EA039356B1 - БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ К EGFR/c-Met АНТИТЕЛА - Google Patents

БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ К EGFR/c-Met АНТИТЕЛА Download PDF

Info

Publication number
EA039356B1
EA039356B1 EA201891597A EA201891597A EA039356B1 EA 039356 B1 EA039356 B1 EA 039356B1 EA 201891597 A EA201891597 A EA 201891597A EA 201891597 A EA201891597 A EA 201891597A EA 039356 B1 EA039356 B1 EA 039356B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
egfr
cancer
met
antibody
seq
Prior art date
Application number
EA201891597A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201891597A2 (ru
EA201891597A3 (ru
Inventor
Марк Чиу
Шери Мурс
Йост Нейссен
Пауль Паррен
Янине Схюрман
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of EA201891597A2 publication Critical patent/EA201891597A2/ru
Publication of EA201891597A3 publication Critical patent/EA201891597A3/ru
Publication of EA039356B1 publication Critical patent/EA039356B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics

Abstract

Биспецифические к EGFR и/или c-Met антитела и способы получения и применения молекул. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, ErbB1 или HERI) представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I массой 170 кДа, кодируемый протоонкогеном с-ErbB1. EGFR является членом семейства человеческих рецепторов эпидермальных факторов роста (HER), которые представляют собой рецепторные тирозинкиназы (RTK), включающего HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4). Сигнализация EGFR инициируется связыванием лигандов, за которым следует индукция конформационного изменения, гомодимеризация или гетеродимеризация рецептора с другими членами семейства ErbB.

Description

Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к биспецифическим к EGFR и/или c-Met антителам и способам получения и применения молекул.
Предпосылки создания изобретения
Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, ErbB1 или HER1) представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I массой 170 кДа, кодируемый протоонкогеном с-ЕгЬВ1. EGFR является членом семейства человеческих рецепторов эпидермальных факторов роста (HER), которые представляют собой рецепторные тирозинкиназы (RTK), включающего HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4). EGFR-сигнализация запускается связыванием с лигандом, за которым следует индукция конформационного изменения, гомодимеризация или гетеродимеризация рецептора с другими членами семейства ErbB и трансаутофосфорилирование рецептора (Ferguson et al., Annu Rev Biophys, 37:353-73, 2008), в результате чего запускаются каскады трансдукции сигналов, которые в конечном счете влияют на широкий спектр клеточных функций, включая пролиферацию и выживаемость клеток. Увеличение экспрессии или киназной активности EGFR соотносят с рядом разновидностей рака у человека, что делает EGFR привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства (Mendelsohn et al., Oncogene, 19:6550-6565, 2000; Grunwald et al., J. Natl. Cancer Inst. 95:851-67, 2003; Mendelsohn et al., Semin. Oncol. 33:369-85, 2006). Как увеличение числа копий гена EGFR, так и увеличение экспрессии белка связывают с благоприятными ответами на ингибитор тирозинкиназы EGFR IRESSA™ (гефитиниб) при немелкоклеточном раке легких (Hirsch et al., Ann Oncol. 18:752-60, 2007).
EGFR-терапия включает использование как малых молекул, так и антител к EGFR, которые одобрены для лечения колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи и немелкоклеточного рака легких (NSCLC) (Baselga and Arteaga, J. Clin. Oncol. 23:2445-2459 (20005; Gill et al., J. Biol. Chem., 259:7755-7760, 1984; Goldstein et al., Clin. Cancer Res., 1:131 1-1318; 1995; Prewett et al., Clin. Cancer Res., 4:2957-2966, 1998).
Эффективность терапии анти-EGFR может зависеть от типа опухоли и от статуса мутации/амплификации EGFR в опухоли. Побочные эффекты существующих терапевтических средств могут включать кожную токсичность (De Roock et al., Lancet Oncol. 11:753-762, 2010; Linardou et al., Nat. Rev. Clin. Oncol., 6:352-366, 2009; Li and Perez-Soler, Targ. Oncol. 4:107-119, 2009). Ингибиторы тирозинкиназы EGFR (TKI) обычно применяют в качестве терапии 2-й линии при немелкоклеточном раке легких (NSCLC), но часто они прекращают работать в течение 12 месяцев из-за обусловливающих резистентность путей (Riely et al., Clin. Cancer Res. 12:839-44, 2006).
c-Met кодирует трансмембранный рецептор тирозинкиназы. Впервые его обнаружили как протоонкоген в 1984 г., после того как было выявлено, что воздействие канцерогена приводило к появлению конститутивно активного слитного белка TPR-MET (Cooper et al., Nature, 311:29-33, 1984). Активация c-Met посредством его лиганда, фактора роста гепатоцитов (HGF), вызывает стимуляцию большого числа клеточных процессов, включая рост, подвижность, вовлечение в злокачественный процесс, метастазирование, эпителиально-мезенхимальное превращение, ангиогенез/заживление ран и регенерацию тканей (Christensen et al., Cancer Lett. 225:1-26, 2005; Peters and Adjei, Nat. Rev. Clin. Oncol. 9:314-26, 2012). c-Met синтезируется в виде одноцепочечного белка, который протеолитически расщепляется на альфасубъединицу массой 50 кДа и бета-субъединицу массой 140 кДа, которые соединены дисульфидной связью (Ма et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22:309-325, 2003). c-Met структурно аналогичен другим мембранным рецепторам, таким как RON и Sea. Точная стехиометрия связывания HGF:c-Met неизвестна, но по существу считается, что две молекулы HGF связываются с двумя молекулами с-Met, что приводит к димеризации рецептора и аутофосфорилированию по тирозиновым остаткам 1230, 1234 и 1235 (Stamos et al., The EMBO Journal, 23:2325-2335, 2004). Также возможно независимое от лиганда аутофосфорилирование c-Met из-за амплификации гена, мутации или сверхэкспрессии рецептора.
c-Met часто является амплифицированным, мутированным или сверхэкспрессированным при многих типах рака, включая рак желудка, легких, толстой кишки, молочной железы, мочевого пузыря, головы и шеи, яичников, простаты, щитовидной железы, поджелудочной железы и рак в ЦНС. Миссенсмутации, как правило, локализованные в киназном домене, часто обнаруживают при наследственных папиллярных почечно-клеточных карциномах (PRCC) и в 13% случаев спорадических PRCC (Schmidt et al., Oncogene, 18:2343-2350, 1999). Мутации c-Met, локализованные в семафориновом или околомембранном доменах c-Met, часто обнаруживают при раке желудка, головы и шеи, печени, яичников, NSCLC и раке щитовидной железы (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22:309-325, 2003; Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999. 24:299-305). При раке мозга, колоректальном раке, раке желудка и легких обнаруживается амплификация c-Met, что часто коррелирует с прогрессированием заболевания (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22:309-325, 2003). До 4 и 20% случаев немелкоклеточного рака легких (NSCLC) и рака желудка соответственно показывают амплификацию c-Met (Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999, 24:299-305, Sierra and Tsao, Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21-35, 2011). При раке легких, даже в отсутствие амплификации гена, часто наблюдают сверхэкспрессию c-Met (Ichimura et al., Jpn. J. Cancer Res., 87:1063-9, 1996). Более того, почти половина клинических образцов легочных аденокарцином показывала высокие уровни c-Met и HGF, оба из которых коррелируют с повышен- 1 039356 ной скоростью роста опухоли, метастазированием и плохим прогнозом (Sierra and Tsao,
Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21-35, 2011; Siegfried et al., Ann. Thorac. Surg. 66:1915-8,
1998).
Почти в 60% всех опухолей, которые стали резистентны к ингибиторам тирозинкиназы EGFR, повышена экспрессия c-Met, амплификация c-Met или уровень единственного известного лиганда c-Met HGF (Turke et al., Cancer Cell, 17:77-88, 2010), что указывает на наличие компенсаторного пути для EGFR через c-Met. Амплификацию c-Met впервые обнаружили в культивируемых клетках, которые стали резистентны к гефитинибу, ингибитору киназы EGFR, и показывали улучшенную выживаемость через путь Her3 (Engelman et al., Science, 316:1039-43, 2007). Это было дополнительно подтверждено по клиническим образцам, в которых у 9 из 43 пациентов с приобретенной резистентностью к эрлотинибу или гефитинибу проявилась амплификация c-Met по сравнению лишь с 2 из 62 пациентов без лечения. Четверо из девяти получавших лечение пациентов также приобрели активирующую EGFR мутацию Т790М, что демонстрирует одновременные обусловливающие резистентность пути (Beat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:20932-7, 2007).
Отдельные роли как EGFR, так и c-Met при раке хорошо известны, что делает данные мишени привлекательными для комбинированной терапии. Оба рецептора генерируют сигнал через одни и те же антиапоптозные и обеспечивающие выживаемость пути (ERK и AKT). Таким образом, ингибирование данной пары в комбинации может ограничить потенциал активации компенсаторных путей, таким образом повышая общую эффективность. Комбинированные виды терапии, нацеленные на EGFR и c-Met, тестировали в клинических испытаниях Tarceva® (эрлотиниб) в комбинации с одновалентным антителом к c-Met при NSCLC (Spigel et al., 2011 ASCO Annual Meeting Proceedings 2011, Journal of Clinical Oncology:Chicago, IL. p. 7505) и Tarceva (эрлотиниб) в комбинации с ARQ-197, низкомолекулярным ингибитором c-Met (Adjei et al., Oncologist, 16:788-99, 2011). Комбинированные виды терапии или биспецифические анти-EGFR/c-Met молекулы описаны, например, в международных патентных публикациях № WO 2008/127710, WO 2009/111691, WO 2009/126834, WO 2010/039248, WO 2010/115551 и патентной публикации США № US 2009/0042906.
Современные подходы с использованием низкомолекулярных и высокомолекулярных терапевтических средств, антагонистов к сигнальным путям EGFR и/или c-Met, могут быть недостаточно оптимальны из-за возможного недостатка специфичности, потенциальной побочной активности и ограничивающей дозу токсичности, которая может проявляться при использовании низкомолекулярных ингибиторов. Типичные моноспецифические двухвалентные антитела могут приводить к кластеризации мембраносвязанных рецепторов и нежелательной активации сигнальных путей, расположенных ниже. Одновалентные антитела, имеющие полноразмерные тяжелые цепи (полуплечи), отличаются значительной сложностью и затратны в производстве.
Соответственно, существует потребность в дополнительных моноспецифических или биспецифических к EGFR и/или c-Met ингибиторах как для терапевтической, так и для диагностической целей.
Изложение сущности изобретения
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенное биспецифическое к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR)/рецептору фактора роста гепатоцитов (с-Met) антитело, содержащее:
первую тяжелую цепь (HC1), содержащую константный домен 3 HC1 (HC1 СН3) и вариабельный участок 1 HC1 (VH1);
вторую тяжелую цепь (НС2), содержащую константный домен 3 НС2 (НС2 СН3) и вариабельный участок 2 НС2 (VH2);
первую легкую цепь (LC1), содержащую вариабельный участок 1 легкой цепи (VL1); и вторую легкую цепь (LC2), содержащую вариабельный участок 2 легкой цепи (VL2), причем VH1 и VL1 совместно образуют первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с EGFR,
VH2 и VL2 совместно образуют второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с c-Met,
HC1 содержит по меньшей мере одну замену в HC1 СН3, а НС2 содержит по меньшей мере одну замену в НС2 СН3, и замена в HC1 СН3 и замена в НС2 СН3 происходит по разным положениям аминокислотных остатков, если нумерация остатков соответствует каталогу ЕС.
В других вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены биспецифические к EGFR/c-Met антитела, причем антитело ингибирует фосфорилирование связанных с внеклеточными сигналами киназ 1 и 2 (ERK1/2) в клеточной линии NCI-H292, NCI-H1975 или SKMES-1 со значением IC50, которое по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 20 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 30 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 40 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 50 раз меньше или по меньшей мере приблизительно в 60 раз меньше по сравнению со значением IC50 для ингибирования фосфорилирования ERK1/2 в клеточных линиях NCI-H292, NCI-H1975 или SKMES-1 при помощи смеси контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего тяжелую цепь 3 (НС3) и легкую цепь 3 (LC3), и контрольного однова- 2 039356 лентного антитела к c-Met, содержащего тяжелую цепь 4 (НС4) и легкую цепь 4 (LC4), причем НС3 и HC1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно, причем фосфорилирование ERK1/2 измеряют в цельноклеточных лизатах методом сэндвич-ИФА с применением антитела к фосфо-ERK1/2 в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела, связывающегося с не фосфорилированной и фосфорилированной ERK1/2, в качестве детекторного антитела.
В других вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены биспецифические к EGFR/c-Met антитела, причем антитело ингибирует фосфорилирование протеинкиназы В (AKT) по Ser473 в клеточной линии NCI-H1975 со значением IC50, которое по меньшей мере приблизительно в 70 раз меньше значения IC50 для ингибирования фосфорилирования AKT по Ser473 в клеточной линии NCI-H1975 с помощью смеси контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего НС3 и LC3, и контрольного одновалентного антитела к c-Met, содержащего НС4 и LC4, причем НС3 и HC1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно, причем фосфорилирование AKT по Ser473 измеряют в цельноклеточных лизатах методом сэндвич-ИФА с применением антитела, связывающегося с не фосфорилированной и фосфорилированной AKT, в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела к фосфорилированной по Ser473 AKT в качестве детекторного антитела.
В других вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены биспецифические к EGFR/c-Met антитела, которые связываются с EGFR в SEQ ID NO: 73 по остаткам EGFR K489, I491, K467 и S492 и с c-Met по остаткам PEFRDSYPIKYVHAF (SEQ ID NO: 238) и FAQSKPDSAEPMDRSA (SEQ ID NO: 239).
В других вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены биспецифические к EGFR/c-Met антитела, которые ингибируют рост клеток NCI-H292 или NCI-H1975 со значением IC50, которое по меньшей мере приблизительно в 300 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 400 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 500 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 600 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 700 раз меньше или по меньшей мере приблизительно в 800 раз меньше значения IC50 для ингибирования роста клеток NCI-H292 или NCI-H1975 цетуксимабом, когда клетки NCI-H292 или NCI-H1975 выращивают в условиях с низким прикреплением.
В других вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены биспецифические к EGFR/c-Met антитела, которые ингибируют рост опухоли из экспрессирующих HGF клеток SKMES-1 у мышей SCID Beige с процентным (%) значением Т/С на 36 сутки, которое по меньшей мере в 500 раз меньше по сравнению с цетуксимабом, при введении биспецифического антитела и цетуксимаба в дозе 20 мг/кг.
В других вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены биспецифические к EGFR/c-Met антитела, в которых HC1 СН3 содержит замену K409R или F405L, а НС2 СН3 содержит замену K409R или F405L, причем нумерация остатков соответствует каталогу ЕС.
В других вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены биспецифические к EGFR/c-Met антитела, содержащие некоторые последовательности тяжелой и легкой цепей CDR, VH1, VL1, VH2, VL2, HC1, LC1, HC2 и LC2.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный синтетический полинуклеотид, кодирующий HC1, НС2, LC1 или LC2 настоящего изобретения.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой вектор, содержащий полинуклеотид настоящего изобретения.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой клетку-хозяина, содержащую вектор настоящего изобретения.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ получения выделенного биспецифического к EGFR/c-Met антитела, включающий:
объединение выделенного моноспецифического двухвалентного антитела к EGFR, содержащего две тяжелые цепи с SEQ ID NO: 199 и две легкие цепи с SEQ ID NO: 200, а также выделенного моноспецифического двухвалентного антитела к c-Met, содержащего две тяжелые цепи с SEQ ID NO: 201 и две легкие цепи с SEQ ID NO: 202, в смесь с молярным соотношением приблизительно 1:1;
введение в смесь восстанавливающего агента;
инкубирование смеси в течение от приблизительно 90 мин до приблизительно 6 ч;
удаление восстанавливающего агента;
очистку биспецифического к EGFR/c-Met антитела, содержащего первую тяжелую цепь с SEQ ID NO: 199 и вторую тяжелую цепь с SEQ ID NO: 201, первую легкую цепь с SEQ ID NO: 200 и вторую легкую цепь с SEQ ID NO: 202, причем первая тяжелая цепь с SEQ ID NO: 199 совместно с первой легкой цепью с SEQ ID NO: 200 образует первый связывающий домен, который специфически связывается с EGFR, а вторая тяжелая цепь с SEQ ID NO: 201 совместно со второй легкой цепью с SEQ ID NO: 202 образует второй связывающий домен, который специфически связывается с c-Met.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую биспецифическое антитело настоящего изобретения и фармацевтически при- 3 039356 емлемый носитель.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ лечения субъекта, имеющего рак, который включает введение терапевтически эффективного количества биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения нуждающемуся в лечении пациенту в течение периода времени, достаточного для лечения рака.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования роста или пролиферации клеток, экспрессирующих EGFR и/или c-Met, который включает приведение клеток в контакт с биспецифическим антителом настоящего изобретения.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования роста и метастазирования экспрессирующей EGFR и/или c-Met опухоли или раковых клеток у субъекта, который включает введение субъекту эффективного количества биспецифического антитела настоящего изобретения для ингибирования роста или метастазирования экспрессирующей EGFR и/или c-Met опухоли или раковых клеток.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А и 1В. Выравнивание аминокислотной последовательности доменов FN3, связывающихся с EGFR. В прямоугольники заключены петли ВС и FG в остатках 22-28 и 75-86 в SEQ ID NO: 18. Некоторые варианты включают повышающие температурную стабильность замены L17A, N46K и E86I (нумерация остатков соответствует Tencon SEQ ID NO: 1).
Фиг. 2. Выравнивание последовательности каркаса Tencon27 (SEQ ID NO: 99) и библиотеки TCL14 (SEQ ID NO: 100), имеющей рандомизированную альтернативной поверхность C-CD-F-FG. Остатки петли заключены в прямоугольники. Над последовательностями указаны петли и тяжи.
Фиг. 3. Выравнивание последовательности доменов FN3, связывающихся с c-Met. Петля С и тяж CD, а также петля F и тяж FG заключены в прямоугольники и охватывают остатки 29-43 и 65-81.
Фиг. 4. Ингибирование фосфорилирования c-Met в клетках NCI-H292, предварительно обработанных моноспецифическими или биспецифическими молекулами, содержащими домен FN3, и стимулированных HGF. Наблюдали существенное увеличение эффективности биспецифической к EGFR/c-Met молекулы (ЕСВ1) по сравнению с моноспецифическим доменом FN3, связывающимся с c-Met (P114AR5P74-A5, показан на фигуре как элемент А5), используемым отдельно или в комбинации с доменом FN3, связывающимся с EGFR (P54AR4-83v2, показан на фигуре как элемент 83v2).
Фиг. 5. Ингибирование фосфорилирования EGFR и c-Met в клетках, предварительно обработанных моноспецифическими или биспецифическими молекулами, содержащими домен FN3. В клеточных линиях с высокими уровнями экспрессии EGFR, NCI-H292 (фиг. 5А) и Н596 (фиг. 5В) моноспецифические или биспецифические молекулы антител к EGFR, содержащих домен FN3, в равной степени могут эффективно уменьшать фосфорилирование EGFR. В клеточных линиях с низким уровнем экспрессии EGFR относительно c-Met, NCI-H441 (фиг. 5С) биспецифические к EGFR/c-Met молекулы повышают эффективность ингибирования фосфорилирования EGFR по сравнению только с моноспецифическим доменом FN3, связывающимся с EGFR. В клеточных линиях с низким уровнем экспрессии c-Met относительно EGFR, NCI-H292 (фиг. 5D) и Н596 (фиг. 5Е) ингибирование фосфорилирования c-Met существенно усиливалось с биспецифической к EGFR/c-Met молекулой по сравнению только с моноспецифическим доменом FN3, связывающимся с c-Met. В исследовании использовали следующие молекулы: биспецифическая ЕСВ5 (показана на фигуре как элемент 17-А3), моноспецифический домен FN3, связывающийся с EGFR, P53A1R5-17 (показан на фигуре как элемент 17), биспецифическая к EGFR/c-Met молекула ЕСВ3 (показана на фигуре как элемент 83-Н9) и моноспецифический домен FN3, связывающийся с c-Met, P114AR7P93-H9 (показан на фигуре как элемент Н9).
Фиг. 6. Фармакодинамическая сигнализация в опухолях, выделенных из мышей, получавших биспецифические к EGFR/c-Met молекулы в течение 6 или 72 ч. Все молекулы существенно снижали фосфорилирование c-Met, EGFR и ERK через 6 и 72 ч, причем степень ингибирования зависела от аффинности доменов FN3 к EGFR и/или c-Met. Биспецифические молекулы создавали путем соединения домена FN3, связывающегося с EGFR, с высокой (показано на фигуре как элемент 83, p54AR4-83v2) или средней (показано на фигуре как элемент 17v2, P53A1R5-17v2) аффинностью с доменом FN3, связывающимся с c-Met, с высокой (показано на фигуре как элемент A3, P114AR7P94-A3) или средней (показано на фигуре как элемент А5, P114AR5P74-A5) аффинностью.
Фиг. 7. Накопление в плазме (сверху) и в опухоли (снизу) биспецифических к EGFR/c-Met молекул с различными значениями аффинности, связанных с альбумин-связывающим доменом (ABD), показано через 6 ч (слева) и 72 ч (справа) после интраперитонеального (и/п) введения. Через 6 ч после введения накопление в опухоли было максимальным у мышей, получавших биспецифическую молекулу, в которой удерживается домен FN3, связывающийся с EGFR (17v2), со средней аффинностью, или домен, связывающийся с EGFR (83v2), с высокой аффинностью. Биспецифические молекулы, в которые включены домены FN3, связывающиеся с EGFR или c-Met, со средней или высокой аффинностью, были следующими: 83v2-A5-ABD (ЕСВ18; высокая/средняя для EGFR/c-Met) 83v2-A3-ABD (ECB38; высокая/высокая) 17v2-A5 (ЕСВ28; средняя/средняя) 17v2-A3-ABD (ECB39; средняя/высокая). На фиг. 7 3v2 обозначает p54AR4-83v2; 17v2 обозначает p53A1R5-17v2; A3 обозначает p114AR7P94-A3 и А5 обозна- 4 039356 чает p114AR5P74-A5.
Фиг. 8. Ксенотрансплантаты опухоли H292-HGF имплантировали мышам SCID Beige. Когда опухоли достигали среднего объема приблизительно 80 мм3, мышам три раза в неделю вводили биспецифические к EGFR/c-Met молекулы (25 мг/кг) или носитель PBS. Все биспецифические молекулы уменьшали рост опухоли, причем ингибирование роста опухоли (TGI) зависело от значений аффинности молекул к c-Met и EGFR (высокая EGFR - высокая c-Met соответствует p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3 (ECB38); высокая EGFR - средняя c-Met соответствует p54AR4-83v2-p114AR5P74-A5 (ECB18); средняя EGFR высокая c-Met соответствует p53A1R5-17v2-p114AR7P94-A3 (ECB39); средняя EGFR - средняя c-Met соответствует p53AlR5-17-p114AR5P74-A5 (ЕСВ28)).
Фиг. 9. Ксенотрансплантаты опухоли H292-HGF имплантировали мышам SCID Beige и проводили лечение с использованием разных видов терапии. Показана противоопухолевая активность терапии (биспецифическая к EGFR/c-Met молекула обозначает p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3-ABD (ECB38); другие виды терапии представляют собой кризотиниб, эрлотиниб, цетуксимаб и комбинацию кризотиниба и эрлотиниба).
Фиг. 10. Ксенотрансплантаты опухоли SKMES-HGF имплантировали мышам SCID Beige и проводили разные виды терапии. Противоопухолевая активность терапии показана как изменение размера опухоли (мм3) с течением времени. Биспецифическое к EGFR/c-Met антитело EM1-mAb вводили интраперитонеально (и/п) дважды в неделю в дозе 20, 5 или 1 мг/кг; цетуксимаб вводили и/п дважды в неделю в дозе 20 мг/кг. Стрелки на фигуре показывают дни введения. Числа после антител указывают на введенную дозу.
Фиг. 11. Ксенотрансплантаты опухоли НСС827 имплантировали бестимусным мышам, и мыши получали лечение эрлотинибом или EM1-mAb в указанных дозах. EM1-mAb вводили дважды в неделю, а эрлотиниб - один раз в сутки в течение четырех недель. Стрелки на фигуре показывают дни введения. Противоопухолевая активность терапии показана как изменение размера опухоли (мм3) с течением времени.
Фиг. 12. Ксенотрансплантаты опухоли SNU-5 имплантировали мышам CB17/SCID, и мыши получали лечение цетуксимабом 10 мг/кг или EM1-mAb 10 или 1 мг/кг. Антитела вводили дважды в неделю в течение четырех недель. Стрелки на фигуре показывают дни введения. Противоопухолевая активность терапии показана как изменение размера опухоли (мм3) с течением времени.
Фиг. 13. Ксенотрансплантаты опухоли H1975-HGF имплантировали бестимусным мышам, и мыши получали лечение 10 мг/кг цетуксимаба, 10 мг/кг EM1-mAb, 50 мг/кг эрлотиниба, 15 мг/кг афатиниба или комбинацией 10 мг/кг EM1-mAb и 15 мг/кг афатиниба. Антитела вводили дважды в неделю, а низкомолекулярные соединения - один раз в сутки в течение трех недель. Стрелки на фигуре показывают дни введения. Противоопухолевая активность терапии показана как изменение размера опухоли (мм3) с течением времени.
Фиг. 14. Ксенотрансплантаты опухоли HCC827-ER1 имплантировали бестимусным мышам, и мыши получали лечение 10 мг/кг EM1-mAb, 25 мг/кг эрлотиниба или комбинацией двух препаратов. EM1-mAb вводили дважды в неделю, а эрлотиниб вводили один раз в сутки в течение 19 дней. Стрелки на фигуре показывают дни введения. Противоопухолевая активность терапии показана как изменение размера опухоли (мм3) с течением времени.
Фиг. 15. Средние уровни EGFR и c-Met в лизатах опухолей, выделенных из ксенотрансплантатов опухоли Н1975 HGF, имплантированных мышам SCID Beige, после однократного введения 20 мг/кг EM1-mAb. Уровни рецепторов показаны в % относительно контроля PBS в указанное время после лечения.
Фиг. 16. Ксенотрансплантаты опухоли H1975-HGF имплантировали бестимусным мышам, и мыши получали лечение 10 мг/кг EM1-mAb или 10 мг/кг варианта EM1-mAb IgG2 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, не связывающегося с рецептором Fc и не имеющего эффекторных функций. Антитела вводили дважды в неделю в указанные дни. Противоопухолевая активность терапии показана как изменение размера опухоли (мм3) с течением времени.
Подробное описание изобретения
Термин домен фибронектина типа III (FN3) (домен FN3) в настоящем документе обозначает домен, часто встречающийся в белках, включая фибронектины, тенасцин, белки внутриклеточного цитоскелета, цитокиновые рецепторы и прокариотические ферменты (Bork and Doolittle, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J. Bacteriol. 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:15659-15665, 1990). Примеры доменов FN3 представляют собой 15 разных доменов FN3, присутствующих в тенасцине С человека, 15 различных доменов FN3, присутствующих в фибронектине (FN) человека, и синтетические домены неприродного происхождения FN3, описанные, например, в патентной публикации США № 2010/0216708. Отдельные домены FN3 обозначают по номеру домена и названию белка, например 3-й домен FN3 тенасцина (TN3) или 10-й домен FN3 фибронектина (FN10).
Термин замена, замещенный, мутация или мутированный в настоящем документе относится к изменению, делеции или вставке одной или более аминокислот или нуклеотидов в последовательности полипептида или полинуклеотида для создания варианта этой последовательности.
- 5 039356
Термин рандомизация, рандомизированный, диверсифицированный или диверсификация в настоящем документе относится к выполнению по меньшей мере одной замены, вставки или делеции в последовательности полинуклеотида или полипептида.
Термин вариант в настоящем документе относится к полипептиду или полинуклеотиду, который отличается от эталонного полипептида или эталонного полинуклеотида одной или более модификациями, например, заменами, вставками или делециями.
Термин специфически связывается или специфическое связывание в настоящем документе относится к способности домена FN3, биспецифического агента, который специфически связывается с EGFR и c-Met, или биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения связываться с заданным антигеном с константой диссоциации (KD) приблизительно 1х10’6 М или менее, например, приблизительно 1х10’7 М или менее, приблизительно 1х10’8 М или менее, приблизительно 1х10’9 М или менее, приблизительно 1x10’1° М или менее, приблизительно 1x10-11 М или менее, приблизительно 1х1012 М или менее или приблизительно 1x10’1 М или менее. Как правило, домен FN3, биспецифический агент, который специфически связывается с ECFR и c-Met, или биспецифическое к EGFR/c-Met антитело настоящего изобретения связывается с заданным антигеном (т. е. EGFR или c-Met) с KD, который по меньшей мере в десять раз меньше его KD для неспецифического антигена (например, BSA или казеина), что измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса с помощью, например, прибора Proteon (BioRad). Таким образом, биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3, биспецифический агент, который специфически связывается с EGFR и c-Met, или биспецифическое к EGFR/c-Met антитело настоящего изобретения специфически связывается с каждым EGFR и с c-Met с аффинностью связывания (KD) по меньшей мере приблизительно 1х10’6 М или менее, например, приблизительно 1х10’7 М или менее, приблизительно 1х10’8 М или менее, приблизительно 1х10’9 М или менее, приблизительно 1х10’10 М или менее, приблизительно 1х10-11 М или менее, приблизительно 1х10’12 М или менее или приблизительно 1х10’13 М или менее. Однако биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3, биспецифический агент, который специфически связывается с EGFR и с-Met, или биспецифическое к EGFR/c-Met антитело настоящего изобретения, которое специфически связывается с заданным антигеном, может обладать перекрестной реактивностью к другим родственным антигенам, например к одному и тому же заданному антигену других видов (гомологам).
Термин библиотека в настоящем документе относится к группе вариантов. Библиотека может состоять из вариантов полипептида или полинуклеотида.
Термин стабильность в настоящем документе относится к способности молекулы сохранять свернутое состояние в физиологических условиях, так чтобы сохранять по меньшей мере одну из своих обычных функциональных активностей, например способность связываться с заданным антигеном, таким как EGFR или c-Met.
Термин рецептор эпидермального фактора роста или EGFR в настоящем документе относится к человеческому EGFR, также известному как HER1 или ErbB1 (Ullrich et al., Nature, 309:418425, 1984), с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 73, и по номеру доступа NP 005219 в GenBank, а также ее вариантами, которые встречаются в естественных условиях. Такие варианты включают хорошо известный EGFRvIII и другие варианты альтернативного сплайсинга (например, определенный под номером Р00533-1 в SwissProt (дикий тип, идентичный SEQ ID NO: 73 и NP 005219), P00533-2 (F404L/L405S), Р00533-3 (628-705:
CTGPGLEGCP...GEAPNQALLR^PGNESLKAML...SVIITASSCH и 706-1210 делеция), Р00533-4 (C628S и 629-1210 делеция), варианты GlnQ98, R266, K521, I674, G962 и Р988 (Livingston et al., NIEHS-SNPs, Environmental Genome Project, NIEHS ES15478), T790M, L858R/T790M и del (E746, A750)).
Термин лиганд EGFR в настоящем документе охватывает все (например, физиологические) лиганды для EGFR, включая EGF, TGFa, гепарин-связывающий EGF (HB-EGF), амфирегулин (AR) и эпирегулин (EPI).
Термин эпидермальный фактор роста (EGF) в настоящем документе относится к хорошо известному EGF человека из 53 аминокислот, имеющему аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 74.
Термин рецептор фактора роста гепатоцитов, или c-Met, в настоящем документе относится к c-Met человека с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 101, или по номеру доступа в GenBank NP 001120972, и ее природными вариантами.
Термин фактор роста гепатоцитов (HGF) в настоящем документе относится к хорошо известному HGF человека с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 102, которая расщепляется с образованием димера альфа- и бета-цепи, связанной дисульфидной связью.
В настоящем документе на взаимозаменяемой основе термины блокирует связывание или ингибирует связывание относятся к способности доменов FN3, биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домены FN3 настоящего изобретения, биспецифического агента, специфически связывающегося с EGFR и c-Met, или биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения блокировать или ингибировать связывание лиганда EGFR, например EGF с EGFR и/или HGF с c-Met, и вклю- 6 039356 чает как частичное, так и полное блокирование/ингибирование. Блокирование/ингибирование лиганда EGFR, например EGF с EGFR и/или HGF с c-Met, посредством доменов FN3 или биспецифической к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащей домены FN3, биспецифического агента, специфически связывающегося с EGFR и c-Met, или биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения частично или полностью снижает нормальный уровень сигнализации EGFR и/или сигнализации c-Met по сравнению со связыванием лиганда EGFR с EGFR и/или связыванием HGF с c-Met без блокирования или ингибирования. Домен FN3 или биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домены FN3, биспецифический агент, специфически связывающийся с EGFR и c-Met, или биспецифическое к EGFR/c-Met антитело настоящего изобретения блокирует связывание лиганда EGFR, например EGF с EGFR и/или HGF с c-Met, когда ингибирование составляет по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.
Ингибирование связывания можно измерить при помощи хорошо известных способов, например путем измерения ингибирования связывания биотинилированного EGF на экспрессирующих EGFR клетках А431, которые подвергали воздействию домена FN3, биспецифической молекулы, содержащей домены FN3, связывающиеся с EGFR/c-Met, биспецифического агента, специфически связывающегося с EGFR и c-Met, или биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения, с использованием FACS, а также с использованием способов, описанных в настоящем документе, или путем измерения связывания биотинилированного HGF с внеклеточным доменом c-Met с использованием хорошо известных способов и способов, описанных в настоящем документе.
Термин сигнализация EGFR в настоящем документе относится к трансдукции сигнала, индуцированной связыванием лиганда EGFR с EGFR, что приводит к аутофосфорилированию по меньшей мере одного тирозинового остатка в EGFR. Пример лиганда EGFR представляет собой EGF.
Термин нейтрализует сигнализацию EGFR в настоящем документе относится к способности доменов FN3, биспецифической к EGFR/c-Met содержащей FN3 молекулы, биспецифического агента, специфически связывающегося с EGFR и c-Met, или биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения ингибировать EGFR-сигнализацию, индуцируемую лигандом EGFR, таким как EGF, по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.
Термин сигнализация c-Met в настоящем документе относится к трансдукции сигнала, индуцированной связыванием лиганда HGF с c-Met, что приводит к аутофосфорилированию по меньшей мере одного тирозинового остатка в c-Met. Как правило, по меньшей мере один тирозиновый остаток в положениях 1230, 1234, 1235 или 1349 после связывания HGF подвергается аутофосфорилированию.
Термин нейтрализует сигнализацию c-Met в настоящем документе относится к способности доменов FN3, биспецифической к EGFR/c-Met содержащей FN3 молекулы, биспецифического агента, специфически связывающегося с EGFR и c-Met, или биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения ингибировать сигнализацию c-Met, индуцируемую HGF, по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98, 99 или 100%.
В настоящем документе на взаимозаменяемой основе термины сверхэкспрессия, сверхэкспрессируемый и сверхэкспрессирующий относятся к раковой или злокачественной клетке, которая имеет на поверхности измеримо повышенные уровни EGFR и/или c-Met по сравнению с нормальной клеткой из ткани того же типа. Такая сверхэкспрессия может быть вызвана амплификацией генов или повышенной транскрипцией или трансляцией. Экспрессию и сверхэкспрессию EGFR и/или c-Met можно измерить, используя хорошо известные анализы, например ИФА, иммунофлуоресценцию, проточную цитометрию или радиоиммунный анализ на живых или лизированных клетках. Альтернативно или дополнительно, уровни молекул нуклеиновых кислот, кодирующих EGFR и/или c-Met, можно измерить в клетке, например, с помощью методик флуоресцентной гибридизации in situ, саузерн-блоттинга или ПЦР. Сверхэкспрессия EGFR и/или c-Met означает, что уровень EGFR и/или c-Met на поверхности клетки по меньшей мере в 1,5 раза выше по сравнению с уровнем нормальной клетки.
Термин Tencon в настоящем документе обозначает синтетический домен фибронектина типа III (FN3), имеющий последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 и описанную в патентной публикации США № US 2010/0216708.
Термин раковая клетка или опухолевая клетка в настоящем документе обозначает раковую, предраковую или преобразованную клетку in vivo, ex vivo и в культуре клеток, которая имеет спонтанные или индуцированные фенотипические изменения, которые необязательно затрагивают получение нового генетического материала. Хотя преобразование может вызвать инфицирование преобразующим вирусом и встраивание новой геномной нуклеиновой кислоты или поглощение экзогенной нуклеиновой кислоты, она также может возникнуть спонтанно или после воздействия канцерогена, в результате чего происходит мутация эндогенного гена. Преобразование/рак проявляется, например, в морфологических изменениях, иммортализации клеток, нарушении контроля роста, образовании очагов, пролиферации, злокачественности, уровнях маркера, специфичных для опухоли, инвазивности, росте опухоли или ее подавлении у подходящих животных-хозяев, таких как бестимусные мыши и т.п., in vitro, in vivo и ex vivo (Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)).
Термин вектор означает полинуклеотид, способный к воспроизведению внутри биологической
- 7 039356 системы или который можно переместить между такими системами. Полинуклеотиды-векторы, как правило, содержат элементы, такие как точки начала репликации, сигнал полиаденилирования или маркеры выбора, которые функционируют так, чтобы способствовать удвоению или сохранению этих полинуклеотидов в биологической системе. Примеры таких биологических систем могут включать клетку, вирус, животное, растение и реконструированные биологические системы, использующие биологические компоненты, способные к удвоению вектора. Содержащий вектор полинуклеотид может представлять собой молекулы ДНК или РНК или их гибрид.
Термин вектор экспрессии означает вектор, который можно использовать в биологической системе или реконструированной биологической системе для прямой трансляции полипептида, закодированного полинуклеотидной последовательностью, присутствующей в векторе экспрессии.
Термин полинуклеотид означает молекулу, содержащую цепь нуклеотидов, ковалентно связанных через сахарофосфатную основную цепь или другую эквивалентную ковалентную химическую структуру. Двухцепочечные и одноцепочечные молекулы ДНК и РНК представляют собой типичные примеры полинуклеотидов.
Термин комплементарная ДНК, или кДНК, обозначает известный синтетический полинуклеотид, имеющий то же расположение элементов последовательности, что и в нативных зрелых разновидностях мРНК, со смежными экзонами и с удаленными вмешивающимися интронами, присутствующими в геномной ДНК. Кодоны, кодирующие начальный метионин, могут присутствовать или не присутствовать в кДНК. кДНК можно синтезировать, например, путем обратной транскрипции или синтетической сборки генов.
Синтетический, или неприродного происхождения, или искусственный в настоящем документе относится к полинуклеотидной или полипептидной молекуле, не присутствующей в природе.
Термин полипептид или белок обозначает молекулу, которая содержит по меньшей мере два аминокислотных остатка, связанных пептидной связью с образованием полипептида. Малые полипептиды, содержащие менее чем приблизительно 50 аминокислот, могут называться пептидами.
Термин биспецифическая к EGFR/c-Met молекула или биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3 в настоящем документе обозначает молекулу, содержащую домен FN3, связывающийся с EGFR, и отдельный домен FN3, связывающийся с c-Met, которые ковалентно связаны либо напрямую, либо посредством линкера. Пример биспецифической молекулы, связывающейся с EGFR/c-Met, содержит первый домен FN3, специфически связывающийся с EGFR, и второй домен FN3, специфически связывающийся с c-Met.
Термин валентный в настоящем документе относится к наличию в молекуле установленного числа сайтов связывания, специфичных для антигена. Таким образом, термины одновалентный, двухвалентный, четырехвалентный и шестивалентный относятся к наличию в молекуле соответственно одного, двух, четырех и шести сайтов связывания, специфичных для антигена.
Термин смесь в настоящем документе относится к образцу или препарату из двух или более доменов FN3, не связанных вместе ковалентной связью. Смесь может состоять из двух или более идентичных доменов FN3 или разных доменов FN3. Смесь, использованная в настоящем документе, также относится к образцу или препарату из двух или более одновалентных антител, которые являются одновалентными по отношению к EGFR и/или одновалентными по отношению к c-Met.
Термин биспецифический агент, специфически связывающийся с EGFR и c-Met, в настоящем документе означает молекулу, содержащую первый домен, специфически связывающийся с EGFR, и второй домен, специфически связывающийся с c-Met. Примером агента, специфически связывающегося с EGFR и c-Met, является биспецифическое антитело. Другим примером биспецифического агента, специфически связывающегося с EGFR и c-Met, является молекула, содержащая связывающийся с EGFR домен FN3, и отдельный домен FN3, связывающийся с c-Met. Биспецифический агент, специфически связывающийся с EGFR и c-Met, может быть образован из одного полипептида или более чем из одного полипептида.
Термин биспецифическое антитело к EGFR/c-Met, или биспецифическое к EGFR/c-Met антитело, в настоящем документе означает биспецифическое антитело, имеющее первый домен, специфически связывающийся с EGFR, и второй домен, специфически связывающийся с c-Met. Домены, специфически связывающиеся с EGFR и c-Met, как правило, представляют собой пары VH/VL, а биспецифическое антитело к EGFR/c-Met является одновалентным в отношении связывания с EGFR и c-Met.
Предполагается, что термин антитела в настоящем документе используется в широком смысле и включает молекулы иммуноглобулинов, включая поликлональные антитела, моноклональные антитела, включая мышиные, человеческие, адаптированные для человека, гуманизированные и химерные моноклональные антитела, фрагменты антител, биспецифические или мультиспецифические антитела, димерные, тетрамерные или мультимерные антитела, а также одноцепочечные антитела.
Иммуноглобулины могут относиться к пяти основным классам, а именно IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. IgA и IgG дополнительно классифицируются на изотипы IgA,, IgA2, IgGi, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи антител любых видов позвоночных можно отнести к одному из двух четко отличающихся типов, а именно каппа (к)
- 8 039356 и лямбда (λ), в зависимости от аминокислотных последовательностей их константных доменов.
Термин фрагменты антитела означает часть молекулы иммуноглобулина, которая сохраняет антигенсвязывающий сайт тяжелой цепи и/или легкой цепи, например участки тяжелой цепи (HCDR) 1, 2 и 3, определяющие комплементарность, участки легкой цепи (LCDR) 1, 2 и 3, определяющие комплементарность, вариабельный участок тяжелой цепи (VH) или вариабельный участок легкой цепи (VL). К фрагментам антител относятся фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CHI; фрагмент F(ab)2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирном участке; фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CHI; фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; доменный (dAb) фрагмент антитела (Ward et al. (1989), Nature, 341:544-546), состоящий из домена VH. Домены VH и VL могут быть сконструированы методами инженерии и связаны вместе посредством синтетического линкера с образованием различных типов конструкций одноцепочечных антител, в которых домены VH/VL соединяются в пару внутримолекулярно или межмолекулярно в тех случаях, когда домены VH и VL экспрессированы в отдельных одноцепочечных конструктах антител, с образованием одновалентного антигенсвязывающего сайта, например одноцепочечного Fv (scFv) или диатела; описаны, например, в международных публикациях РСТ № WO 1998/44001, WO 1988/01649, WO 1994/13804 и WO 1992/01047. Данные фрагменты антител получают с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области, и проводят скрининг фрагментов на пригодность таким же образом, как и для полноразмерных антител.
Фраза выделенное антитело означает антитело или фрагмент антитела, по существу не содержащий других антител, имеющих разные значения антигенной специфичности (например, выделенное биспецифическое антитело, специфически связывающееся с EGFR и c-Met, по существу не содержит антител, специфически связывающихся с антигенами, отличными от человеческого EGFR и c-Met). Однако выделенное антитело, специфически связывающееся с EGFR и c-Met, может иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, например ортологами человеческого EGFR и/или c-Met, такими как EGFR и/или c-Met Macaca fascicularis (яванский макак). Более того, выделенное антитело может по существу не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.
Вариабельный участок антитела состоит из каркасного участка, разделенного тремя антигенсвязывающими сайтами. Антигенсвязывающие сайты определены с помощью различных терминов: (i) участки, определяющие комплементарность (CDR) - три в VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три в VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) - основаны на вариабельности последовательности (Wu и Kabat (1970), J. Exp. Med. 132:211-50, 1970; Kabat et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991); (ii) гипервариабельные участки, HVR или HV - три в VH (H1, H2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3) - обозначают участки вариабельных доменов антитела, которые являются гипервариабельными по структуре согласно определению Chothia и Lesk (Chothia and Lesk Mol. Biol. 196:901-17, 1987). К другим терминам относятся IMGT-CDR (Lefranc et al., Dev. Comparat Immunol. 27:55-77, 2003) и используемые остатки, определяющие специфичность (SDRU) (Almagro Mol. Recognit. 17:132-43, 2004). В базе данных International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) представлена стандартизованная нумерация и определение антигенсвязывающих сайтов. Соответствие между границами CDR, HV и IMGT описано в публикации Lefranc et al., Dev. Comparat Immunol. 27:55-77, 2003.
Остатки по Chothia в настоящем документе представляют собой остатки антитела VL и VH с нумерацией в соответствии с Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-48, 1997).
Каркас или каркасные последовательности представляют собой оставшиеся последовательности вариабельного участка, которые отличны от определяющих антигенсвязывающие сайты. Так как антигенсвязывающие сайты, как описано выше, могут определяться различными терминами, точная аминокислотная последовательность каркаса зависит от определения антигенсвязывающего сайта.
Гуманизированное антитело означает антитело, в котором антиген связывающие сайты получены от видов, отличных от человека, а каркасы вариабельного участка получены от последовательностей человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела могут включать замены в каркасных участках, в результате чего каркас может не быть точной копией экспрессированного человеческого иммуноглобулина или зародышевых генных последовательностей.
Термин адаптированные для человека антитела или адаптированные для человеческого каркаса (HFA) антитела означает гуманизированные антитела, адаптированные в соответствии со способами, описанными в патентной публикации США № US 2009/0118127. Адаптированные для человека антитела гуманизируют путем выбора человеческих каркасов-реципиентов на основе максимальных сходств CDR и FR, совместимости длины и сходства последовательности петель CDR1 и CDR2 и части петель CDR3 легкой цепи.
Термин человеческое антитело означает антитело, имеющее вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, в которых как каркасные, так и антигенсвязывающие сайты получены из последовательностей человеческого происхождения. Если антитело содержит константный участок, то константный участок также получен из последовательностей человеческого происхождения.
Человеческое антитело содержит вариабельные участки тяжелой или легкой цепи, которые полу- 9 039356 чены из последовательностей человеческого происхождения, если вариабельные участки антитела получены из системы, в которой используется человеческий иммуноглобулин зародышевого типа или перераспределенные гены иммуноглобулина. К таким системам относятся библиотеки генов человеческих иммуноглобулинов на фаговом дисплее и трансгенные животные, отличные от человека, например мыши, несущие локусы человеческих иммуноглобулинов, как описано в настоящем документе. Человеческое антитело может содержать аминокислотные отличия по сравнению с человеческой зародышевой линией или перераспределенные последовательности иммуноглобулинов, обусловленные, например, встречающимися в естественных условиях соматическими мутациями или намеренным введением замен в каркасные или антигенсвязывающие сайты. Как правило, человеческое антитело по меньшей мере приблизительно на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,98, 99 или 100% идентично аминокислотной последовательности, кодируемой геном человеческой зародышевой линии или перераспределенным геном иммуноглобулина. В некоторых случаях человеческое антитело может содержать консенсусные каркасные последовательности, полученные в результате анализов человеческих каркасных последовательностей, например, как описано в публикации Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:5786, 2000), или синтетические HCDR3, включенные в библиотеки генов человеческих иммуноглобулинов на фаговом дисплее, например, как описано в публикации Shi et al., J. Mol. Biol. 397:385-96, 2010 и международной патентной публикации № WO 2009/085462). Антитела, в которых антигенсвязывающие сайты получены от видов, отличных от человека, не подходят под определение человеческого антитела.
Выделенные гуманизированные антитела могут быть синтетическими. Человеческие антитела, хотя и полученные из последовательностей человеческого иммуноглобулина, могут быть созданы с использованием таких систем, как фаговый дисплей, включающий синтетические CDR и/или синтетические каркасы, или могут быть подвергнуты мутагенезу in vitro для улучшения свойств антитела, что приведет к получению антител, в естественных условиях не входящих в репертуар человеческих антител зародышевой линии in vivo.
Термин рекомбинантное антитело в настоящем документе включает все антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные рекомбинантными средствами, например антитела, выделенные из животного (например, мыши), являющегося трансгенным или трансхромосомным по генам человеческого иммуноглобулина, или из полученной из него гибридомы (дополнительно описана ниже), антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител, и антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают сплайсинг генов человеческого иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК, или антитела, созданные in vitro с помощью обмена плеч Fab.
Термин моноклональное антитело в настоящем документе означает препарат молекул антитела одномолекулярной композиции. Композиция моноклонального антитела демонстрирует одну специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу или, в случае биспецифического моноклонального антитела, двойную специфичность связывания с двумя отдельными эпитопами.
Термин по существу идентичный в настоящем документе означает, что аминокислотные последовательности двух сравниваемых вариабельных участков антител идентичны или имеют несущественные отличия. Несущественные отличия представляют собой замены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в последовательности вариабельного участка антитела, не оказывающие отрицательного воздействия на свойства антитела. Аминокислотные последовательности, по существу идентичные последовательностям вариабельных участков, описанных в настоящем документе, находятся в рамках объема настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей может составлять приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или выше. Процентное значение идентичности можно определить, например, путем попарного выравнивания с использованием настроек по умолчанию для модуля AlignX в Vector NTI v. 9.0.0 (Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния, США). Белковые последовательности настоящего изобретения можно использовать в качестве искомой последовательности при выполнении поиска в общедоступных или патентованных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Примерами программ, используемых для выполнения таких поисков, являются программы XBLAST или BLASTP (http_//www_ncbi_nlm/nih_gov) или пакет GenomeQuest™ (GenomeQuest, г. Вестборо, штат Массачусетс, США) с использованием настроек по умолчанию.
Термин эпитоп в настоящем документе означает часть антигена, с которым специфически связывается антитело. Как правило, эпитопы состоят из химически активных (например, полярных, неполярных или гидрофобных) поверхностных группировок остатков, например, боковых цепей аминокислот или полисахаридов, и они могут иметь специфические особенности трехмерной структуры, а также специфические характеристики заряда. Эпитоп может быть образован из смежных и/или несмежных аминокислот, образующих конформационный пространственный блок. В случае несмежного эпитопа аминокислоты из разных частей линейной последовательности антигена подходят близко друг к другу в трехмерном пространстве благодаря сворачиванию молекулы белка.
Термин в комбинации с в настоящем документе означает, что два или более терапевтических
- 10 039356 средства можно вводить субъекту в смеси, одновременно в качестве отдельных средств или последовательно в качестве отдельных средств в любом порядке.
Нумерация аминокислотных остатков в константном участке антитела в настоящем описании осуществляется в соответствии с каталогом ЕС, как описано в публикации Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), если явно не указано иное.
Композиции настоящего изобретения
В настоящем изобретении предложены биспецифические агенты, которые специфически связываются с EGFR и c-Met. В настоящем изобретении предложены полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие биспецифические агенты настоящего изобретения, или комплементарные к ним нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы их получения и применения.
