CN1809591A - 针对炭疽芽孢杆菌保护性抗原的人单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

公开了结合炭疽保护性抗原的分离的人单克隆抗体。可以在能够通过经历V－D－J重组和同种型转换产生人单克隆抗体的多种同种型的非人转基因动物，如转基因小鼠中产生人抗体。还公开了人抗体的衍生物(例如，双特异性抗体和免疫缀合物)、含有人抗体的药物组合物、产生人抗体的非人转基因动物和杂交瘤，和使用人抗体的治疗和诊断方法。

Description

针对炭疽芽孢杆菌保护性抗原的人单克隆抗体

发明背景

炭疽(炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis))主要是驯养和野生动物，尤其食草动物，如牛、绵羊、马、骡和山羊的疾病。尽管人类中天然炭疽感染很罕见(通过与患病动物接触感染的危险为约1/100,000)，但是其引起来自生物恐怖主义的非常真实的危险。该细菌形成坚硬孢子，其耐热并且可以在天然条件下存活数十年。尽管皮肤炭疽更容易治疗，但是吸入炭疽通常导致突然的灾难性疾病，其在2-4天内的死亡率在80％以上。该疾病由于孢子的稳定性而容易传播，这可以从2002年在美国发生的5例死亡来证明。如果炭疽孢子通过恐怖主义活动传播，那么该事件将可能无法发觉，直到许多人就医或者死亡。当前的治疗，包括抗生素和疫苗，不能帮助这些受害者的大多数。

当前的炭疽感染模型教导孢子萌发后，活跃生长的细菌细胞产生含有聚-D-谷氨酸多肽的荚膜，其保护细菌免于血清的杀细菌成分和巨噬细胞以及吞噬性吞入的作用。荚膜在感染建立期间比疾病末期更重要，疾病的末期由炭疽毒素介导。该毒素是疾病的病因，由保护性抗原(PA)、致命因子(LF)和水肿因子(EF)组成。EF是钙-钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶，认为其导致与炭疽感染相关的水肿和防止免疫细胞摄入和降解细菌。LF是细胞类型特异的金属蛋白酶，其切割促分裂原活化的蛋白激酶-激酶和几种肽激素。它导致巨噬细胞死亡和释放毒素物质(例如，与脓毒性休克相关的物质，如TNF-α和IL-1)。LF是与炭疽毒性相关的主要毒性因子并且造成全身性休克和死亡。

没有一种毒素成分单独是致病的，EF和LF需要PA在宿主细胞中发挥它们的毒性效果。感染期间，从快速生长的炭疽芽孢杆菌分泌的83kDa的保护性抗原PA83蛋白质通过炭疽毒素受体(ATR)结合宿主细胞表面(Bradley等人，2001，Nature 414：225-229)。膜结合的弗林蛋白酶和/或弗林蛋白酶样蛋白酶对PA83的切割释放氨基末端20kDa PA片段，导致受体结合的63kDa PA。PA63寡聚成七聚体环形成高亲和性结合位点，其被LF和EF的氨基末端识别。受体-毒素复合体向酸性内体(endosome)的胞吞引起PA63的构象改变，从而LF或EF释放到内体。溶酶体酸化和随后受体释放促进了寡聚P63A孔(pore)的不可逆膜插入。PA63形成的孔允许LF和EF转运到胞质，在那里它们可以引起各自的毒性。

已经研究了中断PA功能的几种模式以便开发针对炭疽的治疗。导入含有具有ATR的细胞(例如，巨噬细胞)的培养基的可溶性ATR(sATR)导致PA结合sATR而不是细胞表面上的受体(Bradley等人，2003，Biochem.Pharmacol.65：309-314)，表明ATR可以用于设计炭疽治疗。已经表明称作显性阴性抑制剂(dominant negativeinhibitors，DNIs)的PA的突变形式允许当与天然PA混合时形成七聚体复合体，其不能将EF和LF注射到细胞培养物和啮齿动物模型的细胞中(Sellman等人，2001，Science 292：695-697)。针对PA产生的单克隆抗体可以减轻感染症状以及提供预防。抗体可以阻断PA对其细胞表面上受体的结合和/或可以阻断EF或LF与PA的结合。这些方法任一种都可以防止毒素进入细胞和导致破坏。尽管抗生素单独可以控制细菌繁殖，但是它们不中和毒素的作用。此外，可以将抗性工程化到细菌中，从而使得抗生素失效。

含有作为主要免疫原性组分的PA的炭疽疫苗(AVA)，可以赋予针对疾病的保护。然而，使用AVA存在若干缺点。免疫方案(例如，6次最初剂量接着是每年强化)不产生强烈的免疫学记忆。而且，缺少抗原水平的标准化导致功效在批-批之间很大程度地变化。此外，因为疫苗是无细胞培养基滤液，其含有几种细胞组分，其也可以促进局部和全身反应的高发生率。在应答疫苗产生的多克隆抗体的预防性使用中，针对PA的抗体已经显示出可在暴露于炭疽后防止疾病。已经描述了从结合PA的抗体的天然单链Fv噬菌粒文库筛选的人scFv的开发(Cirino等人，1999，Infection and Immunity 67：2957-2963)。基于这些PA结合剂能够抑制受体介导的PA对细胞的结合，针对纯化的PA83选择这些PA结合剂。然而，因为这些免疫学活性剂不是完整抗体，它们在治疗中的用途受到减小的半寿期和更低亲合力的限制，这需要更高的剂量，用于预防性治疗中尤其如此。

单克隆抗体相对抗生素具有优点，而且可以用于增强抗体功效。对于治疗活跃肺病，抗生素将不中和预先形成和释放的导致病理的毒素，而抗体可以在额外的毒素促进进一步炎症级联之前中和所述毒素。对于预防性治疗，所需的抗生素预防的持续时间为60天，其难以遵循。此外，该时间间隔可以通过单次抗体注射覆盖。此外，在真实的暴露中，抗体可以干扰保扩性免疫应答的发展，从而终止给药后不能提供保护。

因此，需要治疗炭疽感染的改进疗法，尤其针对炭疽芽孢杆菌保护性抗原的抗体，所述抗体将良好地被免疫系统耐受并且能够预防性、暴露后预防性和治疗性使用。

发明概述

本发明提供了分离的人单克隆抗体，其结合炭疽芽孢杆菌(炭疽)的保护性抗原，从而抑制其生物学活性，还提供了所述抗体的衍生物(例如，免疫缀合物、双特异性分子和单链片段(ScFv)和含有单独此类抗体或者与额外治疗联合的其他治疗组合物。还提供了使用本发明的抗体治疗和预防炭疽感染的方法和组合物。

本发明的抗体提供了治疗和预防炭疽感染的改进方法，这部分是由于抗体能够有效中和保护性抗原活性和抗体完全的人组分，其使得它们当施用于人类患者时比以前产生的其他保护性抗原抗体(例如，鼠和人源化抗体)具有显著更低的免疫原性和更多的治疗有效性和有用性。

从而，一方面，本发明提供了完全的人抗体，其以至少10⁷M^-1的表观亲和力结合炭疽芽孢杆菌保护性抗原并在毒素中和测定中以5μg/ml或更小的ED₅₀中和炭疽芽孢杆菌毒素。

另一方面，本发明提供了针对炭疽保护性抗原的人单克隆抗体，其具有一种或多种下面的特征：

(1)需要结合到Fc受体以具有中和活性；

(2)显示出对PA63比对PA83更高的亲和性；

(3)显示出选自以下的一种或多种特征：

(a)根据标准ELISA在1μg/ml，OD_405nm为0.2或更小时不结合PA83，

(b)在竞争性结合测定中不阻断炭疽致命因子或者水肿因子结合保护性抗原；

(4)不与选自鼠1G3、鼠2D5和鼠14B7的抗-PA抗体竞争结合PA63。

在具体实施方案中，所述抗体具有人重链可变区和人轻链可变区，其中人重链可变区和人轻链可变区的序列分别包含选自SEQ ID NOs：2和4、SEQ ID NOs：2和6、SEQ ID NOs：8和10、SEQ ID NOs：12和14、或者SEQ ID NOs：16和18的序列，并且包括其保守序列修饰。

在另一实施方案中，所述抗体具有含有FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列的人重链可变区和含有FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列的人轻链可变区，其中人重链可变区CDR3序列选自SEQ ID NOs：20、38、50和62，和其保守修饰；人轻链可变区CDR3序列选自SEQID NOs：26、32、44、56和68，和其保守修饰。

在再一个实施方案中，本发明的具体人抗体包括含有CDR结构域的那些抗体，所述CDR结构域具有人重和轻链CDR1区、人重和轻链CDR2区、和人重和轻链CDR3区，其包含与图1-9中所示CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列具有至少80％同源性，优选85％同源性，更优选90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。

在其他实施方案中，所述抗体具有人重链可变区和人轻链可变区，其中人重链可变区包含选自SEQ ID NOs：2、8、12和16，和与SEQ ID NOs：2、8、12和16至少80％同源的序列的氨基酸序列，人轻链可变区含有选自SEQ ID NOs：4、6、10、14和18和与SEQ ID NOs：4、6、10、14和18至少80％同源的序列的氨基酸序列。

本发明的具体治疗抗体包括人单克隆抗体(HuMab)5E8和功能等价抗体，其(a)由人重链和轻链核酸编码，所述核酸在它们的可变区分别含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中给出的核苷酸序列，和它们的保守序列修饰，或者(b)包括重链和轻链可变区，其含有分别在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中给出的氨基酸序列，和其保守序列修饰。在另一实施方案中，HuMab 5E8的轻链可变区包含分别在SEQ ID NOs：5和6中给出的核苷酸序列和氨基酸序列，包括它们的保守修饰。

本发明的另一具体治疗抗体包括人单克隆抗体2D5和功能等价抗体，其(a)由人重链和轻链核酸编码，所述核酸在它们的可变区分别含有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9中给出的核苷酸序列，和它们的保守序列修饰，或者(b)包括重链和轻链可变区，其含有分别在SEQID NO：8和SEQ ID NO：10中给出的氨基酸序列，和其保守序列修饰。

本发明的另一具体治疗抗体包括人单克隆抗体2H4和功能等价抗体，其(a)由人重链和轻链核酸编码，所述核酸在它们的可变区分别含有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13中给出的核苷酸序列，和它们的保守序列修饰，或者(b)包括重链和轻链可变区，其含有分别在SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14中给出的氨基酸序列，和其保守序列修饰。

本发明的另一具体治疗抗体包括人单克隆抗体5D5和功能等价抗体，其(a)由人重链和轻链核酸编码，所述核酸在它们的可变区分别含有SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17中给出的核苷酸序列，和它们的保守序列修饰，或者(b)包括重链和轻链可变区，其含有分别在SEQID NO：16和SEQ ID NO：18中给出的氨基酸序列，和其保守序列修饰。

本发明还包括结合抗体5E8、2D5、2H4或5D5定义的炭疽保护性能抗原上的表位和/或与抗体5E8、2D5、2H4或5D5竞争结合保护性抗原，或者具有抗体5E8、2D5、2H4或5D5显示出的其他功能结合特征的抗体。此类抗体包括特异结合保护性抗原(例如，没有与细胞表面抗原的交叉反应性)和显示出毒素中和活性的那些抗体。

在再一方面，本发明提供了编码人抗-PA抗体和其部分(例如，其可变区)的核酸分子，以及包括本发明核酸的重组表达载体，和用此类载体转染的宿主细胞。本发明还包括通过培养这些宿主细胞产生抗体的方法。编码本发明抗体的具体核酸包括抗体5E8、2D5、2H4或5D5的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了转基因非人动物，其基因组含有人重链转基因或者转染色体和人轻链转基因或者转染色体，所述动物表达结合保护性抗原的人单克隆抗体。在具体实施方案中，转基因非人动物是转基因小鼠(本文中也称作“HuMAb mouse”)。

另一方面，本发明提供了来自所述转基因非人动物，例如，转基因小鼠的分离的B细胞，其表达人抗-PA抗体。所分离的B细胞然后可以通过与永生化细胞融合永生化以提供人抗-PA抗体的来源(例如，杂交瘤)。此类杂交瘤(即，产生人抗-保护性抗原抗体)也包括在本发明范围内。

如本文例证的，本发明的人抗体可以直接从表达该抗体的杂交瘤得到，或者可以经克隆并在宿主细胞(例如，CHO细胞或者淋巴细胞)中重组表达。因此，另一方面，本发明提供了通过用炭疽芽孢杆菌保护性抗原或者表达炭疽芽孢杆菌保护性抗原的细胞免疫基因组含有人重链转基因和人轻链转基因的转基因非人动物，从而动物的B细胞产生抗体，分离B细胞，并将B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成分泌所述抗体的永生化细胞，以产生结合炭疽保护性抗原的人单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，方法包括用炭疽保护性抗原的纯化的或者富集的制备物和/或表达炭疽保护性抗原的细胞免疫HuMAb Mouse。

在再一方面，将本发明的人抗-PA抗体衍生化、连接到另一功能分子或者与另一功能分子，例如，另一肽或者蛋白质(例如，Fab’片段)共表达。例如，本发明的抗体或者抗原结合部分可以功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合等等)一个或多个其他分子实体，如另一抗体，以产生双特异性或者多特异性抗体。因此，本发明包括多种抗体缀合物、双特异性和多特异性分子，和融合蛋白质，它们都结合炭疽保护性抗原，并且可以用于将炭疽保护性抗原靶定到特定细胞。

再一方面，本发明提供了体外或体内检测样品中炭疽保护性抗原的存在，以例如，诊断炭疽感染的方法。在一个实施方案中，这通过将待试样品，以及任选的对照样品，与本发明的人单克隆抗体(或者其抗原结合部分)在允许抗体和保护性抗原之间形成复合体的条件下接触，然后检测所形成的复合体(例如，使用ELISA)来实现。当使用对照样品以及受试样品时，在两种样品中都检测到复合体，并且样品之间复合体形成中的任何统计学显著差异表明受试样品中存在保护性抗原。

另一方面，本发明提供了通过顺序步骤筛选针对炭疽保护性抗原的抗体的方法，所述顺序步骤为选择在毒素中和测定中中和炭疽毒素的一种或多种抗体，然后选择ED₅₀为0.1μg/ml或者更小的抗体，其中抗原-抗体结合亲和测定不用作任一步骤前的选择标准。

另一方面，本发明提供了含有一种或多种人抗-PA抗体以及载体的治疗和诊断组合物。在具体实施方案中，所述组合物还包括一种或多种额外的治疗剂，如保护性抗原疫苗或者针对炭疽细菌、孢子、保护性抗原、致命因子或者水肿因子的第二种抗体，或者所述第二抗体的Fab、F(ab’)₂、Fv或单链Fv片段。

另一方面，本发明提供了使用本领域公知的用于基于抗体的临床产品的任意适宜的施用途径，例如，皮下注射和静脉内途径，将本发明的人抗体以治疗有效剂量施用于患者(例如，人类受试者)以体内治疗和预防炭疽的方法。

在具体实施方案中，本发明提供了通过施用针对炭疽保护性抗原的中和抗体治疗或预防需要此类治疗的患者的方法，所述抗体的特征为(1)其需要结合到Fc受体以具有中和活性，(2)显示出对PA63比对PA83更高的亲和性，(3)显示出下列的一种或多种(a)根据标准ELISA在1μg/ml，OD_405nm为0.2或更小时不结合PA83，(b)在竞争性结合测定(例如，见Little，1996)中不阻断炭疽致命因子或者水肿因子结合保护性抗原，和(4)在0.1mg/kg到100mg/kg剂量下不与选自鼠1G3、鼠2D5和鼠14B7的抗-PA抗体竞争结合PA63。在本发明的另一具体实施方案中，可以用本发明的抗体治疗感染炭疽和表现出炭疽病的病征和/或症状的患者。

在具体实施方案中，本发明的人抗体与一种或多种额外的治疗剂共同施用，所述额外治疗剂为例如，抗生素、保护性抗原疫苗或者针对炭疽细菌、孢子、保护性抗原、致命因子或水肿因子的抗体。此类额外治疗剂可以与本发明抗体的施用同时共同施用(例如在一种组合物中或者分开)或者在抗-PA抗体的施用之前或之后施用。

根据下面的详细描述和实施例可以显而易见本发明的其他特点和优点，这些实施例不应理解为限制。本申请中所有参考文献、专利和公开的专利申请在此特别并入本文作为参考。

附图简述

图1显示了HuMab 5E8的V_H区的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。指出了CDR区。

图2显示了HuMab 5E8的V_L区(主要)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。指出了CDR区。

图3显示了HuMab 5E8的V_H区(次要)的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。指出了CDR区。

图4显示了HuMab 2D5的V_H区的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。指出了CDR区。

图5显示了HuMab 2D5的V_L区的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。指出了CDR区。

图6显示了HuMab 2H4的V_H区的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。指出了CDR区。

图7显示了HuMab 2H4的V_L区的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。指出了CDR区。

图8显示了HuMab 5D5-2E10的V_H区的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。指出了CDR区。

图9显示了HuMab 5D5-2E10的V_L区的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。指出了CDR区。

