PT1871353E

PT1871353E - Vitamina k para prevenção e tratamento de irritação de pele secundária a terapia anti-egfr

Info

Publication number: PT1871353E
Application number: PT06750246T
Authority: PT
Inventors: Yi-He Ling; Roman Perez-Soler
Original assignee: Einstein Coll Med
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2011-03-29
Also published as: US20090239952A1; DE602006019074D1; KR101332869B1; EP2305224B1; CY1111786T1; CA2603785C; EP1871353A4; EP2305224A2; EP2494965A3; ATE492275T1; WO2006113479A2; JP5620443B2; EP2494965A2; KR20070121843A; CA2851079A1; EP1871353A2; CA2603785A1; US20090209652A1; US20100324148A1; WO2006113479A3

Description

ΕΡ 1 871 353/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Vitamina Κ para prevenção e tratamento de irritação de pele secundária a terapia anti-EGFR"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Ao longo do presente pedido referem-se várias publicações entre parêntesis. As citações completas destas referências podem ser encontradas no final do fascículo imediatamente antes das reivindicações. As revelações destas publicações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade no presente pedido para descrever mais completamente a especialidade a que se refere o presente pedido. 0 receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) é uma proteína transmembranar expressa em todas as superfícies epiteliais. Desempenha um papel fisiológico importante na reparação e regeneração epitelial. 0 factor de crescimento epidérmico (EGF) é um péptido excretado pelas glândulas salivares e outras glândulas associadas a superfícies epiteliais que se liga a uma área específica do domínio extracelular de EGFR. Por ligação gera um sinal que é transmitido ao interior da célula. 0 primeiro evento intracelular em resultado da ligação de EGF é uma alteração conformacional do domínio intracelular de EGFR que permite a entrada de adenosina-5'-trifosfato (ATP) no denominado domínio de tirosina quinase (TK), um bolso que contém um resíduo tirosina, e a doação do grupo fosfato ao resíduo de tirosina. 0 EGFR intracelular contendo uma tirosina fosforilada torna-se capaz de se associar a outras proteínas intracelulares e origina uma série de reacções bioquímicas que se propagam a jusante através de uma rede muito complexa. Os braços mais conhecidos desta rede são a via de proteína quinase activada por mitogénio (MAPK), que por activação resulta em divisão de células de tumor, e a via AKT, que por activação resulta em sobrevivência celular melhorada. Os resultados de activação de EGFR são portanto um aumento da proliferação celular e tolerância celular melhorada a diferentes insultos. 2 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ

Muitos tumores sobrexpressam EGFR comparativamente a tecidos vizinhos normais ou à superfície epitelial da qual são originários ou apresentam uma versão mutante de EGFR, intrinsecamente activado ou com uma susceptibilidade a activação melhorada. Pensa-se que tal sobrexpressão é um de muitos mecanismos pelos quais as células de tumor adquirem uma vantagem de crescimento, uma característica chave do fenótipo maligno. Consequentemente, pensa-se que bloquear a via de sinalização EGFR é uma estratégia racional para o tratamento de muitas malignidades humanas. Existem basicamente dois modos de inibir a via de sinalização EGFR a montante: 1) evitar a ligação de egf e outros ligandos peptídicos naturais ao domínio extracelular de EGFR por utilização de anticorpos monoclonais específicos e 2) evitar a entrada de ATP e de outros dadores de fosfato no bolso TK do domínio intracelular de EGFR por utilização de moléculas pequenas que se encaixam estruturalmente muito bem no bolso (as denominadas inibidores de tk de EGFR).

