아를 함유한 pH8.0의 희석 완충제로 희석한 다음, pH를 pH 3.0 - 4.0로 적정하였다. 수득되는 용액을 실온에서 1시간 인큐베이션한 다음, pH를 pH 8.0로 적정하였다. 수득되는 용액은 4℃에서 정치시켰다.
2종의 단백질, CTB-UreB와 CTB 모노머를 1:4 몰 비율로 혼합한 다음 최종 리폴딩 용액 (50mM Tris-HCl pH8.0 + 10% 글리세롤 + 150mM NaCl)으로 5배 부피로 희석하였다. DTT 농도는 0.2-1.0mM 범위에서 통제하였으며, 우레아 농도는 1.0M-2.5M 범위로 통제하였다. 수득되는 결과물은 밤새 실온에서 정치시켰다.
상기한 용액을 킬레이팅 FF 및 QHP를 통해 정제하여, 정제된 CTB-UreB/4CTB를 수득하였다.
킬레이팅 FF
평형 완충제: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 20mM 이미다졸, pH8.0,
용출 완충제: 대상 단백질을 용출시키는 경우, 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 200 ~ 300mM 이미다졸, 전체 피크 수집;
불순물 세척 완충제: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 500mM 이미다졸, pH8.0
QHP 정제
완충제 A: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤, pH7.5
완충제 B: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 0.3M NaCl,pH7.5
대상 단백질을 용출시키는 경우, 0-100% B 10CV
CTB-UreB/4CTB 정제에 대한 전기영동 결과는 도 9A에 나타낸다.
1.1.3.3. 안정성 실험
정제된 CTB-UreB/4CTB 키메라 항원 벌크 물질 샘플의 pH를 염산을 사용해 여러가지 pH로 조절하였다. 1시간 동안 실온에서 정치시킨 후, 샘플을 SDS-PAGE 전기영동을 위해 취하였다. 전기영동 결과는 도 9B에 나타내는데, 여기서 다양한 레인의 샘플들은 다음과 같다: M: 사전-염색된 단백질 단편; 레인 1-7: 각각 pH 9.0, 8.0, 7.0, 6.0, 5.0, 4.0, 3.0 조건 하에 처리한 샘플들.
도 9B의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, pH 감소에 따라, 키메라 포지션에 위치되는 단백질의 농도가 전기영동 디스플레이에서 점차적으로 감소되었고, 키메라 보다 분자량이 작은 단백질 밴드가 여러개 나타났는데, 이는 더 작은 분자량의 분해 산물이 형성되었다는 것을 의미한다. 그러나, pH 7.0 보다 높은 pH, 특히 pH 8.0에서의 키메라 단백질은 안정적이었으며, 키메라 단백질 보다 분자량이 낮은 단백질 밴드들은 관찰되지 않았다. 이는, CTB-UreB/4CTB 항원 키메라가 중성 내지 약 알칼리 환경에서 안정적이며, 산성 조건에서는 쉽게 해리됨을 보여준다. 구체적으로, pH> 7.0인 경우에, 상대적으로 안정적이며, 바람직하게는 pH 8.0이다.
1.2 CTB-CagA/4CTB 제조
1.2.1 재조합 조작 박테리아 PET-28a-CTB-CagA/BL21-DE3의 구축
CTB-CagA는, UreB 유전자 대신 CagA 유전자를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1에서의 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. 구축된 조작 균주의 플라스미드 크기는, 이중 절단 후 1266 bp였으며 (도 5 참조), 융합 단백질의 발현은 도 7에 나타낸다.
유전자 서열 서열번호 :2, 여기서 링커는 밑줄 및 이탤릭체로 표시됨:
Figure pct00008
1.2.2 재조합 조작 박테리아 PET-28a-CTB-CagA/BL21 (DE3)의 발효
재조합 조작 박테리아 PET-28a-CTB-CagA/BL21 (DE3)은 실시예 1에서와 동일한 방식으로 발효시켰다.
1.2.3 CTB-CagA/4CTB 제조
1.2.3.1 CTB-CagA 제조
(1) CTB-CagA 봉입체를 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법을 사용해 추출하였다.
(2) 봉입체를 봉입체 용해 용액과 1: 20 (W/V) 비율로 혼합하고, 4℃에서 3시간 교반한 다음 밤새 정치시켰으며, 12000rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액을 수집하였다.
(3) Q FF 컬럼 정제
완충제 A: 20mM Tirs-HCl + 8M 우레아 + 5mM DTT+5% 글리세롤, pH7.5
완충제 B: 20mM Tirs-HCl, 8M 우레아, 1.0M NaCl, 5mMDTT, 5% 글리세롤, pH7.5
컬럼을 완충제 A로 밸런싱 및 세척하고, 완충제 B로 용출시켰다.