图10显示了四种不同的人抗-PA抗体对炭疽芽孢杆菌致命毒素的中和。

图11显示了通过ELISA测定的抗-PA抗体对全长保护性抗原(83kD，白色条形)和经切割的保护性抗原(63kDa，阴影条形)的结合。

图12显示HuMAb 5E8和鼠mAb 14B7对炭疽芽孢杆菌致命毒素中和的动力学分析。

图13显示使用HuMAb 5E8抗体的F(ab’)₂片段和完整5E8 mAb在抗小鼠FcRII/III单克隆抗体2.4G2存在或缺乏时比较炭疽芽孢杆菌致命毒素的中和。

图14显示使用标准ELISA测定法对HuMAb 5E8对PA63和PA83的结合的比较。

图15显示使用PA63标准ELISA，HuMAb 5E8和3种鼠mAbs之间的竞争性结合测定。

图16显示兔吸入模型中HuMAbs 5E8和5D5的功效。

图17显示兔吸入模型中更低剂量下HuMAb 5E8的功效。

图18显示在兔吸入模型中暴露后施用的HuMAb 5E8的功效。(A)暴露后24小时和5天治疗的动物。(B)暴露后48小时和6天治疗的动物。

发明详述

本发明提供了用以治疗和诊断炭疽(炭疽芽孢杆菌)的新的抗-PA抗体和改进的基于抗体的疗法。本发明的方法利用分离的人单克隆抗体，或者其抗原结合部分，所述抗体或者其抗原结合部分结合炭疽保护性抗原并抑制炭疽保护性抗原、水肿因子和/或致命因子的功能，所述方法可用于人的治疗。

本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或者IgG3抗体)或者可以仅包括抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)₂、Fv或者单链Fv片段)。在一个实施方案中，在非人转基因动物(例如，转基因小鼠)中产生了人抗体，所述非人转基因动物能够通过经历V-D-J重组和同种型转换产生针对炭疽PA的人单克隆抗体的多种同种型(例如，IgG、IgA和/或IgE)。因此，本发明的具体方面不仅包括抗体、抗体片段和其药物组合物，还包括非人转基因动物、产生单克隆抗体的B细胞和杂交瘤。本发明还包括使用本发明的抗体检测生物样品中炭疽PA的方法。还提供了使用本发明的抗体阻断或抑制炭疽PA诱导的生物学，例如，毒素相关的功能的方法并且所述方法可以用于治疗或者预防炭疽感染。

为了本发明更容易理解，在下文首先定义一些术语，额外的定义在“发明详述”中给出。

文中所用“保护性抗原”和“PA”指细菌炭疽芽孢杆菌(炭疽)产生的保护性抗原蛋白质，并且包括炭疽保护性抗原的任意变体、同种型和物种同源物，它们能够由细菌天然表达或者重组表达[见Welkos等人，Gene 69：287-300(1988)]。术语“保护性抗原”和“PA”指炭疽保护性抗原的83kD(PA83)和63kD(PA63)形式，除非术语特别限制于一种形式或者另一种形式。

在一个实施方案中，本发明的抗-PA抗体“中和”炭疽毒素(即，致命因子或者水肿因子)。文中所用“中和”和其语法上的变体指本发明抗体的活性，当抗体结合炭疽PA时，所述活性防止EF或者LF进入或者运输到易受炭疽感染的细胞中。尽管不希望被任何具体的作用机理限制，但是本发明抗体与炭疽PA的结合可以导致在感染过程期间在许多不同点防止毒素运输到细胞的细胞质中，所述不同点为例如(1)炭疽PA对细胞上ATR的结合，(2)PA83切割成PA63形式，(3)形成含有7个PA63单位的七聚体，和(4)毒素与七聚体的结合或者缔合。本发明的抗体可以通过在感染过程期间通过结合炭疽PA抑制或者阻断一个或多个不同点来中和炭疽毒素。

用于确定治疗化合物，如本发明的人抗体，能否中和炭疽毒素的体外测定法是本领域熟知的。本发明抗体的这种活性可以例如，通过毒素中和测定法(TNA)(见，例如，Little等人，1990，Infection andImmunity58：1606-1613，其描述使用毒素敏感性巨噬细胞系J774A.1，其在抗-PA抗体的存在下暴露于炭疽LF和PA的混合物，其中抗体介导的毒素的中和导致巨噬细胞的存活增加；Little等人，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.199：676-82；和Little等人，1996，Microbiology 142：707-715)测定。在进行TNA以确定本发明抗体的有效性中，测量能够实现50％细胞生存力的抗体的有效剂量(ED₅₀)。用于本发明的抗-PA抗体在小于5μg/ml，更优选小于1μg/ml，最优选小于0.1μg/ml的浓度下中和炭疽毒素。从而，如通过TNA测量的，本发明的抗体具有约0.001到5μg/ml，优选1μg/ml或更小，最优选0.1μg/ml或更小的ED₅₀。

本文所用术语“抗体”包括完整抗体和其任意抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或者其单链。“抗体”指含有通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或者其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(本文缩写为V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH₁、CH₂和CH₃。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域C_L。V_H和V_L区还可以细分成超可变区，其称作互补决定区(CDR)，其间散布更保守的称作构架区(FR)的区域。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或者因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一种组分(C1q)。

文中所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或者简称“抗体部分”)指抗体的一个或多个片段，其保留结合抗原(例如，炭疽芽孢杆菌保护性抗原)的能力。已经表明通过全长抗体的片段可以实施抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”包括的术语“结合片段”包括(i)Fab片段，其是由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，其是含有在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的FV片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由V_H结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管FV片段的两个结构域V_L和V_H由不同的基因编码，它们可以经重组方法通过合成的接头连接，所述接头使得V_L和V_H成为一条蛋白质链，其中V_L和V_H区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也预期由术语抗体的“抗原结合片段”包括。使用本领域技术人员公知的常规技术得到这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的实用性。

术语“表位”指能够结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面集簇(groupings)，如氨基酸或者糖侧链组成并且通常具有特定三维结构特征，以及特定电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下对构象表位的结合丧失，但是对非构象表位的结合没有丧失。

术语“双特异性分子”意在包括具有两种不同结合特异性的任意试剂(agent)，例如，蛋白质、肽或者蛋白质或肽复合体。例如，该分子可以结合或者与(a)细胞表面抗原和(b)另一抗-PA抗体相互作用。术语“多特异性分子”或者“异种特异性分子”意在包括具有两种以上不同结合特异性的任意试剂，例如，蛋白质、肽或者蛋白质或肽复合体。例如，该分子可以结合或者与(a)细胞表面抗原和(b)另一抗-PA抗体，和(c)至少一种其他组分相互作用。因此，本发明包括但不限于，双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子，这些分子针对细胞表面抗原，如炭疽芽孢杆菌保护性抗原和其他靶标，如另一抗-PA抗体。

术语“双特异性抗体”还包括双功能抗体(diabody)。双功能抗体是二价、双特异性抗体，其中V_H和V_L结构域在一条多肽链上表达，但是使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，从而强迫结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(见，例如，Holliger，P.，等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak，R.J.，等人(1994)Structure 2：1121-1123)。文中所用术语“异种抗体”指两种或多种抗体、抗体结合片段(例如，Fab)、其衍生物或者连接在一起的抗原结合区，它们中的至少两种具有不同特异性。这些不同特异性包括对另一种炭疽抗原的结合特异性。

文中所用术语“人抗体”意在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或者位点特异诱变或者体内体细胞突变导入的突变)。然而，文中所用术语“人抗体”不意在包括这样的抗体，所述抗体中来源于另一哺乳动物物种(例如，小鼠)种系的CDR序列已经嫁接到人构架序列上。

文中所用术语“单克隆抗体”或者“单克隆抗体成分”指单一分子成分的抗体分子的制备物。单克隆抗体成分显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”指显示出单一结合特异性的抗体，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，所述杂交瘤包括从转基因非人动物，例如，转基因小鼠中获得的、与永生化细胞融合的B细胞，所述动物的基因组包含人重链转基因和轻链转基因。

文中所用术语“重组人抗体”意在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如(a)从对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(在下面的章节I中进一步描述)，(b)使用转染到宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，(c)从重组、组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任意其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体可以进行体外诱变(或者当使用对于人Ig序列为转基因的动物时，体内体细胞诱变)从而重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列为这样的序列，其尽管来源于或者与人种系V_H和V_L序列相关，但是不天然体内存在于人抗体种系所有组成成分中。

文中所用的“异源抗体”是针对产生此类抗体的转基因非人生物体定义的。该术语指抗体的氨基酸序列或者其编码核酸序列相应于不由该转基因非人动物组成的生物体中发现的氨基酸序列或者其编码核酸序列，并且通常来自不同于该转基因非人动物的物种。

文中所用“异种杂合抗体”指具有不同生物体来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链结合的人重链的抗体是异种杂合抗体。异种杂合抗体的实例包括上文讨论的嵌合和人源化抗体。

文中所用“分离的抗体”意在指抗体，其基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，结合保护性抗原的分离的抗体基本上没有结合不同于保护性抗原的抗原的抗体)。然而，结合炭疽保护性抗原的表位、同种型或者变体的分离的抗体与例如，来自其他细菌物种的其他相关抗原(例如，保护性抗原物种同源物)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞物质和/或化学品。在本发明的一个实施方案中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体的组合被组合在意义明确的组合物中。

文中所用“特异结合”指本发明的抗-PA抗体结合炭疽保护性抗原。通常，抗体以至少约1×10⁷M^-1的亲和力结合，并且结合保护性抗原的亲和力比结合保护性抗原或者密切相关抗原之外的非特异抗原(例如，BSA、酪蛋白)的亲和力大至少2倍。短语“识别保护性抗原的抗体”和“保护性抗原特异抗体”与术语“特异结合保护性抗原的抗体”在本文中互换使用。

文中所用术语IgG抗体的“高亲和性”指至少约10⁷M^-1，优选至少约10⁸M^-1，更优选至少约10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1或更大，例如高达10¹³M^-1或更大的结合亲和力。然而，其他抗体同种型的“高亲和性”结合可以不同。例如，IgM同种型的“高亲和性”结合指至少约10⁷M^-1的结合亲和力。

文中所用术语“K_assoc”或者“K_a”意在指具体抗体-抗原相互作用的结合常数。

文中所用术语“K_dis”或者“K_d”意在指具体抗体-抗原相互作用的解离常数。

文中所用“同种型”指重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。本发明的分离的人抗体可以是任意抗体同种型，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、和IgE。

文中所用“同种型转换”指抗体的类别或者同种型从一种Ig类别改变成其他Ig类别之一的现象。

如文中所用，“非转换的同种型”指当没有发生同种型转换时产生的重链的同种型类别；编码非转换的同种型的CH基因通常是功能重排的VDJ基因的紧邻下游的第一个CH基因。已经将同种型转换分类为典型或非典型同种型转换。通过重组事件发生典型同种型转换，所述重组事件包括转基因中的至少一个转换序列区。通过例如，人σ_μ和人∑_μ(δ相关的缺失)之间的同源重组可以发生非典型同种型转换。备选的非典型转换机理，如转基因间和/或染色体间重组等等也可以发生并且实现同种型转换。

文中所用术语“转换序列”指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体”序列(通常是μ转换区)将是转换重组期间待缺失的构建体区的5’(即上游)。“转换受体”区将为待缺失的构建体区和替换恒定区(例如，γ、ε等)之间。由于重组通常发生的地方没有特异位点，最终基因序列将通常不可从构建体预测。

文中所用“糖基化模式”定义为共价连接到蛋白质，更具体地是连接到免疫球蛋白的糖单位的模式。异源抗体的糖基化模式特征可以为与非人转基因动物的物种产生的抗体上天然发生的糖基化模式基本上相似，此时本领域技术人员将认识到异源抗体的糖基化模式比转基因的CH基因所来源的物种更相似于非人转基因动物物种中糖基化模式。

应用于物体的文中所用术语“天然发生的”指物体可以在自然中找到。例如，存在于生物体(包括病毒)中可以从天然来源分离并且没有由实验人员有意修饰的多肽或者多核苷酸序列是天然发生的。

文中所用术语“重排的”指重链或者轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V片段位置紧邻D-J或者J片段，它们处于分别编码基本上完整V_H或V_L结构域的构象中。通过与种系DNA比较可以鉴定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源元件。

术语“未重排的”或者“种系构型”在文中用于V片段时指这样的构型，其中V片段未重组从而与D或者J片段紧密相邻。

文中所用术语“核酸分子”意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选双链DNA。

文中所用术语“分离的核酸分子”当用于编码结合保护性抗原的抗体或者抗体部分(例如，V_H、V_L、CDR3)的核酸时，指核酸分子，其中编码抗体或者抗体部分的核苷酸序列没有编码结合不同于保护性抗原的抗原的抗体或者抗体部分的其他核苷酸序列，所述其他核苷酸序列可以天然地在人基因组DNA中所述核酸的侧翼。在一个实施方案中，人抗-PA抗体，或者其部分具有5E8(和5E8’)、2D5、2H4、5D5的核苷酸和氨基酸序列，或者具有分别在SEQ ID NOs：1和2、7和8、11和12、15和16中所示的核苷酸和氨基酸序列的重链(V_H)可变区，或者具有分别在SEQ ID NOs：3和4、5和6、9和10、13和14、和17和18中所示的核苷酸和氨基酸序列的轻链(V_L)可变区。本领域普通技术人员将明白抗体5E8和5E8’具有相同重链，而它们的轻链不同，其中5E8具有分别在SEQ ID NO：3和4中所示的核苷酸和氨基酸序列的轻链(V_L主要)可变区，5E8’具有分别在SEQ ID NO：5和6中所示的核苷酸和氨基酸序列的轻链(V_L次要)可变区。来自5E8杂交瘤的这些抗体都结合炭疽保护性抗原和中和TNA中炭疽毒素。

如本文公开和要求保护的，SEQ ID NO：1-72中给出的序列包括“保守序列修饰”，即，核苷酸和氨基酸序列修饰，其中所述修饰不显著影响或者改变所述核苷酸序列编码或者含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸替换、加入和缺失。通过本领域中公知的标准技术，如定点诱变和PCR-介导的诱变可以向SEQ ID NOs：1-72中导入修饰。保守氨基酸替换包括其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基代替的替换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。从而，人抗-PA抗体中预测的非必需氨基酸残基优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基代替。

备选地，在另一实施方案中，可以沿着全部或部分抗-PA抗体编码序列通过例如饱和诱变随机导入突变，并且可以筛选所得经修饰的抗-PA抗体的结合活性。

因此，本文公开的(重和轻链可变区)核苷酸序列编码和/或含有本文公开的(重和轻链可变区)氨基酸序列(即，SEQ ID NO：1-18)的抗体包括由已经经保守修饰的相似序列编码或者含有经保守修饰的相似序列的基本上相似的抗体。下面提供关于基于SEQ ID NOs：1-18中公开的部分(即，重和轻链可变区)序列怎样产生此类基本上相似的抗体的进一步讨论。

对于核酸，术语“基本上同源性(substantial homology)”表示两种核酸，或者其指定的序列，当最佳比对和比较时在至少约80％核苷酸，通常至少约90％到95％，更优选至少约98％到99.5％的核苷酸中是相同的，其中利用了适宜的核苷酸插入或缺失。备选地，当片段在选择性杂交条件下与所述链的互补序列杂交时，存在基本上同源性。

两种序列之间的百分数同一性(percent identity)是序列共有的相同位置数的函数(即％同源性＝相同位置数/总位置数×100)，考虑缺口数，和每个缺口的长度，为了两条序列的最佳比对，需要导入所述缺口。两条序列之间的序列比较和百分数同一性确定可以使用数学算法，如下面的非限制性实例描述的算法来完成。

可以使用GCG软件包(在http：//www.gcg.com可以得到)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重可以确定两条核苷酸序列之间的百分数同一性。两条核苷酸和氨基酸序列之间的百分数同一性也可以利用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))(其已整合到ALIGN程序(版本2.0)中)的算法，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分12和缺口罚分4来确定。此外，使用整合到GCG软件包(在http：//www.gcg.com可以得到)的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法，用Blossum 62矩阵或者PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6、或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重可以确定两条氨基酸序列之间的百分数同一性。

本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”对公共数据库进行搜索以例如，鉴定相关序列。此类搜索可以使用Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。可以用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸搜索，以得到与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质搜索得到与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了比较目的得到带缺口的比对，可以使用如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的缺口BLAST。当利用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。见，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。

核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或者可以以部分纯化的或者基本上纯的形式存在。当通过标准技术将核酸从其他细胞组分或者其他污染物，例如，其他细胞核酸或蛋白质纯化出来时，该核酸是“分离的”或者“使得基本上纯的”，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带法、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他方法。见，F.Ausubel，等人，编著，Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。

本发明的核酸成分尽管通常是天然序列(除了经修饰的限制性位点等等)，来自cDNA、基因组或者混合物，可以根据标准技术突变本发明的核酸成分以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可以如所希望的影响氨基酸序列。具体地，预期了与本文描述的天然V、D、J、恒定序列、转换序列和其他此类序列基本上同源或者衍生于所述序列的DNA序列(其中“衍生”表示一种序列与另一序列相同或者从所述另一序列修饰得到)。

当核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，所述核酸是“有效连接的(operably linked)”。例如，启动子或者增强子如果影响编码序列的转录，那么启动子或者增强子与编码序列有效连接。关于转录调节序列，有效连接的指所连接的DNA序列相邻的(contiguous)并且，当需要连接两个蛋白质编码区时，是相邻且处于读框中。对于转换序列，有效连接表示序列能够影响转换重组。

