CN1163609C - 表达载体pBVIL1及其构建方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达载体pBVIL1及其构建方法和用途。本发明公开了一个全长4118bp的表达载体pBVIL1，它包含质粒pBV220的大部分序列和经改造的人IL-1β基因(IL-1M)，在IL-1M中含有起始密码子ATG、终止密码子TAA和内切酶点XhoI及XbaI。本发明还公开了pBVIL1的构建过程及其在基因克隆、表达中的用途。由于用pBVIL1表达的融合蛋白的非特异反应低，IL-1M的活性肽具有免疫佐剂作用，外源基因的克隆位点具有互补酶，便于多基因连接，因而pBVIL1是抗原表达的理想载体，具有广泛的应用前景。

Description

表达载体pBVIL1及其构建方法和用途

本发明涉及基因工程领域，具体地说是一个表达载体pBVIL1及其构建方法和用途。

在免疫测定试剂抗原研究中，大分子重组蛋白有时会有非特异反应，使用小分子肽可以减小非特异反应，如Ortho公司第三代的HCV免疫印迹试剂RIBA3.0是把原来120个氨基酸残基的重组蛋白c22-3r改为只有44个氨基酸(aa)的合成肽c22p，把c100-3r(362aa)改为只有16aa的c100p，从而减小了非特异反应[Pawlotsky JM，Roudot-Thoraval F，Pellet C，Aumont P，Darthuy F，Remire J，Duval J and Dhumeaux D.，Influence of hepatitis C virus(HCV)Genotypes on HCV recombinant immunoblot assay patterns，J.ClinMicrob，1995；35(5)：1357-1359]。然而，为了增加抗原的覆盖面，如ELISA试剂，有时又需要具有多个抗原表位的融合抗原，以提高检测的灵敏度[Chien DY，Arcangel P，Medina-Selby A，Coit D，Baumeister M，Nguyen S，George-Nascimento C，Gyenes A，Kuo G，Valenzuela P.Use of a novel hepatitis C virus(HCV)major-epitope chimeric polypeptide for diagnosis of HCV infection.J Clin Microbiol 1999 May；37(5)：1393-7]。若分别用化学合成法合成小肽，不但成本高，合成量有限，而且小肽不利于包被，影响试剂的灵敏度。理想的方法是小肽抗原表位既可单独表达，又可根据需要，把多个抗原表位连接起来融合表达。

pBV220是目前国内较常用的原核表达载体，由张智清等人构建[张智清，姚立红，候云德，含P_RP_L启动子的原核高效表达载体的组建及其应用。病毒学报，1990；6(2)：111-115]。它含有P_RP_L热诱导启动子和合成SD序列，李伍举等研究表明目的基因表达高低和起始密码子后及终止密码子前一段序列的结构有关[李伍举，吴加金，pBV220载体中外源基因表达水平的定量分析，病毒学报，1997；13(2)：126-133]。

我们曾经构建了pBV220/IL-1β表达质粒，使重组人IL-1β获得了高效的表达[郭甫坤，凌世淦等，IL-1β及其突变体克隆、表达与活性研究，军事医学科学院院刊，1999，23(3)：238-9]。由于人IL-1β是人体自身蛋白质，人体内不含有天然的抗人IL-1β抗体，因此在IL-1β基因中选择合适部位插入目的基因，在并不改变读码框架的前提下，融合表达的小分子抗原用于免疫检测试剂时不会引起非特异性反应。而且，人IL-1β及其分子中的片段是很强的免疫增强剂[Hakim I，Levy S，Levy R，A nine-amino acid peptidefrom IL-1β augments antitumor immune responses induced byprotein and DNA vaccines.J Immunol 1996 Dec15；157(12)：5503-11；Beckers W，Villa L，Gonfloni S，CastagnoliL，Newton SM，Cesareni G，Ghiara P.，Increasing theimmunogenicity of protein antigens through the geneticinsertion of VQGEESNDK sequence of human IL-1β into theirsequence.J Immunol 1993 Aug 15；151(4)：1757-64]，当表达产物用于疫苗免疫原研究时，分子中融合的人IL-1β片段又能起到免疫佐剂的作用。基于这一构思，我们在pBV220/IL-1β表达质粒的基础上，构建了一个融合表达载体pBVIL1，使小分子肽能在原核细胞中高效稳定地表达，并能根据需要实现小分子肽之间方便地相互连接。

