CN102161999A - 一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法。本发明方法将猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因插入原核表达载体pET28a而构建表达载体pEF28a-cC1，转化大肠杆菌，从而建立了一种表达菌株。培养该表达菌株，用终浓度为0.05-0.5mmol/L的IPTG诱导，诱导温度30-37℃，诱导时间6-10h，外源蛋白可溶性表达量可高达菌体总蛋白的60％，从而获得稳定高效可溶性表达重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的工艺方法，为产业化生产重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1奠定了基础。

Description

一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法。

技术背景

猪囊尾蚴期特异性抗原cC1(cysticercus common antigen 1)是以囊虫病患者、囊虫病病猪血清为探针从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选的具有高度特异性的人、猪共同抗原，该蛋白基因序列具有4个膜联蛋白家族的保守序列，故将其归属于膜联蛋白家族，又命名膜联蛋白32(Annexins 32)或膜联蛋白B1(AnnexinsB1)(孙树汉，王俊霞，陈蕊雯，等.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，15(1)：15-20；颜宏利，孙树汉，陈蕊雯.第二军医大学学报，2002，23(4)：381-383；Hongli Y，Shuhan S，Ruiwen C，et al.Mol Biochem Parasitol.2002，119(1)：1-5；Zhang Y，Wang KH，Guo YJ，et al.Biol Chem.2007，388(6)：601-610.)。该抗原可用作为人、猪囊尾蚴病的诊断性抗原，同时，它还是囊尾蚴病的一个较好的疫苗候选分子，对囊尾蚴病有较好的保护性(吴丹，郭瀛军，林懿，等.第二军医大学学报，2000，21(6)：508-510；Li DA，He Y，Guo YJ，et al.Vaccine.2007，25(5)：932-938.)。然而，无论是作为诊断性抗原或亚单位疫苗，稳定高效的表达都是其有效应用的重要前提。

重组蛋白在大肠杆菌中能否表达及高表达受很多因素的影响，如大肠杆菌菌株、原核表达载体、诱导时间和温度以及诱导剂使用浓度等。曾有研究采用pGEX表达系统表达cC1融合蛋白，尽管亦可获得较高的表达量，但其纯化标签蛋白为日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)，其分子量较大，对目的蛋白的结构和功能可能产生较多影响，通常需要切除(陈蕊雯，林懿，孙树汉.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2000，18(1)：37-39.)。而且，在日本血吸虫流行区，人群中抗GST抗体阳性者有较大比例，如用pGEX表达系统表达的cC1重组蛋白作为诊断用抗原，则必须切除融合和GST标签，否则，会引起交叉反应，导致假阳性结果的出现。而这势必则增加了cC1蛋白表达纯化的难度和成本。为了获得大量廉价高纯度的重组cC1蛋白，zhang等曾尝试用pJLA503表达系统表达非融合性cC1蛋白蛋白，尽管其最终获得了纯度高达98％的cC1重组蛋白，但其需要2步色谱纯化，且最终得率仅为cC1重组蛋白表达量的10％，而在该系统，cC1重组蛋白表达量则仅为总菌体蛋白量的35.2％(Zhang Y，Guo YJ，Sun SH，et al.Zhang Y，Guo YJ，Sun SH，et al.Protein Expr Purif.2004，34(1)：68-74.)。

因此，本领域迫切需要一种能够稳定高效表达可溶性的、易于纯化的、对蛋白结构功能影响不大的、与其他疾病标志无交叉反应的猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的表达方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法，具体是将猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因插入pET28a载体，并转化入宿主菌，获得一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1表达菌株；继而对诱导表达方法进行选择，获得稳定高效可溶性表达重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的工艺方法。

本发明提供了一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的表达载体pET28a-cC1，该载体含有猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因，它插入载体pET28a。

所述的表达载体pET28a-cC1的构建：

根据猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因序列(SEQ ID NO.1)合成2条引物(引物1：5′-GGATCCATGGCCTACTGTCGCTCC-3′(SEQ ID NO.2)，引物2：5′-CTCGAGTTATGCAGGGCCGATGAG-3′(SEQ ID NO.3))，提取猪囊尾蚴总RNA，以RT-PCR扩增出猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因，将PCR产物和载体pET28a分别以BamHI、XhoI酶切后，T4DNA连接酶连接，将猪囊尾蚴期特异性抗原cC 1基因插入载体pET28a的BamHI、XhoI之间。