文中所用术语“载体”意在指核酸分子，其能够转运其所连接的另一核酸。一种类型的载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，其中可以连接额外的DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)当导入宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。此类载体在本文称作“重组表达载体”(或者简称“表达载体”)。通常用于重组DNA技术中的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用的形式。然而，本发明意在包括此类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们起等价功能。

文中所用术语“重组宿主细胞”(或者简称“宿主细胞”)意在指已经导入重组表达载体的宿主细胞。应该理解此类术语意在不仅指具体主题细胞，而且指这种细胞的后代。因为由于突变或者环境影响在以后的代中可能发生某些修饰，此类后代实际上可能不与亲代细胞相同，但是仍然包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括，例如，CHO细胞和淋巴细胞。

在下面的小节中进一步详细描述本发明的多个方面。

I.产生针对炭疽芽孢杆菌保护性抗原的人抗体

通过多种技术可以产生本发明的单克隆抗体(MAbs)，所述技术包括常规单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature256：495的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交方法是优选的，但是原则上，也可以使用产生单克隆抗体的其他技术，例如，B淋巴细胞的病毒或者癌基因转化。

用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是非常成熟的方法。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域公知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是公知的。

在优选实施方案中，使用携带人免疫系统而不是鼠系统的某些部分的转基因小鼠可以产生针对保护性抗原的人单克隆抗体。这些转基因小鼠在本文中称作“HuMAb”小鼠，含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因以及失活内源μ和κ链基因座的靶定突变(Lonberg，等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠显示出小鼠IgM或κ的降低的表达，并且响应免疫，所导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性人IgGκ单克隆(Lonberg，N.等人(1994)，上文，Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546中综述)。HuMab小鼠的制备在下面的章节II中和Taylor，L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等人(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等人(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，(1994)Nature368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Taylor，L.等人(1994)International Immunology6：579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546；Fishwild，D.等人(1996)NatureBiotechnology 14：845-851中详述，将上面所有文献的内容完整引用作为本文的参考。还参见，Lonberg和Kay和GenPharm International的美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；1998年6月11日公开的WO 98/24884；1994年11月10日公开的WO94/25585；1993年6月24日公开的WO 93/1227；1992年12月23日公开的WO92/22645；1992年3月19日公开的WO 92/03918，将上面所有文献的内容完整引用作为本文的参考。备选地，实施例1的小节II中描述的HCO12转基因小鼠可以用于产生人抗-PA抗体。

HuMAb免疫

为了充分地产生针对保护性抗原的人单克隆抗体，可以用炭疽PA83或PA63或者PA83和PA63两者和/或表达保护性抗原的细胞的纯化或富集的制备物免疫HuMAb小鼠，如Lonberg，N.等人(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人(1996)NatureBiotechnology 14：845-851和WO98/24884描述。优选地，第一次灌注时小鼠将为6-16周龄。例如，Stephen Little，U.S.Army MedicalResearch Institute of Infectious Disease友情提供的保护抗原的经纯化的制备物(5-20μg)可以用于腹膜内免疫HuMAb小鼠。还可以用表达保护性抗原的转染细胞免疫小鼠以促进免疫应答。

对多种抗原积累的经历表明当用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)初次免疫，然后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内免疫(长达共6周)时，HuMAb转基因小鼠应答最佳。从后眼窝取血得到血浆样品，可以在免疫方案的过程中监视免疫应答。可以通过ELISA(如下文描述)筛选血浆，并且具有抗-PA人免疫球蛋白的足够效价的小鼠可以用于融合。可以用抗原静脉内强化小鼠，3天后处死小鼠并取出脾脏。每种抗原预计需要进行2-3次融合。将对每种抗原免疫几只小鼠。例如，可以免疫HCO7和HCO12品系的共12只HuMAb小鼠。

产生针对保护性抗原的人单克隆抗体的杂交瘤的制备

基于标准方案，分离小鼠脾细胞并用PEG融合将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后筛选所得杂交瘤的抗原特异性抗体的产生。例如，使用50％PEG，来自免疫小鼠的脾脏淋巴细胞的单个细胞悬浮物可以与P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠杂交瘤细胞(ATCC，CRL 1580)数目的1/6融合。将细胞以约2×10⁵个铺在平底微量滴定板中，然后用选择培养基孵育2周，所述选择培养基含有20％胎儿Clone Serum，18％“653”条件培养基，5％origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/ml青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)。2周后，细胞在其中用HT替换HAT的培养基中培养。然后通过ELISA对每个孔筛选人抗-PA单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤重新铺平板，再次筛选，如果对于人IgG——抗-PA单克隆抗体仍然阳性，可以通过有限稀释将杂交瘤亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。

产生针对炭疽保护性抗原的人单克隆抗体的转染瘤的制备

使用例如，本领域熟知的重组DNA技术和基因转染方法(例如，Morrison，S.(1985)Scienee 229：1202)的联合可以在宿主细胞转染瘤中产生本发明的人抗体。

例如，为了表达抗体，或者其抗体片段，编码部分或者全长轻链和重链的DNA可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增、定点诱变)产生并且可以插入表达载体中从而基因与转录和翻译控制序列有效连接。在该上下文中，术语“有效连接”意在指抗体基因连接到载体从而载体内的转录和翻译控制序列发挥它们的调节抗体基因转录和翻译的预定功能。选择载体和表达控制序列使之与所用表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到不同的载体，或者更典型地，两种基因都插入到同一表达载体。通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，通过平端连接)将抗体基因插入到表达载体中。本文描述的轻链和重链可变区可以用于产生任意抗体同种型的全长抗体基因，这可以通过将它们插入到已经编码所希望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，从而V_H片段有效连接载体内的C_H片段并且V_L片段有效连接载体内的C_L片段来实现。额外或备选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中从而信号肽连接到抗体链基因的氨基末端的框内。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调节序列描述于例如，Goeddel；GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)。本领域技术人员将理解表达载体的设计，包括调节序列的选择，取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、目的蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如启动子和/或增强子，它们来源于巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多形瘤。备选地，可以使用非病毒调节序列，如泛蛋白启动子或者β-珠蛋白启动子。

除了抗体链基因和调节序列，本发明的重组表达载体还可以携带额外的序列，如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有助于载体所导入的宿主细胞的选择(见，例如，Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择性标记基因赋予载体所导入的宿主细胞药物抗性，如针对G418、潮霉素或者氨甲蝶呤的抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞进行氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

对于轻链和重链表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染宿主细胞。术语“转染”的多种形式意在包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。尽管理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在真核细胞，最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为此类真核细胞，尤其哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠的和具有免疫学活性的抗体。已经报导抗体基因的原核生物表达不能有效产生高产量的活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。

用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DHFR选择性标记，例如，在R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，对于使用NSO骨髓瘤细胞，另一种优选的表达系统是WO87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，培养宿主足够时间以允许在宿主细胞中表达抗体或者，更优选地，分泌抗体到宿主细胞生长的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。

使用部分抗体序列表达完整抗体

抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDRs)内的氨基酸残基与靶标抗原相互作用。为此，CDRs内的氨基酸序列在不同抗体之间比CDRs外的序列更多样。因为CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体表达模拟特定天然发生的抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包括来自特定天然发生的抗体的CDR序列，其嫁接到具有不同性质的不同抗体的构架序列上(见，例如，Riechmann，L.等人，1998，Nature 332：323-327；Jones，P.等人，1986，Nature 321：522-525；和Queen，C.等人，1989，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033)。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库得到。这些种系序列将与成熟抗体基因序列不同，因为它们将不包括完整装配的可变基因，这些可变基因通过B细胞成熟期间V(D)J连接形成。种系基因序列将在整个可变区内分别均匀地与高亲和性次级所有组成部分(repertoire)抗体不同。例如，体细胞突变在构架区的氨基末端部分中相对不频繁。例如，体细胞突变在构架区1的氨基末端部分和构架区4的羧基末端部分中相对不频繁。此外，许多体细胞突变不显著改变抗体的结合性质。为此，为了再造具有与原始抗体相似的结合性质的完整重组抗体，不必要得到特定抗体的完整DNA序列(见，1999年3月12日提交的PCT/US99/05535，将其为了所有目的并入本文作为参考)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列通常对于该目的是足够的。用部分序列确定哪些种系可变和连接基因片段促进重组的抗体可变基因。然后用种系序列填充可变区的缺失部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟期间被切割并且对最终抗体的性质没有贡献。为此，必需使用相应种系前导序列用于表达构建体。为了加入缺失的序列，可以通过连接或者PCR扩增结合克隆的cDNA序列与合成寡核苷酸。备选地，完整可变区可以作为一组短的、重叠的寡核苷酸合成并通过PCR扩增组合以产生完整合成的可变区克隆。该方法具有某些优点，如消除或包括了特定限制性位点或者优化了特定密码子。

来自杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列用于设计合成寡核苷酸的重叠组以产生具有与天然序列相同的氨基酸编码能力的合成V序列。该合成的重链和κ链序列与天然序列在三方面不同：重复核苷酸碱基链被打断以方便寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak的规则(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870)掺入最佳的翻译起始位点；和HindIII位点经工程化位于翻译起始位点的上游。

对于重链和轻链可变区，优化的编码和相应非编码链序列在相应非编码寡核苷酸的约中点被打断成30-50个核苷酸。从而，对于每条链，寡核苷酸可以装配成重叠的双链组，它们跨越150-400个核苷酸的片段。然后将该库用作模板以产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。通常，一个可变区寡核苷酸组将分解成两个库，它们经单独扩增产生两种重叠的PCR产物。然后这些重叠产物经PCR扩增组合形成完整可变区。还希望在PCR扩增中包括重链或轻链可变区的重叠片段(包括κ轻链的BbsI位点或者γ重链的AgeI位点)以产生容易克隆到表达载体构建体中的片段。

然后重建的重链和轻链可变区与克隆的启动子、翻译启动、恒定区、3’未翻译的、多腺苷酸化和转录终止序列组合形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可以组合到一个载体中、共转染、顺序转染或者单独转染到宿主细胞中，然后所述宿主细胞融合形成表达两条链的宿主细胞。

用于构建人IgGκ表达载体的质粒在下文描述。构建质粒从而PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可以用于重建完整重链和轻链小基因(minigenes)。这些质粒可以用以表达完全人的、或者嵌合的IgG₁κ或IgG₄κ抗体。可以构建类似质粒用于表达其他重链同种型，或者表达含有λ轻链的抗体。

从而，在本发明的另一方面，本发明的人抗-PA抗体，例如，5E8、2D5、2H4或5D5的结构特征用于产生结构上相关的人抗-PA抗体，其保留本发明抗体的至少一种功能性质，如对保护性抗原的结合。更特别地，5E8、2D5、2H4或5D5的一个或多个CDR可与公知的人构架区和CDRs重组组合以产生本发明的额外的、重组工程化的人抗-PA抗体。

因此，另一方面，本发明提供了制备抗-PA抗体的方法，其包括：

制备抗体，其含有(1)人重链构架区和人重链CDRs，其中人重链CDRs的至少一个包含选自图1、4、6或8中所示的CDRs的氨基酸序列(SEQ ID NOs：20、22、24、38、40、42、50、52、54、62、64和66)的氨基酸序列；和(2)人轻链构架区和人轻链CDRs，其中轻链CDRs的至少一个包含选自图2、3、5、7或9中所示的CDRs的氨基酸序列(SEQ ID NOs：26、28、30、32、34、36、44、46、48、56、58、60、68、70和72)的氨基酸序列；

其中所述抗体保留结合保护性抗原的能力。可以使用如实施例中给出的标准结合测定法(例如，ELISA)测定抗体结合保护性抗原的能力。

因为本领域中熟知抗体重链和轻链CDR3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和性中起尤其重要的作用，所以，上面给出的所制备的本发明的重组抗体优选含有5E8、2D5、2H4或5D5的重链和轻链CDR3。所述抗体还可以含有5E8、2D5、2H4或5D5的CDR2。所述抗体还可以含有5E8、2D5、2H4或5D5的CDR1。本发明的抗体还可以包含CDRs的任意组合。

因此，在另一实施方案中，本发明提供了抗-PA抗体，其含有：(1)人重链构架区、人重链CDR1区、人重链CDR2区和人重链CDR3区，其中人重链CDR3区是如图1、4、6或8中所示的5E8、2D5、2H4或5D5的重链CDR3(SEQ ID NOs：20、38、50和62)；和(2)人轻链构架区、人轻链CDR1区、人轻链CDR2区和人轻链CDR3区，其中人轻链CDR3区是如图2、3、5、7或9中所示的5E8、2D5、2H4或5D5的轻链CDR3(SEQ ID NOs：26、32、44、56和68)，其中所述抗体结合保护性抗原。所述抗体可以还包含5E8、2D5、2H4或5D5的重链CDR2和/或轻链CDR2。抗体可以还包含5E8、2D5、2H4或5D5的重链CDR1和/或轻链CDR1。

上述本发明的抗体的CDR1、CDR2和/或CDR3区可以含有与本文公开的5E8、2D5、2H4或5D5的序列完全相同的氨基酸序列。然而，本领域技术人员将理解相对于5E8、2D5、2H4或5D5的确切CDR序列的一定偏差是可能的，而该抗体仍然保留有效结合保护性抗原的能力。因此，在另一实施方案中，本发明的抗体可以含有一个或多个CDR，其与5E8、2D5、2H4或5D5的一个或多个CDR具有例如95％、98％或99.5％同一性。

人单克隆抗体对保护性抗原结合的表征

为了表征本发明的人单克隆抗-PA抗体的结合，可以例如，通过ELISA试验含有抗体的样品，例如，来自经免疫的小鼠的血清。在ELISA方案的典型(但非限制性)实例中，将微量滴定板用溶于PBS的20μg/ml纯化的保护性抗原包被，然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。向每孔加入含有抗-PA抗体的血浆稀释液并在37℃孵育1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤，然后用缀合碱性磷酸酶的山羊抗人IgG Fc-特异多克隆试剂在37℃孵育1小时。洗涤后，将板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并在OD_405-650分析。优选地，得到最高效价的小鼠用于融合。

上述ELISA测定法可以用于筛选显示出与PA免疫原的阳性反应性的杂交瘤。亚克隆和进一步表征以高亲合力结合保护性抗原的杂交瘤。来自每个杂交瘤的保持亲代细胞的反应性(通过ELISA)的克隆可以被选择用于制备5-10瓶细胞库，将其保存在-140℃，用于抗体纯化。

为了纯化抗-PA抗体，所选杂交瘤可以在2升旋转瓶中生长用于单克隆抗体纯化。可以过滤和浓缩上清液，然后用蛋白质A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析。可以通过凝胶电泳和高效液相层析检查洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲液交换成PBS，并且可以使用1.43消光系数通过OD₂₈₀测定浓度。单克隆抗体可以等分试样并在-80℃保存。

为了确定所选的人抗-PA单克隆抗体是否结合独特表位，使用通过商业途径可获得的试剂(Pierce，Rockford，IL)生物素化每种抗体。可使用上述保护抗原包被的ELISA板，用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争性研究。可以用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化MAb结合。

为了确定纯化的抗体的同种型，可以进行同种型ELISAs。例如，可以用10μg/ml抗人IgG在4℃过夜包被微量滴定板的孔。用5％BSA封闭后，将板与10μg/ml单克隆抗体或者经纯化的同种型对照在室温反应2小时。然后孔与人IgG1或者人IgM-特异的碱性磷酸酶缀合的探针反应。如上述使板显色并进行分析。

可以通过蛋白质印迹进一步检验抗-PA人IgG与保护性抗原的反应性。例如，可以将PA进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜，用20％小鼠血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。可以用抗人-IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)显色。

II.产生人单克隆抗-PA抗体的转基因非人动物的产生

在另一方面，本发明提供了转基因和转染色体非人动物，如转基因或者转染色体小鼠，所述动物能够表达特异结合保护性抗原的人单克隆抗体。在具体实施方案中，本发明提供了具有包含人重链转基因的基因组的转基因或者转染色体小鼠，从而当用炭疽保护性抗原和/或表达保护性抗原的细胞免疫小鼠时，小鼠产生人抗-PA抗体。人重链转基因可以整合到小鼠的染色体DNA，如对于本文详细描述和例证的转基因，例如，HuMAb Mouse就是这样。备选地，人重链转基因可以保持在染色体外，如对于WO02/43478中描述的转染色体(例如，KM-Mouse)小鼠就是这样。此类转基因和转染色体动物能够通过经历V-D-J重组和同种型转换产生针对保护性抗原的人单克隆抗体的多种同种型(例如，IgG、IgA和/或IgE)。通过例如，经典或非经典同种型转换可以发生同种型转换。

具有异源抗体所有组成成分(repertoire)的应答外来抗原刺激的转基因或者转染色体非人动物的设计需要包含在转基因动物中的异源免疫球蛋白转基因在整个B-细胞发育途径中正确地发挥作用。这包括，例如，异源重链转基因的同种型转换。因此，构建转基因从而产生同种型转换和一种或多种下面的抗体：(1)高水平和细胞类型特异的表达，(2)功能基因重排，(3)等位基因排斥的激活和等位基因排斥的应答，(4)足够初级所有组成成分的表达，(5)信号转导，(6)体细胞高变，和(7)免疫应答期间转基因抗体基因座的显性化。