(4) SP 빅 비드 정제
완충제 A: 20mM Tris-HCl, 8M 우레아, 5mM DTT, 5% 글리세롤, pH7.5
완충제 B: 20mM Tirs-HCl, 8M 우레아, 150mM NaCl, 5mM DTT, 5% 글리세롤, pH7.5
컬럼을 완충제 A로 밸런싱 및 세척하고, 완충제 B로 용출시켰다.
CTB-CagA 정제에 대한 전기영동 사진을 도 10에 나타낸다.
1.2.3.2 CTB-CagA / 4CTB의 제조
CTB 벌크 물질을 50mM Tris-HCl, 8M 우레아를 함유한 pH8.0의 희석 완충제로 희석한 다음, 이의 pH를 pH 3.0 - 4.0로 적정하였다. 수득물을 실온에서 1시간 인큐베이션한 다음 pH를 pH 8.0로 적정하였다. 수득물을 4℃에서 정치 유지시켰다.
2종의 단백질, CTB- CagA와 CTB 모노머를 1:4 몰 비로 혼합한 다음, 최종 리폴딩 용액 (50mM Tris-HCl pH8.0 + 10% 글리세롤 + 150mM NaCl)으로 5배 부피로 희석하였다. DTT 농도는 0.2-1.0mM 범위에서 통제하였으며, 우레아 농도는 1.0M-2.5M 범위로 통제하였다. 수득되는 결과물은 밤새 실온에서 정치시켰다.
상기한 용액을 킬레이팅 FF 및 SP HP를 통해 정제하여, 정제된 CTB-CagA/4CTB를 수득하였다.
킬레이팅 FF 컬럼 정제
완충제 A: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 20mM 이미다졸, pH8.0
완충제 B: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 200mM 이미다졸, 대상 단백질을 용출시킴
불순물은 100% 완충제 B로 세척하였다.
SP HP 컬럼 정제
완충제 A: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤, pH7.5
완충제 B: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 0.3M NaCl, pH7.5
CTB-CagA/4CTB 키메라 단백질 정제에 대한 전기영동 사진은 도 11A에 나타낸다.
1.2.3.3 안정성 실험
정제된 CTB-CagA/4CTB 키메라 항원 벌크 물질 샘플의 pH를 염산으로 희석함으로써 여러가지 pH로 만들었다. 1시간 동안 실온에서 정치시킨 후, 샘플을 SDS-PAGE 전기영동을 위해 취하였다. 전기영동 결과는 도11B에 나타내는데, 여기서 다양한 레인의 샘플들은 다음과 같다: M: 사전-염색된 단백질 단편; 레인 1-7: 각각 pH 9.0, 8.0, 7.0, 6.0, 5.0, 4.0, 3.0 조건 하에 처리한 샘플들.
도 11B의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, pH 감소에 따라, 키메라 포지션에 위치되는 단백질의 농도가 전기영동 디스플레이에서 점차적으로 감소되었고, 키메라 보다 분자량이 작은 단백질 밴드가 여러개 나타났는데, 이는 더 작은 분자량의 분해 산물이 형성되었다는 것을 의미한다. 그러나, pH 7.0 보다 높은 pH, 특히 pH 8.0에서의 키메라 단백질은 안정적이었으며, 키메라 단백질 보다 분자량이 낮은 단백질 밴드들이 나타나지 않았다. 이는, CTB-CagA/4CTB 항원 키메라가 중성 내지 약 알칼리 환경에서 안정적이며, 산성 조건에서는 쉽게 해리됨을 보여준다. 구체적으로, pH> 7.0인 경우에, 상대적으로 안정적이며, 바람직하게는 pH 8.0에서 안정적이다.
1.3 CTB-NAP/4CTB 제조
1.3.1 재조합 조작 박테리아 PET-28a-CTB-NAP/BL21-DE3 구축
CTB-NAP는, UreB 유전자 대신 NAP 유전자를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1에서의 방법과 동일한 방법으로 제조하였다. 구축된 조작 균주의 플라스미드 크기는, 이중 절단 후 789 bp였으며 (도 5 참조), 융합 단백질의 발현은 도 7에 나타낸다.
유전자 서열 서열번호 :3, 여기서 링커는 밑줄 및 이탤릭체로 표시됨:
Figure pct00009
1.3.2 재조합 조작 박테리아 PET-28a-CTB-NAP/BL21 (DE3)의 발효
재조합 조작 박테리아 PET-28a-CTB-NAP/BL21 (DE3)은 실시예 1에서의 방법과 동일한 방법으로 발효시켰다.
1.3.3 CTB-NAP/4CTB 제조
1.3.3.1 CTB-NAP 제조
(1) CTB-NAP 봉입체를 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법을 사용해 추출하였다.
(2) CTB-NAP 봉입체를 20mM Tris-HCl, 8M 우레아를 함유한 pH 8.0의 완충제로 용해하고, 밤새 인큐베이션한 다음, 12000rpm으로 30분간 원심분리하여 상층액을 수집하였다.
