CN1780856A - 白介素15(il－15)的特异性人抗体 - Google Patents

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Abstract

公开了一种分离的人单克隆抗体以及相关的基于抗体的组合物和分子，所述单克隆抗体特异性结合IL－15(例如，人IL－15)。所述人抗体能够产生于转染瘤或非人转基因动物，例如，转基因小鼠中，所述转基因小鼠能够通过V－D－J重组和同种型转换产生人单克隆抗体的多种同种型。还公开了包含所述人抗体的药物组合物、非人转基因动物和产生所述人抗体的杂交瘤，以及利用所述人抗体的治疗和诊断方法。

Description

白介素15(IL-15)的特异性人抗体
相关申请
本申请要求递交于2003年2月26日的美国系列号10/374,932和递交于2003年3月5日的美国系列号10/379,741的优先权，本申请还要求递交于2002年8月23日的美国系列号10/226615和递交于2001年8月23的美国系列号60/314731的权益，将其内容并入本文作为参考。
发明背景
白介素15(IL-15)是一种促炎细胞因子，一种14-15kD的糖蛋白。在多种细胞和组织中曾报道过组成型表达，所述细胞和组织包括单核细胞和巨噬细胞、成纤维细胞、角质细胞和树突细胞(Waldmann和Tagaya，1999；Fehniger和Caligiuri，2001)。如对于用IFN-γ和LPS刺激或用病毒、细菌或原生动物刺激的单核细胞所报道的，所述表达在炎性条件下上调(Kirman等，1998；Waldmann等，1998；Waldmann和Tagaya，1999；Fehniger和Caligiuri，2001)。而且，在慢性炎性疾病如类风湿性关节炎中，局部产生的IL-15可能通过滑膜T细胞的募集和激活放大炎症。已经提出这种IL-15诱导的作用在疾病的发病机制中发挥关键作用(Kirman等，1998；McInnes等，1996；McInnes等，1997；McInnes和Liew，1998；Fehniger和Caligiuri，2001)。
体外研究显示IL-15与IL-2由于共有的受体组分而共有几种生物学活性。在T细胞上存在的IL-15受体包括一种特有的α链，IL-15Rα，但是与IL-2R共有β链和γ链。结果，两种受体都利用相同的Jak/STAT信号传递元件。不过，基于IL-2和IL-15及其受体的复杂调控和不同表达，已经报道了体内功能的显著差异(Kirman等，1998；Waldmannand Tagaya，1999；Waldmann等，2001)。注意IL-15在天然杀伤(NK)细胞、NT-T细胞和上皮内淋巴细胞发育、存活、增殖和功能中必需的作用也是重要的(Kennedy等，2000；Liu等，2000)。
McInnes与合作者(McInnes等人，1997；McInnes and Liew，1998)报道了在源自类风湿性关节炎患者的T细胞中IL-15刺激之后TNF-α生产的诱导。另外，显示IL-15激活的外周血T细胞通过细胞接触依赖性机制诱导显著的巨噬细胞的TNF-α生产。由于TNF-α在类风湿性关节炎中的破坏性作用，这种细胞因子的抑制降低了疾病的活性(Bathon等，2000；Klippel，2000；Lovell等，2000；Maini和Taylor，2000)。
发明概述
本发明是基于特异性结合人IL-15和抑制由IL-15诱导的促炎作用的完全的人单克隆抗体的首次产生和分离，以及这些新抗体的特征和它们的在治疗多种IL-15介导疾病中的治疗价值的证明。例如，如本文所描述的，已经显示人抗体抑制TNFα的产生和T细胞增殖，二者都固有地包括在炎症中。因此，本发明的人抗体提供一种治疗和预防这类病症(和任何其它IL-15介导的病症)的改进方法，部分归因于它们特有的特异性(例如，表位和物种特异性)、亲和力、结构、功能活性和它们是完全是人抗体的事实，这使得当向人类患者施用时它们比以往制备的其它IL-15抗体(例如，鼠和人源化抗体)显著地更少具有免疫原性并且在治疗上更加有效。本发明还基于诸如本文所述抗体的IL-15抑制性抗体的新治疗用途的发现，包括炎性疾病，诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、移植排斥和癌症的治疗。
本发明的分离的人抗体包括多种抗体同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。一般，它们包括IgG1(例如，IgG1k)、IgG3和IgM同种型。所述抗体能够是全长的(例如，IgG1或IgG3抗体)或者能够只包括抗原结合部分(例如，Fab、F(ab′)2、Fv、单链Fv片段、分离的互补决定区(CDR)或两种或多种分离的CDRs的组合)。
在一种实施方案中，所述人抗体是重组人抗体。在一个特定的实施方案中，所述人抗体是由人IgG重链和人κ轻链核酸编码的，所述核酸分别在其可变区包含如在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列，及其保守性序列修饰。在另一个实施方案中，所述人抗体包括IgG重链和κ轻链区，其分别包含在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列，及其保守性序列修饰。
本发明的人抗体能够在宿主细胞中重组产生，如包含编码所述抗体的重链和轻链的核酸的转染瘤(例如，由永生化CHO细胞或淋巴细胞组成的转染瘤)，或者直接从表达所述抗体的杂交瘤(例如，它包括融合到一个永生化细胞的、从转基因非人动物，例如，转基因小鼠中获得的B细胞，所述小鼠具有包含编码所述抗体的人重链转基因和人轻链转基因的基因组)获得。在一个特定的实施方案中，通过本文称作146B7的杂交瘤或通过含有人重链和人轻链核酸的宿主细胞(例如，CHO细胞)转染瘤生产所述抗体，所述人重链和人轻链核酸分别在其可变区包含如在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列，及其保守性修饰。在特定的实施方案中，由本文称作146B7，146H5，404E4和404A8的杂交瘤生产所述抗体。在一个优选的实施方案中，所述抗体特异性结合于位于IL-15的β-和/或γ-链相互作用域上的表位。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体特异性结合于人IL-15并抑制IL-15诱导促炎作用的能力，例如，在IL-15结合于IL-15受体之后，抑制TNFα的产生和/或抑制诸如PBMC或CTLL-2 T细胞的T细胞的增殖。一般，当通过表面等离子共振(SPR)技术在BIACORE 3000仪器中利用重组人IL-15作为分析物而抗体作为配体进行测定时，人抗体以小于大约10-7M，如小于大约10-8M，10-9M或10-10M或甚至更低的解离平衡常数(KD)结合于IL-15。在一个特定的实施方案中，所述抗体以大约6.5×10-8M的解离平衡常数(KD)结合于人IL-15。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合人IL-15的分离的人单克隆抗体，包含选自下列的至少一种CDR序列：
(i)SEQ ID NOs：5，6，7，8，9和10；
(ii)与在(i)中定义的序列具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；和
(iii)在(i)或(ii)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合人IL-15的分离的人单克隆抗体，包含
(i)SEQ ID NO：7；
(ii)与SEQ ID NO：7具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；或
(iii)在(i)或(ii)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合人IL-15的分离的人单克隆抗体，包含
(i)SEQ ID NOs：5和8；
(ii)SEQ ID NOs：6和9；
(iii)SEQ ID NOs：7和10；
(iv)与在(i)、(ii)或(iii)中定义的序列具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；或
(v)在(i)、(ii)、(iii)或(iv)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合人IL-15的分离的人单克隆抗体，包含选自下列的至少四种CDRs
(i)SEQ ID NOs：5，6，7，8，9或10；
(ii)与在(i)中定义的序列具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；和
(iii)在(i)或(ii)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种特异性结合人IL-15的分离的人单克隆抗体，包含
(i)SEQ ID NOs：5，6，7，8，9或10；
(ii)与在(i)中定义的序列具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；或
(iii)在(i)或(ii)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离的特异性结合人IL-15的人单克隆抗体，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：2；或与SEQ IDNO：2具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离的特异性结合人IL-15的人单克隆抗体，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：4；或与SEQ IDNO：4具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离的特异性结合人IL-15的人单克隆抗体，它通过特异性结合位于人IL-15的γ链相互作用域上的表位，经由IL-15Rγ-链抑制顺式信号传递，并且它抑制相邻细胞上的反式信号传递，所述相邻细胞表达γ链或β和γ链作为IL-15R或另一种细胞因子受体的部分。
还在另一个实施方案中，所述分离的人单克隆抗体特异性结合人IL-15并干扰IL-15受体α，β和γ链组装和/或抑制在相邻细胞上的组装，所述相邻细胞表达β和γ链作为IL-15受体或另一种细胞因子受体的部分。
在另一方面，本发明提供编码本发明的抗体或抗原结合部分的核酸分子。因此，包括本发明编码抗体的核酸的重组表达载体，和用这种载体转染的宿主细胞也被本发明所包括，如同通过培养这些宿主细胞制备本发明的抗体的方法一样。
本发明还涉及一种表达载体，它包含编码重链和轻链可变区的核苷酸序列，所述重链和轻链可变区分别包含如在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列，及其保守性修饰。这种表达载体是本领域公知的。关于这点的例子包括利用，例如，网织红细胞裂解物的体外转录/翻译载体。
还在另一个方面，本发明提供来自转基因非人动物，例如，转基因小鼠的分离的B细胞，所述B细胞能够表达多种特异性结合于IL-15的人单克隆抗体的同种型(例如，IgG，IgA和/或IgM)。优选地，所述分离的B细胞从一种转基因非人动物，例如，转基因小鼠中获得，所述小鼠已经用纯化的或富集的IL-15抗原和/或表达IL-15的细胞进行过免疫。优选地，所述转基因非人动物，例如，转基因小鼠，具有一个包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。随后将分离的B细胞进行永生化以提供抗IL-15的人单克隆抗体的来源(例如，杂交瘤)。
因此，本发明还提供一种能够产生特异性结合IL-15的人单克隆抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，所述杂交瘤包括融合到一个永生化细胞的、从转基因非人动物，例如，转基因小鼠中获得的B细胞，所述小鼠具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。所述转基因非人动物能够用纯化的或富集的IL-15抗原的制剂和/或表达IL-15的细胞进行免疫以生成产生抗体的杂交瘤。本发明提供的特定杂交瘤包括146B7，146H5，404E4和404A8。
还在另一个方面，本发明提供一种转基因非人动物，例如，转基因小鼠，它表达特异性结合IL-15的人单克隆抗体抗体。在一个特定的实施方案中，所述转基因非人动物是一种具有一个包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因小鼠。所述转基因非人动物能够用纯化的或富集的IL-15抗原的制剂和/或表达IL-15的细胞进行免疫。优选地，所述转基因非人动物，例如，转基因小鼠，能够通过进行V-D-J重组和同种型转换产生多种抗IL-15的人单克隆抗体同种型(例如，IgG，IgA和/或IgM)。同种型转换可以通过，例如，经典的或非经典的同种型转换发生。
在另一个方面，本发明提供生产与IL-15特异性反应的人单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用纯化的或富集的IL-15抗体的制剂和/或表达IL-15的细胞免疫一种转基因非人动物，例如，转基因小鼠，所述转基因非人动物具有一个包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。随后获得动物的B细胞(例如，脾B细胞)并与骨髓瘤细胞融合以形成永生化的杂交瘤细胞，其分泌抗IL-15的人单克隆抗体。
在另一方面，本发明对人IL-15抗体进行特征描述，所述抗体偶联到治疗性部分上，例如，细胞毒性药物、酶活性毒素或其片段、放射性同位素或小分子抗癌药物。
在另一方面，本发明提供组合物，例如药物或诊断组合物，其包含一种可药用的载体和至少一种特异性结合于IL-15的本发明的人单克隆抗体。所述组合物能够进一步包括其它治疗剂，如其它免疫抑制剂，或化疗剂。
还在另一方面，本发明提供利用一种或多种本发明的人抗体抑制IL-15的促炎作用的方法，如抑制IL-15诱导的TNFα生产和/或T细胞增殖，优选不会抑制结构上相关的蛋白质/细胞因子(例如，IL-2)的活性(例如，TNFα生产和/或T细胞增殖)。
通过向患这类疾病的患者施用所述抗体，能够使用本发明的人抗体治疗和/或预防多种IL-15介导的疾病。
能够利用本发明的方法和组合物治疗(例如，改善)或预防的示范性疾病包括，但不限于，炎性病症，如关节炎(例如，牛皮癣关节炎和包括活动性类风湿关节和幼年类风湿关节的类风湿关节炎)，炎性肠病。例如，已经显示所述抗体减轻角化不全、减小表皮厚度和减少牛皮癣中角质细胞的增殖。还已经显示所述抗体减弱炎症和/或预防涉及类风湿性关节炎的活化白细胞的趋化性。所述抗体还能够用来治疗感染疾病，如HIV感染。另外，所述抗体能够用来治疗移植排斥。因此，本发明的人单克隆抗体可以对于正在进行或曾经进行过器官或组织移植的患者有用，所述器官或组织移植如心、肺、心-肺的联合、气管、肾、肝、胰、食管、肠、皮肤、四肢移植，脐带移植，干细胞移植，胰岛细胞移植等。
因而本发明的抗体可以用于同种异体移植和异种移植排斥的预防或用来逆转、治疗或否则改善急性同种异体移植或异种移植排斥情况。
能够进行治疗的其它疾病包括移植物抗宿主疾病，例如输血移植物抗宿主疾病和骨髓移植物抗宿主。还要进一步地，所述抗体能够用来治疗多种涉及IL-15介导的新血管形成的疾病，如肿瘤生长和癌症，例如T细胞白血病。具有增长的血管生成的其它例子包括炎性疾病，如类风湿性关节炎。
在另外一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防病症的方法，包括给受试者施用治疗或预防所述病症有效量的根据本发明的抗体，所述病症与人IL-15的超量表达相关联，和/或其中人IL-15诱导的作用的下调或抑制是有益的。
在另外一个实施方案中，所述病症选自
关节炎，如强直性脊柱炎、反应性关节炎、骶髂关节炎(sacroileitis)和成人Still’s病；
结缔组织病，如系统性红斑狼疮、盘状狼疮、中枢神经系统狼疮、狼疮肾炎、结节病、CNS结节病和多肌炎/皮肌炎；
眼科病症，如色素层炎和choreoritinitis；
神经系统病症，如脊髓病/热带痉挛性瘫痪、重症肌无力、宫颈癌、横纹肌肉瘤、Ewing肉瘤和多发性硬化症；
胃肠和肝病，如急性重型肝炎、coeliaki、术后肠结肠炎、溃疡性结肠炎和克隆氏病；
变应性病症，如支气管哮喘；
血液系统病症，如T细胞成淋巴母细胞白血病、成人T细胞白血病、Sezary综合征、慢性淋巴细胞白血病、蕈样肉芽肿病、前体B细胞急性成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、慢性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病、大颗粒淋巴细胞增多、大颗粒淋巴细胞白血病、骨髓瘤、浆细胞瘤、浆细胞骨髓瘤、重链疾病(包括γ，μ和α疾病)，结节外天然杀伤细胞/T细胞淋巴瘤和攻击性天然杀伤细胞白血病；
皮肤病症，如过敏性接触性excema、大疱性类天疱疮、烧伤后肥厚性瘢痕和红苔藓；
肺病，如慢性阻塞性肺疾病、成纤维性肺泡炎和急性呼吸窘迫综合征；
恶性肿瘤，如结肠癌和恶性黑素瘤；
源于移植的病症，如同种异体移植和异种移植排斥，以及移植物抗宿主疾病；
内分泌病症，如自身免疫性甲状腺炎和格雷夫斯病；
血管病症，如Wegener肉芽肿病、细微多血管炎、结节性多动脉炎、巨细胞动脉炎和动脉粥样硬化；
妇产科病症，如复发的自发流产和子宫内膜异位症；和
感染性疾病，如败血症和AIDS。
还在另一个实施方案中，所述病症选自强直性脊柱炎，系统性红斑狼疮，溃疡性结肠炎，同种异体移植排斥和移植物抗宿主疾病。
本发明的人抗体还可以与一种或多种其它治疗剂相组合，如抗炎剂、DMARDs(病症改进性抗风湿药物)、免疫抑制剂、化疗剂和牛皮癣剂。
在一个实施方案中，还可以加用一种或多种增强所述抗体促炎作用的抑制的药剂治疗受剂者，所述药剂例如，抗炎剂，如，甾体类药物或NSAID(非甾体类抗炎药物)。优选的药剂包括，例如，阿司匹林和其它水杨酸盐，Cox-2抑制剂，如罗非克西(Vioxx)和塞来克西(Celebrex)，NSAIDs如布洛芬(Motrin，Advil)，苯氧布洛芬(Nalfon)，萘普生(Naprosyn)，舒林酸(Clinoril)，双氯芬酸(Voltaren)，吡罗昔康(Feldene)，酮洛芬(Orudis)，二氟尼柳(Dolobid)，萘丁美酮(Relafen)，依托度酸(Lodine)，奥沙普嗪(Daypro)和吲哚美辛(Indocin)。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体能够与一种或多种DMARDs组合给药，如氨甲喋呤(Rheumatrex)，羟化氯喹(Plaquenil)，柳氮磺胺吡啶(Asulfidine)，嘧啶合成抑制剂，例如来氟米特(Arava)，IL-1受体阻断剂，例如ahakinra(Kineret)，和TNF-α阻断剂，例如etanercept(Enbrel)，英夫单抗(Remicade)和adalimumab。
其它的例子是IL-10、可溶性IL-15R、抗-IL6R抗体、CTLA4Ig和抗CD20抗体。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体能够与一种或多种免疫抑制剂组合给药，如环孢霉素(Sandimmune，Neoral)  和硫唑嘌呤(Imural)。
其它的例子为霉酚酸、霉酚酸莫非替克(mycophenolatemofetil)、皮质类固醇，如强的松、氨甲蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶、抗疟药、brequinar、来氟米特、咪唑立宾、15-去氧精胍素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、免疫抑制剂(FK-506)和抗胸腺细胞球蛋白。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体可以与两种或多种免疫抑制剂组合给药，如强的松和环孢霉素；强的松、环孢霉素和硫唑嘌呤；或强的松、环孢霉素和霉酚酸莫非替克(mycophenolate mofetil)。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体可以与一种或多种化疗剂组合给药，如阿霉素(Adriamycin)，顺铂(Platinol)，博来霉素(Blenoxane)，卡莫司汀(Gliadel)，环磷酰胺(Cytoxan，Procytox，Neosar)，和苯丁酸氮芥(Leukeran)。本发明的人抗体可以结合放疗进行给药。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体可以与一种或多种治疗牛皮癣的药剂组合给药，如包含煤焦油的局部药物，维生素A，可的松或其它皮质类固醇，口服或注射的药物，如皮质类固醇，氨甲蝶呤，维生素A类，例如acicretin(Neogitason)或环孢霉素(Sandimmune，Neoral)。其它治疗可以包括暴露于阳光下或光疗。
其它的实例是蒽环霉素，calcipotrien，tarazotene，etanercept，alefacept，efalizumab，6-硫鸟嘌呤，霉酚酸莫非替克，藤霉素(FK-506)，和羟基脲。其它实例是CTLA4Ig和英夫单抗。其它治疗可以包括UVB(宽波和窄波紫外线B)，UVA(紫外线A)和PUVA(补骨脂素methoxalen加紫外线A)。