不是所有前面的标准都需要满足。例如，在其中转基因动物的内源免疫球蛋白基因座被功能性破坏的那些实施方案中，转基因不必要激活等位基因排斥。此外，在其中转基因含有功能重排的重和/或轻链免疫球蛋白基因的那些实施方案中，功能基因重排的第二个标准不是必要的，至少对于已经重排的转基因是这样的。关于分子免疫学背景，见，Fundamental Immunology.第二版(1989)，Paul William E.，编者Raven Press，N.Y.。

在某些实施方案中，可以用于产生本发明的人单克隆抗体的转基因或者转染色体非人动物在转基因动物的种系中含有重排的、未重排的或者重排和未重排联合的异源免疫球蛋白重和轻链转基因。每个重链转基因含有至少一个C_H基因。此外，重链转基因可以含有功能同种型转换序列，其能够支持转基因动物的B细胞中编码多种C_H基因的异源转基因的同种型转换。此类转换序列可以是来自作为转基因C_H基因来源的物种的种系免疫球蛋白基因座中天然发生的那些转换序列，或者此类转换序列可以来源于在接受转基因构建体的物种(转基因动物)中发生的那些序列。例如，用于产生转基因小鼠的人转基因构建体如果掺入类似于在小鼠重链基因座中天然发生的那些转换序列的转换序列，那么可以产生更高频率的同种型转换事件，因为可能小鼠转换序列对于与小鼠转换重组酶系统发挥功能来说是最优化的，而人转换序列则不是。可以通过常规克隆方法分离和克隆转换序列，或者可以由基于关于免疫球蛋白转换区序列的公开的序列信息而设计的重叠的合成寡核苷酸从头合成转换序列(Mills等人，Nucl.Acids Res.15：7305-7316(1991)；Sideras等人，Intl.ImmunoL 1：631-642(1989))。对于每个前面的转基因动物，在转基因动物B细胞的显著部分(至少10％)中发现功能重排的异源重和轻链免疫球蛋白转基因。

用于产生用于产生本发明的人单克隆抗体的转基因非人动物的转基因包括重链转基因，其包含编码至少一个可变基因片段、一个多样性基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。免疫球蛋白轻链转基因含有编码至少一个可变基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。编码轻和重链基因片段的基因片段对于转基因动物是异源的，因为它们来源于，或者对应于编码来自不由该转基因非人动物组成的物种的免疫球蛋白重和轻链基因的DNA。在本发明的一方面，构建转基因从而该个体基因片段是未重排的，即不重排从而编码功能性免疫球蛋白重或轻链。此类未重排的转基因支持V、D和J基因片段的重组(功能重排)和优选支持当暴露于保护性抗原时转基因动物内所得重排免疫球蛋白重链中掺入所有或部分D区基因片段。

在备选实施方案中，转基因含有未重排的“小基因座”(minilocus)。此类转基因通常含有C、D和J片段的大部分以及V基因片段的子集。在此类转基因构建体中，多种调节序列，例如，启动子、增强子、类别转换区、RNA加工的剪切供体和剪接受体序列、重组信号等等含有来源于异源DNA的相应序列。此类调节序列可以掺入到来自用于本发明非人动物的相同或相关物种的转基因中。例如，人免疫球蛋白基因片段可以组合到具有用于转基因小鼠的啮齿动物免疫球蛋白增强子序列的转基因中。备选地，合成的调节序列可以掺入到该转基因中，其中此类合成的调节序列不与已知在哺乳动物的基因组中天然发生的功能DNA序列同源。根据一致同意的规则(consensusrules)，例如，规定剪接受体位点或启动子/增强子基元(motif)的可接受的序列的那些规则可以设计合成的调节序列。例如，小基因座含有基因组免疫球蛋白基因座的一部分，其与天然发生的种系Ig基因座相比具有非必需DNA部分(例如，间隔序列；内含子或者其部分)的至少一个内部(例如，不在该部分的末端)缺失。

在本发明的优选实施方案中，用于产生针对保护性抗原的人抗体的转基因或者转染色体动物含有WO 98/24884的实施例12中描述的转基因的至少一个，通常2-10个，有时25-50个或更多个拷贝(例如，pHC1或者pHC2)，所述动物与含有WO 98/24884的实施例5、6、8或14中描述的轻链转基因的一个拷贝的动物交配，并且后代与WO98/24884的实施例10中描述的J_H缺失动物交配。将动物育种至对于这三种性状的每一种都为纯合型。此类动物具有下面的基因型：单拷贝(每单倍体染色体组)人重链未重组的小基因座(WO 98/24884的实施例12中描述)、单拷贝(每单倍体染色体组)未重排的人K轻链构建体(WO 98/24884的实施例14中描述)，和每个内源小鼠重链基因座上的缺失，其除去所有功能J_H片段(WO 98/24884的实施例10中描述)。这些动物与对J_H片段缺失纯合的小鼠(WO 98/24884的实施例10中描述)交配产生对J_H缺失纯合和对人重和轻链构建体半合的后代。所得动物用抗原注射并用于产生针对这些抗原的人单克隆抗体。

从这种动物分离的B细胞关于人重和轻链是单特异的，因为它们含有每个基因的仅一个拷贝。此外，它们将对于人或者小鼠重链是单特异的，因为通过如WO 98/24884的实施例9和12中描述的导入跨越JH区的缺失，两个内源小鼠重链基因拷贝是非功能的。此外，大部分B细胞将对于人或者小鼠轻链是单特异的，因为重排的人κ轻链基因的单拷贝的表达将在等位基因和同种型上排斥显著部分的B细胞中内源小鼠κ和λ链基因的重排。

优选的转基因和转染色体非人动物，例如，小鼠，将表现出具有大部分所有组成成分的免疫球蛋白产生，理想地基本上与天然小鼠的相似。从而，例如，在其中内源Ig基因已经失活的实施方案中，总免疫球蛋白水平将为约0.1到10mg/ml血清，优选0.5到5mg/ml血清，理想地至少约1.0mg/ml。当能够实现从IgM到IgG的转换的转基因已经导入转基因小鼠时，成年小鼠血清IgG与IgM的比例优选约10∶1。IgG与IgM的比例将在未成熟小鼠中低得多。通常，大于约10％，优选40到80％脾脏和淋巴结B细胞专一地表达人IgG蛋白质。

所有组成成分将理想地接近天然小鼠中显示的，通常至少高达约10％，优选25到50％或更高。通常，将产生至少约1000个不同的免疫球蛋白(理想地IgG)，优选10⁴到10⁶或更多，这主要取决于导入小鼠基因组的不同V、J和D区的数目。这些免疫球蛋白将通常识别约半数或更多高度抗原性蛋白质，例如，葡萄球菌蛋白质A。通常，免疫球蛋白将显示出对预先选择的抗原低于10^-7M，如低于10^-8M、10^-9M或10^-10M，或更低的亲和性(K_D)。在一些实施方案中，优选产生这样的非人动物，其具有预定的所有组成成分以限制抗体应答预定抗原类型所代表的V基因的选择。具有预定所有组成成分的重链转基因可以含有例如，人V_H基因，其优选用于对人体中预定抗原类型的抗体应答。备选地，某些V_H基因由于多种原因(例如，编码对预定抗原高亲和性V区的低可能性；经历体细胞突变和亲和力加强(sharpening)的低倾向性；或者对于某些人为免疫原性的)可以排除于限定的所有组成成分之外。从而，含有多种重或轻链基因片段的转基因重排之前，此类基因片段可以容易地通过例如，杂交或者DNA测序鉴定，其来自不同于所述转基因动物的生物体物种。

上述转基因和转染色体非人动物，例如，小鼠，可以用例如，保护性抗原和/或表达保护性抗原的细胞的纯化或重组的制备物免疫。备选地，可以用编码人保护性抗原的DNA免疫转基因动物。该动物然后将产生B细胞，其通过转基因内转换重组(顺式转换)经历类别转换并表达与保护性抗原反应的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是人抗体(也称作“人序列抗体”)，其中重和轻链多肽由人转基因序列编码，所述人转基因序列可以包括从体细胞突变和V区重组连接衍生的序列，以及种系编码的序列；这些人抗体可以称作与人V_L或V_H基因片段和人J_L或D_H和J_H片段编码的多肽序列基本上相同，尽管由于体细胞突变和差别V-J和V-D-J重组结合的结果可以存在其他非种系序列。每种抗体链的可变区通常为人种系V、J编码至少80％，并且对于重链，则为D基因片段编码至少80％；经常至少85％可变区由存在于转基因上的人种系序列编码；通常90或95％或更多可变区序列由存在于转基因上人种系序列编码。然而，因为体细胞突变和VJ和VDJ结合导入非种系序列，人序列抗体将经常具有某些可变区序列(和更不频繁的恒定区序列)，其不由小鼠的种系中的人转基因中发现的人V、D或J基因片段编码。通常，此类非种系序列(或者个体核苷酸位置)将在CDRs内或附近聚簇，或者在其中公知体细胞突变聚簇的区域中聚簇。

结合预定抗原的人抗体可以从同种型转换得到，从而产生含有人序列γ链(如γ1、γ2a、γ2B或γ3)和人序列轻链(如κ)的人抗体。此类同种型转换的人抗体通常含有一个或多个体细胞突变，通常在可变区和经常在CDR的约10个残基内含有所述体细胞突变，所述突变是由于亲和力成熟和抗原，尤其二次(或随后)抗原刺激后对B细胞的选择导致的。这些高亲和性人抗体可以具有低于10^-7M，如低于10^-8M、10^-9M或10^-10M、或更低的结合亲和性(K_D)。

本发明的另一方面包括来于与本文描述的转基因或者转染色体非人动物的B细胞。B细胞可以用于产生表达人单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体以高亲和力(例如，低于10^-7M)结合人保护性抗原。从而，在另一实施方案中，本发明提供了杂交瘤，其产生具有低于10^-7M，如低于10^-8M、10^-9M或10^-10M、或更低的亲和性(K_D)的人抗体，所述亲和性可以通过表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE3000仪器中使用重组人保护性抗原作为分析物和抗体作为结合人保护性抗原的配体来测定，其中抗体含有：

人序列轻链，其组成为(1)轻链可变区，其多肽序列与人V_L基因片段和人J_L片段编码的多肽序列基本上相同，和(2)轻链恒定区，其多肽序列与人C_L基因片段编码的多肽序列基本上相同；和

人序列重链，其组成为(1)重链可变区，其多肽序列与人V_H基因片段，任选D区和人J_H片段编码的多肽序列基本上相同；和(2)恒定区，其多肽序列与人C_H基因片段编码的多肽序列基本上相同。

通过如下方法可以促进针对保护性抗原的高亲和性人单克隆抗体的开发，所述方法用于扩大具有包含整合的人免疫球蛋白转基因的基因组的转基因非人动物中人可变区基因片段的所有组成成分，所述方法包括向基因组导入V基因转基因，其含有不存在于所述整合的人免疫球蛋白转基因中的V区基因片段。通常，V区转基因是酵母人工染色体，其含有一部分人V_H或V_L(V_K)基因片段排列(array)，其可以天然存在于人基因组或者可以通过重组方法一起单独剪接，其可以包括次序颠倒的或者缺失的V基因片段。通常在该YAC上含有至少5个或更多功能性V基因片段。在该变通方案中，可能得到通过V所有组成成分扩大方法产生的转基因动物，其中该动物表达免疫球蛋白链，其包含存在于V区转基因上的V区基因片段编码的可变区序列和人IgG转基因上编码的C区。通过V所有组成成分扩大方法，可以产生具有至少5种不同V基因的转基因动物；因为动物可以含有至少约24个V基因或更多。某些V基因片段可以是非功能的(例如，假基因等等)；这些片段可以被保持或者如果希望，可以通过技术人员可利用的重组方法选择性缺失。

一旦小鼠种系经工程化而含有具有扩大的V片段所有组成成分的功能性YAC，所述V片段所有组成成分基本上不存在于含有J和C基因片段的人Ig转基因中，那么所述性状可以增殖并育种到其他遗传背景中，所述背景包括其中具有扩大的V片段所有组成成分的的功能性YAC育种到具有不同人Ig转基因的非人动物种系的背景。具有扩大的V片段所有组成成分的多种功能YAC可以育种到种系中与人Ig转基因(或者多种人Ig转基因)一起工作。尽管本文中被称为YAC转基因，但是此类转基因当整合到基因组中时可以基本上缺少酵母序列，如酵母中自主复制所需的序列；当酵母中复制不再必需时(即导入小鼠ES细胞或者小鼠前合子(prozygote)中之前)，此类序列可以任选通过基因工程(例如，限制性消化和脉冲场凝胶电泳或者其他适宜的方法)除去。增殖人序列免疫球蛋白表达的性状的方法包括育种具有人Ig转基因和任选还具有扩大的V片段所有组成成分的功能YAC的转基因动物。V_H和V_L基因片段可以存在于YAC上。从业者可以将转基因动物育种成任意希望的背景，包括含有其他人转基因的背景，所述转基因包括人Ig转基因和/或编码其他人淋巴细胞蛋白质的转基因。本发明还提供了具有扩大的V区所有组成成分的YAC转基因的转基因小鼠产生的高亲和性人序列免疫球蛋白。尽管前面描述了用于产生本发明的人单克隆抗体的转基因动物的优选实施方案，但是设想了其他实施方案，它们可以分成四类：

I.含有未重排的重和重排的轻免疫球蛋白转基因的转基因动物；

II.含有未重排的重和未重排的轻免疫球蛋白转基因的转基因动物；

III.含有重排的重和未重排的轻免疫球蛋白转基因的转基因动物；

IV.含有重排的重和重排的轻免疫球蛋白转基因的转基因动物。

在这些类别的转基因动物中，优选顺序如下：II＞I＞III＞IV，其中内源轻链基因(或者至少K基因)已经通过同源重组(或者其他方法)敲除；和I＞II＞III＞IV，其中内源轻链基因未被敲除并且必需通过等位基因排斥显性化(dominated)。

III.结合保护性抗原的双特异性/多特异性分子

在本发明的再一个实施方案中，针对保护性抗原的人单克隆抗体或者其抗原结合部分可以衍生化或者连接另一功能分子，例如，另一种肽或者蛋白质(例如，Fab’片段)以产生结合多个结合位点或靶表位的双特异性或者多特异性分子。例如，本发明的抗体或者抗原结合部分可以功能地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方法)一个或多个其他结合分子，如另一种抗体、抗体片段、肽或者结合模拟物。

因此，本发明包括双特异性和多特异性分子，它们含有对保护性抗原的至少一种第一结合特异性和对第二种靶表位的第二种结合特异性。

在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体，或者其抗体片段，包括例如，Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv或者单链Fv。该抗体还可以是轻链或者重链二聚体，或者其任意最小片段，如1990年8月7目授权的Ladner等人的美国专利号4,946,778中描述的Fv或者单链构建体，将该专利的内容特别并入本文作为参考。

尽管优选人单克隆抗体，但是可以用于本发明的双特异性或者多特异性分子的其他抗体为鼠、嵌合的和人源化单克隆抗体。

嵌合小鼠-人单克隆抗体(即，嵌合抗体)可以通过本领域公知的重组DNA技术产生。例如，将编码鼠(或者其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因用限制酶消化以除去编码鼠Fc的区域，并且替代为编码人Fc恒定区的基因的等价部分(见Robinson等人，国际专利公开PCT/US86/02269；Akira，等人，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等人，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人，国际申请WO 86/01533；Cabilly等人美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利申请125,023；Better etal.(1988 Science 240：1041-1043)；Liu etal.(1987)PNAS84：3439-3443；Liu等人，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等人，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood等人(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等人，1988，J.Natl Cancer Inst.80：1553-1559)。

通过将不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列用来自人Fv可变区的等价序列替换可以进一步人源化嵌合抗体。人源化嵌合抗体的一般综述由Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207和Oi等人，1986，BioTechniques 4：214提供。那些方法包括分离、操作和表达核酸序列，其编码来自至少一条重链或轻链的所有或部分免疫球蛋白Fv可变区。此类核酸的来源是本领域技术人员熟知的并且例如，可以从7E3得到，7E3是产生抗-GPII_bIII_a抗体的杂交瘤。编码嵌合抗体或者其片段的重组DNA可以随后克隆到适宜的表达载体中。适宜的人源化抗体可以任选地通过CDR替换产生。见美国专利5,225,539；Jones等人1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等人1988Science 239：1534；和Beidler等人1988 J.Immunol.141：4053-4060。

具体人抗体的所有CDR可以用至少一部分非人CDR替换，或者仅一些CDR可以用非人CDR替换。仅必须替换人源化抗体结合Fc受体所需的那些CDRs。

可以通过任意方法人源化抗体，所述方法能够用来自非人抗体的CDR替换人抗体的至少一部分CDR。Winter描述了用于制备本发明的人源化抗体的方法(英国专利申请GB2188638A，1987年2月26日申请)，将该申请的内容特别并入本文作为参考。使用国际申请WO94/10332标题为“Humanized Antibodies to Fc Receptors forImmunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes”的寡核苷酸定点诱变可以用非人CDR替换人CDR。

本发明范围还包括嵌合的和人源化抗体，其中已经替换、缺失或加入的特定氨基酸。具体地，优选的人源化抗体在构架区具有氨基酸替换，从而提高对抗原的结合。例如，在具有小鼠CDR的人源化抗体中，位于人构架区中的氨基酸可以用位于小鼠抗体内的相应位置的氨基酸替换。已知某些情况中此类替换提高人源化抗体对抗原的结合。其中已经加入、缺失或替换氨基酸的抗体在本文中称作经修饰的抗体或者经改变的抗体。