Моноспецифические и биспецифические к EGFR и/или c-Met содержащие домен FN3 связывающие молекулы.
Моноспецифические к EGFR содержащие домен FN3 связывающие молекулы.
В настоящем изобретении предложены домены фибронектина типа III (FN3), которые специфически связываются с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокируют связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, и, следовательно, могут широко применяться в терапии и диагностике. В настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие домены FN3 настоящего изобретения, или комплементарные к ним нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы их получения и применения.
Домены FN3 настоящего изобретения связываются с EGFR с высокой аффинностью, ингибируют сигнализацию EGFR, могут оказать благоприятный эффект в плане специфичности и сниженной побочной токсичности по сравнению с низкомолекулярными ингибиторами EGFR и иметь улучшенное проникание в ткани по сравнению с традиционными терапевтическими средствами на основе антител.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный домен фибронектина типа III (FN3), который специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR.
Домены FN3 настоящего изобретения могут блокировать связывание EGF с EGFR со значением IC50 менее чем приблизительно 1х10’7 М, менее чем приблизительно 1х10’8 М, менее чем приблизительно 1x10’9 М, менее чем приблизительно 1х1010 М, менее чем приблизительно 1x10-11 М или менее чем приблизительно 1х10-12 М в конкурентном анализе с использованием клеток А431 и обнаружения величины флуоресценции от связанного биотинилированного EGF с использованием конъюгата стрептавидинфикоэритрин при 600 нм в клетках А431, инкубированных с доменами FN3 настоящего изобретения или без них. Примеры доменов FN3 могут блокировать связывание EGF с EGFR со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 1x10’9 до приблизительно 1х10’7 М, например домены FN3, связывающиеся с EGFR, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137. Домены FN3 настоящего изобретения могут блокировать связывание EGF с EGFR по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению со связыванием EGF с EGFR в отсутствие доменов FN3 настоящего изобретения при использовании одинаковых условий анализа.
Домены FN3 настоящего изобретения могут ингибировать сигнализацию EGFR по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем сигнализации в отсутствие доменов FN3 настоящего изобретения при использовании таких же условий анализа.
Связывание лиганда, например EGF с EGFR, стимулирует димеризацию рецепторов, аутофосфорилирование, активацию внутреннего рецептора, цитоплазматического тирозинкиназного домена и инициирование множества сигнальных путей трансдукции и трансактивации, вовлеченных в регуляцию синтеза ДНК (активацию генов) и прохождение клеточного цикла или деления. Ингибирование сигнализации EGFR может приводить к ингибированию одного или более расположенных ниже сигнальных путей EGFR, и, следовательно, нейтрализация EGFR может оказывать различные эффекты, включая ингибирование пролиферации и дифференцировки клеток, ангиогенез, подвижность клеток и метастазирование.
Сигнализацию EGFR можно измерять различными известными способами, например путем измерения аутофосфорилирования рецептора по любому из тирозиновых остатков Y1068, Y1148 и Y1173 (Downward et al., Nature, 311:483-5, 1984) и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Фосфорилирование можно обнаруживать хорошо известными способами, такими как анализ ИФА или вестерн-блоттинг, с использованием антитела, специфического к фосфотирозину. Примеры анализа можно найти в публикациях Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283:1433-44, 1997 и Batley et al., Life Sci. 62:143-50, 1998, а также в анализах, описанных в настоящем документе.
В одном варианте осуществления домен FN3 настоящего изобретения ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC50 менее чем приблизительно 2,5x10’6 М, например, менее чем приблизительно 1х10’6 М, менее чем приблизи- 11 039356 тельно 1х10-7 М, менее чем приблизительно 1х10-8 М, менее чем приблизительно 1х10-9 М, менее чем приблизительно 1х10-10 М, менее чем приблизительно 1х10-11 М или менее чем приблизительно
1х10-12 М при измерении в клетках А431 с использованием 50 нг/мл человеческого EGF.
В одном варианте осуществления домен FN3 настоящего изобретения ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC50 от приблизительно 1,8х 10-8 до приблизительно 2,5х10-6 М при измерении в клетках А431 с использованием 50 нг/мл человеческого EGF. Такие примеры доменов FN3 представляют собой домены с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137.
В одном варианте осуществления домен FN3 настоящего изобретения связывает человеческий EGFR с константой диссоциации (KD) менее чем приблизительно 1 х 10-8 М, например, менее чем приблизительно 1 х 10-9 М, менее чем приблизительно 1 х 10-10 М, менее чем приблизительно 1 х 10-11 М, менее чем приблизительно 1 х 10-12 М или менее чем приблизительно 1 х 10-13 М при определении методом поверхностного плазмонного резонанса или методом кинетического исключения (Kinexa), известным специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления домен FN3 настоящего изобретения связывается с человеческим EGFR с KD в диапазоне от приблизительно 2х10-10 до приблизительно 1 х 10-8 М. Аффинность домена FN3 к EGFR можно определить экспериментально с использованием любого подходящего способа (см., например, Berzofsky, et al., Antibody-Antigen Interactions, Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY (1992); и описанные в настоящем документе способы). Измеренная аффинность взаимодействия в конкретной паре домен FN3 - антиген может изменяться при измерении в разных условиях (например, осмолярность, рН). Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, KD, Kon, Koff) предпочтительно выполняют с использованием стандартизированных растворов белкового каркаса и антигена и стандартизированного буфера, такого как буфер, описанный в настоящем документе.
Примеры доменов FN3 настоящего изобретения, которые связываются с EGFR, включают домены FN3 с SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137.
В одном варианте осуществления домен FN3, который специфически связывается с EGFR, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 87% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27.
В одном варианте осуществления домен FN3, который специфически связывается с EGFR, содер жит:
петлю FG, содержащую последовательность HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) или последовательность LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), причем X9 представляет собой М или I; и петлю ВС, содержащую последовательность X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181);
причем X1 представляет собой А, Т, G или D;
Х2 представляет собой A, D, Y или W;
Х3 представляет собой Р, D или N;
Х4 представляет собой L или отсутствует;
Х5 представляет собой D, H, R, G, Y или W;
Х6 представляет собой G, D или А;
Х7 представляет собой A, F, G, Н или D;
X8 представляет собой Y, F или L.
Домены FN3 настоящего изобретения, которые специфически связываются с EGFR и ингибируют аутофосфорилирование EGFR, могут содержать в качестве структурного элемента петлю FG, которая содержит последовательность HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) или последовательность LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), причем X9 представляет собой М или I. Такие домены FN3 могут дополнительно содержать петлю ВС длиной 8 или 9 аминокислот, которая описана последовательностью X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181), и могут ингибировать аутофосфорилирование EGFR со значением IC50 менее чем приблизительно 2,5х10-6 М или со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 1,8х 10-8 до приблизительно 2,5х10-6 М при измерении в клетках А431 с использованием 50 нг/мл человеческого EGF.
Домены FN3 настоящего изобретения, которые специфически связываются с EGFR и ингибируют аутофосфорилирование EGFR, дополнительно содержат последовательность
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182) или последовательность
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWXiX2X3X4X5X&X7XsDSFLIQYQESEKVGEAINLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), причем X1 представляет собой А, Т, G или D;
X2 представляет собой A, D, Y или W;
- 12 039356
Х3 представляет собой Р, D или N;
X представляет собой L или отсутствует;
Х5 представляет собой D, Н, R, G, Y или W;
Х6 представляет собой G, D или А;
Х7 представляет собой A, F, G, Н или D;
Х8 представляет собой Y, F или L;
Х9 представляет собой М или I.
Домены FN3, связывающиеся с EGFR, можно создать и протестировать на их способность ингибировать аутофосфорилирование EGFR с использованием известных способов и способов, описанных в настоящем документе.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с EGFR, причем домен FN3 содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137.
В некоторых вариантах осуществления домены FN3, связывающиеся с EGFR, содержат инициаторметионин (Met), связанный с N-концом, или цистеин (Cys), связанный с С-концом конкретного домена FN3, например, для облегчения экспрессии и/или конъюгации с молекулами, продлевающими период полужизни.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный домен фибронектина типа III (FN3), который специфически связывается с EGFR и блокирует связывание EGF с EGFR, причем домен FN3 выделен из библиотеки, разработанной на основе последовательности Tencon SEQ ID NO: 1.
Моноспецифические к c-Met содержащие домен FN3 связывающие молекулы.
В настоящем изобретении предложены домены фибронектина типа III (FN3), которые специфически связываются с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met), блокируют связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met и, следовательно, могут широко применяться в терапии и диагностике. В настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие домены FN3 настоящего изобретения, или комплементарные к ним нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы их получения и применения.
Домены FN3 настоящего изобретения связываются с c-Met с высокой аффинностью, ингибируя сигнализацию c-Met, и могут оказать благоприятный эффект в отношении специфичности и сниженной побочной токсичности по сравнению с низкомолекулярными ингибиторами c-Met и иметь улучшенное проникновение в ткань по сравнению с традиционными терапевтическими средствами на основе антител. Домены FN3 настоящего изобретения являются одновалентными, и, следовательно, предотвращается нежелательная кластеризация и активация рецептора, которая возможна при использовании других двухвалентных молекул.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный домен фибронектина типа III (FN3), который специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (с-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met.
Домены FN3 настоящего изобретения могут блокировать связывание HGF с c-Met со значением IC50 менее чем приблизительно 1x10’7 М, менее чем приблизительно 1х10’8 М, менее чем приблизительно 1х10’9 М, менее чем приблизительно 1x10’10 М, менее чем приблизительно 1x10’11 М или менее чем приблизительно 1x10’12 М в анализе на обнаружение ингибирования связывания биотинилированного HGF со слитным белком c-Met-Fc в присутствии доменов FN3 настоящего изобретения. Примеры доменов FN3 могут блокировать связывание HGF с c-Met со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 2x10’10 до приблизительно 6x10’8 М. Домены FN3 настоящего изобретения могут блокировать связывание HGF с c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению со связыванием HGF с c-Met в отсутствие доменов FN3 настоящего изобретения при использовании таких же условий анализа.
Домен FN3 настоящего изобретения, описанный в настоящем документе, может ингибировать сигнализацию c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем сигнализации в отсутствие доменов FN3 настоящего изобретения при использовании таких же условий анализа.
Связывание лиганда, например HGF с c-Met, стимулирует димеризацию рецептора, аутофосфорилирование, активацию внутреннего рецептора, цитоплазматического тирозинкиназного домена и инициирование множества сигнальных путей трансдукции и трансактивации, вовлеченных в регуляцию синтеза ДНК (активацию генов) и прохождение клеточного цикла или деления. Ингибирование сигнализации c-Met может приводить к ингибированию одного или более расположенных ниже сигнальных путей передачи c-Met, и, следовательно, нейтрализация c-Met может оказывать различные эффекты, включая ингибирование пролиферации и дифференцировки клеток, ангиогенез, подвижность клеток и метастазирование.
Сигнализацию c-Met можно измерять различными известными способами, например путем измере
- 13 039356 ния аутофосфорилирования рецептора по меньшей мере одного из тирозиновых остатков Y1230, Y1234, Y1235 или Y1349 и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Фосфорилирование можно обнаруживать, например, при помощи антитела, специфичного к фосфотирозину, с помощью анализа ИФА или вестерн-блоттинга. Анализы на тирозинкиназную активность описаны, например, в публикациях Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283:1433-44, 1997 и Batley et al., Life Sci. 62:143-50, 1998, а также в анализах, описанных в настоящем документе.
В одном варианте осуществления домен FN3 настоящего изобретения ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по остатку c-Met в положении 1349 со значением IC50 менее чем приблизительно 1x10’6 М, менее чем приблизительно 1х10’7 М, менее чем приблизительно 1x10’8 М, менее чем приблизительно 1x10’9 М, менее чем приблизительно 1x10’10 М, менее чем приблизительно 1x10-11 М или менее чем приблизительно 1x10’12 М при измерении в клетках NCI-H441 с использованием 100 нг/мл рекомбинантного человеческого HGF.
В одном варианте осуществления домен FN3 настоящего изобретения ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку c-Met в положении Y1349 со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 4x10’9 до приблизительно 1x10’6 М при измерении в клетках NCI-H441 с использованием 100 нг/мл рекомбинантного человеческого HGF.
В одном варианте осуществления домен FN3 настоящего изобретения связывает человеческий cMet с константой диссоциации (KD), которая равна или менее чем приблизительно 1x10’7 М, 1x10’8 М, 1x10’9 М, 1x10’10 М, 1 x10-11 М, 1x10’12 М, 1x10’13 М, 1x10’14 М или 1x10’15 М в соответствии с данными поверхностного плазмонного резонанса или метода Kinexa, известного специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления домен FN3 настоящего изобретения связывается с человеческим c-Met с KD в диапазоне от приблизительно 3x10’10 до приблизительно 5x10’8 М. Аффинность домена FN3 к c-Met можно определить экспериментально с использованием любого подходящего способа (см., например, Berzofsky, et al., Antibody-Antigen Interactions, Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY (1992); и описанные в настоящем документе способы). Измеренная аффинность взаимодействия в конкретной паре домен FN3 - антиген может изменяться при измерении в разных условиях (например, осмолярность, рН). Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, KD, Kon, Koff) предпочтительно выполняют с использованием стандартизированных растворов белкового каркаса и антигена и стандартизированного буфера, такого как буфер, описанный в настоящем документе.
Примеры доменов FN3 настоящего изобретения, которые связываются с c-Met, включают домены FN3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32-49 или 111-114.
В одном варианте осуществления домен FN3, который специфически связывается с c-Met, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 83% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41.
В одном варианте осуществления домен FN3, который специфически связывается с c-Met, содержит тяж С и петлю CD, содержащую последовательность DSFXi0IRYXnE X12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), причем Х10 представляет собой W, F или V;
Х11 представляет собой D, F или L;
X12 представляет собой V, F или L;
Х13 представляет собой V, L или Т;
Х14 представляет собой V, R, G, L, Т или S;
X15 представляет собой G, S, А, Т или K;
X16 представляет собой Е или D; и тяж F и петлю FG, содержащую последовательность TEYX17VX18IX19X20V KGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), причем X17 представляет собой Y, W, I, V, G или А;
X18 представляет собой N, T, Q или G;
X19 представляет собой L, М, N или I;
Х20 представляет собой G или S;
X21 представляет собой S, L, G, Y, T, R, Н или K;
Х22 представляет собой I, V или L;
Х23 представляет собой V, Т, Н, I, P, Y или L.
Домены FN3 настоящего изобретения, которые специфически связываются с c-Met и ингибируют аутофосфорилирование c-Met, дополнительно содержат последовательность
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFXioIRYXnE X12X13X14X15GX16
AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT (SEQ ID NO: 186), причем Х10 представляет собой W, F или V;
Х11 представляет собой D, F или L;
X12 представляет собой V, F или L;
- 14 039356
Х13 представляет собой V, L или Т;
Х14 представляет собой V, R, G, L, Т или S;
X15 представляет собой G, S, А, Т или K;
X16 представляет собой Е или D;
X17 представляет собой Y, W, I, V, G или А;
X18 представляет собой N, T, Q или G;
X19 представляет собой L, М, N или I;
Х20 представляет собой G или S;
X21 представляет собой S, L, G, Y, T, R, Н или K;
Х22 представляет собой I, V или L;
Х23 представляет собой V, Т, Н, I, P, Y или L.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с c-Met, причем домен FN3 содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 32-49 или 111-114.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный домен фибронектина типа III (FN3), который специфически связывается с c-Met и блокирует связывание HGF с c-Met, причем домен FN3 выделен из библиотеки, разработанной на основе последовательности Tencon SEQ ID NO: 1.
Выделение EGFR или доменов FN3 c-Met из библиотеки, основанной на последовательности Tencon.
Tencon (SEQ ID NO: 1) представляет собой не встречающийся в естественных условиях домен фибронектина типа III (FN3), разработанный на основе консенсусной последовательности пятнадцати доменов FN3 тенасцина-С человека (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; патентная публикация № 2010/0216708). Кристаллическая структура Tencon демонстрирует шесть открытых на поверхности петель, соединяющих семь бета-тяжей, характерных для доменов FN3, причем бета-тяжи обозначены как А, В, С, D, E, F и G, а петли обозначены как АВ, ВС, CD, DE, EF и FG (Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:8990-8992, 1992; патент США № 6673901). Данные петли или выбранные остатки в пределах каждой петли можно рандомизировать с конструированием библиотеки доменов фибронектина типа III (FN3), которые можно использовать для выбора новых молекул, связывающихся с EGFR или с-Met. В табл. 1 показаны положения и последовательности каждой петли и бетатяжа в Tencon (SEQ ID NO: 1).
Таким образом, библиотека, разработанная на основе последовательности Tencon, может иметь рандомизированную петлю FG или рандомизированные петли ВС и FG, например описанные ниже библиотеки TCL1 или TCL2. Петля ВС Tencon имеет длину 7 аминокислот, таким образом, в библиотеке на основе последовательности Tencon с диверсификацией по петле ВС можно рандомизировать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот. Петля FC Tencon имеет длину 7 аминокислот, таким образом, в библиотеке на основе последовательности Tencon с диверсификацией по петле FG можно рандомизировать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот. Дополнительного разнообразия в петлях библиотек Tencon можно достичь путем вставки и/или делеций остатков в петлях. Например, петли FG и/или ВС можно расширить на 1-22 аминокислоты или уменьшить на 1-3 аминокислоты. Петля FG Tencon имеет длину 7 аминокислот, тогда как соответствующая петля в тяжелых цепях антител находится в диапазоне от 4 до 28 остатков. Для обеспечения максимального разнообразия петлю FG можно диверсифицировать в последовательности, а также по длине для соответствия диапазону длины CDR3 антитела в 4-28 остатков. Например, петлю FG можно дополнительно диверсифицировать по длине, удлинив петлю на дополнительные 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот.
Библиотека, разработанная на основе последовательности Tencon, также может иметь альтернативные рандомизированные поверхности, образованные сбоку от домена FN3 и содержащие два или более бета-тяжа и по меньшей мере одну петлю. Одна такая альтернативная поверхность образована аминокислотами в бета-тяжах С и F и в петлях CD и FG (поверхность С-CD-F-FG). Разработка библиотеки, основанной на альтернативной поверхности C-CD-F-FG в Tencon, показана на фиг. 1, и подробное создание таких библиотек описано в патентной публикации США № US 2013/0226834.
Библиотеки, разработанные на основе последовательности Tencon, также включают библиотеки на основе вариантов Tencon, таких как варианты Tencon, имеющие замены в положениях остатков 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 86 (нумерация остатков соответствует SEQ ID NO: 1), и такие варианты демонстрируют повышенную термическую стабильность. Примеры вариантов Tencon описаны в патентной публикации США № 2011/0274623 и включают Tencon27 (SEQ ID NO: 99), имеющую замены E11R, L17A, N46V и E86I по сравнению с Tencon в SEQ ID NO: 1.
- 15 039356
Библиотеки на основе Tencon и другой FN3-последовательности можно рандомизировать по выбранным положениям остатков с использованием случайного или заданного набора аминокислот. Например, варианты библиотеки, имеющие случайные замены, можно создать с использованием кодонов NNK, которые кодируют все 20 аминокислот, встречающихся в естественных условиях. В других схемах диверсификации можно применять кодоны DVK для кодирования аминокислот Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly и Cys. Альтернативно, для получения всех 20 аминокислотных остатков и одновременного снижения частоты стоп-кодонов можно применять кодоны NNS. Библиотеки доменов FN3 со смещенным распределением аминокислот в диверсифицируемых положениях можно синтезировать, например, с использованием технологии Slonomics® (http:_//www_sloning_com). В данной технологии применяют библиотеку предварительно приготовленных двухцепочечных триплетов, которые выступают в качестве универсальных строительных блоков, достаточных для тысяч процессов синтеза генов. В библиотеке триплетов представлены все возможные комбинации последовательностей, необходимые для построения любой желаемой молекулы ДНК. Для обозначения кодонов используется хорошо известный код IUB.
Домены FN3 настоящего изобретения, специфически связывающиеся с EGFR или c-Met, можно выделить путем получения FN3-библиотеки, такой как библиотека Tencon, с использованием cis-дисплея для лигирования фрагментов ДНК, кодирующих каркасные белки, с фрагментом ДНК, кодирующим RepA, для создания пула комплексов белок-ДНК, образованных после трансляции in vitro, причем каждый белок стабильно связан с кодирующей его ДНК (патент США № 7842476; Odegrip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2806-2810, 2004), и анализа библиотеки на специфическое связывание с EGFR и/или c-Met любым способом, известным в данной области или описанным в примере. Примеры хорошо известных способов, которые можно применять, представляют собой ИФА, сэндвич-ИФА и конкурентный и неконкурентный анализы (см., например, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Дополнительно характеризуют идентифицированные домены FN3, специфически связывающиеся с EGFR или c-Met, по их способности блокировать связывание лиганда EGFR, например EGF, с EGFR, или связывание HGF с c-Met, а также по их способности ингибировать сигнализацию EGFR и/или c-Met с использованием способов, описанных в настоящем документе.
Домены FN3 настоящего изобретения, специфически связывающиеся с EGFR или c-Met, можно конструировать, используя любой домен FN3 в качестве матрицы для создания библиотеки и отбора в библиотеке молекул, специфически связывающихся с EGFR или c-Met, с использованием предложенных в ней способов. Примеры подходящих для использования доменов FN3 включают 3-й домен FN3 тенасцина С (TN3) (SEQ ID NO: 75), Fibcon (SEQ ID NO: 76) и 10-й домен FN3 фибронектина (FN10) (SEQ ID NO: 77). Применяют стандартные методики клонирования и экспрессии для клонирования библиотек в вектор или синтеза кассет библиотеки с двухцепочечной кДНК, чтобы экспрессировать библиотеки или транслировать их in vitro. Например, можно использовать рибосомный дисплей (Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942, 1997), мРНК-дисплей (Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302, 1997) или другие бесклеточные системы (патент США № 5643768). Библиотеки вариантов домена FN3 можно экспрессировать как слитные белки, отображающиеся на поверхности, например, любого подходящего бактериофага. Хорошо известны способы отображения слитных полипептидов на поверхности бактериофага (патентная публикация США № 2011/0118144; международная патентная публикация № WO 2009/085462; патенты США № 6969108; 6172197; 5223409; 6582915; 6472147).
Домены FN3 настоящего изобретения, специфически связывающиеся с EGFR или c-Met, можно модифицировать для улучшения их свойств, например, улучшения термической стабильности и обратимости термического свертывания и развертывания. Для повышения очевидной термической стабильности
- 16 039356 белков и ферментов использовали несколько способов, включая рациональную конфигурацию, основанную на сравнении с термически стабильными последовательностями с высокой степенью сходства, конфигурацию стабилизирующих дисульфидных мостиков, мутации для повышения склонности к образованию альфа-спирали, конструирование солевых мостиков, изменение поверхностного заряда белка, направленную эволюцию и композицию консенсусных последовательностей (Lehmann and Wyss, Curr. Opin. Biotechnol., 12,371-375,2001). Высокая термостабильность может повышать выход экспрессируемого белка, растворимость или активность, снижать иммуногенность и минимизировать необходимость в холодной линии для производства. Остатки, в которые можно ввести замены для повышения термической стабильности Tencon (SEQ ID NO: 1), представляют собой положения остатков 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 86, как описано в патентной публикации США № 2011/0274623. Замены, соответствующие данным остаткам, можно ввести в домены FN3 или в биспецифические молекулы настоящего изобретения, содержащие домены FN3.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с EGFR и блокирует связывание EGF с EGFR, который содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122-137, которая дополнительно содержит замены в одном или более положениях остатков, соответствующих положениям 11, 14, 17, 37, 46, 73 и 86 в Tencon (SEQ ID NO: 1).
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с c-Met и блокирует связывание HGF с c-Met, содержащий последовательность, показанную в SEQ ID NO: 32-49, 111-114, которая дополнительно содержит замены в одном или более положениях остатков, соответствующих положениям 11, 14, 17, 37, 46, 73 и 86 в Tencon (SEQ ID NO: 1).
Примеры замен представляют собой замены E11N, Е14Р, L17A, Е37Р, N46V, G73Y и E86I (нумерация соответствует SEQ ID NO: 1).
В некоторых вариантах осуществления домены FN3 настоящего изобретения содержат замены, соответствующие заменам L17A, N46V и E86I в Tencon (SEQ ID NO: 1).
Домены FN3, специфически связывающиеся с EGFR (фиг. 1), имеют удлиненную петлю FG по сравнению с Tencon (SEQ ID NO: 1). Следовательно, остатки, соответствующие остаткам 11, 14, 17, 37, 46, 73 и 86 в Tencon (SEQ ID NO: 1), представляют собой остатки 11, 14, 17, 37, 46, 73 и 91 в доменах FN3 EGFR, показанных на фиг. 1А и 1В, кроме домена FN3 с SEQ ID NO: 24, в которой соответствующие остатки представляют собой остатки 11, 14, 17, 38, 74 и 92 вследствие вставки одной аминокислоты в петлю ВС.
Другой вариант настоящего изобретения представляет собой выделенный домен FN3, который специфически связывается с EGFR и блокирует связывание EGF с EGFR, который содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18-29,107-110 или 122-137, необязательно имеющую замены, соответствующие заменам L17A, N46V и E86I в Tencon (SEQ ID NO: 1).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен выделенный домен FN3, который специфически связывается с c-Met и блокирует связывание HGF с c-Met, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 32-49 или 111-114, которая необязательно имеет замены, соответствующие заменам L17A, N46V и E86I в Tencon (SEQ ID NO: 1).
Измерение стабильности белка и лабильности белка можно рассматривать как один или разные аспекты целостности белка. Белки чувствительны или лабильны к денатурации, вызванной нагревом, ультрафиолетовым или ионизирующим излучением, изменениями осмолярности окружающей среды и рН при нахождении в жидком растворе, механическим сдвиговым усилием, вызванным фильтрованием через поры малого размера, ультрафиолетовым излучением, ионизирующим излучением, таким как гамма-облучение, химической или термической дегидратацией или любым другим воздействием или усилием, которые могут привести к разрушению структуры белка. Стабильность молекулы можно определить с использованием стандартных способов. Например, стабильность молекулы можно определить путем измерения температуры термического плавления (ТМ) - температуры в градусах Цельсия (°С), при которой половина молекул разворачиваются, с использованием стандартных способов. Как правило, чем выше ТМ, тем более стабильной является молекула. Способность белка сохранять конкретную трехмерную структуру можно изменять, кроме нагревания, путем изменения химической среды.
В одном варианте осуществления домены FN3 настоящего изобретения, которые связываются с EGFR или c-Met, демонстрируют стабильность, повышенную по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% или более по сравнению с таким же доменом до конструирования, что измеряется по повышению ТМ.
Химическую денатурацию аналогичным образом можно измерить различными способами. Химические денатурирующие вещества включают гидрохлорид гуанидиния, тиоцианат гуанидиния, мочевину, ацетон, органические растворители (ДМФ, бензол, ацетонитрил), соли (сульфат аммония, бромид лития, хлорид лития, бромид натрия, хлорид кальция, хлорид натрия); восстанавливающие агенты (например, дитиотреитол, бета-меркаптоэтанол, динитротиобензол, а также гидриды, такие как борогидрид натрия), неионные и ионные моющие средства, кислоты (например, соляную кислоту (HCl), уксусную кислоту
- 17 039356 (СН3СООН), галогензамещенные уксусные кислоты), гидрофобные молекулы (например, фосфолипиды) и направленные денатурирующие вещества. Количественное определение степени денатурации может быть основано на потере функционального свойства, такого как способность связываться с молекулоймишенью, или на физико-химических свойствах, таких как склонность к агрегации, открытие доступа к ранее недоступным растворителю остаткам, или на разрушении или образовании дисульфидных связей.
В одном варианте осуществления домен FN3 настоящего изобретения, связывающийся с EGFR или c-Met, демонстрирует стабильность, повышенную по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% или более по сравнению с таким же каркасом до конструирования, что измеряется путем применения гидрохлорида гуанидиния в качестве химического денатурирующего вещества. Повышение стабильности можно измерять в зависимости от снижения флуоресценции триптофана при обработке повышающимися концентрациями гидрохлорида гуанидиния с использованием хорошо известных способов.
Домены FN3 настоящего изобретения можно создать в виде мономеров, димеров или мультимеров, например, как средство повышения валентности и, таким образом, авидности к связыванию молекулымишени или для создания би- или мультиспецифических каркасов, одновременно связывающих две или более разные молекулы-мишени. Димеры и мультимеры можно создать путем связывания моноспецифических, би- или мультиспецифических белковых каркасов, например, путем включения аминокислотного линкера, например, линкера, содержащего полиглицин, глицин и серин или аланин и пролин. Примеры линкеров включают (GS)2, (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)5 (SEQ ID NO: 81), (АР)10 (SEQ ID NO: 82), (AP)20 (SEQ ID NO: 83) и A(EAAAK)5AAA (SEQ ID NO: 84) линкеры. Димеры и мультимеры могут соединяться друг с другом в направлении от N-конца к С-концу. Применение встречающихся в естественных условиях, а также искусственных пептидных линкеров для соединения полипептидов в новые связанные слитные полипептиды известно в литературе (Hallewell et al., J. Biol. Chem. 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry, 35, 109-116, 1996; патент США № 5856456).
Биспецифические агенты, специфически связывающиеся с EGFR и c-Met.
Биспецифические агенты настоящего изобретения, которые специфически связываются с EGFR и c-Met, могут обеспечить преимущество в отношении специфичности и сниженной побочной токсичности по сравнению с низкомолекулярными ингибиторами EGFR и/или c-Met. Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на неожиданном обнаружении того, что биспецифические агенты, специфически связывающиеся с EGFR и c-Met, обеспечивают значительно повышенный синергический ингибиторный эффект по сравнению со смесью моноспецифических агентов, связывающихся с EGFR и c-Met. Молекулы можно настроить на конкретную аффинность в отношении как EGFR, так и c-Met для максимального повышения проникновения в опухоль и удержания в ней. Биспецифические агенты, специфически связывающиеся с EGFR и c-Met, обеспечивают более эффективное ингибирование сигнальных путей EGFR и/или c-Met и более эффективное ингибирование роста опухоли, чем цетуксимаб (Erbitux®).
Биспецифические агенты, специфически связывающиеся с EGFR и c-Met, могут быть образованы любым полипептидом или мультимерным полипептидом, который содержит домен, связывающийся с EGFR, и домен, связывающийся с c-Met. Домены, связывающиеся с EGFR и с-Met, могут представлять собой антигенсвязывающие сайты антитела, пару VH/VL антитела или другой тип связывающейся молекулы, например, домен, основанный на домене фибронектина типа III (FN3), домене фибронектина типа IX (FN9) или любой их комбинации.
Полипептиды, связывающиеся с EGFR и c-Met, могут быть получены из существующих моноспецифических полипептидов, связывающихся с EGFR и c-Met, или их можно выделить de novo.
Содержащие домен FN3 биспецифические к EGFR/c-Met молекулы.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенную биспецифическую молекулу, содержащую домен FN3, которая содержит первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, причем первый домен FN3 специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащие домен FN3, можно создать путем ковалентного связывания любого домена FN3, связывающегося с EGFR, и любого домена FN3 настоящего изобретения, связывающегося с c-Met, напрямую или посредством линкера. Следовательно, первый домен FN3 биспецифической молекулы может иметь характеристики, описанные выше применительно к доменам FN3, связывающимся с EGFR, а второй домен FN3 биспецифической молекулы может иметь характеристики, описанные выше применительно к доменам FN3, связывающимся с c-Met.
В одном варианте осуществления первый домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому
- 18 039356 остатку EGFR в положении 1173 со значением IC50 менее чем приблизительно 2,5х10-6 М при измерении в клетках А431 с использованием 50 нг/мл человеческого EGF, а второй домен FN3 биспецифической к
EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование cMet по тирозиновому остатку c-Met в положении 1349 со значением IC50 менее чем приблизительно
1,5х10-6 М при измерении в клетках NCI-H441 с использованием 100 нг/мл человеческого HGF.
В другом варианте осуществления первый домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 1,8x10-8 до приблизительно 2,5х10-6 М при измерении в клетках А431 с использованием 50 нг/мл человеческого EGF, а второй домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку c-Met в положении 1349 со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 4х10-9 до приблизительно 1,5х10-6 М при измерении в клетках NCI-H441 с использованием 100 нг/мл человеческого HGF.
В другом варианте осуществления первый домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, связывается с человеческим EGFR с константой диссоциации (KD) менее чем приблизительно 1х10-8 М, а второй домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, связывается с человеческим c-Met с KD менее чем приблизительно 5х10-8 М.
В биспецифической молекуле, связывающейся как с EGFR, так и с c-Met, первый домен FN3 связывается с человеческим EGFR с KD в диапазоне от приблизительно 2х10-10 до приблизительно 1х10-8 М, а второй домен FN3 связывается с человеческим c-Met с KD в диапазоне от приблизительно 3х10-10 до приблизительно 5х10-8 М.
Аффинность биспецифической к EGFR/c-Met молекулы по отношению к EGFR и c-Met можно определить так, как описано выше для моноспецифических молекул.
Первый домен FN3 в биспецифической к EGFR/c-Met молекуле настоящего изобретения может блокировать связывание EGF с EGFR со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 1х10-9 до приблизительно 1,5х10-7 М в анализе с использованием клеток А431 и с детекцией величины флуоресценции от связанного биотинилированного EGF с использованием конъюгата стрептавидин-фикоэритрин при длине волны 600 нм в клетках А431, инкубированных с первым доменом FN3 или без него. Первый домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения может блокировать связывание EGF с EGFR по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% по сравнению со связыванием EGF с EGFR в отсутствие первых доменов FN3 при использовании одинаковых условий анализа.
Второй домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения может блокировать связывание HGF с c-Met со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 2х10-10 до приблизительно 6х10-8 М в анализе на детекцию ингибирования связывания биотинилированного HGF со слитным белком c-Met-Fc в присутствии второго домена FN3. Второй домен FN3 биспецифической к EGFR/c-Met молекулы может блокировать связывание HGF с c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению со связыванием HGF с c-Met в отсутствие второго домена FN3 при использовании одинаковых условий анализа.
Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула настоящего изобретения может ингибировать сигнализацию EGFR и/или c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем сигнализации в отсутствие биспецифической к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения при использовании одинаковых условий анализа.
Сигнализацию EGFR и c-Met можно измерить с использованием различных хорошо известных способов, описанных выше применительно к моноспецифическим молекулам.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащие первый домен FN3, специфически связывающийся с EGFR, и второй домен FN3, специфически связывающийся с c-Met, обеспечивают значительно более высокое синергичное ингибирование сигнализации EGFR и c-Met и пролиферации опухолевых клеток по сравнению с синергичным ингибированием, наблюдаемым в случае смеси первого и второго домена FN3. Синергичное ингибирование можно анализировать, например, путем измерения ингибирования фосфорилирования ERK посредством биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, и посредством смеси двух моноспецифических молекул, одна из которых связывается с EGFR, а другая - с c-Met. Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения могут ингибировать фосфорилирование ERK со значением IC50, которое по меньшей мере приблизительно в 100 раз меньше, например, по меньшей мере в 500, 1000, 5000 или 10000 раз меньше по сравнению со значением IC50 для смеси двух моноспецифических доменов FN3, что указывает на по меньшей мере 100-кратно более высокую эффективность биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, по сравнению со смесью двух моноспецифических доменов FN3. Примеры биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, могут ингибировать фосфорилирование ERK со значением IC50 приблизительно 5х10-9 М или менее. Фосфорилирование ERK можно измерять с использованием стандартных способов и способов, описанных в настоящем до- 19 039356 кументе.
Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула настоящего изобретения, содержащая домен FN3, может ингибировать пролиферацию клеток NCI-H292 со значением IC50, которое по меньшей мере в 30 раз меньше по сравнению со значением IC50 ингибирования роста клеток NCI-H292 смесью первого домена FN3 и второго домена FN3, причем пролиферация клеток индуцируется средой, содержащей 10% FBS с добавлением 7,5 нг/мл HGF. Биспецифическая молекула настоящего изобретения может ингибировать пролиферацию опухолевых клеток со значением IC50, которое приблизительно в 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или приблизительно 1000 раз меньше по сравнению со значением IC50 ингибирования пролиферации опухолевых клеток смесью первого домена FN3 и второго домена FN3. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток можно измерить с использованием стандартных способов и способов, описанных в настоящем документе.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой биспецифическую молекулу, содержащую домен FN3, которая содержит первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, причем первый домен FN3 специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met, причем первый домен FN3 содержит:
петлю FG, содержащую последовательность HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) или последовательность LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), причем X9 представляет собой М или I; и петлю ВС, содержащую последовательность X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181), причем X1 представляет собой А, Т, G или D;
Х2 представляет собой A, D, Y или W;
Х3 представляет собой Р, D или N;
Х4 представляет собой L или отсутствует;
Х5 представляет собой D, Н, R, G, Y или W;
Х6 представляет собой G, D или А;
Х7 представляет собой A, F, G, Н или D;
X8 представляет собой Y, F или L; и второй домен FN3 содержит:
тяж С и петлю CD, содержащую последовательность DSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), причем Х10 представляет собой W, F или V;
Х11 представляет собой D, F или L;
X12 представляет собой V, F или L;
Х13 представляет собой V, L или Т;
Х14 представляет собой V, R, G, L, Т или S;
X15 представляет собой G, S, А, Т или K;
X16 представляет собой Е или D; и тяж F и петлю FG, содержащую последовательность TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), причем X17 представляет собой Y, W, I, V, G или А;
X18 представляет собой N, T, Q или G;
X19 представляет собой L, М, N или I;
Х20 представляет собой G или S;
Х21 представляет собой S, L, G, Y, T, R, Н или K;
Х22 представляет собой I, V или L; и
Х23 представляет собой V, Т, Н, I, P, Y или L.
В другом варианте осуществления биспецифическая молекула содержит первый домен FN3, связывающийся с EGFR, который содержит последовательность:
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182) или последовательность
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX^XsXiXsXoXvXsDSFLIQYQESEKVGEAINLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), причем в SEQ ID NO: 182 и 183:
X1 представляет собой А, Т, G или D;
Х2 представляет собой A, D, Y или W;
Х3 представляет собой Р, D или N;
- 20 039356
Х4 представляет собой L или отсутствует;
Х5 представляет собой D, Н, R, G, Y или W;
Х6 представляет собой G, D или А;
Х7 представляет собой A, F, G, Н или D;
Х8 представляет собой Y, F или L;
Х9 представляет собой М или I.
В другом варианте осуществления биспецифическая молекула содержит домен FN3, связывающийся с c-Met, который содержит последовательность
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFXioIRYXnE X12X13X14X15GX16
AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG ТЕУХпУХ^ЕХзэХгоУКООХгАггЗХгз PLSAEFTT (SEQ ID
NO: 186), причем Х10 представляет собой W, F или V;
Х11 представляет собой D, F или L;
X12 представляет собой V, F или L;
Х13 представляет собой V, L или Т;
Х14 представляет собой V, R, G, L, Т или S;
X15 представляет собой G, S, А, Т или K;
X16 представляет собой Е или D;
Х17 представляет собой Y, W, I, V, G или А;
X18 представляет собой N, T, Q или G;
X19 представляет собой L, М, N или I;
Х20 представляет собой G или S;
Х21 представляет собой S, L, G, Y, T, R, Н или K;
Х22 представляет собой I, V или L;
Х23 представляет собой V, Т, Н, I, P, Y,T или L.
Примеры биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домены FN3, содержат аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121 или 138-167.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения имеют некоторые структурные характеристики, связанные с их функциональными характеристиками, такими как ингибирование аутофосфорилирования EGFR, например, петля FG первого домена FN3, связывающаяся с EGFR, которая содержит последовательность HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) или последовательность LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), причем X9 представляет собой М или I.
В одном варианте осуществления биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащие домен FN3:
ингибируют индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC50 менее чем приблизительно 8х10’7 М при измерении в клетках Н292 с использованием 50 нг/мл человеческого EGF;
ингибируют индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку с-Met в положении 1349 со значением IC50 менее чем приблизительно 8,4x10’7 М при измерении в клетках NCI-H441 с использованием 100 нг/мл человеческого HGF;
ингибируют индуцированную HGF пролиферацию клеток NCI-H292 со значением IC50 менее чем приблизительно 9,5x10’6 М, причем пролиферацию клеток индуцируют 10% FBS с содержанием 7,5 нг HGF;
связываются с EGFR с KD менее чем приблизительно 2,0x10’8 М или связываются с c-Met с KD менее чем приблизительно 2,0x10’8 М.
В другом варианте осуществления биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащие домен FN3:
ингибируют индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 4,2x10’9 до 8x10’7 М при измерении в клетках Н292 с использованием 50 нг/мл человеческого EGF;
ингибируют индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку с-Met в положении 1349 со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 2,4x10’8 до 8,4x10’7 М при измерении в клетках NCI-H441 с использованием 100 нг/мл человеческого HGF;
ингибируют индуцированную HGF пролиферацию клеток NCI-H292 со значением IC50 в диапазоне от приблизительно 2,3x10’8 до 9,5x10’6 М, причем пролиферацию клеток индуцируют 10% FBS с содержанием 7,5 нг HGF;
связываются с EGFR с KD от приблизительно 2x10’10 до приблизительно 2,0x10’8 М или связываются с c-Met с KD от приблизительно 1x10’9 до приблизительно 2,0x10’8 М.
В одном варианте осуществления биспецифические к EGFR/c-Met молекулы содержат домен FN3, связывающийся с EGFR, содержащий последовательность
- 21 039356
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV HNVYKDTNX9RGL PLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), причем X1 представляет собой D;
Х2 представляет собой D;
Х3 представляет собой Р;
Х4 отсутствует;
Х5 представляет собой Н или W;
Х6 представляет собой А;
Х7 представляет собой F;
X8 представляет собой Y;
Х9 представляет собой М или I; и домен FN3, связывающийся с c-Met, с последовательностью
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFXioIRYXnE X12X13X14X15GX16
AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23 PLSAEFTT (SEQ ID NO: 186), причем Х10 представляет собой W;
Х11 представляет собой F;
X12 представляет собой F;
Х13 представляет собой V или L;
Х14 представляет собой G или S;
X15 представляет собой S или K;
X16 представляет собой Е или D;
Х17 представляет собой V;
X18 представляет собой N;
X19 представляет собой L или М;
Х20 представляет собой G или S;
Х21 представляет собой S или K;
Х22 представляет собой I;
Х23 представляет собой Р.
Примеры биспецифических к EGFR/c-Met молекул представляют собой молекулы, имеющие последовательность, показанную в SEQ ID NO: 57, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 и 68.
Биспецифические молекулы настоящего изобретения могут дополнительно содержать замены в одном или более положениях остатков в первом домене FN3 и/или втором домене FN3, соответствующих положениям 11, 14, 17,37,46,73 и 86 в Tencon (SEQ ID NO: 1), как описано выше, и замену в положении 29. Примеры замен представляют собой замены E11N, Е14Р, L17A, Е37Р, N46V, G73Y, E86I и D29E (нумерация соответствует SEQ ID NO: 1). Специалисту в данной области будет понятно, что в качестве замен можно использовать другие аминокислоты, например, аминокислоты из семейства аминокислот, имеющих родственные боковые цепи, как описано ниже. Созданные варианты можно протестировать на их стабильность и связывание с EGFR и/или c-Met с использованием способов, описанных в настоящем документе.
В одном варианте осуществления биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3, содержит первый домен FN3, специфически связывающийся с EGFR, и второй домен FN3, специфически связывающийся с c-Met, причем первый домен FN3 содержит последовательность
LPAPKNLWSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX30LTVPGSERSYDL
TGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT (SEQ ID NO: 187), причем Х24 представляет собой Е, N или R;
Х25 представляет собой Е или Р;
Х26 представляет собой L или А;
Х27 представляет собой Н или W;
Х28 представляет собой Е или D;
Х29 представляет собой Е или Р;
Х30 представляет собой N или V;
Х31 представляет собой G или Y;
Х32 представляет собой М или I;
Х33 представляет собой Е или I; и второй домен FN3 содержит последовательность
LPAPKNLVVSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X4oGX4iAIX42LTVPGSERSY
DLTGLKPGTEYVVNIX43X44VKGGX45ISPPLSAX46FTT (SEQ ID NO: 188);
причем Х34 представляет собой Е, N или R;
Х35 представляет собой Е или Р;
- 22 039356
Х36 представляет собой L или А;
Х37 представляет собой Е или Р;
Х38 представляет собой V или L;
Х39 представляет собой G или S;
Х40 представляет собой S или K;
Х41 представляет собой Е или D;
Х42 представляет собой N или V;
Х43 представляет собой L или М;
Х44 представляет собой G или S;
Х45 представляет собой S или K;
Х46 представляет собой Е или I.
В других вариантах осуществления биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3, содержит первый домен FN3, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, и второй домен FN3, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащие домен FN3, могут быть созданы с учетом конкретной аффинности в отношении EGFR и c-Met для максимального увеличения накопления в опухоли.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенную биспецифическую молекулу, содержащую домен FN3, которая содержит первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, причем первый домен FN3 специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met, причем первый домен FN3 и второй домен FN3 выделены из библиотеки, разработанной на основе последовательности Tencon SEQ ID NO: 1.
Биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу настоящего изобретения, содержащую домен FN3, можно создать путем ковалентного соединения домена FN3, связывающегося с EGFR, и домена FN3 настоящего изобретения, связывающегося с c-Met, с использованием известных способов. Домены FN3 можно соединить посредством линкера, например линкера, содержащего полиглицин, глицин и серин или аланин и пролин. Примеры линкеров включают (GS)2, (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)5 (SEQ ID NO: 81), (АР)ю (SEQ ID NO: 82), (AP)20 (SEQ ID NO: 83), A(EAAAK)5AAA (SEQ ID NO: 84) линкеры. Применение встречающихся в естественных условиях, а также искусственных пептидных линкеров для соединения полипептидов в новые связанные слитные полипептиды известно в литературе (Hallewell et al., J. Biol. Chem. 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8,725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry, 35, 109-116, 1996; патент США № 5856456). Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения можно соединить вместе С-концом первого домена FN3 к N-концу второго домена FN3 или С-концом второго домена FN3 к N-концу первого домена FN3. Любой домен FN3, связывающийся с EGFR, можно ковалентно соединять с доменом FN3, связывающимся с c-Met. Примеры доменов FN3, связывающихся с EGFR, представляют собой домены, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137, а примеры доменов FN3, связывающихся с c-Met, представляют собой домены, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 32-49 и 111-114. Домены FN3, связывающиеся с EGFR, которые нужно соединить с биспецифической молекулой, могут дополнительно содержать инициатор-метионин (Met) на своих N-концах.
Варианты биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, находятся в рамках объема настоящего изобретения. Например, в биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу, содержащую домен FN3, можно вводить замены, если полученный вариант будет сохранять аналогичную селективность и эффективность в отношении EGFR и c-Met по сравнению с исходной молекулой. Примеры модификаций представляют собой, например, консервативные замены, которые приводят к получению вариантов с характеристиками, которые аналогичны характеристикам исходной молекулы. Консервативными являются замены, проводимые внутри семейства аминокислот с родственной структурой их боковых цепей. Генетически кодируемые аминокислоты можно разделить на четыре семейства: (1) кислотные (аспартат, глутамат); (2) основные (лизин, аргинин, гистидин); (3) неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и (4) незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин). Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда объединяют в одну группу ароматических аминокислот. Альтернативно набор аминокислот можно разделить на следующие группы: (1) кислые (аспартат, глутамат); (2) основные (лизин, аргинин, гистидин); (3) алифатические (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин), причем серин и треонин можно необязательно объединить в отдельную группу алифатических гидроксильных аминокислот; (4) ароматические (фенилаланин, тирозин, триптофан); (5) амидные (аспарагин, глутамин) и (6) серосодержащие
- 23 039356 (цистеин и метионин) (Stryer (ed.), Biochemistry, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981). Возможно введение в биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу, содержащую домен FN3, неконсервативных замен, которые включают замены аминокислотных остатков на другие классы аминокислот для улучшения свойств биспецифических молекул. Чтобы быстро определить возможность получения функционального гомолога в результате изменения аминокислотной последовательности полипептида или его фрагмента можно проанализировать способность модифицированного полипептида или фрагмента вызывать отклик аналогично немодифицированному полипептиду или фрагменту с использованием анализов, описанных в настоящем документе. Пептиды, полипептиды или белки с более чем одной заменой также можно легко протестировать аналогичным образом.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащие домен FN3, можно создавать, например, в форме димеров или мультимеров в качестве средства повышения валентности и, таким образом, авидности связывания с молекулой-мишенью. Мультимеры можно создавать путем соединения одного или более доменов FN3, связывающихся с EGFR, и одного или более доменов FN3, связывающихся с c-Met, с образованием молекул, содержащих по меньшей мере три отдельных домена FN3, которые являются по меньшей мере биспецифичными либо к EGFR, либо к c-Met, например, путем включения аминокислотного линкера с использованием известных способов.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой биспецифическую молекулу, содержащую домен FN3, которая содержит первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, причем первый домен FN3 специфически связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и блокирует связывание эпидермального фактора роста (EGF) с EGFR, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met, причем молекула содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 50-72, 106 или 138-165.
Фрагменты, продлевающие период полужизни.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домен FN3, или моноспецифические домены FN3 настоящего изобретения, связывающиеся с EGFR или c-Met, могут включать другие субъединицы, например, посредством ковалентного взаимодействия. В одном аспекте настоящего изобретения биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащие домен FN3, дополнительно содержат фрагмент, продлевающий период полужизни. Примеры фрагментов, продлевающих период полужизни, представляют собой альбумин, варианты альбумина, альбумин-связывающие белки и/или домены, трансферрин и их фрагменты и аналоги, а также Fc-участки. Пример альбуминсвязывающего домена показан в SEQ ID NO: 117.
К молекулам настоящего изобретения можно присоединить весь константный участок антитела или его часть для придания им антителоподобных свойств, особенно тех свойств, которые связаны с Fc-участком, таких как эффекторные функции Fc, такие как связывание с Clq, комплементзависимая цитотоксичность (CDC), связывание с Fc-рецептором, антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, подавление ингибирования рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR), и их можно дополнительно модифицировать путем модификации остатков, которые в Fc отвечают за данные функции (см. обзор в публикации Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685-691, 2009).
В биспецифические молекулы настоящего изобретения можно встроить дополнительные фрагменты, такие как молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ), такие как ПЭГ-5000 или ПЭГ-20000, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот с разной длиной цепи, например лаурат, миристат, стеарат, арахидат, бегенат, олеат, арахидонат, октандиовую кислоту, тетрадекандиовую кислоту, октадекандиовую кислоту, докозандиовую кислоту и т.п., полилизин, октан, углеводы (декстран, целлюлозу, олиго- или полисахариды) для получения необходимых свойств. Данные фрагменты могут представлять собой результаты прямого слияния с кодирующими белковый каркас последовательностями, и их можно создавать с помощью стандартных методик клонирования и экспрессии. Альтернативно, для прикрепления фрагментов в формируемые рекомбинантным способом молекулы настоящего изобретения можно применять хорошо известные способы химического связывания.
