CN103554263B - 结合膜结合的IgE的凋亡性抗IgE抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及结合膜结合的IgE的凋亡性抗IgE抗体。本申请涉及凋亡性抗IgE抗体、其编码核酸、其治疗组合物、及其在IgE介导的病症的治疗中的用途。

Description

结合膜结合的IgE的凋亡性抗IgE抗体
本申请是申请日为2008年03月21日、中国申请号为200880016908.4、发明名称为“结合膜结合的IgE的凋亡性抗IgE抗体”的发明申请的分案申请。
相关申请
本发明依据35U.S.C.§119(e)要求2007年3月22日提交的U.S.S.N.60/896,339的优先权。
发明领域
本发明涉及凋亡性抗IgE抗体、其编码核酸、其治疗组合物、及其在IgE介导的病症的治疗中的用途。
发明背景
变态反应/变应性/过敏(allergy)指其中针对环境抗原的免疫应答引起组织炎症和器官功能障碍的某些疾病。每一种变应性疾病的临床特征反映了所涉及器官或组织中免疫学诱导的炎症应答。这些特征一般独立于抗原的化学或物理特性。变应性应答的多样性源于不同免疫学效应器途径的参与，每一种生成独特的炎症型式。
变应性在全世界都是常见的。然而，具体疾病的偏好在不同年龄组、性别和种族间变化。对具体变应原的敏感性的流行性由遗传偏好及由对变应原暴露负有责任的地理和文化因素二者决定。变应性的临床状态只影响遭遇每一种变应原的一些个体。变应原暴露时变应性疾病的发生不仅要求在先“致敏”，而且要求决定反应定位于特定器官的其它因素。
在变应原暴露诱导的变应性疾病之前的一个生物学过程是称作“致敏”或致敏期的免疫应答。一旦发生致敏，个体直到后续变应原暴露才会变得有症状。致敏的效果也称作免疫记忆。
诱导炎症的主要途径之一是经由免疫球蛋白E(IgE)。依靠其作为肥大细胞和嗜碱性细胞表面上变应原受体的作用，IgE在变应性中发挥重要作用。通过分子的Fc部分结合至称作FcεRI的高亲和力细胞表面受体，IgE抗体固定至肥大细胞和嗜碱性细胞的表面。在多价变应原分子结合占据这些受体的抗体时，变应性反应启动。结果是FcεRI的桥接，其继而在胞内发信号，引起炎症介导物的释放和活化，所述炎症介导物为组胺，白三烯，趋化因子，血小板活化因子，和蛋白酶。这些被活化的介导物局部地发挥作用并引起升高的血管通透性、血管舒张、平滑肌收缩和粘液腺分泌。此类事件在临床上称作立即期或早期，而且在变应原暴露后的前15-30分钟内发生。在随后的12小时里，应答尚未完全了解的其它化学介导物，产生炎症细胞的渐进性组织浸润，自嗜中性细胞进行至嗜曙红细胞再至单个核细胞。变应原暴露后6-12小时的这段时间称作晚期且以细胞炎症的临床表现为特征。鉴于晚期反应，尤其是在肺中，是在早期反应缺失的情况中发生的，仍然尚未完全了解晚期反应是否必然是IgE介导的。
IgE以膜结合形式及以分泌形式存在。这些不同形式似乎是剪接变体。通过下调IgE来实现治疗效果的先前办法主要靶向分泌形式(例如omalizumab)，用以阻止或解除免疫系统的进一步“武装”。IgE的分泌形式是较短的形式，基本是位于CH4结构域的Fc区末端(图1A-1B)，而较长的形式包括额外的C端残基，包括由称作M1/M1’和M2的外显子编码的肽。虽然已经有人报告了两种不同形式的膜结合IgE，二者均有和无称作M1’的52个氨基酸的区段[Batista等,J.Exp.Med.184:2197-2205(1996)]，但是发明人不能验证任何膜结合形式都缺乏此M1’区段。使用与分泌形式IgE结合的抗IgE抗体进行的常规疗法导致游离血清IgE的降低，但不降低总血清IgE[Casale等,J.Allergy Clin.Immunol.100(1):110-121(1997)]。
已经注意到，在抗原信号缺失的情况中，交联的B细胞受体(即免疫球蛋白)倾向于凋亡。令人惊讶的是，申请人已经发现，用抗IgE抗体靶向IgE的M1’区段能导致诱导B细胞凋亡。由于活化的B细胞的后代能导致生成和分泌分泌形式IgE的浆细胞，因此经由凋亡来消减生成IgE的B细胞为变应性/变态反应(allergy)的治疗提供了一种新的治疗办法。
发明概述
本发明提供了凋亡性抗IgE抗体或其功能性片段，及其在IgE介导的病症的治疗中的用途。本发明进一步提供了抑制B细胞生成和分泌IgE的组合物和方法。本发明进一步提供了特异性消减生成IgE的B细胞和降低总血清IgE的组合物和方法。
在一个实施方案中，本发明提供了抗IgE/M1’抗体，其特异性结合IgE的M1’区段且在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。在一个具体的方面，所述抗体特异性消减生成IgE的B细胞。在另一个具体的方面，所述抗体降低总血清IgE。在另又一个具体的方面，所述抗体降低总血清IgE和游离血清IgE二者。在又一个具体的方面，所述血清IgE是变应原特异的。在又一个具体的方面，所述抗体结合起源为人、恒河猴(rhesus monkey)和猕猴(cynomolgusmonkey)的IgE。在又一个具体的方面，所述抗体是嵌合的。在又一个具体的方面，所述抗体是人源化的。在又一个方面，所述抗体是人的。