术语经修饰的抗体还意在包括已经通过例如缺失、加入或者替换抗体的部分而修饰的抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如，可以通过缺失恒定区并将其用旨在增加抗体的半寿期，例如，血清半寿期、稳定性或亲和力的恒定区替换而进行修饰。只要双特异性和多特异性分子具有对FcγR特异的至少一个抗原结合区并引发至少一种效应功能，那么任一修饰就在本发明的范围内。

使用化学技术(见，例如，D.M.Kranz等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5807)、“polydoma”技术(见Reading的美国专利4,474,893)或者重组DNA技术可以产生本发明的双特异性和多特异性分子。

具体地，使用本领域公知的和本文提供的实施例中描述的方法，通过缀合成分结合特异性，例如，抗-FcR和抗-PA特异性可以制备本发明的双特异性和多特异性分子。例如，可以单独产生双特异性和多特异性分子的每种结合特异性然后将它们相互缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联或者交联剂可以用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5’5-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸硫代琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)(见，例如，Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等人(Science(1985)229：81-83)，和Glennie等人(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)描述的方法。优选的缀合试剂是SATA和sulfo-SMCC，它们都可以从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)得到。

当结合特异性是抗体(例如，两种人源化抗体)时，它们可以通过两条重链的C-末端铰链区的巯基键合缀合。在尤其优选的实施方案中，在缀合前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基，优选一个巯基残基。

备选地，两种结合特异性可以在相同载体中编码并且在同一宿主细胞中表达和装配。该方法尤其可用于其中双特异性和多特异性分子是MAb x MAb、MAb x Fab、Fab x F(ab′)₂或配体xFab融合蛋白质的情况。本发明的双特异性和多特异性分子，例如，双特异性分子可以是单链分子，如单链双特异性抗体、含有单链抗体和结合决定簇的单链双特异性分子，或者含有两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子还可以是单链分子或者可以含有至少两个单链分子。制备双特异性和多特异性分子的方法在例如，美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中描述。

双特异性和多特异性分子对它们的特异靶标的结合可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，毒素中和测定)或者蛋白质印迹测定来证实。这些测定法的每一种通常通过利用对目的复合体特异的标记试剂(例如，抗体)检测特定目的蛋白质-抗体复合体的存在。例如，可以使用例如，识别并特异结合抗体-FcR复合体的酶联抗体或者抗体片段检测FcR-抗体复合体。备选地，使用多种其他免疫测定法的任一种检测复合体。例如，抗体可以经放射活性标记并用于放射免疫测定法(RIA)(见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，TheEndocrine Society，March，1986，将其并入本文作为参考)。通过例如使用γ计数器或者闪烁计数器或者通过放射自显影可以检测放射性同位素。

V.药物组合物

另一方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，所述组合物含有与可药用载体一起配制的一种人抗-PA单克隆抗体或者其抗原结合部分或者所述抗体或其抗原结合部分的组合。从而，在一个实施方案中，该组合物包括多种(例如，两种或多种)本发明的分离的人抗-PA抗体或者其抗原结合部分的组合。优选地，组合物的每种抗体或者其抗原结合部分结合保护性抗原的不同的、预先选定的表位。

文中所用的“可药用的载体”包括生理上相容的任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂，等等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊椎或者表皮施用(例如，通过注射或灌注)。取决于施用途径，活性化合物，即，抗体、双特异性和多特异性分子可以包衣在保护化合物免受酸和可以使该化合物失活的其他天然条件的材料中。

“可药用盐”指保持亲本化合物的所希望的生物活性并且不产生任何不希望的毒理学效果的盐(见，例如，Berge，S.M.，等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自非毒性无机酸和非毒性有机酸的盐，所述非毒性无机酸为例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等等，所述非毒性有机酸为例如，脂族单-和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸，等等。加碱盐包括衍生自碱土金属的盐，所述碱土金属为例如钠、钾、镁、钙等等，以及衍生自无毒有机胺的盐，所述无毒有机胺为例如，N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等等。

本发明的组合物可以通过本领域公知的多种方法施用。如本领域技术人员将明白的，施用途径和/或方式将随所希望的结果而变。可以用保护化合物防止快速释放的载体制备活性化合物，如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂，和微囊化递送系统。也可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoesters)、和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已经申请专利或者是本领域技术人员公知的。见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

为了通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能必需将化合物用防止其失活的材料包衣或者将化合物与所述材料共同施用。例如，可以将化合物以适宜的载体，例如，脂质体或者稀释剂施用于受试者。可药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。

可药用载体包括无菌水性溶液或者分散剂或者用于临时制备无菌注射液或者分散剂的无菌粉剂。用于药学活性物质的此类介质和活性剂的使用是本领域公知的。除了迄今与活性化合物不相容的介质或者活性剂之外，设想所述介质和活性剂用于本发明的药物组合物中。补充性活性化合物也可以掺入组合物中。

治疗组合物通常必须是无菌的和在生产和保存条件下是稳定的。组合物可以配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或者适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或者分散介质，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇，和液态聚乙二醇等等)，和它们的适宜的混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂，对于分散剂通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂可以保持适宜的流动性。在许多情况中，组合物中将优选包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇或者氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的介质，例如单硬脂酸盐和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。

可以通过将活性化合物以所需要的量与上面列举的一种成分或成分的组合掺入适宜溶剂，如果需要，随后进行无菌微滤，可以制备无菌注射液。通常，将活性化合物掺入含有基本分散介质和上面列举的所需的其他成分的无菌载体中可以制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冰冻干燥(冻干)，其产生活性成分以及来自其以前的无菌过滤溶液的额外的所希望的成分的粉末。

调节剂量方案以提供最优的所希望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次快速浓注(bolus)，几个分开的剂量可以随时间施用或者根据治疗情况的紧急性成比例地减小或者增加剂量。特别有利的是配制易于施用和剂量的统一的剂量单位形式的肠胃外组合物。本文所用的剂量单位形式指适于作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，所述量经计算与所需的药物载体结合产生所希望的疗效。本发明的剂量单位形式的说明受支配于并且直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和将实现的特定疗效，和(b)本领域配制用于治疗个体中敏感性的活性化合物的内在限制。

可药用抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化基金，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，如ascorbyl palmitate、丁化羟基苯甲醚(BHA)、丁化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。

对于治疗组合物，本发明的制剂包括适于经口、经鼻、局部(包括口含和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域公知的任意方法制备。可以与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量将随所治疗的受试者和具体施用方式而变。可以与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量通常是产生疗效的组合物的量。通常，以百分数表示，所述量将为约0.01％到约99％活性成分，优选约0.1％到约70％，最优选约1％到约30％。

适于阴道施用的本发明制剂还包括阴道栓剂、棉球、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂、或者喷雾制剂，这些制剂含有本领域公知适宜的载体。本发明组合物的局部或者透皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与可药用载体，和任意防腐剂、缓冲剂、或者可能需要的推进剂混合。

短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”在本文中用于指不同于经肠和局部施用的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和灌注。

可以用于本发明的药物组合物的适宜的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)、和它们的适宜混合物、植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料，如卵磷脂，对于分散剂通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂可以保持适宜流动性。

这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过上文消毒步骤和通过包括多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等可以确保防止微生物的存在。还希望组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等等。此外，通过包括延迟吸收的介质，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射药物形式的吸收。

当本发明的化合物作为药物施用于人和动物时，它们可以单独给药或者作为药物组合物给药，所述药物组合物含有例如，0.01到99.5％(更优选0.1到90％)活性成分联合可药用的载体。

不管所选的施用途径，可以以适宜水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员公知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变从而得到活性成分的量，其有效实现具体患者、组合物和施用方式的所希望的治疗应答而对该患者无毒。所选剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括所用的本发明的具体组合物或者其酯、盐或者酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排出速率、治疗持续时间、与所用的具体组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和以前的病史，和医学领域中熟知的类似因素。

本领域普通医生或兽医可以容易地确定和规定所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以药物组合物中所用本发明的化合物的低于实现所希望的疗效所需剂量水平的剂量开始，并逐渐增加剂量直到实现希望的效果。通常，本发明组合物的适宜的日剂量为有效产生疗效的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量将通常取决于上面描述的因素。

任意肠胃外施用方式适于用于本发明。优选施用是静脉内、肌内、腹膜内或者皮下的，优选接近靶标部位施用。如果希望，治疗组合物的有效日剂量可以在一天中以适宜的间隔，任选以单位剂型，以两次、三次、四次、五次、六次或更多小剂量分开施用。尽管可能仅施用本发明的化合物，但是优选以药物制剂(组合物)施用所述化合物。

可以用本领域公知的医学装置施用治疗组合物。例如，在优选实施方案中，可以用无针皮下注射装置，如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置施用本发明的治疗组合物。可用于本发明的熟知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了以可控速率分配药物的可植入的微型灌注泵；美国专利号，486,194，其公开了通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确灌注速率递送药物的药物灌注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流可植入的灌注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。将这些专利并入本文作为参考。许多其他此类植入物、递送装置和模块是本领域技术人员公知的。

在某些实施方案中，可以配制本发明的人单克隆抗体以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果希望)，可以将它们以例如，脂质体配制。对于生产脂质体的方法，见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以含有选择性运输到特定细胞或器官，从而增强靶定药物递送的一个或多个部分(见，例如，V.V.Ranade(1989)J Clin.Pharmacol.29：685)。代表性靶定部分(moieties)包括叶酸或生物素(见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白质A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，可以包含本发明制剂以及所发明分子的组分的不同种类；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。在本发明的一个实施方案中，以脂质体配制本发明的治疗化合物；在更优选的实施方案中，脂质体包括靶定部分。在最优选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物通过快速浓注递送到接近所希望区域的部位，例如，炎症或者感染部位。组合物必须是流体从而可以容易地注射。它必须在生产和保存条件下是稳定的并且防止微生物如细菌和真菌的污染作用来保存。

术语“治疗有效的”用于本发明抗体的剂量时指抗体的量，其相对于未治疗的受试者减小与炭疽感染有关的病征或者症状至少约20％，优选至少约40％，更优选至少约60％，更进一步优选至少约80％，最优选完全减少。优选地，本发明抗体的治疗有效量为足以预防暴露于炭疽的受试者死亡的量。本发明抗体减小与炭疽感染相关的病征和/或症状的能力(包括防止死亡)可以在动物模型系统中评估，所述动物模型系统预测治疗人炭疽感染中抗体的功效。此类模型的实例在下文实施例6-8中描述，实施例6-8提供了用兔子进行的研究，其中将动物用炭疽感染，然后用本发明的抗体治疗。

备选地，通过在毒素中和测定中检查抗体体外中和炭疽毒素的能力可以评估本发明抗体的治疗有效量，所述毒素中和测定是本领域中熟知的并且在上文描述。本领域技术人员将能够基于诸如受试者的大小、病征和/或受试者的症状的严重性和所选的具体组合物或施用途径确定此类治疗有效量。

治疗用途的含有本发明抗体的组合物必须是无菌并且具有一定程度的流动性从而可以通过注射器递送组合物。除了水，载体还可以是等渗缓冲盐溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等等)，和它们的适宜的混合物。例如，通过使用包衣如卵磷脂，对于分散剂通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂可以保持适宜的流动性。在许多情况中，组合物中将优选包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇和氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的介质，例如单硬脂酸铝或明胶，可以产生可注射组合物的长期吸收。

当活性化合物受到如上述的适宜保护时，可以例如使用惰性稀释剂或者可同化的可食用载体经口施用化合物。

VI.本发明的用途和方法

本发明的人抗体、抗体组合物和方法具有多种体外和体内诊断和治疗效用，包括诊断、预防和治疗炭疽感染。例如，这些抗体可以施用于人类受试者以治疗和/或预防炭疽感染。此外，可以从受试者取出血液或组织样品并与本发明的抗体在允许检测样品中炭疽PA的条件下接触以便诊断受试者中的炭疽感染。文中所用术语“受试者”意在包括人和非人动物。

在具体实施方案中，抗体(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)体内用于治疗、预防或诊断炭疽感染。在一种预防用途中，受试者还没有暴露于炭疽，因此可以经历用本发明的人抗体的预防一暴露前治疗以预防炭疽感染。在另一预防用途中，已知受试者已经暴露于炭疽，但是其没有表现出疾病病征或者症状，可以经历暴露后预防性治疗以预防与炭疽疾病发展相关的病理。在治疗性治疗中，受试者已经暴露于炭疽，感染并且显示出该疾病的病征和/或症状。本发明的抗体可以用于炭疽的预防和治疗性治疗中。

例如，本发明的人抗体、抗体组合物和方法可以用于治疗已经感染(或者怀疑已经感染)炭疽芽孢杆菌和/或表现出炭疽感染的病征和/或症状的受试者。感染炭疽或可能感染的受试者的病征和/或症状是可测量的。例如，病征可以包括低pO₂(血液中氧气)、体温升高(测量到的发热)、肺检查中附加音、低血压(或者其他休克病征)、胸部X射线纵隔变宽(例如，由于肺引流淋巴结裂解)，或者与未受控制的肺部炭疽感染和毒素释放有关的通常公知的其他病征；症状可以包括呼吸短促、咳嗽、寒战、感觉发热、虚弱、深呼吸疼痛或者与一般与肺部炭疽有关的其他症状。皮肤炭疽以搔痒性丘疹或者小疱开始，丘疹或者小疱变大并腐蚀(1-2天)，剩下坏死性溃疡，随后形成中心黑色焦痂。胃肠炭疽可以导致咽喉痛的咽部病灶、dypshagia marked脖子肿胀和局部淋巴结病，或者肠感染，其特征是发热、严重腹部疼痛、大量腹水、呕血和血样腹泻。对于任意形式的炭疽，该生物从原发部位的血原性扩散可以导致出血性脑膜炎。

在一个实施方案中，本发明的抗体(例如，人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可以用于检测生物样品(例如，来自炭疽感染的受试者的血液)中的保护性抗原的水平，该水平可以与某些疾病症状相关联。这可以使用本领域公知的常规检测测定法实现，例如，通过将样品和对照样品与抗-PA抗体在允许抗体和保护性抗原形成复合体的条件下接触来实现。可以检测和比较样品和对照之间抗体和保护性抗原之间形成的复合体。

在另一实施方案中，可以初步试验本发明的抗体(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)与体外治疗或诊断用途有关的结合活性。例如，可以利用下面实施例中描述的ELISA和流式细胞术测定法试验本发明的组合物。

本发明的抗体(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)在炭疽的治疗和诊断中具有额外的效用。例如，人单克隆抗体、多特异性或双特异性分子可以用于在体内或体外引起一种或多种下面的生物活性：(1)防止炭疽毒素进入或转运到细胞；(2)防止保护性抗原与表达ATR的细胞上的ATR的结合；(3)抑制PA83切割成PA63；(4)防止形成PA七聚体；(5)阻断或减小毒素(水肿因子或致命因子)对七聚体的结合；(6)中和致命因子或水肿因子从而毒素不能导致对细胞的生理损伤；和/或(7)保护细胞抵抗毒素的致命效果。

体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如，人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)的适宜途径是本领域技术人员熟知的并且可以由技术人员选择。例如，可以通过如上述的注射(例如，静脉内或皮下)施用抗体组合物。所用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄和体重和抗体组合物的浓度和/或剂型(formulation)。施用于患者以抵抗炭疽感染的本发明抗体的治疗有效剂量包括0.1mg/kg到100mg/kg的剂量，其中所述患者需要(i)治疗(即，炭疽感染和显示出临床病征和/或症状)，(ii)预防性治疗(例如，防止炭疽的临床表现，如嗜中性白细胞减少，怀疑暴露于炭疽或者感染炭疽但是没有显示出临床病征或症状的患者中的临床病征和/或临床症状)，或者(iii)预防(例如，炭疽暴露或感染前疾病的预防，包括用于对抗生素过敏的个体或者其中炭疽是抗生素抗性的或者联合疫苗疗法，其中疫苗可以长达18个月具有功效)。在特定实施方案中，技术人员可以施用0.3mg/kg到50mg/kg或约1mg/kg到12mg/kg。剂量将取决于患者的健康、是否存在炭疽感染、是否存在炭疽病的病征或者症状，和施用是否用于预防等。技术人员将明白根据这些因素可以修改本发明抗体的剂量。

因此，下面的给药方案将不应被理解为限制性的。例如，如果患者被诊断为炭疽感染并且显示出炭疽感染的病征，那么可以施用相当高的剂量，例如，至少25mg/kg，或者50mg/kg，或者甚至100mg/kg，以拯救患者的生命。备选地，认为感染但是未显示出病征或者症状的患者可以从相对较低剂量，例如，小于12-15mg/kg或甚至1-3mg/kg的剂量受益。在接受炭疽疫苗的患者中，希望提供治疗抗体以提供针对炭疽感染的立即保护，之后通过接种产生患者自身抗体的适宜的血浆水平，从业者可以使用中等剂量范围，例如，12-15mg/kg。

本发明的人抗-PA抗体可以与一种或多种其他治疗或者免疫刺激剂共同施用。抗体可以在所述试剂之前、之后或同时施用，或者可以与其他公知的治疗共同施用，所述其他公知的治疗包括炭疽疫苗、针对LF、EF、PA的抗体和炭疽芽孢杆菌抗生素，例如，环丙沙星、多西环素、氯霉素、克林霉素、四环素、利福平和万古霉素。