(3) QFF 크로마토그래피:
완충제 A: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤, pH7.5
완충제 B: 20mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 0.3M NaCl, pH7.5
컬럼을 완충제 A로 밸런싱 및 세척하고, 완충제 B로 용출시켰다. CTB-NAP 융합 단백질 정제에 대한 전기영동 사진은 도 12에 나타낸다.
1.3.3.2 CTB-NAP/4CTB의 제조
(1) CTB-NAP의 가공: CTB-NAP 샘플을 20mM Tris-HCl, 8M 우레아를 함유한 pH 8.0의 완충제로 희석한 다음, 이의 pH를 pH 8.0으로 적정하였다. 그런 후, 머캅토에탄올을 최종 농도 3mM로 첨가하였다.
(2) CTB의 가공: CTB 벌크 용액을 20mM Tris-HCl, 8M 우레아를 함유한 pH 8.0의 희석 완충제로 희석한 다음, 이의 pH를 pH 3.5 - 3.7로 적정하였다. 수득물을 실온에서 1시간 인큐베이션한 다음, pH를 pH 8.0로 적정하였다. 머캅토에탄올을 최종 농도 3mM로 첨가하였다.
(3) 재생:
가공 처리한 2종의 단백질 CTB-NAP와 CTB 모노머를 1:4 몰 비로 혼합한 다음 50mM Tris-HCl, 5% 글리세롤, 0.03 mM GSSG를 함유한 pH 8.0 완충액으로 1:6 비율로 희석하였다. 머캅토에탄올은 0.2-1.0 mM 범위로 통제하였고, 우레아의 농도는 1.0M-2.5M 범위로 통제하였다. 수득한 용액을 밤새 21℃에서 정치 유지하였다.
(4) NI FF 정제:
완충제 A: 50mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 20mM 이미다졸, pH8.0
완충제 B: 50mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 300mM 이미다졸, pH8.0
이미다졸을 재생을 위해 샘플에 최종 농도 20mM로 첨가하였다. 샘플을 NI FF 컬럼에 주입하였고, 유속은 8 ml/min이었으며, 컬럼을 완충제 A로 헹구고, 완충제 B로 용출시켰다.
(5) QHP 정제
완충제 A: 50mM Tris-HCl + 5% 글리세롤,
완충제 B: 50mM Tris-HCl + 5% 글리세롤 + 1M NaCl, pH8.0
NI FF 컬럼의 용출된 샘플 (컨덕티비티 4-5)을 유속 3ml/분으로 QHP 컬럼에 주입하였다. 그런 후, 컬럼을 완충제 A로 밸런싱 및 세척하고, 완충제 B 30%로 용출시켰으며, 유속은 1ml/min이었다.
CTB-NAP/4CTB 키메라 단백질의 정제에 대한 전기영동 사진은 도 13에 나타낸다.
2. 마우스를 대상으로 하는 재조합 헬리코박터 필로리 (rHP) 백신의 면역원성 실험
2.1 키메라 단백질 CTB-UreB/4CTB의 면역원성 실험
2.1.1 BALB/c 마우스의 면역화 방법
2.1.1.1 테스트 시스템: 8-10주령, 체중 18-20g, SPF 등급, 암컷 BALB/c 마우스.
2.1.1.2 시험 항목: UreB, CTB-UreB 융합 단백질, CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질을 각각 Tris-HCl 완충제 (pH 8.0)로 희석하였다. UreB 단백질 면역화를 위한 투여량은 20㎍/mouse이며, CTB-UreB 융합 단백질과 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질은 UreB 단백질 그룹의 UreB와 등가의 몰 함량으로 투여한다. 제산제 (antacid)를 PBS에 첨가하여 50mg/ml로 희석하였다.
2.1.1.3 4개의 그룹을 본 실험에서 확립하였다: UreB 그룹, CTB-UreB 그룹, CTB-UreB/4CTB 그룹 및 염수 그룹 (또는 블랭크 대조군 (CON, 대조군)).
2.1.1.4 마우스 면역화 프로그램: 7일 간격으로 총 4회로 마우스에 백신 접종하였다. 각 동물에 실험 약제를 위관 영양을 통해 0.2ml 경구 투여하였다. 투여하기 10분 전에, 제산제 0.2ml을 투여하였다. 동물들 모두 실험하기 전 12시간 동안 물을 제외하고는 금식시켰다. 물과 사료는 투여한지 1시간 후에 다시 공급하였다.
2.1.1.5 샘플 수집 및 검사:
각 마우스 그룹의 혈액을 면역화하기 하루 전날과, 1차 투여 후 2주, 4주, 6주, 8주 및 10주째에, 혈청 IgG와 IgA 항체 수준을 측정하기 위해, 채혈하였다. 마지막 수집시 안구를 통해 채혈하는 것을 제외하고는; 그외 채혈은 마우스 꼬리를 통해 수행한다. 혈액 샘플들 모두 밤새 4℃에 두고, 다음날 샘플들 모두 4℃에서 5000rpm으로 15분간 원심분리한 다음, 혈청의 상층액을 취하여, -20℃에 보관하였다.