上述PCR和酶切、连接反应的方法在本领域是已知的，具体操作按相关试剂说明书进行。

另一方面，本发明提供了一种重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1的表达菌株，它含有表达载体pET28a-cC1。优选地，该表达菌株的宿主菌为大肠杆菌。更优选地，为大肠杆菌BL21(DE3)。

该表达菌株的制备方法，包括将上述表达载体pET28a-cC1转化宿主菌的步骤。

将表达载体转化宿主菌的方法在本领域是已知的，例如电穿孔转化法或热激转化感受态细胞法。宿主菌感受态细胞的制备按照《分子克隆实验指南》(第三版)的方法制备。

由于培养和诱导表达条件对重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1的表达有显著影响，因此，本发明还提供了重组重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1高效可溶性表达的方法，该方法通过培养上述表达菌株实现。

在本发明中，提供了一种重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1高效可溶性表达的方法，该方法包括培养上述表达菌株的步骤，诱导温度为30-37℃。

在本发明中，提供了一种重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1高效可溶性表达的方法，该方法通过培养上述表达菌株实现，诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的终浓度为0.05-1.0mmol/L。优选的，IPTG的终浓度为0.05-0.5mmol/L。

在本发明中，提供了一种重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1高效可溶性表达的方法，该方法通过培养上述表达菌株实现，用诱导剂IPTG诱导重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1表达，诱导时间为2-12h。优选地，诱导时间为6-10h。

优选地，本发明重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1高效可溶性表达的方法为：培养上述表达菌株，诱导温度30-37℃，IPTG的终浓度为0.05-0.5mmol/L，诱导时间为6-10h。

检测表达蛋白的方法在本领域是公知的，例如用SDS-PAGE检测目标蛋白的表达：收获菌体，破碎菌体，然后全菌破碎液、离心后上清(可溶性表达)和沉淀(包涵体)分别进行SDS-PAGE电泳，以凝胶自动扫描密度定量分析表达量和可溶性表达产物的比例。

利用本发明的表达菌株，采用优选的表达方法，重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1可获得高效可溶性表达，外源蛋白可溶性表达量达菌体总蛋白的60％(图2)。

本发明的表达菌株表达重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1具有良好的优势：一是采用了pET28a表达载体，是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统之一，其纯化标签为由6个组氨酸构成HIS标签。由于表达的cC1蛋白带有HIS纯化标签，则很容易利用Ni+柱纯化，获得高纯度的目标蛋白。同时，HIS标签对目的蛋白空间结构和功能影响小，而且可避免了GST标签的与日本血吸虫感染者存在交叉反应的问题，无需进行标签切除，更加经济实用。二是本发明优选了BL21(DH3)作为表达载体pET28a-cC1的表达菌株宿主菌，该菌株带有谷胱甘肽还原酶和硫氧还原蛋白双突变，有利于外源蛋白在细胞质中二硫键的形成，增加外源蛋白的可溶性。

本发明提供的带有HIS标签的重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法，有效解决了现有技术中缺乏能够稳定高效表达可溶性的、易于纯化的、对蛋白结构功能影响不大的、与其他疾病标志无交叉反应的猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的表达方法的问题，为产业化生产重组猪囊尾蚴特异性抗原cC1奠定了基础。

附图说明

附图1PCR产物琼脂糖电泳图。泳道M为DNA分子量标准；泳道1为PCR产物。

附图2大肠杆菌E.coli BL21(pET-cC1)SDS-PAGE电泳图。1：E.coli BL21(pET-cC1)(IPTG诱导，沉淀)；2 E.coli BL21(pET-cC1)(IPTG诱导，上清)；3E.coli BL21(pET-cC1)(IPTG诱导，全菌)；4 E.coli BL21空菌；5 E.coli(pET-cC1)(未诱导，全菌)6：纯化后的融合蛋白；M：蛋白质分子量标准

具体实施方式

实施例1重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1表达载体pET28a-cC1的构建

根据猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因序列，合成2条引物，序列如下：

引物1：5′-GGATCCATGGCCTACTGTCGCTCC-3′(SEQ ID NO.2)(下划线为BamHI酶切位点)

引物2：5′-CTCGAGTTATGCAGGGCCGATGAG-3′(SEQ ID NO.3)(下划线为XhoI酶切位点)