Após anos de esforços de pesquisa e avaliação clínica, demonstrou-se recentemente que os inibidores de EGFR são agentes antitumor activos contra vários tumores sólidos incluindo, entre outros, adenocarcinoma colorrectal, cancro de pulmão de células não pequenas, cancro da cabeça e pescoço e gliomas malignos (Conen et al., 2003; Lage et al., 2003; Lorusso, 2003; Vanhoefer et al., 2004). Foi até ao presente demonstrado benefício clínico, definido como o alívio dos sintomas ou o prolongamento da sobrevivência, com o anticorpo anti-EGFR, cetuximab (Erbitux®) e os inibidores de tirosina quinase (TK) de EGFR, gefitinib (Iressa®) e erlotinib (Tarceva®). Estão a ser desenvolvidos muitos agentes adicionais pertencentes a esta classe. Até à data, as indicações aprovadas por FDA incluem carcinoma colorrectal quimiorefractário e cancro do pulmão de células não pequenas, carcinoma da cabeça e pescoço e carcinoma pancreático. Estão actualmente a decorrer muitos estudos clínicos utilizando estes agentes sozinhos ou em combinação, para doentes refractários ou a quem não tinha sido previamente administrada 3 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ quimioterapia com várias outras doenças malignas. Espera-se que 200 000 doentes por ano nos EUA possam receber estes agentes num futuro próximo.

Embora estes agentes não causem toxicidade potencialmente letal, o principal efeito secundário é uma irritação de pele que ocorre em 60-70% dos doentes, afecta predominantemente a face e o tronco e, em muitos casos, causa desconforto e alterações cosméticas desfavoráveis. Os principais sintomas causados pela irritação de pele são prurido, secura e infecção secundária. A ocorrência e intensidade da irritação está nitidamente relacionada com a dose e o tempo médio de ocorrência é de 10 dias após o início da terapia. Cerca de 10% dos doentes param a terapia devido a toxicidade na pele. A maioria dos estudos clínicos revelou que a maioria dos doentes que desenvolvem irritação de pele em resultado de terapia anti-EGFR tendem a viver mais tempo. Pensa-se que a ocorrência de irritação de pele requer tanto uma inibição de EGFR eficaz na pele, como um sistema imunitário competente que seja capaz de responder ao insulto do tecido causado por tal inibição com uma resposta inflamatória adequada. Dado que há cada vez mais evidência que a irritação de pele é um indicador secundário de eficácia de antitumor e beneficio clínico (Cohen et al., 2003), o aumento da dose de agentes anti-EGFR até causar uma irritação de pele pode tornar-se uma prática comum. Se for esse o caso, o tratamento da irritação de pele tornar-se-á também mais importante. Em consequência, o tratamento da irritação de pele também se está tornar mais importante. Não existem métodos racionais, comprovados cientificamente e clinicamente eficazes para o tratamento desta forma de irritação de pele. Foram tentados antibióticos tópicos ou sistémicos, agentes anti-inflamatórios, retinóides, lubrificantes tópicos e outros tipos de remédios de uma forma empírica, com resultados fracos ou inconsistentes. Actualmente não existe uma terapia ou prevenção estabelecida para esta nova doença de pele, doença que se espera que afecte cerca de 150000 indivíduos por ano nos EUA num futuro muito próximo. 4 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ

Tem-se utilizado vitamina K para o tratamento de doenças dos vasos sanguíneos da pele, tratamentos de pele cosméticos e tratamento da pele após tratamento com laser (Patente U.S. No. 5 510 391; publicação de pedido de patente U.S. No. US 2003/0170187; publicações internacionais PCT Nos. WO 97/39746, WO 02/13780, WO 03/101415, WO 2004/019923; Lou et al., 1999; Shah et al., 2002). No entanto, a administração tópica de vitamina K3 pode causar dermatite (Page et al., 1942) e vesiculação da pele (Ulbrich, 1961).

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona vitamina Kl ou vitamina K3 para utilização num método para tratar ou prevenir uma irritação de pele secundária a uma terapia com anti-receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) num indivíduo que recebe tal terapia, em que o método compreende aplicar a vitamina Kl ou vitamina K3 na pele numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir a irritação de pele, em que a vitamina Kl ou vitamina K3 é formulada numa formulação farmacêutica adequada para administração tópica. O presente invento também proporciona a utilização de vitamina Kl ou vitamina K3 no fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de uma irritação de pele secundária a uma terapia com anti-receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR), em que a composição farmacêutica é formulada para administração tópica e compreende uma quantidade de vitamina Kl ou vitamina K3 eficaz para tratar ou prevenir a referida irritação de pele.

DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS

Figura 1A-1C. Efeitos de vitaminas Kl, K2 e K3 (VKl, VK2, VK3) na fosforilação de EGFR (A), AKT (B) e Stat-3 (C) em células de carcinoma vulvar A431 humanas. Plaquearam-se células A431 (lxlO6 células/poço) numa placa de 6 poços e incubaram-se em meio RPMi-1640 com soro a 10% durante a noite. Expuseram-se as células às concentrações indicadas de VKl, VK2 5 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ e VK3 durante 2 horas. Após exposição, lavaram-se as células duas vezes com solução salina tamponada de fosfato (PBS) fria e lisaram-se com 50 μΐ de tampão de lise. Sujeitaram-se quantidades iguais de lisado (30 pg de proteína) a SDS-PAGE a 7,5% ou 12%. Detectou-se EGFR, phos-EGFR, AKT, phos-AKT, Stat-3 e phos-Stat-3 por análise de transferência imunitária utilizando os anticorpos correspondentes. A vitamina K3 estimulou EGFR, Akt e Stat-3. A vitamina Kl também activou EGFR, enquanto a vitamina K2 teve um efeito pequeno ou nulo.

Figura 2. A vitamina K3 (menadiona) evita a inibição de fosforilação de EGFR causada por erlotinib, um inibidor de tirosina quinase de EGFR, em células A431. Plaquearam-se células A431 (lxlO6 células/poço) numa placa de 6 poços e incubaram-se em meio RPMI-1640 sem soro bovino fetal durante 24 horas. Após jejum, expuseram-se as células a diferentes concentrações de vitamina K3 sozinha (0,01-0,5 mM) ou com erlotinib a 2 μΜ durante 2 horas, ou estimularam-se com EGF a 100 ng/ml durante 5 min. Após exposição, lavaram-se as células duas vezes com solução de PBS fria e lisaram-se com 50 μΐ de tampão de lise. Sujeitaram-se quantidades iguais de lisado (30 pg de proteína) a um SDS-PAGE a 7,5%. Detectou-se EGFR e EGFR fosforilado por análise de imunotransferência com utilização dos anticorpos correspondentes.

Figura 3. Efeito de VK3 (menadiona) em inibição de crescimento celular induzido por erlotinib em células A431. As células foram plaqueadas numa placa de 96 poços durante a noite. Expuseram-se as células a diferentes concentrações de erlotinib sozinho ou em combinação com VK3 (menadiona) 50 μΜ ou 100 μΜ durante 72 horas. Após exposição, recolheram-se as células por tripsinização e avaliou-se a viabilidade celular por contagem das células utilizando um hemacitómetro. Cada ponto representa a média de duas experiências independentes.

Figura 4A-4B. A fosforilação de EGFR induzida por VK3 é reversível em células A431. Expuseram-se as células a VK3 0,1 mM durante 1 hora. Após a exposição, lavaram-se as células três vezes com meio frio e seguidamente reincubaram-se em meio 6 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ fresco isento de VK3 com soro fetal bovino a 10% durante os tempos indicados. Recolheram-se as células e lisaram-se com tampão de lise. Sujeitaram-se quantidades iguais de lisado celular a um gel de SDS-PAGE a 7,5% (A). Detectou-se EGFR total e EGFR fosforilado (p-EGFR) por análise de imunotransferência utilizando os anticorpos correspondentes. Controlo (Con) significa células que não foram expostas a VK3. O p-EGFR relativo foi expresso como a intensidade das bandas de p-EGFR em cada ponto de tempo medida por densitometria de laser comparativamente com a do controlo, que se assumiu igual a um (B) .

Figura 5. A vitamina K3 inibe a actividade de fosfatase. Expuseram-se células A431 a VK3 0,1 mM durante 1 hora. Após exposição, lavaram-se as células três vezes com meio frio e seguidamente reincubaram-se em meio isento de VK3 com soro fetal bovino a 10% durante o tempo indicado. Recolheram-se as células e prepararam-se extractos celulares para o ensaio de actividade de fosfatase utilizando pNPP (4-nitrofenilfosfato de dissódio) como substrato. Controlo (Con) significa a actividade de fosfatase em células sem exposição a VK3. A actividade de fosfatase relativa foi expressa em comparação com a do controlo que se assumiu igual a um. A inibição de fosfatase induzida por VK3 é reversível após remoção de VK3.