К биспецифическим или моноспецифическим молекулам настоящего изобретения можно добавить, например, легальный фрагмент путем добавления цистеинового остатка к С-концу молекулы и присоединения пегильной группы к цистеину с помощью хорошо известных способов. Примеры биспецифических молекул с С-концевым цистеином представляют собой молекулы с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ IN NO:170-178.
Моноспецифические и биспецифические молекулы настоящего изобретения, которые включают дополнительные фрагменты, можно сравнить по функциональности с помощью нескольких известных анализов. Например, изменение свойств моноспецифических и/или биспецифических молекул вследствие включения доменов Fc и/или вариантов домена Fc можно проанализировать в анализах связывания с рецепторами Fc с использованием растворимых форм рецепторов, таких как рецепторы FcyRI, FcyRII, FcyRIII или FcRn, или с использованием известных клеточных анализов для измерения, например, ADCC
- 24 039356 или CDC, или оценки фармакокинетических свойств молекул настоящего изобретения в моделях in vivo.
Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева.
В настоящем изобретении предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие домены FN3, связывающиеся с EGFR или c-Met, или биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащие домен FN3, в виде выделенных полинуклеотидов, или в виде частей векторов экспрессии, или в виде частей линейных последовательностей ДНК, включая линейные последовательности ДНК, применяемые для транскрипции/трансляции in vitro, векторов, совместимых с экспрессией, секрецией и/или представлением композиций или результатов их направленного мутагенеза в прокариотах, эукариотах или нитчатых фагах. В настоящем документе описаны некоторые примеры полинуклеотидов, однако другие полинуклеотиды, которые, учитывая вырожденность генетического кода или предпочтения в отношении кодона в данной системе экспрессии, кодируют домены FN3, связывающиеся с EGFR или cMet, или биспецифические к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащие домен FN3, также входят в объем настоящего изобретения.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующий домен FN3, специфически связывающийся с EGFR, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18-29, 107-110 или 122-137.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 97-98 или 168-169.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующий домен FN3, специфически связывающийся с c-Met, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 32-49 или 111-114.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующий биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу, содержащую домен FN3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121 или 138-165.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 115-116 или 166-167.
Полинуклеотиды настоящего изобретения можно получить путем химического синтеза, такого как синтез в твердой фазе полинуклеотидов на автоматическом синтезаторе полинуклеотидов, и сборки в полные одно- или двухцепочечные молекулы. Альтернативно, полинуклеотиды настоящего изобретения можно получить другими методиками, такими как ПЦР с последующим стандартным клонированием. Методики производства или получения полинуклеотидов с заданной известной последовательностью хорошо известны в данной области.
Полинуклеотиды настоящего изобретения могут содержать по меньшей мере одну некодирующую последовательность, такую как промоторная или энхансерная последовательность, интрон, сигнал полиаденилирования, cis-последовательность, облегчающую связывание с RepA, и т.п. Полинуклеотидные последовательности также могут содержать дополнительные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, которые кодируют, например, маркерную последовательность или последовательность тега, такую как гистидиновый тег или НА-тег, для облегчения очистки или обнаружения белка, сигнальную последовательность, партнер для слитного белка, такой как RepA, Fc или белок покрытия бактериофага, такой как pIX или pIII
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид настоящего изобретения. Такие векторы могут представлять собой плазмидные векторы, вирусные векторы, векторы для экспрессии бакуловируса, векторы на основе транспозонов или любые другие векторы, подходящие для введения полинуклеотидов настоящего изобретения в данный организм или генетическое окружение каким-либо образом. Такие векторы могут представлять собой векторы экспрессии, содержащие элементы нуклеотидной последовательности, которые могут контролировать, регулировать, вызывать или допускать экспрессию полипептидов, кодируемых таким вектором. Такие элементы могут содержать сайты связывания энхансера транскрипции, сайты инициации РНК-полимеразы, сайты связывания рибосом и другие сайты, способствующие экспрессии закодированных полипептидов в заданной экспрессирующей системе. Такие экспрессирующие системы могут представлять собой клеточные или бесклеточные системы, хорошо известные в данной области.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой клетку-хозяина, содержащую вектор настоящего изобретения. Моноспецифический домен FN3, связывающийся с EGFR или c-Met, или биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу настоящего изобретения, содержащую домены FN3, можно необязательно получить с помощью клеточной линии, смешанной клеточной линии, иммортализованной клетки или клональной популяции иммортализованных клеток, как хорошо известно в данной области. См., например, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
- 25 039356
Выбранная для экспрессии клетка-хозяин может происходить от млекопитающего или ее можно выбрать из клеток COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, СНО, BSC-1, He G2, SP2/0, HeLa, миеломы, лимфомы, дрожжей, насекомых или растений или любых производных, их иммортализованных или преобразованных клеток. Альтернативно, клетку-хозяина можно выбрать из видов или организмов, не способных к гликозилированию полипептидов, например прокариотической клетки или организма, такого как BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3) и любого из природных или сконструированных штаммов Е. coli, Klebsiella или Pseudomonas.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ получения выделенного домена FN3 настоящего изобретения, специфически связывающегося с EGFR или c-Met, или выделенной биспецифической к EGFR/c-Met молекулы настоящего изобретения, содержащей домен FN3, включающий культивирование выделенной клетки-хозяина настоящего изобретения в таких условиях, чтобы экспрессировался выделенный домен FN3, специфически связывающийся с EGFR или c-Met, или выделенная биспецифическая к EGFR/c-Met молекула, содержащая домен FN3, а также очистку домена или молекулы.
Домен FN3, специфически связывающийся с EGFR или c-Met, или выделенную биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу настоящего изобретения, содержащую домен FN3, можно очистить из рекомбинантных клеточных культур с помощью хорошо известных способов, например путем очистки белком А, осаждением сульфатом аммония или этанолом, кислотной экстракцией, анионной или катионной обменной хроматографией, фосфоцеллюлозной хроматографией, хроматографией с гидрофобным взаимодействием, аффинной хроматографией, гидроксилапатитной хроматографией, лектиновой хроматографией или высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела можно создавать de novo или можно конструировать из существующих моноспецифических антител к EGFR и c-Met.
Примерами антител к EGFR, которые можно использовать для конструирования биспецифических молекул, являются, например, панитумумаб (ABX-EGF), нимотузумаб, нецитумумаб, матузумаб, а также описанные, например, в патентах США № US 7595378, US 7247301, патентной публикации США № US 2011/0256142, патентах США № US 5891996; US 5212290, US 5558864, US 7589180. Например, можно использовать домен VH антитела, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 189 или 191, и домен VL антитела, имеющий аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 190 или 192.
К примерам антител к c-Met, которые можно использовать для конструирования биспецифических молекул, относятся, например, рилотумумаб, онартузумаб, фиклатузумаб и антитела, описанные, например, в международной публикации РСТ № WO 2011/110642, патентной публикации США № US 2004/0166544, в международной публикации РСТ № WO 2005/016382 или в международной публикации РСТ № WO 2006/015371. Например, можно использовать домен VH антитела, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 193 или 195, и домен VL антитела, имеющий аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 194 или 196. Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей антител, идентифицированные по их наименованиям в соответствии с United States Adopted Names (USAN), можно получить в American Medical Association на сайте http://_www_ama-assn_org или в реестре CAS.
Моноспецифические к EGFR и c-Met вариабельные домены можно выбрать de novo, например, из библиотеки на фаговом дисплее, где сконструирован фаг, экспрессирующий человеческие иммуноглобулины или их части, такие как Fab, одноцепочечные антитела (scFv) или неспаренные или спаренные вариабельные участки антитела (Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84, 2001; Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314,1996; Sheets et al., PITAS (USA), 95:61576162, 1998; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991), и затем конструируют в биспецифическом формате. Моноспецифические к EGFR и c-Met вариабельные домены можно выделять, например, из библиотек фаговых дисплеев, экспрессирующих вариабельные участки легкой и тяжелой цепей, в виде белков, слитых с белком оболочки бактериофага pIX, как описано в Shi et al. (2010), J. Mol. Biol. 397:385-96 и в международной публикации РСТ № wO 09/085462). В библиотеках антител проводят скрининг на связывание с внеклеточными доменами человеческих EGFR или c-Met, и полученные положительные клоны дополнительно характеризуют, а из лизатов клонов выделяют Fab. Такое применение способов фагового дисплея для выделения человеческих антител известно в данной области. См., например, патенты США № 5223409, 5403484, 5571698, 5427908, 5580717, 5969108, 6172197, 5885793,; 6521404, 6544731, 6555313, 6582915 и 6593081. Полученные de novo вариабельные участки, связывающиеся с EGFR или c-Met, конструируют в биспецифических форматах, используя способы, описанные в настоящем документе.
Биспецифические форматы антител.
Антитела настоящего изобретения имеют два или более антигенсвязывающих сайта и являются биспецифическими. К биспецифическим антителам настоящего изобретения относятся антитела, имеющие полноразмерную структуру антитела.
- 26 039356
Термин полноразмерное антитело в настоящем документе означает антитело, имеющее две полноразмерных тяжелые цепи антитела и две полноразмерных легкие цепи антитела. Полноразмерная тяжелая цепь антитела (НС) состоит из хорошо известных вариабельных и константных доменов тяжелой цепи VH, CH1, CH2 и СН3. Полноразмерная легкая цепь антитела (LC) состоит из хорошо известных вариабельных и константных доменов легкой цепи VL и CL. Полноразмерное антитело может не содержать С-концевого лизина (K) либо в одной, либо в обеих тяжелых цепях.
Термин Fab-плечо или полумолекула означает одну пару тяжелая цепь - легкая цепь, специфически связывающуюся с антигеном.
Полноразмерные биспецифические антитела настоящего изобретения можно создать, например, путем обмена Fab-плечами (или обмена полумолекулами) между двумя моноспецифическими двухвалентными антителами, введя в СН3-интерфейс тяжелой цепи в каждой полумолекуле замены, способствующие образованию гетеродимера из двух полумолекул антител, имеющих разную специфичность, либо in vitro в бесклеточной среде, либо с использованием коэкспрессии. Реакция обмена Fab-плечами является результатом реакции изомеризации дисульфидной связи и диссоциации-ассоциации СН3-доменов. Восстанавливаются дисульфидные связи тяжелых цепей в шарнирных участках исходных моноспецифических антител. Полученные свободные цистеины одного из исходных моноспецифических антител образуют дисульфидную связь тяжелых цепей с цистеиновыми остатками второй исходной молекулы моноспецифического антитела, и одновременно СН3-домены исходных антител высвобождаются? и происходит переформирование путем диссоциации-ассоциации. СН3-домены Fab-плеч могут быть сконструированы так, чтобы они способствовали гетеродимеризации, а не гомодимеризации. Полученный продукт представляет собой биспецифическое антитело, имеющее два Fab-плеча, или полумолекулы, каждое из которых связывается с отдельным эпитопом, т.е. эпитопом на EGFR и эпитопом на c-Met.
Термин гомодимеризация в настоящем документе обозначает взаимодействие двух тяжелых цепей, имеющих идентичные аминокислотные последовательности СН3. Термин гомодимер в настоящем документе обозначает антитело, имеющее две тяжелые цепи с идентичными аминокислотными последовательностями СН3.
Термин гетеродимеризация в настоящем документе обозначает взаимодействие двух тяжелых цепей, имеющих неидентичные аминокислотные последовательности СН3. Термин гетеродимер в настоящем документе обозначает антитело, имеющее две тяжелые цепи с неидентичными аминокислотными последовательностями СН3.
Для создания полноразмерных биспецифических антител можно использовать стратегию выступ во впадину (см., например, международную публикацию РСТ № WO 2006/028936). Вкратце, выбранные аминокислоты, образующие интерфейс между доменами СН3 в человеческом IgG, можно подвергнуть мутации в положениях, влияющих на взаимодействия доменов СН3, стимулируя образование гетеродимера. Аминокислоту с короткой боковой цепью (впадина) вводят в тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося с первым антигеном, а аминокислоту с длинной боковой цепью (выступ) вводят в тяжелую цепь антитела, специфически связывающегося со вторым антигеном. После коэкспрессии двух антител в результате предпочтительного взаимодействия тяжелой цепи с впадиной и тяжелой цепи с выступом образуется гетеродимер. Примерами пар замен в СН3, образующих выступ и впадину, являются следующие (указано как модифицированное положение в первом домене СН3 первой тяжелой цепи/модифицированное положение во втором домене СН3 второй тяжелой цепи): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S и T366W/T366S_L368A_Y407V.
Можно использовать другие стратегии, например стимулирование гетеродимеризации тяжелых цепей с использованием электростатических взаимодействий путем введения замен положительно заряженных остатков на одной поверхности СН3 и отрицательно заряженных остатков на другой поверхности СН3, как описано в патентной публикации США № US 2010/0015133; патентной публикации США № US 2009/0182127, патентной публикации США № US 2010/028637 или патентной публикации США № US2011/0123532. В других стратегиях гетеродимеризацию можно стимулировать путем следующих замен (указано модифицированное положение в первом домене СН3 первой тяжелой цепи/модифицированное положение во втором домене СН3 второй тяжелой цепи): L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V,
T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F,
Y407A/T366A_K409F или T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, как описано в патентной публикации США № US2012/0149876; патентной публикации США № US 2013/0195849.
В дополнение к вышеописанным способам, биспецифические антитела настоящего изобретения можно создавать in vitro в бесклеточной среде, вводя асимметричные мутации в СН3-участках двух моноспецифических гомодимерных антител и образуя биспецифическое гетеродимерное антитело из двух исходных моноспецифических гомодимерных антител в восстановительных условиях, что способствует изомеризации дисульфидной связи в соответствии со способами, описанными в международной патентной публикации США № WO 2011/131746. В этих способах первое моноспецифическое двухвалентное антитело (например, антитело к c-Met) и второе моноспецифическое двухвалентное антитело (например,
- 27 039356 антитело к EGFR) конструируют так, чтобы они имели некоторые замены в домене СН3, которые способствуют стабильности гетеродимера; антитела инкубируют вместе в восстановительных условиях, позволяющих цистеинам в шарнирном участке проходить изомеризацию дисульфидной связи; в результате этого путем обмена Fab-плечами создается биспецифическое антитело. Условия инкубирования можно оптимально возвратить к невосстановительным. К примерам пригодных для использования восстанавливающих агентов относятся 2-меркаптоэтиламин (2-МЕА), дитиотреитол (DTT), дитиоэритритол (DTE), глутатион, трис-(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), L-цистеин и бета-меркаптоэтанол, предпочтительно восстанавливающий агент выбирают из группы, состоящей из:2-меркаптоэтиламина, дитиотреитола и трис-(2-карбоксиэтил)фосфина. Например, можно использовать инкубирование в течение по меньшей мере 90 мин при температуре по меньшей мере 20°С в присутствии по меньшей мере 25 мМ 2-МЕА или в присутствии по меньшей мере 0,5 мМ дитиотреитола при рН 5-8, например при рН 7,0 или при рН 7,4.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения могут обеспечить преимущество в отношении специфичности и сниженной побочной токсичности по сравнению с низкомолекулярными ингибиторами EGFR и/или c-Met. Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на неожиданном открытии того, что биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения обеспечивают существенно повышенный синергический ингибиторный эффект по сравнению со смесью связывающихся с EGFR и связывающихся с c-Met моноспецифических антител или описанными в публикациях биспецифическими к EGFR/c-Met антителами. В зависимости от анализа наблюдался синергический эффект в диапазоне от приблизительно 14-кратного до более чем приблизительно 800-кратного. Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения обеспечивают более эффективное ингибирование сигнальных путей EGFR и c-Met и более эффективное ингибирование роста опухоли, чем цетуксимаб (Erbitux®) Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения ингибируют сигнализацию EGFR в опухолях и/или линиях опухолевых клеток, имеющих активирующие EGFR мутации и/или мутации в EGFR, в отношении которых известен эффект резистентности к лечению ингибиторами тирозинкиназ, таким как гефитиниб, и ингибируют сигнальный путь c-Met, для которого показано усиление активности и обеспечение компенсаторной сигнализации при лечении ингибиторами тирозинкиназы EGFR при онкологических заболеваниях, таких как NSCLC. Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения в дополнение к прямому ингибированию сигнализации EGFR и c-Met демонстрируют противоопухолевую активность благодаря усиленной антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и деградации рецепторов EGFR и c-Met. В отличие от существующих видов терапии EGFR (цетуксимаб и панитумумаб), биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения индуцируют уничтожение опухолевых клеток, имеющих мутации KRAS, посредством усиленной ADCC.
В международной патентной публикации США № WO 2010/115551 описано биспецифическое к EGFR/c-Met антитело (BSAB01), сконструированное в формате IgG-scFv с применением связывающей EGFR пары VH/VL из цетуксимаба и связывающей c-Met пары VH/VL из антитела 5D5 (MetMab, онартузумаб), в настоящее время проходящее фазу III испытаний. BSAB01 демонстрирует приблизительно двукратное (аддитивное) усиление ингибирования пролиферации клеток А431 по сравнению с исходными антителами (пример 7, фиг. 8b в WO 2010/115551) и умеренное аддитивное ингибирование пролиферации клеток Ovarc-8 (фиг. 10а, пример 16 в WO 2010/115551) по сравнению с комбинацией двух исходных антител (ингибирование 15% в сравнении с 10%). Таким образом, что удивительно и неожиданно, в настоящем изобретении предложены биспецифические к EGFR/c-Met антитела, демонстрирующие существенный синергический эффект при ингибировании сигнализации EGFR и c-Met, выживании раковых клеток и росте опухоли. Без стремления к ограничению какой-либо теорией считается, что существенный синергический эффект биспецифических антител настоящего изобретения по меньшей мере частично обусловлен специфичностью к эпитопам обоих из связывающихся с EGFR и c-Met плеч, что, возможно, приводит к ингибированию сигнализации не только через гомодимеры EGFR и c-Met, но также через гетеродимеры EGFR/HERx.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой выделенное биспецифическое к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR)/рецептору фактора роста гепатоцитов (c-Met) антитело, содержащее:
a) первую тяжелую цепь (HC1), содержащую константный домен 3 HC1 (HC1 СН3) и вариабельный участок 1 HC1 (VH1);
b) вторую тяжелую цепь (НС2), содержащую константный домен 3 НС2 (НС2 СН3) и вариабельный участок 2 НС2 (VH2);
c) первую легкую цепь (LC1), содержащую вариабельный участок 1 легкой цепи (VL1); и вторую легкую цепь (LC2), содержащую вариабельный участок 2 легкой цепи (VL2), причем VH1 и VL1 совместно образуют первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с EGFR, a VH2 и VL2 совместно образуют второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с c-Met, причем HC1 содержит по меньшей мере одну замену в HC1 СН3, а НС2 содержит по меньшей
- 28 039356 мере одну замену в НС2 СН3, причем замена в HC1 СН3 и замена в НС2 СН3 происходят по разным положениям аминокислотных остатков, если нумерация остатков соответствует каталогу ЕС.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело ингибирует фосфорилирование связанных с внеклеточными сигналами киназ 1 и 2 (ERK1/2) в клеточной линии NCI-H292, NCI-H1975 или SKMES-1 со значением IC50, которое по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 20 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 30 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 40 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 50 раз меньше или по меньшей мере приблизительно в 60 раз меньше по сравнению со значением IC50 для ингибирования фосфорилирования ERK1/2 в клеточных линиях NCI-H292, NCI-H1975 или SKMES-1 при помощи смеси контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего тяжелую цепь 3 (НС3) и легкую цепь 3 (LC3), и контрольного одновалентного антитела к c-Met, содержащего тяжелую цепь 4 (НС4) и легкую цепь 4 (LC4), причем НС3 и HC1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно, и фосфорилирование ERK1/2 измеряют в цельноклеточных лизатах с помощью сэндвич-ИФА с применением антитела к фосфо-ERK1/2 в качестве захватывающего антитела, и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела, связывающегося с не фосфорилированной и фосфорилированной ERK1/2, в качестве детекторного антитела. Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения обеспечивают синергическое, более выраженное ингибирование сигнализации EGFR и c-Met по сравнению с комбинацией моноспецифических антител к EGFR и моноспецифических антител к c-Met, если оценивать ингибирование по ингибированию фосфорилирования ERK1/2. Таким примером биспецифического к EGFR/c-Met антитела является антитело EM1-mAb настоящего изобретения.
Термин контрольное моноспецифическое к EGFR антитело в настоящем документе означает антитело, имеющее первое Fab-плечо, которое связывается с EGFR и идентично по аминокислотной последовательности связывающемуся с EGFR Fab-плечу тестируемого биспецифического к EGFR/c-Met антитела и имеет второе Fab-плечо, являющееся инертным и связывающимся с неродственным/не связанным антигеном, вирусом иммунодефицита человека (HIV) gp120. Второе Fab-плечо имеет легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 209, и тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 198, в тех случаях, когда связывающееся с EGFR Fab-плечо в тестируемом биспецифическом к EGFR/c-Met антителе содержит замену F405L. Второе Fab-плечо имеет легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 209, и тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 197, в тех случаях, когда связывающееся с EGFR Fab-плечо в тестируемом биспецифическом к EGFR/c-Met антителе содержит замену K409R.
Термин контрольное моноспецифическое к c-Met антитело в настоящем документе означает антитело, имеющее первое Fab-плечо, которое связывается с c-Met и идентично по аминокислотной последовательности связывающемуся с c-Met Fab-плечу тестируемого биспецифического к EGFR/c-Met антитела, и имеющее второе Fab-плечо, являющееся инертным и связывающимся с неродственным/не связанным антигеном, HIV gp120. Второе Fab-плечо имеет легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 209, и тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 198, в тех случаях, когда связывающееся с c-Met Fab-плечо в тестируемом биспецифическом к EGFR/c-Met антителе содержит замену F405L. Второе, инертное Fab-плечо имеет легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 209, и тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 197, в тех случаях, когда связывающееся с c-Met Fab-плечо в тестируемом биспецифическом к EGFR/c-Met антителе содержит замену K409R.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело ингибирует фосфорилирование ERK1/2 со значением IC50 приблизительно 2x10’9 М или менее, приблизительно 1x10’9 М или менее или приблизительно 1х10’10 М или менее.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, ERK1 фосфорилируется по остаткам Thr202 и Tyr204, a ERK2 фосфорилируется по остаткам Thr185 и Tyr197.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело ингибирует фосфорилирование протеинкиназы В (AKT) по Ser473 в клеточной линии NCI-H1975 со значением IC50, по меньшей мере приблизительно в 70 раз меньшим по сравнению со значением IC50 для ингибирования фосфорилирования AKT по Ser473 в клеточной линии NCI-H1975 со смесью контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего НС3 и LC3, и контрольного одновалентного антитела к c-Met, содержащего НС4 и LC4, причем НС3 и HC1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно, причем фосфорилирование AKT по Ser473 измеряют в цельноклеточных лизатах с помощью сэндвич-ИФА с применением антитела, связывающегося с не фосфорилированной и фосфорилированной AKT в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела к фосфорилированной по Ser473 AKT в качестве детекторного антитела.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело ингибирует фосфорилирование протеинкиназы В (AKT) по Thr308 в клеточной линии NCI-H1975 со значением IC50, по меньшей мере приблизительно в 100 раз меньшим по сравнению
- 29 039356 со значением IC50 для ингибирования фосфорилирования AKT по Thr308 в клеточной линии NCI-H1975 со смесью контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего НС3 и LC3, и контрольного одновалентного антитела к c-Met, содержащего НС4 и LC4, причем НС3 и НС1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно, причем фосфорилирование AKT по Thr308 измеряют в цельноклеточных лизатах с помощью сэндвич-ИФА с применением антитела, связывающегося с не фосфорилированной и фосфорилированной AKT в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела к фосфорилированной по Thr308 AKT в качестве детекторного антитела.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения обеспечивают синергическое, более выраженное ингибирование сигнализации EGFR и c-Met по сравнению с комбинацией моноспецифических к EGFR антител и моноспецифических к c-Met антител, если оценивать ингибирование по ингибированию фосфорилирования AKT. Таким примером биспецифического к EGFR/c-Met антитела является антитело EM1-mAb настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело ингибирует фосфорилирование AKT по Ser473 или Thr308 со значением IC50 приблизительно 1x10’9 М или менее.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело связывается с EGFR с SEQ ID NO: 73 по остаткам EGFR K489, I491, K467 и S492 и с c-Met по остаткам PEFRDSYPIKYVHAF (SEQ ID NO: 238) и FAQSKPDSAEPMDRSA (SEQ ID NO: 239). Примером такого биспецифического антитела является EM1-mAb. Биспецифическое антитело ЕМ-1 связывается с EGFR и c-Met в отдельных эпитопах по сравнению с антителом BSAB01, как описано выше в международной патентной публикации США № WO 2010/115551. Исходное связывающееся с EGFR плечо (цетуксимаб) BSAB01 связывается с аминокислотными остатками EGFR R353, Q384, Q408, H409, F412, S418, S440, K443, K465, I467, S468 и N473 в зрелом EGFR, что соответствует остаткам R367, Q408, Q432, H433, F436, S442, S464, K467, K489, I491, S492 и N497 полноразмерного EGFR с SEQ ID NO: 73 (Li et al., Cancer Cell, 7:301-311, 2005). Исходное связывающееся с c-Met плечо BSAB01 (mAb 5D5) связывается с c-Met с остатками 325-340 PGAQLARQIGASLNDD (SEQ ID NO: 240).
Картирование эпитопа, связывающегося с EGFR антитела (2F8), исходного для EM1-mAb, описано в патентной публикации США № US 2011/0256142A1. Цетуксимаб и исходное антитело 2F8 связываются с частично перекрывающимися, но отличными эпитопами.
Картирование эпитопов можно выполнять стандартными способами. Например, в случае, когда известны структуры обоих отдельных компонентов, можно использовать анализ in silico прикрепления одного белка к другому белку для идентификации способных к взаимодействию участков. Может быть проведено избирательное замещение водорода дейтерием (H/D) в комплексе антигена и антитела с целью картирования участков антигена, способных связываться с антителом. Сегментный и точечный мутагенез антигена можно использовать для определения местоположения важных для связывания с антителом аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело нейтрализует сигнализацию EGFR и c-Met.
Биспецифическое к EGFR/c-Met антитело настоящего изобретения может нейтрализовать сигнализацию EGFR и c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, б0, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем сигнализации в отсутствие биспецифической к EGFR/cMet молекулы настоящего изобретения при использовании одинаковых условий анализа.
Связывание лиганда, например, EGF с EGFR, стимулирует димеризацию рецепторов, аутофосфорилирование, активацию внутреннего рецептора, цитоплазматического тирозинкиназного домена и инициирование множества сигнальных путей трансдукции и трансактивации, вовлеченных в регуляцию синтеза ДНК (активацию генов) и прохождение клеточного цикла или деления. Нейтрализация сигнализации EGFR может приводить к ингибированию одного или более расположенных ниже сигнальных путей EGFR, и, следовательно, нейтрализация EGFR может оказывать различные эффекты, включая ингибирование пролиферации и дифференцировки клеток, ангиогенез, подвижность клеток и метастазирование, а также ингибирование расположенных ниже сигнальных путей.
Сигнализацию EGFR и нейтрализацию сигнализации EGFR можно измерить с помощью различных хорошо известных способов, например, путем измерения аутофосфорилирования рецептора по любому из тирозиновых остатков Y1068, Y1148 и Y1173 (Downward et al., Nature, 311:483-5, 1984) и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов, а также измерения ингибирования аутофосфорилирования и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов биспецифическими антителами настоящего изобретения. Фосфорилирование можно обнаруживать хорошо известными способами, такими как анализ ИФА или вестерн-блоттинг, с использованием антитела, специфического к фосфотирозину. Примеры анализа можно найти в Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283:1433-44, 1997 и Batley et al., Life Sci. 62:143-50, 1998, а также в настоящем документе.
Связывание лиганда, например, HGF с c-Met, стимулирует димеризацию рецептора, аутофосфорилирование, активацию цитоплазматического тирозинкиназного домена рецептора и инициирование мно- 30 039356 жества сигнальных путей трансдукции и трансактивации, вовлеченных в регуляцию синтеза ДНК (активацию генов) и прохождение клеточного цикла или деления. Ингибирование сигнализации c-Met может приводить к ингибированию в одном или более расположенных ниже сигнальных путях передачи c-Met, и, следовательно, нейтрализация c-Met может оказывать различные эффекты, включая ингибирование пролиферации и дифференцировки клеток, ангиогенез, подвижность клеток и метастазирование.
Сигнализацию c-Met и нейтрализацию сигнализации c-Met можно измерять различными хорошо известными способами, например путем измерения аутофосфорилирования рецептора по меньшей мере одного из тирозиновых остатков Y1230, Y1234, Y1235 или Y1349 и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Фосфорилирование можно обнаруживать, например, при помощи антитела, специфического к фосфотирозину, способом ИФА или вестерн-блоттингом. Примеры анализа можно найти в Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283:1433-44, 1997 и Batley et al., Life Sci. 62:143-50, 1998, а также в настоящем документе.
Сигнализацию EGFR и c-Met можно измерять при помощи различных хорошо известных способов, описанных в настоящем документе, например, путем измерения ингибирования фосфорилирования ERK1/2 и AKT. Ингибирование фосфорилирования ERK1 по Thr202 и Tyr204 и фосфорилирования ERK2 по Thr185 и Tyr187, а также ингибирование фосфорилирования AKT по Ser473 или Thr308 можно измерять, например, в клеточных лизатах NCI-H1975 с помощью сэндвич-ИФА с захватывающими антителами, нанесенными на твердую подложку, и детекторными антителами, конъюгированными с электрохемилюминесцентным соединением, например, меткой Meso Scale Discover (MSD) SULFO-TAG, с последующим обнаружением сигнала на считывателе для планшетов.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело ингибирует рост клеток NCI-H292 или NCI-H1975 со значением IC50, по меньшей мере приблизительно в 300 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 400 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 500 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 600 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 700 раз меньшим или по меньшей мере приблизительно в 800 раз меньшим по сравнению со значением IC50 ингибирования роста клеток NCI-H292 или NCI-H1975 цетуксимабом, если клетки NCI-H292 или NCI-H1975 выращиваются в условиях с низким прикреплением.
Ингибирование роста клеток можно анализировать известными способами. Клетки можно высеивать на планшеты, покрытые гидрогелями или полимерами-биомиметиками (например, планшеты Ultra Low Attachment производства Corning) для предотвращения или уменьшения прикрепления клеток, а воздействие антител на индуцированный 7,5 нг/мл HGF рост клеток можно оценивать путем измерения процентной доли жизнеспособных клеток после инкубации в течение 72 ч с применением стандартных способов.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения обеспечивают синергическое и более выраженное ингибирование экспрессирующих EGFR и/или c-Met раковых клеток по сравнению с комбинацией моноспецифических к EGFR антител и моноспецифических к c-Met антител, а также со стандартным лечением цетуксимабом. Примером такого биспецифического к EGFR/c-Met антитела является антитело EM1-mAb настоящего изобретения. Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения ингибируют раковые клетки, которые экспрессируют EGFR дикого типа и c-Met дикого типа, а также раковые клетки, которые экспрессируют мутантный EGFR L858R/T790M, причем было обнаружено, что данная мутация способствует развитию резистентности к лечению низкомолекулярными ингибиторами тирозинкиназ (TKI), такими как гефитиниб. Таким образом, биспецифические к EGFR/cMet антитела настоящего изобретения могут обеспечивать преимущество в более широкой популяции пациентов по сравнению с цетуксимабом и TKI.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело ингибирует рост опухоли из экспрессирующих HGF клеток SKMES-1 у мышей SCID Beige с процентным (%) значением Т/С, которое на 36 сутки по меньшей мере в 500 раз меньше по сравнению с цетуксимабом при введении биспецифического антитела и цетуксимаба в дозе 20 мг/кг.
Модели ксенотрансплантата опухоли с использованием мышей SCID Beige являются хорошо известными. Клетки SKMES-1 можно сконструировать так, чтобы они экспрессировали человеческий HGF, с помощью стандартных способов. Как правило, мышам SCID Beige можно подкожно инокулировать клетки SKMES-1, экспрессирующие человеческий HGF, встроенные во внеклеточный матрикс, такой как Culturex, вводя их в дорсальную часть бока каждого животного. Через одну неделю после имплантации мышей можно разделить на группы с эквивалентными объемами опухоли, а после этого вводить, например, три раза в неделю биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения, контрольные или сравниваемые антитела или низкомолекулярные соединения. Объемы опухолей можно регистрировать дважды в неделю, а ингибирование роста опухоли (TGI) можно наблюдать, вычисляя процентное (%) значение Т/С. Значение % Т/С является показателем противоопухолевой эффективности. Т и С представляют собой средние объемы в получавшей лечение и контрольной группе соответственно в заданный день.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения обеспечивают существенно более высокую эффективность в отношении уничтожения опухоли in vivo по сравнению со стандартным
- 31 039356 лечением цетуксимабом и, следовательно, могут обеспечить преимущество в популяции пациентов по сравнению с цетуксимабом.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к
EGFR/c-Met антитело содержит НС1 и НС2 из изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит НС1 и НС2 из изотипа IgG1.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело в НС1 СН3 содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь замен, а в НС2 СН3 содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь замен по положениям остатков 350, 366, 368, 370, 399, 405, 407 или 409, если нумерация остатков соответствует каталогу ЕС.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело в НС1 СН3 содержит по меньшей мере одну, две, три или четыре замены, а в НС2 СН3 содержит по меньшей мере одну, две, три или четыре замены по положениям остатков 350, 370, 405 или 409, если нумерация остатков соответствует каталогу ЕС.
Домены антитела и нумерация являются хорошо известными. Два домена СН3 (или участка СН3) являются неидентичными, если они отличаются друг от друга по меньшей мере одной аминокислотной заменой. Участок IgG1 СН3, как правило, состоит из остатков 341-446 в IgG1 (нумерация остатков соответствует каталогу ЕС). Пример константного участка IgG1 показан в SEQ ID NO: 203. Домен СН3 охватывает остатки 224-329 SEQ ID NO: 203 и соответствует остаткам 341-446 по каталогу ЕС.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело в НС1 СН3 содержит по меньшей мере одну замену, а в НС2 СН3 содержит по меньшей мере одну замену по положениям остатков 405 или 409, если нумерация остатков соответствует каталогу ЕС.
В других вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело в НС1 СН3 содержит замену K409R или F405L, а в НС2 СН3 содержит замену K409R или F405L, если нумерация остатков соответствует каталогу ЕС.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело в НС1 СН3 содержит замену F405L, а в НС2 СН3 содержит замену K409R.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, замены в HC1 СН3 и НС2 СН3 представляют собой замены в положениях 366, 368, 370, 399, 405, 407 или 409 (нумерация соответствует каталогу ЕС). Эти положения соответствуют линейным положениям остатков 248, 250, 252, 281, 287, 289 и 291 соответственно в константном участке тяжелой цепи SEQ ID NO: 203 и 204.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в положении 409 в HC1 СН3 имеется аминокислотная замена, отличная от Lys, Leu или Met, а в положении 405 в НС2 СН3 имеется аминокислотная замена, отличная от Phe.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в положении 405 в НС1 СН3 имеется аминокислотная замена, отличная от Phe, а в положении 409 в НС2 СН3 имеется аминокислотная замена, отличная от Lys, Leu или Met.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в положении 409 в HC1 СН3 имеется аминокислотная замена, отличная от Lys, Leu или Met, а в положении 405 в НС2 СН3 имеется аминокислотная замена, отличная от Phe, Arg или Gly.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, в положении 405 в НС1 СН3 имеется аминокислотная замена, отличная от Phe, Arg или Gly, а в положении 409 в НС2 СН3 имеется аминокислотная замена, отличная от Lys, Leu или Met.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 содержит Phe в положении 405 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met, в положении 409, а НС2 СН3 содержит аминокислоту, отличную от Phe, в положении 405 и содержит Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Phe в положении 405 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Phe в положении 405 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met, в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Phe в положении 405 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met, в положении 409, а НС2 СН3 имеет замену, отличную от Phe, Arg или Gly в положении 405 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет замену, отличную от Phe, Arg или Gly в положении 405 и Lys положении 409, а НС2 СН3 имеет Phe в положении 405 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met, в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Phe в положении 405 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met, в положении 409, а НС2 СН3 имеет Leu в положении 405 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, НС1 СН3 имеет Leu в положении 405 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Phe в положении 405 и аминокислоту, отлич- 32 039356 ную от Lys, Leu или Met в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Phe в положении 405 и Arg в положении 409, а НС2 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Phe, Arg или Gly в положении 405 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Phe, Arg или Gly в положении 405 и Lys положении 409, а НС2 СН3 имеет Phe в положении 405 и Arg в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Phe в положении 405 и Arg в положении 409, а НС2 СН3 имеет Leu в положении 405 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Leu в положении 405 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Phe в положении 405 и Arg в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Phe в положении 405 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Leu в положении 405 и Arg в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Leu в положении 405 и Arg в положении 409, а НС2 СН3 имеет Phe в положении 405 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met, в положении 409, а НС2 СН3 имеет Lys в положении 409, Thr в положении 370 и Leu в положении 405.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Lys в положении 409, Thr в положении 370 и Leu в положении 405, а НС2 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Arg в положении 409, а НС2 СН3 имеет Lys в положении 409, Thr в положении 370 и Leu в положении 405.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Lys в положении 409, Thr в положении 370 и Leu в положении 405, а НС2 СН3 имеет Arg в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Lys в положении 370, Phe в положении 405 и Arg в положении 409, а НС2 СН3 имеет Lys в положении 409, Thr в положении 370 и Leu в положении 405.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Lys в положении 409, Thr в положении 370 и Leu в положении 405, а НС2 СН3 имеет Lys в положении 370, Phe в положении 405 и Arg в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409, а НС2 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser или Thr в положении 407.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser или Thr в положении 407, a HC2 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409, а НС2 СН3 имеет Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val или Trp в положении 407.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val или Trp в положении 407, a HC2 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met, в положении 409, а НС2 СН3 имеет Gly, Leu, Met, Asn или Trp в положении 407.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Gly, Leu, Met, Asn или Trp в положении 407, а НС2 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Tyr в положении 407 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409, а НС2 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser или Thr в положении 407 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser или Thr в положении 407 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Tyr в положении 407 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Tyr в положении 407 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409, а НС2 СН3 имеет Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val или Trp в положении 407 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val или Trp в положении 407 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Tyr в
- 33 039356 положении 407 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Tyr в положении 407 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409, а НС2 СН3 имеет Gly,
Leu, Met, Asn или Trp в положении 407 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Gly, Leu, Met, Asn или Trp в положении 407 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Tyr в положении 407 и аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Tyr в положении 407 и Arg в положении 409, а НС2 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser или Thr в положении 407 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser или Thr в положении 407 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Tyr в положении 407 и Arg в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Tyr в положении 407 и Arg в положении 409, а НС2 СН3 имеет Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val или Trp в положении 407 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val или Trp в положении 407 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Tyr в положении 407 и Arg в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, НС1 СН3 имеет Tyr в положении 407 и Arg в положении 409, а НС2 СН3 имеет Gly, Leu, Met, Asn или Trp в положении 407 и Lys в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Gly, Leu, Met, Asn или Trp в положении 407 и Lys в положении 409, а НС2 СН3 имеет Tyr в положении 407 и Arg в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met, в положении 409, а НС2 СН3 имеет (i) аминокислоту, отличную от Phe, Leu и Met, в положении 368, или (ii) Trp в положении 370, или (iii) аминокислоту, отличную от Asp, Cys, Pro, Glu или Gln в положении 399.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет (i) аминокислоту, отличную от Phe, Leu и Met в положении 368, или (ii) Trp в положении 370, или (iii) аминокислоту, отличную от Asp, Cys, Pro, Glu или Gln в положении 399, а НС2 СН3 имеет аминокислоту, отличную от Lys, Leu или Met в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Arg, Ala, His или Gly в положении 409, а НС2 СН3 содержит (i) Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val или Trp в положении 368 или (ii) Trp в положении 370, или (iii) Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg или Tyr в положении 399.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет (i) Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val или Trp в положении 368, или (ii) Trp в положении 370, или (iii) Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg или Tyr в положении 399, а НС2 СН3 имеет Arg, Ala, His или Gly в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет Arg в положении 409, а НС2 СН3 имеет (i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val или Trp в положении 368, или (ii) Trp в положении 370, или (iii) Phe, His, Lys, Arg или Tyr в положении 399.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 имеет (i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val или Trp в положении 368, или (ii) Trp в положении 370, или (iii) Phe, His, Lys, Arg или Tyr в положении 399, а НС2 СН3 имеет Arg в положении 409.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 содержит замену K409R или замену F405L, а НС2 СН3 содержит замену K409R или замену F405L, причем нумерация остатков соответствует каталогу ЕС.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, HC1 СН3 содержит замену F405L, а НС2 СН3 содержит замену K409R.
Как правило, замены вводят в молекулу, например, в константный домен антитела, на уровне ДНК с помощью стандартных способов.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит VH1 и VL1, причем:
VH1 содержит участок, определяющий комплементарность, тяжелой цепи (HCDR) 1 (HCDR1), HCDR2 (HCDR2) и HCDR3 (HCDR3) с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 210, 211 и 212 соответственно; и
VL1 содержит участок, определяющий комплементарность, легкой цепи (LCDR) 1 (LCDR1), LCDR2 (LCDR2) и LCDR3 (LCDR3) с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 213, 214 и 215 соответственно.
- 34 039356
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к
EGFR/c-Met антитело содержит VH2 и VL2, причем:
VH2 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями
SEQ ID NO: 216, 217 и 218 соответственно; и
VL2 содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями
SEQ ID NO: 219, 220 и 221 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит VH1, VL1, VH2 и VL2 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 189, 190, 193 и 194 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит НС1, LC1, HC2 и LC2 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 199, 200, 201 и 202 соответственно, необязательно имеющие С-концевой лизин, удаленный из HC1, НС2 или обоих из HC1 и НС2.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит VH1 и VL1, причем:
VH1 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями
SEQ ID NO: 222, 223 и 224 соответственно; и
VL1 содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями
SEQ ID NO: 225, 226 и 227 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит VH2 и VL2, причем:
VH2 содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями
SEQ ID NO: 228, 229 и 230 соответственно; и
VL2 содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями
SEQ ID NO: 231, 232 и 233 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит VH1, VL1, VH2 и VL2 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 191, 192, 195 и 196 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит НС1, LC1, HC2 и LC2 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 234, 235, 236 и 237 соответственно, необязательно имеющими удаленный из НС1, НС2 или как из HC1, так и из НС2 С-концевой лизин.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифические к EGFR/c-Met антитела могут блокировать связывание EGF с EGFR и связывание HGF с c-Met со значением IC50 менее чем приблизительно 1х10-8 М, менее чем приблизительно 1х10’9 М, менее чем приблизительно 1х10’10 М, менее чем приблизительно 1х10-11 М или менее чем приблизительно 1х10’12 М в конкурентном анализе с использованием внеклеточных доменов рекомбинантного человеческого EGFR или рекомбинантного человеческого c-Met, нанесенных на планшеты и инкубированных с биспецифическими к EGFR/c-Met антителами настоящего изобретения или без них. Биспецифические к EGFR/c-Met антитела, описанные в настоящем документе, могут блокировать связывание ECF с EGFR и связывание HGF с c-Met по меньшей мере на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению со связыванием EGF с EGFR и связыванием HGF с c-Met в отсутствие биспецифических к EGFR/c-Met антител настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, при использовании одинаковых условий анализа.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит НС1, LC1, HC2 и LC2, причем НС1, LC1, HC2 и LC2 кодируются синтетическими полинуклеотидами, содержащими последовательность SEQ ID NO: 205, 206, 207 и 208 соответственно.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения можно создать с помощью методик, описанных в настоящем документе, например, с использованием конструирования СН3 и создания антител с помощью обмена Fab-плечами in vitro. Пример биспецифического антитела можно создать из двух моноспецифических антител, объединив приблизительно 1-20 мг/мл каждого антитела в молярном соотношении 1:1 в PBS при рН 7,0-7,4 в буферном растворе, имеющем конечную концентрацию 75 мМ 2-меркаптоэтаноламина (2-МЕА), инкубируя в течение 2-6 ч при 25-37°С с последующим удалением 2-МЕА путем диализа, диафильтрации, тангенциальной поточной фильтрации и фильтрации в вихревой ячейке. Выход биспецифического антитела может составлять более чем приблизительно 80%, более чем приблизительно 90%, более чем приблизительно 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, предложены способы получения выделенного биспецифического к EGFR/c-Met антитела, включающие:
объединение выделенного моноспецифического двухвалентного антитела к EGFR, содержащего две тяжелые цепи с SEQ ID NO: 199 и две легкие цепи с SEQ ID NO: 200, а также выделенного моноспеци- 35 039356 фического двухвалентного антитела к c-Met, содержащего две тяжелые цепи с SEQ ID NO: 201 и две легкие цепи с SEQ ID NO: 202, в смесь с молярным соотношением приблизительно 1:1;
введение в смесь восстанавливающего агента;
инкубирование смеси в течение от приблизительно 90 мин до приблизительно 6 ч;
удаление восстанавливающего агента;
очистку биспецифического к EGFR/c-Met антитела, содержащего первую тяжелую цепь с SEQ ID NO: 199 и вторую тяжелую цепь с SEQ ID NO: 201, первую легкую цепь с SEQ ID NO: 200 и вторую легкую цепь с SEQ ID NO: 202, причем первая тяжелая цепь с SEQ ID NO: 199 совместно с первой легкой цепью с SEQ ID NO: 200 образует первый связывающий домен, который специфически связывается с EGFR, а вторая тяжелая цепь с SEQ ID NO: 201 совместно со второй легкой цепью с SEQ ID NO: 202 образует второй связывающий домен, который специфически связывается с c-Met.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, восстанавливающий агент представляет собой 2-меркаптоэтаноламин (2-МЕА).
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, 2-МЕА присутствует в концентрации от приблизительно 25 до приблизительно 75 мМ.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, стадию инкубации проводят при температуре от приблизительно 25 до приблизительно 37°С.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, предложено выделенное биспецифическое к EGFR/-c-Met антитело, содержащее НС1, LC1, HC2 и LC2, причем НС1 содержит последовательность SEQ ID NO: 199, LC1 содержит последовательность SEQ ID NO: 200, HC2 содержит последовательность SEQ ID NO: 201 и LC2 содержит последовательность SEQ ID NO: 202, причем HC1, LC1, HC2 и/или LC2 дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 консервативных аминокислотных замен.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, предложено выделенное биспецифическое к EGFR/-c-Met антитело, содержащее НС1, LC1, HC2 и LC2, причем НС1 содержит последовательность SEQ ID NO: 234, LC1 содержит последовательность SEQ ID NO: 235, HC2 содержит последовательность SEQ ID NO: 236 и LC2 содержит последовательность SEQ ID NO: 237, причем HC1, LC1, HC2 и/или LC2 дополнительно содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 консервативных аминокислотных замен.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела, в которых аминокислотные последовательности НС1, LC1, HC2 и LC2 несущественно отличаются от антител, описанных в настоящем документе, входят в объем настоящего изобретения. Как правило, это включает одну или более консервативных аминокислотных замен на аминокислоту, имеющую аналогичный заряд, гидрофобные или стереохимические характеристики в антигенсвязывающих сайтах или в каркасах без неблагоприятного изменения свойств антитела. Также могут быть осуществлены консервативные замены, улучшающие свойства антитела, например, стабильность или аффинность. Например, возможно введение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных замен в VH1, VL1, VH2 и/или VL2. Например, консервативные аминокислотные замены могут включать замену нативных аминокислотных остатков на ненативные остатки, такие как те, которые не сопровождаются изменением или сопровождаются незначительными изменениями полярности или заряда аминокислотного остатка в этом положении. Более того, любой нативный остаток в полипептиде также может быть заменен на аланин, как было описано ранее в отношении аланин-сканирующего мутагенеза (MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv. Biophys. 35:1-24, 1998). Желательные аминокислотные замены могут определить специалисты в данной области, когда такие замены необходимы. Например, аминокислотные замены можно использовать для того, чтобы идентифицировать важные остатки в последовательности молекулы или для увеличения или уменьшения аффинности молекул, описанных в настоящем изобретении. Примеры консервативных аминокислотных замен описаны выше.
Аминокислотные замены могут быть выполнены, например, с помощью ПЦР-мутагенеза (патент США №4,683,195). Библиотеки вариантов можно создать с использованием хорошо известных способов, например, путем применения случайных (NNK) или неслучайных кодонов, например, кодонов DVK, кодирующих 11 аминокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp), а также скрининга библиотек на наличие вариантов с желательными свойствами.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, аминокислотные замены можно вводить в константный участок антитела. Например, можно использовать разные аллотипы IgG1 в биспецифических к EGFR/c-Met антителах настоящего изобретения, например хорошо известный аллотип Glm17, аллотип Glm3, аллотип Glm1 или их комбинацию.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, фармакокинетические свойства биспецифических к EGFR/c-Met антител можно улучшить путем введения в домен Fc замен, модулирующих период полужизни антитела. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело содержит замену M252Y/S254T/T256E в НС1 и/или НС2, причем нумерация остатков соответствует каталогу ЕС. Было показано, что замены M252Y/S254T/T256E увеличивают период полужизни антитела (Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem.
- 36 039356
281:23514-24, 2006).
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела, имеющие консервативные замены и/или дополнительные замены в их Fc-участке, тестировали для определения их характеристик с помощью способов, описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, иммуноэффекторные свойства биспецифических к EGFR/c-Met антител могут быть усилены или ослаблены за счет модификаций Fc с помощью методик, известных специалистам в данной области. Например, эффекторные функции Fc, такие как связывание C1q, комплементзависимая цитотоксичность (CDC), антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP), уменьшение числа рецепторов на поверхности клетки (например, В-клеточного рецептора; BCR) и т.п., можно обеспечивать и/или контролировать путем модификации остатков в Fc, отвечающих за эти функции.
Антителозависимая клеточная цитотоксичность, или ADCC, представляет собой клеточноопосредованную реакцию, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие рецепторы Fc (FcRc) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени, а затем вызывают лизис клетки-мишени.
Способность моноклональных антител индуцировать ADCC можно усилить путем конструирования их олигосахаридного компонента. Человеческие IgG1 или IgG3 подвергаются N-гликозилированию по Asn297 большинством гликанов в хорошо известных 2-антенарных формах GO, GOF, G1, G1F, G2 или G2F. Антитела, продуцируемые ^сконструированными клетками СНО, как правило, имеют содержание фукозы в гликанах приблизительно по меньшей мере 85%. Удаление центральной фукозы из 2-антенарных комплексных олигосахаридов, присоединенных к Fc-участкам, усиливает ADCC антител посредством улучшенного связывания с FcyRIIIa без изменения связывания с антигеном или комплемент-зависимой (CDC) активности. Такие mAb можно получить разными способами, которые, по сообщениям, приводили к успешной экспрессии антител с относительно высоким дефукозилированием, несущих Fc-олигосахариды 2-антенарного комплексного типа, например, путем контроля осмоляльности культуры (Konno et al., Cytotechnology, 64:249-65, 2012), путем применения варианта клеточной линии СНО Lec13 в качестве клеток-хозяев (Shields et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740, 2002), путем применения варианта клеточной линии СНО ЕВ66 в качестве клеток-хозяев (Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010; Epub ahead of print; PMID:20562582), путем применения гибридомной клеточной линии YB2/0 в качестве клеток-хозяев (Shinkawa et al., J. Biol Chem 278:3466-3473, 2003), путем введения малой интерферирующей РНК, специфичной к гену α 1,6-фукозилтрансферазы (FUT8) (Mori et al., Biotechnol. Bioeng. 88:901-908, 2004) или путем коэкспрессии в-1,4-М-ацетилглюкозаминилтрансферазы III и α-маннозидазы Гольджи II или эффективного ингибитора альфа-маннозидазы I, кифунензина (Ferrara et al., J. Biol Chem 281:50325036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008).