1차 면역화 후 10주째에 안구를 통해 채혈한 후 모든 동물을 안락사시켰다. 개복 후, 회맹부의 거의 끝부분 10cm 회장을 절단하여, PBS로 3번 세척한 다음, 장 점막을 멸균 블레드로 긁어 0.01 mol/L PBS 완충제 (pH7.4, 50mmol/L EDTA, 20nmol/L 프로테아제 저해제 루펩틴 및 펩스타틴 함유) 1ml에 용해하였다. 용해물을 10분간 10000rpm에서 원심분리하고, 상층액을 취하여 여기에 100 mmol/L PMSF (Sigma) 20㎕를 첨가하였다. 혈청 IgG와 장 점막 sIgA 항체 수준을 ELISA로 측정하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트에서, 각 웰에 UreB 항원 (1.25㎍/ml) 100㎕을 넣어, 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 웰내 용액을 다음날 버리고, 웰을 PBST로 3번 헹군 다음; 각 웰에 블롯킹 용액 200 ㎕ (2 % BSA 함유)을 첨가하여 37℃에서 2시간 블롯킹한 다음 PBST로 3회 세척하고; 각 웰에 혈청 (1:300 희석물) 100㎕을 첨가하여, 37℃에서 1시간 반응 시킨 다음 PBST로 3번 웰을 세척하였으며, 각 웰에 100 ㎕의 HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG (1: 2000-1: 50000)/HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG (1: 4000-1: 8000)를 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, PBST로 6번 세척하였고; 금방 제조한 기질 용액을 즉각적으로 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가하여, 실온에서 15분간 반응하도록 둔 다음, 정지 용액 50 ㎕를 웰에 첨가하고; 각 웰의 흡광도 OD 450 값을 마이크로플레이트 검출기로 측정하였다.
2.1.2 결과
HP 백신으로 경구 면역화한 후, BALB/C 마우스의 혈청 IgG와 장 점막 항체 sIgA 반응을 도 14 및 도 15에 나타내었다. 대조군과 UreB 단백질 그룹에서 마우스의 항체 수준은 투여 후 증가하지 않는 반면, CTB-UreB 융합 단백질 그룹과 CTB- UreB/4CTB 키메라 단백질 그룹에서는, 마우스의 혈청내 IgG 항체 수준이 1차 면역화 후 4주째에 현저하게 증가하였고, 8주째에 피크에 도달하였으며, 비교 결과, 양쪽 그룹은 대조군과 비교해 유의한 차이가 존재하는 것으로 나타났으며 (P<0.001); 이들 2개의 그룹에서는 sIgA 장 점막 항체의 수준이 명확하게 증가하였고, 대조군과 비교해 현저한 차이가 있었다 (P<0.001). 융합 단백질 CTB-UreB 그룹의 마우스의 경우, 항-UreB 항체의 혈청 전환율 (seroconversion rate)은 60%였으며; CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질 그룹의 마우스의 경우 항-UreB 항체의 혈청 전환율은 95%였는데, 이는 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질 백신이 유의한 면역 반응을 유발할 수 있음을 시사해준다.
2.1.3 결론
재조합 CTB-UreB 융합 단백질 및 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질을 경구 투여하면 신체가 UreB 항체에 대한 특이적인 항체를 생산하도록 자극할 수 있다. 그러나, CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질에 의해 유발되는 면역 반응은 CTB-UreB 융합 단백질에 의한 면역 반응 보다 현저하게 우수하였는데, 이는 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질이 면역 반응과 면역원성이 우수하며, 따라서 헬리코박터 필로리의 예방 백신용 후보제로서 사용할 수 있음을 시사해준다.
2.2 CTB-CagA / 4CTB 키메라 단백질의 면역원성
2.2.1 BALB/c 마우스에 대한 면역화 방법
면역화 방법은 섹션 2.1.1.에 기술된 방법과 동일하였다. Cag A 단백질, CTB-CagA 융합 단백질, CTB- CagA/4CTB 키메라 단백질을 각각 Tris-HCl 완충제 (pH 8.0)로 희석하였다. CagA 단백질의 면역화를 위한 투여량은 200㎍/mouse이며, CTB- CagA 융합 단백질과 CTB-CagA/4CTB 키메라 단백질은 CagA 단백질 그룹의 CagA과 등가의 몰 함량으로 투여하며, 부피는 0.2 ml/mouse이다. ELISA에서, 웰을 CagA 항원으로 코팅하였다. 혈청 IgG와 장 점막 sIgA 항체 반응을 도 16과 17에 나타낸다.