在特定实施方案中，本发明提供了检测样品中保护性抗原的存在，或者测量炭疽保护性抗原的量的方法，其包括将样品和对照样品与本发明的人单克隆抗体或者其特异结合保护性抗原的抗原结合部分在允许抗体或者其部分与保护性抗原之间形成复合体的条件下接触。然后检测复合体的形成，其中与对照样品相比样品的复合体形成之间的差异表明样品中存在保护性抗原。

本发明范围还包括包含本发明的抗体组合物(例如，人抗体和免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒。该试剂盒可以还含有上述一种或多种额外的诊断、治疗或者免疫刺激剂。通过下面的实施例进一步阐明本发明，不应将这些实施例理解为进一步限制。

本发明还提供了鉴定新抗体的筛选方法，所述抗体具有使得它们可以用于治疗方法的性质。除了具有上述和下文实施例中描述的中和活性外，尤其适用于治疗方法的抗体包括具有一种或多种下面特征的抗体：结合Fc受体以产生中和活性(例如，通过使用Fc受体阻断抗体如2.4G2或者在TNA中使用Fab’₂或者ScFv导致活性减小至少5倍，更优选10倍)；显示出对PA63比对PA83更高的亲和性(例如，通过标准ELISA使用1μg/ml抗体测量的)，根据标准ELISA在1μg/ml，OD_405nm0.2或者更小下不结合PA83，根据Little等人，1996，Microbiology 142：707-715中描述的竞争结合测定法不阻断炭疽致命因子/水肿因子，或者不与选自鼠1G3、鼠2D5和鼠14B7的抗-PA抗体竞争结合PA63(例如，通过标准ELISA竞争测定法测量)。具有许多或所有这些特征的抗体用于体内使用是适当的。尤其有用的抗体不与选自鼠14B7的抗-PA抗体竞争结合PA63(见Little等人，1996，Microbiology 142：707-715)，即阻断PA对ATR的结合的抗体，并且适于用于体内治疗。

在本发明的具体筛选方法中，基于(1)首先选择在毒素中和测定中中和炭疽毒素的一种或多种抗体，和(2)然后选择在TNA中具有0.1μg/ml或更小的ED₅₀的抗体来选择抗体。在该方法中，在TNA步骤前不使用抗原-抗体结合亲和性测定(例如，ELISA)。这与常用于现有技术的方法相反，常规技术依赖于抗原-抗体结合亲和测定作为第一和首要的筛选方法。通过包括这种步骤，将本来将表现出优秀的毒素中和活性的许多抗体(如HuMAb 5E8)排除于进一步开发之外。本发明人已经发现对PA的结合亲和性不是有用的标准，因此其在本发明的选择方法中省略掉。此外，除了上述两个步骤，还可以实施选择步骤以得到具有所述性质的抗体。

实施例

实施例1：制备充分表达人抗体的转基因动物

I.产生转基因(Cmu靶定的)小鼠

构建CMD寻靶(targeting)载体

质粒pICEmu含有鼠Ig重链基因座的EcoRI/XhoI片段，其跨越mu基因，mu基因从Balb/C基因组λ噬菌体文库得到(Marcu等人Cell22：187，1980)。将该基因组片段亚克隆到质粒pICEMI9H(Marsh等人，Gene 32，481-485，1984)的XhoI/EcoRI位点。pICEmu中包括的重链序列从mu内含增强子的3’的EcoRI位点的下游延伸到位于mu基因的最后跨膜外显子的约1kb下游的XhoI位点；然而，大部分mu转换重复区已经通过在大肠杆菌中传代缺失。

如下构建寻靶载体。从pICEmu切除1.3kb HindIII/SmaI片段并亚克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)。该pICEmu片段从位于Cmu1的5’的约1kb的HindIII位点延伸到位于Cmu1内的SmaI位点。所得质粒经SmaI/SpeI消化并插入来自pICEmu的约4kb SmaI/XbaI，其从Cmu13’的SmaI位点延伸到最后一个Cmu外显子刚好下游的XbaI位点。所得质粒pTAR1在SmaI位点线性化并插入neo表达盒。该盒由处于小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子(XbaI/TaqI片段；Adra等人(1987)Gene 60：65-74)转录控制下的neo基因组成并且其含有pgk多腺苷酸化位点(PvuII/HindIII片段；Boer等人(1990)Biochemical Genetics28：299-308)。该盒从质粒pKJ1(由Tybulewicz等人(1991)Cell 65：1153-1163描述)得到，从该质粒切割neo盒作为EcoRI/HindIII片段并亚克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)以产生pGEM-7(KJ1)。Neo盒经EcoRI/SalI消化从pGEM-7(KJ1)切除、平端化并亚克隆到质粒pTAR1的SmaI位点中与基因组Cmu序列反向。所得质粒经NotI线性化，并插入单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)盒以允许如Mansour等人(1988)Nature 336：348-352所描述的具有同源重组体的ES克隆的富集。该盒由tk基因的编码序列组成，所述编码序列夹在小鼠pgk启动子和多腺苷酸化位点之间，如Tybulewicz等人(1991)Cell 65：1153-1163描述。所得CMD寻靶载体含有与重链基因座同源的共约5.3kb并且被设计以产生突变mu基因，其中突变mu基因中已经在第一个Cmu外显子的唯一SmaI位点中插入neo表达盒。将该寻靶载体用PvuI线性化，PvuI在质粒序列内切割，之后电穿孔到ES细胞。

产生和分析靶定的ES细胞

基本上如(Robertson，E.J.(1987)在Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells：a Practical Approach(E.J.Robertson，ed.)Oxford：IRL Press，p.71-112)中描述的在有丝分裂失活的SNL76/7细胞饲养层(ibid.)上生长AB-1 ES细胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.，(1990)Cell 62：1073-1085)。通过Hasty等人(Hasty，P.R.等人(1991)Nature 350：243-246)描述的方法将线性化CMD寻靶载体电穿孔到AB-1细胞。将电穿孔的细胞以1-2×10⁶个细胞/皿的密度铺在100mm培养皿中。24小时后，向培养基加入G418(200微克/ml活性组分)和FIAU(5×10^-7M)，并允许药物抗性克隆生长8-9天。挑选克隆、胰酶处理、分成两部分，并进一步扩大。然后将来自每种克隆的细胞的一半冷冻并将另一半分析载体和靶序列之间的同源重组。

通过DNA印迹杂交进行DNA分析。如Laird等人(Laird，P.W.等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：4293)描述的从克隆分离DNA。将分离的基因组DNA用SpeI消化并用915bp SacI片段——探针A(见图1)探测，该探针与mu内含增强子和mu转换区之间的序列杂交。探针A检测来自野生型基因座的9.9kb SpeI片段和来自mu基因座的诊断性7.6kb带，其中该mu基因座已经与CMD寻靶载体同源重组(neo表达盒含有SpeI位点)。在通过DNA印迹分析筛选的1132个G418和FIAU抗性克隆中，3个显示出7.6kb SpeI带，其表示mu基因座上的同源重组。将这三个克隆用酶BglI、BstXI和EcoRI进一步消化以证实载体同源整合到mu基因中。当用探针A杂交时，用BglI、BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的DNA印迹分别产生15.7、7.3和12.5kb的片段，而分别通过7.7、6.6和14.3kb的片段表明靶定的mu等位基因的存在。通过SpeI消化检测的所有三个阳性克隆显示出预期的BglI、BstXI和EcoRI限制性片段，其诊断neo盒向CmuI外显子的插入。

产生具有突变的mu基因的小鼠

将编号为264、272和408的三个靶定的ES克隆解冻并如Bradley(Bradley，A.(1987)在Teratocarcinomas and Embryonic StemCells：a Practical Approach.(E.J.Robertson，编著)Oxford：IRL Press，p.113-151)描述的注射到C57BL/6J胚泡中。将注射的胚泡转移到假孕雌性的子宫以产生嵌合小鼠，其代表来自输入ES细胞和宿主胚泡的细胞混合物。ES细胞对嵌合体的贡献程度可以通过黑色C57BL/6J背景下来自ES细胞系的刺豚鼠皮毛颜色(agouti coatcoloration)的量通过视觉估计。克隆272和408仅产生低百分数嵌合体(即低百分数刺豚鼠着色)，但是克隆264产生高百分数雄性嵌合体。这些嵌合体与C57BL/6J雌性交配并产生刺豚鼠后代，这表明ES细胞基因组的种系传递。通过来自尾巴活组织检查的BglI消化的DNA的DNA印迹分析实施靶定的mu基因的筛选(如上述对于ES细胞DNA的分析)。约50％刺豚鼠后代除了15.7kb的野生型带之外还显示出7.7kb的杂交BglI带，表明靶定的mu基因的种系转移。

分析转基因小鼠的mu基因的功能失活

为了确定neo盒向CmuI的插入是否已经失活了Ig重链基因，将克隆264嵌合体与对JHD突变纯合的小鼠交配，所述突变由于缺失JH基因片段而失活重链表达(Chen等人，(1993)Immunol.5：647-656)。产生了4只刺豚鼠后代。在1个月大小时从这些动物得到血清并通过ELISA分析鼠IgM的存在。四只后代中的两只完全缺乏IgM(见表1)。通过DNA印迹分析对来自尾巴活组织检查的DNA通过BglI消化并与探针A杂交(见图1)，并通过StuI消化和与475bp EcoRI/StuI片段(ibid.)杂交对四只动物确定基因型，表明不能表达血清IgM的动物是其中重链基因座的一个等位基因携带JHD突变，另一个等位基因携带CmuI突变的动物。对JHD突变杂合的小鼠表现出血清Ig的野生型水平。这些数据表明CmuI突变使mu基因的表达失活。

表1

小鼠	血清IgM(μg/ml)	IgH链基因型
			42	＜0.002	CMD/JHD
43	196	+/JHD
			44	＜0.002	CMD/JHD
45	174	+/JHD
			129×BL6 F1	153	+/+
JHD	＜0.002	JHD/JHD

表1示出了对于携带CMD和JHD突变的小鼠(CMD/JHD)，对于JHD突变杂合的小鼠(+/JHD)，对于野生型(129Sv x C57BL/6J)F1小鼠(+/+)，和对于JDH突变纯合的B细胞缺陷小鼠(JHD/JHD)，通过ELISA检测的血清IgM的水平。

II.产生HCO12转基因小鼠

通过共同注射pHC2(Taylor等人，1994，Int.Immunol.，6：579-591)的80kb插入片段和pVx6的25kb插入片段产生HCO12人重转基因。如下面描述的构建质粒pVx6。

将含有种系人V_H1-18(DP-14)基因以及约2.5kb的5’侧翼和5kb的3’侧翼基因组序列的8.5kb HindIII/SalI DNA片段亚克隆到质粒载体pSP72(Promega，Madison，WI)以产生质粒p343.7.16。将含有种系人V_H5-51(DP-73)基因以及约5kb的5’侧翼和1kb的3’侧翼基因组序列的7kb BamHI/HindIII DNA片段克隆到基于pBR322的质粒克隆载体pGP1f(Taylor等人1992，Nucleic Acids Res.20：6287-6295)，以产生质粒p251f。将衍生自pGP1f的新克隆载体pGP1k用EcoRV/BamHI消化，并连接到10kb EcoRV/BamHI DNA片段，其含有种系人V_H3-23(DP47)基因以及约4kb的5’侧翼和5kb的3’侧翼基因组序列。将所得质粒p112.2RR.7用BamHI/SalI消化并与p251f的7kb纯化的BamHI/SalI插入片段连接。所得质粒pVx4用XhoI消化并与p343.7.16的8.5kb XhoI/SalI连接。

V_H1-18基因具有与其他两个V基因相同的方向以得到克隆。该克隆称作pVx6，将其用NotI消化并如Hogan等人(B.Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，第二版，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview NY)描述的将纯化的26kb插入片段与pCH2的纯化80kb NotI插入片段以1∶1摩尔比共同插入到半天(C57BL/6J x DBA/2J)F2胚胎的原核中。基于从注射胚胎发育而来的小鼠建立了含有来自Vx6和HC2的序列的转基因小鼠的三个独立品系(lines)。这些品系称作(HCO12)14881、(HCO12)15083和(HCO12)15087。然后将这三个品系的每一种与含有实施例1中描述的CMD突变、JKD突变(Chen等人1993，EMBO J.12：811-820)，和(KCo5)9272转基因(Fishwild等人1996，NatureBiotechnology 14：845-851)的小鼠交配。所得小鼠表达人免疫球蛋白重链和κ轻链转基因，其处于对内源小鼠重链和κ轻链基因座的破坏纯合的背景。

实施例2：产生针对炭疽保护性抗原的完整人抗体

如下文描述的在如上面描述产生的转基因小鼠中产生针对炭疽保护性抗原的人单克隆抗体。

产生人抗-PA单克隆抗体

转基因HuMAb Mouse品系HC2/KCo7用于免疫，所述品系具有四种不同的遗传修饰。这些转基因小鼠含有人免疫球蛋白基因小基因座，其编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及失活内源μ和κ链基因座的靶定突变。因此，该小鼠不表现出小鼠IgM或κ的表达，并且响应免疫所引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变而产生高亲和性人IgGκ单克隆抗体。

小鼠关在filter笼子中并在免疫、取血和融合的那些天评估处于良好的生理状况。使用乳化针将15微克重组全长炭疽PA83在150μLPBS中的溶液与完全弗氏佐剂(SigmaF5881)或MPL+TDM(RIBI)佐剂(Sigma M6536)以1∶1混合。对小鼠腹膜内注射0.3cc制备的抗原，并随后使用全长PA83不完全弗氏佐剂(Sigma F5506)或者RIBI(Sigma M6536)以14天间隔再强化2到4次，但是HuMab 5E8除外，通过随后用PA63加强制备HuMab 5E8。通过ELISA使用PA监视小鼠中的抗体应答。对于产生针对保护性抗原的抗-PA效价的动物融合前72小时静脉内注射重组保护性抗原。来自每只小鼠的效价为1∶200到大于1∶100,000。收获、纯化并融合小鼠脾细胞。

将来自免疫动物的脾脏淋巴细胞的单个细胞悬浮液与鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653(美国典型培养物保藏中心，Rockville MD；ATCCCRL 1580，批号F-15183)在聚乙二醇存在下融合。将最初的ATCC瓶解冻并培养扩增。从该扩增制备冷冻瓶的种子原种(seed stock)。细胞保持在培养基中3-6个月，每周传代两次。将P388D1(ATCC TIB-63FL)扩大到200mL并耗竭。离心上清液并将其过滤并用作培养基添加物，其还称作条件培养基。该细胞系传代3到6个月，然后解冻新瓶。

含有5％FBS和青霉素-Strepatientomycin(Cellgro # 30004030)的High Glucose DMEM(Mediatech，Cellgro # 10013245)用于培养骨髓瘤和P388D1细胞。向杂交瘤生长培养基加入额外的培养基补充物，其包括：3％Origen-Hybridoma Cloning Factor(Igen，36335)，10％P388D1条件培养基(8/10/99DH)，10％FBS(Hyclone，SH30071lot # AGH6843)，L-谷氨酰胺(Gibco # 1016483)、0.1％庆大霉素(Gibco # 1020070)、2-巯基乙醇(Gibco # 1019091)、HAT(Sigma，HO262)、1.0×10⁴M次黄嘌呤、4.0×10^-7M Aminopatienterin，1.6×10^-5M胸苷)。

融合后24小时加入HAT选择杂交瘤。首先通过夹层ELISA对杂交瘤选择人IgG生产者。简言之，用山羊抗-人κ(Southern Biotech，Birmingham AL)捕获杂交瘤上清液，然后与碱性磷酸酶-缀合的山羊抗人IgG(γ链特异的)(Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc.，West Grove，PA)反应。

然后使用体外毒素中和测定法(Little等人，1990，Infectionand Immunity 65：5171-5175；见实施例3)筛选产生特异人IgG的杂交瘤。最初，通过ELISA使用全长PA83试验mAbs对炭疽保护性抗原的结合。然而，通过ELISA发现表现出良好的毒素中和活性(TNA)的一些mAb结合很弱。多数这些抗体与切割的PA63反应良好。由于该发现，将TNA用作初步筛选，然后用ELISA进一步鉴定。该方案导致分离到至少四种目的抗体，例如，5E8、2D5、2H4和5D5。然后从杂交瘤的RNA分离所选抗-PA HuMAb的V_H和V_L区，将其反转录成cDNA，并通过PCR扩增V区。如实施例4中所示测序PCR产物。

然后通过蛋白质A柱层析纯化HuMab，使用下面的步骤：(1)上样条件：将上清液加到用磷酸盐缓冲溶液(PBS)平衡的5ml蛋白质A柱；(2)洗涤：PBS缓冲液；(3)洗脱：0.1M甘氨酸与150mM NaCl，pH2.9。洗脱液用1M Tris缓冲液中和(每2ml级分30μl)。每个洗脱的级分合并前在凝胶上运行。一旦通过考马斯染色确认了纯度，就将级分合并并对含有150mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)透析。