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, ADCC, вызванную биспецифическими к EGFR/c-Met антителами, также можно усилить путем введения некоторых замен в Fc-область антитела. Примерами замен являются, например, замены в аминокислотных положениях 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 или 430 (нумерация соответствует каталогу ЕС), как описано в патенте США № US6737056.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело настоящего изобретения имеет структуру 2-антенарного гликана с содержанием фукозы в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 15%, например 15, 14, 13, 12, 11 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое к EGFR/c-Met антитело имеет структуру 2-антенарного гликана с содержанием фукозы приблизительно 50, 40, 45, 40, 35, 30, 25 или 20%.
Содержание фукозы означает количество моносахарида фукозы в пределах сахарной цепи в положении Asn297. Относительное количество фукозы представляет собой процентную долю фукозосодержащих структур относительно всех гликоструктур. Его можно охарактеризовать и количественно измерить множеством способов, например 1) при помощи MALDI-TOF (времяпролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы) образца, обработанного N-гликозидазой F (например, комплексные, гибридные, олигоманнозные и высокоманнозные структуры), как описано в международной патентной публикации США № WO 2008/077546; 2) путем ферментативного высвобождения гликанов Asn297 с последующим получением производных и обнаружением/количественной оценкой ВЭЖХ (СЭЖХ) с флуоресцентным обнаружением и/или ВЭЖХ-МС (СЭЖХ-МС); 3) путем анализа интактного белка нативного или восстановленного mAb с обработкой/без обработки гликанов Asn297 при помощи Endo S или другого фермента, выполняющего расщепление между первым и вторым GlcNAcмоносахаридами, оставляя фукозу присоединенной к первому GlcNAc; 4) путем расщепления mAb на составляющие пептиды ферментативным способом (например, трипсином или эндопептидазой Lys-C) с последующим разделением, обнаружением и количественной оценкой методом ВЭЖХ-МС (СЭЖХ-МС);
- 37 039356
5) путем отделения олигосахаридов от белка mAb методом специфического ферментативного дегликозилирования PNGase F по Asn 297. Высвобожденные таким образом олигосахариды можно пометить флуорофором, разделить и идентифицировать различными вспомогательными методиками, которые позволяют точно охарактеризовать структуры гликанов методом масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI) путем сравнения экспериментальных масс с теоретическими массами, определить степень сиалилирования ионообменной ВЭЖХ (GlycoSep С), разделить и количественно измерить формы олигосахаридов по критерию гидрофильности ВЭЖХ с обычной фазой (GlycoSep N) и разделить и количественно измерить формы олигосахаридов высокоэффективным капиллярным электрофорезом с лазерно-индуцированной флуоресценцией (HPCE-LIF).
Термин низкофукозный или с низким содержанием фукозы в настоящем документе относится к антителам с содержанием фукозы приблизительно 1-15%.
Термин нормальнофукозный или с нормальным содержанием фукозы в настоящем документе относится к антителам с содержанием фукозы приблизительно более 50%, как правило, приблизительно более 80 или более 85%.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложены синтетические нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые цепи и легкие цепи биспецифических антител настоящего изобретения, связывающихся с EGFR/c-Met, в виде выделенных полинуклеотидов, или в виде частей экспрессионных векторов, или в виде частей линейных последовательностей ДНК, включая линейные последовательности ДНК, применяемые для транскрипции/трансляции in vitro, векторов, совместимых с экспрессией, секрецией и/или представлением композиций или результатов их направленного мутагенеза в прокариотах, эукариотах или нитчатых фагах.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 205, 206, 207 или 208.
Полинуклеотиды настоящего изобретения можно получить путем химического синтеза, такого как синтез в твердой фазе полинуклеотидов на автоматическом синтезаторе полинуклеотидов, и сборки в полные одно- или двухцепочечные молекулы. Альтернативно, полинуклеотиды настоящего изобретения можно получить другими методиками, такими как ПЦР с последующим стандартным клонированием. Методики производства или получения полинуклеотидов с заданной известной последовательностью хорошо известны в данной области.
Полинуклеотиды настоящего изобретения могут содержать по меньшей мере одну некодирующую последовательность, такую как промоторная или энхансерная последовательность, интрон, сигнал полиаденилирования, cis-последовательность, облегчающую связывание с RepA, и т.п. Полинуклеотидные последовательности также могут содержать дополнительные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, которые кодируют, например, маркерную последовательность или последовательность тега, такую как гистидиновый тег или НА-тег, для облегчения очистки или обнаружения белка, сигнальную последовательность, партнер для слитного белка, такой как RepA, Fc или белок покрытия бактериофага, такой как pIX или pIII.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, предложен вектор, содержащий полинуклеотид настоящего изобретения. Такие векторы могут представлять собой плазмидные векторы, вирусные векторы, векторы для экспрессии бакуловируса, векторы на основе транспозонов или любые другие векторы, подходящие для введения полинуклеотида настоящего изобретения в данный организм или в данное генетическое окружение каким-либо образом. Например, полинуклеотиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи биспецифических антител настоящего изобретения, можно ввести в экспрессионные векторы. Легкую и тяжелую цепи можно клонировать в одном или в разных векторах экспрессии. ДНК-сегменты, кодирующие иммуноглобулиновые цепи, могут быть функционально соединены в векторе(ах) экспрессии с управляющими последовательностями, обеспечивающими экспрессию иммуноглобулиновых полипептидов. К таким управляющим последовательностям относятся сигнальные последовательности, промоторы (например, естественно ассоциированные или гетерологичные промоторы), энхансерные элементы и останавливающие транскрипцию последовательности, и их можно выбирать так, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии антитела. После введения вектора в соответствующего хозяина можно провести инкубацию хозяина в условиях, подходящих для высокоуровневой экспрессии белков, кодируемых введенными синтетическими полинуклеотидами.
Как правило, подходящие экспрессионные векторы могут подвергаться репликации в организмаххозяевах либо в виде эписом, либо в виде неотъемлемой части хромосомной ДНК хозяина. Обычно экспрессионные векторы содержат маркеры селекции, например, резистентность к ампициллину, резистентность к гигромицину, резистентность к тетрациклину, резистентность к канамицину или резистентность к неомицину, чтобы можно было выполнить обнаружение клеток, трансформированных желательными последовательностями ДНК.
В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, предложена клеткахозяин, содержащая вектор настоящего изобретения. Термин клетка-хозяин относится к клетке, в которую вводят вектор. Следует понимать, что термин клетка-хозяин означает не только конкретную клет- 38 039356 ку субъекта, но и потомков такой клетки. Так как в последующих поколениях могут возникнуть некоторые модификации вследствие либо мутации, либо воздействий среды, такое потомство может быть не идентичным исходной клетке, но оно также может быть охвачено термином клетка-хозяин. Такими клетками-хозяевами могут быть эукариотические, прокариотические, растительные клетки или клетки архей.
Примерами эукариотических клеток могут быть клетки млекопитающих, насекомых, птиц или другие клетки животного происхождения. Эукариотические клетки млекопитающих включают иммортализованные клеточные линии, такие как гибридомы или клеточные линии миеломы, например, SP2/0 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), г. Манассас, штат Вирджиния, США, CRL-1581), NS0 (Европейская коллекция клеточных культур (ЕСАСС), г. Солсбери, Уилтшир, Великобритания, ЕСАСС № 85110503), FO (АТСС CRL-1646) и Ag653 (АТСС CRL-1580) мышиные клеточные линии. Обычно используется линия клеток миеломы человека U266 (АТТС CRL-TIB-196). Другие полезные клеточные линии включают линии, полученные из яичников китайского хомячка (СНО), например линии CHO-K1SV (Lonza Biologics, г. Уолкерсвилл, штат Мэриленд, США), СНО-Ki (АТСС CRL-61) или DG44.
Использование биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, биспецифических к EGFR/c-Met антител и связывающихся с EGFR или c-Met доменов FN3 настоящего изобретения.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домен FN3, связывающиеся с EGFR домены FN3, связывающиеся с c-Met домены FN3 или биспецифические к EGFR-c-Met антитела настоящего изобретения можно использовать для диагностики, отслеживания, модуляции, лечения, ослабления, помощи при профилактике развития или облегчения симптомов заболевания человека или конкретных патологий клеток, тканей, органов, текучей среды или по существу хозяина. Способы настоящего изобретения можно использовать для лечения любого пациента-животного в рамках любой классификации. Примеры таких животных включают млекопитающих, таких как люди, грызуны, собаки, кошки и сельскохозяйственные/домашние животные.
Один аспект настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования роста или пролиферации клеток, экспрессирующих EGFR и/или c-Met, включающий приведение в контакт клеток с выделенной биспецифической к EGFR/c-Met молекулой, содержащей домен FN3, доменом FN3, связывающимся с EGFR, доменом FN3, связывающимся с c-Met, или биспецифическим к EGFR/c-Met антителом настоящего изобретения.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ ингибирования роста или метастазирования экспрессирующих EGFR и/или c-Met опухолевых или раковых клеток у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества выделенной биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, домена FN3, связывающегося с EGFR, домена FN3, связывающегося с cMet, или биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения таким образом, чтобы ингибировать рост или метастазирование экспрессирующих EGFR и/или c-Met опухолевых или раковых клеток.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ лечения субъекта, имеющего рак, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенной биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3, домена FN3, связывающегося с EGFR, домена FN3, связывающегося с c-Met, или биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретении нуждающемуся в лечении пациенту в течение периода времени, достаточного для лечения рака.
Биспецифическую к EGFR/c-Met молекулу, содержащую домен FN3, FN3-домен, связывающийся с EGFR, или FN3-домен, связывающийся с c-Met, или биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения можно использовать для лечения любого заболевания или расстройства, характеризующегося аномальной активацией или продукцией EGFR, c-Met, EGF, растворимого EGF, растворимого cMet или другого лиганда EGFR или HGF, или расстройства, связанного с экспрессией EGFR или c-Met, которые могут быть связаны или не связаны со злокачественными образованиями или раком, в которых аномальная активация и/или продукция EGFR, c-Met, EGF или другого лиганда EGFR или HGF происходит в клетках или тканях субъекта, имеющего заболевание или расстройство, или субъекта, предрасположенного к заболеванию или расстройству.
Домены FN3 настоящего изобретения, специфически связывающиеся с c-Met и блокирующие связывание HGF с c-Met, можно использовать для лечения опухолей, включая раковые и доброкачественные опухоли. Виды рака, поддающиеся лечению посредством доменов FN3 настоящего изобретения, связывающихся с c-Met, включают виды, связанные со сверхэкспрессией c-Met. Примеры видов рака, поддающихся лечению с помощью доменов FN3 настоящего изобретения, включают виды рака эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак простаты, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак желудка, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, тестикулярный рак, рак желудка и рак тимуса.
Домены FN3 настоящего изобретения, специфически связывающиеся с EGFR и блокирующие связывание EGF с EGFR, можно использовать для лечения опухолей, включая раковые и доброкачествен- 39 039356 ные опухоли. Виды рака, поддающиеся лечению посредством доменов FN3 настоящего изобретения, включают виды, связанные со сверхэкспрессией EGFR, или их варианты. Примеры видов рака, поддающихся лечению посредством доменов FN3 настоящего изобретения, включают виды рака эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак простаты, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, тестикулярный рак, рак желудка и рак тимуса. Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домен FN3, или биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения можно использовать для лечения опухолей, включая раковые заболевания и доброкачественные опухоли. Примерами раковых заболеваний, поддающихся лечению биспецифической к EGFR/c-Met молекулой настоящего изобретения, содержащей домен FN3, или биспецифическим к EGFR/c-Met антителом настоящего изобретения являются раковые заболевания со сверхэкспрессией EGFR и/или c-Met, раковые заболевания с повышенной активностью и/или уровнем экспрессии EGFR (например, с активирующей EGFR мутацией, амплификацией гена EGFR или опосредованной лигандом активацией EGFR) и с повышенной активностью и/или уровнем экспрессии c-Met (например, с активирующей c-Met мутацией, амплификацией гена c-Met или опосредованной лигандом активацией c-Met).
Примеры активирующих EGFR мутаций, которые могут быть связаны с раком, включают точечные мутации, мутации делеции, мутации вставки, инверсии или амплификации генов, которые приводят к усилению по меньшей мере одной биологической активности EGFR, такой как повышение тирозинкиназной активности, формирование гомодимеров или гетеродимеров рецепторов, улучшение связывания с лигандом и т. п. Мутации могут локализоваться в любой части гена EGFR или регуляторных участках, связанных с геном EGFR, и включают мутации в экзоне 18, 19, 20 или 21 или мутации в киназном домене. Примеры активирующих EGFR мутаций представляют собой замены G719A, L861X (X представляет собой любую аминокислоту), L858R, Е746К, L747S, E749Q, А750Р, A755V, V765M, L858P или Т790М, делецию Е746-А750, делецию R748-P753, вставку Ala между М766 и А767, вставку SVA (Ser, Val, Ala) между S768 и V769 и вставку NS (Asn, Ser) между Р772 и H773. Другие примеры активирующих EGFR мутаций известны в данной области (см. например, патентную публикацию США № US 2005/0272083). Информация о EGFR и других рецепторах ErbB, включая гомо- и гетеродимерные рецепторы, лиганды рецепторов, сайты аутофосфорилирования и сигнальные молекулы, участвующие в опосредованной ErbB сигнализации, известна в данной области (см., например, Hynes and Lane, Nature Reviews Cancer, 5:341-354, 2005).
Примеры активирующих c-Met мутаций включают точечные мутации, мутации делеции, мутации вставки, инверсии или амплификации генов, которые приводят к усилению по меньшей мере одной биологической активности белка c-Met, такой как повышение тирозинкиназной активности, формирование гомодимеров или гетеродимеров рецепторов, улучшение связывания с лигандом и т.п. Мутации могут локализоваться в любой части гена c-Met или регуляторных участках, связанных с геном, например мутации в киназном домене c-Met. Примеры активирующих c-Met мутаций представляют собой мутации по положениям остатков N375, V13, V923, R175, V136, L229, S323, R988, S1058/T1010 и Е168. Способы обнаружения мутаций или амплификаций генов EGFR и c-Met хорошо известны.
Примерами раковых заболеваний, поддающихся лечению биспецифическими молекулами настоящего изобретения, такими как биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения, являются рак эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), легочная аденокарцинома, мелкоклеточный рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак простаты, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак глотки, рак носа, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак языка, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, тестикулярный рак, рак желудка, рак тимуса, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак печени (гепатоклеточная карцинома (НСС)) или спорадическая или наследственная папиллярная почечная карцинома (PRCC).
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ лечения субъекта, имеющего рак, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения нуждающемуся в этом пациенту в течение периода времени, достаточного для лечения рака, причем субъект является гомозиготным по фенилаланину в положении 158 в CD16 (генотип FcyRIIIa-158F/F) или гетерозиготным по валину и фенилаланину в положении 158 в CD16 (генотип FcyRHIa-158F/V). CD16 также известен как Fc-гамма рецептор IIIa (FcyRHIa) или низкоаффинный рецептор к Fc-участку иммуноглобулина гамма, изоформа III-А. Было показано, что полиморфизм валин/фенилаланин (V/F) в белке FcyRIIIa в положении 158 отрицательно влияет на аффинность FcyRIIIa к человеческому IgG. Рецептор с полиморфизмами FcyRIIIa-158F/F или FcyRHIa158F/V демонстрирует сниженное связывание с Fc и, таким образом, сниженную ADCC по сравнению с FcyRHIa-158V/V. Отсутствие или низкое количество фукозы в N-связанных олигосахаридах увеличивает способность антител индуцировать ADCC вследствие улучшенного связывания антител с человеческим FcyRHIa (CD16) (Shields et al., J. Biol. Chem. 277:26733-40, 2002). Антитела настоящего изобретения
- 40 039356 имеют сниженное содержание фукозы в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 10%. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое к EGFR/c-Met антитело имеет гликановую структуру с содержанием фукозы приблизительно 50, 40, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%. Таким образом, антитела настоящего изобретения могут быть более эффективными при лечении пациентов с генотипами FcyRIIIa-158F/F или FcyRIIIa-158F/V. Пациентов можно проанализировать на их полиморфизм FcyRIIIa с помощью стандартных способов.
В некоторых способах, описанных в настоящем документе, антитела настоящего изобретения можно использовать для лечения субъекта, имеющего рак, который резистентен или приобрел резистентность к лечению одним или более ингибиторами EGFR. Примеры ингибиторов EGFR, к которым рак может приобретать резистентность, представляют собой антитела к EGFR цетуксимаб (Erbitux®), пантинумумаб (Vectibix®), матузумаб, нимотузумаб, низкомолекулярные ингибиторы EGFR Tarceva® (эрлотиниб), IRESSA (гефитиниб), EKB-569 (пелитиниб, необратимый ингибитор тирозинкиназы EGFR), ингибиторы пан-ErbB и другие ингибиторы рецепторных тирозинкиназ, лапатиниб (ингибитор EGFR и HER2), пелитиниб (ингибитор EGFR и HER2), вандетаниб (ZD6474, ZACTIMA™, EGFR, VEGFR2 и RET TKI), PF00299804 (дакомитиниб, необратимый пан-erbB тирозинкиназный ингибитор), CI-1033 (необратимый пан-ErbB тирозинкиназный ингибитор), афатиниб (BIBW2992, необратимый пан-ErbB тирозинкиназный ингибитор), AV-412 (двойной ингибитор EGFR и ErbB2), EXEL-7647 (ингибитор EGFR, ErbB2, GEVGR и EphB4), CO-1686 (необратимый мутант-селективный ингибитор тирозинкиназы EGFR), AZD9291 (необратимый мутант-селективный тирозинкиназный ингибитор EGFR) и HKI-272 (нератиниб, необратимый ингибитор EGFR/ErbB2). Способы, описанные в настоящем документе, можно использовать для лечения рака, резистентного к лечению гефитинибом, эрлотинибом, афатинибом, СО-1686, AZD9291 и/или цетуксимабом. Примером антитела, которое можно использовать, является EM1-mAb.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ лечения субъекта, имеющего рак, включающий введение нуждающемуся в лечении пациенту терапевтически эффективного количества выделенного биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения в течение периода времени, достаточного для лечения рака, причем субъект является резистентным или приобрел резистентность к лечению эрлотинибом, гефитинибом, афатинибом, СО-1686, AZD9291 или цетуксимабом.
Для определения того, имеет ли субъект резистентность, приобретенную резистентность или предрасположенность к приобретению резистентности к лечению ингибитором EGFR, можно использовать различные качественные и/или количественные способы. Симптомы, которые могут быть связаны с резистентностью к ингибитору EGFR, включают, например, ухудшение или отсутствие улучшения состояния здоровья пациента, увеличение размера опухоли, прекращение или замедление торможения роста опухоли и/или распространение раковых клеток в организме из одного места к другим органам, тканям или клеткам. Показателем того, что у субъекта развилась резистентность или имеется предрасположенность к развитию резистентности к ингибиторам EGFR, также может быть повторное появление или ухудшение различных симптомов, связанных с раком, таких как анорексия, когнитивные расстройства, депрессия, одышка, утомляемость, гормональные нарушения, нейтропения, боль, периферическая нейропатия и половые дисфункции. Симптомы, связанные с раком, могут варьироваться в зависимости от типа рака. Например, симптомы, связанные с раком шейки матки, могут включать аномальное кровотечение, нетипично сильные выделения из влагалища, боли в области таза, не связанные с нормальным менструальным циклом, боли в мочевом пузыре или при мочеиспускании и кровотечение в промежутке между нормальными менструальными периодами, после полового сношения, спринцевания или обследования органов таза. Симптомы, связанные с раком легких, могут включать устойчивый кашель, откашливание крови, нехватку дыхания, дыхание с присвистом и болью в груди, потерю аппетита, потерю веса без стремления к похудению и утомляемость. Симптомы рака печени могут включать потерю аппетита и веса, боли в брюшной полости, особенно в верхней правой части живота, которые могут отдавать в спину и плечо, тошноту и рвоту, общую слабость и утомляемость, увеличение печени, вздутие живота (асцит) и желтую окраску кожи и белков глаз (желтуха). Специалист-онколог может легко идентифицировать симптомы, связанные с конкретным типом рака.
Другие способы определения развития резистентности к ингибитору EGFR включают исследование фосфорилирования EGFR, фосфорилирования ERK1/2 и/или фосфорилирования AKT в раковых клетках, где повышенное фосфорилирование может быть показателем того, что субъект имеет приобретенную резистентность или предрасположенность к развитию резистентности к ингибитору EGFR. Способы определения фосфорилирования EGFR, ERK1/2 и/или AKT хорошо известны и описаны в настоящем документе. Идентификация пациента с развившейся резистентностью к ингибитору EGFR может включать обнаружение повышенного уровня экспрессии c-Met или повышенной активности c-Met, например, связанной с повышенным уровнем циркулирующего HGF, активирующей мутацией гена c-Met или амплификацией гена с-Met.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ лечения NSCLC у пациента, имеющего опухоль NSCLC или метастазирование опухоли, имеющей активирующую EGFR мутацию или амплификацию гена EGFR, включающий введение пациенту терапевтически
- 41 039356 эффективного количества биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения можно использовать для лечения немелкоклеточного рака легких (NSCLC), включая плоскоклеточную карциному, аденокарциному и крупноклеточную карциному. В некоторых вариантах осуществления клетки NSCLC имеют эпителиальный фенотип. В некоторых вариантах осуществления NSCLC имеет приобретенную резистентность к лечению с использованием одного или более ингибиторов EGFR.
В NSCLC конкретные мутации гена EGFR связаны с высокой частотой ответа (70-80%) на ингибиторы тирозинкиназы EGFR (EGFR-TKI). С чувствительностью к EGFR-TKI связана делеция 5 аминокислот в экзоне 19 или точечная мутация L858R в EGFR (Nakata and Gotoh, Expert. Opin. Ther. Targets, 16:771-781, 2012). Такие мутации приводят к лиганд-независимой активации киназной активности EGFR. Активирующие EGFR мутации наблюдаются у 10-30% пациентов с NSCLC, и они в значительно большей степени распространены у восточных азиатов, женщин, никогда не куривших людей и пациентов с гистологией, характерной для аденокарциномы (Janne and Johnson, Clin. Cancer Res. 12(14 Suppl):4416s4420s, 2006). Амплификация гена EGFR также в значительной степени коррелирует с ответом после лечения EGFR-TKI (Cappuzzo et al., J. Natl. Cancer Inst. 97:643-55, 2005).
Хотя большинство пациентов с NSCLC с мутациями EGFR изначально отвечают на терапию EGFR TKI, практически у всех развивается резистентность, предотвращающая устойчивый ответ. У 50-60% пациентов резистентность развивается из-за точечной мутации второй локализации в киназном домене EGFR (T790M). Почти в 60% всех опухолей, ставших резистентными к ингибиторам тирозинкиназы EGFR, увеличивается экспрессия c-Met, амплифицируется ген c-Met или увеличивается уровень единственного известного лиганда, HGF (Turke et al., Cancer Cell, 17:77-88, 2010).
Другие варианты осуществления настоящего изобретения представляют собой способ лечения пациента, имеющего рак, включающий введение нуждающемуся в лечении пациенту терапевтически эффективного количества биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения в течение периода времени, достаточного для лечения рака, причем рак связан с активирующей EGFR мутацией, амплификацией гена EGFR, повышенным уровнем циркулирующего HGF, активирующей c-Met мутацией или амплификацией гена c-Met.
В некоторых вариантах осуществления активирующая EGFR мутация представляет собой замену G719A, G719X (X представляет собой любую аминокислоту), L861X (X представляет собой любую аминокислоту), L858R, Е746К, L747S, E749Q, А750Р, A755V, V765M, L858P или Т790М, делецию Е746-А750, делецию R748-P753, вставку Ala (А) между М766 и А767, вставку Ser, Val и Ala (SVA) между S768 и V769 и вставку Asn и Ser (NS) между Р772 и Н773.
Другие варианты осуществления настоящего изобретения представляют собой способы лечения пациента, имеющего рак, включающий введение нуждающемуся в лечении пациенту терапевтически эффективного количества биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения в течение периода времени, достаточного для лечения рака, причем рак связан с мутацией EGFR L858R, Т790М или делецией остатков Е746-А750 (del (E746, А750)), амплификацией EGFR или амплификацией c-Met.
В некоторых вариантах осуществления рак связан с EGFR дикого типа и c-Met дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления рак связан с EGFR дикого типа и амплификацией с-Met.
В некоторых вариантах осуществления рак связан с мутациями в EGFR L858R и Т790М и c-Met дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления рак связан с делецией в EGFR del (E764, А750) и с-Met дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления рак связан с делецией в EGFR del (E764, А750) и амплификацией c-Met.
В некоторых вариантах осуществления рак связан с делецией в EGFR del (E764, А750), амплификацией EGFR и амплификацией c-Met.
В некоторых вариантах осуществления пациент имеет NSCLC, связанный с мутациями в EGFR L858R и Т790М и c-Met дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления пациент имеет NSCLC, связанный с амплификацией EGFR и c-Met дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления пациент имеет NSCLC, связанный с амплификацией EGFR и амплификацией c-Met.
В некоторых вариантах осуществления пациент имеет NSCLC, связанный с делецией в EGFR del (E764, А750) и c-Met дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления пациент имеет NSCLC, связанный с делецией в EGFR del (E764, А750) и амплификацией c-Met.
В некоторых вариантах осуществления пациенты получают лечение EM1-mAb настоящего изобретения. Антитело EM1-mAb настоящего изобретения демонстрирует эффективность в животных моделях опухолей in vivo, когда опухоли связаны с мутациями L858R, Т790М, del (Е746, А750) в EGFR, амплификацией EGFR, диким типом c-Met и/или амплификацией c-Met. Амплификацию EGFR или c-Met можно оценивать стандартными способами, например путем определения числа копий гена EGFR или c-Met
- 42 039356 с помощью саузерн-блоттинга, FISH или сравнительной геномной гибридизации (CGH).
Другие варианты осуществления настоящего изобретения представляют собой способ лечения пациента, имеющего рак, включающий введение нуждающемуся в лечении пациенту терапевтически эффективного количества биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения в течение периода времени, достаточного для лечения рака, причем рак связан с мутацией EGFR L858R, Т790М или делецией остатков Е746-А750 (del (E746, А750)), амплификацией EGFR или амплификацией c-Met и мутантным KRAS.
В некоторых вариантах осуществления мутантный KRAS имеет замену G12V. KRAS относится к семейству протоонкогенов RAS, кодирующих гуанозинтрифосфатазы (ГТФазы), и опосредует трансдукцию сигнала EGFR ниже от рецептора. Таким образом, ожидается, что опухоли с мутациями протоонкогенного KRAS, например с активирующей мутацией G12V или G12C, не будут поддаваться лечению антителами EGFR. Клинические исследования антител к EGFR, таких как цетуксимаб и панитумумаб, продемонстрировали, что пациенты с колоректальными опухолями, имеющими мутацию KRAS, не отвечают на лечение этими агентами (Van Cutsem et al., N. Eng. J. Med. 360:1408-1417, 2009; Lievre et al., J. Clin. Oncol. 26:374-379, 2008; Amado et al., J. Clin. Oncol. 26:1626-1634m 2008). Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения опосредуют уничтожение клеточной линии с мутантным KRAS посредством эффективной ADCC и, таким образом, в отличие от существующих видов терапии антителами к EGFR, могут быть эффективны при лечении пациентов, у которых рак связан с мутациями, активирующими KRAS. Примером такого антитела является EM1-mAb.
Термины лечить или лечение обозначают как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры, причем целью является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или расстройства, например, развития или распространения рака. Для целей настоящего изобретения преимущественные или желательные клинические результаты включают, без ограничений, облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизацию состояния (т. е. отсутствие ухудшения), задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное улучшение состояния и ремиссию (полную или частичную), как обнаружимые, так и не обнаружимые. Лечение также может обозначать продление срока жизни по сравнению с ожидаемым в отсутствие лечения. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают тех, кто уже имеет состояние или расстройство, а также тех, кто имеет предрасположенность к состоянию или расстройству, или тех, у кого состояние или расстройство необходимо предотвратить.
Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения может изменяться в зависимости от факторов, таких как состояние болезни, возраст, пол и вес индивида, а также способности биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения вызывать желательный ответ у индивида. Примеры показателей эффективности терапевтического средства с EGFR/c-Met, которые могут снижаться или ослабевать при резистентности, включают, например, улучшение состояния здоровья пациента, уменьшение или сокращение размера опухоли, прекращение или замедление роста опухоли и/или отсутствие метастазирования раковых клеток в другие места в организме.
Введение/фармацевтические композиции.
В настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие биспецифическое к EGFR/c-Met антитело настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Для терапевтического применения биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домен FN3, домены FN3, связывающиеся с EGFR, домены FN3, связывающиеся с c-Met, или биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения можно получить в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество домена, молекулы или антитела в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которыми вводят активное соединение. Такие носители могут быть жидкостями, такими как вода и масла, включая масла, получаемые из нефти, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т. п. Например, можно использовать 0,4%-ный соляной раствор и 0,3%-ный раствор глицина. Эти растворы стерильны и по существу не содержат твердых примесей. Затем стерилизацию проводят с использованием стандартных хорошо известных методик стерилизации (например, фильтрования). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для соответствующих физиологических условий, такие как регулирующие рН и буферные агенты, стабилизирующие, сгущающие, увлажняющие и окрашивающие агенты и т.п. Концентрация молекул или антител настоящего изобретения в таком фармацевтическом составе может значительно варьироваться, т.е. от менее чем приблизительно 0,5%, обычно по меньшей мере приблизительно 1% и до 15 или 20% вес, и определяется преимущественно на основе необходимой дозы, объемов текучей среды, значений вязкости и т.п. в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Подходящие носители и составы, включая другие белки человека, например сывороточный альбумин человека, описаны, например, в
- 43 039356
Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins,
Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing, p. 691-1092, см. особенно p. 958-989.
Способ введения для терапевтического применения биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, доменов FN3, связывающихся с EGFR, доменов FN3, связывающихся с c-Met, или биспецифических к EGFR/c-Met антител настоящего изобретения может представлять собой любой подходящий способ, доставляющий агент к хозяину, такой как парентеральное введение, например внутрикожное, внутримышечное, интраперитонеальное, внутривенное или подкожное, легочное, трансмукозальное (пероральное, интраназальное, интравагинальное, ректальное), введение с применением состава в виде таблетки, капсулы, раствора, порошка, геля, частицы и введение содержимого в шприце, имплантируемом устройстве, осмотическом насосе, кассете, микронасосе или другие средства, известные специалистам, а также известные в данной области. Специфическое введение в область можно обеспечить, например, путем доставки в сустав, бронхи, брюшную полость, внутрь капсулы, в хрящ, полость, клетку, мозжечок, желудочек мозга, толстую кишку, шейку матки, желудок, печень, миокард, кость, таз, перикард, полость живота, плевру, простату, легкие, прямую кишку, почку, сетчатку, позвоночник, суставную сумку, грудную клетку, матку, сосуд, внутрь мочевого пузыря, в поврежденную ткань, вагинально, ректально, буккально, сублингвально, интраназально или трансдермально.
Таким образом, фармацевтическую композицию настоящего изобретения для внутримышечной инъекции можно получить с содержанием 1 мл стерильной забуференной воды и от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мг/кг, например, от приблизительно 50 нг до приблизительно 30 мг/кг или более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 25 мг/кг биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3, домены FN3, связывающиеся с EGFR, или домены FN3, связывающиеся с c-Met, настоящего изобретения.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения можно вводить пациенту любым подходящим способом, например парентерально, путем внутривенной (в/в) инфузии или болюсной инъекции, внутримышечно, подкожно или интраперитонеально. Внутривенную инфузию можно проводить в течение лишь 15 мин, но чаще - в течение 30, 60, 90 мин или даже 2 или 3 ч. Биспецифические к EGFR/cMet антитела настоящего изобретения также можно вводить непосредственно в область заболевания (например, в саму опухоль). Доза, вводимая пациенту, имеющему рак, достаточна для того, чтобы облегчить или по меньшей мере частично затормозить подвергаемое лечению заболевание (терапевтически эффективное количество), и может иногда составлять от 0,1 до 10 мг/кг веса тела, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг, но может быть даже выше, например 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг. Также можно обеспечивать фиксированную разовую дозу, например 50, 100, 200, 500 или 1000 мг, или доза может зависеть от площади поверхности тела пациента, например 400, 300, 250, 200 или 100 мг/м2. Для лечения рака обычно вводят от 1 до 8 доз (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8), но можно вводить 10, 12, 20 или более доз. Введение биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения можно повторять через одни сутки, двое суток, трое суток, четверо суток, пять суток, шесть суток, одну неделю, две недели, три недели, один месяц, пять недель, шесть недель, семь недель, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев или более. Также возможны повторные курсы лечения в виде хронического применения. Повторное введение можно проводить в той же дозе или в другой дозе.
Например, фармацевтическую композицию, содержащую биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения, для внутривенной инфузии можно приготовить таким образом, чтобы она содержала приблизительно 200 мл стерильного раствора Рингера и от приблизительно 8 до приблизительно 2400 мг, от приблизительно 400 до приблизительно 1600 мг или от приблизительно 400 до приблизительно 800 мг биспецифического к EGFR/c-Met антитела для введения пациенту весом 80 кг. Способы получения композиций для парентерального введения хорошо известны и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домен FN3, домены FN3, связывающиеся с EGFR, домены FN3, связывающиеся с c-Met, и биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения можно лиофилизировать для хранения и перед применением восстановить в подходящем носителе. Было показано, что данная методика эффективна для стандартных белковых препаратов, при этом можно использовать хорошо известные методики лиофилизации и восстановления.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы, содержащие домен FN3, домены FN3, связывающиеся с EGFR, домены FN3, связывающиеся с c-Met, и биспецифические к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения можно вводить в комбинации со вторым терапевтическим агентом одновременно, последовательно или по отдельности. Второй терапевтический агент может представлять собой химиотерапевтический агент или средство для таргетной противораковой терапии.
Биспецифическое к EGFR/c-Met антитело настоящего изобретения можно вводить вместе с любым одним или более из химиотерапевтических лекарственных средств или другими противораковыми терапевтическими средствами, известными в данной области. Химиотерапевтические агенты представляют собой химические соединения, подходящие для лечения рака, включают ингибирующие рост или другие цитотоксические агенты и включают алкилирующие агенты, антиметаболические средства, ингибиторы микротрубочек, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы рецепторных тирозинкиназ, ингибиторы роста
- 44 039356 сосудов и т.п. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®); алкилсульфонаты, такие как бисульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохион, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамин и триметилоломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамин, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтаминоксид гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицины, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-b-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, куэламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболические средства, такие как метотрексат и 5-FU; аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренергические средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихион; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазихион; 2,2',2-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-С); циклофосфамид; тиротепа; члены семейства таксоида или таксана, такие как паклитаксел (TAXOL® доцетаксел (TAXOTERE®) и его аналоги; хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевую кислоту; эсперамицины; капецитабин; ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и/или ангиогенеза, такие как сорафениб (NEXAVAR®), сунитиниб (SUTENT®), пазопаниб (VOTRIENT™), тоцераниб (PALLADIA™), вандетаниб (ZACTIMA™), цедираниб (RECENTIN®), регорафениб (BAY 73-4506), акситиниб (AG013736), лестауртиниб (СЕР-701), эрлотиниб (TARCEVA®), гефитиниб (IRESSA™), BIBW 2992 (TOVOK™), лапатиниб (TYKERB®), нератиниб (HKI-272) и т. п., и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых указанных выше соединений. Также данное определение включает антигормональные средства, которые регулируют или ингибируют воздействие гормонов на опухоль, такие как антиэстрогеновые вещества, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен (FARESTON®); а также антиандрогенные средства, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любых указанных выше соединений. Другие традиционные химические соединения цитотоксического действия, описанные в Wiemann et al., 1985, in Medical Oncology (Calabresi et aL, eds.), Chapter 10, McMillan Publishing, также применимы к способам настоящего изобретения.
К примерам агентов, которые можно использовать в комбинации с биспецифическими к EGFR/c-Met молекулами, содержащими домен FN3, доменами FN3, связывающимися с EGFR, доменами FN3, связывающимися с c-Met, и биспецифическими к EGFR/c-Met антителами настоящего изобретения, относятся ингибиторы тирозинкиназ и таргетные противораковые препараты, такие как Iressa® (гефитиниб) и Tarceva (эрлотиниб), а также другие антагонисты HER2, HER3, HER4 или VEGF. Примеры антагонистов HER2 включают СР-724-714, HERCEPTIN™ (трастузумаб), OMNITARG™ (пертузумаб), TAK-165, лапатиниб (ингибитор EGFR и HER2) и GW-282974. Примеры антагонистов HER3 включают антитела к Her3 (см. например, патентную публикацию США № US 2004/0197332). Примеры антагонистов HER4 включают миРНК к HER4 (см., например, Maatta et al., Mol. Biol. Cell, 17:67-79, 2006. Пример антагониста VEGF представляет собой бевацизумаб (Avastin™).
Когда низкомолекулярное соединение применяется в комбинации с биспецифическим к EGFR/c-Met антителом настоящего изобретения, его, как правило, вводят чаще, предпочтительно один раз в сутки, но также возможно вводить 2, 3, 4 или более раз в сутки, а также каждые два дня, раз в неделю или с некоторым другим интервалом. Низкомолекулярные лекарственные средства часто вводят перорально, но также возможно парентеральное введение, например в/в инфузия, болюсная инъекция, подкожное или внутримышечное введение. Дозы низкомолекулярных лекарственных средств, как правило,
- 45 039356 могут составлять от 10 до 1000 мг или приблизительно 100, 150, 200 или 250 мг.
При введении биспецифического к EGFR/c-Met антитела настоящего изобретения в комбинации со вторым терапевтическим агентом комбинация может иметь место в любом удобном временном промежутке. Например, биспецифическое к EGFR/c-Met антитело и второй терапевтический агент можно вводить пациенту в один и тот же день и даже в одной и той же внутривенной инфузии. Однако биспецифическое к EGFR/c-Met антитело и второй терапевтический агент также можно вводить в чередующиеся дни или чередующиеся недели, двухнедельные промежутки или месяцы и т.д. В некоторых способах биспецифическое к EGFR/c-Met антитело и второй терапевтический агент вводят достаточно близко по времени друг к другу, так что они одновременно присутствуют (например, в сыворотке) в обнаружимых уровнях у получающего лечение пациента. В некоторых способах весь курс лечения биспецифическим к EGFR/c-Met антителом состоит из введения некоторого числа доз в течение периода времени, за которым следует или которому предшествует курс лечения вторым терапевтическим агентом, который также состоит из введения некоторого числа доз. В некоторых способах лечение биспецифическим к EGFR/c-Met антителом, вводимым во вторую очередь, начинается, если у пациента имеется резистентность или развивается резистентность ко второму терапевтическому агенту, вводимому изначально. Пациент может получать только один курс или множество курсов лечения одним или обоими из биспецифического к EGFR/c-Met антитела и второго терапевтического агента. Можно использовать период восстановления 1, 2 или несколько дней или недель между введением биспецифического к EGFR/c-Met антитела и второго терапевтического агента. Когда установлена подходящая схема лечения вторым терапевтическим агентом, эту схему можно применять в комбинации с биспецифическим к EGFR/c-Met антителом настоящего изобретения. Например, Tarceva® (эрлотиниб) принимают в виде пилюль 100 или 150 мг один раз в сутки, a Iressa® (гефитиниб) принимают в виде таблетки 250 мг один раз в сутки.
Биспецифическое к EGFR/c-Met антитело, необязательно в комбинации со вторым терапевтическим агентом, можно вводить вместе с любой формой радиационной терапии, включая внешнее направленное излучение, радиационную терапию с модуляцией интенсивности (IMRT), а также любой формой радиохирургии, включая Gamma Knife, Cyberknife, Linac и внутритканевое облучение (например, имплантированные радиоактивные зерна, баллон GliaSite), и/или хирургическим лечением. Комбинация с радиационной терапией особенно уместна для лечения рака головы и шеи и опухолей мозга.
Хотя настоящее изобретение описано в общих чертах, варианты осуществления настоящего изобретения более подробно описаны в следующих примерах, которые не следует толковать как ограничивающие объем формулы изобретения.
Пример 1. Создание библиотек Tencon.
Tencon (SEQ ID NO: 1) представляет собой каркасный иммуноглобулин-подобный домен фибронектина типа III (FN3), разработанный на основе консенсусной последовательности 15 доменов FN3 тенасцина-С человека (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; патентная публикация США № 2010/0216708). На кристаллической структуре Tencon выявляются шесть поверхностных петель, соединяющих семь бета-тяжей. Данные петли или выбранные остатки в пределах каждой петли можно подвергать рандомизации с созданием библиотеки доменов фибронектина типа III (FN3), которые можно использовать для выбора новых молекул, связывающихся с конкретными мишенями.
Tencon:
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIY GVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO 1):
Создание библиотеки TCL1.
Библиотека, разработанная с рандомизацией только петли FG в Tencon (SEQ ID NO: 1), TCL1, была создана для применения с cis-дисплейной системой (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012). В данной системе создается одноцепочная ДНК, в которую включены последовательности для промотора Тас, кодовая последовательность библиотеки Tencon, кодовая последовательность RepA, cis-элемент и ori-элемент. При экспрессии в системе транскрипции/трансляции in vitro формируется комплекс слитного белка Tencon-RepA, связанный в cis с ДНК, которая его кодирует. Затем комплексы, связывающиеся с молекулой-мишенью, выделяют и амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано ниже.
Создание библиотеки TCL1 для использования с cis-дисплеем достигается путем последовательных циклов ПЦР с получением конечных линейных двухцепочечных молекул ДНК из двух половин; 5-фрагмент содержит промотор и последовательности Tencon, тогда как 3-фрагмент содержит ген repA и cis- и ori-элементы. Эти две половины объединяют рестриктазным фрагментом с получением полного конструкта. Библиотека TCL1 была выполнена с возможностью включения случайных аминокислот только в петлю FG в Tencon, KGGHRSN (SEQ ID NO: 86). При создании данной библиотеки использовали NNS-кодоны, что позволило встраивать в петлю FG все 20 аминокислот и один стоп-кодон. Библиотека TCL1 содержит шесть отдельных подбиблиотек, каждая из которых имеет разную рандомизированную длину петли FG, от 7 до 12 остатков, для дополнительного увеличения разнообразия. Конфигурация библиотек на основе Tencon показана в табл. 2.
- 46 039356
Таблица 2
Библиотека Конфигурация петли ВС Конфигурация петли FG
WT Tencon TAPDAAFD* KGGHRSN**
TCL1 TAPDAAFD* ХХХХХХХ хххххххх ххххххххх хххххххххх ххххххххххх хххххххххххх
TCL2 ########
* TAPDAAFD: остатки 22-28 в SEQ ID NO: 1;
* *KGGHRSN: SEQ ID NO: 86.
X обозначает вырожденные аминокислоты, кодируемые NNS-кодонами.
# обозначает разработанное распределение аминокислот, описанное в тексте.
Для создания библиотеки TCL1 выполняли последовательные циклы ПЦР для присоединения промотора Tac, введения вырожденных элементов в петлю FG и добавления необходимых рестрикционных сайтов для конечной сборки. Во-первых, в две стадии создали последовательность ДНК, содержащую промоторную последовательность и последовательность 5'-фрагмента петли FG Tencon. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК, соответствующую полной последовательности гена Tencon, с праймерами РОР2220 (SEQ ID NO: 2) и TC5'toFG (SEQ ID NO: 3). Полученный в данной реакции продукт ПЦР использовали в качестве матрицы для следующего цикла ПЦР-амплификации с праймерами 130mer (SEQ ID NO: 4) и Tc5'toFG для завершения присоединения последовательности 5'-фрагмента и промоторной последовательности к Tencon. Затем в петлю FG вводили диверсификацию путем амплификации ДНК-продукта, полученного на первой стадии, с прямым праймером РОР2222 (SEQ ID NO: 5) и обратными праймерами TCF7 (SEQ ID NO: 6), TCF8 (SEQ ID NO: 7), TCF9 (SEQ ID NO: 8), TCF10 (SEQ ID NO: 9), TCF11 (SEQ ID N NO:10) или TCF12 (SEQ ID NO: 11), содержащими вырожденные нуклеотиды. Выполнили по меньшей мере по восемь ПЦР-реакций по 100 мкл для каждой подбиблиотеки, чтобы свести к минимуму число циклов ПЦР и максимально увеличить разнообразие библиотеки. По меньшей мере 5 мкг данного ПЦР-продукта очистили из геля и использовали на последующей стадии с праймерами РОР2222 (SEQ ID NO: 5) и РОР2234 (SEQ ID NO: 12), выполнив в результате прикрепление 6xHis-Teгa и рестрикционного сайта NotI к 3' концу последовательности Tencon. Данную реакцию ПЦР проводили с использованием лишь 15 циклов ПЦР и по меньшей мере 500 нг ДНК-матрицы. Полученный ПЦР-продукт очистили из геля, расщепили рестрикционным ферментом NotI и очистили на колонке Qiagen.
3'-фрагмент библиотеки представляет собой константную ДНК-последовательность, содержащую элементы дисплея, включая рестрикционный сайт PspOMI, кодирующий участок гена repA и cis- и ori-элементы. ПЦР проводили с использованием плазмиды (pCR4Blunt) (Invitrogen), содержащей данный ДНК-фрагмент, с праймерами М13 Forward (прямой) и М13 Reverse (обратный). Полученные ПЦРпродукты расщепляли PspOMI в течение ночи и очищали из геля. Для лигирования 5-части библиотечной ДНК с 3'-фрагментом ДНК, содержащим ген repA, 2 пмоль 5'-фрагмента ДНК лигировали с эквимолярным количеством 3'-фрагмента repA ДНК в присутствии ферментов NotI и PspOMI и лигазы Т4. После лигирования в течение ночи при 37°С небольшую часть лигированной ДНК прогоняли через гель для проверки эффективности лигирования. Лигированный библиотечный продукт разделили на двенадцать ПЦР-амплификаций и провели ПЦР в 12 циклов с парой праймеров РОР2250 (SEQ ID NO: 13) и DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Выход ДНК для каждой подбиблиотеки в библиотеке TCL1 находился в диапазоне 32-34 мкг.
Для анализа качества библиотеки небольшую часть рабочей библиотеки амплифицировали с праймерами Tcon5new2 (SEQ ID NO: 15) и Tcon6 (SEQ ID NO: 16) и клонировали в модифицированном векторе рЕТ посредством безлигазного клонирования. Плазмидную ДНК трансформировали в компетентные клетки BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) и 96 случайно выбранных колоний секвенировали с использованием праймера промотора Т7. Дублирующиеся последовательности обнаружены не были. В целом приблизительно 70-85% клонов имели полный промотор и кодирующую последовательность Tencon без мутации сдвига рамки считывания. Доля функционального секвенирования, которая исключает клонов
- 47 039356 со стоп-кодонами, находилась в диапазоне от 59 до 80%.
Создание библиотеки TCL2.
Была создана библиотека TCL2, в которой в Tencon были рандомизированы как петля ВС, так и петля FG, а распределение аминокислот в каждом положении строго контролировалось. В табл. 3 представлено распределение аминокислот в желаемых положениях петель в библиотеке TCL2. Разработанное распределение аминокислот имело две цели. Во-первых, библиотека была ориентирована на остатки, которые по прогнозу являются структурно значимыми для сворачивания и стабильности Tencon на основании анализа кристаллической структуры Tencon и/или гомологического моделирования. Например, положение 29 было предназначено только для набора гидрофобных аминокислот, так как данный остаток погружен в гидрофобную сердцевину свернутого Tencon. Второй уровень разработки включал смещение распределения аминокислот к распределению остатков, которые предпочтительно обнаруживаются в тяжелой цепи HCDR3 антител, для эффективного получения соединений с высокой аффинностью связывания (Birtalan et al., J. Mol. Biol. 377:1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci. 16:476-84, 2007). Таким образом, разработанное распределение из табл. 3 обозначает представленное ниже распределение: 6% аланина, 6% аргинина, 3,9% аспарагина, 7,5% аспарагиновой кислоты, 2,5% глутаминовой кислоты, 1,5% глутамина, 15% глицина, 2,3% гистидина, 2,5% изолейцина, 5% лейцина, 1,5% лизина, 2,5% фенилаланина, 4% пролина, 10% серина, 4,5% треонина, 4% триптофана, 17,3% тирозина и 4% валина. В данном распределении отсутствуют метионин, цистеин и стоп-кодоны.
Таблица 3
Положение остатка* Остатки
дикого типа Распределение в библиотеке TCL2
22 Т Разработанное распределение
23 А Разработанное распределение
24 Р 50% Р + разработанное распределение
25 D Разработанное распределение
26 А 20% А + 20% G + разработанное распределение
27 А Разработанное распределение
28 F 20% F, 20% I, 20% L, 20% V, 20% Y
29 D 33% D, 33% Е, 33% Т
75 К Разработанное распределение
76 G Разработанное распределение
77 G Разработанное распределение
78 Н Разработанное распределение
79 R Разработанное распределение
80 S 100% S
81 N Разработанное распределение
82 Р 50% Р + разработанное распределение
*Нумерация остатков основана на последовательности Tencon SEQ ID NO: 1.
5'-фрагмент библиотеки TCL2 содержал промотор и кодирующий участок Tencon (SEQ ID NO: 1), которые химически синтезировали в виде библиотечного пула (Sloning Biotechnology). Данный пул ДНК содержал по меньшей мере 1x10й разных элементов. В конец фрагмента был включен рестрикционный сайт BsaI для лигирования с RepA.
3-фрагмент библиотеки представлял собой константную ДНК-последовательность, содержащую элементы дисплея, включая тег 6xHis, кодирующую участок repA и cis-элемент. ДНК получили в ПЦР-реакции с помощью существующей ДНК-матрицы (выше) и праймеров LS1008 (SEQ ID NO: 17) и DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Для сборки готовой библиотеки TCL2 общее количество 1 мкг расщепленного рестриктазой BsaI 5-фрагмента библиотечной ДНК Tencon лигировали с 3,5 мкг 3'-фрагмента, полученного путем рестрикционного расщепления тем же ферментом. После лигирования в течение ночи ДНК очищали на колонке Qiagen и проводили количественную оценку ДНК путем измерения поглощения при длине волны 260 нм. Лигированный библиотечный продукт амплифицировали ПЦР в 12 циклов с парой праймеров РОР2250 (SEQ ID NO: 13) и DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Всего выполнили 72 реакции, в каждой из которых в качестве матрицы использовали 50 нг лигированных ДНК-продуктов. Общий выход рабочей библиотеки ДНК TCL2 составил приблизительно 100 мкг. Небольшую часть рабочей библиотеки подвергли субклонированию и секвенированию, как описано выше для библиотеки TCL1.