2.2.2 결론
재조합 CTB-CagA/4CTB 키메라 단백질을 경구 투여하면, 특이적인 항-CagA 항원 항체를 생산하도록 신체를 자극할 수 있다. 이러한 결과는, CTB-CagA/4CTB 키메라 단백질이 우수한 면역 반응과 면역원성을 가지고 있으며, 따라서 헬리코박터 필로리를 예방하기 위한 백신 후보로서 사용할 수 있음을 보여준다.
2.3 CTB-NAP/4CTB 키메라 단백질의 면역원성
2.3.1 BALB/c 마우스에 대한 면역화 방법
면역화 방법은 섹션 2.1.1.에 기술된 방법과 동일하였다. 시험 항목 NAP 단백질, CTB-NAP 융합 단백질, CTB-NAP 4CTB 키메라 단백질을 각각 Tris-HCl 완충제 (pH 8.0)로 희석하였다. NAP 단백질 면역화를 위한 투여량은 200㎍/mouse이고, CTB-NAP 융합 단백질과 CTB-NAP/4CTB 키메라 단백질은 NAP 단백질 그룹의 NAP와 등가의 몰 함량으로 투여하며, 그 부피는 0.2ml/mouse였다. ELISA에서, 웰을 NAP 항원으로 블롯킹하였다.
2.3.2 결과
HP 백신으로 면역화한 후, BALB/c 마우스에서 혈청 IgG와 장 점막 sIgA 항체의 반응을 도 18과 19에 나타내었다.
2.3.3 결론
재조합 CTB-NAP/4CTB 키메라 단백질을 경구 투여하면, 특이적인 항-NAP 항원 항체를 생산하도록 신체를 자극할 수 있다. 이러한 결과는, CTB-NAP/4CTB 키메라 단백질이 우수한 면역 반응과 면역원성을 가지고 있으며, 따라서 헬리코박터 필로리를 예방하기 위한 백신 후보로서 사용할 수 있음을 보여준다.
3. BALB/c 마우스에서 헬리코박터 필로리 SS1 균주 감염에 대한 재조합 헬리코박터 필로리 백신의 면역 보호
3.1 검사 방법
3.1.1 면역화 방법은 섹션 2.1.1.의 방법과 동일하였다.
3.1.2 HP SS1 박테리아 기회감염:
마지막 면역화 후 2주 후에, 시험군과 대조군의 동물들에게 HP SS1 박테리아 0.2 ml (1x109 CFU/ml)을 3일 연속하여 하루에 1회씩 위관 영양을 통해 경구로 투여하였다. 제산제 0.2ml을 HP SS1 박테리아 투여하기 10분 전에 위관 영양을 통해 경구로 투여하였다.
3.1.3 샘플 수집 및 검사
혈청 및 장 점막에 대한 샘플 수집과 검사 방법은 섹션 2.1.1.5.와 동일하였다.
HP SS1 박테리아로 기회 감염한 후 4주째에 동물들을 모두 희생시키고, 개복하여 위를 적출한 다음, 장축을 따라 위 조직을 3개의 섹션으로 분할하였으며, 각 섹션에는 기저부, 위 체부와 진정부 (antrum)가 포함되었다. 섹션 하나는 박테리아의 정량적인 배양을 수행하는데 사용하였다: 진정부 조직은 멸균 쪽집게로 잡고, 이의 점막하 표면을 이용해 37℃에서 선택적인 HP 배양 플레이트를 덮은 다음 플레이트를 미세-호기 조건에서 약 1일 배양하였다. 투명하고, 매끈한, 작은 침상 콜로니가 관찰되면, 이것은 양성 샘플로 간주하였다.
2번째 섹션은 96웰 플레이트에서 신속 우레아제 검사에 사용하였다: 우레아제 시약 용액을 랫 위 조직이 담긴 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였으며, 각 웰은 100㎕로 부피를 맞추었으며, 실온에서 0.5시간 동안 밀폐된 상태로 두었다. 시약의 색이 노란색에서 붉은 색으로 바뀌면, 이를 양성 샘플로 간주하였고, 즉, 이 샘플은 HP 감염된 것으로 간주하였다.
3번째 섹션은 4% 파라포름알데하이드에서 고정한 후, 파라핀-포매한 다음, 슬라이스하고, HE 염색, 김자액 염색을 수행하였고, HP SS1 박테리아 군집화와 염증 조직을 현미경으로 검경하였다.
3.2 결과
3.2.1 면역화/기회감염 후 마우스에서 독성 및 유해 반응의 관찰
각 마우스 그룹은 양호한 정신 상태를 유지하였고, 무기력함, 설사 및 그외 유해한 효과는 관찰되지 않았다.
3.2.2 혈청/장 점막 IgG/sIgA 항체 결과
블랭크 대조군, UreB 단백질 그룹 및 UreB + CTB 그룹 마우스의 항체는 투여 후 증가하지 않는 반면, CTB-UreB 융합 단백질 그룹의 마우스 및 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질 그룹의 마우스에서는 혈청 IgG 항체와 장 점막 항체 sIgA가 1차 투여 후 9.5주째에 현저하게 증가하였으며, 블랭크 대조군과 비교한 바 유의한 차이가 확인되었다. 그 결과는 도 20 및 21에 나타낸다.