本发明的目的是提供一个在原核细胞表达的高效融合表达载体pBVIL1。

本发明的再一目的是提供表达载体pBVIL1的构建方法。

本发明的又一目的是提供表达载体pBVIL1在基因克隆、抗原表达及疫苗免疫原制备中pBVIL1的用途。

根据本发明的第一个方面，本发明公开的pBVIL1载体如图1所示，是全长为4118bp的闭环质粒。所述载体为保藏登记号CGMCCNO.0437的生物学样品所包含的质粒。它是在表达载体pBV220的原多克隆位点EcoR I和BamH I之间插入经改造的人IL-1β基因(以下简称IL-1M)构建成的。除pBV220载体多克隆位点EcoR I和BamH I之间“CCGG”4个碱基对(bp)之外，pBVIL1包含了其余3662bp的pBV220序列，它还包含了456bp的插入序列IL-1M，全长为4118bp。pBVIL1的质粒图谱详见图1，以EcoR I切点GAATCC中的第一个“A”为第1位，按顺针方向依次为插入的IL-1M(第6-461位)，pBV220的多克隆位点BamH I、Sal I、Pst I、HindIII，rrnB核糖体转录终止信号，氨苄抗性基因(AmpR)，cIts857，以及P_RP_L启动子等。

所述插入的IL-1M的序列详见图2，IL-1M是456bp插入了Xho I及Xba I内切酶位点的人IL-1β基因，pBVIL1载体的270-275位为Xho I酶切位点“CTCGAG”，第279-284位为Xba I酶切位点“TCTAGA”。

本发明的pBVIL1载体同样带有pBV220的cIts857阻遏蛋白基因和P_RP_L启动子，因而具有热诱导表达的特性，即在42℃时，插入pBVIL1的外源片断与IL-1β基因一起融合表达。

根据本发明的第二个方面，pBVIL1通过如下技术方案构建的：

1.合成引物

本发明合成的四条引物如图3a所示，分别为F1、R1、F2和R2。其中F1和R1用于扩增成熟IL-1β编码基因的第1-261位，在引物F1的5’端引入了起始密码子ATG，在引物R1引入了Xho I和Xba I酶切点。F2和R2用于扩增成熟IL-1β编码基因的第285-459位，引物F2引入了Xba I位点，R2的引入了终止码TAA。

2.RT-PCR获得人IL-1β基因

从正常人外周血单核细胞中提取总mRNA，以上述F1和R2为上下游引物，通过反转录PCR法(RT-PCR)获得了人IL-1β基因，该过程详见郭甫坤、凌世淦等人“IL-1β及其突变体克隆、表达与活性研究”，军事医学科学院院刊，1999，23(3)：238-9。

3.PCR扩增获得改造的IL-1β基因(IL-1M)

以人IL-1β基因为模板，分别以F1、R1和F2、R2为上、下游引物进行PCR扩增，扩增片断分别用Xba I酶切，经连接酶连接即获得改造的IL-1M基因，即引入了Xho I和Xba I两个克隆酶切位点的IL-1β基因。

如图4所示，本发明是在以前的工作基础上，以质粒pBV220/IL-1β为模板进行扩增的。正如本领域的熟练技术人员所知的，作为模板的人IL-1β基因可以来自人cDNA文库，也可以是由RT-PCR合成的，也可以是含有人IL-1β基因的质粒DNA。

4.将基因克隆入pBV220载体

将IL-1M基因用EcoR I和BamH I酶切，插入用同样酶切的pBV220载体，即可获得含有所需克隆酶切位点的表达载体pBVIL1。

根据本发明的第三个方面，pBVIL1可以方便地用于基因克隆、抗原表达及制备抗原组合物中的有用成分。

如图6所示，pBVIL1可用于单个目的基因的插入及表达。只要目的基因含有与载体相同的酶切位点，就可按基因工程的常规方法，将目的基因双酶切后插入同样处理过的pBVIL1载体，转化大肠杆菌后，可以得到目的基因和IL-1M的融合表达。目的基因可以是化学合成的小基因片段，也可以是PCR扩增的产物。