- 48 039356
Дублирующиеся последовательности обнаружены не были. Приблизительно 80% последовательностей содержали полный промотор и кодирующие последовательности Tencon без мутаций сдвига рамки считывания.
Создание библиотеки TCL14.
Верхние (ВС, DE и FG) и нижние (АВ, CD и EF) петли, например отмеченные поверхности связывания в доменах FN3, разделены бета-тяжами, которые образуют центр структуры FN3. Альтернативные поверхности, находящиеся с двух сторон доменов FN3 и имеющие другие формы, нежели поверхности, образованные только петлями, образованы с одной стороны домена FN3 двумя антипараллельными бетатяжами, бета-тяжами С и F и петлями CD и FG, и в настоящем документе называются поверхностью C-CD-F-FG.
Была создана библиотека, рандомизирующая альтернативную поверхность Tencon путем рандомизации выбранных открытых на поверхности остатков, относящихся к тяжам С и F, а также к частям петель CD и FG, как показано на фиг. 1. Для создания библиотеки использовали вариант Tencon, Tencon27 (SEQ ID NO: 99), имеющий следующие замены по сравнению с Tencon (SEQ ID NO: 1): E11R L17A, N46V, E86I. Полное описание способов, использованных для разработки этой библиотеки, приведено в патентной публикации США № US 2013/0226834.
Пример 2. Выбор доменов фибронектина типа III (FN3), связывающихся с EGFR и ингибирующих связывание EGF.
Скрининг библиотеки.
Для выбора доменов, связывающихся с EGFR, из библиотек TCL1 и TCL2 использовали cis-дисплей. Рекомбинантный человеческий внеклеточный домен EGFR, слитый с IgG1 Fc (R&D Systems), биотинилировали стандартными способами и применяли для пэннинга (остатки 25-645 полноразмерного EGFR с SEQ ID NO: 73). Для транскрипции и трансляции in vitro (ITT) 2-6 мкг библиотечной ДНК инкубировали с 0,1 мМ полного набора аминокислот, компонентами 1-кратного премикса S30 и 30 мкл экстракта S30 (Promega) в общем объеме 100 мкл и инкубировали при 30°С. Через 1 ч добавляли 450 мкл блокирующего раствора (PBS рН 7,4 с добавлением 2% бычьего сывороточного альбумина, 100 мкг/мл ДНК спермы сельди и 1 мг/мл гепарина) и реакционную смесь инкубировали на льду в течение 15 мин. Собирали комплексы EGFR-Fc:EGF с молярными соотношениями 1:1 и 10:1 для EGFR к EGF путем смешивания рекомбинантного человеческого EGF (R&D Systems) с биотинилированным рекомбинантным EGFR-Fc в блокирующем растворе в течение 1 ч при комнатной температуре. Для связывания 500 мкл заблокированных реакционных смесей ITT смешивали со 100 мкл комплексов EGFR-Fc: EGF и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего связанные комплексы извлекали магнитными гранулами с нейтравидином или стрептавидином (Seradyne). Несвязанные элементы библиотеки удаляли путем последовательных промывок PBST и PBS. После промывки ДНК элюировали из связанных комплексов путем нагревания до 65°С в течение 10 мин, амплифицировали ПЦР и присоединяли к ДНК-фрагменту, кодирующему RepA, путем рестрикционного расщепления и лигирования для дополнительных циклов пэннинга. Соединения с высокой аффинностью связывания выделяли путем последовательного понижения концентрации мишени EGFR-Fc в каждом цикле от 200 до 50 нМ и увеличения жесткости условий промывки. В циклах 4 и 5 несвязанные и слабо связанные домены FN3 удаляли путем промывки в присутствии 10-кратного молярного избытка небиотинилированных EGFR-Fc в течение ночи в PBS.
После пэннинга выбранные домены FN3 амплифицировали ПЦР с помощью олигонуклеотидов Tcon5new2 (SEQ ID NO: 15) и Tcon6 (SEQ ID NO: 16), субклонировали в вектор рЕТ, модифицировали путем включения сайта безлигазного клонирования и трансформировали в клетки BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) для экспрессии растворимого продукта в Е. coli с использованием стандартных методик молекулярной биологии. К каждому домену FN3 добавляли генную последовательность, кодирующую С-концевой полигистидиновый тег, для обеспечения возможности очистки и обнаружения. Культуры выращивали до достижения оптической плотности 0,6-0,8 в среде 2YT с добавлением 100 мкг/мл карбенициллина в 96-луночных блоках объемом 1 мл при 37°С, затем добавляли IPTG до 1 мМ и в этот момент температуру снижали до 30°С. Клетки собирали приблизительно через 16 ч путем центрифугирования и замораживали при -20°С. Лизирование клеток проводили путем инкубации каждого осадка в 0,6 мл лизирующего буфера BugBuster® НТ (Novagen EMD Biosciences) со встряхиванием при комнатной температуре в течение 45 мин.
Выбор доменов FN3, связывающихся с EGFR на клетках.
Для анализа способности разных доменов FN3 связываться с EGFR в более физиологическом контексте измеряли их способность связываться с клетками А431. Клетки А431 (Американская коллекция типовых культур, № по кат. CRL-1555) обладают сверхэкспрессией EGFR ~2х106 рецепторов на клетку. Клетки высеивали по 5000/лунка на непрозрачные черные 96-луночные планшеты, позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO2. Лизаты экспрессирующих домены FN3 бактерий 1000-кратно разбавляли в буфере для окрашивания при FACS (Becton Dickinson) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в трех планшетах. Лизаты удаляли и клетки промы- 49 039356 вали 3 раза, добавляя в лунки буфер для окрашивания при FACS по 150 мкл/лунка. Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка конъюгата антител к пентагистидину His-Alexa488 (Qiagen) с разбавлением 1:100 в буфере для окрашивания при FACS в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза со 150 мкл/лунка буфером для окрашивания при FACS, после чего к клеткам добавляли 100 мкл буфера для окрашивания при FACS и регистрировали флуоресценцию при 488 нм с использованием считывателя Acumen еХ3. Бактериальные лизаты, содержащие домены FN3, отбирали путем скрининга по их способности связываться с клетками А431 (1320 неочищенных бактериальных лизатов по библиотекам TCL1 и TCL2), и обнаружили 516 положительных клонов, у которых связывание >10-кратно превосходило фоновый сигнал. Для связывания отбирали посредством скрининга 300 лизатов из библиотеки TCL14, получив 58 уникальных последовательностей доменов FN3, связывающихся с EGFR.
Выбор доменов FN3, ингибирующих связывание EGF с EGFR на клетках.
Чтобы лучше охарактеризовать механизм связывания с EGFR, измеряли способность различных обнаруженных клонов домена FN3 связываться с EGFR в конкуренции с EGF с использованием клеток А431 параллельно со скрининговым анализом связывания с А431. Клетки А431 высеивали по 5000/лунка на непрозрачные черные 96-луночные планшеты, позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием CO2. Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка разбавленного 1:1000 лизата бактерий в течение 1 ч при комнатной температуре в трех планшетах. Биотинилированный EGF (Invitrogen, № по кат. Е-3477) добавляли в каждую лунку до конечной концентрации 30 нг/мл и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза буфером для окрашивания при FACS по 150 мкл/лунка. Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка конъюгата стрептавидинфикоэритрин (Invitrogen) с разбавлением 1:100 в буфере для окрашивания при FACS в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза со 150 мкл/лунка буфером для окрашивания при FACS, после чего к клеткам добавляли 100 мкл буфера для окрашивания при FACS и регистрировали флуоресценцию при 600 нм с использованием считывателя Acumen еХ3.
Скрининг бактериальных лизатов, содержащих домены FN3, проводили в анализе на конкуренцию с EGF, описанном выше. Скринингу подвергли 1320 неочищенных бактериальных лизатов из библиотек TCL1 и TCL2, получив 451 положительный клон с ингибированием связывания EGF >50%.
Экспрессия и очистка идентифицированных доменов FN3, связывающихся с EGFR.
Домены FN3 с His-тегом очищали из лизатов Е. coli с использованием планшетов His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) и элюировали в буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия и 250 мМ имидазола, рН 7,4. В очищенных образцах для анализа заменяли буфер на PBS, рН 7,4, с использованием планшетов PD MultiTrap™ G-25 (GE Healthcare).
Анализ методом эксклюзионной хроматографии.
Для оценки состояния агрегации доменов FN3, связывающихся с EGFR, использовали эксклюзионную хроматографию (SEC). Аликвоты (10 мкл) каждого очищенного домена FN3 вводили в колонку Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) со скоростью потока 0,3 мл/мин в подвижной фазе PBS с рН 7,4. Элюирование с колонки отслеживали по поглощению на 280 нм. Домены FN3, показывающие высокие уровни агрегации, в соответствии с SEC исключали из дополнительного анализа.
Скорость диссоциации выбранных доменов FN3, связывающихся с EGFR, от EGFR-Fc.
Для выбранных доменов FN3, связывающихся с EGFR, проводили скрининг для идентификации доменов с низкими константами диссоциации (koff) при связывании с EGFR-Fc на приборе ProteOn XPR-36 (Bio-Rad) для упрощения выбора соединений с высокой аффинностью связывания. Козьи антитела к человеческим Fc IgG (R&D systems) в концентрации 5 мкг/мл напрямую иммобилизовали посредством аминного связывания (при рН 5,0) во всех 6 горизонтально ориентированных лигандных каналах на чипе при скорости потока 30 мкл/мин в PBS, содержащем 0,005% Tween-20. Значения плотности иммобилизации в среднем составляли приблизительно 1500 отвечающих единиц (RU) с менее чем 5%-ным разбросом между разными каналами. EGFR-Fc захватывался поверхностью с антителами к человеческому Fc IgG с плотностью приблизительно 600 RU в вертикальной ориентации лиганда. Все протестированные домены FN3 нормализовали к концентрации 1 мкМ и тестировали на их связывание в горизонтальной ориентации. Для доменов FN3 использовали все 6 каналов для аналита, чтобы максимально увеличить производительность скрининга. Фазу диссоциации отслеживали в течение 10 мин при скорости потока 100 мкл/мин. В качестве эталонов при отслеживании неспецифического связывания между аналитами и поверхностью с иммобилизованными IgG использовали сигналы связывания между пятнами, и данные сигналы вычитали из всех сигналов связывания. Обработанные данные связывания локально аппроксимировали простой моделью связывания Ленгмюра 1:1 для получения kf по каждому домену FN3, связывающемуся с захваченными EGFR-Fc.
Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR.
Очищенные домены FN3, связывающиеся с EGFR, тестировали на их способность ингибировать стимулированное EGF фосфорилирование EGFR в клетках А431 в одной концентрации. Фосфорилирование EGFR отслеживали с помощью набора EGFR phospho (Tyr1173) (Meso Scale Discovery). Клетки высеивали по 20000/лунка на прозрачные 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования
- 50 039356 ткани (Nunc), в среду RPMI 100 мкл/лунка (Gibco), содержащую GlutaMAX™, с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Gibco), и позволяли им прикрепиться на ночь при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Культуральную среду полностью удаляли и клетки выдерживали в течение ночи в условиях голодания в 100 мкл/лунка среды, не содержащей FBS, при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Затем клетки обрабатывали по 100 мкл/лунка предварительно нагретой (37°С) средой без питательных веществ, содержащей домены FN3, связывающиеся с EGFR, в концентрации 2 мкМ в течение 1 ч при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Контроли обрабатывали только средой без питательных веществ. Клетки стимулировали путем добавления и осторожного перемешивания 100 мкл/лунка подогретой (37°С) среды без питательных веществ, содержащей 100 нг/мл рекомбинантного человеческого EGF (R&D Systems, № по кат. 236-EG) с конечными концентрациями 50 нг/мл EGF, а также 1 мкМ домена FN3, связывающегося с EGFR, и инкубирования при 37°С, 5% CO2 в течение 15 мин. Один набор контрольных лунок оставляли без стимуляции в качестве отрицательных контролей. Среду полностью удаляли и клетки лизировали при помощи 100 мкл/лунка лизирующего буфера Complete Lysis Buffer (Meso Scale Discovery) в течение 10 мин при комнатной температуре при встряхивании, как описано в инструкциях производителя. Планшеты для анализа, предназначенные для измерения EGFR, фосфорилированного по тирозиновому остатку 1173 (Meso Scale Discovery), блокировали прилагаемым блокирующим раствором в соответствии с инструкциями производителя при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч. Затем планшеты промывали 4 раза, используя 200 мкл/лунка 1X Tris Wash Buffer (Meso Scale Discovery). Аликвоты клеточных лизатов (30 мкл/лунка) переносили в планшеты для анализа, которые закрывали пленкой для герметизации планшетов (VWR), и инкубировали при комнатной температуре со встряхиванием в течение 1 ч. Планшеты для анализа промывали 4 раза, по 200 мкл/лунка Tris Wash Buffer, после чего в каждую лунку добавляли по 25 мкл ледяного раствора антител для обнаружения (Meso Scale Discovery), стараясь избегать появления пузырей. Планшеты инкубировали при комнатной температуре со встряхиванием в течение 1 ч, затем промывали 4 раза по 200 мкл/лунка Tris Wash Buffer. Сигналы обнаруживали путем добавления по 150 мкл/лунка буфера считывания (Meso Scale Discovery) и считывали на приборе SECTOR® Imager 6 000 (Meso Scale Discovery) с использованием заданных производителем параметров для данного анализа по умолчанию. Процентное ингибирование стимулированного EGF положительного контрольного сигнала вычисляли для каждого домена FN3, связывающегося с EGFR.
Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR измеряли для 232 идентифицированных клонов из библиотек TCL1 и TCL2. 22 из данных клонов ингибировали фосфорилирование EGFR на >50% при концентрации 1 мкМ. После удаления клонов, которые либо плохо экспрессировались, либо были сочтены мультимерами в соответствии с данными эксклюзионной хроматографии, отобрали девять клонов для дополнительной биологической характеризации. Последовательности петель ВС и FG данных клонов показаны в табл. 4. Восемь из девяти выбранных клонов имели общую последовательность петли FG (HNVYKDTNMRGL; SEQ ID NO: 95), и между несколькими клонами наблюдали существенное сходство в последовательностях петель ВС.
Таблица 4
Домен FN3 Петля ВС Петля FG
Идентификационный номер клона SEQ ID NO: Последовательность SEQ ID NO: Петля FG SEQ ID NO:
P53A1R5-17 18 ADPHGFYD 87 HNVYKDTNMRGL 95
P54AR4-17 19 TYDRDGYD 88 HNVYKDTNMRGL 95
P54AR4-47 20 WDPFSFYD 89 HNVYKDTNMRGL 95
P54AR4-48 21 DDPRGFYE 90 HNVYKDTNMRGL 95
P54AR4-73 22 TWPYADLD 91 HNVYKDTNMRGL 95
P54AR4-74 23 GYNGDHFD 92 HNVYKDTNMRGL 95
P54AR4-81 24 DYDLGVYD 93 HNVYKDTNMRGL 95
P54AR4-83 25 DDPWDFYE 94 HNVYKDTNMRGL 95
P54CR4-31 26 TAPDAAFD 85 LGSYVFEHDVM 96
Пример 3. Характеризация доменов FN3, связывающихся с EGFR, которые ингибируют связывание EGF.
Крупномасштабная экспрессия, очистка и удаление эндотоксина.
Домены FN3, показанные в табл. 4, подвергли крупномасштабной экспрессии, чтобы обеспечить больше материала для подробной характеризации. Культивируемую в течение ночи культуру, содержащую каждый из вариантов домена FN3, связывающегося с EGFR, инокулировали в 0,8 л бульонной питательной среды Terrific с добавлением 100 мкг/мл ампициллина с разбавлением 1/80 ночной культуры свежей средой и инкубировали при встряхивании при 37°С. Когда была достигнута оптическая плот- 51 039356 ность ~1,2-1,5 при 600 нм, культуру индуцировали путем добавления IPTG до конечной концентрации мМ и снижали температуру до 30°С. Через 4 ч клетки собирали путем центрифугирования и клеточный осадок хранили при -80°С столько, сколько необходимо.
Для лизирования клеток оттаявший осадок повторно суспендировали в растворе 1X BugBuster® с добавлением 25 Ед./мл Benzonase® (Sigma-Aldrich) и 1 тыс. Ед./мл rLysozyme™ (Novagen EMD Biosciences) в соотношении 5 мл BugBuster® на 1 г осадка. Лизирование проводили в течение 1 ч при комнатной температуре с осторожным встряхиванием, затем центрифугировали при 56000xg в течение 50 мин при 4°С. Супернатант отбирали и фильтровали через фильтр 0,2 мкм, после чего наносили на 5-мл колонку HisTrap FF, предварительно доведенную до равновесного состояния при помощи буфера А (50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола) с использованием хроматографической системы GE Healthcare AKTAexplorer 100s. Колонку промывали буфером А объемом, составляющим 20 объемов колонки, и дополнительно промывали 16% буфером В (50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 250 мМ имидазола) объемом, составляющим 6 объемов колонки. Домены FN3 элюировали 50% буфером В объемом, составляющим 10 объемов колонки, а затем градиентом 50-100% буфера В объемом, составляющим 6 объемов колонки. Фракции, содержащие белок домена FN3, объединяли, концентрировали с использованием концентратора Millipore 10K MWCO и фильтровали, после чего наносили на колонку HiLoad™ 16/60 Superdex™ 75 (GE Healthcare), предварительно доведенную до равновесного состояния PBS. Выбирали пик мономерного белка, элюирующийся из эксклюзионной колонки.
Эндотоксины удаляли, используя пакетный подход, при помощи смолы ActiClean Etox (Sterogene Bioseparations). Перед удалением эндотоксина смолу предварительно обрабатывали 1н. NaOH в течение 2 ч при 37°С (или в течение ночи при 4°С) и обильно промывали PBS до стабилизации рН на уровне ~7 по измерениям с помощью индикаторной бумаги для определения рН. Очищенный белок фильтровали через фильтр 0,2 мкм, затем добавляли 1 мл смолы Etox в соотношении 10 мл белка на 1 мл смолы. Связывание эндотоксина со смолой проводили при комнатной температуре в течение по меньшей мере 2 ч при осторожном вращении. Смолу удаляли центрифугированием при 500xg в течение 2 мин и отбирали белковый супернатант. Уровни эндотоксина измеряли с использованием кассет EndoSafe®-PTS™ и анализировали на считывателе EndoSafe®-MCS (Charles River). Если уровни эндотоксина превышали 5 ЭЕ/мг после первой обработки Etox, описанную выше процедуру повторяли до тех пор, пока уровни эндотоксина не снижались до >5 ЭЕ/мг. Когда уровень эндотоксина был выше 5 ЭЕ/мг и стабилизировался после двух последовательных обработок Etox, для белка разрабатывали условия анионообменной или гидрофобной хроматографии для удаления оставшихся эндотоксинов.
Определение аффинности выбранных доменов FN3, связывающихся с EGFR, по отношению EGFR-Fc (аффинность к EGFR-Fc).
Аффинность связывания выбранных доменов FN3, связывающихся с EGFR, с рекомбинантным внеклеточным доменом EGFR дополнительно характеризовали методами поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора Proteon (BioRad). Схема анализа (подготовка чипа, захват EGFR-Fc) была аналогична описанной выше схеме применительно к анализу скорости диссоциации. Выбранные домены FN3, связывающиеся с EGFR, тестировали в концентрации 1 мкМ в серии 3-кратных разбавлений в горизонтальной ориентации. Для отслеживания исходной стабильности также вводили образец буфера. Фазу диссоциации для всех концентраций каждого домена FN3, связывающегося с EGFR, отслеживали при скорости потока 100 мкл/мин в течение 30 мин (для доменов с koff ~10-2 с-1 в соответствии с данными скринингового исследования скорости диссоциации) или 1 ч (для доменов с koff ~10-3 с-1 или менее). Из данных ответов вычитали два набора эталонных данных: 1) сигналы между пятнами для коррекции неспецифических взаимодействий между доменом FN3, связывающимся с EGFR, и поверхностью с иммобилизованными IgG; 2) сигналы буферных каналов для коррекции сдвига базовой линии изза диссоциации захваченной поверхности с EGFR-Fc с течением времени. Обработанные данные связывания при всех концентрациях для каждого домена FN3 глобально аппроксимировали простой моделью связывания Ленгмюра 1:1 для получения кинетических констант (kon, koff) и константы аффинности (KD). В табл. 5 показаны кинетические константы для каждого из конструктов с аффинностью в диапазоне от 200 пМ до 9,6 нМ.
Связывание выбранных доменов FN3, связывающихся с EGFR, с EGFR на клетках (анализ связывания с клетками А431).
Клетки А431 высеивали по 5000/лунка на непрозрачные черные 96-луночные планшеты, позволяя им прикрепиться в течение ночи при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2. Очищенные домены FN3, связывающиеся с EGFR (от 1,5 нМ до 30 мкМ), добавляли к клеткам (50 мкл) в течение 1 ч при комнатной температуре в трех планшетах. Супернатант удаляли и клетки промывали 3 раза, добавляя в лунки буфер для окрашивания при FACS по 150 мкл/лунка. Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка конъюгата антител к пентагистидину His-Alexa488 (Qiagen) с разбавлением 1:100 в буфере для окрашивания при FACS в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза со 150 мкл/лунка буфером для окрашивания при FACS, после чего к клеткам добавляли 100 мкл буфера для окрашивания при FACS и регистрировали флуоресценцию при 488 нм с использованием считывателя
- 52 039356
Acumen еХ3. Строили график зависимости необработанного сигнала флуоресценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и аппроксимировали сигмовидной кривой доза-ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4 (GraphPad Software) для вычисления значений ЕС50. В табл. 5 показаны ЕС50 для каждого из конструктов в диапазоне от 2,2 нМ до >20 мкМ.
Ингибирование связывания EGF с EGFR на клетках с использованием выбранных доменов FN3, связывающихся с EGFR (анализ конкуренции с EGF на клетках А431).
Клетки А431 высеивали по 5000/лунка на непрозрачные черные 96-луночные планшеты, позволяя им прикрепиться в течение ночи при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием CO2. Очищенные домены FN3, связывающиеся с EGFR (от 1,5 нМ до 30 мкМ), добавляли к клеткам (50 мкл/лунка) в течение 1 ч при комнатной температуре в трех планшетах. Биотинилированный EGF (Invitrogen, № по кат. Е-3477) добавляли в каждую лунку с конечной концентрацией 30 нг/мл и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза буфером для окрашивания при FACS по 150 мкл/лунка. Клетки инкубировали с 50 мкл/лунка конъюгата стрептавидин-фикоэритрин (Invitrogen) с разбавлением 1:100 в буфере для окрашивания при FACS в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки промывали 3 раза со 150 мкл/лунка буфером для окрашивания при FACS, после чего к клеткам добавляли 100 мкл буфера для окрашивания при FACS и регистрировали флуоресценцию при 600 нм с использованием считывателя Acumen еХ3. Строили график зависимости необработанного сигнала флуоресценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и аппроксимировали сигмовидной кривой доза-ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4 (GraphPad Software) для вычисления значений IC50. В табл. 5 показаны значения IC50 в диапазоне от 1,8 до 121 нМ.
Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR (анализ фосфо-EGRF).
Выбранные домены FN3, которые специфически ингибировали стимулированное EGF фосфорилирование EGFR, более полно анализировали путем измерения значений IC50 для ингибирования. Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR анализировали при разных концентрациях домена FN3 (от 0,5 нМ до 10 мкМ), как описано выше в разделе Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR. Строили график зависимости сигнала электрохемилюминесценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и определяли значения IC50 путем аппроксимации данных сигмовидной кривой доза-ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4 (GraphPad Software). В табл. 5 показаны значения IC50 в диапазоне от 18 нМ до >2,5 мкМ.
Ингибирование роста человеческих опухолевых клеток (анализ роста клеток NCI-H292 и NCI-H322).
Ингибирование EGFR-зависимого роста клеток анализировали по измерению жизнеспособности клеток человеческих опухолевых клеточных линий со сверхэкспрессией EGFR, NCI-H292 и NCI-H322 (Американская коллекция типовых культур, № по кат. CRL-1848 и CRL-5806 соответственно) после воздействия доменов FN3, связывающихся с EGFR. Клетки высеивали по 500/лунка (NCI-H292) или по 1000/лунка (NCI-H322) на непрозрачные белые 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования тканей (Nunc), в среду RPMI (Gibco) 100 мкл/лунка, содержащую GlutaMAX™ и 10 мМ HEPES, с добавлением 10% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco) и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco), и позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Клетки обрабатывали фосфатно-буферным соляным раствором (PBS), содержащим разные концентрации доменов FN3, связывающихся с EGFR, по 5 мкл/лунка. Контроли обрабатывали 5 мкл/лунка только PBS или 25 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты в PBS. Клетки инкубировали при 37°С, 5% CO2 в течение 120 ч. Жизнеспособные клетки обнаруживали путем добавления 75 мкл/лунка реагента CellTiter-Glo® (Promega) с последующим перемешиванием на шейкере для планшетов в течение 2 мин и инкубацией в темноте при комнатной температуре в течение дополнительных 10 мин. Планшеты считывали на считывателе для планшетов SpectraMax M5 (Molecular Devices) в режиме люминесценции с временем считывания 0,5 с/лунка в сравнении с пустой средой. Строили график зависимости процента роста обработанных PBS клеток от логарифма молярной концентрации домена FN3. Значения IC50 определяли путем аппроксимации данных уравнением сигмовидной кривой дозаответ с переменным наклоном с использованием GraphPad Prism 4 (GraphPad Software). В табл. 5 показаны значения IC50 в диапазоне от 5,9 нМ до 1,15 мкМ и от 9,2 нМ до >3,1 мкМ при использовании клеток NCI-H292 и NCI-H322 соответственно. В табл. 5 представлена сводная информация по биологическим свойствам доменов FN3, связывающихся с EGFR, для каждого анализа.
- 53 039356
Таблица 5
ID клона домена FN3 SEQ ID NO: Аффинность к EGFR-Fc (нМ) Связывание с клетками А431 Конкуренция с EGF на клетках А431 Фосфо- EGFR Рост NCI- Н292 Рост NCI- Н322
ЕС5о (нМ) 1С5о (нМ) 1С5о (нМ) 1С50 (нМ) 1С5о (нМ)
P53A1R5-17 18 1,89 4,0 9,8 >2500 86 65
P54AR4-17 19 9,62 16 21 184 Н/о Н/о
P54AR4-47 20 2,51 8,6 7,1 295 44 39
P54AR4-48 21 7,78 12 9,8 170 Н/о Н/о
P54AR4-73 22 0,197 9,4 4,6 141 83 73
P54AR4-74 23 Н/о 77 Н/о Н/о Н/о Н/о
P54AR4-81 24 Н/о 84 121 Н/о Н/о Н/о
P54AR4-83 25 0,255 2,2 1,8 18 5,9 9,2
P54CR4-31 26 0,383 > 20 000 55 179 1150 >3073
Пример 4. Конструирование доменов FN3, связывающихся с EGFR.
Было сконструировано подмножество доменов FN3, связывающихся с EGFR, для увеличения конформационной стабильности каждой молекулы. Мутации L17A, N46V и E86I, для которых было показано улучшение стабильности домена FN3 (описаны в патентной публикации США № US 2011/0274623), были введены в клоны P54AR4-83, P54CR4-31 и P54AR4-37 путем синтеза ДНК. Новые мутанты P54AR5-83v2, P54CR431-v2 и P54AR4-37v2 экспрессировали и очищали, как описано выше. Для анализа стабильности каждого мутанта для сравнения с соответствующей исходной молекулой использовали дифференциальную сканирующую калориметрию в PBS. В табл. 6 показано, что молекулу каждого варианта существенно стабилизировали со средним увеличением Tm=18,5°С.
Таблица 6
Клон домена FN3 SEQ ID NO: Tm(°C)
P54AR4-83 25 50,6
P54AR4-83v2 27 69,8
P54CR4-31 26 60,9
P54CR4-31v2 28 78,9
P54AR4-37 22 45,9
P54AR4-37v2 29 64,2
Пример 5. Выбор доменов фибронектина типа III (FN3), связывающихся с c-Met и ингибирующих связывание HGF Пэннинг на человеческом c-Met.
Проводили скрининг библиотеки TCL14 на биотинилированный внеклеточный домен человеческого c-Met (bt-c-Met) для идентификации доменов FN3, способных к специфическому связыванию с c-Met. Для выбора 3 мкг библиотеки TCL14 транскрибировали и транслировали in vitro (IVTT) в линейном экстракте S30 Е. Coli (Promega, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) и экспрессированную библиотеку блокировали Cis Block (2% BSA (Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури, США), 100 мкг/мл ДНК спермы сельди (Promega) и 1 мг/мл гепарина (Sigma-Aldrich)). Для выбора добавляли bt-c-Met в концентрациях 400 нМ (цикл 1), 200 нМ (циклы 2 и 3) и 100 нМ (циклы 4 и 5). Связанные элементы библиотеки извлекали с использованием магнитных гранул с нейтравидином (Thermo Fisher, г. Рокфорд, штат Иллинойс, США) (циклы 1, 3 и 5) или магнитных гранул со стрептавидином (Promega) (циклы 2 и 4), а несвязанные элементы библиотеки удаляли путем промывки гранул 5-14 раз с помощью 500 мкл PBS-T с последующей 2-кратной промывкой с помощью 500 мкл PBS.
Выполняли дополнительные циклы выбора для идентификации молекул доменов FN3 с улучшенными значениями аффинности. Вкратце, результаты цикла 5 получали, как описано выше, и подвергали дополнительным итерационным циклам выбора со следующими изменениями: инкубацию с bt-c-Met уменьшили с 1 ч до 15 мин, продолжительность захвата на гранулы снизили с 20 до 15 мин, концентрацию bt-c-Met уменьшили до 25 нМ (циклы 6 и 7) или 2,5 нМ (циклы 8 и 9) и провели дополнительную промывку в присутствии избытка небиотинилированного c-Met в течение 1 ч. Цель данных изменений заключалась в одновременном выборе связывающих соединений с потенциально более высокой скоро- 54 039356 стью ассоциации и более низкой скоростью диссоциации, что позволяет получить по существу меньшее значение KD.
Результаты циклов 5, 7 и 9 клонировали с помощью ПЦР в модифицированный вектор рЕТ15 (EMD Biosciences, г. Гиббстаун, штат Нью-Джерси, США), содержащий сайт безлигазного клонирования (pET15-LIC), с использованием праймеров TCON6 (SEQ ID NO: 30) и TCON5 E86I short (SEQ ID NO: 31), а белки экспрессировали как белки с His6-тегом на С-конце после преобразований и индукции IPTG (конечная концентрация 1 мМ, 30°С в течение 16 ч) с использованием стандартных протоколов. Клетки собирали путем центрифугирования и затем лизировали с помощью Bugbuster НТ (EMD Biosciences) с добавлением 0,2 мг/мл лизоцима из белка куриного яйца (Sigma-Aldrich). Бактериальные лизаты очищали путем центрифугирования и супернатанты переносили в новые 96-луночные планшеты deep-well Plates (Nunc) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты дважды промывали, используя 300 мкл/лунка трис-буферного раствора с 0,05% Tween 20 (TBS-T, Sigma-Aldrich) в приборе для промывки планшетов Biotek. Планшеты для анализа блокировали StartingBlock T20 (200 мкл/лунка, Thermo Fisher Scientific, г. Рокленд, штат Иллинойс, США) в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) при встряхивании и повторно дважды промывали 300 мкл TBS-T. Лизаты с доменом FN3 разбавляли в StartingBlock T20 (от 1:10 до 1:100 000) с помощью роботизированной системы Hamilton STARplus. Лизаты (50 мкл/лунка) инкубировали на планшетах для анализа в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Без промывки планшетов добавляли bt-HGF (1 мкг/мл в StartingBlock T20, 50 мкл/лунка, биотинилированный) на 30 мин при комнатной температуре при встряхивании. В контрольные лунки, содержащие лизаты Tencon27, добавляли либо Starting Block T20, либо разбавленный bt-HGF. Затем планшеты промывали четыре раза 300 мкл/лунка TBS-T и инкубировали со 100 мкл/лунка Streptavidin-HRP (1:2000 в TBS-T, Jackson Immunoresearch, г. Вест Гроув, штат Пенсильвания, США) в течение 30-40 мин при комнатной температуре при встряхивании. Планшеты повторно промывали TBS-T четыре раза. Для формирования сигнала на планшет добавляли хемилюминесцентный субстрат, POD Chemiluminescence Substrate (50 мкл/лунка, Roche Diagnostics, г. Индианаполис, штат Индиана, США), полученный в соответствии с инструкциями производителя, и в течение приблизительно 3 мин регистрировали хемилюминесценцию на приборе Molecular Devices M5 с использованием SoftMax Pro. Процентное ингибирование определяли с использованием следующих расчетов: 100 - ((RLU образец - среднее RLU котроль без bt-HGF)/(среднее RLU контроль bt-HGF - среднее RLU контроль без bt-HGF) * 100). Значения процент ного ингибирования 50% или более считались успешными.
Высокопроизводительная экспрессия и очистка доменов FN3.
Домены FN3 с His-тегом очищали из лизатов Е. coli с использованием планшетов His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) и элюировали в буфере, содержащем 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия и 250 мМ имидазола, рН 7,4. В очищенных образцах для анализа заменяли буфер на PBS, рН 7,4, с использованием планшетов PD MultiTrap™ G-25 (GE Healthcare).
Определение IC50 для ингибирования связывания HGF с c-Met.
Выбранные домены FN3 дополнительно характеризовали в анализе на конкуренцию с HGF. Строили кривые доза-ответ для очищенных доменов FN3 с использованием описанного выше анализа (начальные концентрации - 5 мкМ). Вычисляли значения процентного ингибирования. Строили график зависимости % ингибирования от логарифма молярной концентрации домена FN3 и определяли значения IC50 путем аппроксимации данных сигмовидной кривой доза-ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4.
В цикле 5 идентифицировали 35 уникальных последовательностей, показывающих активность при разбавлениях 1:10 со значениями IC50 в диапазоне от 0,5 до 1500 нМ. В цикле 7 получали 39 уникальных последовательностей с активностью при разбавлениях 1:100 и значениями IC50 в диапазоне от 0,16 до 2,9 нМ. В цикле 9 идентифицировали 66 уникальных последовательностей, где удачными считались варианты, проявлявшие активность при разбавлениях 1:1000. В цикле 9 (табл. 8) наблюдали значения IC50 лишь 0,2 нМ.
Определение аффинности выбранных доменов FN3, связывающихся с c-Met, по отношению c-Met-Fc (аффинность к EGFR-Fc).
Значения аффинности для выбранных доменов FN3, связывающихся с c-Met, определяли так, как описано в примере 3 применительно к определению аффинности выбранных доменов FN3, связывающихся с EGFR, за исключением того, что в анализах использовали c-Met-Fc.
Пример 6. Характеризация доменов FN3, связывающихся с c-Met и ингибирующих связывание HGF.
Домены FN3 экспрессировали и очищали, как описано выше в примере 2. Эксклюзионную хроматографию и кинетический анализ проводили так, как описано выше в примерах 1 и 2 соответственно. В табл. 7 показаны последовательности тяжа С, петли CD, тяжа F и петли FG, а также полная аминокислотная последовательность SEQ ID NO: для каждого домена.
- 55 039356
Таблица 7
Клон Петля С Тяж CD Петля F ТяжЕС
Название SEQ ID NO:
P114AR5P74-A5 32 FDSFWIRYDE VVVGGE TEYYVNILGV KGGSISV
P114AR5P75-E9 33 FDSFFIRYDE FLRSGE TEYWVTILGV KGGLVST
P114AR7P92-F3 34 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYIVNIMGV KGGSISH
P114AR7P92-F6 35 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYYVNILGV KGGGLSV
P114AR7P92-G8 36 FDSFVIRYFE FLGSGE TEYVVQILGV KGGYISI
P114AR7P92-H5 37 FDSFWIRYLE FLLGGE TEYVVQIMGV KGGTVSP
P114AR7P93-D11 38 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYVVGINGV KGGYISY
P114AR7P93-G8 39 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYGVTINGV KGGRVST
P114AR7P93-H9 40 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYVVQIIGV KGGHISL
P114AR7P94-A3 41 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYVVNIMGV KGGKISP
P114AR7P94-E5 42 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYAVNIMGV KGGRVSV
P114AR7P95-B9 43 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYVVQILGV KGGSISV
P114AR7P95-D3 44 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYVVNIMGV KGGSISY
P114AR7P95-D4 45 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYVVQILGV KGGYISI
P114AR7P95-E3 46 FDSFWIRYFE FLGSGE TEYVVQIMGV KGGTVSP
P114AR7P95-F10 47 FDSFWIRYFE FTTAGE TEYVVNIMGV KGGSISP
P114AR7P95-G7 48 FDSFWIRYFE LLSTGE TEYVVNIMGV KGGSISP
P114AR7P95-H8 49 FDSFWIRYFE FVSKGE TEYVVNIMGV KGGSISP
Остатки петли С соответствуют остаткам 28-37 указанной SEQ ID NO. Остатки тяжа CD соответствуют остаткам 38-43 указанной SEQ ID NO. Остатки петли F соответствуют остаткам 65-74 указанной SEQ ID NO. Остатки петли FG соответствуют остаткам 75-81 указанной SEQ ID NO.
Связывание выбранных доменов FN3, связывающихся с c-Met, с c-Met на клетках (анализ связывания с клетками Н441).
Клетки NCI-H441 (№ по кат. НТВ-174, Американская коллекция типовых культур, г. Манассас, штат Вирджиния, США) высеивали по 20000/лунка на покрытые поли-D-лизином черные 96-луночные планшеты с прозрачным дном (BD Biosciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния, США) и позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°С, 5% СО2. Очищенные домены FN3 (50 мкл/лунка; 0-1000 нМ) добавляли к клеткам на 1 ч при 4°С на двух планшетах. Супернатанты удаляли и клетки трижды промывали буфером для окрашивания при FACS (150 мкл/лунка, BD Biosciences, № по кат. 554657). Клетки инкубировали с биотинилированным антителом к HIS (с разбавлением 1:160 в буфере для окрашивания при FACS, 50 мкл/лунка, R&D Systems, № по кат. ВАМ050) в течение 30 мин при 4°С. Клетки трижды промывали буфером для окрашивания при FACS (150 мкл/лунка), после чего инкубировали с конъюгированными антителами к мышиному IgGrAlexa488 (с разбавлением 1:80 в буфере для окрашивания при FACS, 50 мкл/лунка, Life Technologies, № по кат. А21121) в течение 30 мин при 4°С. Клетки трижды промывали буфером для окрашивания при FACS (150 мкл/лунка) и оставляли в буфере для окрашивания при FACS (50 мкл/лунка). Определяли полную флуоресценцию на считывателе Acumen еХ3. Строили график зависимости необработанного сигнала флуоресценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и аппроксимировали сигмовидной кривой доза-ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4 (GraphPad Software) для вычисления значений ЕС50. Было обнаружено, что домены FN3 показывают диапазон значений активности связывания со значениями ЕС50 от 1,4 до 22,0 нМ, как показано в табл. 8.
Ингибирование стимулированного HGF фосфорилирования c-Met.
Очищенные домены FN3 тестировали на их способность ингибировать стимулированное HGF фосфорилирование c-Met в NCI-H441 с использованием набора c-Met phospho(Tyr1349) производства Meso Scale Discovery (г. Гейтерсберг, штат Мэриленд, США). Клетки высеивали по 20000/лунка на прозрачные 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования ткани, в среду RPMI 100 мкл/лунка (содержащую Glutamax и HEPES, Life Technologies), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Life Technologies) и позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Культуральную среду полностью удаляли и клетки выдерживали в условиях голодания в бессывороточной среде RPMI (100 мкл/лунка) при 37°С, 5% CO2. Затем к клеткам добавляли свежую бессывороточную среду RPMI (100 мкл/лунка), содержащую домены FN3 в концентрации 20 мкМ и ниже, на 1 ч при 37°С, 5% СО2. Контроли обрабатывали только средой. Клетки стимулировали 100 нг/мл рекомбинантного человеческого HGF (100 мкл/лунка, R&D Systems, № по кат. 294-HGN) и инкубировали при 37°С, 5% CO2, в течение 15 мин. Один набор контрольных лунок оставляли без стимуляции в качестве отрицательных контролей. Среду полностью удаляли и лизировали клетки полным лизирующим буфером Complete Lysis Buffer (50 мкл/лунка, Meso Scale Discovery) в течение 10 мин при комнатной температуре со встряхиванием в соответствии с инструкциями производителя. Планшеты для анализа, предназначенные для измерения фосфорилированного с-Met, блокировали прилагаемым блокирующим раствором в соответствии с инструкциями производителя при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшеты трижды промывали Tris Wash Buffer (200 мкл/лунка, Meso Scale Discovery). Клеточные лизаты (30 мкл/лунка) наносили на планшеты для анализа и инкубировали при комнатной температуре со встряхиванием в течение 1 ч. Затем планшеты для анализа четырехкратно промывали Tris Wash Buffer, после чего в каждую лунку добавляли ледяной раствор антител для обнаружения (25 мкл/лунка,
- 56 039356
Meso Scale Discovery) на 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Планшеты повторно четырехкратно промывали Tris Wash Buffer. Сигналы обнаруживали путем добавления буфера 150 Read Buffer (150 мкл/лунка, Meso Scale Discovery) и считывания на приборе SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) с использованием заданных производителем параметров для данного анализа по умолчанию. Строили график зависимости сигнала электрохемилюминесценции от логарифма молярной концентрации домена FN3 и определили значения IC50 путем аппроксимации данных сигмовидной кривой доза-ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4. Было обнаружено, что домены FN3 ингибировали фосфорилирование c-Met со значениями IC50 в диапазоне от 4,6 до 1415 нМ, как показано в табл. 8.
Ингибирование роста или жизнеспособности человеческих опухолевых клеток.
Ингибирование c-Met-зависимого роста клеток анализировали путем измерения жизнеспособности клеток U87-MG (Американская коллекция типовых культур, № по кат. НТВ-14) после воздействия доменов FN3, связывающихся с c-Met. Клетки высеивали по 8000/лунка на непрозрачные белые 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования ткани (Nunc), в среду RPMI 100 мкл/лунка с добавлением 10% FBS и позволяли им прикрепиться в течение ночи при 37°С, 5% СО2. Через 24 ч после высеивания среду отсасывали и к клеткам добавляли свежую бессывороточную среду RPMI. Через 24 ч после обработки бессывороточной средой клетки обрабатывали путем добавления бессывороточной среды, содержащей домены FN3, связывающиеся с c-Met (30 мкл/лунка). Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 72 ч. Жизнеспособные клетки обнаруживали путем добавления 100 мкл/лунка реагента CellTiter-Glo® (Promega) с последующим перемешиванием на шейкере для планшетов в течение 10 мин. Планшеты считывали на считывателе для планшетов SpectraMax M5 (Molecular Devices), настроенном на режим люминесценции, с временем считывания 0,5 с/лунка. Строили график зависимости исходных единиц люминесценции (RLU) от логарифма молярной концентрации домена FN3. Значения IC50 определяли путем аппроксимации данных уравнением сигмовидной кривой доза-ответ с переменным наклоном при помощи GraphPad Prism 4. В табл. 8 показаны значения IC50 в диапазоне от 1 до >1000 нМ. Характеристики доменов FN3, связывающихся с c-Met, обобщены в табл. 8.
Таблица 8
Клон Аффинность (Kd, нМ) Конкуренция с HGF, IC50 (нМ) Связывание с клетками Н441 (ЕС50, нМ) Ингибирование pMet в клетках Н441 (IC50, нМ) Ингибирование пролиферации клеток U87-MG (IC50, нМ)
Название SEQ ID NO
P114AR5P74-A5 32 10,1 5,2 18,7 1078 464,4
P114AR5P75-E9 33 45,8 51,9 Н/о 1415 1193,9
P114AR7P92-F3 34 0,4 0,2 1,5 8,3 2,7
P114AR7P92-F6 35 3,1 2,2 4,9 165,3 350,5
P114AR7P92-G8 36 1,0 1,6 5,9 155,3 123,9
P114AR7P92-H5 37 11,6 Н/о 22,0 766,4 672,3
P114AR7P93-D11 38 Н/о Н/о 2,3 16 14,4
P114AR7P93-G8 39 6,9 1 3,8 459,5 103,5
P114AR7P93-H9 40 3,3 2,9 12,9 288,2 269,9
P114AR7P94-A3 41 0,4 0,2 1,4 5 9,3
P114AR7P94-E5 42 4,2 0,7 3,4 124,3 195,6
P114AR7P95-B9 43 0,5 0,3 Н/о 9,8 17,4
P114AR7P95-D3 44 0,3 0,2 1,5 4,6 17
P114AR7P95-D4 45 0,4 Н/о 1,4 19,5 19,4
P114AR7P95-E3 46 1,5 Н/о 3,2 204,6 209,2
P114AR7P95-F10 47 4,2 1,4 4,4 187,6 129,7
P114AR7P95-G7 48 20,0 Н/о 11,3 659,3 692
P114AR7P95-H8 49 3,7 Н/о 4,1 209,8 280,7
Термостабильность доменов FN3, связывающихся с c-Met.
Для анализа стабильности каждого домена FN3 использовали дифференциальную сканирующую калориметрию в PBS. Результаты эксперимента показаны в табл. 9.
Таблица 9
Клон Термостабильность (Tm, °C)
Название SEQ. ID NO:
P114AR5P74-A5 32 74,1
P114AR5P75-E9 33 Н/о
P114AR7P92-F3 34 81,5
P114AR7P92-F6 35 76,8
- 57 039356
Пример 7. Создание и характеризация биспецифических к EGFR/c-Met молекул.
Создание биспецифических к EGFR/c-Met молекул.
Множество комбинаций доменов FN3, связывающихся с EGFR и c-Met, описанных в примерах 1-6, соединяли в биспецифические молекулы, способные связываться как с EGFR, так и с c-Met. Кроме того, были созданы и соединены в биспецифические молекулы домены FN3, связывающиеся с EGFR, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 107-110, и домены FN3, связывающиеся с c-Met, имеющие аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 111-114. Были созданы синтетические гены, кодирующие аминокислотные последовательности, описанные в SEQ ID NO: 50-72 и 106 (табл. 10), так чтобы обеспечить соблюдение следующего формата:домен FN3, связывающийся cEGFR, затем пептидный линкер, затем домен FN3, связывающийся с c-Met. Для обеспечения очистки на С-конце встроили полигистидиновый тег. Помимо данных молекул, описанных в табл. 10, линкер между двумя доменами FN3 варьировали по длине, композиции последовательности и структуре в соответствии с перечисленным в табл. 11. Предусмотрена возможность использования ряда других линкеров для соединения таких доменов FN3. Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы экспрессировали и очищали из Е. coli, как описано применительно к моноспецифическим к EGFR или к c-Met доменам FN3, с использованием стадий IMAC и гель-проникающей хроматографии.
- 58 039356
Таблица 10
Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула Домен FN3, связывающийся с EGFR Домен FN3, связывающийся с c-MET Линкер
Идентификационный номер клона SEQ ID NO' Идентификационный номер клона SEQ ID NO' Идентификационный номер клона SEQ ID NO' Последовательность SEQ ID NO'
ЕСВ1 50 P54AR4-83V2 27 Р114AR5P74-A5 32 (GGGGS)4 79
ЕСВ2 51 P54AR4-83V2 27 Р114AR7P94-A3 41 (GGGGS)4 79
ЕСВЗ 52 P54AR4-83V2 27 Р114AR7P93-H9 40 (GGGGS)4 79
ЕСВ4 53 P54AR4-83V2 27 Р114AR5P75-E9 33 (GGGGS)4 79
ЕСВ5 54 Р53А1 R5-17V2 107 Р114AR7P94-A3 41 (GGGGS)4 79
ЕСВ6 55 Р53А1 R5-17V2 107 Р114AR7P93-H9 40 (GGGGS)4 79
ЕСВ7 56 Р53А1 R5-17V2 107 Р114AR5P75-E9 33 (GGGGS)4 79
ЕСВ15 57 P54AR4-83V2 27 Р114AR7P94-A3 41 (AP)5 81
ЕСВ27 58 P54AR4-83V2 27 Р114AR5P74-A5 32 (AP)5 81
ЕСВ60 59 Р53А1 R5-17V2 107 Р114AR7P94-A3 41 (AP)5 81
ЕСВ37 60 Р53А1 R5-17V2 107 Р114AR5P74-A5 32 (AP)5 81
ЕСВ94 61 P54AR4-83V22 108 P114AR7P94-A3V22 111 (AP)5 81
ЕСВ95 62 P54AR4-83v22 108 P114AR9P121 -A6v2 112 (AP)5 81
ЕСВ96 63 P54AR4-83v22 108 Р114AR9P122-A7V2 113 (AP)5 81
ЕСВ97 64 P54AR4-83v22 108 P114AR7P95-C5V2 114 (AP)5 81
ЕСВ106 65 P54AR4-83v23 109 109 109 109 110 110 110 Р114AR7P94-A3V22 111 (AP)5 81
ЕСВ107 66 P54AR4-83v23 P114AR9P121 -A6v2 112 (AP)5 81
ЕСВ108 67 P54AR4-83v23 P114AR9P122-A7V2 113 (AP)5 81
ЕСВ109 68 P54AR4-83V23 Р114AR7P95-C5V2 114 (AP)5 81
ЕСВ118 69 P53A1 R5-17v22 Р114AR7P94-A3V22 111 (AP)5 81
ЕСВ119 70 P53A1 R5-17V22 P114AR9P121 -A6v2 112 (AP)5 81
ЕСВ120 71 P53A1 R5-17v22 P114AR9P122-A7v2 113 (AP)5 81
ЕСВ121 72 P53A1 R5-17v22 110 P114AR7P95-C5V2 114 (AP)5 81
ЕСВ91 106 P54AR4-83v22 108 Р114AR7P95-C5V2 114 (AP)5 81
ЕСВ18 118 P54AR4-83v2 27 Р114AR5P74-A5 32 (AP)5 81
ЕСВ28 119 P53A1 R5-17v2 107 Р114AR5P74-A5 32 (AP)5 81
ЕСВ38 120 P54AR4-83v2 27 Р114AR7P94-A3 41 (AP)5 81
ЕСВ39 121 P53A1 R5-17v2 107 Р114AR7P94-A3 41 (AP)5 81
Таблица 11
Линкер SEQ ID NO: Длина линкера в аминокислотах Структура
GS 78 2 Неупорядоченная
GGGGS 105 5 Неупорядоченная
(GGGGS)4 79 20 Неупорядоченная
(AP)2 80 4 Жесткая
(AP)5 81 5 Жесткая
(АР)ю 82 20 Жесткая
(AP)20 83 40 Жесткая
A(EAAAK)5AAA 84 29 а-спиральная
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы увеличивают эффективность по сравнению с отдельными моноспецифическими молекулами, что указывает на авидность.