Figura 6. Efeito de vitamina K3 (menadiona) na inibição da fosforilação de EGFR induzida por erlotinib em pele de ratinho. A vitamina K3 salva a inibição de fosforilação de EGFR induzida por erlotinib em tecido da pele de ratinho. Administrou-se diariamente erlotinib a 50 mg/kg por gavagem oral (P.O) aos ratinhos; Esfregou-se a pele do ratinho com solução de VK3 15 mM em etanol. Após tratamento, sacrificaram-se os ratinhos e retirou-se tecido da pele. Utilizou-se 100 mg de tecido da pele para a preparação de extractos de tecido. Sujeitaram-se quantidades iguais de extractos de tecido de pele (80 pg de proteína) a um SDS-PAGE a 7,5%. Detectou-se EGFR total e p-EGFR por análise de imunotransferência. 7 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ

Figura 7. Efeito de VK3, creme B e creme VK na fosforilação de EGFR em tecido de pele de ratinho. Esfregaram-se os ratinhos com VK3 30 mM ou 100 mM (em etanol), ou com as mesmas doses de creme B ou creme VK. Após o tratamento, sacrificaram-se os ratinhos e removeram-se tecidos de pele para a preparação de extractos de tecido. Sujeitaram-se quantidades iguais de extractos de tecido (80 pg de proteína) a um SDS-PAGE a 7,5%. Detectou-se EGFR total e p-EGFR por análise de imunotransferência utilizando anticorpos anti-EGFR e anti-p-EGFR policlonais. O creme B é um produto não sujeito a prescrição médica (Baby Cakes) contendo vitamina K3 de acordo com o seu rótulo; a concentração não é especificada. O creme VK é um creme de vitamina K a 5% não sujeito a prescrição médica. Contrariamente a VK3 30 mM ou 100 mM, os cremes comerciais não apresentaram qualquer efeito.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento refere-se a vitamina Kl ou vitamina K3 para utilização num método para tratar uma irritação de pele secundária a uma terapia com anti-receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) num indivíduo que recebe tal terapia, em que o método compreender aplicar um análogo de vitamina K à irritação de pele numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir a irritação de pele, em que a vitamina Kl ou vitamina K3 é formulada numa formulação farmacêutica adequada para administração tópica. O presente invento também proporciona a utilização de vitamina Kl ou vitamina K3 no fabrico de uma composição farmacêutica para tratamento ou prevenção de uma irritação de pele secundária a uma terapia anti-receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR), em que a composição farmacêutica é formulada para administração tópica e compreende uma quantidade de vitamina Kl ou vitamina K3 eficaz para tratar ou prevenir a referida irritação de pele. Tal como aqui utilizada, a expressão "tratar" uma irritação de pele secundária a terapia anti-EGFR significa reduzir ou eliminar a irritação de pele e/ou diminuir ou eliminar o aumento ou alastramento da irritação de pele na pele do indivíduo. 8 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ

Os indivíduos que recebem terapia anti-EGFR incluem doentes que recebem tratamento com um anticorpo anti-EGFR, tal como cetuximab, e/ou com um inibidor de tirosina quinase de EGFR, tal como gefitinib ou erlotinib. A vitamina Kl é 2-metil-3-fitil-1,4-naftoquinona) e a vitamina K3 é 2-metil-l,4-naftoquinona; menadiona). A vitamina K3 tem a estrutura: o

A vitamina Kl tem a estrutura: o

As formas preferidas da vitamina Kl são o isómero trans da vitamina Kl ou uma mistura dos isómeros trans e cis, dado que o isómero cis tem uma actividade biológica muito baixa ou nula (Matschiner et al., 1972).

As vitaminas Kl ocorrem naturalmente. A vitamina K3 é um análogo sintético. Foram descritos processos para preparar análogos de vitamina K, e.g., patentes U.S. Nos. 4 374 775, 4 906 411, 5 412 124, 5 637 741, 5 770 774 e 6 579 994 e Sah 9 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ (1949-50). As vitaminas Kl e K3 estão disponíveis, e.g., de Sigma-Aldrich.