在另一个实施方案中，本发明的组合物结合两种或多种以上疗法进行给药，如氨甲蝶呤+光疗(PUVA或UVA)；氨甲蝶呤+阿昔曲丁；阿昔曲丁+光疗(PUVA或UVA)；氨甲蝶呤+阿昔曲丁+光疗(PUVA或UVB；羟基脲+光疗(PUVA或UVB)；羟基脲+阿昔曲丁；环孢霉素+氨甲蝶呤；或calcipotrien+光疗(UVB)。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体能够与其它抗体组合给药，如CD4特异性抗体和IL-2特异性抗体。本发明抗体与CD4特异性抗体或IL-2特异性抗体的组合被认为对于治疗自身免疫疾病和移植排斥特别有用。
在另一个实施方案中，本发明的抗体可以与其它抗体组合给药，例如，其它免疫抑制性人单克隆抗体，如结合于例如，MHC，CD2，CD3，CD7，CD28，B7，CD40，CD45，IFN-γ，TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-5，IL-6R，IL-7，IL-8，IL-10，CD11a，CD20或CD58或其配体的抗体；或其它免疫调节性化合物，例如，可溶性IL-15R或IL-10。
还在另一个实施方案中，本发明提供一种体外或体内检测样品中IL-15抗原的存在的方法，以便例如，诊断IL-15介导的疾病。在一个实施方案中，这通过在允许形成抗体与IL-15之间复合物的条件下，将待试验样品与对照样品一起和本发明的单克隆抗体，或其抗原结合部分相接触来实现。随后在两种样品中检测复合物的形成(例如，利用ELISA)，样品之间复合物形成的任何统计学显著的差异都是试验样品中IL-15抗原存在的指征。
由下列详述和权利要求本发明的其它特征和益处是显而易见的。
附图简述
图1包括了显示人IL-15特异性抗体146B7，147H5，404A8和404E4结合于人IL-15(hIL-15)  和突变IL-15蛋白Q108S和D8SQ108的图。在ELISA中检查抗体的系列稀释物与hIL-15或突变IL-15蛋白D8SQ108S和Q108S的结合。
图2和3分别显示来自抗体146B7的VH和VL区的氨基酸(SEQ IDNOs：2和4)和核苷酸(SEQ ID NOs：1和3)序列。指出构架(FR)和互补决定区(CDR)。
图4A-D包括显示抗体146B7进行的IL-15介导的TNF-α释放的抑制的图。用hIL-15(0，50，100ng/ml)组合146B7抗体或一种同种型对照抗体(0.1，1，10μg/ml)对人PBMC进行孵育72小时。通过ELISA测量产生的TNF-α的量。显示来自两个健康志愿者的数据。
图5是显示抗体146B7对于IL-2或IL-15介导的TNF-α生产的作用的图。用hIL-15(0，50，100ng/ml)  或用hIL-2(100ng/ml)结合以146B7(0.1，1，10μg/ml)对人PBMC进行孵育72小时。通过ELISA测量产生的TNF-α的量。
图6是显示抗体146B7，146H5，404E4和404A8对于hIL-15诱导的CTLL-2增殖的抑制活性的图。用hIL-15(60pg/ml)  结合以146B7，146H5，404E4和404A8的系列稀释物对缺乏hIL-2的CTLL-2细胞进行孵育48小时。测量[3H]-胸苷掺入以表示增殖(cpm)。结果表示为平均值。
图7-9包括显示抗体146B7(图7)，404E4(图8)  和404A8(图9)对于IL-15诱导的PBMC增殖的抑制性活性的图。用hIL-15(0，25，100ng/ml；分别为图7A、8A和9A)或hIL-2(0，10，100ng/ml；分别为图7B，8B，和9B)结合0.1、1、10μg/ml的146B7(图7)、404E4(图8)或404A8(图9)对人PBMC进行孵育72小时。测量[3H]-胸苷掺入以表示增殖(cpm)。
图10是显示抗体146B7结合于IFNγ刺激的单核细胞的图。在IFNγ(500U/ml)存在的情况下培养人PBMCs最多达2天(37℃)。在分析后通过流式细胞分析和对单核细胞的门控测定至少5000细胞/样品的荧光强度。数据显示刺激指数(S.I.＝(平均荧光阳性染色)/(平均荧光背景染色))。
图11显示人单核细胞与抗体146B7(图片B)或与同种型对照抗体(图片A)的结合。在用IFNγ(500U/ml)培养细胞之后分离人PBMCs并制备细胞沉淀物。用苏木精对细胞进行复染。
图12显示人牛皮癣皮肤与146B7(图片B)或与同种型对照抗体(hIgG1)(图片A)的结合。在知情同意之后从患者中获得人银屑斑，并保存于-80℃待分析。用生物素化的抗体对组织进行染色并在辣根过氧化酶激活之后进行显影。
图13A是显示在用146B7或赋形剂处理SCID小鼠之后类风湿性关节炎组织中具核细胞的百分比的图。用苏木精和曙红(H&E)对组织进行染色并用Photo Shop 6.0版进行分析。数据显示为在146B7处理(n＝4)  或赋形剂处理(n＝2)之后小鼠的核的平均数和s.e.m.。图13B和13C显示在用146B7(图13C)或用PBS(图13B)处理之后，在SCID小鼠中异种移植的RA组织的代表性H&E染色。
图14包括显示在SCID/牛皮癣小鼠中抗体146B7治疗效果的图。将活检组织固定于福尔马林中进行石蜡包埋并在H&E中染色并且用于Ki-67核抗原。图14A显示通过表皮评估的牛皮癣的严重性，其是从角质层到皮钉(rete pegs)的开始部分进行测量的。图14B显示从角质层到皮钉的最深部分测量的表皮厚度。图14C显示角化不全的等级。图14D显示上层真皮中炎性单核细胞的数目。图14E显示Ki-67+循环角质细胞的数目。
图15显示在用抗体146B7(图片C)，用CsA(图片B)，或用赋形剂(图片A)处理之后，在SCID小鼠中移植的人牛皮癣皮肤的H&E染色。移植后三周，小鼠每两天以10mg/kg的剂量接受PBS(placebo)，CsA(环孢霉素A)(Sandoz)持续15天，或者在第1天以20mg/kg的剂量和在第8和15天以10mg/kg的剂量接受146B7。最后一次注射后一周，处死小鼠，从每个异种移植物中取4mm的针刺生物活检组织。将活检组织固定于福尔马林中进行石蜡包埋并在H&E中染色。
图16显示在用抗体146B7(图片C)，用CsA(图片B)，或用赋形剂(图片A)处理之后，在SCID小鼠中移植的人牛皮癣皮肤的Ki-67染色。移植后三周，小鼠每两天以10mg/kg的剂量接受PBS(安慰剂)，CsA(环孢霉素A)(Sandoz)持续15天，或者在第1天以20mg/kg的剂量和在第8和15天以10mg/kg的剂量接受146B7。最后一次注射后一周，处死小鼠，从每个异种移植物中取4mm的针刺生物活检组织。将活检组织固定于福尔马林中进行石蜡包埋并在Ki-67中染色。
图17是显示抗体146B7结合于受体结合的IL-15的图。用IL-15Rα涂布平板并用IL-15进行孵育。10分钟后，将生物素化的146B7加到孔中。在ELISA读数器中于405nm评估146B7与受体结合的IL-15的结合。
图18是显示在IL-15结合于Raji细胞上表达的其受体之后，抗体146B7结合于IL-15的图。在表达IL-15R的Raji细胞与IL-15一起孵育之后，10分钟以后向细胞中加入生物素化的146B7。通过FACS分析来评估146B7与受体结合的IL-15的结合。
发明详述
本发明提供了新的基于抗体的疗法，用于治疗和诊断多种由IL-15介导的病症(即，由IL-15的促炎作用所引起的病症)。如本文所用的，术语“IL-15的促炎作用”包括由IL-15诱导的任何体液或细胞介导的免疫反应，如TNFα和其它炎性介质的生产，以及T细胞的募集/增殖。本发明的疗法采用分离的人单克隆抗体，它特异性结合于存在于IL-15上的表位。
在一个实施方案中，在非人转基因动物，例如，转基因小鼠中生产人抗体，所述转基因动物能够通过进行V-D-J重组和同种型转换生产多种抗IL-15的人单克隆抗体的同种型(例如，IgG，IgA和/或IgE)。因此，本发明的各个方面包括抗体及其药物组合物，以及用于生产这种单克隆抗体的非人转基因动物、B细胞、宿主细胞转染瘤和杂交瘤。利用本发明的方法检测结合IL-15，和/或在体外或体内抑制IL-15介导的功能的方法，也为本发明所包括。还包括将试剂靶向结合IL-15的细胞的方法。
为了可以更加容易地理解本发明，首先定义某些术语。其它的定义在整个详述中给出。
本文中术语″IL-15，”“IL-15抗原”和“白介素15”可交换使用，并且包括任何由细胞天然表达的变体或同功型。
如本文所称的术语“抗体”包括完整的抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包括至少两条由二硫键内部连接的重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包括一个重链可变区(这里缩写为VH)和一个重链恒定区。重链恒定区由三个结构域，CH1，CH2和CH3组成。每条轻链由一个轻链可变区(这里缩写为VL)和一个轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域，CL组成。VH和VL区可以被进一步分为称作互补决定区(CDR)的超变区，中间镶嵌更保守的区域，叫做构架区(FR)。每条VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端以下列顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包含一个与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)的结合。
本文所使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保持与抗原(如EGFR)特异性结合能力的抗体的一个或更多片段。已经介绍过抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来完成。在术语抗体的“抗原结合部位”范围内的结合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL，VH，CL和CHI结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含两个由铰链区的二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体一个单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由一个VH结构域组成的dAb片段(Ward et al，(1989)Nature 341：544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由各自的基因编码，它们可以用重组方法通过合成的接头连接，合成接头使它们可以作为单蛋白链产生，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见Bird et al(1988)Science 242：423-426；及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85：5879-5883)。这种单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合部分”范围中。这些抗体片段用本领域技术人员公知的传统技术获得，为使用而进行的片段筛选与完整抗体的方法相同。
本文所使用的术语“单克隆抗体”表示表现出对一种特定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区并表现出单结合特异性的抗体。在一种实施方案中，人单克隆抗体由包含一个从转基因非人动物如转基因小鼠中获得的B细胞与永生化细胞融合产生的杂交瘤产生，转基因小鼠有一个包含一个人类重链转基因和一个人类轻链转基因的基因组。
如本文所用的术语“重组人抗体″意欲包括所有用重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，如(a)从转基因为人免疫球蛋白基因的动物(如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体(在下面的第一部分详述)；(b)从经转化而表达抗体的宿主细胞，如转染瘤分离的抗体，(c)由重组组合人抗体文库分离的抗体，和(d)用其它涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的方法制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人抗体来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而在某些实施方案中，这种重组人抗体经历了体外诱变(或，当使用转基因为人Ig序列的动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体VH和VL区的氨基酸序列来源于人种系VH和VL序列并与其相关，可能在体内并不天然存在于人抗体种系的所有组成成分。
如本文所用的，“异源抗体”是与产生这种抗体的转基因非人生物相联系而定义的。此术语是指这样一种抗体，它具有与存在于不构成转基因非人动物的生物中的氨基酸序列或编码核酸序列相对应，并一般是从转基因非人动物以外的物种获得的氨基酸序列或编码核酸序列。
如本文所用的，“分离的抗体”意在表示基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合IL-15的分离的抗体基本上不含特异性结合除了IL-15以外的抗原的抗体)。不过，特异性结合IL-15表位的分离的抗体可能具有对其它相关细胞因子或其它来自不同物种的IL-15蛋白的交叉反应性。但是，所述抗体优选总是结合人IL-15。此外，分离的抗体一般基本上不含其它细胞材料和/或化合物。在本发明的一种实施方案中，在一种充分定义的组合物中将具有不同IL-15特异性的“分离的”单克隆抗体组合在一起。
如本文所用的，术语“特异性结合”是指抗体与预定的抗原结合。一般，抗体以低于约1×107M-1，如大约低于10-8M，10-9M或10-10M或甚至更低的亲和力(KD)结合，这是通过表面等离子共振(SPR)技术在BIACORE3000仪器中测定，其中使用重组的人IL-15作为分析物，并且将抗体作为配体，并且与预定抗原结合的亲和力至少比与预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(如BSA，酪蛋白)的亲和力大两倍。短语“识别抗原的抗体”和“抗原的特异性抗体”在这里可以与术语“特异性与抗原结合的抗体”互换使用。
如本文所用的，术语“KD″意指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
如本文所用的，“同种型”表示由重链恒定区基因编码的抗体类型(例如，IgM或IgG1)。
如本文所用的，“同种型转换”表示一种抗体的类型或同种型从一种Ig类型转变成另一种Ig类型的现象。
如本文所用的，“非转换同种型”是指在没有发生同种型转换的情况下产生的重链同种型类型；编码非转换同种型的CH基因一般是功能性重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换被分类为经典或非经典同种型转换。经典同种型转换是通过涉及转基因中至少一个转换序列区的重组事件而发生的。非经典同种型转换可以通过例如在人σμ和人∑μ之间的同源重组(伴δ缺失)而发生。其它非经典转换机制，如转基因间和/或染色体间重组及其它机制，可以发生并完成同种型转换。
如本文所用的，术语“转换序列”是指那些负责转换组合的DNA序列。“转换供体”序列，一般是一个μ转换区，将处在转换重组过程中被去除的结构区的5′(上游)。“转换受体”区将在将被去除的结构区和替代恒定区(如γ，ε等)之间。由于不存在重组经常发生的特定位点，从结构一般不能预测最终的基因序列。
如本文所用的，“糖基化模式”被定义为与蛋白，更具体地说是免疫球蛋白共价连接的糖单位模式。当本领域技术人员发现异源抗体的糖基化模式与转基因的CH基因所来源的物种相比，与非人转基因动物物种的糖基化模式更相似时，异源抗体糖基化模式的特征可以在于基本上与非人转基因动物物种产生的抗体的上天然存在的糖基化模式相似。
如本文所用的，应用于一种对象的术语“天然存在的”是指某种对象可以在自然中发现。例如，可以从天然来源中分离并没有通过人在实验室中进行有意的修饰的生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。
如本文所用的术语“重排的”是指一条重链或轻链免疫球蛋白基因座的一种构型，其中的V段在分别编码基本上完整的VH或VL结构域的一种构象中紧邻D-J或J段。重排的免疫球蛋白基因座可以通过与种系DNA比较而识别；重排基因座将有至少一个重组的七聚体/九聚体同源元件。
如本文所用的关于V片段的术语“未重排的”或“种系构型”是指V段未重组因此不与D或J段紧邻的构型。
如本文所用的，术语“核酸分子”意在包括DNA和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
如本文所用的，关于结合IL-15的编码抗体或抗体部分(例如，VH，VL，CDR3)的术语“分离的核酸分子”意指一种核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含其它编码结合除了IL-15以外抗原的抗体或抗体部分的核苷酸序列，所述其它序列可以天然地位于人基因组DNA中核酸的侧翼。SEQ ID NOS：1-4相应于包含本发明的人抗IL-15抗体146B7的重链(VH)和轻链(VL)可变区的核苷酸和氨基酸序列。具体地，SEQ ID NO：1和2相应于146B7抗体的VH，SEQ ID NO：3和4相应于146B7抗体的VL。
本发明还包括SEQ ID NOs：1-4中所示序列的“保守性序列修饰”，即，不显著影响或改变由该核苷酸序列编码或包含该氨基酸序列的抗体结合特性的核苷酸和氨基酸序列修饰。这类保守性序列修饰包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变等将修饰导入SEQ ID NOs：1-4中。保守氨基酸取代包括氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用来自于同一侧链家族的另一种氨基酸残基替代人抗IL-15抗体中的非必须氨基酸残基。
或者，在另一个实施方案中，可以沿着全部或部分的抗IL-15抗体编码序列随机引入突变，如通过饱和突变，并且能够对得到的修饰抗IL-15抗体筛选结合活性。
因此，由本文所公开的(重链和轻链可变区)核苷酸序列编码的抗体和/或含有此处公开的氨基酸序列(即SEQ ID NOs：1-4)的抗体包括基本上由经保守修饰的相似序列编码的，或含有经保守修饰的相似序列的抗体。下文提供了关于如何基于此处公开为SEQ ID Nos：l-4的部分(即重链和轻链可变区)序列产生所述基本相似的抗体的进一步讨论。
对于核酸，术语“基本同源”指两个核酸或其指定序列，当最优比对和比较时，在有适当的核苷酸插入和缺失情况下，至少约80％的核苷酸，通常至少约90到95％，更优选至少约98％到99.5％的核苷酸是相同的。另外，在选择性杂交条件下片段与其互补链进行杂交时也存在基本同源。
对于氨基酸序列来说，术语“同源性”表示当与适当的插入或缺失进行优化比对和比较时，两种氨基酸序列之间同一性的程度。
两个序列间的百分比同一性是一个关于序列间相同位置数量的函数(即同源％＝相同位置数/总位置数×100)，考虑在最优比对两个序列时需要引入的空位数量和每个空位的长度。序列比较和判断两个序列的百分比同一性可以用数学算法来完成，在下面的非限制实施例中描述。
两个核苷酸序列的百分比同一性可以用GCG软件包(在http：//www.gcg.com可以找到)中的GAP程序判断，使用NWSgapdna.CMP矩阵，以及40，50，60，70，或80的空位权重和1，2，3，4，5或6的长度权重。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可以用引入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller算法判断(CABIOS，4：11-17(1989))，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可以用引入GCG软件包(在http：//www.gcg.com可以找到)中GAP程序中的Needleman和Wunsh算法判断(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16，14，12，10，8，6或4的空位权重和1，2，3，4，5或6的长度权重。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“询问序列”来进行对公共数据库的检索，如鉴定相关序列。这种检索可以按Altschul，等在(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中所描述的，用NBLAST和XBLAST程序(2.0版)执行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序执行，分数＝100，字长＝12，从而获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序执行，分数＝50，字长＝3，从而获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为比较目的而获得有空位的比对，有空位的BLAST可以按照Altschul等在(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中的描述来使用。当使用BLAST和有空位的BLAST程序时，可以使用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.