3.2.3 조직 스미어 (tissue smear) 및 우레아제의 신속 검출
각 그룹의 마우스를 대상으로 신속 우레아제 검사와 조직 스미어를 기회 감염 4주 후에 수행하였으며, 그 결과를 나타내었다: 모델군의 동물 8마리 모두 HP SS1으로 감염되어, 우레아제 검사와 조직 스미어에서 양성 결과가 나타났으며; 블랭크 대조군 (HP SS1 기회감염하지 않음)의 동물들 모두에서는 우레아제 검사와 조직 스미어에서 음성 결과가 나타났으며; UreB 그룹의 경우 동물 7마리가 우레아제 검사와 조직 스미어 검사에서 양성 결과를 나타내었고; CTB-UreB 그룹의 경우 동물 5마리가 우레아제 양성 결과를 나타낸 반면, 동물 4마리는 스미어 검사에서 양성이었으며; CTB-UreB/4CTB 그룹에서는 오직 동물 한마리만 우레아제 검사에서 양성 결과를 나타내었으며, CTB-UreB/4CTB 그룹의 동물들 모두 스미어 검사에서는 음성 결과를 나타내었다. 이들 결과는 표 1에 나타낸다.
표 1: 본 발명의 구현예에 따른 rHP 백신을 경구 투여한 후, HP SS1을 기회감염한 마우스에 대한 검사 결과
Figure pct00010
3.2.4 조직병리학적 염색 결과
대조군의 마우스에서는 위소와 (gastric pit)에서 다수의 공 모양의 헬리코박퍼 필로리 군락과, 위 점막 고유층의 심부에서 중간까지 많은 수의 대식세포와 호중구의 침윤이 관찰되었다. CTB-UreB 융합 단백질 그룹의 마우스에서는 위소와에서 소량의 헬리코박터 필로리 군락과 중간 수준의 대식세포 및 호중구의 침윤, 그리고 위 점막 고유층의 심부에서의 경미한 염증이 관찰되었으며; CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질 그룹의 마우스에서는 위소와에서 극 소량의 헬리코박터 필로리 군락이 관찰되었고, 조직 섹션에서 대식세포와 호중구 침윤은 관찰되지 않았다 (도 22 참조).
3.3 결론
실험 전체에서, CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질을 이용한 면역화를 제공받은 마우스에서는 유해한 반응은 나타나지 않았으며, 병리학적 검사에서 면역화된 마우스에서 위내 현저한 염증 변화는 없는 것으로 확인되었는데, 이는 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질을 항원으로서 이용한 HP 백신이 실험 투여량으로 면역화를 위해 사용하는 경우, 양호한 보호를 제공함을 의미한다.
CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질은 경구 면역화를 통해 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있으며, HP SS1 박테리아 기회 감염을 시험한 마우스에서 양호한 예방 효과를 나타낸다. 따라서, 이 단백질은 항-HP 감염 경구 백신으로서 유망한 전망을 가진다.
상기한 검출 실험의 결과들은, 재조합 CTB-UreB 융합 단백질 및 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질의 경구 투여가 Ure 항원에 대한 특이적인 항체를 생산하도록 신체를 자극할 수 있는 것으로 나타났으며; CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질로 면역화된 마우스로부터 수득되는 혈청 특이 IgG 및 위 점막 sIgA 항체의 역가와 혈청변환율이 CTB-UreB 융합 단백질 경우 보다 현저하게 높으며, 대조군과의 비교시 유의한 차이가 있었는데, 이는 상기 항원들이 양호한 면역반응성과 항원성을 가지고 있어, HP의 후보 백신으로서 사용될 수 있음을 시사해준다.
그 결과, CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질에 의해 생산되는 항체 수준은 UreB 단독으로 면역화함으로써 생성되는 항체 보다 현저하게 높은 것으로 나타났다. 그리고, 혈청 항체와 분비 항체 측면에서 모두, CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질이 항체 수준의 현저한 증가를 유도하는 것으로 관찰되었다. 이는, 본 발명의 항원 조성물이 오리지날 항원의 면역원성을 현저하게 개선시키며, 신체의 면역 반응을 강화하여, 보다 효과적인 백신이 만들어지는데 기여하였다는 것을 시사해준다. 표 1 및 도 14의 분비형 IgA 검사 결과 역시, 본 발명의 재조합 단백질 항원과 더불어 구축된 키메라 단백질이 항원이 장 점막을 침투하여 분비형 IgA를 생산하도록 점막을 자극하는데 우호적이라는 것을 보여주었다.