Клетки NCI-H292 высеивали на 96-луночные планшеты в среду RPMI, содержащую 10% FBS. Через 24 ч среду заменяли на бессывороточную RPMI. Через 24 ч после бессывороточной среды клетки обрабатывали различными концентрациями доменов FN3:моноспецифического к EGFR домена FN3 с высокой аффинностью (P54AR4-83v2), моноспецифического к c-Met домена FN3 с низкой аффинностью (P114AR5P74-A5), смеси двух моноспецифических к EGFR и к c-Met доменов FN3 или биспецифических к EGFR/c-Met молекул, содержащих домен FN3 с низкой аффинностью к c-Met, соединенный с доменом FN3 с высокой аффинностью к EGFR (ECB1). Клетки обрабатывали в течение 1 ч моноспецифическими или биспецифическими молекулами, а затем стимулировали EGF, HGF или комбинацией EGF и HGF в течение 15 мин при 37°С, 5% CO2. Клетки лизировали лизирующим буфером MSD и анализировали сигнализацию в клетках с использованием соответствующих планшетов для анализа MSD в соответствии с инструкциями производителя, как описано выше.
- 59 039356
Домен FN3 с низкой аффинностью к c-Met ингибировал фосфорилирование c-Met со значением IC50, равным 610 нМ (фиг. 4). Как и ожидалось, домен FN3, связывающийся с EGFR, не был способен ингибировать фосфорилирование c-Met, а смесь моноспецифических молекул выглядела идентично одному домену FN3, связывающемуся с c-Met. Однако биспецифическая к EGFR/c-Met молекула ингибировала фосфорилирование c-Met с IC50, равным 1 нМ (фиг. 4), т.е. с обеспечением сдвига эффективности более чем на 2 порядка относительно одной моноспецифической к c-Met молекулы.
Потенциал биспецифической к EGFR/c-Met молекулы в отношении увеличения ингибирования фосфорилирования c-Met и/или EGFR посредством эффекта авидности оценивали на множестве типов клеток с различными значениями плотности и соотношениями c-Met и EGFR (фиг. 5). Клетки NCI-H292, NCI-H441 или NCI-H596 высеивали на 96-луночные планшеты в среду RPMI, содержащую 10% FBS. Через 24 ч среду заменяли на бессывороточную RPMI. Через 24 ч после бессывороточной среды клетки обрабатывали разными концентрациями моноспецифического домена FN3, связывающегося с EGFR, моноспецифического домена FN3, связывающегося с c-Met, или биспецифической к EGFR/c-Met молекулы (ЕСВ5, образован из P53A1R5-17v2 и P114AR7P94-A3). Клетки обрабатывали в течение 1 ч моноспецифическими или биспецифическими молекулами, а затем стимулировали EGF, HGF или комбинацией EGF и HGF в течение 15 мин при 37°С, 5% CO2. Клетки лизировали лизирующим буфером MSD и анализировали сигнализацию в клетках с использованием соответствующих планшетов для анализа MSD в соответствии с инструкциями производителя, как описано выше.
На фиг. 5А-5С показано ингибирование EGFR с помощью моноспецифического домена FN3, связывающегося с EGFR, по сравнению с биспецифической к EGFR/c-Met молекулой в трех разных клеточных линиях. Для анализа авидности в анализе на фосфорилирование EGFR домен FN3, связывающийся с EGFR со средней аффинностью (1,9 нМ) (P53A1R5-17v2), сравнивали с биспецифической к EGFR/c-Met молекулой, содержащей тот же домен FN3, связывающийся с EGFR, соединенный с доменом FN3, связывающимся с c-Met с высокой аффинностью (0,4 нМ) (P114AR7P94-A3). В клетках NCI-H292 и Н596 ингибирование фосфорилирования EGFR для моноспецифических и биспецифических молекул было сопоставимым (фиг. 5А и 5В), вероятно, вследствие того, что данные клеточные линии имели высокое соотношение рецепторов EGFR и с-Met. Для проверки данной теории оценивали ингибирование фосфорилирования EGFR в клетках NCI-H441, содержащих больше рецепторов c-Met, чем EGFR. Обработка клеток NCI-H441 биспецифической к EGFR/c-Met молекулой снижала IC50 для ингибирования фосфорилирования EGFR по сравнению с моноспецифическим доменом FN3, связывающимся с EGFR, в 30 раз (фиг. 5С).
Потенциал увеличения эффективности в случае биспецифической к EGFR/c-Met молекулы оценивали в анализе фосфорилирования c-Met с использованием молекулы с высокой аффинностью к EGFR (0,26 нМ) и средней аффинностью к c-Met (10,1 нМ). Как в клетках NCI-H292, так и в клетках NCI-H596 ингибирование фосфорилирования c-Met биспецифической молекулой было увеличено по сравнению с моноспецифическим доменом FN3, связывающимся с c-Met, в 134 и 1012 раз соответственно (фиг. 3D и 3Е).
Было подтверждено, что увеличенная эффективность ингибирования фосфорилирования EGFR и c-Met биспецифическими к EGFR/c-Met молекулами отражается в увеличенном ингибировании сигнализации и пролиферации. В данных экспериментах смесь доменов FN3, связывающихся с EGFR, и доменов FN3, связывающихся с c-Met, сравнивали с биспецифической к EGFR/c-Met молекулой. Как описано в табл. 12 и 13, значения IC50 для фосфорилирования ERK (табл. 12) и пролиферации клеток NCI-H292 (табл. 13) были снижены при обработке клеток биспецифической к EGFR/c-Met молекулой по сравнению с моноспецифическими связывающими соединениями. IC50 для ингибирования фосфорилирования ERK биспецифической к EGFR/c-Met молекулой было в 143 раза ниже, чем в случае смеси двух моноспецифических к EGFR и c-Met доменов FN3, что демонстрирует влияние авидности на эффективность молекул в данном анализе. В табл. 12 моноспецифические домены FN3, связывающиеся с EGFR и c-Met, не полностью ингибируют активность, и, следовательно, показанные значения IC50 следует считать нижними пределами. Анализ пролиферации выполняли с использованием разных комбинаций доменов FN3, связывающихся с EGFR и c-Met, либо в виде смеси, либо в виде связанных в биспецифический формат. IC50 для ингибирования пролиферации для биспецифической к EGFR/c-Met молекулы было в 34-236 раза ниже, чем при использовании смеси моноспецифических исходных доменов FN3, связывающихся с EGFR и c-Met. Это подтверждает, что эффект авидности, наблюдавшийся на уровне рецепторов (фиг. 4 и 5), преобразуется в улучшение ингибирования сигнализации в клетках (табл. 12) и пролиферации (табл. 13).
- 60 039356
Таблица 12
Специфичность молекулы, содержащей домены FN3 Название клона Тип 1С5о (нМ) (фосфорилирование ERK)
EGFR P54AR4-83v2 Моноспецифическая > 10 000
c-Met P114AR5P74-A5 Моноспецифическая 2366
EGFR или сMet P54AR4-83v2 + P114AR5P74-A5 Смесь моноспецифических молекул 798,4
EGFR и c-Met ECB1 Биспецифическая молекула 5,6
Таблица 13
Домен FN3, связывающийся с EGFR (аффинность) Домен FN3, связывающийся с c-Met (аффинность) ICso для смеси моноспецифических молекул (нМ) IC50 ДЛЯ биспецифической молекулы (нМ) Кратность увеличения 1С5о для смеси моноспецифических/ биспецифических
P54AR4-83V2 (0,26 нМ) Р114ARP94-A3 (0,4 нМ) 36,5 1,04 35
P54AR4-83v2 (0,26 нМ) Р114AR7P93-H9 (3,3 нМ) 274,5 8,05 34
P54AR4-83V2 (0,26 нМ) Р114AR5P74-A5 (10,1 нМ) 1719 7,29 236
Опухолевые ксенотрансплантаты in vivo:фармакокинетика/фармакодинамика (ФК/ФД).
Для определения эффективности молекул моноспецифических и биспецифических доменов FN3 in vivo были сконструированы опухолевые клетки, секретирующие человеческий HGF (мышиный HGF не связывается с человеческим c-Met). Человеческий HGF стабильно экспрессировался в клетках NCI-H292 с использованием инфицирования лентивирусом (лентивирусный ДНК-вектор, экспрессирующий человеческий HGF (№ по кат. X16322), и набор для лентивирусной упаковки производства Genecopoeia). После инфицирования экспрессирующие HGF клетки выбирали, используя 4 мкг/мл пуромицина (Invitrogen). Человеческий белок HGF обнаруживали в кондиционированной среде объединенных клеток с использованием планшетов для анализа производства MesoScale Discovery.
Мышей SCID Beige подкожно инокулировали клетками NCI-H292, экспрессирующими человеческий HGF (2,0х106 клеток в Cultrex (Trevigen) в объеме 200 мкл), в дорсальную часть бока каждого животного. Измерения опухолей проводили дважды в неделю до тех пор, пока объем опухоли не составил 150-250 мм3. Затем мышам и/п вводили одну дозу биспецифических к EGFR/c-Met молекул (связанных с альбумин-связывающим доменом для увеличения периода полужизни) или носитель PBS. Через 6 или 72 ч после введения опухоли извлекали и немедленно замораживали в жидком азоте. Образцы крови собирали посредством кардиальной пункции в 3,8% цитрат, содержащий ингибиторы протеаз. Сразу же после сбора образцы крови центрифугировали и полученную плазму переносили в пробирки для образцов и хранили при -80°С. Опухоли взвешивали, разрезали на небольшие части и лизировали в пробирках Lysing Matrix A (LMA), содержащих буфер RIPA с ингибиторами протеаз/фосфатаз HALT (Pierce), 50 мМ фторида натрия (Sigma), 2 мМ активированного ортованадата натрия (Sigma) и 1 мМ PMSF (MesoScale Discovery). Лизаты удаляли из матрицы LMA и центрифугировали для удаления нерастворимого белка. Растворимый белок опухоли количественно определяли в анализе на белок ВСА и разбавляли до эквивалентных уровней белка в лизирующем буфере для опухоли.
Фосфорилированные c-Met, EGFR и ERK измеряли при помощи планшетов для анализов MesoScale Discovery (в соответствии с протоколом производителя и приведенным выше описанием).
На фиг. 6 показаны результаты экспериментов. Каждая биспецифическая к EGFR/c-Met молекула существенно снижала уровни фосфорилирования c-Met, EGFR и ERK как через 6 ч, так и через 72 ч. Данные, представленные на фиг. 6, показывают важность одновременного ингибирования как c-Met, так и EGFR, а также то, как аффинность биспецифической к EGFR/c-Met молекулы для каждого рецептора влияет на ингибирование расположенной ниже ERK. Молекулы, содержащие домены FN3, связывающиеся с EGFR с высокой аффинностью (P54AR4-83v2; показан на фигуре как элемент 8, KD=0,26 нМ), ингибировали фосфорилирование EGFR в большей степени, чем молекулы, содержащие домены FN3, связывающиеся с EGFR со средней аффинностью (P53A1R5-17v2; показан на фигуре как элемент 17, KD=1,9 нМ), как через 6 ч, так и через 72 ч. Все четыре протестированные биспецифические молекулы полностью ингибировали фосфорилирование ERK в момент времени через 6 ч независимо от аффинности. Через момент времени 72 ч молекулы, содержащие домен, связывающийся с c-Met с высокой аффинностью (P114AR7P94-A3; показан на фигуре как элемент A3, KD=0,4 нМ), существенно ингибировали фосфорилирование ERK по сравнению с доменом FN3, связывающимся с c-Met со средней аффинностью (P114AR5P74-A5; показан на фигуре как элемент А5; KD=10,1 нМ; фиг. 6).
Концентрацию каждой биспецифической к EGFR/c-Met молекулы измеряли через 6 и 72 ч после введения в крови и в опухоли (фиг. 7). Интересно, что биспецифическая молекула с доменом, связывающимся с EGFR со средней аффинностью (P53A1R5-17v2; KD=1,9 нМ), но с доменом FN3, связывающимся с c-Met с высокой аффинностью (P114AR7P94-A3; KD=0,4 нМ), демонстрировала существенно боль
- 61 039356 шее накопление через 6 ч относительно других молекул, хотя различие исчезало к 72 ч. Можно предположить, что клетки за пределами опухоли имеют на поверхности более низкие уровни экспрессии как EGFR, так и c-Met, и, следовательно, молекула со средней аффинностью к EGFR не связывается с нормальной тканью так прочно, как домен FN3, связывающийся с EGFR с высокой аффинностью. Следовательно, для связывания с опухолью остается больше свободного домена FN3, связывающегося с EGFR со средней аффинностью. Следовательно, определение соответствующих значений аффинности к каждому рецептору может позволить обнаружить терапевтическое средство со сниженными значениями системной токсичности и повышенным накоплением в опухоли.
Исследования эффективности биспецифических к EGFR/c-Met молекул в отношении опухоли.
Мышей SCID Beige подкожно инокулировали клетками NCI-H292, экспрессирующими человеческий HGF (2,0x106 клеток в Cultrex (Trevigen), 200 мкл), в дорсальную часть бока каждого животного. Через одну неделю после имплантации мышей делили на группы с эквивалентными объемами опухолей (средний объем опухоли = 77,9 ± 1,7 мм3). Мышам три раза в неделю вводили биспецифические молекулы и дважды в неделю регистрировали объем опухоли.
Ингибирование роста опухоли (TGI) наблюдали при использовании четырех разных биспецифических молекул с разными значениями аффинности к c-Met и EGFR. На фиг. 8 показано преимущество ингибирования как c-Met, так и EGFR, поскольку наблюдали задержку роста опухоли у мышей, получавших домен FN3, связывающийся с EGFR с высокой аффинностью, по сравнению с доменом FN3, связывающимся с EGFR со средней аффинностью, когда домен FN3, связывающийся с c-Met, имел среднюю аффинность (незаштрихованные и заштрихованные треугольники, P54AR4-83v2- P114AR5P74-A5 по сравнению с P53A1R5-17-P114AR5P74-A5). Кроме того, данные показывают значимость наличия домена FN3, связывающегося с c-Met с высокой аффинностью, поскольку биспецифические молекулы, содержащие домены FN3, связывающиеся с EGFR либо с высокой, либо со средней аффинностью, но домен FN3, связывающийся с c-Met с высокой аффинностью, показал наибольшую эффективность (пунктирные серые и черные линии, P54AR4-83v2-P114AR7P94-A3 и P53A1R5-17v2-P114AR7P94-A3).
Эффективность биспецифической молекулы и других ингибиторов EGFR и c-Met.
Терапевтическую эффективность in vivo биспецифической к EGFR/c-Met молекулы (ЕСВ38) и низкомолекулярных ингибиторов кризотиниба (ингибитор c-Met) и эрлотиниба (ингибитор EGFR), цетуксимаба (антитело к EGFR), каждого по отдельности, а также комбинации кризотиниба и эрлотиниба оценивали в модели подкожной ксенотрансплантации клеток человеческого рака легких H292-HGF у мышей SCID/Beige.
Клетки H292-HGF культивировали in vitro в среде RPMI1640 с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки (10% об./об.) и L-глутамина (2 мМ) при 37°С в воздушной атмосфере с 5% CO2. Клетки регулярно пересевали дважды в неделю с обработкой трипсин-ЭДТА. Клетки, достигшие фазы экспоненциального роста, собирали и подсчитывали для инокуляции опухоли.
Для развития опухоли каждой мыши подкожно инокулировали опухолевые клетки в область правого бока H292-HGF (2x106) в 0,1 мл PBS с Cultrex (1:1). Лечение начинали, когда средний размер опухоли достигал 139 мм3. Введение тестового продукта и число животных в каждой экспериментальной группе показаны в следующей таблице плана эксперимента. Дату инокуляции опухолевыми клетками обозначали как 0 сутки. В табл. 14 показаны группы лечения.
Таблица 14
Группа N Лечение Доза (мг/кг) Способ введения Плановый график Фактический график
1 10 Контроль с носителем 0 и/п QD х 3 недели QD х 3 недели
2 10 Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула 25 и/п 3 раза в неделю х 3 недели 3 раза в неделю х 3 недели
3 10 Кризотиниб 50 п/о QD х 3 недели QD х 17 суток
4 10 Эрлотиниб 50 п/о QD х 2 недели QD х 3 недели
5 10 Кризотиниб 50 п/о QD х 3 недели QD х 3 недели
6 10 Цетуксимаб 1 мг/мышь и/п Q4d х 6 Q4d х 6
N: число животных;
п/о: пероральное введение;
и/п: интраперитонеальная инъекция 3 раза в неделю: введение доз в 1, 3 и 5 сутки недели;
QD: один раз в сутки;
Q4d: один раз в четверо суток;
интервал для комбинации кризотиниба и эрлотиниба составлял 0,5 ч;
объем введения корректировался с учетом веса тела (10 л/г);
а: дозу не давали на 14 сутки после разбиения на группы.
Перед началом лечения всех животных взвешивали и измеряли объемы опухолей. Поскольку объем опухоли может влиять на эффективность любого заданного лечения, мышей распределяли по группам в
- 62 039356 соответствии с планом с рандомизированными блоками на основе их объемов опухолей. Это гарантирует, что все группы в исходном состоянии будут сопоставимы. Для распределения экспериментальных животных по группам применяли план с рандомизированными блоками. Во-первых, экспериментальных животных делили на однородные блоки в соответствии с их исходным размером опухолей. Во-вторых, в пределах каждого блока проводили рандомизацию экспериментальных животных по типам лечения. Распределение экспериментальных животных с использованием плана с рандомизированными блоками гарантирует, что у всех животных имеется одинаковая вероятность получения заданного типа лечения, и, следовательно, снижается систематическая ошибка.
Во время регулярного контроля у животных проверяли наличие каких-либо воздействий роста опухоли и видов лечения на нормальное поведение, например, на подвижность, визуальную оценку потребления корма и воды, прирост/потерю веса тела (вес тела измеряли дважды в неделю), помутнение глаз/шерсти и любые другие аномальные эффекты.
Конечный критерий оценки - можно ли замедлить рост опухоли или излечить мышей-носителей опухоли. Размер опухоли измеряли дважды в неделю в двух направлениях с использованием штангенциркуля; объем выражали в мм3 с использованием формулы V=0,5 аxb2, где а и b представляют собой большой и малый диаметры опухоли соответственно. Затем размер опухоли использовали для вычислений значений как Т - С, так и Т/С. Вычисляли значение Т - С, где Т - время (в сутках), необходимое для того, чтобы опухоль среднего размера в группе лечения достигла 1000 мм3, а С - время (в сутках), необходимое для того, чтобы опухоль среднего размера в контрольной группе достигла того же размера. Значение Т/С (в процентах) представляло собой показатель противоопухолевой эффективности; Т и С представляли собой средний объем опухоли в группе лечения и контрольной группе соответственно в заданные сутки. Полную регрессию опухоли (CR) определяли как уменьшение опухоли до предела, который не обнаруживается при пальпации (62,5 мм3). Частичную регрессию опухоли (PR) определяли как уменьшение опухоли относительно исходного объема опухоли. Чтобы CR или PR расценивались как устойчивые, требовалось, чтобы CR или PR определялись минимум в течение трех или более последовательных измерений опухоли.
Животных, у которых потеря массы тела превышала 20% или у которых средний размер опухоли в группе превышал 2000 мм3, усыпляли. Исследование завершали через две недели наблюдения после введения конечной дозы.
В табл. 15 показана сводная статистика, включающая среднее и стандартную погрешность среднего (СПС) для объема опухоли в каждой группе и в каждый момент времени. Статистические анализы различий в объеме опухоли между группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими отдельными сравнениями с использованием критерия ГеймсаХоуэлла (не предполагающим равные дисперсии). Все данные анализировали с использованием SPSS 18.0. Значение p<0,05 считалось статистически значимым.
Таблица 15
Сутки Объем опухоли (мм3)а
Носитель Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула 25 мг/кг Кризотиниб 50 мг/кг Эрлотиниб 50 мг/кг Кризотиниб; эрлотиниб 50 мг/кг; 50 мг/кг Цетуксимаб, 1 мг/мышь
7 139 ±7 137 ±7 140 ±9 141 ±8 139 ±8 139 ± 10
9 230 ± 20 142 ±7 217 ±20 201 ± 19 134 ±9 168 ± 13
13 516 ±45 83 ±6 547 ± 43 392 ± 46 109 ± 10 212 ±20
16 808 ± 104 44 ±7 914 ±92 560 ± 70 127 ± 15 252 ± 28
20 1280 ± 209 30 ±6 1438 ±239 872 ±136 214 ±30 371 ±48
23 1758 ±259 23 ±7 2102 ±298 1122 ±202 265 ± 40 485 ±61
27 2264 ±318 21 ± 5 — 1419 ±577 266 ± 42 640 ± 82
30 — 23 ±6 — 1516 ±623 482 ±61 869 ± 100
Средний размер опухоли у группы, получавшей лечение носителем (группа 1), достиг 1758 мм3 на 23 сутки после инокуляции опухоли. Лечение биспецифической к EGFR/c-Met молекулой при уровне дозы 25 мг/кг (группа 2) приводило к полной регрессии опухоли (CR) у всех мышей, которая была устойчива при >3 последовательных измерениях опухоли (среднее значение объема опухоли 23 мм3, значение Т/С=1%, р=0,004, в сравнении с группой с носителем, на 23 сутки).
Лечение кризотинибом в виде единственного агента при уровне дозы 50 мг/кг (группа 3) не показало противоопухолевой активности; средний размер опухоли составил 2102 мм3 на 23 сутки (значение Т/С=120%, р=0,944 по сравнению с группой с носителем).
Лечение эрлотинибом в качестве единственного агента при уровне дозирования 50 мг/кг (группа 4) показало небольшую противоопухолевую активность, но существенных отличий от группы с носителем выявлено не было; средний размер опухоли составил 1122 мм3 на 23 сутки (значение Т/С=64%, р=0,429 по сравнению с группой с носителем) с замедлением роста опухоли при 1000 мм3 на 4 суток по сравнению с группой с носителем.
- 63 039356
Комбинация кризотиниба (50 мг/кг, группа 5) и эрлотиниба (50 мг/кг, группа 5) показала существенную противоопухолевую активность; средний размер опухоли составил 265 мм3 на 23 сутки (Т/С=15%, р=0,008) с замедлением роста опухоли при 1000 мм3 на 17 суток по сравнению с группой с носителем.
Цетуксимаб при уровне дозирования 1 мг/мышь в качестве единственного агента (группа 6) показал существенную противоопухолевую активность; средний размер опухоли составил 485 мм3 на 23 сутки (Т/С=28%, р=0,018) с замедлением роста опухоли при 1000 мм3 на 17 суток по сравнению с группой с носителем. На фиг. 15 и в табл. 16 показаны значения противоопухолевой активности различных терапевтических средств.
Таблица 16
Лечение Размер опухоли (мм3) на 23 сутки Т/С (%) Т - С (сутки) при 1000 мм3 Значение Р
Носитель 1758 + 259 - - -
Биспецифическая к EGFR/c-Met молекула (25 мг/кг) 23 + 7 1 — 0,004
Кризотиниб (50 мг/кг) 2102 + 298 120 -1 0,944
Эрлотиниб (50 мг/кг) 1122 + 202 64 4 0,429
Кризотиниб + эрлотиниб (50 мг/кг + 50 мг/кг) 265 ± 40 15 17 0,008
Цетуксимаб (1 мг/мышь) 485 + 61 28 17 0,018
В группе с носителем наблюдали потерю веса от средней до высокой тяжести, что может быть связано с увеличением влияния опухоли; 3 мыши погибли, а 1 мышь усыпили при потере веса > 20% к 23 суткам. В группе 2 наблюдали небольшую токсичность биспецифической к EGFR/c-Met молекулы; 3 мышей усыпили при потере веса >20% в период лечения; вес тела постепенно восстановился после отмены лечения в течение 2-недельного периода наблюдения. Более тяжелую потерю веса наблюдали в группе монотерапии кризотинибом или эрлотинибом по сравнению с группой с носителем, что указывает на связанную с лечением токсичность. Комбинация кризотиниба и эрлотиниба по существу переносилось на фазе введения, но к концу исследования наблюдали сильную потерю веса, что может быть связано с возобновлением быстрого роста опухоли в период отсутствия лечения. Монотерапия цетуксимабом в настоящем исследовании хорошо переносилась; потерю веса наблюдали только к концу исследования из-за продолжения роста опухоли.
Таким образом, биспецифическая к EGFR/c-Met молекула при 25 мг/кг (3 раза в неделюх3 недели) обеспечивала полный ответ в модели ксенотрансплантации клеток человеческого рака легких H292-HGF мышам SCID/Beige. Лечение перенесли 7 из 10 мышей, и сильную потерю веса наблюдали у 3 из 10 мышей. На фиг. 9 показано влияние различных терапевтических средств на размер опухоли в моменты времени после лечения.
Пример 8. Продление периода полужизни биспецифических к EGFR/c-Met молекул.
Было описано множество способов уменьшения почечной фильтрации и, таким образом, продления периода полужизни белков в сыворотке, включая модификацию полиэтиленгликолем (ПЭГ) или другими полимерами, связывание с альбумином, слияние с доменами белков, которые связываются с альбумином или другими сывороточными белками, генетическое слияние с альбумином, слияние с Fc-доменами IgG и слияние с длинными неструктурированными аминокислотными последовательностями.
Биспецифические к EGFR/c-Met молекулы модифицировали ПЭГ для увеличения гидродинамического радиуса путем встраивания свободного цистеина в С-конце молекулы. Чаще всего свободная тиольная группа цистеинового остатка используется для присоединения молекул ПЭГ, которые функционализировали группами малеимида или йодацетимида с использованием стандартных способов. Для модификации белка можно использовать различные формы ПЭГ, включая линейные ПЭГ с массой 1000, 2000, 5000, 10000, 20000 или 40000 кДа. Разветвленные молекулы ПЭГ с этой молекулярной массой также можно использовать для модификации. В некоторых случаях группы ПЭГ также можно присоединять при помощи первичных аминов в биспецифических к EGFR/c-Met молекулах.
Помимо пегилирования, период полужизни биспецифических к EGFR/c-Met молекул продлевали путем формирования данных белков в виде слитных молекул с встречающимся в естественных условиях 3-спиральным связывающимся с сывороточным альбумином доменом (ABD) или консенсусным альбумин-связывающим доменом (ABDCon). Данные белковые домены присоединяли к С-концу домена FN3, связывающегося с c-Met, посредством любого из линкеров, описанных в табл. 12. Домен ABD или ABDCon также можно помещать в первичную последовательность между доменом FN3, связывающимся с EGFR, и доменом FN3, связывающимся с c-Met.
Пример 9. Характеризация биспецифических к EGFR/c-Met молекул.
Выбранные биспецифические к EGFR/c-Met молекулы характеризовали по их аффинности как к
- 64 039356
EGFR, так и к c-Met, по их способности ингибировать аутофосфорилирование EGFR и c-Met и по их влиянию на пролиферацию клеток HGF. Аффинность связывания биспецифических к EGFR/c-Met молекул с рекомбинантным внеклеточным доменом EGFR и/или c-Met дополнительно оценивали методами поверхностного плазмонного резонанса с помощью прибора Proteon (BioRad) в соответствии с протоколом, описанным в примере 3. Результаты характеризации показаны в табл. 17.
Таблица 17
Kd (EGFR, нМ) Kd (c-Met, нМ) Ингибирование pMet в клетках H441 (IC50, нМ) H292 - ингибирование pEGFR в клетках H292 (IC50, нМ) H292-HGF Ингибирование пролиферации в индуцированных HGF клетках Н292 (1С50, нМ)
ECB15 0,2 2,6 Н/Д 4,2 23
ECB94 1 4,3 53,8 5,1 29,6
ECB95 1,1 6,2 178,8 13,6 383,4
ECB96 1,6 22,1 835,4 24,7 9480
ECB97 1,3 1,7 24,2 16,6 31,0
ECB106 16,7 5,1 53,3 367,4 484,5
ECB107 16,9 9 29,9 812,3 2637
ECB108 15,3 25,5 126,2 814,4 11372
ECB109 17,3 2,1 26 432 573,6
Пример 10. Создание биспецифических к EGFR/c-Met антител.
Несколько моноспецифических к EGFR и c-Met антител экспрессировали в виде IgG1, каппа, имеющего Fc-замены K409R или F405L в их Fc-участках (нумерация соответствует каталогу ЕС). Моноспецифические антитела экспрессировали в двух клеточных линиях СНО, причем одна линия имела сниженную способность к фукозилированию, что позволило получить антитела с содержанием фукозы в полисахаридной цепи антитела 1-15%.
Моноспецифические антитела очищали с помощью стандартных способов с использованием колонки с белком А (колонка HiTrap MabSelect SuRe). После элюирования пулы диализировали в D-PBS, рН 7,2.
Биспецифические к EGFR/c-Met антитела создавали, объединяя моноспецифическое mAb к EGFR и моноспецифическое mAb к c-Met во время обмена Fab-плечами in vitro (как описано в WO 2011/131746). Вкратце, приблизительно 1-20 мг/мл каждого антитела в молярном соотношении 1:1 в PBS, рН 7-7,4 и 75 мМ 2-меркаптоэтаноламина (2-МЕА) смешивали вместе и инкубировали при 25-37°С в течение 2-6 ч, после чего удаляли 2-МЕА посредством диализа, диафильтрации, тангенциальной поточной фильтрации и фильтрации в вихревой ячейке с помощью стандартных способов.
Несколько моноспецифических антител к EGFR и антител к c-Met объединяли во время обмена Fab-плечами in vitro в матриксе с созданием биспецифических антител, которые впоследствии дополнительно характеризовали. Созданные биспецифические антитела ранжировали с применением четырехстадийной стратегии с помощью указанных ниже анализов.
Стадия 1: связывание с клетками NCI-H441, NCI-H1975 и А549 в анализе FACS (сортировка клеток с возбуждением флуоресценции).
Стадия 2: ингибирование фосфорилирования pMet в клетках А549.
Стадия 3: ингибирование пролиферации клеток NCI-H1975, KP4 и NCI-H441.
Стадия 4: ингибирование фосфорилирования EGFR в клетках А549 и SNU-5.
Следует отметить, что характеристики исходных антител в биспецифическом антителе не сохранялись. Например, присутствие некоторых связывающихся с EGFR плеч в биспецифическом антителе приводило к утрате или снижению ингибирования или к усилению фосфорилирования c-Met. Пары отобрали на основе характеризационных исследований.
Было создано моноспецифическое двухвалентное антитело к EGFR, E1-K409R, содержащее участки VH и VL антитела к EGFR 2F8, имеющего VH с SEQ ID NO: 189 и VL с SEQ ID NO: 190 (антитело 2F8 описано в международной патентной публикации № WO 2002/100348) и константный участок IgG1 с заменой K409R.
Было создано моноспецифическое двухвалентное антитело к EGFR, E1-F405L, содержащее участки VH и VL антитела к EGFR 2F8, имеющего VH с SEQ ID NO: 189 и VL с SEQ ID NO: 190 (антитело 2F8 описано в международной патентной публикации № WO 2002/100348) и константный участок IgG1 с заменой F405L.
Было создано моноспецифическое двухвалентное антитело к EGFR, E2-K409R, содержащее участки VH и VL антитела к EGFR 018, имеющего VH с SEQ ID NO: 191 и VL с SEQ ID NO: 192 (антитело 018 описано в международной патентной публикации № WO 2009/030239) и константный участок IgG1 с заменой K409R.
Было создано моноспецифическое двухвалентное антитело к EGFR, E2-F405L, содержащее участки VH и VL антитела к EGFR 018, имеющего VH с SEQ ID NO: 191 и VL с SEQ ID NO: 192 (антитело 018
- 65 039356 описано в международной патентной публикации № WO 2009/030239) и константный участок IgG1 с заменой F405L.
Было создано моноспецифическое двухвалентное антитело к c-Met, M1-K409R, содержащее участки VH и VL антитела к c-Met 069, имеющего VH с SEQ ID NO: 193 и VL с SEQ ID NO: 194 (антитело 069 описано в WO 2011/110642), и константный участок IgG1 с заменой K409R.
Было создано моноспецифическое двухвалентное антитело к c-Met, M1-F405L, содержащее участки VH и VL антитела к c-Met 069, имеющего VH с SEQ ID NO: 193 и VL с SEQ ID NO: 194 (антитело 069 описано в WO 2011/110642), и константный участок IgG1 с заменой F405L.
Было создано моноспецифическое антитело к c-Met, M2-K409R, содержащее участки VH и VL антитела к c-Met 058, имеющего VH с SEQ ID NO: 195 и VL с SEQ ID NO: 196 (антитело 058 описано в WO 2011/110642), и константный участок IgG1 с заменой K409R.
Было создано моноспецифическое антитело к c-Met, M2-F405L, содержащее участки VH и VL антитела к c-Met 058, имеющего VH с SEQ ID NO: 195 и VL с SEQ ID NO: 196 (антитело 058 описано в WO 2011/110642), и константный участок IgG1 с заменой F405L.
Последовательности VH, VL, НС и LC антител показаны ниже:
> SEQ ID NO: 189, mAb к EGFR El VH
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVS S > SEQ ID NO: 190, mAb к EGFR El VL
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSES
GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK > SEQ ID NO: 191, mAb к EGFR E2 VH
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMNWVRQA PGKGLEWVAN IKKDGSEKYY
VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL GWGWGWYFDL
- 66 039356
WGRGTLVTVSS > SEQ ID NO: 192, mAb к EGFR E2 VL
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPTFGQ GTKVEIK > SEQ ID NO: 193, mAb к c-Met Ml VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGYTNYAQ KLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTLVTVSS > SEQ ID NO: 194, mAb к c-Met M1VL
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP-ITFGQGTRLEIK > SEQ ID NO: 195, mAb к c-Met М2 VH
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDDGSYTYYPDS VKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGLYYYGSGSYYNQDYWGQGTLVTVSS > SEQ ID NO: 196 c-Met mAb М2 VL
QLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGLSSALAWYRQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSYPQITFGQGTRLEIK > SEQ ID NO: 199, EMl-mAb Hl (антитело к EGFR,405L)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK > SEQ ID NO: 200, EM-1 mAb LI
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSES GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC > SEQ ID NO: 201, EM-1 mAb H2 (K409R, антитело к c-Met)
- 67 039356
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGYTNYAQ KLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK > SEQ ID NO: 202, EM-1 mAb L2
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC > SEQ ID NO: 234, E2-mAb HCl (EGFR-F405L)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMNWVRQA PGKGLEWVAN IKKDGSEKYY VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL
GWGWGWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > SEQ ID NO: 235, E2-mAb LC1 (EGFR)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > SEQ ID NO: 236, E2-mAb HC2 (c-Met-K409R)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDDGSYTYYPDS VKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGLYYYGSGSYYNQDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK > SEQ ID NO: 237
E2-mAb LC2 (c-Met)
QLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGLSSALAWYRQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSYPQITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
Созданные моноспецифические антитела к EGFR и c-Met смешивали для обмена Fab-плечами in vitro в матриксе и охарактеризовывали с помощью различных анализов. Биспецифическое антитело EM1-mAb содержит связывающееся с EGFR плечо mAb E1-F405L и связывающееся с c-Met плечо mAb M1-K409R. Биспецифическое антитело EM2-mAb содержит связывающееся с EGFR плечо mAb E2-F405L и связывающееся с c-Met плечо mAb M2-K409R. Биспецифическое антитело ЕМЭ-mAb содержит связывающееся с EGFR плечо mAb E1-K409R и связывающееся с c-Met плечо mAb M1-F405L. Биспецифическое антитело EM4-mAb содержит связывающееся с EGFR плечо mAb E2-K409R и связывающееся с c-Met плечо mAb M2-F405L. EM1-mAb и ЕМЭ-mAb имели сопоставимые характеристики.
Биспецифическое антитело EM1-mAb культивировали в клеточной линии СНО, имеющей сниженную способность к фукозилированию гликопротеинов, и которое, следовательно, имело содержание фукозы приблизительно 1-15%. Удаление центральной фукозы из 2-антенарных олигосахаридов комплексного типа, присоединенных к Fc-участкам, существенно усиливает ADCC антител посредством улучшенного связывания с FcYRIIIa без изменения связывания с антигеном или комплемент-зависимой (CDC) активности. Такие mAb можно получить с помощью разных способов, которые, по сообщениям, приводят к успешной экспрессии терапевтических антител с относительно высоким дефукозилированием, ко- 68 039356 торые содержат описанные выше 2-антенарные олигосахариды комплексного типа в Fc-участках.
Пример 11. Очистка биспецифических к EGFR/c-Met антител.
Биспецифическое антитело EM1-mAb дополнительно очищали после обмена Fab-плечами in vitro при помощи хроматографии с гидрофобным взаимодействием для сведения к минимуму остаточного содержания исходных антител к c-Met и EGFR с помощью стандартных способов.
Пример 12. Характеризация биспецифических к EGFR/c-Met антител.
В различных анализах тестировали характеристики биспецифического к EGFR/c-Met антитела EM1-mAb, включая ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR, стимулированного HGF фосфорилирования c-Met, фосфорилирования ERK1/2, фосфорилирования AKT, ингибирования связывания лиганда и жизнеспособности клеток. Характеристики EM1-mAb сравнивали с контрольными одновалентными связывающимися с EGFR или c-Met антителами, а также с известными ингибиторами EGFR, такими как эрлотиниб (CAS 183321-74-6; ингибитор тирозинкиназ) и цетуксимаб (CAS 205923-56-4).
Так как антитела, являющиеся исходными для mAb EM-1 антителами, являются двухвалентными, контрольные одновалентные антитела к EGFR и c-Met были созданы в биспецифическом формате в комбинации с Fab-плечом, связывающим неродственный/несвязанный антиген, для более точного сравнения синергии и авидности биспецифического mAb EM-1 со смесью соответствующих контрольных одновалентных молекул.
Для создания контрольных одновалентных антител к EGFR и c-Met было создано моноспецифическое антитело к gp120 ВИЧ, gp120-K409R, содержащее тяжелую цепь с SEQ ID NO: 198 и легкую цепь с SEQ ID NO: 209. Было создано моноспецифическое антитело к gp120 ВИЧ, gp120-F405L, содержащее тяжелую цепь с SEQ ID NO: 197 и легкую цепь с SEQ ID NO: 209.
Контрольное одновалентное mAb к EGFR, E1-F405L-gp120-K409R, создали путем обмена Fab-плечами in vitro между E1-F405L и gp120-K409R, а контрольное одновалентное mAb к c-Met, M1-K409R-gp120-F405L, создали путем обмена Fab-плечами in vitro между M1-K409R и gp120-F405L и очистили так, как описано ранее.
Для характеризации биспецифических антител использовали следующие клеточные линии: NCI-H292 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), № по кат. CRL-1848), NCI-H1975 (АТСС, № по кат. CRL-5908 ), SKMES-1 (АТСС, № по кат. НТВ-58), А431 (АТСС, № по кат. CRL-1555), NCI-H441 (АТСС, № по кат. НТВ-174), NCI-H3255 (хранилище опухолевых/линейных клеток DCTD, NCI, Frederick, NCI-Navy Medical oncology Cell Line supplement. J. Cell Biochem suppl 24, 1996; Tracy S. Cancer Res. 64:7241-4, 2004; Shimamura T. Cancer Res. 65:6401-8, 2005) и HCC-827 (ATCC, № по кат. CRL-2868). Клетки NCI-H292 и SKMES-1 экспрессируют как EGFR дикого типа, так и c-Met дикого типа. NCI-3255 экспрессирует мутант L858R EGFR и проявляет амплификацию EGFR и c-Met. Н1975 экспрессирует мутант L858R/T790M EGFR и с-Met дикого типа. НСС-827 экспрессирует Δ (Е746, А750) EGFR и проявляет амплификацию EGFR. Клеточные линии NCI-H292, NCI-H975, NCI-H441 и NCIH3255 в настоящем описании на взаимозаменяемой основе называются соответственно Н292, Н975, Н441 и Н3255.
Связывание биспецифических к EGFR/c-Met антител с EGFR и c-Met на клетках (анализ связывания с клетками А431).
Биспецифическое к EGFR/c-Met антитело ЕМ1-mAb тестировали на связывание с EGFR и c-Met на клетках с помощью протокола, описанного в примере 3 (Анализ связывания с клетками А431) и в примере 6 (Анализ связывания с клетками H441). Цетуксимаб и контрольное одновалентное антитело к EGFR, E1-F405L-gp120-K409R, использовали в качестве контролей для клеток А431. Цетуксимаб имел значение ЕС50 5,0 нМ. В табл. 18 показаны значения ЕС50 для связывания. EM1-mAb продемонстрировало 1,9-кратное (клетки А431) и 2,3-кратное (клетки H441) снижение связывания по сравнению с двухвалентными моноспецифическими исходными контрольными антителами. Цетуксимаб был сопоставим с двухвалентными исходными контрольными антителами. У EM1-mAb наблюдались более высокие значения ЕС50 связывания, чем значения для исходных mAb, вследствие одновалентного связывания EGFR и c-Met. EM1-mAb имело значения ЕС50, аналогичные биспецифическим одновалентным mAb одноплечевое Е1/инертное плечо и Е2/инертное плечо.
- 69 039356
Таблица 18
ЕС50 (нМ) при связывании с клетками
EMl-mAb Исходные шАЬ El-F405L-gpl20-K409R (клетки А431) или Ml - K409R -gpl20- F405L (клетки Н441)
А431 (анализ связывания с EGFR) 9,6 + 3 5,1+0,3 10,1 ±0,6
Н441 (анализ связывания с c-Met) 1,5 + 0,7 0,65 + 0,1 1,0 + 0,3
Ингибирование связывания лиганда с рецептором.
Биспецифические антитела тестировали на их способность блокировать связывание EGF с внеклеточным доменом EGFR и HGF с внеклеточным доменом c-Met в иммуноферментном анализе (ИФА). Рекомбинантный человеческий EGFR-Fc (R&D Systems, № по кат. 344-ER-050) или человеческий HGF (R&D Systems, № по кат. 294-HGN-025/CF) наносили на планшеты MSD HighBind (Meso Scale Discovery, г. Гейтерсберг, штат Мэриленд, США) в течение 2 ч при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли буфер MSD Blocker A (Meso Scale Discovery, г. Гейтерсберг, штат Мэриленд, США) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали 0,1 М буфера HEPES, рН 7,4, с последующим добавлением смеси либо меченного флуоресцентным красителем (MSD) EGF, либо биотинилированных белков HGF с разными концентрациями антител. Меченный рутением белок EGF инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) с увеличивающимися концентрациями разных антител - от 1 нМ до 4 мкМ. После 2 ч культивирования с осторожным встряхиванием при комнатной температуре планшеты трижды промывали 0,1 М буфера HEPES (рН 7,4). Разводили и добавляли буфер MSD Read Buffer T и анализировали сигналы при помощи SECTOR Imager 6000. Анализы ингибирования HGF выполняли по аналогии с анализами ингибирования EGF/EGFR, за исключением того, что 10 нМ биотинилированного HGF инкубировали в течение 30 мин при RT с увеличивающимися концентрациями разных антител - от 1 нМ до 2 мкМ.
EM1-mAb ингибировало связывание EGF с EGFR со значением IC50 10,7±1,2 нМ в присутствии 50 нМ EGF и со значением IC50 10,6±1,5 нМ в присутствии 80 нМ EGF. Исходное двухвалентное антитело ингибировало связывание EGF с EGFR со значением IC50 0,14±1,5 нМ в присутствии 50 нМ EGF и со значением IC50 1,7±1,4 нМ в присутствии 80 нМ EGF. EM1 mAb обладало более слабым ингибированием связывания EGF с внеклеточным доменом EGFR из-за одновалентного связывания EM1 mAb по сравнению с двухвалентным исходным mAb.
EM1-mAb ингибировало связывание HGF с c-Met со значением IC50 29,9±1,5 нМ. Исходное двухвалентное антитело ингибировало связывание HGF с c-Met со значением IC50 14,8±1,6 нМ. EM1 mAb обладало более слабым ингибированием связывания HGF с внеклеточным доменом c-Met из-за одновалентного связывания ЕМ1-mAb по сравнению с исходным двухвалентным mAb.
Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR и стимулированного HGF фосфорилирования c-Met.
Антитела тестировали для определения значений IC50 для ингибирования фосфорилирования EGFR и c-Met. Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR и стимулированного HGF фосфорилирования c-Met оценивали при различных концентрациях антител (итоговая - 0,035-700 нМ), как описано в примере 2 (Ингибирование стимулированного EGF фосфорилирования EGFR) и примере 6 (Ингибирование стимулированного HGF фосфорилирования c-Met). В некоторых экспериментах к клеткам добавляли как EGF, так и HGF, так что один и тот же клеточный лизат можно было использовать для обнаружения как фосфорилирования EGFR, так и фосфорилирования c-Met.
Контрольное mAb к EGFR, E1-F405L-gp120-K409R, одновалентное к EGFR, и исходное двухвалентное антитело к EGFR с низким содержанием фукозы использовали в качестве контрольных антител. В табл. 19 показаны значения IC50 в анализах.
- 70 039356
Таблица 19
pEGFR (1С50, нМ) pMet (1С50, нМ)
Клеточная линия Н292 Н1975 Н292 Н1975
Антитело
EMl-mAb 8,6-29 1,5 0,55-0,83 0,64
El-F405L-gpl20-K409R 10,9-13,1 Н/о 0,7-4 Н/о
Исходное mAb к EGFR (F405L)* 1,5 Н/о Нет эффекта Н/о
*Антитело имело низкое содержание фукозы.
Усиленное ингибирование pERK и pAKT антителом EM1-mAb по сравнению со смесью одновалентных антител (анализ pERK (анализ mAb к pAKT)).
Потенциал усиления эффективности биспецифического к EGFR/c-Met антитела оценивали путем анализа воздействий mAb на сигнализацию pERK и pAKT, расположенную ниже. В этих экспериментах смесь одновалентных контрольных антител к EGFR и одновалентных контрольных антител к c-Met сравнивали с биспецифическим антителом EM1-mAb. Клетки высеивали в прозрачные 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования тканей (Nunc), в 100 мкл/лунка среды RPMI, содержащей GlutaMAX и 25 мМ Hepes (Invitrogen), с добавлением 1 мМ пирувата натрия (Gibco), 0,1 мМ NEAA (Gibco), 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco) и 7,5 нг/мл HGF (R&D Systems, № по кат. 294-HGN) и позволяли прикрепиться в течение ночи при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. Клетки не подвергали воздействию бессывороточной среды. Клетки обрабатывали в течение 30 мин (анализ pERK) или 1 ч (анализ pAkt) с различными концентрациями (итоговая - 0,11-700 нМ) одновалентных контрольных антител или EM1-mAb.
В клетках анализировали уровни pERK или pAKT с помощью представленных ниже комплектов и в соответствии с инструкциями производителя, компании Meso Scale Discovery: Phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187) Assay Whole Cell Lysate Kit (№ по кат. K151DWD, Phospho-Akt (Ser473) Assay Whole Cell Lysate Kit (№ по кат. K151CAD), Phospho-Akt (Thr308) Assay Whole Cell Lysate Kit (№ по кат. K151DYD). При анализе pERK клетки лизировали и цельноклеточные лизаты добавляли на планшеты, покрытые антителом к фосфо-ERK1/2 (распознающим ERK1, фосфорилированную по остаткам Thr202 и Tyr204, и ERK2, фосфорилированную по остаткам Thr185 и Tyr187), и фосфорилированную ERK1/2 обнаруживали с использованием антитела ко всей ERK1/2, конъюгированного с реагентом MSD SULFO-TAG™. При анализе pAKT Ser473 захватывающим антителом было антитело к общей AKT, а детекторным антителом - антитело к pAKT Ser473, конъюгированное с реагентом MSD SULFO-TAG™. При анализе pAKT Thr308 захватывающим антителом было антитело к общей AKT, а детекторным антителом - антитело к pAKT Thr308, конъюгированное с реагентом MSD SULFO-TAG™.
Планшеты считывали на SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) с использованием настроек, заданных производителем для данного анализа по умолчанию. Строили график зависимости сигнала электрохемилюминесценции от логарифма концентрации антитела и определяли значения IC50 путем аппроксимации данных сигмовидной кривой доза-ответ с переменным наклоном при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 5. В этих анализах использовали клеточные линии NCI-H292, Н1975 и SKMES-1.
IC50 для ингибирования фосфорилирования ERK биспецифическим антителом EM1-mAb было приблизительно в 14-63 раза ниже относительно смеси двух одновалентных контрольных антител, в зависимости от протестированной клеточной линии (табл. 20). Повышенная эффективность EM1-mAb по сравнению со смесью двух одновалентных контрольных антител указывает на кооперативный эффект или эффект авидности вследствие улучшенного связывания EM1 -mAb с этими клеточными линиями. IC50 для ингибирования фосфорилирования AKT по Ser475 (pAKTS475) и Thr308 (pAKTT308) в клеточной линии NCI-H1975 было приблизительно в 75 и 122 раза ниже соответственно по сравнению со смесью двух одновалентных контрольных антител (табл. 21). Повышенная эффективность EM1-mAb по сравнению со смесью двух одновалентных контрольных антител указывает на кооперативный эффект или эффект авидности вследствие улучшенного связывания EM1-mAb с этими клеточными линиями. Таким образом, биспецифический характер EM1-mAb привел к усиленному эффекту в отношении эффекторов нижележащей сигнализации.
- 71 039356
Таблица 20
1С50 (нМ) pERK
Антитело
Клеточная линия Биспецифическое антитело ЕМ1mAb Смесь Е1- F405L-gpl20K409R и М1K409R-gpl20- F405L Кратность изменения для биспецифических антител в сравнении со смесью двух одновалентных контрольных антител
Н292 0,64 34,94 55
Н1975 1,67 106 63
SKMES-1 0,54 7,63 14
Таблица 21
Антитело 1С50 (нМ) pAKTS473 1С50 (нМ) рАКТТ308
Биспецифическое антитело EMl-mAb 0,87 0,96
Смесь El-F405L-gpl20-K409R и M1-K409Rgpl20-F405L 65 117
Кратность изменения для смеси двух одновалентных антител в сравнении с биспецифическими 75 122
Ингибирование антителами роста или жизнеспособности человеческих опухолевых клеток.
Ингибирование c-Met-зависимого роста клеток оценивали путем измерения жизнеспособности различных опухолевых клеток после воздействия биспецифических антител EM1-mAb. В исследованиях использовали клетки NCI-H292, SKMES-1, NCI-H1975 и NCI-H3255.
Клетки культивировали в стандартном двумерном формате и в формате с низким прикреплением. В качестве контролей использовали эрлотиниб и цетуксимаб. В табл. 22 обобщены значения IC50 в анализах.
Ингибирование антителами роста или жизнеспособности человеческих опухолевых клеток - стандартный двумерный формат.