核酸可以在完整细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本纯净形式中存在。当用包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域中公知的标准技术将核酸从其它细胞成分或其它污染物如其它细胞的核酸或蛋白中纯化出来时，核酸就是“分离的”或“表现为基本纯净”。见F.Ausubel，et al. Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
来自cDNA，基因组或混合物的本发明的核酸组合物尽管通常是天然序列(除修饰的限制位点等)，但可以依照标准技术进行突变而提供基因序列。对于编码序列，这些突变可以按照需要影响氨基酸序列。具体而言，本发明考虑了与天然V，D，J，恒定区，转换区和其它类似序列同源或由其衍生的DNA序列(“衍生”表示一个序列与另一个序列相同或由其修饰而来)。
当核酸与另一个核苷酸序列置于功能关系时，就被“可操作性连接”。例如，如果启动子或增强子影响一个编码序列的转录，那么它就被可操作性连接到该序列。对于转录调节序列，可操作性连接表示被连接的DNA序列是邻接的并且对连接读框中的两个邻接的蛋白编码区是必要的。对于转换序列，可操作性连接提示该序列可以影响转换重组。
如本文所用的，术语“载体”意指可以将核酸转运到与其连接序列的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，指可以将额外的DNA片段连接到其中的双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以与病毒基因组连接。某些载体可以在其引入的宿主细胞(如有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)中自主复制。其它载体(如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，与宿主基因组一起复制。此外，某些载体可以指导与其可操作性连接的基因的表达。这种载体在这里被称作“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。总的说来，应用在重组DNA技术中的表达载体通常以质粒形式存在。在本详述中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常使用的载体。然而，本发明意欲包括有相同功能的载体的其它表达形式，如病毒载体(如复制缺陷逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)。
如本文所用的，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意指重组表达载体引入的细胞。必须理解这些术语并不仅指特定受试细胞，也指这些细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中出现某些修饰，这些后代实际上可能不会与母体细胞相同，但仍然包括在这里用到的术语“宿主细胞“的范围内。
如本文所用的，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物能够用于治疗患有炎性疾病，如关节炎，例如，类风湿性关节炎的受试者。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳类和非人哺乳类，如非人灵长类、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。
在下面的各小节中将对本发明的各个方面作更详细的说明。
I.抗IL-15的人抗体的生产
可以利用多种已知技术，如Kohler和Milstein，Nature256：495，(1975)所介绍的标准体细胞杂交技术来生产本发明的人单克隆抗体。尽管体细胞杂交法在理论上是优选的，还可以利用生产单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化，利用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备生产本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的优选动物体系是鼠类体系。在小鼠中杂交瘤生产是本领域公知的，包括免疫方案和分离并融合免疫化脾细胞的技术。
在一种实施方案中，抗IL-15的人单克隆抗体可以用携带所述人免疫系统的部分而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。在一种实施方案中，本发明采用在本文中称为“HuMAb”小鼠的转基因小鼠，它含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座，以及灭活内源性γ和κ链基因座的靶突变(Lonberg，N.Et al.(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，此小鼠显示小鼠IgM或κ的表达减少，并且由于免疫应答，引入的人重链和轻链转基因经历了类型转换和体细胞突变而产生高亲和力人IgGk单克隆抗体(Lonberg，N et al.(1994)，supra；综述于Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F.And Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Aci764：536-546)。HuMAb小鼠的制备在下面的第II部分和以下文献中有详细描述，Taylor，L.Et al.(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J，et al.(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen J.et al.(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg et al.，(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.9(1994)Handbook of Experience Pharmacology113：49-101；Taylor，L.Et al.(1994)International Immunology 6；579-591；Lonberg，N.And Hszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546；Fishwild，D.Et al.(1996)Nature Biotechnology14：845-851，在此完整引入其全部内容作为参考。还可进一步参考都属于Lonberg and kay，and GenPharm International的美国专利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；属于Surani et al.的美国专利No.5,545,807；公开于1998年6月11日的国际公开WO98/24884；公开于1994年11月10日的WO94/25585；公开于1993年6月24日的WO93/1227；公开于1992年12月23日的WO92/22645；公开于1992年3月19日的WO92/03918，在此完整引入其公开内容作为参考。另外，具体地，HCO12转基因HuMAb小鼠的制备在实施例2中进行描述。
免疫
为了制备IL-15的完全的人单克隆抗体，可以通过例如Lonberg等，(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14：845-851和WO94/24884所述的方法用纯化或富集的IL-15抗原制剂和/或表达IL-15的细胞对包含人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)进行免疫。或者，可以用编码人IL-15的DNA免疫小鼠。优选地，在第一次输注时，所述小鼠为6-16周龄。例如，可以通过腹膜内注射方式用IL-15抗原的纯化或富集的制剂(5-50μg)对HuMab小鼠进行免疫。在用IL-15抗原的纯化或富集的制剂进行免疫不产生抗体时，还可以用表达IL-15的细胞，例如，一种细胞系来免疫小鼠以促进免疫应答。
用各种抗原积累的经验业已显示，当用存在于完全弗氏佐剂中的抗原通过腹膜内(IP)或皮下(SC)进行起始免疫，然后每隔一周用存在于不完全弗氏佐剂中的抗原进行IP/SC免疫(一共多达10次)时，所述HuMAb转基因小鼠应答最强。在免疫方案过程中，可以通过眼眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。可以通过ELISA对所述血浆进行筛选(如下所述的)，并且可以将具有足够滴度的抗IL-15人免疫球蛋白的小鼠用于融合。在处死并取出脾脏之前3天，可以通过静脉内注射抗原对所述小鼠进行加强免疫。
制备产生抗IL-15的入单克隆抗体的杂交瘤
为了制备生产抗IL-15的人单克隆抗体的杂交瘤，可以从免疫小鼠中分离脾细胞和淋巴结细胞并且与合适的永生化细胞系，如小鼠骨髓瘤细胞系相融合。随后可以对得到的杂交瘤筛选抗原特异性抗体的生产。例如，通过50％的PEG(w/v)使来自免疫过的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与SP2/0-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。以大约1×105每孔的密度将细胞铺在平底微量滴定板上，然后在选择培养基中孵育2周，该培养基在通常使用的试剂之外含有10％胎克隆血清，5-10％origen杂交瘤克隆因子(IGEN)和1×HAT(Sigma)。大约2周之后在HAT被HT取代的培养基中培养细胞。然后通过ELISA对各个孔筛选人抗IL-15单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生了广泛的杂交瘤的生长，通常可以在10-14天之后对培养基进行观察。可以将抗体分泌杂交瘤重新铺平板，再次筛选，并且如果仍然对于人IgG呈阳性的话，可以通过限制稀释将抗IL-15单克隆抗体亚克隆至少2次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以便在组织培养基中制备抗体用于鉴定。
生产抗IL-15的人单克隆抗体的转染瘤的制备
利用，例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，还可以在宿主细胞转染瘤中生产本发明的人抗体(Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，在一个实施方案中，可以将目的基因，例如，人抗体基因连接入一种表达载体中，如在WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338841中公开的GS基因表达系统或其它本领域公知的表达系统所用的真核表达质粒。可以将纯化的具有克隆的抗体基因的质粒导入真核宿主细胞如CHO细胞或NSO细胞或其它真核细胞像源于植物的细胞、真菌或酵母的细胞中。用于导入这些基因的方法可以是本领域所公开的方法，如电穿孔、脂转染、脂转染胺或其它的方法。将这些抗体基因导入宿主细胞中后，可以鉴定并筛选表达该抗体的细胞。这些细胞代表转染瘤，其可以随后进行扩增以增加它们的表达水平并进行提高以生产抗体。可以从这些培养物上清液和/或细胞分离并纯化重组抗体。
选择性地，可以将这些克隆的抗体基因表达于其它表达系统中，如大肠杆菌，或表达于完整的生物中，或能够进行合成性表达。
利用部分抗体序列表达完整抗体
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDRs)的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，CDRs中的氨基酸序列在各个抗体之间比在CDRs外的序列更多样。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，可以通过构建包含来自于嫁接至来自于具有不同特性的不同抗体的构架序列上的特异性天然抗体的CDR序列的表达载体而表达模拟特异性天然抗体的特性的重组抗体(见，例如，Riechmann，L.et al.，1998，Nature 332：323-327；Jones，P.et al.，1986，Nature321：522-525；和Queen，C.et al.，1989，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033)。可以从包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得所述构架序列。这些种系序列与成熟抗体基因序列不同，因为它们不包括完全组装的可变区基因，所述基因是通过B细胞成熟过程中的V(D)J连接而形成的。种系基因序列也将不同于各个平均跨可变区的高亲和力第二全部组成成分抗体的序列。例如，体突变在构架区的氨基末端部分相对不常见。例如，体突变在构架区1的氨基末端部分和构架区4的羧基末端部分相对不常见。此外，许多体突变不显著改变抗体的结合特性。因此，为了重建具有相似于原始抗体的结合特性的完整重组抗体，并不必须获得特定抗体的完整DNA序列(见1999年3月12日提交的PCT/US99/05535，在此引入作为参考)。跨CDR区的部分重链和轻链序列一般足够用于此目的。用部分序列确定哪一种种系可变区和连接基因片段贡献于重组抗体可变区基因。然后用种系序列填充可变区的缺少部分。重链和轻链前导序列在蛋白成熟中切割，并且不贡献于最终抗体的特性。为此，必须使用相应的种系前导序列而表达构建体。为了加入缺少的序列，可以通过连接或PCR扩增将克隆的cDNA序列与合成的寡核苷酸结合。或者，可以将完整的可变区合成为一组短的、重叠的寡核苷酸并且通过PCR扩增结合，以产生完整的合成可变区克隆。这一过程具有某些优点，如去除或引入特定的限制位点，或优化特定的密码子。
用来自于杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列设计一组重叠的合成寡核苷酸，以产生与天然序列具有相同氨基酸编码能力的合成V序列。合成重链和κ链可以以三种方式不同于天然序列：打断重复核苷酸碱基串以促进寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak规则掺入最优翻译起始位点(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266L19867019870)，以及将HindIII位点工程化至翻译起始位点上游。
对于重链和轻链可变区，最优化的编码链和相应的非编码链序列在相应非编码寡核苷酸大约中点分解为大约30-50个核苷酸。因此，对于每条链，寡核苷酸可以组装为跨150-400个核苷酸的片段的重叠双链组。然后用合并物作为模板来产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。一般地，单可变区寡核苷酸组将分解为两个合并物，它们可以分别扩增以产生两个重叠的PCV产物。然后通过PCT扩增结合重叠产物，以形成完整的可变区。也可能需要在PCR扩增中引入重链或轻链恒定区的重叠片段(包括κ轻链的BbsI位点或γ重链的AgeI位点)，从而产生可以容易克隆至表达载体构建体中的片段。
然后将重新构建的重链和轻链可变区与克隆的启动子、翻译起始位点、恒定区、3’非翻译区、聚腺苷酸化位点和转录终止位点序列结合，以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可以结合至共转染、系列转染、或分开转染至宿主细胞中的单一载体中，所述宿主细胞然后融合形成表达两条链的宿主细胞。
用于构建表达载体以表达人IgGκ的质粒描述如下(实施例1)。构建质粒以使得PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列能用于重新构建完整的重链和轻链小基因。这些质粒能用作完整地表达人或嵌合IgG1κ或IgG4κ抗体。本发明的完全的人和嵌合抗体还包括IgG2，IgG3，IgE，IgA，IgM和IgD抗体。构建相似的质粒用于表达其它重链同种型，或用于表达含有λ轻链的抗体。
因而，在发明的另一方面，将本发明的人抗IL-15抗体146B7、147H5、404A8和404E4的结构特征用于产生结构相关的人抗IL-15抗体，它至少保留本发明抗体的一种功能特征，如结合IL-15。更具体地，可以将146B7、147H5、404A8和404E4的一种或多种CDR区与已知的人构架区和CDRs重组结合以产生本发明的其它的、重组工程化的人抗IL-15抗体。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种制备抗IL-15抗体的方法，包括：
制备一种抗体，其包含(1)人重链构架区和人重链CDRs，其中至少一种人重链CDRs包含选自图2中所示的CDRs氨基酸序列的氨基酸序列(或对应SEQ ID NO：2中的氨基酸残基)；和(2)人轻链构架区和人轻链CDRs，其中至少一种人轻链CDRs包含选自图3中所示的CDRs氨基酸序列的氨基酸序列(或对应SEQ ID NO：4中的氨基酸残基)；
其中该抗体保留结合IL-15的能力。
利用标准的结合测试，如在实施例中给出的那些(例如，ELISA分析)来测定抗体结合IL-15的能力。
由于在本领域中众所周知抗体重链和轻链CDR3区在抗体对抗原的结合特异性/亲和力中发挥着特别重要的作用，所以如上所示制备的本发明的重组抗体优选包含146B7、147H5、404A8和404E4的重链和轻链CDR3s。另外该抗体可以包含146B7、147H5、404A8和404E4的CDR2s。另外该抗体可以包含146B7、147H5、404A8和404E4的CDR1s。该抗体可以进一步包含CDRs的任何组合。
因此，在另一种实施方案中，本发明进一步提供抗IL-15抗体，包含：(1)人重链构架区、人重链CDR1区、人重链CDR2区和人重链CDR3区，其中人重链CDR3区选自146B7、147H5、404A8和404E4的CDR3s，例如，如图2中所示的146B7的人重链CDR区(或对应于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基)；(2)人轻链构架区、人轻链CDR1区、人轻链CDR2区和人轻链CDR3区，其中人轻链CDR3区选自146B7、147H5、404A8和404E4的CDR3s，例如，如图3中所示的146B7的人轻链CDR区(或对应于SEQ ID NO：4中的氨基酸残基)，其中该抗体结合IL-15。该抗体可以进一步包含146B7、147H5、404A8和404E4的重链CDR2和/或轻链CDR2。该抗体可以进一步包含146B7、147H5、404A8和404E4的重链CDR1和/或轻链CDR1。
上述工程化的抗体的CDR1、2和/或3可以包含本文公开的146B7、147H5、404A8和404E4的那些确切氨基酸序列。不过，普通技术人员会理解从146B7、147H5、404A8和404E4的CDR确切氨基酸序列而来的一些偏差是可能的，同时仍然保留有效结合IL-15的抗体的能力(例如，保守性序列修饰)。因此，在另一个实施方案中，工程化的抗体可以由与一种或多种146B7、147H5、404A8和404E4的CDRs具有例如90％、95％、98％或99.5％同一性的一种或多种CDRs组成。
除了简单地结合IL-15之外，可以对工程化的抗体，如上述的抗体保有本发明的抗体的其它功能特性进行选择，如
(1)结合人IL-15和抑制IL-15诱导的促炎作用；
(2)抑制IL-15诱导的TNFα生产或T细胞增殖；
(3)当通过表面等离子共振(SPR)技术在BIACORE 3000仪器中利用重组人IL-15作为分析物而抗体作为配体进行测定时，以小于大约10-7M的解离平衡常数(KD)结合人IL-15；
(4)结合位于人IL-15的β和/或γ链相互作用结构域上的表位；
(5)干扰人IL-15的Asp8结合人IL-15受体的β亚基和/或人IL-15的Gln108结合人IL-15受体的γ亚基；
(6)结合受体结合的人IL-15；
(7)结合人IL-15并抑制人IL-15诱导角化不全的能力；
(8)结合人IL-15并抑制人IL-15诱导表皮增厚的能力；
(9)结合人IL-15并抑制人IL-15诱导角质细胞增殖的能力；和/或
(10)结合人IL-15并抑制人IL-15诱导激活的白细胞趋化性的能力。
抗IL-15的人单克隆抗体的鉴定
可以利用多种已知的技术鉴定本发明的人单克隆抗体与IL-15的结合。一般，最初通过ELISA对抗体进行鉴定。简言之，可以用PBS中的纯化的IL-15涂布微量滴定板，随后用不相关的蛋白质如稀释于PBS中的牛血清白蛋白(BSA)进行封闭。将来自IL-15免疫的小鼠血浆的稀释物加到每个孔中并于37℃孵育1-2小时。用PBS/Tween20洗涤板并且随后用偶联到碱性磷酸酶上的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂于37℃孵育1小时。洗涤后，用ABTS底物将板进行显影，并于OD405进行分析。优选地，产生最高滴度的小鼠将被用于融合。
可以利用上述的ELISA分析筛选抗体，并且因而，筛选产生显示与IL-15免疫原阳性反应性的抗体的杂交瘤。随后可以对优选以高亲和力结合IL-15的抗体进行亚克隆并进一步进行鉴定。随后可以选择保持亲本细胞的反应性(通过ELISA)的来自每个杂交瘤的一个克隆，用于制成细胞文库，并用于抗体纯化。
为了纯化人抗IL-15抗体，可以将选择的杂交瘤生长于滚瓶、两升的旋转烧瓶或其它培养系统中。在用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析以纯化蛋白质之前，可以对上清液进行过滤并浓缩。将缓冲液换成PBS之后，可以通过OD280使用1.43的消光系数或优选通过浊度分析测定浓度。可以通过凝胶电泳和通过抗原特异性方法检查IgG。
为了确定所选择的人抗IL-15单克隆抗体是否结合独特的表位，可以使用市场上现有的试剂(Pierce，Rockford，IL)对每种抗体进行生物素化。生物素化的MAb结合可以用链霉抗生物素标记的探针进行检测。为了测定纯化抗体的同种型，可以进行本领域公知的技术进行同种型ELISAs。例如，可以用10□g/ml的抗人Ig涂布微量滴定板的孔于4℃过夜。在用5％BSA封闭之后，用10□g/ml的单克隆抗体或纯化的同种型对照于环境温度下对板进行反应2小时。随后可以将孔与人IgGl或其它的人同种型特异性偶联的探针反应。如上所述对板进行显影和分析。
为了检测单克隆抗体结合表达IL-15的活体细胞，可以使用流式细胞术。简言之，将细胞系和/或表达膜结合的IL-15的PBMCs(在标记生长条件下生长)与各种浓度的单克隆抗体于4℃混合1小时，所述抗体在包含0.1％BSA和0.01％NaN3的PBS中。洗涤后，将细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体在与一抗染色相同的条件下进行反应。能够通过利用光和侧向散射特性以门控单个细胞的FACScan仪器对样品进行分析并且测定标记抗体的结合。除了流式细胞术之外(或代替流式细胞术)，还可以利用一种使用荧光显微镜的可供选择的测试法。可以完全与上述一样对细胞进行染色并通过荧光显微镜进行检查。这种方法能够观察到单个细胞，但可能根据抗原的密度具有减小的敏感性。