비교예 1
본 발명자들은 UreB 및 콜레라 독소의 A2 서브유닛(CTA 2)과 같은 헬리코박터 필로리 항원의 융합 단백질 발현하기 위한 발현 벡터를 구축하였고, 이 융합 단백질을 시험관내에서 발현된 CTB 단백질과 조합하여, UreB-CTA2-/5CTB의 키메라 단백질을 만들고자 하였다.
종래 기술에 따르면, CTA2와 CTB의 조합 방식은, CTB 자체적으로 모든 비-공유 결합을 형성하므로, 동일한 방법은 비슷한 수율을 가져야 한다.
그러나, 그 결과, UreB-CTA2/5CTB 키메라 단백질의 조립 효율은 <5%이고 (도 23A), 반면 CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질의 조립 효율은 > 90%로 (도 23B), 본 발명의 CTB-UreB/4CTB가 UreB-CTA2/5CTB 보다 훨씬 조립 효율이 높다. CTB-UreB/4CTB 키메라 단백질은 낮은 조립 효율로 인한 UreB-CTA2/5CTB의 소량 생산 가능성 문제를 유의하게 해결할 수 있다.
비교예 2
본 발명자들은 CTB-항원 융합 단백질과 CTB의 동시 발현을 위한 진핵생물 발현 시스템으로서 효모를 이용하고자 시도하였으며, 원하는 효과를 가진 천연적으로 발생된 키메라 구조를 수득하고자 하였다. 본 발명자들은, 효모 시스템에서 발현시, CTB가 동일한 CTB 모노머 5개로 구성된 호모-펜타머 구조를 바르게 형성할 수 없고, 발현된 CTB의 분자량 (약 65KD)이 천연 상태의 분자량 (55KD) 보다 현저하게 높다는 것을 발견하였는데, 이는, 진핵 생물 시스템에서 발현되면, CTB 당화가 번역후 수정으로서 발생될 수 있으며, 따라서 발현된 CTB와 천연 CTB 분자 간에 큰 차이가 존재하므로, GM1 수용체와의 결합력을 발휘하는데 좋지 않은 것으로 시사되었다. 동시에, 이런 방식으로 키메라를 제조하는 경우에는, CTB에 융합시키는 항원에 엄격한 크기 제한이 뒷따른다. 또한, 이런 방식으로 발현하면, 융합 단백질과 CTB의 자연적인 조립 효율이 낮아, 전체 시스템의 발현 수율이 매우 낮고, 따라서 백신의 대량 생산에 적용할 수 없다.
비교예 3
본 발명자들은 원핵세포 발현 시스템의 예로서 E. coli에서 CTB-항원 융합 단백질과 CTB를 동시에 발현시키고자 시도하였으며, 키메라가 자연적으로 형성되기를 원하였다. 콜레라 독소 B 서브유닛의 펜타머 조립 기전은 알려져 있지 않기 때문에, 현재 다양한 실험들에서 키메라의 조립이 침투 프로세스에서 이루어지는 것으로 동의되어 있다. E. coli 발현 시스템에서, 신호 펩타이드를 가진 CTB-항원 융합 단백질은 세포막을 적절하게 침투할 수 없으며, 바람직한 키메라 구조를 형성할 수 없다. 또한, 세포내에서 발현된 융합 단백질은 대부분 봉입체를 형성하며, CTB는 첫번째 아미노산인 메티오닌의 존재로 인해 천연적인 CTB 펜타머를 형성할 수 없으므로, 따라서 바람직한 키메라 구조를 형성할 수 없다.
전술한 설명들에서는, 단지 본 발명의 CTB-X-4CTB 시스템의 적용과 항원의 면역원성을 강화하는 효과를 설명하기 위한 예로서, 헬리코박터 필로리-관련 항원을 예로 들었을 뿐이다. 당해 기술 분야의 당업자는 경험과 이해를 토대로, 본 발명의 CTB-X-4CTB 시스템을 다양한 다른 점막 면역 항원, 비제한적인 예로, 헬리코박터 필로리 항원, 장티푸스 항원, 인플루엔자 HA 항원에 적용하여, 이들 항원의 면역원성을 향상시키고, 매우 강력한 백신을 제조할 수 있다는 것을 추론할 수 있다. 대응되는 담체 선정 및 단백질의 준비, 발현 및 정제는 당해 기술 분야에서 공지의 기술이며, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 내용을 숙지한 후 본 발명의 CTB-X-4CTB 시스템을 이용해 해당 융합 단백질과 항원 조성물을 제조할 수 있으며, 면역원성의 증가를 검출할 수 있다.
따라서, 전술한 설명은 본 발명의 바람직한 구현예일 뿐, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 사상과 원리내에서 이루어지는 모든 수정, 등가의 치환 및 개선은 본 발명의 보호 범위에 포함되어야 한다.