pBVIL1还可以用于不同目的基因的共同插入及表达。通过设计特殊的通用连接引物L1、L2(图3b)，可以实现插入多个基因的目的。如图7所示，pBVIL1/a和pBVIL1/b分别为含有目的基因a和b的质粒。用Xba I和BamH I酶切pBVIL1/a后，切开的质粒上带有含Xba I粘末端的a基因，以pBVIL1/b为模板，用通用连接引物L1和R2扩增，则在基因b的5’端引入酶切位点Spe I，由于a基因的末端含有与Spe I互补的Xba I序列，a和b连接后，用于连接的酶切位点消失，而a和b的序列没有变化，新的含a和b序列的融合表达质粒的克隆酶切位点和原表达质粒相同。同样，也可以选用通用引物F1和引物L2扩增带有Sal I位点的a基因，用EcoR I和Xho I酶切pBVIL1/b，产生带有Xho I的b基因后，二者连接也可得到带有a和b基因的新质粒。根据这一思路，还可以用同样的方法设计引物并继续插入基因，以此实现多个不同基因的融合表达。待插入基因可以是质粒DNA，也可以是基因片段。

本发明的特点及优点如下：首先，人IL-1β是人体自身蛋白质，在人血清中没有抗人IL-1β的抗体，通过pBVIL1载体获得的小分子肽和IL-1M融合表达产物的非特异反应很低。其次，IL-1β是很好的免疫激活因子，但有一定毒性，本发明通过改造IL-1β分子内与受体结合有关的G环以及插入外源基因，降低了人IL-1β的活性，但分子中活性肽片(成熟分子的47至55位)仍保持适度的免疫刺激活性，在融合蛋白中可以作为免疫佐剂提高疫苗的免疫活性。再者，pBVIL1载体的克隆位点具有互补内切酶，可方便地进行基因间的相互连接，因此是抗原表达的理想载体。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

图1为表达载体pBVIL1的结构和酶切位点图；

图2为插入pBVIL1载体的IL-1M基因序列

图3为载体构建、基因合成和连接中需要合成的引物；

a载体构建的引物  b.通用连接引物  c.基因合成的引物

图中下划线部分为引入的酶切位点

图4为pBVIL1融合表达载体构建示意图；

图5为载体pBVIL1的酶切鉴定及改构后表达的鉴定；

a/酶切鉴定(EcoR I，BamH I双切)

(1)分子量标准：1857；1060，929，383，121

(2)PBV220对照  (3)，(4)PBVIL1质粒

b/载体的诱导表达全菌的SDS-PAGE鉴定

(1)分子量标准(2)载体中IL-1β表达带

图6为目的基因的插入载体pBVIL1方法示意图；

图7为载体pBVIL1上不同目的基因间互相连接示意图；

图8为不同基因表达质粒PCR及产物表达的鉴定；

a/不同基因表达质粒的PCR鉴定(F1和各基因的引物R)

(1)pBVIL1/NS4(2)pBVIL1/C(3)pBVIL1/NS3

(4)pBVIL1/NS5a(5)pBVIL1/NS5b(6)pBVIL1/NS5a-NS5b

(7)pBVIL1/NS4-C(8)pBVIL1/NS4-C-NS5a

(9)pBVIL1-NS4-C-NS5a-NS5b(10)分子量标准

b/不同基因表达质粒诱导表达全菌体的SDS-PAGE鉴定

(1)pBVIL1载体  (2)pBVIL1/NS4  (3)pBVIL1/C

(3)pBVIL1/NS3  (5)pBVIL1/NS5a  (6)pBVIL1/NS5b

(7)pBVIL1/NS5a-NS5b  (8)pBVIL1/NS4-C

(9)pBVIL1/NS4-C-NS5a  (10)pBVIL1-NS4-C-NS5a-NS5b

(11)分子量标准

图9为IL-1β分子结构及酶切位点插入处示意图；

实施例：

为进一步说明pBVIL1表达载体、构建及应用，参照下列实施例进行说明，这些实施例是为了解释而不以任何方式限制本发明。

一、插入部位的确定及内切酶的选择

通过英特网下载人IL-1分子晶体X光衍射构象分析资料(网址： www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/3d)，并用RasMol动态观察人IL-1β的分子结构，可以看到IL-1β分子主要为多个反向平行的β片层形成的β桶状结构，在分子第86-100处为无定形圈曲区(G环)位于分子的表面，可用于片段插入和减小IL-1β的毒性(如图9)。

人IL-1β中引入的酶切位点需要满足以下要求：在人IL-1β内部及pBV220载体上不存在；酶切后的粘末端与其它的内切酶有互补性，以便酶切后的基因与用互补酶切的基因连接后不再被切，由此实现多个不同基因片段的连接。通过酶切位点分析，选择了Xba I和Xho I作为插入IL-1β的克隆酶切位点，它们分别与Spe I和SalI互补。