As vitaminas Kl e K3 podem activar EGFR, Akt e/ou Stat-3. Tal como aqui utilizado, "activar" EGFR, Akt e/ou Stat-3 significa aumentar a forma fosforilada de EGFR, Akt e/ou Stat-3.

Tal como aqui utilizada para tratar uma irritação de pele, a vitamina Kl ou K3 é aplicada topicamente à pele. Os compostos de vitamina K são facilmente solúveis em álcool etílico e solventes orgânicos e podem ser preparados em formulações para utilização tópica, às concentrações pretendidas. O análogo de vitamina K pode ser aplicado à pele utilizando, e.g., cremes, géis, emulsões, loções, líquidos e/ou lipossomas. A formulação pode ser uma formulação que proporcione libertação prolongada do análogo de vitamina K. As formulações tópicas para pele podem incluir, por exemplo, ingredientes que incluem, entre outros, qualquer dos seguintes: álcool etílico, álcool isopropílico, álcool benzílico, álcool cetílico, álcool estearílico, grânulos de lecitina, palmitato de isopropilo, miristinato de isopropilo, propilparabeno, metilparabeno, um tensioactivo (e.g., Pluronic F-127 NF), Dowicil 200, óleo mineral, óleo natural, óleo de silicone, parafina, glicerina, diéster de ácido esteárico, estearato de glicerol, estabilizantes, tais como ciclodextrina e filtros de ultravioleta (UV). A vitamina Kl ou K3 pode ser aplicada à pele até à dose máxima tolerada, que pode variar de indivíduo para indivíduo e depende do análogo de vitamina K específico que se utiliza no tratamento. A dose máxima tolerada pode ser facilmente determinada por um perito na especialidade. De preferência, a vitamina Kl ou K3 é aplicada à pele a uma concentração de pelo menos 100 μΜ ou pelo menos 15 pg/ml. De preferência, a vitamina K3 é aplicada a uma concentração de 50 pg/ml a 200 pg/ml, com maior preferência de 75 pg/ml a 100 pg/ml. De preferência, a vitamina Kl é aplicada à pele a uma concentração de pelo menos 450 pg/ml. 10 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ Ο tratamento com a vitamina Kl ou K3 pode ter inicio, por exemplo, no dia de inicio da terapia com um agente anti-EGFR ou logo que a irritação de pele apareça ou como recomendado pelo médico assistente. A vitamina Kl ou K3 é administrada periodicamente durante o decorrer da terapia com o agente anti-EGFR. A frequência de administração variará de acordo com a formulação, por exemplo duas vezes por dia, diariamente ou dia sim, dia não ou como recomendado pelo médico assistente. Uma formulação de libertação prolongada requererá uma administração menos frequente do que uma formulação que não proporcione libertação prolongada ou lenta do análogo de vitamina K. 0 invento proporciona vitamina Kl ou K3 para utilização num método para prevenir uma irritação de pele secundária a uma terapia anti-receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) num indivíduo que receba a referida terapia, em que o método compreende aplicar um análogo de vitamina κ à pele numa quantidade eficaz para prevenir a irritação de pele, tal como aqui descrito para tratamento de uma irritação de pele. A irritação de pele secundária a terapia anti-EGFR ocorre usualmente na face e tronco. De preferência, a vitamina Kl ou K3 é aplicada nas áreas do corpo onde aparece tipicamente a irritação de pele secundária a terapia anti-EGFR, tal como a face e tronco, ou a uma área do corpo em que o indivíduo tenha sentido uma irritação de pele durante terapia anti-EGFR anterior. De modo a prevenir a irritação de pele, a vitamina Kl ou K3 pode ser aplicada à pele com inicio, por exemplo, no dia de inicio da terapia com o agente anti-EGFR ou como recomendado pelo médico. O invento refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade de qualquer um dos análogos de vitamina K aqui descritos eficaz para tratar e/ou prevenir uma irritação de pele secundária a uma terapia anti-receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR). As composições podem também incluir um transportador farmaceuticamente aceitável. Tal como aqui utilizada, a expressão "transportador" abrange 11 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ transportadores farmacêuticos padrão, tais como álcool etílico e solventes orgânicos. Numa concretização preferida, a composição farmacêutica é formulada para administração tópica. A vitamina Kl ou K3 pode ser formulada numa formulação de libertação controlada. 0 presente invento será melhor entendido com os detalhes experimentais que se seguem. No entanto, um perito na especialidade facilmente considerará que os métodos e resultados específicos discutidos são meramente ilustrativos do invento, tal como mais completamente descrito nas reivindicações que se seguem.