取液氮冻存的囊尾蚴，按Trizol说明书提取猪囊尾蚴总RNA。分别用紫外分光光度法测定总RNA的纯度和浓度，1.2％TBE琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，选取高质量的RNA按照Fermentase公司的RevertAid^TM第一链cDNA合成使用说明书进行逆转录。以合成的cDNA为模板，用自行设计的引物按下列条件进行PCR扩增：94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min30s，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增出一条约1000bp的片段，与预期一致(图1)。将PCR产物和载体pET28a分别以BamHI、XhoI酶切后，使用TaKaRa DNA连接试剂盒(TaKaRaDNA Ligation Kit)进行连接，获得重组表达载体pET28a-cC1。

将上述载体用热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。操作如下：取1管大肠杆菌DH5α感受态细胞(含100μl菌液)，在冰上融化，将上述连接液加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃水浴90s，冰上放置2-3min，加入900μl LB培养基(其组成为1％胰蛋白胨、0.5酵母提取物和1％NaCl)，转移至37℃摇床中250r/min振荡培养1h，然后涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜；第二天挑选单克隆，转接在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜后，提取质粒，酶切鉴定后，对核苷酸序列进行测序，结果表明核苷酸序列和氨基酸序列的阅读框完全正确。表明pET28a-cC1表达载体构建成功。

实施例2重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1表达菌株的构建与表达

将重组载体pET28a-cC1用热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中(操作同实施例1)。第二天挑选单克隆，转接在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜后，提取质粒，酶切鉴定后进行诱导表达。将含pET28a-cC1表达载体的单克隆菌E.coli BL21-cC1含50mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃振荡培养约3小时至OD600为0.6，加入浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达6h，离心收集菌体，经超声破碎后，分别对全菌、上清及沉淀蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示在分子量40kd左右均有一条明显的表达带，与预期的一致，表明构建的表达菌株能够高效可溶性表达重组重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1。

实施例3温度对重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1可溶性表达的影响

将含pET28a-cC1表达载体的表达菌株E.coli BL21-cC1接种于5ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜后，将菌液以1∶100比例转接于100ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养约3小时至OD600为0.6，加入浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达，诱导温度分别为25℃、30℃、37℃，诱导表达6h后，离心收集菌体，经超声破碎后，分别对全菌、上清及沉淀蛋白进行SDS-PAGE分析离心收集菌体，经超声破碎后，分别对全菌、上清及沉淀蛋白进行SDS-PAGE分析，检测重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1可溶性表达效果。经凝胶自动扫描密度分析，在25℃、30℃、37℃下诱导，表达的融合蛋白分别占总蛋白的39％、47％、52％，可溶性表达量占总表达量的75％，70％，73％。

实施例4诱导剂浓度对重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1可溶性表达的影响

将含pET28a-cC1表达载体的表达菌株E.coli BL21-cC1接种于5ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜后，将菌液以1∶100比例转接于100ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养约3小时至OD600为0.6时，向菌液中加入终浓度分别为0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L的IPTG进行诱导表达，诱导温度分别为37℃，诱导表达6h后，离心收集菌体，经超声破碎后，分别对全菌、上清及沉淀蛋白进行SDS-PAGE分析离心收集菌体，经超声破碎后，分别对全菌、上清及沉淀蛋白进行SDS-PAGE分析，检测重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1可溶性表达效果。经凝胶自动扫描密度分析，在0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L的IPTG下诱导，表达的融合蛋白分别占总蛋白的34％、72％、75％、75％、52％，可溶性表达量占总表达量的88％、82％，80％，78％、73％。

实施例5诱导时间对重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1可溶性表达的影响

将含pET28a-cC1表达载体的表达菌株E.coli BL21-cC1接种于5ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜后，将菌液以1∶100比例转接于含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养约3小时至OD600为0.6，加入浓度为0.05mmol/L的IPTG进行诱导表达，诱导温度为37℃，分别于诱导表达2h、4h、6h、8h、10h、16h后，离心收集菌体，经超声破碎后，分别对全菌、上清及沉淀蛋白进行SDS-PAGE分析离心收集菌体，经超声破碎后，分别对全菌、上清及沉淀蛋白进行SDS-PAGE分析，检测重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1可溶性表达效果。经凝胶自动扫描密度分析，诱导表达时间为2h、4h、6h、8h、10h、16h时，表达的融合蛋白分别占总蛋白的35％、48％、75％、73％、70％、38％，可溶性表达量占总表达量的85％、82％、80％，80％，78％、64％。