二、pBVIL1的构建

1.引物设计

根据扩增需要以及要引入的酶切位点，设计合成了四条前面已提到的引物(图3a)。其中F1和R1用于扩增人成熟IL-1β基因1-261位，F2、R2用于扩增IL-1β基因285-459位。

2.RT-PCR获得人IL-1β基因：

从正常人外周血中分离单核细胞，以10⁶个/ml细胞浓度在10％小牛血清和适量LPS的1640培养液中刺激培养4小时，吸弃上清和悬浮细胞，加入变性溶液(4mol/L硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠pH7.0，0.5％Sarcosyl，0.1mol/L巯基乙醇)0.75ml，使细胞裂解；吸出裂解液，进而按《分子克隆》(科学出版社，第二版)方法进行抽提纯化细胞总mRNA。

取纯化细胞总mRNA进行逆转录合成第一条链，反应体系为：5×缓冲液8μl，细胞总mRNA10μg，dNTPs(10mM)4μl，Rnsin(500U/μl)1μl，引物R2 4μl，AMV逆转录酶(8U/μl)3μl，加水至40μl，42℃反应60分钟。进而PCR扩增，扩增体系为：上述逆转录反应液20μl，引物F1 2μl，10×PCR缓冲液10μl，Taq DNA聚合酶1μl，加水到100μl。PCR扩增反应：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，共30循环。用小量PCR产物纯化试剂盒(华舜生物工程公司产)按说明书方法纯化。

质粒pBV220为本室保存，按照《分子克隆》的操作，将IL-1β基因克隆入pBV220载体，构建重组质粒pBV220/IL-1β。

3.在人IL-1β基因中引入Xho I和Xba I两个酶切位点

以质粒pBV220/IL-1β为模板，分别用F1、R1和F2、R2引物进行PCR扩增。扩增体系为：含镁离子的10×扩增缓冲液10μl，4×dNTPs(10mmol)1μl，上下游引物(F1，R1或F2，R2)各1μl，上述pBV220/IL-1β 1μl，Taq DNA聚合酶(3单位/μl)1μl，加灭菌水至100μl。

PCR扩增反应：94℃3分钟变性后，以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，共30循环。用小量PCR产物纯化试剂盒(华舜生物工程公司产品)按说明书方法纯化。

两种纯化产物均用Xba I酶切。酶切体系为：10μl 10×酶切缓冲液(H)，水21μl，纯化产物30μl，酶XbaI 3μl(10单位/μl)，加水至60μl，37℃水浴8小时。酶切后产物分别用琼脂糖凝胶电泳分离，用离心式小量胶回收试剂盒(华舜生物工程公司产品)按说明书方法回收。

两个片段连接：连接体系为：纯化回收产物各2μl，10×T4 DNA连接缓冲液1μl，12u/μl的T4 DNA连接酶1μl，水6μl，16℃水浴过夜。以连接产物插入了酶切位点的变构IL-1β(IL-1M)为模板，用引物F1和R2进行第二次PCR扩增，产物的纯化同前。

4.IL-1M插入pBV220

双酶切：上述纯化的IL-1M和用碱变性法提取的质粒pBV220，分别用EcoR I和BamH I双酶切。对30μl纯化的PCR产物及10μl质粒分别进行酶切，酶切体系还有10×缓冲液(H)4μl，10u/μl的EcoR I 2μl，10u/μl的BamH I 2μl加水至总体积40μl，37℃水浴8小时。酶切后分别按上述方法纯化。

插入连接：连接体系为：双酶切后质粒pBV220和IL-1M，各1μl，10×T4 DNA连接缓冲液1μl，T4 DNA连接酶(12u/μl)1μl，加水至总体积10μl，16℃水浴过夜。

5.转化和表达：

HB101大肠菌为本室保存，复苏活化冷冻的菌株后，按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的CaCl₂方法制备感受态细胞；取感受态细胞100μl，加入连接产物5μl，轻轻旋转以混匀内容物，在冰浴中放置30分钟，立即转移到42℃水浴中放置2分钟，然后每管加入0.5ml不加抗生素的LB培养基，37℃水浴15分钟后，37℃摇床轻摇45分钟；取100μl转化菌体，均匀涂布于含有100mg/ml氨苄的琼脂平板培养基上，室温晾干后，37℃倒置培养过夜。