Ингибирование роста клеток анализировали путем измерения жизнеспособности NCI-H292 и NCI-H1975 после воздействия антител в двух форматах. При работе со стандартным двумерным форматом клетки высеивали на белые непрозрачные 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования тканей (PerkinElmer), в среду RPMI, содержащую GlutaMAX и 25 мМ Hepes (Invitrogen), с добавлением 1 мМ пирувата натрия (Gibco), 0,1 мМ NEAA (Gibco) и 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco), после чего позволяли прикрепиться в течение ночи при 37°С, 5% CO2. Клетки обрабатывали различными концентрациями антител (конечная концентрация 0,035-700 нМ), а также HGF (7,5 нг/мл, R&D Systems, № по кат. 294-HGF), затем инкубировали при 37°С, 5% CO2, в течение 72 ч. Некоторые лунки оставляли без обработки либо HGF, либо антителами в качестве контролей. Жизнеспособные клетки обнаруживали с помощью реагента CellTiter-Glo® (Promega), и данные анализировали так, как описано в примере 3 Ингибирование роста человеческих опухолевых клеток (анализ роста клеток NCI-H292 и NCI-H322).
Ингибирование антителами роста или жизнеспособности человеческих опухолевых клеток - формат с низким прикреплением.
Для оценки выживаемости в условиях низкого прикрепления клетки высеивали на 96-луночные планшеты со сверхнизким прикреплением Ultra Low Attachment (Corning Costar) в 50 мкл/лунка среды RPMI (Invitrogen), содержащей GlutaMAX и 25 мМ Hepes, с добавлением 1 мМ пирувата натрия (Gibco), 0,1 мМ NEAA (Gibco) и 10% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco), после чего позволяли прикрепиться в течение ночи при 37°С, 5% СО2. Клетки обрабатывали различными концентрациями антител (конечная концентрация 0,035-700 нМ), а также HGF (7,5 нг/мл, R&D Systems № по каталогу 294-HGN), затем инкубировали при 37°С, 5% CO2, в течение 72 ч. Некоторые лунки оставляли без обработки либо HGF, либо антителами в качестве контролей. Жизнеспособные клетки обнаруживали с использованием реагента CellTiter-Glo® (Promega), и данные анализировали так, как описано выше в разделе Ингибирование роста человеческих опухолевых клеток (анализ роста клеток NCI-H292 и NCI-H322) в примере 3, за исключением того, что лизаты переносили в непрозрачные белые 96-луночные планшеты, обработанные для культивирования тканей (PerkinElmer), перед регистрацией люминесценции.
В стандартной двумерной культуре EM1-mAb ингибировало рост NCI-H292 с IC50 31 нМ, а в условиях низкого прикрепления - с IC50 0,64 нМ. ЕМ-1 mAb ингибировало рост клеток NCI-H1975 с IC50 >700 нМ и 0,8-1,35 нМ в стандартной двумерной культуре и с низким прикреплением соответственно. В клетках NCI-H292, экспрессирующих как EGFR, так и c-Met дикого типа, EM1-mAb имело эффективность, которая в 22 раза выше в стандартной двумерной культуре и приблизительно в 330 раз выше в условиях низкого прикрепления культуры по сравнению с цетуксимабом. В клетках NCI-H1975, экспрессирующих мутант EGFR L858R, Т790М и c-Met дикого типа, mAb EM-1 было по меньшей мере в 518 раз
- 72 039356 более эффективным по сравнению с цетуксимабом в условиях низкого прикрепления культуры. В табл. 22 показаны сводные данные по анализам.
Таблица 22
Клеточная линия Статус EGFR Статус c-Met EMl-mAb, стандартная двухмерная культура, 1С50 (нМ) EMl-mAb, низкое прикрепление, 1С50 (нМ) Цетуксимаб, стандартная двухмерная культура, 1С50 (нМ) Цетуксимаб, низкое прикрепление, 1С50 (нМ)
NCI-H292 д.т. Д.т. 31 0,64 >700 212
NCI-H1975 L858R, Т790М Д.т. >700 0,8-1,35 >700 >700
Комбинация эрлотиниба и EM1-mAb эффективно ингибирует рост клеточных линий с мутантным EGFR.
Ингибирование роста клеток комбинацией эрлотиниба и EM1-mAb оценивали как в условиях стандартной двумерной культуры, так и в формате с низким прикреплением. Клетки NCI-H3255 и НСС-827 высеивали так, как описано выше в разделе Ингибирование антителами роста или жизнеспособности человеческих опухолевых клеток. Вместе с обработкой антителами к клеткам добавляли HGF (7,5 нг/мл, R&D Systems, № по кат. 294-HGN). Клетки обрабатывали различными концентрациями антител (итоговая - 0,11-700 нМ), или эрлотиниба (итоговая - 0,46-3000 нМ), или комбинации эрлотиниба с антителом с использованием увеличивающихся количеств каждого при фиксированном соотношении (например, наименьшая концентрация комбинации = наименьшая концентрация антитела (0,11 нМ) + наименьшая концентрация эрлотиниба (0,46 нМ)). Некоторые лунки оставляли без обработки либо HGF, либо антителами в качестве контролей. Клетки инкубировали при 37°С, 5% CO2 в течение 72 ч, после чего жизнеспособные клетки обнаруживали при помощи реагента CellTiter-Glo® (Promega) и анализировали данные так, как описано выше в разделе Ингибирование роста человеческих опухолевых клеток (анализ роста клеток NCI-H292 и NCI-H322). В табл. 23 обобщены результаты эксперимента. В таблице значения IC50 для комбинаций даны относительно или антитела, или эрлотиниба, в зависимости от того, что указано в скобках.
Как в клетках NCI-H3255, так и в клетках НСС-827 (клеточные линии с мутантным EGFR) добавление EM1-mAb к эрлотинибу как повышало мощность ингибирования жизнеспособности клеток, так и было более эффективным в отношении получения меньшего общего числа жизнеспособных клеток. В клетках NCI-H3255 с помощью стандартного двумерного формата IC50 для одного эрлотиниба составило 122 нМ, тогда как для комбинации - 49 нМ. Аналогичным образом, в клетках НСС-827 IC50 для одного эрлотиниба составило 27 нМ, тогда как для комбинации - 15 нМ. Кроме того, комбинация эрлотиниба и EM1-mAb также была более эффективной, чем комбинация эрлотиниба и цетуксимаба. Таким образом, в этом анализе в присутствии HGF добавление EM1-mAb повышало эффективность эрлотиниба.
Клетки NCI-H3255 экспрессируют мутант EGFR L858R и амплифицированный c-Met. Клетки НСС827 экспрессируют мутанты EGFR с делециями в аминокислотных положениях 746 и 750, а также c-Met дикого типа. Антитело EM1-mAb оказывало более сильные воздействия на жизнеспособность НСС-827 и NCI-3255 в присутствии эрлотиниба, чем один эрлотиниб либо в стандартных условиях, либо в условиях с низким прикреплением культур.
Таблица 23
Образцы IC50 mAb ЕМ1 + эрлотиниб (нМ) IC50 эрлотиниб (нМ)
NCI-H3255, стандартная двухмерная культура 49,0 122
NCI-H3255, культура с низким прикреплением 10,6 47,1
НСС-827, стандартная двухмерная культура 14,6 27,4
НСС-827, культура с низким прикреплением 3,5 9,5
Пример 13. Антитело-опосредованная клеточная цитотоксичность (ADCC) EM1-mAb в клеточных линиях in vitro.
Анализы ADCC проводили, как описано ранее (Scallon et al., Mol. Immunol. 44:1524-1534, 2007).
- 73 039356
Вкратце, мононуклеары периферической крови (РВМС) из человеческой крови выделяли с использованием градиентов Ficoll и использовали в качестве эффекторных клеток для анализов ADCC. Клетки NCI-H292, NCI-H1975 или NCI-H441 использовали в качестве клеток-мишеней в соотношении 1 клеткамишень к 50 эффекторным клеткам. Клетки-мишени предварительно метили BATDA (PerkinElmer) в течение 20 мин при 37°С, дважды промывали и повторно растворяли в DMEM с добавлением 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина (все производства Invitrogen). Клетки-мишени (1х104 клеток) и эффекторные клетки (0,5х106 клеток) объединяли и добавляли по 100 мкл клеток в лунки 96-луночной планшеты с U-образным дном. Добавляли дополнительные 100 мкл с конструктами шАЬ дикого типа с устойчивостью к протеазам или без них. Все образцы обрабатывали в двух повторностях. Планшеты центрифугировали при 200xg в течение 3 мин, инкубировали при 37°С в течение 2 ч, а затем вновь центрифугировали при 200xg в течение 3 мин. Отбирали всего 20 мкл супернатанта на лунку и лизис клеток измеряли путем добавления 200 мкл реагента DELPHIA на основе европия (PerkinElmer). Флуоресценцию измеряли при помощи считывателя Envision 2101 Multilabel Reader (PerkinElmer). Данные нормализовали к максимальной цитотоксичности 0,67% Triton Х-100 (Sigma Aldrich) и минимальному контролю, который определяли по спонтанному высвобождению BATDA из клеток-мишеней в отсутствие любого антитела, с использованием представленного ниже уравнения: (экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение)х100%. Данные аппроксимировали сигмовидной моделью дозаэффект при помощи GraphPad Prism v5.
Результаты по ADCC для mAb ЕМ1 и сравниваемых препаратов обобщены в табл. 24 (клетки NCI-H292), табл. 25 (клетки NCI-H1975) и табл. 26 (клетки NCI-H441), а в табл. 27 (клетки NCI-H1993) перечислены значения ЕС5о и максимальное достигнутое лизирование. Клетки NCI-H292 экспрессируют EGFR дикого типа (д.т.), c-Met д.т. и KRAS д.т.; клетки NCI-H1975 экспрессируют мутантный EGFR (L858R Т790М), c-Met д.т. и KRAS д.т.; клетки NCI-H441 экспрессируют EGFR д.т., c-Met д.т. и мутацию KRAS (G12V), а клетки NCI-H1993 экспрессируют EGFR д.т., амплифицированный c-Met и KRAS д.т. KRAS также известен как GTPase KRas, а также как гомолог вирусного онкогена крысиной саркомы Кирстена V-Ki-ras2.
ЕМ 1-mAb имеет более высокую эффективность ADCC-ответов, чем цетуксимаб и версия EMl-mAb с нормальным содержанием фукозы, на что указывают более низкие значения ЕС5о· EMI mAb имеет более высокую эффективность в отношении максимального достигнутого лизирования, чем цетуксимаб и биспецифическое mAb с нормальным содержанием фукозы. Как показано на профилях в табл. 24-27, EM-1 mAb оказывает ADCC-активность на клетки, имеющие мутантный и дикий тип EGFR, дикий тип с нормальным и амплифицированным уровнями c-Met, а также KRAS дикого типа и мутацию.
Таблица 24
mAb Эффективность (ЕСзо, мкг/мл) R2 Эффективность (максимальное достигнутое лизирование)
EMI mAb 0,0058 0,93 19%
Биспецифическое к EGFR х c-Met mAb с нормальным содержанием фукозы 0,22 0,85 13%
Цетуксимаб 0,0064 0,94 12%
Таблица 25
mAb Эффективность (ЕСзо, мкг/мл) R2 Эффективность (максимальное достигнутое лизирование)
EMI mAb 0,022 0,91 19%
Биспецифическое к EGFR х c-Met mAb с нормальным содержанием фукозы 1,8 0,79 13%
Цетуксимаб 0,029 0,70 11%
-74039356
Таблица 26
mAb Эффективность (ЕСэо, мкг/мл) R2 Эффективность (максимальное достигнутое лизирование)
EMI mAb 0,022 0,97 24%
Биспецифическое к EGFR х c-Met mAb с нормальным содержанием фукозы 0,52 0,87 7,9%
Цетуксимаб 0,013 0,85 15%
Таблица 27
mAb Эффективность (ЕСзо мкг/мл) R2 Эффективность (максимальное достигнутое лизирование)
EMI mAb 0,0013 0,95 27%
Биспецифическое к EGFR χ c-Met mAb с нормальным содержанием фукозы 0,054 0,87 17%
Цетуксимаб 0,0042 0,76 21%
Пример 14. Исследования противоопухолевой эффективности EM1-mAb.
Эффективность EM1 mAb в отношении роста опухоли оценивали так, как описано в примере 7 Исследования эффективности биспецифических к EGFR/c-Met молекул в отношении опухоли. Вкратце, клетки NCI-H292-HGF имплантировали подкожно (п/к) с Cultrex при 2x106 самкам мышей SCID Beige. Мышей разделяли по объему опухоли через 7 суток после имплантации на 5 групп, по 10 мышей в группе. Введение начинали после того, как средний объем опухоли в группе достигал 62-66 мм3 (малые опухоли). PBS или терапевтическое средство вводили интраперитонеально (и/п) 2 раза в неделю.
В оценке эффективности также использовали SKMES-HGF, клетки человеческой плоскоклеточной карциномы, которую трансфицировали человеческим HGF (печеночный фактор роста). Эти клетки имплантировали п/к при 10x106 самкам мышей SCID Beige. Этих мышей разделяли по объему опухоли через 12 суток после имплантации на 5 групп, по 8 мышей в группе. Первое исследование начинали после того, как средний объем опухоли в группе достигал 98-101 мм3 (крупные опухоли). PBS или терапевтические mAb вводили и/п 2 раза в неделю в течение 4 недель. В исследовании опухолей более крупного размера мышей делили на 2 группы после того, как опухоли достигли объема приблизительно 200-300 мм3. Затем этим мышам проводили обработку либо цетуксимабом (20 мг/кг), либо EM1-mAb (20 мг/кг), и/п, 2 раза в неделю (3 недели).
Сводные данные показаны в табл. 28. На фиг. 10 показана эффективность молекул с течением времени. EM1-mAb имело улучшенный профиль подавления опухоли по сравнению с цетуксимабом в модели с небольшими опухолями H292-HGF и в моделях с небольшими и крупными опухолями SKMES-HGF.
Таблица 28
Образец и время Клеточная линия Доза в Частичная Полная
мг на кг регрессия регрессия
ЕМ1 на 35 сутки H292-HGF, 20 10/10 10/10
небольшая опухоль 5 10/10 10/10
1 0/10 0/10
Цетуксимаб на 35 сутки H292-HGF, 20 0/10 0/10
небольшая опухоль
ЕМ1 на 67 сутки SKMES-HGF, 20 0/8 8/8
небольшая опухоль 5 1/8 6/8
1 2/8 4/8
Цетуксимаб на 67 сутки 20 0/8 6/8
ЕМ1 на 70 сутки SKMES-HGF, 20 4/7 3/7
Цетуксимаб на 35 сутки крупная опухоль 20 0/7 0/7
- 75 039356
В табл. 29 показаны размеры опухолей в группах лечения с опухолями SKMES-HGF, а в табл. 30 показана противоопухолевая активность.
EM1-mAb ингибировало рост опухоли в модели SKMES-HGF на 97% или более при многократных дозах вплоть до 1 мг/кг. Хотя изначально цетуксимаб был очень эффективен (88% TGI при 20 мг/кг), после окончания введения обработанные цетуксимабом опухоли снова выросли. Напротив, опухоли, обработанные EM1-mAb 5 или 20 мг/кг, не выросли в течение исследования (>2 месяцев).
Таблица 29
Сутки Объем опухоли (мм3)
Носитель Биспецифическо е ЕМ1, 20 мг/кг Биспецифическое ЕМ1, 5 мг/кг Биспецифическо е EMI, 1 мг/кг Цетуксимаб, 20мг/кг
1 99 ±6 99 ±7 101 ±6 101 ±6 98 ±5
8 146 ± 14 48 ± 10 49 ±9 49 ± 10 60 ±8
15 192 ±21 9± 1 22 ± 10 41 ± 13 44 ±23
22 326 ±43 3±2 17 ± 12 33 ± 15 42 ±23
29 577 ±55 2± 1 15 ±9 38 ± 17 85 ±60
36 994± 114 0,2 ±0,1 13 ±9 26 ± 14 125 ± 62
50 — 0,04 ± 0,04 10 ± 7 18 ± 9 423 ± 115
57 |- 0,1 ±0,2 3±2 21 ± 10 650 ± 116
67 - 0±0 8±7 34 ±22 1257 ±151
Таблица 30
Лечение Размер опухоли (мм3) на 36 сутки Т/С (%) Т - С (сутки) при 1000 мм3 Значение Р
Носитель 994± 114 — — —
Биспецифическое ЕМ1, 20 мг/кг 0,19 ±0,12 0,02 --
Биспецифическое ЕМ1, 5 мг/кг 13 ±9 1,3 --
Биспецифическое EMI, 1 мг/кг 26 ± 14 2,6 --
Цетуксимаб (20 мг/кг) 125 ± 62 13 31
Пример 15. Ингибирование миграции клеток EM1-mAb in vitro.
Способ.
Воздействие EM-mAb и контрольных одновалентных антител на ингибирование миграции опухолевых клеток анализировали в клетках NIH-1650. Клеточную линию H1650 с мутантным EGFR (клетки легочной бронхиолоальвеолярной карциномы, имеющие мутацию в экзоне 19 [делеция Е746, А750]) культивировали во флаконах для тканевой культуры в нормальных условиях для культивирования (37°С, 5% CO2, влажность 95%). Все среды и добавки соответствовали рекомендациям поставщика клеток (Американская коллекция типовых культур, г. Манассас, штат Вирджиния, США)
Сфероиды создавали путем посева клеток легочной опухоли H1650, по 10 000 клеток/лунка, в 96луночные планшеты с U-образным дном и сверхнизким прикреплением Ultra Low Adherence (ULA) (Corning, г. Тьюксбери, США) по 200 мкл/лунка. Данные планшеты стимулируют спонтанное образование одиночного сфероида из клеток в течение 24 ч (инкубация при 37°С, 5% CO2). Сфероиды выращивали в течение четырех суток в нормальных условиях культивирования.
Круглодонные 96-луночные планшеты (BD Bioscience) покрывали 0,1% желатином (EMD Millipore, г. Биллерика, США) в стерильной воде в течение 1 ч при 37°С. В исследованиях по оценке соединений на 4 сутки сфероиды из 10000 опухолевых клеток (Н1650 и NCI-H1975) переносили в круглодонные планшеты с покрытием и обрабатывали EM1-mAb, контрольными одновалентными mAb к EGFR, E1-F405L-gp120-K409R, имеющими низкое содержание фукозы, контрольными одновалентными mAb к c-Met, M1-K409R-gp120-F405L, имеющими низкое содержание фукозы, и комбинацией двух одновалентных антител E1-F405L-gp120-K409R и М1-K409R-gp120-F405L (полученных с низким содержанием фукозы) в серии разведений с 20 нг/мл HGF (R&D systems). Контроли обрабатывали носителем, который представлял собой изотипический контрольный IgG1 каппа (концентрация равна наивысшей для обработанных лекарственным средством клеток). Воздействие соединений анализировали через 48 ч путем измерения площади, покрытой мигрирующими клетками, с применением изображений в ярком поле в полностью автоматизированной системе многопараметрической визуализации Operetta (Perkin Elmer) с объективом 2х. Ингибирование миграции клеток (общая площадь), обусловленное воздействием обработки, анализировали путем нормирования данных, используя деление на значение контроля, содержащего только среду, получив процентную долю миграции клеток относительно контроля. Таким образом, значение менее 1 будет означать ингибирование миграции клеток.
- 76 039356
Результаты.
EM1-mAb продемонстрировало мощное синергическое ингибирование миграции клеток в клетках Н1650 (мутант EGFR L858R) и Н1975 (мутант EGFR L858R/T790M) по сравнению с комбинацией контрольных одновалентных антител к EGRF и c-Met, E1-F405L-gp120-K409R и М1-K409R-gp120-F405L. В клетках Н1650 шесть наивысших концентраций EM1-mAb значительно ингибировали миграцию клеток (р < 0,001) по сравнению с изотипическим контролем. Значение ЕС50 для EM1-mAb составило 0,23 нМ, тогда как значение ЕС50 для комбинации моноспецифических контрольных антител составило 4,39 нМ. Следовательно, EM1-mAb приблизительно в 19 раз более эффективно ингибировало миграцию клеток H1650 по сравнению с комбинацией одновалентных контрольных антител. Уровень ингибирования миграции клеток EM1-mAb был выше, чем у комбинации моноспецифических контрольных mAb в клетках Н1650 и H1975. В табл. 31 показаны значения ЕС50 для анализа.
Таблица 31
Образцы Н1650 Н1975
ЕС50 (нМ) Ингибирование при 30 нМ Ингибирование при 30 нМ
ЕМ 1-mAb 0,23 64% 38%
Смесь El-F405L-gpl20-K409R* и Ml-K409R-gpl20-F405L* 4,39 59% 20%
E1-F405L - gp!20-K409R* 5,44 15% 7%
Ml-K409R-gpl20-F405L* 7,36 43 10%
* Антитела имели низкое содержание фукозы.
Пример 16. Картирование эпитопов антител к c-Met-069 и 5D5.
Эпитоп, связывающий mAb с c-Met 069, картировали с использованием линейной и стесненной технологии CLIPS-пептидов. Пептиды сканировали SEMA, PSI и Ig-домены человеческого c-Met. Линейные пептиды и CLIPS-пептиды синтезировали с использованием аминокислотной последовательности вышеупомянутого c-Met с применением стандартных химических методов Fmoc, а защитные группы снимали при помощи трифторуксусной кислоты с акцепторами. Стесненные пептиды синтезировали на химических каркасах с целью реконструкции конформационных эпитопов с использованием технологии химически связанных пептидов на каркасах (Chemically linked Peptides on Scaffolds, CLIPS) (Timmerman et al., J. Mol. Recognition. 20:283, 2007). Линейные и стесненные пептиды присоединяли к платам PEPSCAN и проводили скрининг с использованием ИФА, ориентированного на PEPSCAN (Slootstra et al., Molecular Diversity, 1, 87-96, 1996). Эпитоп связывания mAb с c-Met 069 представляет собой непрерывный эпитоп, состоящий из аминокислот c-Met 239-253 PEFRDSYPIKYVHAF (SEQ ID NO:238) и 346-361 FAQSKPDSAEPMDRSA (SEQ ID NO: 239). Аминокислотная последовательность c-Met показана в SEQ ID NO: 201.
Аналогичные методы использовали для картирования эпитопа mAb 5D5 (MetMab, онартузумаб). mAb 5D5 связывается с c-Met по остаткам 325-340 PGAQLARQIGASLNDD (SEQ ID NO: 240).
Пример 17. Исследования противоопухолевой эффективности EM1-mAb in vivo.
Эффективность EM1-mAb в отношении роста опухоли исследовали так, как описано в примере 7 Исследования эффективности биспецифических к EGFR/c-Met молекул в отношении опухоли и в примере 14 с применением дополнительных опухолевых клеточных линий с мутацией EGFR или амплификациями EGFR и/или c-Met. Вкратце, клетки SNU-5, H1975, НСС827, клетки Н1975, экспрессирующие человеческий HGF, или клон клеток НСС827, выбранный по его повышенной резистентности к эрлотинибу (клетки HCC827-ER1), имплантировали подкожно (п/к) самкам бестимусных мышей, за исключением клеток SNU-5, которые были имплантированы мышам CR17/SCID. Мышам интраперитонеально вводили PBS или EM1-mAb, цетуксимаб (CAS 205923-56-4), эрлотиниб (CAS 183321-74-6), афатиниб (CAS 439081-18-2) или комбинацию mAb EM-1 и афатиниба и mAb EM-1 и эрлотиниба в указанной дозировке и по схеме, показанной в табл. 32. Противоопухолевую эффективность измеряли в виде %TGI (ингибирование роста опухоли), вычисляемой как 100 - %Т/С (Т = средний размер опухоли в группе лечения; С = средний размер опухоли в контрольной группе в указанный день, как описано в примере 7).
В опухолях с первичными активирующими EGFR мутациями (без резистентности к ингибиторам тирозинкиназ (TKI) EGFR): (опухоль НСС827, EGFR del (E746, А750)), EM1-mAb в дозе 10 мг/кг ингибировало рост опухоли на 82%. Эрлотиниб в этой модели имел аналогичную эффективность, как и комбинация эрлотиниба и EM1-mAb. На фиг. 11 показана эффективность терапевтических средств с течением времени в модели опухоли НСС827.
В опухолях с EGFR дикого типа и амплификацией гена c-Met (модель рака желудка SNU-5) EM1-mAb продемонстрировало противоопухолевую эффективность с полной регрессией опухоли (98% TGI на 34 сутки, р<0,01 по сравнению с носителем с использованием однофакторного дисперсионного
- 77 039356 анализа (ANOVA) с последующими отдельными сравнениями с использованием критерия ГеймсаХоуэлла). Противоопухолевая активность цетуксимаба (mAb к EGFR) в этой модели была меньше - 49% на 34 сутки. На фиг. 12 показана эффективность терапевтических средств с течением временем в модели
SNU-5.
EM1-mAb тестировали в модели немелкоклеточного рака легких (NSCLC), содержащей первичную активирующую EGFR мутацию и мутацию EGFR T790M, придающую опухолям резистентность к ингибиторам тирозинкиназы EGFR 1-го поколения (модель Н1975). EM1-mAb ингибировало рост опухоли со значением TGI 57% в модели с имплантацией клеточной линии Н1975 бестимусным мышам (р<0,0001 по сравнению с носителем PBS с использованием логрангового анализа в программе Prism 3.03). Как и ожидалось, эрлотиниб не был эффективен в этой модели с мутацией Т790М. Афатиниб был столь же эффективен, как и EM1-mAb (57% TGI). Цетуксимаб и комбинация EM1-mAb с афатинибом были наиболее эффективны, вызывая регрессию опухолей с ингибированием роста опухоли на 91 и 96% соответственно (р<0,0001 как для цетуксимаба по сравнению с PBS, так и для EM1-mAb + афатиниб по сравнению с группой с носителями PBS + афатиниб с использованием логрангового анализа в программе Prism 3.03). Сигнальные пути c-Met в этой модели не активировались, поскольку мышиный HGF не связывается с человеческим c-Met.
EM1-mAb тестировали в нескольких моделях, сконструированных для экспрессии человеческого HGF в системе трансдукции лентивируса. Это позволяет смоделировать лигандную активацию пути cMet in vivo, поскольку мышиный HGF не активирует человеческий c-Met на имплантированных человеческих опухолевых клетках. Результаты модели SKMES-HGF показаны в примере 14 и на фиг. 10, а значения TGI в % обобщены в табл. 32. EM1-mAb ингибировало рост опухоли в модели H1975-HGF на 71% (р<0,0001 по сравнению с носителем PBS с использованием логрангового анализа в программе Prism 3.03). Афатиниб, эрлотиниб и цетуксимаб в этой модели были менее эффективными. Комбинация EM1-mAb и афатиниба была очень эффективной (96% TGI, р<0,0001, по сравнению с группой с носителями PBS + афатиниб с использованием логрангового анализа в программе Prism 3.03). На фиг. 13 показана эффективность молекул с течением времени в модели H1975-HGF. Таким образом, эрлотиниб, афатиниб и цетуксимаб теряют свою противоопухолевую эффективность в моделях опухолей, в которых активируется путь c-Met.
EM1-mAb тестировали в модели опухоли, характеризующейся первичной активирующей EGFR мутацией и повышенной резистентностью к EGFR TKI 1-го поколения (эрлотиниб), обусловленной амплификацией гена c-Met (модель HCC827-ER1). EM1-mAb в дозе 10 мг/кг приводило к частичной регрессии имплантированных опухолей HCC827-ER1 со значением TGI 86% на 25 сутки и было более эффективным, чем только эрлотиниб (65% TGI на 25 сутки). Комбинация EM1-mAb и эрлотиниба не давала дополнительного повышения эффективности. На фиг. 14 показана эффективность молекул с течением времени.
Таким образом, EM1-mAb демонстрирует эффективность в моделях опухолей с EGFR дикого типа, с первичными активирующими EGFR мутациями, с мутацией EGFR T790M, связанной с резистентностью к терапевтическим средствам в отношении EGFR, а также в моделях, в которых c-Met активируется лиганд-зависимым (аутокринная экспрессия HGF) или лиганд-независимым (амплификация гена c-Met) способом. Комбинация EM1-mAb с эрлотинибом или афатинибом может повышать эффективность в некоторых моделях опухолей.
- 78 039356
Таблица 32
Тип опухоли EGFR c-Met Лечение % TGI (сутки исследования); по сравнению с введением носителя PBS
(доза в мг/кг), схема
SKMES-HGF, плоскоклеточный рак легких Д.т. Д.т. EM1-mAb (20), BIWx4 недели Цетуксимаб (20), BIW х4 недели 100 (36) 88 (36)
SNU-5 рак желудка Λ·τ. ампл. EM1-mAb (10), BIWx4 недели Цетуксимаб (10), BIW х4 недели 98 (34) 49 (34)
Н1975 NSCLC L858R; Т790М Д.т. EM1-mAb (10), BIWx3 недели Цетуксимаб (10), BIW хЗ недели 57 (18) 91 (18)
Эрлотиниб (50), QDx21 сутки 9 (18)
Афатиниб (15), QD х 21 сутки 57 (18)
EM1-mAb (10), BIW хЗ недели + афатиниб (15), QD х 21 сутки 96 (18)
H1975-HGF NSCLC L858R; Т790М Д.т. EM1-mAb (10), BIWx3 недели Цетуксимаб (10), BIW хЗ недели 71 (16) 42 (16)
Эрлотиниб (50), QDx21 сутки 20 (16)
Афатиниб (15), QD х 21 сутки 29 (16)
EM1-mAb (10), BIW хЗ недели + афатиниб (15), QD х 21 сутки 96 (16)
НСС827 NSCLC del (Е746, А750); ампл. Д.т. EM1-mAb (10), BIWx4 недели 82 (35)
Эрлотиниб (25), QD х 28 суток 79 (35)
EM1-mAb (10), BIW хЗ недели + эрлотиниб (25), QD х28 суток 78 (35)
HCC827-ER1 NSCLC del (Е746, А750); ампл. ампл. EM1-mAb (10), BIWx4 недели 86 (25)
Эрлотиниб (25), QD х 28 суток 65 (25)
EM1-mAb (10), BIW хЗ недели + эрлотиниб (25), QD х28 суток 87 (25)
BIW = два раза в неделю;
QD = один раз в сутки; д.т. = дикий тип; ампл. = амплифицированный.
Пример 18. EM1-mAb индуцирует деградацию EGFR и c-Met in vivo.
Чтобы продемонстрировать вовлечение EM1-mAb как EGFR, так и c-Met в опухоль, отбирали образцы опухолей H1975-HGF в различные временные периоды после однократной дозы 20 мг/кг EM1-mAb. Получали лизаты опухолей, нормализовали к общему белку и разгоняли образцы в гелях ДСН-ПААГ. Г ели переносили на нитроцеллюлозу и выполняли анализ методом вестерн-блоттинга либо для EGFR (мышиные моноклональные антитела (mAb) к человеческому EGFR (EGF-R2); Santa Cruz Biotechnology, № по кат. sc-73511), либо для c-Met (мышиные моноклональные антитела к человеческому Met (L41G3); Cell Signaling Technology, № по кат. 3148). Уровни EGFR нормализовали к GAPDH; уровни c-Met нормализовали к актину. Уровни рецепторов в опухолях, обработанных EM1-mAb, сравнивали с уровнями рецепторов в опухолях, обработанных PBS, получив % общего числа рецепторов. Обработка EM1-mAb снизила общие уровни рецепторов EGFR и c-Met в опухолях H1975-HGF до значений в диапазоне от 20 до 60% от контроля в зависимости от анализируемой временной точки. На фиг. 15 показаны средние уровни рецепторов по сравнению с PBS с течением времени. pEGFR, pc-Met и pAKT также снижались через 72 ч после однократной дозы EM1.
Пример 19. Противоопухолевая активность при сравнении вариантов изоформ IgG1 и IgG2, биспецифических к EGFR/c-Met mAb.
- 79 039356
Чтобы лучше понять вклад эффекторной функции в эффективность, наблюдаемую в модели H1975-HGF, выполнили сравнение между EM1-mAb и вариантом EM1-mAb, имеющим Fc IgG2 с обеспечивающими снижение эффекторной функции заменами V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S в IgG2 (замены описаны в заявке на международный патент № WO 2011/066501) (нумерация соответствует каталогу ЕС). Антитело IgG2 с заменами V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S не взаимодействует с Fc-рецепторами или эффекторными клетками (такими как естественные киллеры и макрофаги). Таким образом, любая потеря активности, наблюдаемая у варианта IgG2 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S EM1-mAb, может отражать вклад в противоопухолевую активность эффектор-опосредованных механизмов, таких как ADCC и/или ADCP. Через 32 суток после имплантации опухолевых клеток в вышеописанной модели H1975-HGF наблюдали потерю противоопухолевой активности варианта IgG2
V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S EM1-mAb по сравнению с исходным EM1-mAb, что свидетельствует о том, что эффектор-опосредованные механизмы вносят вклад в функцию ЕМ-1 mAb. На фиг. 16 показана противоопухолевая активность молекул.
Перечень последовательностей
SEQ ID NO: Тип Вид Описание Последовательность
1 PRT Искусственная Tencon LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQY QESEKVGEAINLT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNP LSAEFTT
2 ДНК Искусственная РОР2220 GGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGA AAAACCTGGTTGT TTCTGAAGTTACC
3 ДНК Искусственная TC5'toFG AACACCGT AGAT AGAAACGGT
4 ДНК Искусственная 130mer CGGCGGTT AGAACGCGGCT ACAATT AAT ACAT AACCCCAT CCCCC TGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTG TGGAATTGTGAGC GGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTAC CATGCTG
5 ДНК Искусственная РОР2222 CGGCGGTTAGAACGCGGCTAC
6 ДНК Искусственная TCF7 GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSN NSNNSNNSNNSNN AACACCGTAGATAGAAACGGT
7 ДНК Искусственная TCF8 GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSN NSNNSNNSNNSNN S NNAACACCGT AGAT AGAAACGGT
8 ДНК Искусственная TCF9 GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSN NSNNSNNSNNSNN SNNS NNAACACCGTAGATAGAAACGGT
9 ДНК Искусственная TCF10 GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSN NSNNSNNSNNSNN SNNSNNS NNAACACCGTAGATAGAAACGGT
10 ДНК Искусственная TCF11 GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSN NSNNSNNSNNSNN SNNSNNSNNS NNAACACCGTAGATAGAAACGGT
11 ДНК Искусственная TCF12 GGTGGTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSN NSNNSNNSNNSNN SNNSNNSNNSNNSNNAACACCGTAGATAGAAA CGGT
12 ДНК Искусственная РОР2234 AAGAT CAGTTGCGGCCGCT AGACT AGAACCGCTGCCAT GGTGATG GTGATGGTGACCGCCGGTGGTGAATTCCGCAG ACAG
13 ДНК Искусственная РОР2250 CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC
14 ДНК Искусственная DidLigRev CATGATTACGCCAAGCTCAGAA
15 ДНК Искусственная Tcon5new 2 GAGCCGCCGCCACCGGTTTAATGGTGATGGTG ATGGT GACCACCGGTGGTGAATTCCGCAGACAG
16 ДНК Искусственная Тсопб AAGAAGGAGAACCGGTATGCTGCCGGCGCCG AAAAAC
17 ДНК Искусственная LS1008 TTTGGGAAGCTTCTAGGTCTCGGCGGTCACCA TCACC ATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCC CCAAC TGATCTTCACCAAAC
18 PRT Искусственная P53A1R5- 17 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWADPHGFYDSFLIQ YQES EKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
- 80 039356
19 PRT Искусственная P54AR4- 17 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTYDRDGYDSFLIQ YQES EKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
20 PRT Искусственная P54AR4- 47 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWGYNGDHFDSFLIQ YQES EKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
21 PRT Искусственная P54AR4- 48 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWDDPRGFYESFLIQ YQES EKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
22 PRT Искусственная P54AR4- 37 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTWPYADLDSFLIQ YQES EKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
23 PRT Искусственная 54AR4-74 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWGYNGDHFDSFLIQ YQES EKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
24 PRT Искусственная P54AR4- 81 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWDYDLGVYFDSFLI QYQE SEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIY GVHN VYKDTNMRGLPLSAEFTT
25 PRT Искусственная P54AR4- 83 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWDDPWAFYESFLIQ YQES EKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
26 PRT Искусственная P54CR4- 31 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQY QESE KVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV LGSY VFEHDVMLPLSAEFTT
27 PRT Искусственная P54AR483v2 без met LPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLIQ YQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNV YKDTNMRGLPLSAIFTT
28 PRT Искусственная P54CR4- 31v2 без met LPAPKNLWSEVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQ YQESE KVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV LGSY VFEHDVMLPLSAIFTT
29 PRT Искусственная P54AR473v2 без met LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTWPYADLDSFLIQ YQES EKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNV YKDTNMRGLPLSAEFTT
30 ДНК Искусственная TCON6 AAG AAG GAG AAC CGG TAT GCT GCC GGC GCC GAA AAA C
31 ДНК Искусственная TCON5 E86lshort GAG CCG CCG CCA CCG GTT TAA TGG TGA TGG TGA TGG TGA CCA CCG GTG GTG AAG АТС GCA GAC AG
- 81 039356
32 PRT Искусственная P114AR5 Р74А5 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YDEV VVGGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYYVNILG VKGG SISVPLSAIFTT
33 PRT Искусственная P114AR5 Р75Е9 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFFIR YDEFL RSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWVTILGV KGGL VSTPLSAIFTT
34 PRT Искусственная P114AR7 Р92F3 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYIVNIMGV KGGSI SHPLSAIFTT
35 PRT Искусственная P114AR7 Р9 2-F6 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGV KGGGL SVPLSAIFTT
36 PRT Искусственная P114AR7 Р9 2-G8 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFVIR YFEFLG SGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVQILGVK GGYISI PLSAIFTT
37 PRT Искусственная P114AR7 Р9 2-Н5 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YLEFLL GGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWQIMGV KGGTVS PPLSAIFTT
38 PRT Искусственная P114AR7 Р9 3-D11 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVGING VKGGYI SYPLSAIFTT
39 PRT Искусственная P114AR7 Р9 3-G8 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTDLKPGTEYGVTINGV KGGRV STPLSAIFTT
40 PRT Искусственная P114AR7 Р9 3-Н9 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVQNGV KGGHIS LPLSAIFTT
41 PRT Искусственная P114AR7 Р9 4-АЗ LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIMG VKGGKI SPPLSAIFTT
42 PRT Искусственная P114AR7 Р9 4-Е5 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYAVNIMG VKGGRV SVPLSAIFTT
43 PRT Искусственная P114AR7 Р9 5-В9 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVQILGV KGGSI SVPLSAIFTT
- 82 039356
44 PRT Искусственная P114AR7 Р9 5-D3 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIMG VKGGSI SYPLSAIFTT
45 PRT Искусственная P114AR7 Р9 5-D4 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVQILGV KGGYI SIPLSAIFTT
46 PRT Искусственная P114AR7 Р9 5-ЕЗ LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVQIMG VKGGTV SPPLSAIFTT
47 PRT Искусственная P114AR7 Р9 5-F10 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFTT AGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIMGV KGGSIS PPLSAIFTT
48 PRT Искусственная P114AR7 Р9 5-G7 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFELLS TGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIMGVK GGSIS PPLSAIFTT
49 PRT Искусственная P114AR7 Р9 5-Н8 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFV SKGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIMG VKGGSI SPPLSAIFTT
50 PRT Искусственная ЕСВ1 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSM LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YDEVV VGGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYYVNILGV KGGSIS VPLSAIFTT
51 PRT Искусственная ЕСВ2 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSL PAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRY FEFLG SGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIMGV KGGKIS PPLSAIFTT
52 PRT Искусственная ЕСВЗ MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSM LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVQNGV KGGHIS LPLSAIFTT
- 83 039356
53 PRT Искусственная ЕСВ4 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSM LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFFIR YDEFLR SGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWVTILGVK GGLVS TPLSAIFTT
54 PRT Искусственная ЕСВ5 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSM LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIMG VKGGKI SPPLSAI FTT
55 PRT Искусственная ЕСВ6 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSM LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVQNGV KGGHIS LPLSAIFTT
56 PRT Искусственная ЕСВ7 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSM LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIR YFEFL GSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVQNGV KGGHIS LPLSAIFTT
57 PRT Искусственная ЕСВ15 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVV SRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVP GSERS YDLTGLKPGTEYVVNIMGVKGGKISPPLSAIFTT
58 PRT Искусственная ЕСВ27 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVV SRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYDEVWGGEAIVLTV PGSER SYDLTGLKPGTEYYVNILGVKGGSISVPLSAIFTT
- 84 039356
59 PRT Искусственная ЕСВ60 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPMLPAPKNLVVSRVT EDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVL TVPGSE RSYDLTGLKPGTEYVVNIMGVKGGKISPPLSAIFT T
60 PRT Искусственная ЕСВ37 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNMRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVSRVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYDEVWGGEAIVLTV PGSER SYDLTGLKPGTEYYVNILGVKGGSISVPLSAIFTT
61 PRT Искусственная ЕСВ94 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVP GSERS YDLTGLKPGTEYVVNILGVKGGKISPPLSAIFTT
62 PRT Искусственная ЕСВ95 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFVGSGEAIVLTV PGSER SYDLTGLKPGTEYWNILGVKGGSISPPLSAIFTT
63 PRT Искусственная ЕСВ96 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFVSKGDAIVLTV PGSERS YDLTGLKPGTEYVVNILGVKGGSISPPLSAIFTT
64 PRT Искусственная ЕСВ97 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVP GSERS YDLTGLKPGTEYVVNILSVKGGSISPPLSAIFTT
65 PRT Искусственная ЕСВ106 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVP GSERS YDLTGLKPGTEYVVNILGVKGGKISPPLSAIFTT
- 85 039356
66 PRT Искусственная ЕСВ107 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFVGSGEAIVLTV PGSER SYDLTGLKPGTEYWNILGVKGGSISPPLSAIFTT
67 PRT Искусственная ЕСВ108 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFVSKGDAIVLTV PGSERS YDLTGLKPGTEYVVNILGVKGGSISPPLSAIFTT
68 PRT Искусственная ЕСВ109 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVP GSERS YDLTGLKPGTEYVVNILSVKGGSISPPLSAIFTT
69 PRT Искусственная ЕСВ118 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVP GSERS YDLTGLKPGTEYVVNILGVKGGKISPPLSAIFTT
70 PRT Искусственная ЕСВ119 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFVGSGEAIVLTV PGSER SYDLTGLKPGTEYWNILGVKGGSISPPLSAIFTT
71 PRT Искусственная ЕСВ120 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLI QYQES EKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFVSKGDAIVLTV PGSERS YDLTGLKPGTEYVVNILGVKGGSISPPLSAIFTT
72 PRT Искусственная ЕСВ121 MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFLI QYQES EKVG EAIVLTVPGS E RSYDLTG LKPGTEYTVSIYG VHNVY KDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLPAPKNLVVS RVTED SAR LSWTAPDAAFDS FWIRYFE F LGSGEAIVLTVP GSERS YDLTGLKPGTEYVVNILSVKGGSISPPLSAIFTT
SEQ ID NO: 73, PRT, Homo Sapiens, EGFR (включает сигнальную последовательность из 24 аминокислот. Зрелый белок начинается с остатка 25)
- 86 039356
MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV
VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA
121 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF
181 QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC
241 TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV
301 VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK
361 NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF
421 ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL
481 FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN
541 LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM
601 GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGCTG PGLEGCPTNG PKIPSIATGM VGALLLLLW
661 ALGIGLFMRR RHIVRKRTLR RLLQERELVE PLTPSGEAPN QALLRILKET EFKKIKVLGS
721 GAFGTVYKGL WIPEGEKVKI PVAIKELREA TSPKANKEIL DEAYVMASVD NPHVCRLLGI
781 CLTSTVQLIT QLMPFGCLLD YVREHKDNIG SQYLLNWCVQ IAKGMNYLED RRLVHRDLAA
841 RNVLVKTPQH VKITDFGLAK LLGAEEKEYH AEGGKVPIKW MALESILHRI YTHQSDVWSY
901 GVTVWELMTF GSKPYDGIPA SEISSILEKG ERLPQPPICT IDVYMIMVKC WMIDADSRPK
961 FRELIIEFSK MARDPQRYLV IQGDERMHLP SPTDSNFYRA LMDEEDMDDV VDADEYLIPQ
1021 QGFFSSPSTS RTPLLSSLSA TSNNSTVACI DRNGLQSCPI KEDSFLQRYS SDPTGALTED
1081 SIDDTFLPVP EYINQSVPKR PAGSVQNPVY HNQPLNPAPS RDPHYQDPHS TAVGNPEYLN
1141 TVQPTCVNST FDSPAHWAQK GSHQISLDNP DYQQDFFPKE AKPNGIFKGS TAENAEYLRV
1201 APQSSEFIGA
74 PRT Homo sapiens EGF NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIG ERCQYRDLKWWELR
SEQ ID NO: 75, PRT, Homo Sapiens, тенасцин-С mgamtqllag vflaflalat eggvlkkvir hkrqsgvnat Ipeenqpwf nhvyruklpv gsqcsvdles asgekdlapp sepsesfqeh tvdgenqivf thnruprra cgcaaapdvk
121 ellsrleele nlvsslreqc tagagcclqp atgrldtrpf csgrgnfste gcgcvcepgw
181 kgpncsepec pgnchlrgrc idgqcicddg ftgedcsqla cpsdcndqgk cvngvcicfe
241 gyagadcsre icpvpcseeh gtcvdglcvc hdgfagddcnkplclnncyn rgrcvenecv
301 cdegftgedc selicpndcf drgrcingtc yceegftged cgkptcphac htqgrceegq
- 87 039356
361 cvcdegfagv dcsekrcpad chnrgrcvdg rcecddgftg adcgelkcpn gcsghgrcvn 421 gqcvcdegyt gedcsqlrcp ndchsrgrcv egkcvceqgf kgydcsdmsc pndchqhgrc 481 vngmcvcddg ytgedcrdrq cprdcsnrgl cvdgqcvced gftgpdcael scpndchgqg 541 rcvngqcvch egfmgkdcke qrcpsdchgq grcvdgqcic hegftgldcg qhscpsdcnn 601 Igqcvsgrci cnegysgedc sevsppkdlv vtevteetvn lawdnemrvt eylwytpth 661 egglemqfrv pgdqtstiiq elepgveyfi rvfailenkk sipvsarvat ylpapeglkf
721 ksiketsvev ewdpldiafe tweufmmn kedegeitks Irrpetsyrq tglapgqeye
781 islhivknnt rgpglkrvtt trldapsqie vkdvtdttal itwfkplaei dgieltygik
841 dvpgdrttid Itedenqysi gnlkpdteye vslisrrgdm ssnpaketft tgldapmlr 901 rvsqtdnsit lewmgkaai dsynkyapi sggdhaevdv pksqqattkt tltglrpgte
961 ygigvsavke dkesnpatm aateldtpkd Iqvsetaets Itllwktpla kfdiyrlnys
1021 Iptgqwvgvq Ipmttsyvl rglepgqeyn vlltaekgrh kskparvkas teqapelenl 1081 tvtevgwdgl rlnwtaadqa yehfiiqvqe ankveaaml tvpgslravd ipglkaatpy 1141 tvsiygviqg yrtpvlsaea stgetpnlge vwaevgwda Iklnwtapeg ayeyffiqvq 1201 eadtveaaqn Itvpgglrst dlpglkaath ytitirgvtq dfsttplsve vlteevpdmg 1261 nltvtevswd alrlnwttpd gtydqftiqv qeadqveeah nltvpgslrs meipglragt 1321 pytvtlhgev rghstrplav ewtedlpql gdlavsevgw dglrlnwtaa dnayehfviq 1381 vqevnkveaa qnltlpgslr avdipgleaa tpyrvsiygv irgyrtpvls aeastakepe 1441 ignlnvsdit pesfnlswma tdgifetfti eudsnrlle tveymsgae rtahisglpp 1501 stdfivylsg lapsirtkti satattealp llenltisdi npygftvswm asenafdsfl
1561 vtwdsgkll dpqeftlsgt qrklelrgli tgigyevmvs gftqghqtkp Iraeivteae
1621 pevdnllvsd atpdgfrlsw tadegvfdnf vlkirdtkkq sepleitlla pertrditgl
1681 reateyeiel ygiskgrrsq tvsaiattam gspkevifsd itensatvsw raptaqvesf 1741 ntyvpitgg tpsmvtvdgt ktqtrlvkli pgveylvsn amkgfeesep vsgsfttald 1801 gpsglvtam tdsealarwq paiatvdsyv isytgekvpe itrtvsgntv eyaltdlepa
1861 teytlnfae kgpqksstit akfttdldsp rdltatevqs etalltwrpp rasvtgyllv
1921 yesvdgtvke vivgpdttsy sladlspsth ytakiqalng plrsnnuqti fttigllypf
1981 pkdcsqamln gdttsglyti ylngdkaeal evfcdmtsdg ggwivflrrk ngrenfyqnw 2041 kayaagfgdr reefwlgldn Inkitaqgqy elrvdlrdhg etafavydkf svgdaktryk 2101 Ikvegysgta gdsmayhngr sfstfdkdtd saitncalsy kgafwymch rvnlmgrygd
2161 nnhsqgvnwf hwkghehsiq faemklrpsn fmlegrrkr a
76 PRT Искусственная Fibcon Ldaptdlqvtnvtdtsitvswtppsatitgyritytpsngpgepkelt vppsstsv titgltpgveywslyalkdnqespplvgtqtt
77 PRT Искусственная 10-й домен FN3 фибронектина (FN10) VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYY RITYGETGGNSPV QEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTG RGDSPASSKPISINY RT
78 PRT Искусственная Линкер GSGS
79 PRT Искусственная Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
80 PRT Искусственная Линкер APAP
81 PRT Искусственная Линкер APAPAPAPAP
82 PRT Искусственная Линкер APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
83 PRT Искусственная Линкер APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP АРАРА PAP
84 PRT Искусственная Линкер AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA
85 PRT Искусственная Петля ВС Tencon TAPDAAFD
- 88 039356
86 PRT Искусственная Петля GF Tencon KGGHRSN
87 PRT Искусственная P53A1R5-17 Петля ВС ADPHGFYD
88 PRT Искусственная P54AR4-17 Петля ВС TYDRDGYD
89 PRT Искусственная P54AR4-47 Петля ВС WDPFSFYD
90 PRT Искусственная P54AR4-48 Петля ВС DDPRGFYE
91 PRT Искусственная P54AR4-73 Петля ВС TWPYADLD
92 PRT Искусственная P54AR4-74 Петля ВС GYNGDHFD
93 PRT Искусственная P54AR4-81 Петля ВС DYDLGVYD
94 PRT Искусственная P54AR4-83 Петля ВС DDPWDFYE
95 PRT Искусственная Петли FG EGFR HNVYKDTNMRGL
96 PRT Искусственная Петли FG EGFR LGSYVFEHDVM
97 ДНК Искусственная > EGFR часть ЕСВ97; P54AR4-83v22 Atgttgccagcgccgaagaacctggtagttagcgaggttactga ggac agcgcgcgtctgagctgggacgatccgtgggcgttctacgaga gctttct gatccagtatcaagagagcgagaaagtcggtgaagcgattgtg ctgac cgtcccgggctccgagcgttcctacgacctgaccggtttgaagc cgggt accgagtatacggtgagcatctacggtgttcacaatgtctataag gaca ctaatatccg cggtctg cctctg ag eg ccattttcaccacc
98 ДНК Искусственная > EGFR часть ЕСВ15; P54AR4-83V2 Atgctgccagcccctaagaatctggtcgtgagcgaagtaaccg agga cagcgcccgcctgagctgggacgacccgtgggcgttctatgag tctttcc tgattcagtatcaagaaagcgaaaaagttggcgaagcgatcgt cctga ccgtcccg gg tag eg ag eg ctcctacg atetg accgg cctg a a accgg gtacggagtacacggtgtccatttacggtgttcacaatgtgtataa agac accaacatgcgtggcctgccgctgtcggcgattttcaccacc
99 PRT Искусственная tencon 27 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VKGGHRSNPLSAIFTT
100 PRT Искусственная Библиотека TCL14 LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSF XIXYX EXXXXGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX VXIXG VKGGXXSXPLSAIFTT
> SEQ ID NO: 101
PRT
Homo sapiens c-Met
- 89 039356 mkapavlapg ilvllftlvq rsngeckeal aksemnvnmk yqlpnftaet piqnvilheh hiflgatnyi yvlneedlqk vaeyktgpvl ehpdcfpcqd csskanlsgg vwkdninmal
121 wdtyyddql iscgsvnrgt cqrhvfphnh tadiqsevhc ifspqieeps qcpdcwsal
181 gakvlssvkd rfinffvgnt inssyfpdhp Ihsisvrrlk etkdgfmflt dqsyidvlpe
241 frdsypikyv hafesnnfiy fltvqretld aqtfhtmr fcsinsglhs ymemplecil
301 tekrkkrstk kevfrulqaa yvskpgaqla rqigaslndd ilfgvfaqsk pdsaepmdrs
361 amcafpikyv ndffnkivnk nnvrclqhfy gpnhehcfnr tllmssgce arrdeyrtef
421 ttalqrvdlf mgqfsevllt sistfikgdl tianlgtseg rfmqvwsrs gpstphvnfl
481 Idshpvspev ivehtlnqng ytlvitgkki tkiplnglgc rhfqscsqcl sappfvqcgw
541 chdkcvrsee clsgtwtqqi clpaiykvfp nsapleggtr Iticgwdfgf rmnkfdlkk
601 trvllgnesc tltlsestmn tlkctvgpam nkhfnmsiu snghgttqys tfsyvdpvit
661 sispkygpma ggtlltltgn ylnsgnsrhi siggktctlk svsnsilecy tpaqtistef
721 avklkidlan retsifsyre dpivyeihpt ksfistwwke plruvsflfc fasggstitg
781 vgknlnsvsv prmvinvhea gmftvacqh rsnseucct tpslqqlnlq Iplktkaffm
841 Idgilskyfd liyvhnpvfk pfekpvmism gnenvleikg ndidpeavkg evlkvgnksc
901 eruhlhseav Ictvpndllk Inselniewk qaisstvlgk vivqpdqnft gliagwsis
961 talllllgff Iwlkkrkqik dlgselvryd arvhtphldr Ivsarsvspt temvsnesvd
1021 yratfpedqf pnssqngscr qvqypltdms piltsgdsdi sspllqntvh idlsalnpel
1081 vqavqhwig psslivhfne vigrghfgcv yhgtlldndg kkihcavksl nntdigevs
1141 qfltegumk dfshpnvlsl Igiclrsegs plwlpymkh gdlmfime thnptvkdli
1201 gfglqvakgm kylaskkfvh rdlaamcml dekftvkvad fglardmydk eyysvhnktg
1261 aklpvkwmal eslqtqkftt ksdvwsfgvl Iwelmtrgap pypdvntfdi tvyllqgrrl
1321 Iqpeycpdpl yevmlkcwhp kaemrpsfse Ivsnsaifs tfigehyvhv natyvnvkcv
1381 apypsllsse dnaddevdtr pasfwets
- 90 039356
102 PRT Homo sapiens HGF QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIK TKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDK ARKQCLWFPFNSMS SGVKKEFGHEFDLYE N KD Yl RNCIIG KG RSYKGTVSITKSGIKCQPWS SMIPHEHSFLPSSYRG KDLQENYCRNP RGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVEC MTCNGESYRGLMDH TESGKICQRWDHQTP HRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPW CYTLDPHTRWEYCAIK TCADNTMNDTDVPL ETTECQGQGEGYRGTVNTWNGIPCQRWDSQ YPHEHDMTPENFKC KDLRENYCRNPDGS ESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDC YRGNGKNYMGNLSQT RSGLTCSMWDKNME DLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPW CYTGNPLIPWDYCPIS RCEGDTTPTIVNL DHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWMVSLR YRNKHICGGSLIKESW VLTARQCFPSRD LKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLV YGPEGSDLVLMKLAR PAVLDD FVSTID LP NYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVA HLYIMGNEKCSQHHRG KVTLNESEICAG AEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVI VPGRGCAIPNRPGIFV RVAYYAKWIHKII LTYKVPQS
103 ДНК Искусственная > c-MET часть ECB97 P114AR7P95C5v2 Ctgccggctccgaagaacttggtggtgagccgtgttaccgaag atagc gcacgcctgagctggacggcaccggatgcggcgttcgatagct tctgg attcgctattttgagtttctgggtagcggtgaggcaattgttctgacg gtgcc gggctctgaacgctcctacgatttgaccggtctgaaaccgggca ccga gtatgtggtgaacattctgagcgttaagggcggtagcatcagccc accg ctgagcgcgatcttcacgactggtggttgc
104 ДНК Искусственная > c-MET часть ECB15 P114AR7P94АЗ Ctgccggcaccgaagaacctggttgtcagccgtgtgaccgagg atag eg ca eg tttg ag ctg g a ccg ctccg g atg cag cctttg a cag ett etgga ttcgttactttgaatttctgggtagcggtgaggcgatcgttctgacg gtgeeg ggctctgaacgcagctatgatttgacgggcctgaagccgggtac tgagt acgtggttaacatcatgggcgttaagggtggtaaaatcagcccg ccatt gtccgcgatctttaccacg
105 PRT Искусственная Линкер GGGGS
- 91 039356
106 PRT Искусственная ЕСВ91 mlpapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvg eaivltvpgse rsydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirglplsaifttapapapa papLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYF EFLGSGEAIVLTV PGSERSYDLTGLKPGTEYWNILSVKGGSISPP LSAIFTT