DETALHES EXPERIMENTAIS

Materiais e métodos

Utilizaram-se duas linhas celulares humanas que sobrexpressam EGFR não mutado: carcinoma da vulva A431 e carcinoma da cabeça e pescoço HN5. Expuseram-se células a diferentes concentrações de diferentes análogos de vitamina K na presença de um a três inibidores de EGFR: o anticorpo monoclonal anti-EGFR cetuximab (Erbitux®) e os inibidores de tirosina quinase EGFR (TKI) erlotinib (Tarceva®) e gefitinib (Iressa®). Avaliou-se a citotoxicidade por contagem de células. Lisaram-se as células e avaliaram-se os efeitos de diferentes análogos de vitamina K na activação de EGFR, na quinase Akt e no transdutor de sinal e activador de transcrição-3 (STAT-3) por análise de hibridação "Western", utilizando anticorpos para as formas fosforiladas (activadas) de EGFR, Akt e Stat-3. Os anticorpos policlonais anti-EGFR, anti-phos-EGFR (Tyrl068), anti-AKT, anti-phos-AKT (Ser473), anti-Stat-3 e anti-phos-Stat-3 (Tyr-705) foram adquiridos de Cell Signaling (Beverly, MA) . As vitaminas Kl, K2 e K3 foram adquiridas de Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Avaliou-se a activação de EGFR, Akt e Stat-3 na presença e ausência de tratamentos anti-EGFR das células. A activação de EGFR pelo análogo de vitamina κ foi também avaliada utilizando pele de ratinho, que foi homogeneizada e lisada após tratamento com o 12 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ análogo de vitamina K. Determinou-se a actividade de fosfatase utilizando pNPP (4-nitrofenilfosfato dissódico) como substrato.

Resultados

Apresentam-se nas figuras 1A-1C os efeitos das vitaminas Kl, K2 e K3 na activação (fosforilação) de EGFR, Akt e Stat-3 obtidos de células A431 lisadas. A vitamina K3 activou EGFR e as componentes de sinalização intracelular a jusante Akt e Stat-3. Podem observar-se claramente os efeitos a uma concentração de vitamina K3 de 100 μΜ ou cerca de 17 pg/ml. A vitamina Kl foi eficaz apenas para activação de EGFR e de Akt à concentração mais elevada utilizada (1000 μΜ ou cerca de 450 pg/ml) . A vitamina K2 teve pouco ou nenhum efeito às concentrações utilizadas (até 1000 μΜ) . Assim, a vitamina K3 é um estimulante muito mais potente de EGFR, Art e Stat-3 do que vitamina Kl ou vitamina K2. A aplicação de vitamina K3 à pele de ratinho normal também activou EGFR.

Ensaiou-se a activação de EGFR, Stat-3 e Akt por vitamina K3 na presença de tratamentos anti-EGFR. Trataram-se células A431 ou células HN5 armazenadas em meio isento de soro com o inibidor de tirosina quinase de EGFR erlotinib (2 μΜ) e com vitamina K3 (0,01 - 0,5 mM) . A vitamina K3 activou EGFR (figura 2) e Stat-3 (a concentrações de 0,1 e 0,5 mM de vitamina K3) e Akt (a uma concentração de 0,5 mM de vitamina K3) na presença de erlotinib. De igual modo, a vitamina K3 (0,1 e 0,5 mM) também activou EGFR, Stat-3 e Akt na presença do anticorpo monoclonal anti-EGFR cetuximab. A vitamina K3 também salva a inibição induzida por erlotinib de fosforilação de EGFR em tecido de pele de ratinho, tal como apresentado na figura 6.