6.载体的鉴定

从平皿上选取生长的集落，提取质粒酶切鉴定，用EcoR I和BamHI酶切，用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果见图5a，从中可以看到，第2泳道的对照质粒表现为40kb大小的质粒带，由于两酶切位点间的小片段太小，因此在电泳图谱上无法看到，3，4泳道为IL-1M插入后，质粒pBVIL1的酶切结果，除40kb的载体外，还可看到约460bp的IL-1M条带，证明IL-1M已插入了pBV220，即pBVIL1构建成功。图5b为转化有pBVIL1载体的细菌，在32℃培养2小时后转入42℃诱导培养2.5小时，取全菌体作聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶浓度为15％，操作过程见《分子克隆》，结果如图所示，在17kd处有一深染带，表明插入IL-1M得到了高效的表达。

三、pBVIL1的用途

(一).目的基因的插入及和IL-1M融合表达

1.插入

实验中设计不同的引物扩增HCV编码基因的不同部分，设计的引物序列见图4c，其中C-F，C-R用于扩增第22-168位(以GenBank序列名为“HPCCGAA”的HCV序列为准，下同)的HCV/C抗原编码基因，NS3-F，NS3-R用于扩增第3574-4371位的HCV/NS3螺旋酶编码基因，NS4-F1，NS4-R1，NS4-F2，NS4-R2用于合成5746-5841位的HCV/NS4C末端编码基因，NS5a-F，NS5a-R用于扩增6796-6942位的HCV/NS5a编码基因，NS5b-F，NS5b-R用于扩增第7141-7374位的编码基因。

以HCV/NS4基因的插入为例，由于引物NS4-F1和NS4-R1的3’端具有互补序列，在合适的条件下互补序列杂交后，在PCR反应中，二者可以互为模板进行扩增。实验的扩增体系及PCR反应设置同实施例二所述，循环数为5个。取1μl扩增产物作为再次PCR的模板，加入引物NS4-F2和NS4-R2，再进行30个循环的PCR扩增。PCR扩增产物经纯化，用Xho I和Xba I双酶切，对质粒pBVIL1也用相同的酶双酶切，然后使酶切后的基因和质粒连接即为pBVIL1/NS4表达质粒，然后转化、表达等操作均同实施例二所述。

表1.  用pBVIL1表达的不同基因来源和大小

多肽名称      基因模板来源      片段大小

HCV/NS4       化学合成            32aa

HCV/C         质粒pBRTM/HCV       49aa

HCV/NS3       质粒pEX/NS3         266aa

HCV/NS5a      质粒pBRTM/HCV       49aa

HCV/NS5b      质粒pBRTM/HCV       78aa

按照上述步骤，用不同的引物扩增的基因片断见表1，插入pBVIL1载体中构建成不同的表达质粒分别为pBVIL1/NS4，pBVIL1/C，pBVIL1/NS3，pBVIL1/NS5a，pBVIL1/NS5b。

2.表达质粒的PCR鉴定

以HCV/NS4基因为例，以纯化后质粒pBVIL1/NS4为模板，以引物F1为正向引物，NS4-R2为负向引物进行PCR扩增，扩增条件实施例二，扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳结果见图8a 1，可扩增出约370bp的特异带，证明NS4基因已插入。其它各插入基因质粒的鉴定方法相同，唯所用的负向引物，分别为引物C-R、NS3-R、NS5a-R、NS5b-R(图3c)，电泳鉴定见图8a带2-5，扩增出相应的片段依次为420bp，1000bp，420bp和510bp。

3.基因表达的SDS-PAGE鉴定

以HCV/NS4基因为例，基因表达的鉴定过程如下：取插入HCV/NS4基因的表达质粒pBVIL1/NS4，按实施例二方法进行转化、培养和热诱导培养，取全菌体进行SDS-PAGE(胶浓度15％)鉴定结果如图8b：区带2约在22kd处有一深染带，和NS4和IL-1M的融合后的理论分子量一致。其它各基因HCV/C，NS3，NS5a，NS5b表达的鉴定方法相同，图3b中区带3-6为各质粒表达菌，表达带的分子量分别为：25kd，50kd，25kd和29kd，和预期分子量结果一致。

(二).不同目的基因的连接和融合表达

不同基因间的相互连接是通过设计特殊的通用连接引物L1、L2(图3b)，可在已构建好的含有不同目的基因的表达质粒间进行。我们构建了如表2所示的4种含有多基因连接的表达质粒。