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Claims (17)

  1. 키메라 항원 (antigen chimera)으로서,
    항원과, 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머로 된, 융합 단백질; 및
    상기 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머를 포함하며,
    상기 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머가 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 및 E. coli 이열성 장독소 (heat-labile enterotoxin) B 서브유닛 (LTB)으로부터 선택되는 하나이고,
    상기 다량체가 펜타머이고,
    상기 키메라 항원에서, 상기 융합 단백질 : 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머의 몰 비가 1:4이며,
    상기 키메라 항원이 안정적인 pH는 > pH7.0이며, 바람직하게는 pH 8.0인, 키메라 항원.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 키메라 항원에서 콜레라 독소 B 서브유닛과 E. coli 이열성 장독소 B 서브유닛이 본래의 천연 구조 (natural structure)이거나, 또는 펜타머를 형성할 수 있는 돌연변이인, 키메라 항원.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 키메라 항원에서 항원은 분자량이 10 - 100kD, 바람직하게는 16kD - 65kD 범위인, 키메라 항원.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 항원이 점막 면역에 적합한 항원인, 키메라 항원.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 항원이, 비제한적으로, 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) 항원, 장티푸스 항원, 인플루엔자 HA 항원을 비롯하여, 점막 경로를 통해 인간 또는 동물의 신체에 감염하는 병원체로부터 유래된 항원들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키메라 항원.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 헬리코박터 필로리 항원이 헬리코박터 필로리 우레아제 (urease) B 서브유닛 (UreB), 헬리코박터 필로리 세포독소 관련 유전자 A (CagA) 및 호중구 활성화 단백질 (NAP)로부터 선택되는 1종 이상인, 키메라 항원.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 상기 항원과 상기 점막 면역 보강제 단백질 모노머 사이에 위치된 3개의 G4S 링커를 포함하는, 키메라 항원.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따른 키메라 항원을 포함하며,
    상기 키메라 항원이 안정적인 pH가 >pH7.0이며, 바람직하게는 pH 8.0인,
    항원 조성물.
  9. 제8항에 따른 항원 조성물 및 백신에 적합한 부형제를 포함하는 백신.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 백신이 경구 백신, 코 투여용 백신 또는 직장 투여용 백신인, 백신.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에서 정의되는 융합 단백질을 발현하는 벡터; 및 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에서 정의되는 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머를 발현하는 벡터를 포함하는, 항원 조성물을 제조하기 위한 카세트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 벡터가 원핵세포 발현 벡터인, 카세트.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따른 키메라 항원의 제조 방법으로서,
    제10항에 따른 카세트의 벡터를 이용해 융합 단백질과 다량체를 형성할 수 있는 점막 면역 보강제 단백질 모노머를 각각 발현하는 단계;
    이들 2종의 단백질을 조합하여, 재생 방법 (renaturation method)을 통해 키메라를 형성하는 단계를 포함하며;
    상기 재생 방법이, 상기 2종의 단백질을 "우레아 및 다이티오트레이톨 (DTT)" 또는 "우레아 및 머캅토에탄올"을 포함하는 리폴딩 용액 (refolding solution)에 함께 위치시킴으로써, 2종의 단백질을 재생하는 단계를 포함하며,
    바람직하게는, 상기 리폴딩 용액의 pH는 >7.0이며, 더 바람직하게는 pH 8.0인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 리폴딩 용액에서 상기 우레아의 농도가 1.0M - 2.5M인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 DTT 또는 머캅토에탄올의 농도가 0.2mM - 1.0mM인, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서,
    재생 단계 이전에, 상기 단백질 모노머를 6 M - 9 M 우레아, 바람직하게는 8 M 우레아를 포함하는 pH 3.0 - 4.0의 완충액내에서 0.5 - 3시간 동안, 바람직하게는 1시간 동안 예비-리폴딩하는, 방법.
  17. 재생에 의해 키메라를 제조하는 방법으로서,
    상기 키메라는,
    (1) 단백질과 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머로 된 융합 단백질, 및
    (2) 상기 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머를 포함하며,
    상기 키메라는, (1)의 융합 단백질의 단백질 모노머와 (2)의 단백질 모노머가 융합되어 다량체를 형성함으로써, 형성되며,
    상기 방법은,
    상기 (2)의 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머를 6 M - 9 M 우레아, 바람직하게는 8 M 우레아를 포함하는 pH 3.0 - 4.0의 완충액내에서 0.5 - 3시간 동안, 바람직하게는 1시간 동안 예비-리폴딩하는 단계; 및
    상기 (1)의 융합 단백질과 상기 (2)의 다량체를 형성할 수 있는 단백질 모노머를, 키메라를 형성하기 위해, 1.0M - 2.5M 우레아 및 0.2mM - 1.0 mM DTT 또는 머캅토에탄올을 포함하는 리폴딩 용액에서 리폴딩하는 단계를 포함하며,
    바람직하게는 상기 리폴딩 용액의 pH는 >7.0이고, 더 바람직하게는 상기 리폴딩 용액의 pH는 8.0인, 방법.
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