通过蛋白质印迹能够进一步测试抗IL-15人IgG与IL-15抗原的反应性。简言之，可以制备来自表达IL-15的细胞的细胞提取物并进行SDS-PAGE电泳。电泳后，分离的抗原将被转移到硝酸纤维素膜上进行检测，所述硝酸纤维素膜用20％的小鼠血清进行封闭，并用单克隆抗体作为探针。人IgG结合利用抗人IgG碱性磷酸酶进行检测并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)进行显影。
II.产生制备人单克隆抗IL-15抗体的转基因和转染色体非人动物
仍在另一个方面，本发明提供了诸如转基因或转染色体小鼠的转基因和转染色体非人动物，它能够表达特异性结合IL-15的人单克隆抗体。在一种特定的实施方案中，本发明提供一种具有包含人重链转基因的基因组的转基因或转染色体小鼠，从而当用IL-15抗原和/或表达IL-15的细胞进行免疫时该小鼠产生人抗IL-15抗体。人重链转基因可以整合入小鼠的染色体DNA中，如转基因的，例如本文详细描述和示例的HuMab小鼠的情况一样。或者，人重链转基因可以保持于染色体外，如WO02/43478中所述的转染色体(例如，KM)小鼠的情况一样。这类转基因和转染色体动物能够通过进行V-D-J重组和同种型转换产生抗IL-15的人单克隆抗体的多种同种型(例如IgG、IgA和/或IgE)。同种型转换可以通过，例如传统的或非传统的同种型转换发生。
设计以异源抗体所有组成成分并应答外来抗原刺激的转基因非人动物要求包含在转基因动物中的异源免疫球蛋白转基因在B细胞发育途径中正确行使功能。在一种优选实施方案中，异源重链转基因的正确功能包括同种型转换。因此，本发明的转基因是为产生同种型转换和下列内容的一项或多项而建立的：(1)高水平和细胞类型特异性表达，(2)功能基因重排，(3)激活并应答等位基因排斥，(4)表达足够的初级组成成分，(5)信号转导，(6)体细胞超变，和(7)免疫应答中转基因抗体基因座的显性化。
并不是前面的标准都需要满足。例如，在那些转基因动物的内源性免疫球蛋白基因座被功能性破坏的实施方案中，转基因不需要激活等位基因排斥。此外，在转基因包含一个功能性重排的重链和/或轻链免疫球蛋白基因的实施方案中，不需要第二条标准的功能基因重排，至少对于已经重排的转基因时如此。分子免疫学的背景知识可以参考fundamental Immunology，2nd edition(1989)，Paul William E.，ed.Raven press，N.Y.，在此引入作为参考。
在某些实施方案中，用于产生本发明的人单克隆抗体的转基因非人动物包含重排、未重排或重排和未重排组合的转基因动物种系中的异源免疫球蛋白重链和轻链转基因。每个重链转基因包含至少一个CH基因。另外，重链转基因可包含能够支持编码转基因动物B细胞中的多个CH基因的异源性转基因的同种型转换功能的同种型转换序列。这些转换序列可以在作为转基因CH基因来源的物种的种系免疫球蛋白基因座中天然存在，或者这些转换序列可以从得到转基因构建体的物种(转基因动物)中的序列衍生而来。例如，如果掺入与小鼠重链基因座中天然存在的序列相同的转换序列，用来产生转基因小鼠的人转基因构建体可以产生更高频率的同种型转换事件，正如假设的那样，小鼠转换序列经优化而与小鼠转换重组酶系统作用，而人转换序列则不是。转换序列可以用传统克隆方法分离和克隆，或可以按照已发表的免疫球蛋白转换区序列相关序列信息从重叠合成寡核苷从头合成(Mills et al.，Nucl.Acids Res.15；7305-7316(1991)；Sideras et al.，Intl.Immunol.1：631-642(1989)，在此引入作为参考)。对于前面的每种转基因动物，可以在转基因动物很大比例的B细胞(至少10％)中发现功能性重排的异源性重链和轻链免疫球蛋白转基因。
用于产生本发明的转基因动物的转基因包括一个含有编码至少一个可变基因片段、一个多样性基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA的重链转基因。免疫球蛋白轻链转基因含有编码至少一个可变基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。编码轻链和重链基因片段的基因片段与衍生它们的转基因非人动物是异源性的，或者说它们与不包括转基因非人动物的物种中编码免疫球蛋白重链和轻链基因片段的DNA相对应。在本发明一个方面，转基因经构建使各个基因片段未重排，或不重排，以便编码一个功能性免疫球蛋白轻链或重链。这种未重排的转基因支持在暴露于IL-15抗原时V，D和J基因片段(功能性重排)重组并优选支持D区基因片段的全部或部分掺入转基因非人动物中得到的未重排免疫球蛋白重链。
在另一种实施方案中，转基因包含一个未重排“微基因座”。这样的转基因一般包含C，D和J片段的基本部分和V基因片段的亚型。在这种转基因构建体中，不同的调节序列，如启动子、增强子、类型转换区、RNA加工的剪接供体和剪接受体、重组信号等，包含从异源性DNA衍生的相应序列。这些调节序列可以从掺入与本发明使用的非人动物相同或相关物种得到的转基因。例如，人免疫球蛋白基因片段可以在转基因中与啮齿类动物免疫球蛋白增强子序列结合用于转基因小鼠。另外，合成的调节序列可以掺入转基因，其中这种合成调节序列与已知的哺乳动物基因组中天然存在的功能性DNA序列不同源。合成调节序列是根据共有序列规则而设计的，例如那些指定剪接受体位点或启动子/增强子基序的允许序列的规则。例如，包含与天然存在的种系Ig基因座相比，具有非必需DNA部分(如间插序列；内含子或其部分)的至少一个内部(即不在该部分的末端)缺失的基因组免疫球蛋白基因座的一部分的微基因座。
在本发明的一种优选实施方案中，用于产生人IL-15抗体的包含至少一个，一般2-10个，有时25-50或更多拷贝的WO98/24884实施例12所描述的转基因(如pHC1或pHC2)的转基因或转染色体动物与含有WO98/24884实施例5，6，8或14所描述轻链转基因的一个拷贝的转基因动物杂交，其后代与WO98/24884实施例10所描述的JH缺失动物杂交，在此特意引入其内容作为参考。对于这三种性状的每一种，动物都杂交到纯合型。这些动物有如下基因型：单拷贝(每单套染色体)的人重链未重排微基因座(在WO98/24884实施例12中有描述)，单拷贝(每单套染色体)的重排人K轻链构建体(在WO98/24884实施例14中有描述)，以及在每个内源性小鼠重链基因座去掉所有功能性JH片段的一个缺失(在WO98/24884实施例10中有描述)。这种动物与对于JH片段缺失为纯合型的小鼠(WO98/24884实施例10)杂交，产生对JH缺失为杂合子(WO98/24884实施例10)且对人重链和轻链构建体为半合子的后代。给得到的动物注射抗原并用来产生抗这些抗原的人单克隆抗体。
从这种动物分离的B细胞对于人重链和轻链是单特异性的，因为它们只包含每个基因的一个拷贝。此外，它们对于人或小鼠重链将是单特异性的，因为内源性小鼠重链基因拷贝由于WO98/24884实施例9和12介绍的跨JH缺失而都是非功能性的。此外，B细胞的绝大部分对于人或鼠轻链是单特异性的，因为单拷贝重排人κ轻链基因的表达将在绝大部分B细胞中等位和同种型排斥内源性小鼠κ和λ链基因的重排。
用于本发明的转基因和转染色体小鼠呈现出免疫球蛋白产物的大部分组成成分，理想的是基本上类似于天然小鼠。这样，例如在内源性Ig基因被灭活的实施方案中，总免疫球蛋白水平将为约0.1到10mg/ml血清，优选0.5到5mg/ml，理想地至少为1.0mg/ml左右。当一个可以实现将IgM转换到IgG的转基因被引入转基因小鼠时，成年小鼠血清IgG与IgM的比例优选为约10∶1。IgG与IgM的比例在未成熟小鼠中将低得多。总的说来，大于约10％，优选40-80％的脾和淋巴结B细胞专门表达人IgG蛋白。
理想的是所述组成成分接近天然小鼠，通常至少占它的大约10％，优选25-50％或更多。一般，会产生至少大约1000个不同的免疫球蛋白(理想为IgG)，优选104-106或更多，这主要取决于导入小鼠基因组中的V、J和D区的数量。这些免疫球蛋白通常识别大约1/2或更多的高抗原性蛋白，例如，葡萄球菌蛋白。通常，所述免疫球蛋白对预先选定的抗原呈现低于10-7M的亲和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低。
在一些实施方案中，可能优选产生有预定所有组成成分的小鼠来限制在对存在于预定抗原类型的抗体应答中的V基因选择。有预定所有组成成分的重链转基因可以包含例如在人预定抗原类型的抗体应答中优选使用的人VH基因。另外，一些VH可能由于各种原因从定义的所有组成成分中被排除(如，不太可能编码对预定抗原的高亲和力V区；进行体细胞突变和亲和力锐减(affinity sharpening)的倾向性小；或对特定人群是免疫原性的)。这样，在包含各种重链或轻链基因片段的转基因重排之前，这些基因片段可以通过如杂交或DNA测序被轻易识别为是从转基因动物以外的生物物种中得到。
本发明的转基因和转染色体小鼠可以按前面所描述的用IL-15抗原的富集或纯化制剂和/或表达IL-15的细胞免疫。此小鼠将产生通过转基因内转换重组(顺式转换)进行类型转换并表达与IL-15反应的免疫球蛋白的B细胞。这些免疫球蛋白可以是人抗体(也称作人序列抗体)，其中重链和轻链多肽由可能包括体来源于细胞突变和V区重组连接的序列和种系编码序列的人转基因序列编码；尽管由于体细胞突变和不同V-J和V-D-J重组结合可能出现其它非种系序列，这些人序列免疫球蛋白可以称作与由人VL或VH基因片段和人JL或JH片段编码的多肽序列基本等同。对于这样的人序列抗体，每条链的可变区一般至少80％由人种系V，L，在重链中为D基因片段编码；通常至少85％的可变区由转基因中存在的人种系序列编码；经常90％或95％或更多的可变区由转基因中存在的人种系序列编码。然而，由于非种系序列由体细胞突变和VJ和VDJ连接而引入，人序列抗体将经常有一些不像在小鼠种系中的人转基因那样由人V，D，或J基因片段编码的可变区序列(恒定区序列少一些)。典型说来，这些非种系序列(或各个核苷酸位点)将在CDR或其附近，或在已知体细胞突变簇集的区域簇集。
能结合预定抗原的人抗体可以由同种型转换产生，以便产生包含人序列γ链(如γ1、γ2a、γ2B或γ3)和人序列轻链(如κ)的人抗体。所述同种型转换的人抗体通常包含一个或多个体细胞突变，一般通常存在于可变区中，并且通常在CDR中或大约10个残基内，作为亲和力成熟，和通过抗原，特别是在进行第二次(或随后)抗原刺激之后进行B细胞筛选的结果。这些高亲和力人抗体可以具有低于10-7M的结合亲和力(KD)，如低于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低。
本发明的另一方面包括源于本文所述的转基因或转染色体小鼠的B细胞。所述B细胞可用于制备表达以高亲和力(例如，低于10-7M)结合人IL-15的人单克隆抗体的杂交瘤。因此，在另一种实施方案中，本发明提供一种杂交瘤，当通过表面等离子共振(SPR)技术在BIACORE 3000仪器中利用重组人IL-15作为分析物而抗体作为配体进行测定时它产生具有低于10-7M的亲和力(KD)的人抗体，如低于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低，其中所述抗体包含：
一种人序列轻链，所述轻链由(1)具有与由人VL基因片段和人JL片段所编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的轻链可变区，和(2)具有与由人CL基因片段所编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的轻链恒定区组成；和
一种人序列重链，所述重链由(1)具有与由人VH基因片段、任选D区和人JH片段所编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的重链可变区，和(2)具有与由人CH基因片段编码的多肽序列基本上相同的多肽序列的恒定区组成。
对IL-15高亲和力的人单克隆抗体的产生可以用一种在具有一个包含整合人免疫球蛋白转基因的基因组的转基因小鼠中扩增人可变区基因片段所有所有组成成分的方法来促进，上述方法包括将一个包含在上述整合人免疫球蛋白转基因中不存在的V区基因片段的V基因转基因引入基因组。通常，V区转基因是一个包含人VH或VL(VK)基因片段阵列的一部分的酵母人工染色体，可能在人基因组中天然存在或可能用重组方法分别剪接在一起，可能包括无序或省略V基因片段。通常YAC包括至少5个或更多功能性V基因片段。在这种变异中，可以产生用V所有组成成分扩增方法产生的转基因小鼠，其中此小鼠表达包含一个由在V区转基因存在的V区基因片段编码的可变区序列和在人Ig转基因上编码的C区的免疫球蛋白链。通过V所有组成成分扩增方法，可以产生至少有5个不同V转基因小鼠；可以产生包含至少24个或更多V基因的小鼠。一些V基因片段可以是非功能性的(如伪基因等)；这些片段可以保留或如果需要，可以由熟练的技术人员用重组方法去除。
当小鼠种系被工程化为含有一个具有扩增V片段所有组成成分，基本上在包含J和C基因片段的人Ig转基因中不存在的功能性YAC时，这种性状可以被增殖并杂交到其它遗传背景，包括有一个扩增的V片段所有组成成分的功能性YAC杂交到有不同人Ig转基因的小鼠种系所在的背景。有一个扩增V片段所有组成成分的多功能性YAC可以杂交到一个种系而与一种人Ig转基因(或多种人Ig转基因)一起作用。尽管这里称作YAC转基因，这些转基因在整合到基因组时可能基本缺乏酵母序列，如酵母中自主复制必需的序列；这些序列可以在酵母中复制后而不再必要时(即在引入小鼠ES细胞或小鼠受精卵前)由基因工程选择性地去除(如限制性消化和脉冲电场凝胶电泳或其它适当方法)。增殖人序列免疫球蛋白表达特性的方法，包括杂交具有人Ig转基因，也可任选具有含有扩增V片段所有组成成分的功能性YAC的转基因小鼠。VH和VL基因片段都可在YAC上存在。转基因小鼠可以杂交到实施者希望的任何背景，包括携带其它人转基因，包括人Ig转基因和/或编码其它人淋巴细胞蛋白的转基因的背景。本发明也提供了由具有扩增的V区所有组成成分的YAC转基因的转基因小鼠产生的高亲和力人序列免疫球蛋白。尽管前面描述了本发明转基因动物的优选实施方案，但本发明也考虑了其它实施方案，可以分为4类：
I.包含一个未重排重链和重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；
II.包含一个未重排重链和未重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；
III.包含一个重排重链和未重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；
IV.包含一个重排重链和重排轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；
在这些转基因动物分类中，优选的优先顺序为II＞I＞III＞IV，其中内源性轻链基因(或至少K基因)通过同源重组(或其它方法)被剔除，以及I＞II＞III＞IV，其中内源性轻链基因没有被剔除并且必需由等位排斥显性化。
III.抗体偶联物/免疫毒素
在另一方面，本发明描述了与诸如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性同位素的治疗成分偶联的人抗IL-15单克隆抗体。
当与细胞毒素偶联时，这些偶联抗体就叫做“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒试剂包括任何对细胞有害(如杀灭细胞)的试剂，其例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩葡糖苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、北豆根碱、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢表雄酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗试剂包括，但不局限于抗代谢物(如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟鸟嘧啶)，烷化剂(如二氯甲基二乙胺、thioepachlorambucil、美法伦、亚硝基脲氮芥(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)((DDP)顺铂)、anthracycline(如道诺红霉素(以前称作道诺霉素)和亚德里亚霉素)，抗生素(如放线菌素(以前称作放射霉素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱、长春花碱)。本发明的抗体可以与放射性同位素如放射性碘偶联，产生治疗IL-15相关病症的细胞毒放射性药物。
本发明的抗体偶联物可以用来修饰某种生物反应。治疗部分并不限于经典化疗剂的范围。例如，药物部分可以是一种具有所需要生物活性的蛋白或多肽。这种蛋白可以包含如酶活性毒素或其活性片段，如红豆因、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌素、或白喉毒素；蛋白如肿瘤坏死因子或γ干扰素；或生物反应调节剂如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)，白介素-2(“IL-2”)，白介素-6(“IL-6”)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生长因子。
将所述治疗部分偶联于抗体的技术是公知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs InCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(编辑)，pp.623-53(Marcel DEkker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review”，in Monoclonal Antibodies 84：Biological AndClinical Applications，Pinchera等(编辑)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective of The Therapeutic Use ofRadiobeled Ant ibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation AndCytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
IV.药物组合物
另一方面，本发明提供了一种组合物，如药物组合物，它包含一种或几种本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分的组合，与可药用的载体一起配制。在一种优选实施方案中，此组合物包括多种(如两种或以上)本发明的分离人抗体或其抗原结合部分的组合。优选地，组合物的每种抗体或其抗原结合部分与独特的、预选的IL-15表位相结合。
本发明的药物组合物也可用于联合治疗，即与其它试剂组合。例如，联合治疗可以包括本发明的组合物和至少一种其它的治疗剂，如抗炎剂，DMARDs(改变疾病的抗风湿性药物)，免疫抑制剂，化疗剂和牛皮癣药剂。本发明的药物组合物还可以结合放疗给药。与其它抗体，如CD4特异性抗体和IL-2特异性抗体的共给药，也为本发明所包括。据认为这类与CD4特异性抗体和IL-2特异性抗体的组合对于治疗自身免疫疾病和移植排斥特别有用。
如本文所用的，“可药用载体”包括任何和所有生理相容的溶剂、分散剂、包衣、抗细菌和抗真菌试剂、等渗的和吸收延缓试剂等。优选地，这种载体适合静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮使用(如通过注射或输注)。取决于给药途径，活性化合物，即抗体、双特异性和多特异性分子可以用一种物质包被，使化合物不受酸和其它可能灭活此混合物的自然条件的影响。
“可药用盐”是指保持母体化合物需要的生物活性并且不带来任何不需要的毒性作用的盐(见，例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这些盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些从如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷等无毒无机酸以及如脂肪酸单和二羧酸、苯取代烷酸、羟基烷酸、芳香酸、脂肪酸和芳香磺酸等无毒有机酸衍生的盐。碱加成盐包括从如钠、钾、镁、钙等碱金属和N，N’-联苯二亚胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒有机胺衍生的盐。
本发明的组合物可以通过许多本领域中公知的方法给药。正如熟练的技术人员所鉴定的，给药途径和/或方式将由希望结果的不同而改变。活性化合物可以用保护化合物避免迅速释放的载体制备，如包括植入物、经皮贴剂、和微胶囊运送系统的控释制剂。可以使用如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸等生物可降解的和生物相容的多聚体。制备这种制剂的许多方法被授予专利并且在本领域的技术人员中是公知的。见如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为通过某种给药途径而给予本发明的化合物，必须将其包被于防止其被灭活的物质中或与这种物质共同给药。例如，这种化合物可以用适当的载体例如脂质体或稀释剂而给予受试者。可药用的稀释剂包括盐和水缓冲液包括水包油包水CGF乳状液以及传统脂质体(Strejanet al.(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
可药用载体包括为临时制备无菌注射液或分散剂所用的无菌水溶液或分散液和无菌粉末。这些针对药用活性物质的媒介和试剂的使用在本领域中是公知的。除了与活性化合物不相容的传统介质或试剂外，考虑了将其使用在本发明的药物组合物中。此组合物中也可掺入补充的活性化合物。
治疗组合物在生产和储存条件下一般必需是无菌和稳定的。此组合物可以配制为溶液、微乳状液、脂质体或其它适合高药物浓度的有序结构。载体可以是包括如水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)，及其适当的混合物的溶剂或分散介质。可以通过例如使用包膜如卵磷脂、在分散时保持要求的颗粒大小及使用表面活性剂来保持适当的液态。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可以通过在组合物中加入延缓吸收的试剂如一硬脂酸盐和明胶来延长注射组合物的吸收。
无菌注射液可以通过在适当溶剂中加入要求的剂量的活性化合物和上面列举的一种或几种成分的组合，并按要求进行灭菌微量过滤。一般说来，分散剂通过将活性化合物加入一种包含上面所列举的基本分散介质和要求的其它成分的无菌载体。对于制备无菌注射液的无菌粉末，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥(低压冻干)，产生活性成分粉末，再加上从前面无菌过滤的溶液得到的其它需要成分。
调整剂量方案来提供最优的需要反应(如治疗反应)。例如，可以给予单次浓注，可以随时间给予一些分开的剂量，或由治疗状况的紧急程度按比例减少或增加剂量。为给药方便和剂量统一，以剂量单位的形式配制肠胃外组合物非常有好处。这里用到的剂量单位形式是指作为受治疗受试者的单位剂量的生理区分的单位；每个单位包含预定量的活性化合物，经计算可以与要求的药物载体协同作用，产生需要的治疗效果。本发明剂量单位形式的规格由以下内容指定并直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和需要达到的特定疗效及(b)本领域中固有的限制如治疗所用化合物个体敏感性的限制。