实施例6重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达

将含pET28a-cC1表达载体的表达菌株E.coli BL21-cC1接种于5ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜后，将菌液以1∶100比例转接于含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养约3小时至OD600为0.6，加入浓度为0.05mmol/L的IPTG于37℃诱导表达6h后，离心收集菌体，经超声破碎后，分别对全菌、上清及沉淀蛋白进行SDS-PAGE分析离心收集菌体，经超声破碎后，分别对全菌、上清及沉淀蛋白进行SDS-PAGE分析，检测重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1可溶性表达效果。经凝胶自动扫描密度分析，表达的融合蛋白占菌体总蛋白的72％，可溶性表达量占总表达量的83％，即可溶性表达的重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1占总菌体蛋白的60％。

序列表

<110>蚌埠医学院

 

<120>一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法

 

<160>3

 

<210>1

<211>1044

<212>cDNA

<213>猪带绦虫(Taenia solium)

 

<220>

<221>gene

<222>(1)...(1044)

 

<400>1

atggcctact gtcgctccct ggttcatcta tatgccccca atggagagaa gtacaaaccg       60

actattaccc caacacccgg gttctcaccg accgctgatg ctgagcactt gaagcgtgca      120

atgcgaggac ttggcacgaa tgaacgtgcg atcattgaca ttcttggaaa ccgaacttca      180

gccgaaagaa tggccattcg tgacgcctat ccgtcgattt ccagcaagac cctgcacgat      240

gctctaacca gcgagctgag tggcaagttc cggaggttcg ccttgttgct aatccaatca      300

ccgtggcagg tgatggcaga ggctctttac gacgccatga agggggctgg cactaaggaa      360

cgcgtactca atgaaattat tgccgggtgt tcaaaggatg acatccctca gttgaaaaaa      420

gcttttgaag aagtgagcgg aggagaaacc cttgatgatg cgatcaaggg ggacacgagt      480

ggcgactacc gcgaggccct tctgctagcg ctcgccggtc aggctgatga accacaggcg      540

atgcaactca aaaacctaac accctccact ctcagtcagg ttgtgaatcc cggccttgct      600

gaaacggatg cgaaggagct gtacgcctgc ggtgaggggc gcccgggcac agcagagagt      660

cgtttcatgc gtcctatcgt caatcgctca ttccttcaat taaacgcaac gaatgaggct      720

tacaatcggg cctacggtca cccgttgatt gatgcaataa agaaggagac gtcgagagac      780

cttgaggact ttctcataac tagagttcgc tacgccactg atcgcgccag tctgtttgcc      840

gaactccttc actttgccat gagaggagct ggcaccaagg actccacttt gcaacgtgtt      900

cttgccttga gggctgatac tgatctagga agcatcaagg agaagtatgc ggagctctat      960

ggtgaaacct tggaagcggc aatcaagggt gatacttctg gtgactatga ggctctctgc     1200

ttgaaactca tcggccctgc ataa                                            1244

 

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<213>引物

 

<400>2

ggatccatgg cctactgtcg ctcc                                             24

 

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<213>引物

 

<400>3

ctcgagttat gcagggccga tgag                                             24

Claims (6)

1.一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的表达载体，其特征在于，该载体由猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因定向插入pET28a得到。

2.一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的表达菌株，其特征在于，该菌株含有如权利要求1所述的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达菌株，其特征在于，宿主菌为大肠杆菌BL21。

4.制备如权利要求2或3所述的表达菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：将猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因插入载体pET28a构建表达载体和将该表达载体转化宿主菌。

5.如权利要求4所述的制备猪囊尾蚴期特异性抗原cC1表达菌株的方法，其特征在于，提取猪囊尾蚴总RNA，采用RT-PCR扩增出猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因，将PCR产物和载体pET28a分别以BamHI、XhoI酶切后，T4连接酶连接，将猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因插入载体pET28a的BamHI、XhoI之间；将连接产物转化宿主菌。

6.一种猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的可溶性表达方法，包括培养如权利2或3所述的表达菌株，其特征在于，用终浓度为0.05-0.5mmol/L的IPTG诱导表达，诱导温度为30-37℃，诱导时间为6-10h。

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