Trataram-se as células com excesso de EGF para determinar se EGF poderia evitar inibição de EGFR por diferentes tratamentos anti-EGFR. EGF foi eficaz na prevenção de inibição de EGFR pelo anticorpo monoclonal anti-EGFR cetuximab, que actua na parte extracelular de EGFR. Contrariamente, o 13 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ tratamento de células com EGF (2 pg/ml) não evita inibição de EGFR pelo inibidor de tirosina quinase de EGFR erlotinib, que actua na parte intracelular do EGFR (figura 2). A exposição de células de carcinoma da vulva humano A431 ao inibidor de tirosina quinase de EGFR erlotinib resulta em morte celular. A co-incubação das células com vitamina K3 (50— 100 μΜ) diminuiu a citotoxicidade do inibidor de EGFR em 4-6 vezes. A figura 3 ilustra os resultados obtidos com duas concentrações diferentes de vitamina K3 no salvamento de células tratadas com erlotinib. Os efeitos da vitamina K3 são reversíveis. As figuras 4A-4B demonstram que a fosforilação de EGFR induzida por vitamina K3 é reversível em células A431. A vitamina K3 actua pelo menos parcialmente por inibição de actividade de fosfatase, tal como apresentado na figura 5. O efeito é reversível 2-3 horas após remoção da vitamina K3.

Analisou-se o efeito da vitamina K3 na pele de animais a receber o inibidor de tirosina quinase de EGFR erlotinib em 100 mg/kg durante 10 dias (dias 1-10). Comparativamente com a pele de controlo de ratinhos que não receberam erlotinib, a pele tratada com vitamina K3 em animais que receberam erlotinib apresentou expressão significativa de p-EGFR, enquanto a pele não tratada com vitamina K3 nos mesmos animais apresentou regulação negativa de p-EGFR (figura 6). Espalhou-se em pele de ratinho vitamina K3 em etanol (BID a 15 mM durante 5 dias aos dias 5 a 10). Comparou-se o efeito da vitamina K3 com a de dois cremes para a pele não sujeitos a prescrição médica. O creme B (Baby Cakes) é um produto não sujeito a prescrição médica que contém vitamina K3 de acordo com a respectiva etiqueta; a concentração não está especificada. O creme VK é um creme com vitamina K a 5% à venda sem prescrição médica. Apresenta-se na figura 7 o efeito de VK3, creme B e creme VK sobre a fosforilação de EGFR em tecido de pele de ratinho. Espalhou-se em pele de ratinho vitamina K3 (em etanol) a 30 mM ou 100 mM em 3 doses cada 12 horas ou as mesmas de creme B ou creme VK. Contrariamente a 14 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ VK3 a 30 mM ou 100 mM, que activa EGFR, os cremes comerciais não apresentam qualquer efeito.

Discussão O presente pedido revela que a vitamina K3 pode evitar os efeitos inibidores de egfr da terapia anti-EGFR em linhas celulares tumorais de origem epitelial que sobrexpressam EGFR. O eixo EGFR nessas células é representativo do eixo EGFR nos queratinócitos da pele. A vitamina K3 teve um efeito estimulante na via de sinalização intracelular de EGFR, que foi eficaz mesmo na presença de terapia anti-EGFR. A vitamina K3 também activou egfr de pele normal de mamífero (ratinho). Observaram-se efeitos estimulantes mais fracos em EGFR com vitamina Kl mas não com vitamina K2. Os presentes resultados demonstram a eficácia inesperada da vitamina K3 comparativamente com a vitamina Kl ou K2 ou com dois cremes para a pele de vitamina K não sujeitos a prescrição médica, no combate à terapia anti-EGFR. A utilização de vitamina K3 para tratamento e prevenção de uma irritação de pele tal como revelado no presente pedido é contra-intuitiva tendo em conta relatos anteriores que a administração tópica de vitamina K3 causa dermatite (Page et al., 1942) e vesiculação da pele (Ulbrich, 1961) . Também se mostrou que a vitamina K3 inibe actividade de fosfatase celular, proporcionando assim a utilização de inibidores de fosfatase para o tratamento e prevenção de irritação da pele e doenças relacionadas da pele ou das mucosas.