可药用抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、硫酸钠等；(2)脂溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗组合物来说，本发明的制剂包括适合口服、鼻、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外给药的制剂。所述制剂能以单位剂型方便地提供，并且可以通过药物学领域的任何已知方法制备。用于产生单一剂型的可以与载体材料组合的活性成分的量，根据被治疗的受试者和特定的给药方式而改变。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量，通常是能产生治疗效果的组合物的量。一般，以百分比衡量，该量将为活性成分的约0.001-99％，优选约0.005-70％，最优选约0.01-30％。
本发明适于阴道给药的制剂也包括含有本领域中公知的适当载体的阴道栓、填塞物、油膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。局部或经皮给予本发明的组合物的剂型包括粉末、喷雾、软膏、糊剂、油膏、洗液、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与可药用载体，以及可能要求的任何防腐剂、缓冲液或推进剂混合。
这里用到的短语“肠胃外给药”和“给药于肠胃外”表示肠道和局部给药以外的给药方式，通常是注射、并包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在本发明的药物组合物中使用的适合水或非水载体包括水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)，及其适当的混合物、植物油，如橄榄油、及可注射有机酯，如亚油酸。可以通过例如使用包被物如卵磷脂、在分散时保持要求的颗粒大小及使用表面活性剂来保持适当的液态。
这些组合物也可以包含佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。预防微生物的出现可以通过灭菌程序，以及通过引入各种抗细菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚山梨酸等。也可能在组合物中需要包括等渗试剂，如糖、氯化钠等。另外，可以通过在组合物中加入延缓吸收的试剂如一硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
当本发明的化合物在作为药物给人和动物施用时，它们可以单独给药，或者作为药物组合物给药，所述组合物包含，例如，0.01-99.5％(更优选0.005-70％，如0.01-30％)的活性成分结合以可药用的载体。
无论选择什么样的给药途径，可以以合适的水合形式应用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物，能通过本领域技术人员所公知的传统方法配制成可以药用的剂量形式。
本发明的药物组合物中的实际剂量水平可以改变，从而获得可以达到特定病人所需的治疗反应的活性成分的量、组合物和给药方式，而对病人无毒。选定的剂量水平将取决于各种药代动力学因素包括本发明使用的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径、给药时间、所使用的特定化合物的分泌速度、疗程、其它与所使用的特定组合物联合使用的药物、化合物和/或物质、年龄、性别、体重、状况、治疗病人的一般健康和过去史等医学领域中熟知的因素。本领域中有常规技术的医生或兽医可以轻易判断并处方需要的药物组合物的量。例如，医生或兽医可以以低于获得需要的疗效要求剂量的用于药物组合物中的本发明的化合物剂量开始，并逐渐增加剂量，直到达到需要的疗效。总之，本发明的组合物的适当剂量是有效产生疗效的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量一般将取决于前面所描述的因素。优选给药方式为静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，优选接近靶位点给药。如果需要，治疗组合物的的有效日剂量可以选择作为2、3、4、5、6或更多亚剂量，在一天中的适当间隔，以单位剂型分别给药。尽管本发明的化合物可以单独给药，优选将化合物作为药物制剂(组合物)使用。
治疗组合物可以通过本领域中的公知医学设备给药。例如，在一种优选实施方案中，本发明的治疗组合物可以用无针皮下注射设备给药，如在美国专利5,399,163，5,383,851，5,312,335，5,064,413，4,941,880，4,790,824或4,596,556中公开的设备。本发明中有用的公知植入物和组件的例子包括：美国专利4,487,603，它公开了以控制速率分散药物的可植入微量滴注泵；美国专利4,486,194，它公开了经皮用药的治疗设备；美国专利4,447,233，它公开了以精确滴注速度运送药物的药物输注泵；美国专利4,447,224，它公开了连续运送药物的可变流量可植入滴注泵；美国专利4,439,196，它公开了一种有多室容器的渗透性药物运送系统；以及美国专利4,475,196，它公开了一种渗透性药物运送系统。在此引入这些专利文献作为参考。许多其它的这种植入物、运送系统和组件在本领域中的技术人员中是公知的。
在某些实施方案中，本发明的人单克隆抗体可以为保证体内适当分布而制剂。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高度亲水的化合物。为保证本发明的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，它们可以在例如脂质体中配制。关于生产脂质体的方法，见，如美国专利4,522,811；5,374,548及5,399,331。脂质体可以包括一个或多个选择性运送到特定细胞或器官内的部分，这样增强了导向性药物运送(见，如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。作为例子的导向部分包括叶酸或生物素(见，如Low et al的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，可以包含本发明的制剂和发明分子成分的不同种类；p120(Schreier etal.(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。在本发明的一种实施方案中，本发明的治疗化合物在脂质体中配制；在一种更优的实施方案中，脂质体包含导向部分。在一种最优实施方案中，脂质体中的治疗化合物由浓集注射运送至肿瘤或感染附近的位点。组合物必须为液体，必需在可以容易注射的范围内。必需在生产和储存条件下保持稳定，并且必需防止微生物如细菌和真菌污染。
在另一个实施方案中，可以对本发明的单克隆抗体进行配制以阻止或减少它们通过胎盘的运输。这可以通过本领域已知的方法进行，例如，通过抗体的PEG化或通过利用F(ab)2’片段。还可以参见另外的参考文献″Cunningham-Rundles C，Zhuo Z，Griffith B，KeenanJ.(1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulinconjugates.Resistance to enzymatic degradation.Jlmmunol Methods.152：177-190；和″Landor M.(1995)Maternal-fetal transfer ofimmunoglobulins，Ann AllergyAsthma Immunol 74：279-283。当抗体用于治疗或预防复发的自发性流产时这特别有效。
对于类风湿性关节炎的“治疗有效剂量”优选导致患者中的ACR20初步定义的改进，更加优选ACR50初步定义的改进并且甚至更加优选ARC70初步定义的改进。
ACR20初步定义的改进定义为：在关节触痛计数(TCJ)和肿胀关节(SWJ)中≥20％的改善，和在下列5种评估：患者疼痛评估(VAS)、患者整体评估(VAS)、医生整体评估(VAS)、患者自我评估的失能(HAQ)、急性期反应物(CRP或ESR)的3种中≥20％的改善。
ACR50和ACR70分别以相同的方式定义为≥50％和≥70％的改善。进一步的细节参见Felson等.American College of RheumatologyPreliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis；Arthritis Rheumatism(1995)38：727-735。
可以在一种动物模型系统中评估一种化合物抑制癌症的能力以预测其在人肿瘤中的效力。或者，可以通过熟练技术人员已知的测试法体外检测该化合物抑制细胞生长或凋亡的能力来评估该化合物的特性。一种治疗性化合物的治疗有效量可以减少肿瘤大小，或者在受试者中改善症状。本领域的普通技术人员能够基于诸如受试者体形、受试者症状的严重性和所选的特定组合物或给药途径的因素来确定这种量。
还可以根据本领域公知的方法评估所述抗体治疗或预防牛皮癣的能力。
所述组合物必须是无菌的，并且其流动性必须达到使该组合物能够通过注射器输送的程度。除了水之外，所述载体可以是等渗的缓冲盐溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，合适的流动性可以通过使用诸如卵磷脂的包被物，对于分散剂来说通过保持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂来保持。在许多情况下，优选在所述组合物中添加等渗剂，例如，糖类，诸如甘露糖醇或山梨醇的聚醇，和氯化钠。可以通过在该组合物中添加诸如一硬脂酸铝或明胶的能延长吸收的制剂而实现可注射组合物的长期吸收。
当所述活性化合物如上所述受到适当保护时，该化合物就可以口服，例如，用一种惰性稀释剂或可同化的食用载体进行保护。
V.本发明的用途和方法
本发明的抗IL-15的人抗IL-15抗体(包括所述抗体的衍生物和结合物)和包含该抗体的组合物可以用于很多体外和体内的诊断和治疗用途。
在一个实施方案中，本发明的人抗体用于抑制IL-15诱导的T细胞和/或单核细胞/巨噬细胞的TNF-α生产，优选不抑制由诸如IL-2的其它细胞因子诱导的TNF-α生产。通过将所述抗体与IL-15接触(例如，通过给予受试者所述抗体)，抑制IL-15通过IL-15受体传递信号的能力，并且因此也抑制T细胞和/或单核细胞/巨噬细胞的TNF-α生产。优选的抗体结合对于IL-15特异性的表位(例如，特定亚基，如γ亚基)，并且因而有利地抑制IL-15诱导的TNF-α生产，但不干扰结构上相关的细胞因子，如IL-2的TNF-α生产。
或者，利用人抗体干扰IL-15受体IL-15受体α-，β-和γ-链组装和/或抑制邻近细胞上的组装，所述邻近细胞表达β-和γ-链作为IL-15受体或另一种细胞因子受体的部分。
在另一个实施方案中，利用本发明的人抗体抑制IL-15诱导的T细胞募集和/或增殖，优选不抑制由其它结构上相关的细胞因子，如IL-2的诱导的T细胞增殖。随着TNF-α生产，通过将所述抗体与IL-15接触(例如，通过给予受试者所述抗体)，抑制IL-15通过IL-15受体传递信号的能力，并且因此也抑制了由IL-15进行的T细胞刺激。
因此，仍在另一个实施方案中，本发明提供一种通过以对于治疗或预防由IL-15介导的病症(例如，自身免疫病，如牛皮癣，类风湿性关节炎，或炎性肠病，或感染性病症，如HIV)有效的量给受试者施用本发明的人抗体来治疗或预防该病症的方法。抗体可以单独给药或与另一种治疗剂一起给药，所述治疗剂如抗炎剂，例如，甾体或非甾体抗炎剂，或与抗体结合或协同性作用来治疗或预防IL-15介导的疾病的细胞毒素。
在一个特定的实施方案中，利用本发明的人抗体治疗或预防类风湿性关节炎(RA)。所述抗体限制IL-15在与诸如RA的疾病相关联的炎症的进展中发挥的作用。T细胞，特别是CD4+T-辅助细胞参与RA中炎症过程的起始和维持。另一种细胞因子TNF-α也参与炎症途径，它最终导致RA患者的关节破坏和失能。IL-15的局部合成在T细胞的激活和募集中和在TNF-α和其它炎性细胞因子的诱导中发挥关键作用。在RA进展中IL-15的作用涉及一种过程，其中由巨噬细胞合成的IL-15诱导T细胞募集。激活的T细胞随后：(1)维持巨噬细胞活化；和(2)诱导TNF-α生产。被刺激的巨噬细胞促进更多IL-15的合成和T细胞激活，因而继续该循环。除了它对于TNF-α和巨噬细胞的作用之外，IL-15还激活嗜中性粒细胞并影响局部B细胞免疫球蛋白分泌，特别是类风湿因子合成。
因此，本发明的抗IL-15抗体能够用于预防或阻断引发RA的IL-15的以上作用，并且因而能够用于预防或治疗这种疾病。例如，本发明的抗IL-15抗体能够用于抑制炎症和/或预防涉及RA的激活的白细胞的趋化性。
本发明的人抗体可以用来抑制对于氨甲蝶呤反应不足的类风温性关节炎患者中的结构破坏的进展，减轻体征和症状，并且延缓中度到重度活动性类风湿性关节炎患者中的结构破坏，所述患者包括以前DMARD治疗未失败的患者。
还可以利用本发明的人抗体阻断或抑制IL-15的其它作用。IL-15在包括单核细胞和巨噬细胞、成纤维细胞、树突细胞和角质细胞的多种细胞中表达。角质细胞是粘膜组织的表皮和上皮层的主要组分。角质细胞生长的控制由细胞因子和生长因子的复杂网络介导，某些所述因子由角质细胞本身产生。源于角质细胞的IL-15有助于牛皮癣斑中T细胞的聚集、增殖和存活。已知多种疾病(其中角质细胞的数目提高)导致表皮过度增生，其对于至少某些相关疾病症状负责。这些疾病包括慢性病如牛皮癣和特应性皮炎，以及像慢性手湿疹、接触性皮炎、病毒性疣(HPV相关的)、皮肤T细胞淋巴瘤、诸如由于糖尿病引起的伤口愈合不良的伤口愈合不良的疾病。因此，本发明提供一种通过以对于治疗或预防病症有效的量给予患者本发明的人抗IL-15抗体来治疗或预防这类病症的方法。例如，能够利用本发明的抗IL-15抗体阻断或抑制牛皮癣中的角化不全，减小牛皮癣中的表皮厚度，并且减少牛皮癣中角质细胞的增殖。
IL-15还调节肠上皮细胞的功能(Reinecker等，(1996)Gastroenterology 111：1706-13)。具体地，IL-15可以引起粘膜上皮细胞上和肠上皮细胞系上的变化，因而参与炎性肠病，例如乳糜泻病的发病机制。IL-15在这类疾病中的作用被患有乳糜泻病的未治疗患者的小肠中IL-15+细胞的选择性过度呈现所显示(WO 00/02582)。因而，已经显示IL-15直接参与乳糜泻病的起始和维持。因此，在另一个实施方案中，通过将抗体以对于治疗或预防病症有效的量向患者给药，本发明的抗IL-15人抗体(即，它抑制IL-15的促炎作用)可以用来治疗和/或预防乳糜泻病。
此外，本发明的发明者发现IL-15还促进新血管的形成，一种称作新血管形成或血管发生的过程。因此，本发明抗体的另一种用途包括涉及新血管形成的疾病的预防或治疗。除了炎性疾病之外，这些疾病包括多种依赖新血管形成或特征为新血管形成的癌症。
本发明的人抗体还可以用于阻断或抑制与诸如HIV的感染性疾病相关联的IL-15的作用。因此，本发明抗体的另一种用途包括感染性疾病，例如HIV-1的预防或治疗。
例如，所述抗体可以在体外或体内用于诊断由IL-15介导的多种疾病。具体地，所述抗体能够用于检测IL-15的水平，或细胞的水平，所述细胞在其膜表面包含IL-15，或包含连接到其受体上的IL-15(受体结合的人IL-15)。随后可以将这种水平的IL-15的检测与某些疾病症状相关联。或者，所述抗体可以用于抑制或阻断IL-15功能，这接下来能够预防或改善由IL-15功能所引发的疾病症状。
如前所述，本发明的人抗IL-15抗体能够与一种或其它的更多治疗剂一起共同给药，例如，一种免疫抑制剂或一种抗炎剂以提高整体抗炎作用。所述抗体能够连接到所述药剂上(作为一种免疫复合物)或能够与所述药剂分开进行给药。在后一种情况中(分开给药)，所述抗体能够在所述药剂之前、之后或同时进行给药。合适的治疗剂包括，但不限于，抗炎剂、DMARDs(改变疾病的抗风湿性药物)、免疫抑制剂、化疗剂和牛皮癣药剂。根据本发明的人抗体还可以结合放疗进行给药。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体可以结合其它的抗体，如CD4特异性抗体和IL-2特异性抗体进行给药。据认为本发明人抗体与CD4特异性抗体和IL-2特异性抗体的组合对于治疗自身免疫疾病和移植排斥特别有用。
包含本发明的人抗IL-15抗体和，任选地，使用说明书的试剂盒也在本发明的范围之内。所述试剂盒可以进一步包含一种或多种其它试剂，如免疫抑制剂，或一种或多种其它的本发明的人抗体(例如，一种具有互补活性的人抗体，它与第一种人抗体结合IL-15抗原中的不同表位)。
因此，用本发明的抗体治疗的患者能够另外用另一种治疗剂，如增强或扩大人抗体治疗作用的抗炎剂进行给药(在本发明人抗体给药之前，同时或之后)。
在另一个实施方案中，本发明的人抗体能够通过将化合物连接到所述抗体而用于将所述化合物(例如，治疗剂、标记、细胞毒素、免疫抑制剂等)靶向细胞，所述细胞具有IL-15结合于其表面(例如，膜结合的)或结合于IL-15受体上。因此，本发明还提供定位来自体内、体内或体外的表达IL-15和IL-15受体的细胞的方法(例如，用一种可检测的标记，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。
本发明的其它实施方案描述于下列实施例中。
通过下列实施例对本发明进行进一步说明，所述实施例不应被认为是进一步限制性的。特此将整个本说明书中的序列表内容、图和引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请都并入本文作为参考。
                      实施例
实施例1 Cmu靶向小鼠的制备
CMD靶向载体的构建
质粒pICEmu包含一个跨mu基因，从Balb/C基因组λ噬菌体文库中获得的鼠Ig重链基因座的EcoRI/XhoI片段(Marcu et al.Cell22：187，1980)。此基因组片段被亚克隆到质粒pICEM19H的XhoI/EcoR位点(Marsh et al；Gene 32，481-485，1984)。包含在pICEmu的重链序列从mu内含子增强子3′的EcoRI位点向下游延伸到mu基因最后一个跨膜外显子下游约1kb的XhoI位点；然而，通过在大肠杆菌中传代，许多mu转换重复区域被去除。
导向载体按如下方法建立。将一个1.3kb的HindIII/SmaI片段从pICEmu切除并亚克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)。此pICEmu片段从位于Cmu1 5′端约1kb的HindIII位点延伸到Cmu1内部的SmaI位点。产生的质粒用SmaI/SpeI消化，然后插入一个约4kb的从pICEmu得到的，从Cmu13′的SmaI位点延伸到最后一个Cmu外显子下游的XbaI位点的SmaI/XbaI片段。产生的质粒pTAR1在SmaI位点被线性化，插入一个neo表达盒。该盒包含一个在小鼠磷酸甘油激酶(pkg)启动子(XbaI/TaqI片段；Adra et al.(1987)Gene 60：65-74)转录控制下并包含pkg聚腺苷酸化位点(PvuII/HindIII片段；Boer et al.(1990)Biochemical Genetics 28：299-308)的neo基因。该盒从质粒pKJ1(Tybulewicz et al.(1991)Cell 65：1153-1163有描述)得到，neo盒作为EcoRI/HindIII片段被切除并亚克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)而产生pGEM-7(KJ1)。Neo盒从pGEM-7(KJ1)通过EcoRI/SalI消化被切除，为平端，并被亚克隆到质粒pTAR1的SmaI位点，与基因组Cmu序列方向相反。产生的质粒被Not I线性化，插入一个单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)盒，这样可以允许有同源重组的ES克隆富集，如Mansour et al.(1988)Nature 336：348-352的描述。该盒包含了其两端为小鼠pgk启动子和聚腺苷酸化位点的tk基因编码序列，如Tybulewicz et al.(1991)Cell 65：1153-1163的描述。产生的CMD导向载体包含与重链基因座总共约5.3kb的同源性，并设计产生在第一个Cmu外显子的唯一SmaI位点插入neo表达盒的突变mu基因。导向载体在电穿孔到ES细胞之前，用在质粒序列内部切割的PvuI线性化。
靶ES细胞的产生和分析
AB-1 ES细胞(McMahon，A.P.and Bradley，A.，(1990)Cell62：1073-1085)在有丝分裂不活跃的SNL76/7细胞饲养层(ibid.)上生长，基本如(Robertson，E.J.(1987)， Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：a Practical Approach(E.J.Robertson，ed.)Oxford：IRL Press，p.71-112)所描述。线性化的CMD导向载体通过Hasty等描述的方法(Hasty，P.R.Et al.(1991)Nature 350：243-246)被电穿孔到AB-1细胞中。被电穿孔的细胞以1-2×106个细胞/平皿的密度被平铺到100mm的平皿。24小时后，将G418(200mg/ml活性成分)和FIAU(5×10-7M)加入培养基，抗药克隆允许培养8-9天。挑选克隆，用胰蛋白酶消化，分为两部分，并进一步扩展。然后从每个克隆得到的细胞的一半被冷冻，另一半为进行载体和靶序列之间的同源重组而进行分析。
DNA分析通过DNA印迹杂交执行。按Laird等描述的方法(Laird，P.W.et al.，(1991)Nucleic Acids Res.19：4293)将DNA从克隆中分离。分离的基因组DNA用SpeI消化并用一个与mu内含子增强子和mu转换区之间的序列杂交的915bp的SacI片段即探针A探测。探针A检测野生型基因座的一个9.9kb的SacI片段和mu基因座的一个与CMD导向载体同源重组(neu表达盒包含一个SpeI位点)的7.6kb的鉴别带。在DNA印迹分析筛选的1132个抗G418和FIAU克隆中，3个显示出了提示mu基因座同源重组的7.6kb的Spe I带。用酶BglI，BstXI和EcoRI进一步消化这3个克隆，证明载体被同源性整合到mu基因中。当与探针A杂交后，用BglI，BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的印记分别产生15.7，7.3和12.5kb的片段，而靶mu等位基因的存在分别由7.7，6.6，和14.3kb的片段提示。由SpeI消化检测的所有3个阳性克隆表现出预期的鉴别neo盒插入Cmu1外显子的BglI，BstXI和EcoRI限制片段。
具有突变mu基因的小鼠的产生
将这三个编号为264，272和408的靶ES克隆融化并按Bradley在 Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：a Practical Approach (E.J.Robertson，ed.)Oxford：IRL Press，p.113-151)中描述的方法注射入C57BL/6J胚泡。将被注入的胚泡转移到假孕雌性小鼠中产生表现从引入ES细胞和宿主胚泡细胞衍生的细胞混合的嵌合小鼠。ES细胞对嵌合体的贡献可以由黑色C57BL/BJ背景上的从ES细胞系衍生的灰色皮毛颜色数量用肉眼估计。克隆272和408只产生低百分比的嵌合体(即低百分比灰色色素)，但克隆264产生高百分比的雄性嵌合体。这些嵌合体与C57BL/J6雌鼠杂交并产生灰色后代，提示ES细胞基因组的种系转移。对靶mu基因的筛选是通过对尾部解剖得到的DNA用BglI消化进行DNA印迹分析而执行的(如前面所描述的ES细胞DNA分析)。约50％的灰色后代除了野生型的15.7kb带，也表现出7.7kb的杂交BglI带，证明了靶mu基因的种系转移。