现以pBVIL1/NS4-C表达质粒的构建为例：

取纯化的pBVIL1/NS4质粒10μl，按实施例二所述的方法用XbaI和BamH I进行双酶切；与此同时，取纯化质粒pBVIL1/C为模板，以通用连接引物L1(图3b)和引物R2(图3a)进行PCR扩增(方法同实施例二)。然后使酶切后的基因和质粒连接、转化和诱导表达等操作均同实施例二所述。

表2.用载体pBVIL1构建的含有多基因连接的表达质粒

构建质粒名称           用于酶切质粒    用于模板质粒

PBVIL1/NS4-C           PBVIL1/NS4         PBVIL1/C

PBVIL1/NS5a-NS5b       PBVIL1/NS5a        PBVIL1/NS5a

PBVIL1/NS4-C-NS5a      PBVIL1/NS4-C       PBVIL1/NS5a

PBVIL1/NS4-C-NS5a-NS5b PBVIL1/NS4-C-NS5a  PBVIL1/NS5b

其它NS5a-NS5b，NS4-C-NS5a，NS4-C-NS5a-NS5b基因的克隆方法相同，所不同的是所用酶切的质粒和用于作PCR模板的质粒不同，表2为各融合抗原表达质粒构建时分别所用的质粒情况。

质粒的PCR鉴定方法如实施例三(一)所述，分别以纯化后质粒为模板，以引物F1为正向引物，以各连接基因最后一个基因的负向引物(表2四种多基因连接质粒分别用图3c的引物C-R、NS 5b-R、NS5a-R、NS5b-R)为负向引物进行PCR扩增，结果如图8a，各质粒区带6-9分别为NS5a-NS5b，NS4-C，NS4-C-NS5a，NS4-C-NS5a-NS5b，均可扩增出相应片段，分别约660bp，520bp，670bp和910bp。

融合多基因表达的鉴定如实施例三(一)方法进行，诱导培养后取全菌体进行SDS-PAGE鉴定结果见图8b，区带7-10分别为NS5a-NS5b，NS4-C，NS4-C-NS5a，NS4-C-NS5a-NS5b等多目的基因的融合表达情况，由图可见在43kd，30kd，38kd和67kd处各有一深染带，分子量和预期结果一致。

Claims (11)

1、一种表达载体pBVIL1，其特征在于包含了质粒pBV220的大部分序列和改造的人IL-1β基因，其中质粒pBV220的大部分序列是指除多克隆位点EcoR I和BamH I之间‘CCGG’4个核苷酸之外的3662个核苷酸序列，改造的人IL-1β基因如序列表中序列1所示，含有起始密码子ATG、终止密码子TAA和内切酶位点Xho I及Xba I。

2、根据权利要求1所述的表达载体，其中所述的载体为保藏登记号CGMCC NO.0437的生物学样品所包含的质粒。

3、根据权利要求1所述的表达载体，其中所述载体为4118bp的闭环质粒，以pBVIL1上ECORI酶切位点GAATCC中的第一个“A”为第1位，载体上第6-461位为改造的人IL-1β基因。

4、根据权利要求1所述的载体，其中所述载体的270-275位为Xho I酶切位点，279-284位为Xba I酶切位点。

5、根据权利要求1所述表达载体的制备方法，它包括以下步骤：

(1)合成引物；

(2)反转录PCR获得人IL-1β基因；

(3)PCR扩增获得IL-1M基因；

(4)将IL-1M基因克隆入pBV220载体。

6、根据权利要5所述的制备方法，其中用于扩增的引物的序列自5’端为：

R1：

5’GC TCT AGA GGC CTC GAG GGG ATC TAC ACT CTC 3’

F2：

5’GC TCT AGA GAA AAG CGA TTT GTC 3’

7、根据权利6所述的制备方法，其中用于扩增的引物R1含有Xho I和Xba I酶切位点，F2含有Xba I酶切位点。

8、根据权利要求1所述的表达载体在基因克隆、抗原表达及疫苗制备中的用途。

9、根据权利要求8所述的用途，其中pBVIL1用于单个基因的插入及表达。

10、根据权利要求8所述的用途，其中pBVIL1用于多个基因的插入及表达。

11、根据权利要求8所述的用途，其中pBVIL1用于制备免疫疫苗。

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