Referências

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Lisboa, 2011-03-21

Claims

ΕΡ 1 871 353/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Vitamina Kl ou vitamina K3 para utilização num método para tratar ou evitar uma irritação de pele secundária a terapia com um anti-receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR) num indivíduo que receba a referida terapia, compreendendo o método aplicar a vitamina Kl ou vitamina K3 à pele numa quantidade eficaz para tratar ou evitar a irritação de pele, em que a vitamina Kl ou vitamina K3 é formulada numa formulação farmacêutica adequada para administração tópica.
2. Vitamina Kl ou vitamina K3 para utilização tal como reivindicado na reivindicação 1, em que a terapia anti-EGFR é tratamento com um anticorpo anti-EGFR. 3. vitamina Kl ou vitamina K3 para utilização tal como reivindicado na reivindicação 2, em que o anticorpo anti-EGFR é cetuximab.
4. Vitamina Kl ou vitamina K3 para utilização tal como reivindicado na reivindicação 1, em que a terapia anti-EGFR é tratamento com um inibidor de tirosina quinase de EGFR.
5. Vitamina Kl ou vitamina K3 para utilização tal como reivindicado na reivindicação 4, em que o inibidor de tirosina quinase de EGFR é gefitinib ou erlotinib.
6. Vitamina K3 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a vitamina K3 é aplicada na pele a uma concentração de pelo menos 15 pg/ml.
7. Vitamina K3 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a vitamina K3 é aplicada na pele a uma concentração de 50 pg/ml a 200 pg/ml. ΕΡ 1 871 353/ΡΤ 2/3
8. Vitamina Κ3 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a vitamina K3 é aplicada na pele a uma concentração de 75 pg/ml a 100 pg/ml.
9. Vitamina Kl para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a vitamina Kl é aplicada na pele a uma concentração de pelo menos 450 pg/ml.
10. Vitamina Kl ou vitamina K3 para utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a vitamina Kl ou vitamina K3 é formulada como uma formulação de libertação controlada.
11. Vitamina Kl ou vitamina K3 para utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a vitamina Kl ou vitamina K3 é aplicada na face ou tronco.
12. Utilização de vitamina Kl ou vitamina K3 no fabrico de uma composição farmacêutica para tratamento ou prevenção da irritação de pele secundária a terapia com um anti-receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR), em que a composição farmacêutica é formulada para administração tópica e compreende uma quantidade de vitamina Kl ou vitamina K3 eficaz para tratar ou evitar a referida irritação de pele.
13. Utilização de vitamina K3 de acordo com a reivindicação 12, em que a composição é formulada com pelo menos 15 pg/ml de vitamina K3.
14. Utilização de vitamina K3 de acordo com a reivindicação 12, em que a composição é formulada com 50 pg/ml a 200 pg/ml de vitamina K3.
15. Utilização de vitamina K3 de acordo com a reivindicação 12, em que a composição é formulada com 75 pg/ml a 100 pg/ml de vitamina K3. ΕΡ 1 871 353/ΡΤ 3/3
16. Utilização de vitamina Kl de acordo com a reivindicação 12, em que a composição é formulada com pelo menos 450 pg/ml de vitamina Kl.
17. Utilização de vitamina Kl ou vitamina K3 de acordo com as reivindicações 12 - 16, em que a vitamina Kl ou vitamina K3 é formulada como uma formulação de libertação controlada. Lisboa, 2011-03-21 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ 1/7

Η μ id/εςε t^s 1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12

Menadiona (VK3) - .01 .01 *05 .05 .1 .1 .5 .5 EGF (100 ng) - FIGURA 2 ro \ -j

χ<3/ε^ε τεε τ <33 FIGURA 3 Η μ A)

χ<3/ε^ε τ ε 8 Con 0 1 2.3 4

Η· 01 H (D H d)ft H· < O 10 Tempo de incubação (h) em meio isento de VK3 \ 'j Ό I H fí «a

FIGURA 4A-4B Tempo de incubação (h) em meio isento de VK3 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ 5/7

£ η Ο ϊπ5 φ ο- ·ο φ Λ 3 Ο α Η Φ a ο Ή Ο Φ Q, S e φ Η £ ιη ί 8 Η h Actividade de fosfatase relativa χ<3/ε^ε τ ε 8 τ da

180 kDa 180 kDa Erlotinib + + + \ -j Menadiona + FIGURA 6 ΕΡ 1 871 353/ΡΤ 7/7