实施例3A：通过抗-PA人单克隆抗体体外中和致命毒素

根据Little等人，1990，上文进行TNA实验。简言之，在不同浓度抗-PA mAb存在或缺乏下将毒素敏感性鼠巨噬细胞系J774A.1暴露于PA和LF(10∶1)的混合物。孵育3小时后，使用生存力染料(MTT)测定巨噬细胞的存活。结果(图10)证明了人抗-PA抗体体外中和致命毒素的活性。下面的表2表明保持TNA中巨噬细胞的50％生存力(ED₅₀)所需的抗体有效剂量。

表2

抗体	ED50(μg/mL)
		5D5	0.035
2H4	0.060
		5E8	0.015
2D5	5

为了检验对炭疽保护性抗原的直接结合，用PA83或者PA63包被ELISA板。以适宜的稀释度加入mAb样品，并用抗-人IgG碱性磷酸酶-缀合的探针检测结合的抗体。用p-NPP底物使板显色并在Softmax板读出器上测定OD₄₀₅。使用等离子体共振技术在BIAcore仪器上测定结合速率常数。

初步结合数据表明HuMab的解离常数为纳摩尔范围。结合活性结果(图11)表明针对rPA-83产生的人抗体结合保护性抗原的全长(83kD)和切割(63kD)形式。HuMabs 5D5、2H4和5E8显示出对PA63比对PA83更大的反应性，这可能是因为抗原切割后更多结合表位被暴露。

为了测定抗体中和炭疽毒素所需的活性，使用HuMAb 5E8和鼠14B7如所述的进行额外的毒素中和测定，除了在毒素加入前30分钟(-30分钟)、毒素加入同时(0分钟)、毒素加入后15分钟(+15分钟)或者毒素加入后30分钟(+30分钟)加入抗体(见图12)。

数据表明细胞暴露于毒素后，HuMab 5E8保护细胞免受炭疽毒素作用。与鼠抗体相比(其防止PA83结合受体(鼠mAb 14B7以10×更高剂量使用))，HuMAb5E8持续防止炭疽毒素导致细胞死亡，甚至在加入PA83和LF后15分钟加入时也是如此。这些数据表明HuMAb 5E8(其优先结合细胞结合的PA63)即使暴露后也可以有效挽救细胞免于炭疽毒素死亡。因此，HuMAb 5E8和具有相似性质的那些抗体预期比阻断受体结合的抗体具有更大的治疗活性。

实施例3B：Humab 5E8体外中和需要Fc受体结合

如前面描述的进行毒素中和测定，除了在抗-小鼠FcRII/III单克隆抗体2.4G2的缺乏或存在下使用5E8抗体的F(ab’)₂片段和完整5E8 mAb，抗体2.4G2特异阻断Fc受体和抗体Fc相互作用(BDBiosciences Pharmingen，San Diego，CA)。通过胃蛋白酶消化mAb5E8然后使用蛋白质A和蛋白质L柱层析纯化F(ab’)₂制备F(ab’)₂片段。

结果表明HuMab 5E8需要Fc受体结合以产生活性(见图13)。HuMab5E8的F(ab’)₂片段保持PA63的全部结合活性，但是不具有结合Fc受体的能力，其不能防止巨噬细胞样细胞的死亡。此外，2.4G2抗体(其特异阻断Fc受体和抗体Fc相互作用)极大地减小了HuMab 5E8的抗毒素活性。

实施例4：抗体测序

从杂交瘤RNA分离四种HuMab的V_H和V_L区，反转录成cDNA，通过PCR扩增并测序。这些HuMab的V_H和V_L区的核酸和氨基酸序列在下面和图1-9中提供。注意到5E8杂交瘤产生具有与两条轻链之一(V_L主要或V_L次要)匹配的重链的抗体。两种抗体(即5E8 V_H/V_L主要和5E8’V_H/V_L次要)结合炭疽PA并且根据TNA可以中和炭疽毒素。

产生这些抗体重链的人种系序列包括V_H3-33和V_H3-7，而产生轻链的人种系序列包括A27、L18和L15，如图1-9所示。这些种系序列是本领域中熟知的，并且可以在免疫学参考课本和免费因特网网站容易地获得，例如，见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest.第五版U.S.Dept of Health and HumanServices，Public Health Service，NIH.NIH publication No.91-3242(在http：//immuno.bme.nwu.Edu和ftp：//ncbi.nlm.nih.gov/repository/kabat更新)和http：//www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php？menu＝901)。

5E8 V_H核酸序列

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcac

cttcagttactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggcatgatgaaag

tattgtatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaaca

gtctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtacgagagaccctggggatccctattactactactacggtttggacgtctgg

ggccaagggaccacggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO：1)

5E8 V_H氨基酸序列

QVQLVESGGGVVQPGRSLRISCAASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIW

HDESIVYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDPGDPYYY

YYGLDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：2)

5E8 V_L(主要)核酸序列

gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtg

ttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggcca

ctggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgc

agtgtattactgtcagcagtatggtagctcaatgtacacttttggccaggggaccaagctagagatcaaa(SEQ ID NO：3)

5E8 V_L(主要)氨基酸序列

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRA

TGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSMYTFGQGTKLEIK(SEQID NO：4)

5E8’V_L(次要)核酸序列

gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtg

ttagcagcagctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggcca

ctggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgc

agtgtattactgtcagcagtatggtagctcacctcccactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa(SEQ IDNO：5)

5E8’V_L(次要)氨基酸序列

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRA

TGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGGGTKVEIK(SEQID NO：6)

2D5 V_H核酸序列

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtcagcgtctggattcac

cttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggaatgatggaa

gtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaa

cagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaaaactggggagagtactttgactactggggccagggaa

ccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO：7)

2D5 V_H氨基酸序列

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIW

NDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARENWGEY

FDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：8)

2D5 V_L核酸序列

gccatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggca

ttagcagtgctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcctccagtttgaaaagtggg

gtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaactta

ttactgtcaacagtttaatagttactggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa(SEQ ID NO：9)

2D5 V_L氨基酸序列

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLKS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYWTFGQGTKVEIK(SEQID NO：10)

2H4 V_H核酸序列

gaggtgcacctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacc

tttagtagctattggatgagctgggtccgccaggctccagggaaagggctggagtgggtggccaacataaatcaatatggaagt

gagaaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcgctgtatctgcaaatgaaca

gcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagggactccccgtattactatggttcggggagttattatagaggata

ctggtacttcgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctca(SEQ ID NO：11)

2H4 V_H氨基酸序列

EVHLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINQ

YGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSPYYYGS

GSYYRGYWYFDLWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO：12)

2H4 V_L核酸序列

gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggta

ttagcagctggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtgg

ggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaactt

attactgccaacagtataatagttaccctcccaccttcggccaagggacacgactggagattaaa(SEQ ID NO：13)

2H4 V_L氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQ

SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGQGTRLEIK(SEQID NO：14)

5D5 V_H核酸序列

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcac

cttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaag

taataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaac

agcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagagggtaatcgtagccactatataccctttgcctactggggc

cagggaaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO：15)

5D5 V_H氨基酸序列

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIW

YDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGNRSHY

IPFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)

5D5 V_L核酸序列

gacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggta

ttagcagctggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtgg

ggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaactt

attactgccaacagtataatagttacccgcgcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa(SEQ ID NO：17)

5D5 V_L氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQ

SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPRTFGGGTKVEIK(SEQID NO：18)

实施例5A：ELISA测定法测定HuMAb 5E8对炭疽保护性抗原的结合特征

如在上文“人单克隆抗体对保护性抗原结合的表征”章节中描述的进行标准ELISA。将板用PA83或PA63包被，并用碱性磷酸酶-缀合的山羊抗人-IgG(Fc特异的)(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA)检测结合的抗体。产生HuMAb 5E8对全长PA83和对PA的活性片段(即PA63)的ELISA结合曲线。

结果表明HuMAb 5E8结合PA63，但是在ELISA测定中表现出无明显的对PA83的结合(见图14)。因此，如果对PA83的ELISA结合用作初步筛选，那么将不选择HuMAb 5E8用于进一步开发，ELISA方法以前已经用于筛选针对保护性抗原的抗体(见，Little等人，1988，Infection and Immunity，56：1807-1813)。

实施例5B：用于确定HuMAb 5E8对炭疽保护性抗原的结合特征的ELISA测定法

如在上文“人单克隆抗体对保护性抗原结合的表征”章节中描述的进行标准ELISA。在用PA63包被的板上将人抗体5E8与鼠抗体14B7、2D5和1G3(Little等人，1996，Microbiology 142：707-715)中的每一种一起孵育。用山羊抗小鼠-IgG(Fc特异的)碱性磷酸酶缀合物(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)检测小鼠抗体对PA的结合。

结果表明没有哪一种鼠Mab对PA63的结合由于HuMAb 5E8对PA63的结合而被阻断(见图15)。这表明这些鼠抗体都不与5E8直接竞争结合PA63，从而表明5E8抗体结合PA63上不同的表位。

实施例6：静脉内和皮下施用于兔后人IgG的药物动力学

该实施例评估在兔中静脉内和皮下施用人单克隆抗体后人IgG的药物动力学。产生的数据用于支持对用于研究的给药方案的选择以在兔致命吸入炭疽模型中评估人单克隆抗体针对炭疽保护性抗原的功效。

静脉内(2只兔)或皮下(4只兔)施用人IgG以确定兔中人单克隆抗体的药物动力学。将10mg/kg的静脉内剂量施用于两只兔并将10mg/kg的皮下剂量施用于4只兔。静脉内和皮下施用后Cmax(最大浓度)分别为389μg/ml和155μg/ml。静脉内注射后Tmax(达到最大浓度的时间)为2小时。皮下施用后Tmax为48小时。在静脉内和皮下施用后4天都观察到大于100μg/ml的血清浓度，14天后观察到大于20μg/ml的水平。皮下和静脉内施用后实现足够血清水平，每一种给药途径在功效研究中都是适宜的。为了长期保持这种足够血清水平，可以最初施用抗体的负荷剂量(loading dose)，然后可以在初次剂量后约4天施用抗体的降低的第二次剂量。然而，当在治疗模型中进行皮下注射时应该考虑达到最大浓度增加的时间。

实施例7A：兔吸入模型中针对炭疽芽孢杆菌(ames株系)的致命气溶胶胁迫(challenge)的人单克隆抗体的功效和治疗性治疗

该实施例证明兔中致命吸入炭疽模型中本发明的抗-PA抗体的功效。用抗体5D5或5E8治疗的30只兔中26只在暴露于炭疽14天后幸存。从而，本发明的抗体提供了对炭疽暴露的有效的新的治疗。

用炭疽芽孢杆菌气溶胶胁迫后立即和96小时后将两种单克隆抗-PA抗体(PA mAb 5E8或5D5)的一种施用于四组中的10只新西兰白兔(New Zealand White Rabbits)。通过仅口罩吸入(muzzle onlyinhalation)以约100倍LD₅₀的剂量递送气溶胶化孢子。在14天的暴露后期间内观察动物的死亡。抗体针对炭疽感染的保护定义为到达死亡的增加的时间或者胁迫后2周的存活。下面的表3提供了人单克隆抗体的功效评估，包括研究组中兔的数目、暴露后1小时施用的抗体的剂量水平、暴露后96小时抗体的剂量水平，和从该研究幸存的兔的数目。

表3

兔的数目	对照或抗体	暴露后1小时剂量水平	暴露后96小时剂量水平	存活
					10	盐水	0mg/kg	0mg/kg	无
10	5D5	6mg/kg	3mg/kg	9/10
					10	5E8	6mg/kg	3mg/kg	9/10
10	5E8	12mg/kg	5mg/kg	8/10

图16中所示研究结果表明本发明的完全人抗体在兔中的功效。对照组中的动物在暴露于炭疽芽孢杆菌5天内死亡。在用mAb 5E8治疗的85％的动物中看到更长的存活时间(14天)。一只接受6mg/kg 5E8的兔在第14天死亡，一只接受12mg/kg 5E8的兔在第13天死亡，一只接受12mg/kg的兔在第14天死亡。一只用3mg/kg 5D5治疗的兔在暴露后5天内死亡。来自兔的血清样品的药物动力学分析表明施用后前24小时内抗体的血浆水平大于70μg/mL。在3mg/kg强化剂量前用6mg/kg治疗的组中血浆水平下降到50到117μg/ml并且到研究结束时小于30μg/ml。这表明高于50μg/ml的抗-PA抗体的血浆水平足够保护该模型中的兔。由于该研究中施用的最低剂量是有效的，可能更低的血浆浓度也是有效的。

实施例7B：兔吸入模型中针对炭疽芽孢杆菌(ames株系)的致命气溶胶胁迫的人单克隆抗体(5E8)的功效

该实施例阐明兔中致命吸入炭疽模型中本发明的抗-PA抗体的较低剂量水平的功效。用抗体5E8治疗的20只兔中17只在暴露于炭疽14天后幸存。从而，本发明的抗体提供了对炭疽暴露的有效治疗。

用炭疽芽孢杆菌气溶胶胁迫后立即和96小时后用单克隆抗-PA抗体(PA mAb 5E8)施予两组中的10只新西兰白兔。通过仅口罩吸入以约100倍LD₅₀的剂量递送气溶胶化孢子。暴露后14天的期间内观察动物的死亡。抗体针对炭疽感染的保护定义为到达死亡的增加的时间或者胁迫后2周的存活。下面的表4提供了人单克隆抗体的功效评估，包括研究组中兔的数目、暴露后1小时施用的抗体的剂量水平、暴露后96小时抗体的剂量水平，和从该研究幸存的兔的数目。

表4

兔的数目	对照或抗体	暴露后1小时剂量水平	暴露后96小时剂量水平	存活
					10	盐水	0mg/kg	0mg/kg	无
10	5E8	1mg/kg	1mg/kg	9/10
					10	5E8	3mg/kg	3mg/kg	8/10

图17中所示研究结果表明本发明的完全人抗体在兔中的功效。对照组中的动物在暴露于炭疽芽孢杆菌5天内死亡。在用mAb 5E8治疗的85％的动物中看到更长的存活时间(14天)。一只接受1mg/kg 5E8的兔在暴露8天内死亡。一只接受3mg/kg的兔在第5天死亡，一只在第6天死亡。该研究中增加的存活率表明低至1mg/kg的剂量水平在该动物模型中可以有效防止死亡。

实施例7C：兔吸入模型中针对炭疽芽孢杆菌(ames株系)的致命气溶胶胁迫的人单克隆抗体(5E8)的治疗性治疗

该实施例阐明兔中致命吸入炭疽模型中已经开始出现暴露的临床病征后，本发明的抗-PA抗体在防止死亡中的功效。在暴露于炭疽后24小时用抗体5E8治疗的10只兔中9只幸存14天。在暴露于炭疽后48小时用抗体5E8治疗的5只兔中的3只幸存14天。这些动物在治疗之前具有可检测到的感染症征。从而，本发明的抗体提供了对炭疽暴露的有效治疗。

用炭疽芽孢杆菌气溶胶胁迫后24小时用单克隆抗-PA抗体(PA mAb5E8)施用于10只新西兰白兔，并且气溶胶胁迫后48小时对10只兔施用单克隆抗-PA抗体(PA mAb 5E8)。通过仅口罩吸入以约100倍LD₅₀的剂量递送气溶胶化孢子。暴露后14天的期间内观察动物的死亡。抗体针对炭疽感染的保护定义为到达死亡的增加的时间或者胁迫后2周存活。下面的表5提供了人单克隆抗体的功效评估，包括研究组中兔的数目、抗体剂量水平、与炭疽胁迫相关的施用时间，和从该研究幸存的兔的数目。

表5

兔的数目	抗体	治疗方案	剂量水平(mg/kg)		存活
						第一种	第二种
			10	盐水				暴露后1、72小时	0	0	0/10
10	5E8	暴露后24、120小时			10	10	8/9a
			10	5E8				暴露后48、144小时	10	10	3/5a

^a由于与炭疽暴露或者单克隆抗体不相关的人道主义原因从研究除去一只动物。

^b暴露后48小时内5只动物死于炭疽，因此没有接受单克隆抗体的治疗。

研究结果证明在兔中产生炭疽病征后本发明的完全人抗体的功效(见图18)。暴露于炭疽后24小时在多数对照动物中观察到嗜中性粒细胞的循环水平的下降(嗜中性粒细胞的绝对数和相对百分数)。在暴露于炭疽后24小时用5E8治疗的动物中也在该时间点评估了这些参数并且这些参数在所有这些动物中的水平都下降了。在暴露于炭疽后48小时用单克隆抗体治疗的5只动物中，治疗前四只动物食欲减退并且其他动物活动性减弱。在该研究中，对照组中的动物在暴露于炭疽芽孢杆菌后5天内死亡，而在24小时接受治疗的9只动物中的8只幸存下来，在48小时接受治疗的5只有症状的动物中的3只幸存下来。这些数据综合起来证明该单克隆抗体可以有效治疗该疾病的临床过程已经开始后的动物。

等价方案

本领域技术人员将认识到或者能够仅仅使用常规实验法确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。这些等价方案将由下面的权利要求书包括。

参考文献

这里完整引用本文引用的所有专利、待决专利申请和其他出版物作为参考。

                                        序列表

<110>Medarex，Inc.et al.