mu基因功能性灭活的转基因小鼠的分析
为判断neo盒插入到Cmu1是否灭活了Ig重链基因，将一只克隆264的嵌合体与一只JHD突变纯合小鼠杂交，JHD突变由于去除JH基因段而导致重链表达失活(Chen et al，(1993)Immunol.5：647-656)。产生四只灰色后代。从1月龄的这些动物中得到血清并用ELISA测定鼠IgM的存在。四只后代中的两只完全缺失IgM(见表1)。从尾部解剖得到的DNA用BglI消化并与探针A杂交，以及通过用StuI消化并与一个475bp的EcoRI/StuI片段(ibid)杂交，DNA印迹分析测定的四只动物的基因型证明，不能表达血清IgM的动物重链基因座中的一个等位基因有JHD突变，另一个有Cmul突变。JHD突变的杂合小鼠显示野生型水平的血清Ig。这些资料证明Cmul突变灭活mu基因的表达。
                    表1
  小鼠   血清IgM(微克/ml)   Ig H链基因型
  42   ＜0.002   CMD/JHD
  43   196   +/JHD
  44   ＜0.002   CMD/JHD
  45   174   +/JHD
  129×BL6 F1   153   +/+
  JHD   ＜0.002   JHD/JHD
表1表示由ELISA检测的，有CMD和JHD突变(CMD/JHD)的小鼠，JHD突变杂合子小鼠(+/JHD)，野生型(129SV×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)及B细胞缺陷JHD突变纯合小鼠(JHD/JHD)的血清IgM水平。
实施例2 HCO12转基因小鼠的制备
HCO12人量链转基因
HCO12转基因通过共同注射80kb的pHC2插入片段(Taylor etal.，1994，Int.Immunol.，6：579-591)和25kb的pVx6插入片段产生。质粒pVx6按如下方法建立。
一个包含种系人VH1-18(DP-14)基因以及约2.5kb的5′侧翼和5kb的3′侧翼基因组序列的8.5kb的HindIII/SalI DNA片段被亚克隆到质粒载体pSP72(Promega，Madison，WI)产生质粒p343.7.16。一个包含种系人VH5-51(DP-73)基因以及约5kb的5′侧翼和1kb的3′侧翼基因组序列的7kb的BanHI/HindIII DNA片段被克隆到基于pBR322的质粒克隆载体pGP1f(Taylor et al.1992，Nucleic AcidsRes.20：6287-6295)产生质粒p251f。从pGP1f衍生的一个新克隆载体pGP1k(SEQ ID NO：13)被EcoRV/BamHI消化并与一个包含种系人VH3-23(DP-47)基因以及约4kb的5′侧翼和5kb的3′侧翼基因组序列的10kb的EcoRV/BamHI DNA片段连接。产生的质粒p112.2RR.7被BamHI/SalI消化并与p251f的7kb的纯化BamHI/SalI插入片段连接。产生的质粒pVx4用XhoI消化并与p343.7.16的8.5kb的XhoI/SalI插入片段连接。
获得了一个VH1-18基因与另外两个V基因方向相同的克隆。然后这个称为pV×6的克隆被NotI消化，按Hogan等的描述(B.Hoganet al.，Manipulating the Mouse embryo，A Laboratory Manual，2ndedition，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)，纯化的26kb插入片段与纯化的pHC2的80kb NotI插入片段以1∶1的摩尔比共同注射到半天的(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎原核中。从注入的胚胎发育的小鼠建立了三个包含从Vx6和HC2得到的序列的独立转基因小鼠系。这些系被指定为(HCO12)14881，(HCO12)15083，(HCO12)15087。然后将这三个系的每一个与包含实施例1中描述的CMD突变、JKD突变(Chen et al.1993，EMBOJ.12：811-820)和(Kco5)9272转基因(Fishwild et al.1996，NatureBiotechnology 14：845-851)的小鼠杂交。产生的小鼠在破坏内源性小鼠重链和κ轻链基因座为纯合的背景下表达人重链和κ轻链转基因。
实施例3抗IL-15的人单克隆抗体的生产
用添加了完全弗氏佐剂(CFA，批号121024LA，DifcoLaboratories，Detroit，Michigan，USA)或不完全弗氏佐剂(ICFA，批号121195LA，Difco)的人重组IL-15(hIL-15，Immunex corp.，Seattle，USA)通过皮下(SC)、腹膜内(IP)或静脉内(IV)对如上制备的并由Medarex，San José，CA，USA提供的HCo12和HCo7转基因小鼠进行免疫。在几种情况下，利用偶联到KLH上的hIL-15进行免疫。在用添加了完全或不完全弗氏佐剂的hIL-15加强几次后，对小鼠血清测试抗IL-15的人抗体的存在。
导致最终克隆146B7，146H5，404E4和404A8的转基因小鼠的免疫 方案
小鼠号码146(HCo12)，ID 995-146，雌性
170699 SC 12μg hIL-15于CFA(Difco，批号121024LA)中
010799 SC 12μg hIL-15于ICFA(Difco，批号121195LA)中
150799 SC 12μg hIL-15于ICFA中
020899 SC 12μg hIL-15-KLH于ICFA中
070999 SC 12μg hIL-15-KLH于ICFA中
280999 SC 12μg hIL-15-KLH于CFA中
111099 IV 30μg hIL-15于PBS中
121099 IV 30μg hIL-15于PBS中
151099该小鼠的淋巴结和脾细胞与SP2/0融合
小鼠号码404(HCo7)，ID 997-404，雌性
201099 IP 25μg hIL-15-KLH于CFA(Difco，批号121024LA)中
031199 IP 12.5μg hIL-15，12.5μg hIL-15-KLH，25μg于ICFA(Difco，批号121195LA)中
101199 IV 12.5μg hIL-15，12.5μg hIL-15-KLH
121199 IV 12.5μg hIL-15，12.5μg hIL-15-KLH
191199该小鼠的淋巴结和脾细胞与SP2/0融合
培养基
融合配偶体培养基(FPM)：
将Iscoves改进的Dulbecco’s培养基添加100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1mM丙酮酸钠，0.5mMβ-巯基乙醇(LifeTechnologies，Paisley，Scotland)和10％热灭活的胎牛血清(HyClone，Utah，USA)。
融合选择培养基(FSM)：
添加了30ml Origen杂交瘤克隆因子(IGEN，Gaithersburg，MD，USA)，HAT(1管瓶，制造商推荐的浓度，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)和0.5mg/ml卡那霉素(Life Technologies，Paisley，Scotland)的FPM。
融合克隆培养基(FCM)：
添加了20ml Origen杂交瘤克隆因子(IGEN，Gaithersburg，MD，USA)，HT(1管瓶，制造商推荐的浓度，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)和0.5mg/ml卡那霉素(Life Technologies，Paisley，Scotland)的FPM。
杂交瘤的制备：脾细胞和淋巴结细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合
为了获得杂交瘤，从小鼠中移除脾、腹股沟和主动脉旁的淋巴结。以细胞比例1∶2将脾和淋巴节细胞的单细胞悬液与SP2/0骨髓瘤细胞混合。将细胞离心下来并于37℃将沉淀轻轻重悬于1ml聚乙烯二醇(50％w/v，溶于PBS，Sigma-Aldrich，Irvine，UK)。在将细胞涡漩60秒之后，加入25ml FPM-2并将细胞于37℃孵育30-60分钟。孵育后，以0.75×105细胞/孔(于100μl)的细胞浓度在FSM中于96孔板里培养细胞。3天后，向每个孔中加入100μl FSM。
用hIL-15免疫的HCo7和HCo12小鼠的脾和淋巴结的融合导致几种产生抗IL-15的杂交瘤的产生。分离出下列四种稳定的产生完全的人抗IL-15抗体的克隆：(1)146LyD7F7B7重新命名为：146B7；(2)146DE2E12A3H5重新命名为：146H5；(3)404CG11B7E4重新命名为：404E4；和(4)404FB12E7A8重新命名为：404A8。这些克隆都是人IgG1/k亚类。
杂交瘤的筛选
在融合后的第7和第11天之间，利用下列ELISAs对所述孔筛选人抗体的存在：
在培养物上清液中筛选人IgG存在的ELISA
为了实施ELISA以检测人IgG抗体的存在，将100μl/孔的于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的0.9μg/ml兔-α-k-轻链抗体(DAKO，Glostrup，Denmark)加至Nunc Maxisorp ELISA板(于室温孵育过夜)。在用添加了鸡血清(2％；Life Technologies，Paisley，Scotland)和Tween-20(0.05％；PBSTC)的PBS封闭板之后，加入培养物上清液。孵育1.5小时之后，洗涤板并加入稀释于PBSTC中0.5μg/ml的偶联了辣根过氧化物酶(DAKO，Glostrup，Denmark)的兔-α-人IgG(Fab2-片段)。孵育1小时之后，洗涤孔并根据生产商的方法加入底物ABTS(2，2’-连氮基双-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)，并在EL808 ELISA读数器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm评估抗体结合。
筛选IL-15特异性抗体存在的ELISA
对包含人IgG/k抗体的孔进一步测试在IL-15特异性ELISA中人抗IL-15抗体的存在。为了实施ELISA，将100μl/孔的于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的1μg/ml IL-15加至Nunc Maxisorp ELISA板(于室温孵育过夜)。在用添加了鸡血清(2％；Life Technologies，Paisley，Scotland)和Tween-20(0.05％；PBSTC)的PBS封闭板之后，加入培养物上清液。孵育1.5小时之后，洗涤板并加入1/5000稀释于PBSTC中的偶联了辣根过氧化物酶的α-人IgG Fc(Jackson Immunoresearch，West Grove，Pennsylvania，USA)。孵育1小时之后，洗涤孔并根据生产商的方法加入底物ABTS(2，2’-连氮基双-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)，并在EL808 ELISA读数器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm评估抗体结合。
杂交瘤的亚克隆
为了获得稳定的抗IL-15细胞系，通过细胞的限制性稀释(至0.5细胞/孔)在96孔板中对杂交瘤进行亚克隆。
在大约10天后用上面提到的IL-15 ELISA对亚克隆进行测试。在几个亚克隆过程中，FSM经由FCM到FPM进行同相改变。用下面描述的ELISA测定所述亚克隆的同种型。
通过ELISA进行抗IL-15抗体的同种型测定
为了实施同种型ELISA，将100μl/孔的于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的1μg/ml抗人Fc(Jackson Immuno research)加至Nunc MaxisorpELISA板(于室温孵育过夜)。在用添加了鸡血清(2％；LifeTechnologies，Paisley，Scotland)和Tween-20(0.05％；PBSTC)的PBS封闭板之后，加入培养物上清液。孵育1.5小时之后，洗涤板并加入偶联了碱性磷酸酶(Zymed，plaats，land)的小鼠-α-HuIgG1，或偶联了辣根过氧化物酶(Zymed)的小鼠-α-HuIgG3。孵育1小时之后，洗涤孔并根据生产商的方法加入底物ABTS(2，2’-连氮基双-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)。在EL808 ELISA读数器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm评估抗体结合。
实施例4完全的人抗IL-15抗体的表位特异性
为了在治疗上发挥功能并抑制IL-15诱导的促炎作用，IL-15特异性抗体需要识别参与和IL-15受体IL-2Rβ链和/或γ链相互作用的IL-15表位。
利用突变体蛋白质(Pettit等所描述的)评估完全的人抗IL-15抗体，146B7，146H5，404A8和404E4的表位特异性。所用的IL-15突变体包括IL-15突变体Q108S(残基108上的Gln被Ser替换；γ链相互作用位点上的突变)和突变体D8SQ108S(残基108上的Gln被Ser替换并且在位置8上的Asp被取代为Ser；IL-15的β和γ链相互作用位点上的突变)。
测定hIL-15特异性抗体146B7，147H5，404A8和404E4结合hIL-15 和突变体IL-15蛋白的ELISA
为了实施ELISA，将100μl的于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的1μg/ml IL-15或hIL-15突变体蛋白加至Nunc Maxisorp ELISA板进行涂布。在用添加了鸡血清(2％；Life Technologies，Paisley，Scotland)和Tween-20(0.05％；PBSTC)的PBS封闭板之后，对hIL-15特异性抗体的系列稀释物进行孵育。洗涤后，加入1/5000稀释于PBSTC中的偶联了过氧化物酶的α-人IgG Fc(Jackson Immunoresearch，West Grove，Pennsylvania，USA)。在洗涤底物之后，根据生产商的方法加入ABTS(2，2’-连氮基双-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)，并在EL808 ELISA读数器(Bio-tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm评估抗体结合。
完全的人IL-15特异性抗体146B7，146H5，404A8和404E4结合hIL-15和IL-15突变体蛋白Q108S和D8SQ108S显示于图1中。146B7和146H5都不能结合这些突变体IL-15蛋白。由于两种突变体都携带Q108S突变，146B7和146H5所识别的表位在IL-15的关键结构域中，它与IL-15受体的γ链相互作用。404A8和404E4都能够结合所述突变体蛋白，所以，这些抗体识别IL-15的β和γ链相互作用结构域之外的表位。146B7和146H5都在与IL-15受体的γ链相互作用的区域上结合IL-15。这与获自增殖分析的数据相一致，所述增殖分析利用本发明的完全的人抗IL-15抗体。如下面详细描述的，404A8和404E4都不能够抑制IL-15诱导的CTLL-2细胞和人PBMCs的增殖。146B7和146H5都能够抑制IL-15诱导的增殖。另外，通过阻断IL-15与IL-15受体γ亚基的相互作用来实现增殖的抑制。
实施例5146B7的VH和VL区序列
利用下列方法测定146B7的重排VH和VL区的核苷酸和推导的氨基酸序列。这些序列给出有关所用的VH和VL种系家族的信息；在这些种系序列中的点突变归因于在动物免疫的过程中B细胞的亲和力成熟。
RNA制备
根据生产商的方法用RNAzol(Biogenesis，Poole，England)从5×106146B7杂交瘤细胞中制备总RNA。
cDNA制备
根据生产商的方法用AMV反转录酶与缓冲液(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)，oligo d(T)15(Promega，Madison，WI，USA)，dNTP(Boehringer Mannheim corp.，USA)和RNAsin(Promega)从3μg总RNA中制备来自146B7的RNA的cDNA。
用来扩增VH和VL区以进行克隆的PCR引物
所用的引物对：
VH：
FR1 5’引物
(1)AB62   CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC
(2)AB63   SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC
(3)AB65   gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC
VH前导区5’引物
(4)AB85   ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC
(5)AB86   ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg
(6)AB87   ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg
(7)AB88   ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC
(8)AB89   ATg ggg TCA ACC gCC ATC CT
VH 3’引物
(9)AB90   TgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg
VK：
FR1 5’引物
(1)AB8    RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC
(2)AB9    gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC
(3)AB10   gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC
(4)AB11   gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC
(5)AB12   gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC
(6)AB13   gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC
(7)AB14   gAA ATT gTg CTg ACT CAg TC
Vk前导区5’引物：
(8)AB123  CCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg
(9)AB124  CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC
(10)AB125 CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC
(11)AB126 ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC
VK 3’引物
(12)AB16  Cgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg
用来扩增VH和VL区以进行克隆的PCR条件
用AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer)在GeneAmp PCR System9700(Perkin Elmer Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)上进行PCR反应。
PCR循环方案：
94°2’
11个循环94°30”
65°30”，-1°/循环
72°30”
30个循环94°30”
55°30”
72°30”
72°10’
冷却至4°
在pGEMT-载体系统I中VH和VL的克隆
在于琼脂糖凝胶上分析PCR产物后，用S-400或S300微离心柱(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ，USA)，或用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)对产物进行纯化。对于每个实验来说，根据生产商的方法，利用FR1或前导区引物，将两种独立扩增的每个VH和VL区的PCR产物克隆于pGEMT载体系统I(Promega)中。
在转化到大肠杆菌DH5α之后，利用T7和SP6通过于55°下30个循环的菌落PCR筛选单个菌落。利用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(Qiagen)纯化来自每一单个菌落的质粒DNA。为了进一步分析，实施Nco1/Not1(NE Biolabs，United Kingdom and RocheDiagnostics)消化并在琼脂糖凝胶上进行分析。
测序
在克隆于pGEMT载体系统I.T7之后对V区进行测序并根据方案将Sp6引物(Eurogentec，Luik，Belgium)与测序试剂盒：ABI PrismBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(AppliedBiosystems，Warrington，United Kingdom)结合使用。反应在ABIPRISM 377测序仪(PE Applied Biosystems)上进行并且用程序DNAStar，SeqmanII分析序列。随后将序列与VBASE( www.mrc- cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm)中的种系V基因序列进行比对。
146B7的VH和VL区的克隆和测序
通过PCR扩增来自杂交瘤146B7的VH和VL区并克隆于pGEMT载体系统I中以测定cDNA序列。将核苷酸和相应的氨基酸序列分别显示于图2(SEQ ID NOs：1和2)和图3(SEQ ID NOs：3和4)中。还显示出构架(FR)和互补决定区(CDR)。根据Vbase中比对的146B7 VH区的种系家族：VH5-51(VH5-亚群)，D2-15/D2(DH-片段)，JH4b(JH-片段)。根据Vbase中比对的146B7 VL区的种系家族：A27(VKIII-亚群)和JK2(JK-片段)。有关VH和VL区的更多信息显示于Kabat数据库 http：//immuno.bme.nwu.edu/或httn：//www.Vbase.com.