107 PRT Искусственная P53A1R517v2 Ipapknlwsevtedsarlswadphgfydsfliqyqesekvgeai vltvpgsersy dltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrglplsaiftt
108 PRT Искусственная P54AR483v22 Ipapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvgea ivltvpgsers ydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirglplsaiftt
109 PRT Искусственная P54AR483v23 Ipapknlwsevtedsarlswddphafyesfliqyqesekvgeai vltvpgsersy dltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirglplsaiftt
110 PRT Искусственная P53A1R517v22 Ipapknlwsevtedsarlswadphgfydsfliqyqesekvgeai vltvpgsersy dltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirglplsaiftt
111 PRT Искусственная P114AR7P94- A3v22 Ipapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwiryfeflgsgeaivl tvpgsersyd Itglkpgteywnilgvkggkispplsaiftt
112 PRT Искусственная P114AR9P121 -A6v2 LPAPKN LWSRVTE DSARLSWT APDAAF DSFWIRYFEFVGSGEAI VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILGVKGGS ISPPLSAIFTT
113 PRT Искусственная P114AR9P122 -A7v2 LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSF WIRYFEFVSKGDA IVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVKGG SISPPLSAIFTT
114 PRT Искусственная P114AR7P95- C5v2 LPAPKN LWSRVTE DSARLSWT APDAAF DSFWIRYFEFLGSGEAI VLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILSVKGG SISPPLSAIFTT
115 ДНК Искусственная ECB97 atgttgccagcgccgaagaacctggtagttagcgaggttactga ggac agcgcgcgtctgagctgggacgatccgtgggcgttctacgaga gctttct g atccagtatca agagagcgagaaagtcggtgaagcg attgtg ctgac cgtcccgggctccgagcgttcctacgacctgaccggtttgaagc cgggt accgagtatacggtgagcatctacggtgttcacaatgtctataag gaca ctaatatccgcggtctgcctctgagcgccattttcaccaccgcacc ggc accggctccggctcctgccccgctgccggctccgaagaacttgg tggtg agccgtgttaccgaagatagcgcacgcctgagctggacggca ccgga tg egg cgttcg atag ettetgg atteg ctattttg agtttctg ggtag c ggtga ggcaattgttctgacggtgccgggctctgaacgctcctacgatttg accg gtctgaaaccgggcaccgagtatgtggtgaacattctgagcgtta aggg cggtagcatcagcccaccgctgagcgcgatcttcacgactggtg gttgc
- 92 039356
116 ДНК Искусственная ЕСВ15 atgctgccagcccctaagaatctggtcgtgagcgaagtaaccg aggac agcgcccgcctgagctgggacgacccgtgggcgttctatgagtc tttcct gattcagtatcaagaaagcgaaaaagttggcgaagcgatcgtc ctgac cgtcccgggtagcgagcgctcctacgatctgaccggcctgaaa ccggg tacggagtacacggtgtccatttacggtgttcacaatgtgtataaa gaca cca a catg eg tg g cctg ccg ctg t eg g eg atttt ca cca ccg eg cctgc gccagcgcctgcaccggctccgctgccggcaccgaagaacct ggttgt cag ccgtgtg accg agg atag eg cacgtttg ag ctg g accg et cegga tgcagcctttgacagcttctggattcgttactttgaatttctgggtagc ggtg aggcgatcgttctgacggtgccgggctctgaacgcagctatgatt tgacg ggcctgaagccgggtactgagtacgtggttaacatcatgggcgtt aagg gtggtaaa atcag cccg ccattgtccg eg atctttaccacg
117 PRT Искусственная альбуминсвязывающий домен tidewllkeakekaieelkkagitsdyyfdlinkaktvegvnalkde ilka
118 PRT Искусственная ЕСВ18 mlpapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvge aivltv pgsersydltglkpgteytvsiygvhmvykdtnmrglplsaiftta papapa paplpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwirydewvgg eaivlt vpgsersydltglkpgteyyvnilgvkggsisvplsaifttapapap apapl aeakvlanreldkygvsdyyknlinnaktvegvkalldeilaalp
119 PRT Искусственная ЕСВ28 mlpapknlwsevtedsarlswadphgfydsfliqyqesekvge aivltv pgsersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrglplsaifttap apapa paplpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwirydevwg geaivlt vpgsersydltglkpgteyyvnilgvkggsisvplsaifttapapap apapl aeakvlanreldkygvsdyyknlinnaktvegvkalldeilaalp
120 PRT Искусственная ЕСВ38 mlpapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvg eaivltv pgsersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrglplsaifttap apapa paplpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwiryfeflgsge aivltv pgsersydltglkpgteywnimgvkggkispplsaifttapapa papapl aeakvlanreldkygvsdyyknlinnaktvegvkalldeilaalp
121 PRT Искусственная ЕСВ39 mlpapknlwsevtedsarlswadphgfydsfliqyqesekvge aivltv pgsersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrglplsaifttap apapa paplpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwiryfeflgsge aivltv pgsersydltglkpgteywnimgvkggkispplsaifttapapa papapl aeakvlanreldkygvsdyyknlinnaktvegvkalldeilaalp
- 93 039356
122 PRT Искусственная Р53А1 R5-17 wthMet MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWADPHGFYDS FLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
123 PRT Искусственная P54AR4-17 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTYDRDGYDS FLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
124 PRT Искусственная P54AR4-47 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWGYNGDHFDS FLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
125 PRT Искусственная P54AR4-48 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWDDPRGFYES FLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
126 PRT Искусственная P54AR4-73 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTWPYADLDS FLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
127 PRT Искусственная 54AR4-74 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWGYNGDHFDS FLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
128 PRT Искусственная P54AR4-81 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWDYDLGVYFD SFLIQ YQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTE YTVSI YGVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
129 PRT Искусственная P54AR4-83 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWDDPWAFYES FLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
130 PRT Искусственная P54CR4-31 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSF LIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT
131 PRT Искусственная P54AR4-83v2 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYES FLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNM RGLPLSAIFTT
132 PRT Искусственная P54CR4-31v2 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWTAPDAAFDS FLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVLGSYVFEHDVMLPLSAIFTT
133 PRT Искусственная P54AR4-73v2 с Met MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTWPYADLDS FLIQY QESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNMRGLPLSAEFTT
134 PRT Искусственная P53A1R517v2 с Met mlpapknlwsevtedsarlswadphgfydsfliqyqesekvge aivltvpgser sydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrglplsaiftt
- 94 039356
135 PRT Искусственная P54AR4- 83v22 с Met mlpapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvg eaivltvpgse rsydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirglplsaiftt
136 PRT Искусственная P54AR4- 83v23 с Met mlpapknlwsevtedsarlswddphafyesfliqyqesekvge aivltvpgser sydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirglplsaiftt
137 PRT Искусственная P53A1R517v22cMet mlpapknlwsevtedsarlswadphgfydsfliqyqesekvge aivltvpgser sydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirglplsaiftt
138 PRT Искусственная ЕСВ1 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGS GGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAP DAAF DSFWIRYDEWVGGEAIVLTVPGSERSYDLTG LKPG TEYYVNILGVKGGSISVPLSAI FTT
139 PRT Искусственная ЕСВ2 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGS GGGG SGGGGSLPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPD AAFD SFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLTGLK PGT EYVVNIMGVKGGKISPPLSAIFTT
140 PRT Искусственная ЕСВЗ без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGS GGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAP DAAF DSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLTGL KPG TEYWQIIGVKGGHISLPLSAI FTT
141 PRT Искусственная ЕСВ4 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGS GGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAP DAAF DSFFIRYDEFLRSGEAIVLTVPGSERSYDLTGL KPGT EYWVTILGVKGGLVSTPLSAIFTT
- 95 039356
142 PRT Искусственная ЕСВ5 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGS GGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAP DAAF DSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLTGL KPG TEYWNIMGVKGGKISPPLSAIFTT
143 PRT Искусственная ЕСВ6 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGS GGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAP DAAF DSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLTGL KPG TEYWQ11GVKGGHISLPLSAIFTT
144 PRT Искусственная ЕСВ7 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTGGGGSGGGGS GGGG SGGGGSMLPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAP DAAF DSFWIRYFEFLGSGEAIVLTVPGSERSYDLTGL KPG TEYWQ 11 GVKGGHISLPLSAI FTT
145 PRT Искусственная ЕСВ15 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEF LGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIMGV KGGKI SPPLSAIFTT
146 PRT Искусственная ЕСВ27 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYDEV WGG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYYVNILGVK GGSI SVPLSAIFTT
- 96 039356
147 PRT Искусственная ЕСВ60 met без LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPM LPAPK NLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFE FLGS GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIMG VKGG KISPPLSAIFTT
148 PRT Искусственная ЕСВ37 met без LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNMRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYDEV WGG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYYVNILGVK GGSI SVPLSAIFTT
149 PRT Искусственная ЕСВ94 met без LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAP L PAP KNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFL GSGE AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVKG GKIS PPLSAIFTT
150 PRT Искусственная ECB95 met без LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAP L PAP KNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFV GSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILGVK GGSI SPPLSAIFTT
151 PRT Искусственная ECB96 met без LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAP L PAP KNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFV SKGD AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVKG GSIS PPLSAIFTT
- 97 039356
152 PRT Искусственная ЕСВ97 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAP L PAP KNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFL GSGE AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILSVKG GSISP PLSAIFTT
153 PRT Искусственная ЕСВ106 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAP L PAP KNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFL GSGE AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVKG GKIS PPLSAIFTT
154 PRT Искусственная ЕСВ107 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAP L PAP KNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFV GSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVK GGSI SPPLSAIFTT
155 PRT Искусственная ЕСВ108 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAP L PAP KNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFV SKGD AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVKG GSIS PPLSAIFTT
156 PRT Искусственная ЕСВ109 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYESFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAP L PAP KNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFL GSGE AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILSVKG GSISP PLSAIFTT
- 98 039356
157 PRT Искусственная ЕСВ118 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLP APKNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFL GSGE AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVKG GKIS PPLSAIFTT
158 PRT Искусственная ЕСВ119 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLP APKNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFV GSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVK GGSI SPPLSAIFTT
159 PRT Искусственная ЕСВ120 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLP APKNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFV SKGD AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVKG GSIS PPLSAIFTT
160 PRT Искусственная ЕСВ121 без met LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWADPHGFYDSFL IQYQ ESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYT VSIYG VHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPLP APKNL WSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEFL GSGE AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILSVKG GSISP PLSAIFTT
161 PRT Искусственная ЕСВ91 без met Ipapknlwsevtedsarlswddpwafyesfhqyqesekvgeai vltvpgsers ydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirglplsaifttapapapap apLPAPK NLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFE FLGSGEAIVLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYVVNILSVKGGSISPPL SAIFTT
162 PRT Искусственная ЕСВ18 без met Ipapknlwsevtedsarlswddpwafyesfhqyqesekvgea ivltvp gsersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrglplsaifttapa papap aplpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwirydevwgg eaivltv pgsersydltglkpgteyyvmlgvkggsisvplsaifttapapapa papla eakvlanreldkygvsdyyknhnnaktvegvkalldeilaalp
- 99 039356
163 PRT Искусственная ЕСВ28 met без Ipapknlwsevtedsarlswadphgfydsfhqyqesekvgeai vltvpg sersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrglplsaifttapap apapa plpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfwirydevwgge aivltvp gsersydltglkpgteyyvmlgvkggsisvplsaifttapapapap aplae akvlanreldkygvsdyyknhnnaktvegvkalldeilaalp
164 PRT Искусственная ЕСВ38 met без Ipapknlwsevtedsarlswddpwafyesfhqyqesekvgea ivltvp gsersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrglplsaifttapa papap aplpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwiryfeflgsgea ivltvp gsersydltglkpgteywmmgvkggkispplsaifttapapap apapla eakvlanreldkygvsdyyknhnnaktvegvkalldeilaalp
165 PRT Искусственная ЕСВ39 met без Ipapknlwsevtedsarlswadphgfydsfhqyqesekvgeai vltvpg sersydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnmrglplsaifttapap apapa plpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwiryfeflgsgeai vltvpg sersydltglkpgteywmmgvkggkispplsaifttapapapa paplae akvlanreldkygvsdyyknhnnaktvegvkalldeilaalp
166 ДНК Искусственная ECB97 met без ttgccagcgccgaagaacctggtagttagcgaggttactgagga cage gcgcgtctgagctgggacgatccgtgggcgttctacgagagcttt etgat ccagtatcaagagagcgagaaagtcggtgaagcgattgtgctg accgt cccgggctccgagcgttcctacgacctgaccggtttgaagccgg gtacc gagtatacggtgagcatctacggtgttcacaatgtctataaggac actaa tateeg eggtetg cctctg ag eg ccatttt caeca ccg caccgg c accg gctccggctcctgccccgctgccggctccgaagaacttggtggt gagee gtgttaccgaagatagcgcacgcctgagctggacggcaccgg atgeg gcgttcgatagcttctggattcgctattttgagtttctgggtagcggt gaggc aattgttctgacggtgccgggctctgaacgctcctacgatttgacc ggtet gaaaccgggcaccgagtatgtggtgaacattctgagcgttaag ggcggt agcatcagcccaccgctgagcgcgatcttcacgactggtggttg c
- 100 039356
167 ДНК Искусственная ЕСВ15 без met ctgccagcccctaagaatctggtcgtgagcgaagtaaccgagg acag cgcccgcctgagctgggacgacccgtgggcgttctatgagtcttt cctga ttcagtatcaagaaagcgaaaaagttggcgaagcgatcgtcct gaccg tcccgggtagcgagcgctcctacgatctgaccggcctgaaacc gggta cggagtacacggtgtccatttacggtgttcacaatgtgtataaag acacc aacatgcgtggcctgccgctgtcggcgattttcaccaccgcgcct gcgc cagcgcctgcaccggctccgctgccggcaccgaagaacctgg ttgtca gccgtgtgaccgaggatagcgcacgtttgagctggaccgctcc ggatg cagcctttgacagcttctggattcgttactttgaatttctgggtagcg gtgag gcgatcgttctgacggtgccgggctctgaacgcagctatgatttg acggg cctgaagccgggtactgagtacgtggttaacatcatgggcgttaa gggtg gtaa aatcag cccg ccattgtccg eg atctttacca eg
168 ДНК Искусственная > EGFR часть ЕСВ97; P54AR4- 83v22 без met ttgccagcgccgaagaacctggtagttagcgaggttactgagga cage gcgcgtctgagctgggacgatccgtgggcgttctacgagagcttt etgat ccagtatcaagagagcgagaaagtcggtgaagcgattgtgctg accgt cccgggctccgagcgttcctacgacctgaccggtttgaagccgg gtacc gagtatacggtgagcatctacggtgttcacaatgtctataaggac actaa tateeg eggtetg cctctg ag eg ccatttt caeca cc
169 ДНК Искусственная > EGFR часть ЕСВ15; P54AR4-83v2 без met ctgccagcccctaagaatctggtcgtgagcgaagtaaccgagg acag cgcccgcctgagctgggacgacccgtgggcgttctatgagtcttt cctga ttcagtatcaagaaagcgaaaaagttggcgaagcgatcgtcct gaccg tcccgggtagcgagcgctcctacgatctgaccggcctgaaacc gggta cggagtacacggtgtccatttacggtgttcacaatgtgtataaag acacc aacatgcgtggcctgccgctgtcggcgattttcaccacc
170 PRT Искусственная ЕСВ94 с Сконцевым цистеином mlpapknlwsevtedsAr'lswddpwafyes FLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEF LGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVK GGKI SPPLSAIFTTC
- 101 039356
171 PRT /!скусственная ЕСВ95 с Сконцевым цистеином MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYES FLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAI FTTAPAPAPAPAPLPAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEF VGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVK GGSI SPPLSAIFTTC
172 PRT Искусственная ЕСВ96 с Сконцевым цистеином MLPAPKNLWSEVTEDSARLSWDDPWAFYESF LIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEF VSKG DAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILGVK GGSI SPPLSAIFTTC
173 PRT Искусственная ЕСВ97 с Сконцевым цистеином MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPWAFYES FLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEF LGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILSVK GGSIS PPLSAIFTTC
174 PRT Искусственная ЕСВ106 с Сконцевым цистеином MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYES FLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEF LGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVK GGKI SPPLSAIFTTC
175 PRT Искусственная ЕСВ107 с Сконцевым цистеином MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYES FLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEF VGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILGVK GGSI SPPLSAIFTTC
176 PRT Искусственная ЕСВ108 с Сконцевым цистеином MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYES FLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEF VSKG DAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNILGVK GGSI SPPLSAIFTTC
177 PRT Искусственная ЕСВ109 с Сконцевым цистеином MLPAPKNLVVSEVTEDSARLSWDDPHAFYES FLIQY QESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEY TVSIY GVHNVYKDTNIRGLPLSAIFTTAPAPAPAPAPL PAPKN LVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYFEF LGSG EAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILSVK GGSIS PPLSAIFTTC
178 PRT Искусственная ЕСВ91 с Сконцевым цистеином mlpapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvg eaivltvpgse rsydltglkpgteytvsiygvhnvykdtnirglplsaifttapapapa papLPAP KNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFWIRYF EFLGSGEAIVLTV PGSERSYDLTGLKPGTEYVVNILSVKGGSISP PLSAIFTTC
- 102 039356 > SEQ ID NO: 179
PRT
Искусственная
Петля FG домена FN3, связывающегося c EGFR HNVYKDTNXgRGL;
причем Xg представляет собой М или I >SEQIDNO: 180
PRT
Искусственная
Петля FG домена FN3, связывающегося с EGFR LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), > SEQ ID NO: 181
PRT
Искусственная
Петля ВС домена FN3, связывающегося с EGFR
- 103 039356
X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181); причем:
Xi представляет собой A, T, G или D;
X2 представляет собой A, D, Y или W;
Хз представляет собой P, D или Ν;
X4 представляет собой L или отсутствует;
Хз представляет собой D, Н, R, G, Y или W;
Хе представляет собой G, D или А;
Х7 представляет собой A, F, G, Н или D; и Xs представляет собой Y, F или L.
> SEQIDNO: 182
PRT
Искусственная
Домен FN3, связывающийся с EGFR
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNXgRGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182),
Xi представляет собой A, T, G или D;
X2 представляет собой A, D, Y или W;
Хз представляет собой Р, D или N;
Х4 представляет собой L или отсутствует;
Хз представляет собой D, Н, R, G, Y или W;
Хб представляет собой G, D или А;
X? представляет собой A, F, G, Н или D;
Xs представляет собой Y, F или L; и Хд представляет собой М или I.
> SEQIDNO: 183
PRT
Искусственная
Домен FN3, связывающийся с EGFR
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), причем:
Xi представляет собой А, Т, G или D;
Хг представляет собой A, D, Y или W;
Хз представляет собой Р, D или N;
Х4 представляет собой L или отсутствует;
- 104 039356
Хз представляет собой D, Н, R G, Y или W;
Хб представляет собой G, D или А;
X? представляет собой A, F, G, Н или D; и Хх представляет собой Y, F или L.
>SEQIDNO: 184
PRT
Искусственная
Последовательность тяжа С и петли CD домена FN3, связывающегося с c-Met
DSFXioIRYXnE X12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), причем:
Хю представляет собой W, F или V;
Хп представляет собой D, F или L;
Х12 представляет собой V, F или L;
Х1з представляет собой V, L или Т;
Х14 представляет собой V, R, G, L, Т или S;
Х15 представляет собой G, S, А, Т или К; и
Х16 представляет собой Е или D; и >SEQIDNO: 185
PRT
Искусственная
Последовательность тяжа F и петли FG домена FN3, связывающегося с c-Met
TEYX17VX18IX19X20V KGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), причем:
Xi7 представляет собой Y, W, I, V, G или А;
Xis представляет собой Ν, Т, Q или G;
Хю представляет собой L, Μ, N или I;
Х20 представляет собой G или S;
Х21 представляет собой S, L, G, Y, Т, R, Н или К;
Х22 представляет собой I, V или L; и
Х23 представляет собой V, Т, Η, I, Р, Y или L.
>SEQIDNO: 186
PRT
Искусственная домен FN3, связывающийся с c-Met
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFXioIRYXnE X12X13X14X15GX16
AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYXi7VXi8IXi9X2oVKGGX2iX22SX23PLSAEFTT (SEQ ID NO: 186), причем:
- 105 039356
Хю представляет собой W, F или V; и
Хп представляет собой D, F или L;
Х12 представляет собой V, F или L;
Хп представляет собой V, L или Т;
Х14 представляет собой V, R, G, L, Т или S;
Х15 представляет собой G, S, А, Т или К;
Х16 представляет собой Е или D;
Х17 представляет собой Y, W, I, V, G или А;
Хю представляет собой Ν, Т, Q или G;
Хю представляет собой L, Μ, N или I;
Х20 представляет собой G или S;
Х21 представляет собой S, L, G, Y, Т, R, Н или К;
Х22 представляет собой I, V или L; и
Х23 представляет собой V, Т, Η, I, Р, Y или L.
>SEQIDNO: 187
PRT
Искусственная
Домен FN3, связывающийся с EGFR, биспецифической к EGFR/c-Met молекулы, содержащей домен FN3
LPAPKNLVVSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX30LTVPGSERSYDL
TGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT (SEQ ID NO: 187), причем:
Х24 представляет собой Е, N или R;
Х25 представляет собой Е или Р;
Х26 представляет собой L или А;
Х27 представляет собой Н или W;
Х28 представляет собой Е или D;
Х29 представляет собой Е или Р;
Хзо представляет собой N или V;
Хз1 представляет собой G или Y;
Х32 представляет собой М или I; и
Хзз представляет собой Е или I;
- 106 039356
X34 представляет собой Е, N или R;
Х35 представляет собой Е или Р;
Хзб представляет собой L или А;
Х37 представляет собой Е или Р;
Хз8 представляет собой V или L;
Хзэ представляет собой G или S;
Х40 представляет собой S или К;
Х41 представляет собой Е или D;
Х42 представляет собой N или V;
Х43 представляет собой L или М;
Х44 представляет собой G или S;
Х45 представляет собой S или К; и
Х46 представляет собой Е или I.
>SEQIDNO: 189
VH mAb к EGFR El
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGD SVKGRFTISRDNSKNTLY
LQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSS > SEQ ID NO: 190
VL mAb к EGFR El
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSES GTDFTLTISSLQP
EDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK > SEQ ID NO: 191
VHmAbKEGFRE2
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMNWVRQA PGKGLEWVAN IKKDGSEKYY
VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL GWGWGWYFDL WGRGTLVTVS
121 S > SEQ ID NO: 192
VLmAbKEGFRE2
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA 61 RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPTFGQ GTKVEIK > SEQ ID NO: 193
VH mAb к c-Met Ml
- 107 039356
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGYTNYAQ KLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTLVTVSS > SEQ ID NO: 194
VL mAb к c-Met Ml
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP-ITFGQGTRLEIK > SEQ ID NO: 195
VH mAb к c-Met М2
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDDGSYTYYPDS VKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGLYYYGSGSYYNQDYWGQGTLVTVSS > SEQ ID NO: 196 c-Met mAb М2 VL
QLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGLSSALAWYRQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSYPQITFGQGTRLEIK > SEQ ID NO: 197
Gpl20 тяжелая цепь c F405L qvqlvqsgaevkkpgasvkvscqasgyrfsnfvihwvrqapgqrfewmgwinpyngnkefsakfqdrvtftadtsantaymelrslrsadtavy ycarvgpyswddspqdnyymdvwgkgttvivssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssgl yslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfh wyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvk gfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfllyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk > SEQ ID NO: 198
Gpl20 тяжелая цепь c K409R qvqlvqsgaevkkpgasvkvscqasgyrfsnfvihwvrqapgqrfewmgwinpyngnkefsakfqdrvtftadtsantaymelrslrsadtavy ycarvgpyswddspqdnyymdvwgkgttvivssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssgl yslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfh wyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvk gfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk > SEQ ID NO: 199
Hl mAb EMI (антитело к EGFR, 405L)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYYGD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVS
- 108 039356
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK > SEQ ID NO: 200
LI mAb EM-1
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSES GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC > SEQ ID NO: 201
H2 mAb EM-1 (K409R, антитело к c-Met)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAYNGYTNYAQ KLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFDYWGQGTL VTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK > SEQ ID NO: 202
L2mAbEM-l
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > SEQ ID NO: 203
Hl, константный участок
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
- 109 039356
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK > SEQ ID NO: 204
H2, константный участок
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK > SEQ ID NO: 205
EMl-mAb Hl, кДНК pdr000015499 caggtgcagctggtcgagagcggcggaggggtggtgcagcccggcagaagcctgaggctgtcctgcgccgccagcggcttcaccttcagcacctac ggcatgcactgggtgcggcaggccccaggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctgggacgacggcagctacaagtactacggcgacagcgt gaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactg cgccagggacggcatcaccatggtgcggggcgtgatgaaggactacttcgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcac caagggcccaagcgtgttccccctggcccccagcagcaagagcaccagcggcggcacagccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccga gccagtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcg tggtgaccgtgcccagcagcagcctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtggagc ccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagccccagagctgctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaagga caccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggc gtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactgg ctgaacggcaaggaatacaagtgcaaggtctccaacaaggccctgccagcccccatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagccacggga gccccaggtgtacaccctgccccccagccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctaccccagcgacatc gccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggcagcttcctcctgtacagcaag ctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctga gcctgagccccggcaaatga > SEQ ID NO: 206
EMl-mAb LI, кДНК pDROOOO 15499 atccagctgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgggtgaccatcacctgccgggccagccaggacatcagcagcgccct ggtctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgacgccagctccctggaaagcggcgtgcccagccggttcagcggcag cgagagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagttcaacagctaccccctgacctt tggcggcggaacaaaggtggagatcaagcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcaccgc cagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagag
- 110 039356 cgtcaccgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctg cgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgctga > SEQ ID NO: 207
EMI-mAb H2, кДНК pDR000016584 caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcgagacttctggttacacctttaccagctatggtat cagctgggtgcgacaggcccctggacacgggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggttacacaaactatgcacagaagctccagggca gggtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagat ctgagaggaactaactactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccaagcgtgttccctctggccccc agcagcaagagcacatctggcggaacagccgccctgggctgcctggtgaaagactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgccct gaccagcggcgtgcacacctttccagccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgtccagcgtggtgaccgtgcccagcagctccctgggcacc cagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtccc ccctgccctgcccctgaactgctgggcggaccctccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgac ctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccaga gaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgacagtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctcca acaaggccctgcctgctcccatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagcctcaggtgtacacactgcctcccagccgggaag agatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctaccccagcgatatcgccgtggaatgggagagcaacggacagcccgagaa caactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctccttcttcctgtactctcggctgaccgtggacaagagccggtggcagcagggaaacg tgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccgggaagtga > SEQ ID NO: 208
EMI-mAb L2, кДНК pDR000016584 gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtccgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggcctcccagggcatctccaactggctg gcctggttccagcacaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgcctcctccctgctgtccggcgtgccctccagattctccggctctggct ccggcaccgacttcaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcaggccaactccttccccatcaccttcggcca gggcacccggctggaaatcaagcgtacggtggccgctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgt ggtgtgcctgctgaacaacttctacccccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcac cgagcaggacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaggt gacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgctga > SEQ ID NO: 209
Gpl20 легкая цепь
Eivltqspgtlslspgeratfscrsshsirsrrvawyqhkpgqaprlvihgvsnrasgisdrfsgsgsgtdftltitrvepedfalyycqvygassytfgqg tklerkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthq glsspvtksfhrgec
- 111 039356 > SEQ ID NO 210
El HC1 HCDR1
TYGMH > SEQ ID NO 211
El HC1 HCDR2
VIWDDGSYKYYGDSVKG > SEQ ID NO 212
El HC1 HCDR3
DGITMVRGVMKDYFDY > SEQ ID NO 213
El LC1 LCDR1
RASQDISSALV > SEQ ID NO 214
El LC1 LCDR2
DASSLES > SEQ ID NO 215
El LC1 LCDR3
QQFNSYPLT > SEQ ID NO 216
El HC2 HCDR1
SYGIS > SEQ ID NO 217
El HC2 HCDR2
WISAYNGYTNYAQKLQG > SEQ ID NO 218
E1HC2 HCDR3
DLRGTNYFDY > SEQ ID NO 219
El LC2 LCDR1
- 112 039356
RASQGISNWLA > SEQ ID NO: 220 El LC2 LCDR2
AASSLLS > SEQ ID NO: 221 El LC2 LCDR3
QQANSFPIT > SEQ ID NO: 222 E2-mAb HCl, HCDR1 SYWMN > SEQ ID NO: 223 E2-mAb HCl, HCDR2
NIKKDGSEKYYVDSVKG > SEQ ID NO: 224 E2-mAb HCl, HCDR3 DLGWGWGWYFDL > SEQ ID NO: 225 E2-mAB LC1 LCDR1
RASQSVSSYLA > SEQ ID NO: 226 E2-mAb LC1, LCDR2 DASNRAT > SEQ ID NO: 227 E2-mAb LC1, LCDR3 QQRSNWPPT > SEQ ID NO: 228 E2-mAb HC2, HCDR1
DYYMY
- 113 039356 > SEQ ID NO: 229
E2-mAb HC2, HCDR2
TISDDGSYTYYPDSVKG > SEQ ID NO: 230
E2-mAb HC2, HCDR3
EGLYYYGSGSYYNQDY > SEQ ID NO: 231
E2-mAb LC2, LCDR1
RASQGLSSALA > SEQ ID NO: 232
E2-mAb LC2, LCDR2
DASSLES > SEQ ID NO: 233
E2-mAb LC2, LCDR3
QQFTSYPQIT > SEQ ID NO: 234
E2-mAb, HC1 (EGFR-F405L)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMNWVRQA PGKGLEWVAN IKKDGSEKYY VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL GWGWGWYFDL WGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK > SEQ ID NO: 235
E2-mAb LC1, (EGFR)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPTFGQ GTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > SEQ ID NO: 236
E2-mAb HC2 (c-Met- K409R)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDDGSYTYYPDS
VKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGLYYYGSGSYYNQDYWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
- 114 039356
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK > SEQ ID NO: 237
E2-mAb LC2 (c-Met)
QLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGLSSALAWYRQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQFTSYPQITFGQGTRLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS lYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > SEQ ID NO: 238 непрерывный эпитоп c-Met в mAb 069
PEFRDSYPIKYVHAF > SEQ ID NO: 239 непрерывный эпитоп c-Met в mAb 069
FAQSKPDSAEPMDRSA > SEQ ID NO: 240 эпитоп mAb 5D5
PGAQLARQIGASLNDD

Claims (50)

1. Выделенное биспецифическое антитело к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR)/рецептору фактора роста гепатоцитов (c-Met), содержащее:
a) первую тяжелую цепь (HC1), содержащую константный домен 3 HC1 (HC1 СН3) и вариабельный участок 1 HC1 (VH1), содержащий определяющие комплементарность участки тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 210, 211 и 212 соответственно;
b) вторую тяжелую цепь (HC2), содержащую константный домен 3 HC2 (HC2 СН3) и вариабельный участок 2 НС2 (VH2), содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 216, 217 и 218 соответственно;
c) первую легкую цепь (LC1), содержащую вариабельный участок 1 легкой цепи (VL1), содержащий определяющие комплементарность участки легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 213, 214 и 215 соответственно; и
d) вторую легкую цепь (LC2), содержащую вариабельный участок 2 легкой цепи (VL2), содержащий LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 219, 220 и 221 соответственно, где пара VH1 и VL1 образует первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с EGFR, пара VH2 и VL2 образует второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с c-Met;
где антитело представляет собой IgG1 и имеет замену F405L в плече связывания EGFR и замену K409R в плече связывания c-Met в константном домене СН3 для усиления гетеродимеризации с образованием биспецифического антитела.
2. Биспецифическое антитело по п.1, где антитело ингибирует фосфорилирование связанных с внеклеточными сигналами киназ 1 и 2 (ERK1/2) в клеточной линии NCI-H292, NCI-H1975 или SKMES-1 со значением IC50, которое по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 20 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 30 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 40 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 50 раз меньше или по меньшей мере приблизительно в 60 раз меньше по сравнению со значением IC50 для ингибирования фосфорилирования ERK1/2 в клеточных линиях NCI-H292, NCI-H1975 или SKMES-1 смесью контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего тяже- 115 039356 лую цепь 3 (НС3) и легкую цепь 3 (LC3), и контрольного одновалентного антитела к с-Met, содержащего тяжелую цепь 4 (НС4) и легкую цепь 4 (LC4);
НС3 и НС1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно;
фосфорилирование ERK1/2 измеряют в цельноклеточных лизатах методом сэндвич-ИФА с применением антитела к фосфо-ERK1/2 в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела, связывающегося с нефосфорилированной и фосфорилированной ERK1/2, в качестве детекторного антитела.
3. Биспецифическое антитело по п.1 или 2, где антитело ингибирует фосфорилирование ERK1/2 со значением IC50 приблизительно 2x10’9 М или менее, приблизительно 1x10’9 М или менее или приблизительно 1x10’1° М или менее.
4. Биспецифическое антитело по п.2 или 3, где ERK1 фосфорилирован на остатках Thr202 и Tyr204, a ERK2 фосфорилирован на остатках Thr185 и Tyr197.
5. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-4, где антитело ингибирует фосфорилирование протеинкиназы В (AKT) на Ser473 в клеточной линии NCI-H1975 со значением IC50, по меньшей мере приблизительно в 70 раз меньшим по сравнению со значением IC50 для ингибирования фосфорилирования AKT по Ser473 в клеточной линии NCI-H1975 смесью контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего НС3 и LC3, и контрольного одновалентного антитела к c-Met, содержащего НС4 и LC4;
НС3 и НС1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно;
фосфорилирование AKT на Ser473 измеряют в цельноклеточных лизатах методом сэндвич-ИФА с применением антитела, связывающегося с нефосфорилированной и фосфорилированной AKT, в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела к фосфорилированной на Ser473 AKT в качестве детекторного антитела.
6. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-5, где антитело ингибирует фосфорилирование AKT на Thr308 в клеточной линии NCI-H1975 со значением IC50, по меньшей мере приблизительно в 100 раз меньшим по сравнению со значением IC50 для ингибирования фосфорилирования AKT на Thr308 в клеточной линии NCI-H1975 смесью контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего НС3 и LC3, и контрольного одновалентного антитела к с-Met, содержащего НС4 и LC4;
НС3 и НС1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно;
фосфорилирование AKT на Thr308 измеряют в цельноклеточных лизатах методом сэндвич-ИФА с применением антитела, связывающегося с нефосфорилированной и фосфорилированной AKT, в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела к фосфорилированной на Thr308 AKT в качестве детекторного антитела.
7. Биспецифическое антитело по п.5 или 6, где антитело ингибирует фосфорилирование AKT на Ser473 или Thr308 со значением IC50, равным приблизительно 1x10’9 М или менее.
8. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-7, где биспецифическое антитело связывается с EGFR, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, на остатках EGFR K489, I491, K467 и S492 и с с-Met на остатках PEFRDSYPIKYVHAF (SEQ ID NO: 238) и FAQSKPDSAEPMDRSA (SEQ ID NO: 239).
9. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-8, где антитело ингибирует рост клеток NCI-H292 или NCI-H1975 со значением IC50, по меньшей мере приблизительно в 300 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 400 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 500 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 600 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 700 раз меньшим или по меньшей мере приблизительно в 800 раз меньшим по сравнению со значением IC50 для ингибирования роста клеток NCI-H292 или NCI-H1975 цетуксимабом, если клетки NCI-H292 или NCI-H1975 выращивают в условиях с низким прикреплением.
10. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-9, где антитело ингибирует рост опухоли из экспрессирующих HGF клеток SKMES-1 у мышей SCID Beige с процентным (%) значением Т/С на 36 сутки, по меньшей мере в 500 раз меньшим по сравнению с цетуксимабом при введении биспецифического антитела и цетуксимаба в дозе 20 мг/кг.
11. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-10, где антитело нейтрализует передачу сигналов EGFR и c-Met.
12. Биспецифическое антитело по п.1, где VH1, VL1, VH2 и VL2 содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 189, 190, 193 и 194 соответственно.
13. Биспецифическое антитело по п.12, содержащее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 консервативных аминокислотных замен в НС1, LC1, HC2 или LC2.
14. Биспецифическое антитело по п.13, содержащее замену M252Y/S254T/T256E в НС1 и/или в
- 116 039356
НС2, где нумерация остатков соответствует индексу ЕС.
15. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-14, где антитело имеет 2-антенарную структуру гликана с содержанием фукозы в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 15%.
16. Биспецифическое антитело по п.2, где НС1, LC1, HC2 и LC2 кодированы синтетическими полинуклеотидами, содержащими последовательности SEQ ID NO: 205, 206, 207 и 208 соответственно.
17. Выделенный синтетический полинуклеотид, кодирующий НС1, НС2, LC1 или LC2 по п.16.
18. Выделенный полинуклеотид по п.17, содержащий полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 205, 206, 207 или 208.
19. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.17 или 18.
20. Выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор по п.19.
21. Способ получения выделенного биспецифического к EGFR/c-Met антитела по п.12, включающий:
a) объединение выделенного моноспецифического двухвалентного антитела к EGFR, содержащего две тяжелые цепи SEQ ID NO: 199 и две легкие цепи SEQ ID NO: 200, и выделенного моноспецифического двухвалентного антитела к с-Met, содержащего две тяжелые цепи SEQ ID NO: 201 и две легкие цепи SEQ ID NO: 202, в смеси с молярным соотношением приблизительно 1:1;
b) введение в смесь восстанавливающего агента;
c) инкубирование смеси в течение от приблизительно 90 мин до приблизительно 6 ч;
d) удаление восстанавливающего агента;
e) очистку биспецифического антитела к EGFR/c-Met антитела, содержащего первую тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 210, 211 и 212, и вторую тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 216, 217 и 218, первую легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 213, 214 и 215, и вторую легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 219, 220 и 221, где пара первой тяжелой цепи и первой легкой цепи образует первый связывающий домен, который специфически связывается с EGFR, и пара второй тяжелой цепи и второй легкой цепи образует второй связывающий домен, который специфически связывается с с-Met.
22. Способ по п.21, где восстанавливающий агент представляет собой 2-меркаптоэтаноламин (2-МЕА).
23. Способ по п.22, где 2-МЕА присутствует в концентрации от приблизительно 25 до приблизительно 75 мМ.
24. Способ по п.23, где стадию инкубации проводят при температуре от приблизительно 25 до приблизительно 37°С.
25. Фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело по любому из пп.1-16 и фармацевтически приемлемый носитель.
26. Способ лечения онкологического больного, включающий введение терапевтически эффективного количества биспецифического к EGFR/c-Met антитела по пп.2, 12 больному в течение периода времени, достаточного для лечения рака, где рак представляет собой рак эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), легочную аденокарциному, мелкоклеточный рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак простаты, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак глотки, рак носа, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак языка, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, тестикулярный рак, рак желудка, рак тимуса, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак печени, гепатоклеточную карциному (НСС) или спорадическую или наследственную папиллярную почечную карциному (PRCC).
27. Способ по п.26, где рак связан с активирующей EGFR мутацией, амплификацией гена EGFR, повышенным уровнем циркулирующего HGF, активирующей c-Met мутацией, амплификацией гена c-Met или мутацией KRAS.
28. Способ по п.27, где активирующая EGFR мутация представляет собой замену G719A, G719X (X представляет собой любую аминокислоту), L861X (X представляет собой любую аминокислоту), L858R, Е746К, L747S, E749Q, А750Р, A755V, V765M, L858P или Т790М, делецию Е746-А750, делецию R748-P753, вставку Ala (А) между М766 и А767, вставку Ser, Val и Ala (SVA) между S768 и V769 и вставку Asn и Ser (Ns) между Р772 и Н773.
29. Способ по п.28, где активирующая EGFR мутация представляет собой замену L858R, del (E476, A750) и/или Т790М.
30. Способ по п.27, где мутация KRAS имеет замену G12V или G12C.
31. Способ по п.30, где мутация KRAS имеет замену G12V.
32. Способ по п.27, где больной резистентен или приобрел резистентность к лечению эрлотинибом, гефитинибом, афатинибом, СО-1686, AZD9192 или цетуксимабом.
33. Способ по п.26, где субъект является гомозиготным по фенилаланину в положении 158 в CD16 или гетерозиготным по валину и фенилаланину в положении 158 в CD16.
34. Способ по п.26, включающий введение второго терапевтического агента.
35. Способ по п.34, где второй терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент или средство для таргетной противораковой терапии.
- 117 039356
36. Способ по п.35, где химиотерапевтический агент представляет собой цисплатин или винбластин.
37. Способ по п.35, где химиотерапевтический агент или средство для таргетной противораковой терапии представляет собой ингибитор тирозинкиназы EGFR, с-Met, HER2, HER3, HER4 или VEGFR.
38. Способ по п.37, где ингибитор тирозинкиназы представляет собой эрлотиниб, гефитиниб или афатиниб.
39. Способ по п.34, где второй терапевтический агент вводят одновременно или по отдельности.
40. Способ по п.39, где второй терапевтический агент вводят последовательно.
41. Способ ингибирования роста или пролиферации клеток, экспрессирующих EGFR и/или с-Met, включающий приведение клеток в контакт с биспецифическим антителом по пп.2, 12.
42. Способ ингибирования роста или метастазирования экспрессирующей EGFR и/или c-Met опухоли или раковых клеток у больного, включающий введение больному эффективного количества биспецифического антитела по пп.2, 12.
43. Способ по п.42, где опухоль, эскпрессирующая EGFR и/или c-Met, представляет собой рак эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), легочную аденокарциному, мелкоклеточный рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак простаты, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак глотки, рак носа, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак языка, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, тестикулярный рак, рак желудка, рак тимуса, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак печени, гепатоклеточную карциному (НСС) или спорадическую или наследственную папиллярную почечную карциному (PRCC).
44. Способ по п.43, где экспрессирующая EGFR и/или c-Met опухоль связана с активирующей EGFR мутацией, амплификацией гена EGFR, повышенным уровнем циркулирующего HGF, активирующей c-Met мутацией, амплификацией гена c-Met или мутацией KRAS.
45. Способ по п.44, где активирующая EGFR мутация представляет собой замену G719A, G719X (X представляет собой любую аминокислоту), L861X (X представляет собой любую аминокислоту), L858R, Е746К, L747S, E749Q, А750Р, A755V, V765M, L858P или Т790М, делецию Е746-А750, делецию R748-P753, вставку Ala (А) между М766 и А767, вставку Ser, Val и Ala (SVA) между S768 и V769 и вставку Asn и Ser (NS) между Р772 и Н773.
46. Способ по п.45, где активирующая EGFR мутация представляет собой замену L858R, del (E476, A750) и/или Т790М.
47. Способ по п.44, где мутация KRAS имеет замену G12V или G12C.
48. Способ по п.47, где мутация KRAS имеет замену G12V.
49. Применение биспецифического антитела по любому из пп.1-16 для терапии.
50. Применение биспецифического антитела по любому из пп.1-16 для лечения рака, где рак представляет собой рак эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), легочную аденокарциному, мелкоклеточный рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак простаты, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак глотки, рак носа, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак языка, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, тестикулярный рак, рак желудка, рак тимуса, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак печени, гепатоклеточную карциному (НСС) или спорадическую или наследственную папиллярную почечную карциному (PRCC).
EA201891597A 2013-10-18 2013-11-21 БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ К EGFR/c-Met АНТИТЕЛА EA039356B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361892797P 2013-10-18 2013-10-18

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201891597A2 EA201891597A2 (ru) 2018-12-28
EA201891597A3 EA201891597A3 (ru) 2019-03-29
EA039356B1 true EA039356B1 (ru) 2022-01-18

Family

ID=80685590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891597A EA039356B1 (ru) 2013-10-18 2013-11-21 БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ К EGFR/c-Met АНТИТЕЛА

Country Status (1)

Country Link
EA (1) EA039356B1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030194403A1 (en) * 2001-06-13 2003-10-16 Genmab, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
US20100254989A1 (en) * 2009-04-07 2010-10-07 Birgit Bossenmaier Bispecific Anti ErbB1 / Anti c Met Antibodies
WO2011110642A2 (en) * 2010-03-10 2011-09-15 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030194403A1 (en) * 2001-06-13 2003-10-16 Genmab, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
US20100254989A1 (en) * 2009-04-07 2010-10-07 Birgit Bossenmaier Bispecific Anti ErbB1 / Anti c Met Antibodies
WO2011110642A2 (en) * 2010-03-10 2011-09-15 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAN F. LABRIJIN et al. Species-specific determinants in the IgG CH3 domain enable Fab-Arm exchange by affecting the noncovalent CH3-CH3 interaction strength, The Journal of Immunology, 2011, Vol. 187, p. 3238-3246, p. 3239 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201891597A2 (ru) 2018-12-28
EA201891597A3 (ru) 2019-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7397105B2 (ja) 二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体
JP6841656B2 (ja) Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及びタキサンを使用する癌の治療方法
AU2020267284A1 (en) EGFR and c-Met-fibronectin type III domain binding molecules
US20210395373A1 (en) Bispecific EGFR/C-Met Antibodies
EA039356B1 (ru) БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ К EGFR/c-Met АНТИТЕЛА
CN117716050A (zh) 用于鉴定进行组合治疗的癌症患者的方法