<120>针对炭疽芽孢杆菌保护性抗原的人单克隆抗体

<130>MXI-305PC

<150>60/472636

<151>2003-05-21

<150>60/512336

<151>2003-10-16

<160>72

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>369

<212>DNA

<213>智人

<400>1

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt tactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggcatg atgaaagtat tgtatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtac gagagaccct 300

ggggatccct attactacta ctacggtttg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360

gtctcctca                                                         369

<210>2

<211>123

<212>PRT

<213>智人

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

 1               5                  10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr

            20                  25                  30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Val Ile Trp His Asp Glu Ser Ile Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

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            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>3

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<212>DNA

<213>智人

<400>3

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cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc cactttcggc 300

ggagggacca aggtggagat caaa                                        324

<210>4

<211>108

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

 1               5                  10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

            20                  25                  30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

        35                  40                  45

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    50                  55                  60

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65                  70                  75                  80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

                85                  90                  95

Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

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<212>DNA

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cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

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<210>6

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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            20                  25                   30

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        35                  40                  45

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    50                  55                  60

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65                  70                  75                  80

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                85                  90                  95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

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<213>智人

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<210>8

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<212>PRT

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

 1               5                  10                  15

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Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

 1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Trp Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>11

<211>387

<212>DNA

<213>智人

<400>11

gaggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaac ataaatcaat atggaagtga gaaatactat 180

gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagggactcc 300

ccgtattact atggttcggg gagttattat agaggatact ggtacttcga tctctggggc 360

cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca                                     387

<210>12

<211>129

<212>PRT

<213>智人

<400>12

Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

 1               5                  10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 6ly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Asn Ile Asn Gln Tyr Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asp Ser Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Arg Gly

            100                 105                 110

Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

        115                 120                 125

Ser

<210>13

<211>321

<212>DNA

<213>智人

<400>13

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120

gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcccac cttcggccaa 300

gggacacgac tggagattaa a                                           321

<210>14

<211>107

<212>PRT

<213>智人

<400>14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

 1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>15

<211>363

<212>DNA

<213>智人

<400>15

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggt 300

aatcgtagcc actatatacc ctttgcctac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca                                                               363

<210>16

<211>121

<212>PRT

<213>智人

<400>16

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

 1               5                  10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Glu Gly Asn Arg Ser His Tyr Ile Pro Phe Ala Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>17

<211>321

<212>DNA

<213>智人

<400>17

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120

gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgcgcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a                                           321

<210>18

<211>107

<212>PRT

<213>智人

<400>18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

 1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>19

<211>42

<212>DNA

<213>智人

<400>19

gaccctgggg atccctatta ctactactac ggtttggacg tc                    42

<210>20

<211>14

<212>PRT

<213>智人

<400>20

Asp Pro Gly Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

 1               5                  10

<210>21

<211>51

<212>DNA

<213>智人

<400>21

gttatatggc atgatgaaag tattgtatac tatgcagact ccgtgaaggg c          51

<210>22

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>22

Val Ile Trp His Asp Glu Ser Ile Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

 1               5                  10                  15

Gly

<210>23

<211>15

<212>DNA

<213>智人

<400>23

tactatggca tgcac                                                   15

<210>24

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>24

Tyr Tyr Gly Met His

 1               5

<210>25

<211>27

<212>DNA

<213>智人

<400>25

cagcagtatg gtagctcacc tcccact                                     27

<210>26

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>26

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Thr

 1               5

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>27

ggtgcatcca gcagggccac t                                           21

<210>28

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>28

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

 1               5

<210>29

<211>36

<212>DNA

<213>智人

<400>29

agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc                           36

<210>30

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>30

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

 1               5                  10

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>智人

<400>31

cagcagtatg gtagctcaat gtacact                                     27

<210>32

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>32

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Met Tyr Thr

 1               5

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>33

ggtgcatcca geagggccac t                                             21

<210>34

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>34

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

 1               5

<210>35

<211>36

<212>DNA

<213>智人

<400>35

agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc                            36

<210>36

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>36

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

 1               5                  10

<210>37

<211>27

<212>DNA

<213>智人

<400>37

gaaaactggg gagagtactt tgactac                                      27

<210>38

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>38

Glu Asn Trp Gly Glu Tyr Phe Asp Tyr

 1               5

<210>39

<211>51

<212>DNA

<213>智人

<400>39

gttatatgga atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c          51

<210>40

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>40

Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

 1               5                  10

<210>41

<211>15

<212>DNA

<213>智人

<400>41

agctatggca tgcac                                                 15

<210>42

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>42

Ser Tyr Gly Met His

 1               5

<210>43

<211>24

<212>DNA

<213>智人

<400>43

caacagttta atagttactg gacg                                        24

<210>44

<211>8

<212>PRT

<213>智人

<400>44

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Trp Thr

 1               5

<210>45

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>45

gatgcctcca gtttgaaaag t                                           21

<210>46

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>46

Asp Ala Ser Ser Leu Lys Ser

 1               5

<210>47

<211>33

<212>DNA

<213>智人

<400>47

cgggcaagtc agggcattag cagtgettta gcc                              33

<210>48

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>48

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

 1               5                  10

<210>49

<211>60

<212>DNA

<213>智人

<400>49

gactccccgt attactatgg ttcggggagt tattatagag gatactggta cttcgatctc 60

<210>50

<211>20

<212>PRT

<213>智人

<400>50

Asp Ser Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Arg Gly Tyr Trp

 1               5                  10                  15

Tyr Phe Asp Leu

            20

<210>51

<211>51

<212>DNA

<213>智人

<400>51

aacataaatc aatatggaag tgagaaatac tatgtggact ctgtgaaggg c          51

<210>52

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>52

Asn Ile Asn Gln Tyr Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

 1               5                  10                  15

Gly

<210>53

<211>15

<212>DNA

<213>智人

<400>53

agctattgga tgagc                                                 15

<210>54

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>54

Ser Tyr Trp Met Ser

 1               5

<210>55

<211>27

<212>DNA

<213>智人

<400>55

caacagtata atagttaccc tcccacc                                    27

<210>56

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>56

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr

 1               5

<210>57

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>57

gctgcatcca gtttgcaaag t                                           21

<210>58

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>58

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

 1               5

<210>59

<211>33

<212>DNA

<213>智人

<400>59

cgggcgagtc agggtattag cagctggtta gcc                              33

<210>60

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>60

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala

 1               5                  10

<210>61

<211>36

<212>DNA

<213>智人

<400>61

gagggtaatc gtagccacta tatacccttt gcctac                           36

<210>62

<211>12

<212>PRT

<213>智人

<400>62

Glu Gly Asn Arg Ser His Tyr Ile Pro Phe Ala Tyr

 1               5                  10

<210>63

<211>51

<212>DNA

<213>智人

<400>63

gttatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c          51

<210>64

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>64

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

 1               5                  10                   15

Gly

<210>65

<211>15

<212>DNA

<213>智人

<400>65

agctatggca tgcac                                                  15

<210>66

<211>5

<212>PRT

<213>智人

<400>66

Ser Tyr Gly Met His

 1               5

<210>67

<211>27

<212>DNA

<213>智人

<400>67

caacagtata atagttaccc gcgcact                                    27

<210>68

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>68

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr

 1               5

<210>69

<211>21

<212>DNA

<213>智人

<400>69

gctgcatcca gtttgcaaag t                                          21

<210>70

<211>7

<212>PRT

<213>智人

<400>70

Ala Ala Set Ser Leu Gln Ser

 1               5

<210>71

<211>33

<212>DNA

<213>智人

<400>71

cgggcgagtc agggtattag cagctggtta gcc                              33

<210>72

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>72

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala

 1               5                  10

Claims (58)

1.分离的人单克隆抗体，其以至少10⁷M^-1的表观亲和力结合炭疽芽孢杆菌保护性抗原和在毒素中和测定中以5μg/ml或者更小的ED₅₀中和炭疽芽孢杆菌毒素。

2.权利要求1的人抗体，其中ED₅₀为1μg/ml或者更小。

3.权利要求1的人抗体，其中ED₅₀为0.1μg/ml或者更小。

4.权利要求1的人抗体，其中ED₅₀为0.05μg/ml或者更小。

5.前面权利要求任一项的人抗体，其在毒素中和测定中中和炭疽芽孢杆菌致命因子。

6.前面权利要求任一项的人抗体，其中毒素中和测定使用选自神经、心脏、肺和骨髓的组织的细胞。

7.权利要求6的人抗体，其中细胞是巨噬细胞。

8.前面权利要求任一项的人抗体，其含有人IgG重链和人κ轻链。

9.前面权利要求任一项的人抗体，其含有IgG1或者IgG3重链。

10.分离的人单克隆抗体，其含有人重链可变区和人轻链可变区，其中人重链可变区和人轻链可变区的序列分别含有选自SEQ ID NOs：2和4、SEQ ID NOs：2和6、SEQ ID NOs：8和10、SEQ ID NOs：12和14、或者SEQ ID NOs：16和18的序列，并且包括其保守序列修饰。

11.分离的人单克隆抗体，其与权利要求10的人单克隆抗体竞争结合炭疽保护性抗原。

12.分离的人单克隆抗体，其含有人重链可变区和人轻链可变区，人重链可变区含有FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，人轻链可变区含有FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，其中：

(a)人重链可变区CDR3序列选自SEQ ID NOs：20、38、50和62，和其保守修饰；和

(b)人轻链可变区CDR3序列选自SEQ ID NOs：26、32、44、56和68，和其保守修饰；

其中所述抗体以至少10⁷M^-1的表观亲和力结合炭疽芽孢杆菌保护性抗原和在毒素中和测定中以5μg/ml或者更小的ED₅₀中和炭疽芽孢杆菌毒素。

13.权利要求12的分离的人抗体，其中人重链可变区CDR2序列选自SEQ ID NOs：22、40、52和64，和其保守修饰；人轻链可变区CDR2序列选自SEQ ID NOs：28、34、46、58和70，和其保守序列。

14.权利要求12或13的分离的人抗体，其中人重链可变区CDR1序列选自SEQ ID NOs：24、42、54和66，和其保守修饰；人轻链可变区CDR1序列选自SEQ ID NOs：30、36、48、60和72，和其保守序列。

15.分离的人单克隆抗体，其结合炭疽芽孢杆菌保护性抗原，所述抗体含有具有FR1、FR2、FR3和FR4序列的人重链可变区，所述序列衍生自人重链VH_3-33或VH_3-7种系序列。

16.分离的人单克隆抗体，其结合炭疽芽孢杆菌保护性抗原，所述抗体含有具有FR1、FR2、FR3和FR4序列的人轻链可变区，所述序列衍生自人轻链L15、L18或A27种系序列。

17.分离的人单克隆抗体，其结合炭疽芽孢杆菌保护性抗原，所述抗体含有人重和轻链CDR1区、人重和轻链CDR2区和人重和轻链CDR3区，所述区含有与选自图1-9中所示的人重和轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

18.分离的人单克隆抗体，其结合炭疽芽孢杆菌保护性抗原，所述抗体含有人重链可变区和人轻链可变区，其中：

(a)人重链可变区含有选自由SEQ ID NOs：2、8、12和16和与SEQ ID NOs：2、8、12和16至少80％同源的序列所构成的组的氨基酸序列；和

(b)人轻链可变区含有选自由SEQ ID NOs：4、6、10、14和18和与SEQ ID NOs：4、6、10、14和18至少80％同源的序列所构成的组的氨基酸序列。

19.根据前面权利要求任一项的人抗体，其中所述抗体是Fab片段或者单链抗体(scFv)。

20.分离的核酸，其含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码多肽，该多肽含有选自SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16和18的氨基酸序列。

21.编码权利要求1的人抗体的分离的核酸，其含有编码包含选自SEQ ID NOs：20、38、50和62的氨基酸序列的重链可变区CDR3的核苷酸序列，和含有编码包含选自SEQ ID NOs：26、32、44、56和68的氨基酸序列的轻链可变区CDR3的核苷酸序列。

22.分离的核苷酸分子，其编码权利要求10-19任一项的人抗体。

23.表达载体，其含有权利要求20-21任一项的分离的核酸分子。

24.转染瘤，其含有权利要求23的表达载体。

25.转基因非人动物，其表达权利要求1-19任一项的人抗体，其中所述转基因非人动物具有含有人重链转基因或者转染色体和人轻链转基因或者转染色体的基因组。

26.杂交瘤产生的权利要求1-19任一项的分离的人抗体，其中将从具有含有人重链转基因或者转染色体和人轻链转基因或者转染色体的基因组的转基因非人动物得到的B细胞与永生化细胞融合制备杂交瘤。

27.免疫缀合物，其含有连接治疗剂的权利要求1-19任一项的人抗体。

28.权利要求26的免疫缀合物，其中治疗剂是细胞毒素或者放射性同位素。

29.药物组合物，其含有权利要求1-19任一项的人抗体和可药用载体。

30.权利要求29的药物组合物，其含有额外的治疗剂。

31.权利要求30的药物组合物，其中额外的治疗剂选自保护性抗原疫苗或者针对炭疽细菌、孢子、保护性抗原、致命因子或者水肿因子的第二种抗体，或者所述第二种抗体的Fab、F(ab’)2、Fv或者单链Fv片段。

32.药物组合物，其含有权利要求27的免疫缀合物和可药用载体。

33.杂交瘤，其产生可检测量的权利要求1-19任一项的人抗体。

34.产生权利要求1-19任一项的人抗体的方法，其包括：用炭疽芽孢杆菌的保护性抗原或者表达炭疽芽孢杆菌的保护性抗原的细胞免疫具有含有人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，从而通过该动物的B细胞产生抗体，分离该动物的B细胞，并将该B细胞与骨髓瘤细胞融合形成分泌所述抗体的永生化杂交瘤细胞。

35.抑制对炭疽感染敏感的细胞中炭疽芽孢杆菌保护性抗原的生理活性的方法，其包括将炭疽芽孢杆菌保护性抗原与有效量的根据权利要求1-19任一项的抗体在所述细胞的存在下接触，从而抑制保护性抗原的生理活性。

36.中和对炭疽感染敏感的细胞中炭疽芽孢杆菌毒素的方法，其包括将炭疽芽孢杆菌保护性抗原与有效量的根据权利要求1-19任一项的抗体在所述细胞的存在下接触，从而中和毒素。

37.治疗或者预防感染炭疽芽孢杆菌的宿主中炭疽感染的方法，其包括对该宿主施用权利要求1-19任一项的人抗体，抗体的量可有效治疗或者预防炭疽感染。

38.权利要求37的方法，其还包括施用额外的治疗剂。

39.权利要求38的方法，其中额外的治疗剂选自抗生素和疫苗。

40.检测样品中炭疽芽孢杆菌保护性抗原的存在的方法，其包括：

将样品和权利要求1-9、12-14、17或18任一项的抗体在允许包含所述抗体和所述保护性抗原的复合体形成的条件下接触；和

检测复合体的形成。

41.权利要求1-19任一项的人抗体，其中抗体中和毒素的能力需要结合Fc受体。

42.权利要求1-19任一项的人抗体，其中根据标准ELISA，所述抗体显示出对PA63比对PA83更高的亲和性。

43.权利要求1-19任一项的人抗体，其中所述抗体：

(1)根据标准ELISA在1μg/ml，OD_405nm为0.2或更小时不结合PA83；

(2)不阻断炭疽致命因子或者水肿因子对保护性抗原的结合。

44.权利要求1-19任一项的人抗体，其中抗体不与选自鼠1G3、鼠2D5和鼠14B7的抗-PA抗体竞争结合PA63。

45.针对炭疽保护性抗原的中和性抗体，其包含下列特征：

(1)需要结合到Fc受体以具有中和活性；

(2)显示出对PA63比对PA83更高的亲和性；

(3)显示出选自

(a)根据标准ELISA在1μg/ml，OD_405nm为0.2或更小时不结合PA83，(b)不阻断炭疽致命因子或者水肿因子结合保护性抗原；

的特征的一种或多种；

(4)不与选自鼠1G3、鼠2D5和鼠14B7的抗-PA抗体竞争结合PA63。

46.药物组合物，其含有权利要求41-45任一项的抗体和可药用载体。

47.治疗或者预防需要这种治疗的患者中炭疽的方法，其包括以0.1mg/kg到100mg/kg的剂量施用权利要求45的抗体的步骤。

48.治疗或者预防需要这种治疗的患者中炭疽的方法，其包括以0.3mg/kg到50mg/kg的剂量施用权利要求45的抗体的步骤。

49.治疗或者预防需要这种治疗的患者中炭疽的方法，其包括以1mg/kg到12mg/kg的剂量施用权利要求45的抗体的步骤。

50.权利要求47的方法，其中患者受到炭疽感染。

51.根据权利要求50的方法，其中患者表现出嗜中性白细胞减少。

52.根据权利要求50的方法，其中患者表现出一种或多种炭疽感染的病征和/或症状。

53.根据权利要求47的方法，其中患者没有受到炭疽感染。

54.根据权利要求47的方法，其中皮下或者静脉内施用剂量。

55.根据权利要求47的方法，其中施用一个或多个额外的剂量。

56.筛选针对炭疽保护性抗原的抗体的方法，其包括以下顺序步骤：

(1)选择在毒素中和测定中中和炭疽毒素的一种或多种抗体；和

(2)选择ED₅₀为0.1μg/ml或者更小的抗体，

其中抗原-抗体结合亲和测定不用作步骤(1)或(2)之前的选择标准。

57.权利要求56的方法，其中筛选还包括选择需要Fc受体结合以中和炭疽毒素的抗体。

58.抗体，其根据权利要求56的方法选择出来。

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