实施例6 146B7的亲和力结合特性
根据下列方法利用BIACORE 3000仪器通过表面等离子共振(SPR)技术分析146B7的亲和力以测定生物分子蛋白质相互作用。对由生物分子结合引起的表面层上SPR信号的变化进行检测并强调表面层上物质浓度的变化。利用下列定义表示亲和力：ka＝缔合速率常数(M-1sec-1)；kd＝解离速率常数(sec-1)；KA＝缔合平衡常数＝ka/kd(M-1)；和KD＝解离平衡常数＝kd/ka(M)。
实施不同的操作以获得146B7对于人IL-15(hIL-15)的亲和力。将来自两个不同供体的人重组IL-15(Immunex corp.，Seattle，USA andPeprotech，Rocky Hill，NJ，USA)偶联到CM5传感器芯片上。将偶联到感应器芯片上的化合物定义为配体。在其它实验中146B7被用作配体。
在每一种动力学分析中，将分析物146B7或hIL-15的结合与参考对照CM5感应器芯片的结合相比较，所述分析物适合偶联到感应器芯片上的配体。对分析物的系列稀释物(0，3.125，6.25，12.5，25，50μg/ml)进行测试。将缔合和解离曲线对于模型Langmuir 1∶1中的单体相互作用进行拟合，以测定ka和kd并计算KA和KD。利用BIA-Evaluation Version 3.1对所有数据进行分析。对于二价相互作用使用模型“二价分析物”。对所有分析对漂移基线进行校正。
为了测定146B7的抗体亲和力，对于源自两个不同供应商Immunex和Peprotech的人重组IL-15于BIACORE 3000上测量抗体146B7的亲和力。利用146B7作为配体而hIL-15作为分析物，测定单价相互作用(拟合Langmuir 1∶1的曲线)。
对于IL-15(Immunex Corp.)的146B7的亲和力测量如下：
缔合速率常数ka：1.07(±0.17)×105M-1sec-1
解离速率常数kd：6.56(±0.09)×10-3sec-1
缔合平衡常数KA：1.55(±0.21)×107M-1
解离平衡常数KD：6.59(±0.88)×10-8M
为了测定146B7的活性，将IL-15(Immunex Corp.)用作配体面146B7用作分析物。当利用拟合所表达的抗体的二价相互作用的Langmuir(1∶1)曲线分析分析获得的数据时，测定抗体的亲和性。
对于IL-15(Immunex Corp.)的146B7的亲和性测量如下：
缔合速率常数ka：7.30(±0.81)×105M-1sec-1
解离速率常数kd：1.45(±2.05)×10-3sec-1
缔合平衡常数KA：5.03(±3.40)×108M-1
解离平衡常数KD：1.55(±1.24)×10-9M
还对来自Peprotech的IL-15的146B7的亲和力和亲和性进行测定。对于IL-15的两种不同来源未见到亲和力和亲和性的主要差异。
如在以下实施例中所描述的，146B7以剂量依赖的方式抑制IL-15诱导的增殖，正如通过[3H]-胸苷掺入所测量的那样，所述实施例是有关通过完全的人抗IL-15抗体抑制人白介素15(hIL-15)诱导的CTLL-2细胞和PBMC增殖。对于来自这些增殖抑制实验的IC50(于50％抑制时的浓度，一种更加功能性的测定亲和力的方式)进行计算：3.1±0.91nM。这一IC50与利用146B7作为配体而重组IL-15作为分析物通过BIACORE 3000测量的亲和性相一致(KD 1.5nM)，并确认了这里获得的亲和力和亲和性测量值。
实施例7由完全的人抗IL-15抗体抑制IL-15诱导的TNF-α生产
利用下列方法使用健康志愿者的源于外周血的单核细胞(PBMC)研究完全的人抗IL-15抗体146B7，146H5，404E4和404A8对于IL-15诱导的TNF-α生产的作用。为了评估对于IL-15的特异性，还检查了这些抗体对于IL-2介导的TNF-α生产的作用。
细胞培养
将培养物维持于RPMI-1640，所述RPMI-1640具有2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素(全部来自LifeTechnologies，Paisley，Scotland)和10％热灭活的胎牛血清(HyClone，Utah，USA)。
外周血单核细胞(PBMC)的纯化
在征得同意后从健康志愿者体内抽取新鲜人血液，加入肝素抗凝。利用Ficoll(Pharmacia，Uppsala，Sweden)通过密度梯度离心进行PBMC的纯化。
试验化合物
HIL-15，批号：6870-011，Immunex corp.，Seattle，Washington，USA.
hIL-2，Chiron Benelux BV，Amsterdam，The Netherlands.
所用的完全的人抗体：146B7(批次：070101)和146B7RDJW07，404A8(批次：030101)和批次(batch：080101)和作为同种型对照抗体T1(97-2B11-2B12，批次：190900)。
由抗IL-15抗体抑制由PBMC进行的人IL-15(hIL-15)或hIL-2诱 导的TNF-α生产
在hIL-2存在或缺乏以及有或无抗IL-15抗体的情况下以5×105细胞/孔将PBMC三重或四重培养于96孔平底培养板中。将同种型对照抗体(T1)包括为阴性对照。加入伴刀豆球蛋白A(2.5μg/ml，Calbiochem)作为增殖的阳性对照。于37℃和5％CO2中孵育细胞72小时。收集上清液以通过ELISA(U-CyTech，Utrecht，TheNetherlands)定量人TNF-α的量。
通过PBMC对146B7和一种同种型对照抗体对于IL-15介导的TNF-α生产的作用进行测试。146B7以一种剂量依赖的方式抑制hIL-15介导的TNF-α生产，而所述同种型对照抗体并不抑制hIL-15诱导的TNF-α生产(图4)。显示两个健康志愿者的数据。404E4和404A8不能抑制hIL-15诱导的TNF-α生产。
为了确定抗IL-15抗体的特异性，对它们对于hIL-2介导的TNF-α生产的作用进行评估。146B7没有诱导hIL-2介导的TNF-α生产的抑制(图5)。在hIL-2介导的TNF-α生产中没有见到404E4或404A8的剂量依赖的抑制。
只见到146B7对于hIL-15介导的TNF-α生产的剂量依赖性抑制，而未见到404E4和404A8的抑制。所述抑制作用对于hIL-15是特异性的；IL-2介导的TNF-α生产未被抑制。
实施例8由完全的人抗IL-15抗体抑制CTLL-2细胞和PBMC的人白介素15(hIL-15)诱导的增殖
利用下列方法使用CTLL-2细胞(Gillis等.，1978)和外周血单核细胞(PBMC)等对抗体146B7，146H5，404E4和404A8测试其抑制T细胞增殖的能力。
细胞培养
将培养物维持于RPMI-1640，所述RPMI-1640具有2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素(全部来自LifeTechnologies，Paisley，Scotland)和10％热灭活的胎牛血清(HyClone，Utah，USA)。将CTLL-2细胞(Gillis等，1978)培养于添加了36单位的hIL-2/ml(Chiron Benelux BV，Amsterdam，The Netherlands)的上述培养基中，并在实验开始之前不予补充hIL-2持续3-4天。在使用前洗涤CTLL-2细胞三次。
外周血单核细胞(PBMC)的纯化
在征得同意后从健康志愿者体内抽取新鲜人血液，加入肝素抗凝。利用Ficoll(Pharmacia，Uppsala，Sweden)通过密度梯度离心进行PBMC的纯化。
试验化合物
HIL-15，批号：6870-011，Immunex corp.，Seattle，Washington，USA.
hIL-2，Chiron Benelux BV，Amsterdam，The Netherlands.
显示于图6中的此报告中用于CTLL-2分析的抗IL-15抗体：146B7，146H5，404A8，404E4.
用于PBMC分析的抗IL-15抗体：146B7(批次：070101)，404A8(批次：030101)和404E4(批次：080101)。
由抗IL-15抗体抑制人IL-15(hIL-15)或hIL-2诱导的CTLL-2增 殖
在每个实验中，都以5×103细胞/孔在hIL-2或hIL-15存在或缺乏的情况下将细胞三重接种于96孔板中。为了评估对于增殖的作用，添加四种抗IL-15抗体的每一种。将细胞于37℃和5％CO2中孵育16小时。在收获(Harvester 96，Tomtec，Orange CT，USA)前16个小时，加入[3H]胸苷(1μCi/孔，Amersham Life Sciences，LittleChalfont，Buckinhamshire，UK)。
如在图6中所示的，如由减少的[3H]胸苷掺入所反映的，IL-15诱导的CTLL-2细胞的增殖以剂量依赖的方式被146B7和146H5所减少。404E4和404A8二者都不能够阻断hIL-15诱导的CTLL-2细胞的增殖。
由抗IL-15抗体抑制hIL-15(hIL-15)或hIL-2诱导的PBMC增殖
以5×104细胞/孔在hIL-2或hIL-15存在或缺乏的情况下将PBMC三重接种于96孔U底板中(Nunc，Nalge Nunc International，Denmark)。加入伴刀豆球蛋白A(2.5μg/ml，Calbiochem)作为增殖的阳性对照。于37℃和5％CO2中孵育细胞72小时。在收获(Harvester 96，Tomtec，Orange CT，USA)前16个小时，加入[3H]胸苷(1μCi/孔，Amersham Life Sciences，Little Chalfont，Buckinhamshire，UK)。
146B7能够剂量依赖性地抑制IL-15诱导的[3H]胸苷掺入，并且所以抑制增殖(IC50＝3.1±0.91nM)(图7)。404E4和404A8二者都不能够阻断hIL-15诱导的PBMC增殖(图8-9)。未根据以往进行的实验所获得的数据对146H5进行测试。
为了确定146B7，404E4和404A8对于IL-15抗体的特异性，还对这些抗体评估其对于hIL-2介导的增殖的作用。测试的抗IL-15抗体中没有抗体呈现出hIL-2诱导的增殖的作用(图7-9)。
实施例9人抗IL-15抗体146B7结合存在于人PBMCs上的人IL-15
试验化合物
在征得同意之后获自健康志愿者的人PBMCs。
抗体146B7(批次号MDX015)，Medarex Inc.，Annandale，NJ，USA.
146B7和人IgG的生物素化
首先将N-羟基琥珀酰亚胺基-生物素(Sigma)稀释于DMSO(最终稀释液：100mg/m1)中并且随后稀释于0.1M NaHCO3(最终稀释液：1mg/ml，Sigma)。每1mg的抗体(稀释于1ml)加入600μl的生物素溶液(避光，2小时，RT)。将抗体-生物素溶液在slide-a-lyzerTM透析盒(10,000 MWCO，Pierce，Perbio Science，Netherlands)中透析(于4℃过夜)以除去未标记的生物素。第二天，通过分光光度测定法(Ultrospec 2100pro)于OD 280nm测定生物素化抗体的浓度。
外周血的刺激
为了诱导IL-15，通过静脉穿刺从健康志愿者体内获得血液。将PBMCs培养于RPMI-1640(Biowhittaker Europe)中最多2天(37℃)，所述RPMI-1640添加了青霉素(5U/ml)，链霉素(50μg/ml)，L-谷氨酰胺(2mM)(Biowhittaker Europe)，和10％胎牛血清(Optimum C241，Multicell，Wisent Inc.)，并且用500U/ml IFNγ(Boehringer Ingelheim)进行刺激。
流式细胞分析
将细胞与RPMI 1640(Biowhittaker Europe)中的10％人AB血清(CLB，Amsterdam，Netherlands)一起预孵育，所述RPMI-1640添加了青霉素(5U/ml)，链霉素(50μg/ml)，L-谷氨酰胺(2mM)(Biowhittaker Europe)和10％胎牛血清(Optimum C241，Multicell，Wisent Inc.)。在透化(20分钟，4℃，于Cytofix/CytopermTM试剂盒中，Becton Dickinson，San Diego，CA)和于Perm/WashTM缓冲液(Cytofix/CytopermTM试剂盒)中洗涤后，通过流式细胞分析将PBMC进行IL-15的染色。通过在整个染色过程中利用Perm/WashTM缓冲液(Cytofix/CytopermTM试剂盒)实现持续性通透。在用生物素化的146B7或用生物素化的hIgG1(20μg/ml，30min，4℃)孵育细胞和在Perm/WashTM缓冲液中洗涤之后，随后将细胞与链亲和素-藻红蛋白(DAKO)一起孵育30分钟(4℃)。在通过流式细胞分析和对单核细胞门控而进行分析后，测定至少5000细胞/样品的荧光强度。数据显示刺激指数(S.I.)，它计算如下：S.I.＝(平均荧光阳性染色)/(平均荧光背景染色))。
免疫细胞化学
为了检测存在于人单核细胞之中的IL-15，由全血样品制得细胞离心制品。在将5×104细胞(200μl)离心到Superfrost-Plus显微镜载玻片(Menzel)后，将载玻片进行空气干燥(＜60min)，固定于2％低聚甲醛/PBS(8min，4℃)中，用PBS洗涤并再次进行空气干燥。在染色前，将细胞离心制品在PBS(+0.1％皂苷；PBSS)中透化，其随后在整个染色过程中被使用。为了阻断内源性过氧化物酶活性，将细胞离心制品与稀释于柠檬酸/磷酸缓冲液(pH 5.8，20min，RT)中的0.05％(v/v)过氧化氢(H2O2)一起孵育。在用PBSS洗涤之后，根据生产商的说明书(Biotin Blocking Kit，Vector Lab.，DAKO)对内源性生物素的活性进行阻断。在用PBSS洗涤之后，通过将细胞离心制品与PBSS中的10％(v/v)人合并AB血清(CLB，Amsterdam，Netherlands)一起孵育(30min)来阻断非特异性结合位点。其后，将细胞离心制品与生物素化的一抗一起孵育(60min，RT)，在用PBSS洗涤之后，与复合了生物素化的辣根过氧化物酶的链亲和素(streptABComplex/HRP，DAKO；1∶100于PBSS中，包含2％人AB血清；30min，RT)一起孵育。在PBSS中洗涤之后，将细胞离心制品与3-氨基-9-乙基咔唑(0.5mg/ml)和H2O2(0.01％)在醋酸钠缓冲液(50mM，pH 4.9)中一起孵育10分钟(RT)，以检测HRP活性。用流动的自来水洗涤细胞离心物5分钟，用苏木精(DAKO)复染1分钟，再用流动的自来水洗涤5分钟，并包埋于faramount或glycergel(DAKO)中。
流式细胞分析
146B7与IFNγ刺激的人单核细胞的结合显示于图10中。生物素化的146B7结合未刺激的单核细胞，显示在未刺激细胞中IL-15的存在。用IFNγ刺激单核细胞导致146B7与细胞的结合增强，在培养的第一天达到最大值。对照抗体hIgG1显示与未刺激单核细胞的稍许结合。用IFNγ刺激通过单核细胞上Fcγ受体的增强表达来提高hIgG1的结合。
免疫细胞化学
图11显示用146B7，或用对照抗体hIgG1的人单核细胞的染色。在用146B7孵育细胞后观察到清楚的细胞质红色染色，但用对照抗体则没有观察到。因此，146B7结合单核细胞中的hIL-15并且在用IFNγ进行刺激后这种结合得以上调。图11还显示IL-15染色主要是细胞内的。
实施例10通过免疫组织化学检测到人抗IL-15抗体146B7结合组织中的IL-15
试验化合物
人牛皮癣皮肤-在征得同意后获得组织样品。Louise Villadsen，Department of Dermatology，Gentofte University Hospital，Copenhagen，Denmark.
抗体146B7(批次号MDX015)，Medarex，Annandale，NJ，USA146B7和人IgG的生物素化
首先将N-羟基琥珀酰亚胺基-生物素(Sigma)稀释于DMSO(最终稀释液：100mg/ml)中并且随后稀释于0.1M NaHCO3(最终稀释液：1mg/ml，Sigma)。每1mg的抗体(稀释于1ml)加入600μl的生物素溶液(避光，2小时，RT)。将抗体-生物素溶液在slide-a-lyzerTM透析盒(10,000 MWCO，Pierce，Perbio Scienee，Netherlands)中透析(于4℃过夜)以除去未标记的生物素。第二天，通过分光光度测定法(Ultrospec 2100pro)于OD 280nm测定生物素化抗体的浓度。
免疫组织化学
将组织保存于-80℃直到进行分析。融解后，将组织切片固定于丙酮中(10min，RT)并进行空气干燥。为了阻断内源性过氧化物酶活性，将切片与稀释于柠檬酸/磷酸缓冲液中的0.05％(v/v)过氧化氢(H2O2)一起孵育(pH 5.8，20min，RT)。在用PBS-Tween20(PBST，0.05％v/v)洗涤之后，根据生产商的说明书(Biotin BlockingKit，Vector Lab.，DAKO)对内源性生物素的活性进行阻断。在用PBST洗涤之后，通过将组织切片与PBST中的10％(v/v)人合并AB血清(CLB，Amsterdam，Netherlands)一起孵育(30min)来阻断非特异性结合位点。吸去血清并且随后将切片与生物素化的一抗(146B7或hIgG1)一起孵育60分钟(RT)，所述抗体稀释于包含2％人AB血清的PBS中。在PBST中洗涤之后，将所有的组织切片与streptABComplex/HRP(DAKO；1∶100稀释于包含2％人AB血清的PBS中；30min，RT)。在PBST中洗涤之后，将所有组织切片与3-氨基-9-乙基咔唑(0.5mg/ml)和H2O2(0.01％)在醋酸钠缓冲液(50mM，pH 4.9)中一起孵育10分钟(RT)，以检测HRP活性。用流动的自来水洗涤细胞离心物5分钟，用苏木精(DAKO)复染1分钟，再用流动的自来水洗涤5分钟，并包埋于faramount或glycergel(DAKO)中。
结果
在用146B7染色组织切片后在牛皮癣皮肤中观察到清楚的角质细胞细胞质染色，但用对照抗体则没有观察到(图12；146B7染色获自牛皮癣斑的IL-15阳性角质细胞)。
实施例11人抗IL-15抗体146B7在SCID小鼠-人组织嵌合体中阻断IL-15：在关节炎和牛皮癣组织中炎症的显著抑制
试验化合物
滑膜组织-在征得同意后获自幼年型类风湿关节炎患者；AlexeiGrom，division of pediatric rheumatology，Children’s Hospital MedicalCenter，Cincinnati，Ohio，USA.
角质活检组织-在征得同意后获得组织样品。Louise Villadsen，Department of Dermatology，Gentofte Universlty Hospital，Copenhagen，Denmark.
抗体146B7(批次号MDX015)，Medarex Inc.，Annandale，NJ，USA用于牛皮癣实验。
抗体146B7(批次号15-00RDJW07)，Medarex Inc.，Annandale，NJ，USA用于牛皮癣实验。
在SCID小鼠-人滑膜组织嵌合体中阻断IL-15
在关节置换手术之后从幼年型类风湿关节炎患者获得新鲜滑膜组织样品。在无菌条件下收集样品。将来自完整滑膜组织样品的切碎的组织片段充分混合以确保每个制品的均匀性。将切碎的组织(2-4移植物/动物；100mg/位点)皮下移植于SCID/NOD小鼠(JacksonLaboratories)的背部。每只动物都在移植物移植的当天，以及移植后的第7、14和21天接受146B7(500μg，i.p.)。在移植后第28天将动物处死。将滑膜移植物切出并置于福尔马林上进行H&E染色。
来自SCID小鼠-人滑膜组织嵌合体的组织的H&E类色的量化(改进自Lehr等，J.Histochem.Cytochem.1997，45，1559)
在利用X10物镜(Zeiss microscope；Axiovision software)获得获自SCID小鼠-人滑膜组织嵌合体的切片的数字图像(2600×2060，jpg)后，利用Photoshop，version 6.0(Adobe Systems，Mountainview，CA)对数据进行计算机分析并减少到1300×1300像素。在每个切片中选择六个X10视野从而最佳地反映整个载玻片上组织的总体染色。在全部染色核(暗核上的magic wand，耐受度为10)的选择之后，制成选择区域的光密度曲线并记录平均染色强度(在相似/图像直方图指令的选择之后)。随后，选择背景并对染色进行量化(暗核上的magic wand，耐受度为10)。将染色强度计算为核染色与背景染色之间的差异。这被命名为具有任意单位的细胞化学指数。数据显示为平均值和s.e.m。通过斯氏t检验来分析数据。
在SCID小鼠-人牛皮癣组织嵌合体中阻断IL-15
从两位患者的牛皮癣斑中获取角质活检组织，分开并移植到C.B-17SCID(Jackson Laboratories)小鼠上。移植三周后小鼠以10mg/kg的剂量每两天接受PBS(安慰剂)，CsA(环孢霉素A)(Sandoz)持续15天，或在第一天以20mg/kg的剂量并且在第8和15天以10mg/kg的剂量接受146B7。最后一次注射后一个星期，处死小鼠，从每个异种移植物中取4mm的穿刺生物活检组织。将活检组织固定于福尔马林中进行石蜡包埋并在H&E中染色(图15)，以及用于Ki-67核抗原(图16)。
来自SCID小鼠-人牛皮癣组织嵌合体的组织的免疫组织化学类色的量 化
对于H&E染色的切片评估表皮厚度(μm)，角化不全的等级(检定等级从0到3)，上层真皮中炎性单核细胞的数目。对于Ki-67染色的切片评估循环角质细胞数/mm2切片。计算每个处理组中4只小鼠的平均值，并将来自每位患者的数据概括为平均值和s.e.m.。
SCID/RA模型
切片的显微镜观察显示最暗的染色核，所述核属于浸润细胞。所以，将核的数目(测量为相对表面积)认作对于浸润的测量。与赋形剂的治疗相比，注射146B7减少浸润到炎性滑膜组织中的细胞数目(图13a，p＜0.05)。图13B和13C显示146B7对于细胞浸润到异种移植滑膜组织的作用(图13C)，并且与赋形剂的治疗相比，显示具有暗核的细胞数目的减少(图13B)。
SCID/牛皮癣模型
图14显示用146B7或对照疗法治疗的SCID/牛皮癣小鼠。与赋形剂PBS相比，注射146B7减小牛皮癣的严重性，所述严重性是当从角质层到皮钉的起始处进行测量时通过表皮厚度进行评估的(图14A)：PBS(177.8±42.2μm)，CsA(91.0±15.2μm)，146B7(62.5±9.1μm)。当从角质层到皮钉的最深部分进行测量时也观察到表皮厚度的减小(图14B)：PBS(433.8±32.1μm)，CsA(303.8±62.9μm)和146B7(208.0±33.8μm)。另外，角化不全的等级也被146B7治疗所减轻(图14C)：PBS(1.6±0.4)，CsA(1.3±0.3)，146B7(0.5±0.3)。另外，146B7减少上真皮中炎性单核细胞的数目(图14D)：PBS(33.3±1.9单核细胞)，CsA(19.4±8.5)，146B7(16.4±0.1)。人Ki-67的表达严格地与细胞增殖相关联。在分裂间期中，抗原能够在核中专有地被检测到，而在有丝分裂中大多数蛋白复位到染色体的表面。Ki-67蛋白在细胞周期的全部活动期(G(1)，S，G(2)，和有丝分裂)中存在，而对于静息细胞(G(0))缺失的事实使得它成为一种优良的标记，用于测定给定细胞群所谓的生长比例。146B7减少Ki-67+循环角质细胞的数目(图14E)：PBS(247.9±77.0)，CsA(116.0±24.1)，146B7(73.8±9.9)。
用146B7治疗抑制炎性细胞浸润到类风湿性关节炎的人SCID模型的炎症性组织中。另外，在具有移植的人银屑斑的SCID小鼠中，与用CsA治疗相比，用146B7治疗减轻牛皮癣的严重性。事实上，用146B7治疗，人/SCID小鼠中炎症、表皮厚度、分裂的角质细胞数目以及角化不全严重性显著减少。
实施例12人抗IL-15抗体146B7识别受体结合的IL-15
试验化合物
hIgG1-人对照抗体(Sigma).
抗体146B7-Medarex Inc.，Annandale，NJ，USA，MDX015.
具有IL-15Rα的组成性表达的Raji细胞(Martin Glennie，TenovusResearch Laboratory，Southampton General Hospital，Southampton，U.K.).
146B7和人IgG的生物素化
首先将N-羟基琥珀酰亚胺基-生物素(Sigma)稀释于DMSO(最终稀释液：100mg/ml)中并且随后稀释于0.1M NaHCO3(最终稀释液：1mg/ml，Sigma)。每1mg的抗体(稀释于1ml)，加入600μl的生物素溶液(避光，2小时，RT)。将抗体-生物素溶液在slide-a-lyzerTM透析盒(10,000 MWCO，Pierce，Perbio Science，Netherlands)中透析(于4℃过夜)以除去未标记的生物素。第二天，通过分光光度测定法(Ultrospec 2100pro)于OD 280nm测定生物素化抗体的浓度。
通过ELISA检验到146B7结合于IL-15-IL-15Rα复合物上
在用IL-15Rα(R&D systems，Minneapolis，MN，USA)涂布(于室温过夜)平底微量滴定板(Greiner)之后，用PBS和鸡血清(2％，RT，60min)对板进行孵育。在PBS(+0.05％Tween 20：PBST)中洗涤之后，随后用几种未标记的IL-15的稀释液(50μl，RT，Immunex，Seattle，USA)对板进行孵育。10分钟后，将生物素化的抗体以不同浓度加入到孔(50μl)中(于室温90分钟)。在PBST中洗涤之后，用1∶10,000稀释于PBST-C(PBST和2％鸡血清)中的链亲和素-多聚-辣根过氧化物酶(CLB，Amsterdam，Netherlands)对板进行孵育(于室温60分钟)。最后，洗涤板并且随后根据生产商的方法用ABTS缓冲液中的底物ABTS(2，2’-连氮基双-3-ethylbenzthiazoline-磺酸，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)进行孵育。用2％草酸(50μl)停止颜色反应。在EL808ELISA读数器(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA)中于405nm对结合进行评估。
146B7结合Raji细胞上的IL-15-IL-15R复合物
用10％人合并AB血清(CLB，Amsterdam，Netherlands)在FACS缓冲液(PBS，0.05％BSA，0.02％NaNO3)中对Raji细胞进行预孵育(于4℃20分钟)。将Raji细胞(1-2*105细胞/ml)置于孔中，并以几种浓度加入50μl的未标记IL-15(用10％人AB血清稀释于FACS缓冲液中)。在孵育细胞30分钟(4℃)和在FACS缓冲液中洗涤两次后，将50μl的生物素化抗体(146B7或hIgG1)加到孔中(于4℃30分钟)。在FACS缓冲液中洗涤两次后，向每个孔加入50μl的链亲和素-藻红蛋白(于4℃30分钟)。在FACS缓冲液中洗涤两次后，将细胞于200μl FACS缓冲液中取出，并在利用CellQuest软件通过流式细胞术(FACS Calibur，Becton Dickinson)进行分析之后测定至少5000细胞/样品的荧光强度。数据显示刺激指数(S.I.)，其计算如下：S.I.＝(平均荧光阳性染色)/(平均荧光背景染色)。
ELISA
在ELISA中146B7结合IL-15/IL-15R复合物显示于图17中。146B7的结合随着结合于其受体上的IL-15的浓度提高而提高。没有观察到对照抗体结合IL-15或IL-15R的作用。
结合表达IL-15R的Raji细胞
146B7结合Raji细胞上的IL-15/IL-15R复合物显示于图18中。146B7以剂量依赖的方式结合IL-15/IL-15R复合物。没有观察到hIgG1结合Raji细胞上的IL-15/IL-15R复合物(图18)。
146B7能够在这种细胞因子结合于其受体上之后结合IL15。146B7结合IL-15上的不涉及结合受体的表位。
参考文献
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等同方案
只利用常规实验，本领域技术人员会认识到，或能够确定本发所述发明的具体实施方案的许多等同方案。这类等同方案为下列权利要求所包括。在独立权利要求中公开的实施方案的任何组合都在本发明的范围之内。
并入作为参者
特此将本文提到的全部出版物、专利和待审专利申请的全部内容都并入作为参考。
                               序列表
<110>Genmab A/S.et al.
<120>白介素15(IL-15)的特异性人抗体
<130>AMJ-001CP2PC
<150>10/379741
<151>2003-03-05
<150>10/374932
<151>2003-02-26
<150>US 60/314731
<151>2001-08-23
<150>US 10/226615
<151>2002-08-23
<160>31
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>390
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(390)
<400>1
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag   48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                   10                  15
tct etg aag atc tcc tgt aag gtt tct gga tacttc ttt acc acc tac    96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr
             20                  25                  30
tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tat atg   144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
         35                  40                  45
ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc   192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                  55                  60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac   240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                 70                  75                  80
ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt   288
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gcg aga ggg ggt aac tgg aac tgc ttt gac tac tgg ggc cag gga acc   336
Ala Arg Gly Gly Ash Trp Asn Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc   384
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
ctg gca                                                           390
Leu Ala
    130
<210>2
<211>130
<212>PRT
<213>人
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
 1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Ash Trp Ash Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala
    130
<210>3
<211>357
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(357)
<400>3
gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg     48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
 1               5                   10                  15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc agc     96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
             20                  25                  30
tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc     144
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
         35                  40                  45
atc tat ggt gca tcc cgc agg gcc act ggc atc cca gac agg ttc agt     192
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
     50                  55                  60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc aga ctg gag     240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
 65                  70                  75                  80
cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cgg tat ggt agc tca cac     288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Gly Ser Ser His
                 85                  90                  95
act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc agc cga act gtg gct gca     336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ser Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
cca tot gtc ttc atc ttc ccg                                         357
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
        115
<210>4
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                   80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Gly Ser Ser His
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ser Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
        115
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>5
Thr Tyr Trp Ile Gly
 1               5
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>6
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
 1               5                  10                  15
Gly
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>7
Gly Asn Trp Asn Cys Phe Asp Tyr
 1               5
<210>8
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>8
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
 1               5                   10
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人
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Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr
 1               5
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<213>人
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Gln Arg Tyr Gly Ser Ser His Thr
 1                   5
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caggtkcagc tggtgcagtc                                              20
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saggtgcagc tgktggagtc                                              20
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gaggtgcagc tggtgcagtc                                              20
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cccagcgcag cttctcttcc tcctgc                                       26
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atggaaccat ggaagcccca gcacagc                                      27
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<400>31
cgggaagatg aagacagatg                                              20

Claims (14)

1.一种分离的特异性结合人IL-15的人单克隆抗体，包含选自下列的至少一种CDR序列：
(i)SEQ ID NOs：5，6，7，8，9和10；
(ii)与在(i)中定义的序列具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；和
(iii)在(i)或(ii)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
2.权利要求1的抗体，包含
(i)SEQ ID NO：7；
(ii)与SEQ ID NO：7具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；或
(iii)在(i)或(ii)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
3.权利要求1的抗体，包含
(i)SEQ ID NOs：5和8；
(ii)SEQ ID NOs：6和9；
(iii)SEQ ID NOs：7和10；
(iv)与在(i)、(ii)或(iii)中定义的序列具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；或
(v)在(i)、(ii)、(iii)或(iv)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
4.权利要求1的抗体，包含选自下列的至少四种CDRs
(i)SEQ ID NOs：5，6，7，8，9和10；
(ii)与在(i)中定义的序列具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；和
(iii)在(i)或(ii)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
5.权利要求1的抗体，包含
(i)SEQ ID NOs：5，6，7，8，9和10；
(ii)与在(i)定义的序列具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列；或
(iii)在(i)或(ii)中定义的序列的片段，其保持特异性结合人IL-15的能力。
6.一种分离的特异性结合人IL-15的人单克隆抗体，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：2；或与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列的重链可变区。
7.一种分离的特异性结合人IL-15的人单克隆抗体，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：4；或与SEQ ID NO：4具有至少90％同源性，优选至少95％同源性，更加优选至少98％，或至少99％同源性的序列的轻链可变区。
8.一种分离的特异性结合人IL-15的人单克隆抗体，它通过特异性结合位于人IL-15的γ链相互作用域上的表位，经由IL-15Rγ-链抑制顺式信号传递，并且它抑制相邻细胞上的反式信号传递，所述相邻细胞表达γ链或β和γ链作为IL-15R或另一种细胞因子受体的部分。
9.一种分离的人单克隆抗体，它特异性结合人IL-15并干扰IL-15受体α，β和γ链组装。
10.一种分离的人单克隆抗体，它特异性结合人IL-15并抑制在相邻细胞上的组装，所述相邻细胞表达β和γ链作为IL-15受体或另一种细胞因子受体的部分。
11.权利要求9的抗体，其中所述抗体还抑制在相邻细胞上的组装，所述相邻细胞表达β和γ链作为IL-15受体或另一种细胞因子受体的部分。
12.一种治疗或预防与人IL-15的超量表达相关联的和/或其中人IL-15诱导的作用的下调或抑制是有益的病症的方法，包括以对于治疗或预防所述病症有效的量给受试者施用特异性结合人IL-15的分离的人单克隆抗体。
13.权利要求12的方法，其中所述病症选自关节炎、结缔组织病、眼科病症、神经系统病症、胃肠和肝病、变应性病症、血液系统病症、皮肤病症、肺病、恶性肿瘤、源于移植的病症、内分泌病症、血管病症、妇产科病症和感染疾病。
14.权利要求12的方法，其中所述病症选自强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、同种异体移植排斥和移植物抗宿主疾病。
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