在另一个实施方案中，本发明提供了抗IgE/M1’抗体，其特异性结合与图5A-5E中所鉴定的肽对应的任一M1’表位。在一个具体的方面，所述抗体特异性结合与选自下组的抗体所结合的表位相同的表位：47H4，7A6，26A11，47H4v5，7A6v1和26A11v6。在另一个具体的方面，所述抗体结合与选自下组的肽对应的表位：肽4(SEQ ID NO:8)，肽5(SEQ ID NO:9)，肽7(SEQ ID NO:11)或肽8(SEQ ID NO:12)。在另又一个具体的方面，所述抗体结合肽4(SEQID NO:8)。
在又另一个实施方案中，本发明提供了IgE的M1’表位，其选自下组：肽4(SEQ IDNO:8)，肽5(SEQ ID NO:9)，肽7(SEQ ID NO:11)或肽8(SEQ ID NO:12)。在一个具体的方面，所述M1’肽是肽4(SEQ ID NO:8)。
在又一个实施方案中，本发明提供了抗IgE抗体，其以鼠抗IgE/M1’抗体47H4或其人源化变体对人IgE的Scatchard结合亲和力相当的对人IgE的Scatchard结合亲和力特异性结合IgE的M1’区段。在一个具体的方面，所述亲和力相当于47H4的结合亲和力。在另一个具体的方面，所述亲和力介于0.30和0.83nm之间。在另又一个具体的方面，所述亲和力相当于47H4v5的结合亲和力。在又一个具体的方面，所述亲和力为约1.5nm。
在又一个实施方案中，本发明提供了抗IgE/M1’抗体，其包含在图6A-6F任一中出现的抗体的重链和轻链HVR。在一个具体的方面，所述抗体进一步包含在图6A-6F任一中出现的抗体序列的重链和轻链的可变区。在另一个具体的方面，所述抗体包含在图6A-6F任一中出现的抗体的全长重链和轻链。在另又一个具体的方面，所述抗体序列的重链和轻链在图6A-6F任一中显示。在又一个具体的方面，所述抗体选自下组：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。在又一个具体的方面，所述抗体为47H4v5。在又一个具体的方面，所述抗体是无岩藻糖基化的(afucosylated)。
在又一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含与至少一种药学可接受载体组合的抗IgE/M1’抗体，该抗IgE/M1’抗体包含在图6A-6F任一中出现的抗体的重链和轻链HVR。在一个具体的方面，所述抗体选自下组：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。在另一个具体的方面，所述抗体是47H4v5。在另又一个具体的方面，所述抗体是无岩藻糖基化的。
在又一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含与一种或多种选自下组的药物组合的抗IgE/M1’抗体，该抗IgE/M1’抗体包含在图8A-13H任一中出现的抗体的重链和轻链HVR：抗IgE抗体，抗组胺剂(antihistamine)，支气管扩张药(bronchodilator)，糖皮质激素(glucocorticoid)，NSAID，TNF拮抗剂，整联蛋白拮抗剂，免疫抑制剂(immunosuppressive agent)，IL-4拮抗剂，IL-13拮抗剂，双重IL-4/IL-13拮抗剂，DMARD，与B细胞表面标志物结合的抗体和BAFF拮抗剂。在一个具体的方面，所述组合物进一步包含至少一种药学可接受载体。
在又一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其编码在图6A-6F任一中出现的抗IgE/M1’抗体的重链HVR。在一个具体的方面，所述分离的核酸进一步包含编码在图6A-6F任一中出现的抗体的轻链HVR的核酸。在另一个具体的方面，所述抗体是嵌合的。在另又一个具体的方面，所述抗体是人源化的。在又一个方面，所述抗体是人的。在又一个具体的方面，所述抗体选自下组：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。在又一个具体的方面，所述抗体是47H4v5。在又一个具体的方面，所述抗体是无岩藻糖基化的。在又一个方面，所述核酸进一步构成对于所述核酸的表达合适的载体。在又一个具体的方面，所述载体进一步构成对于所述核酸的表达合适的宿主细胞。在又一个具体的方面，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在又一个具体的方面，所述真核细胞是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)。
在又一个实施方案中，本发明提供了制备特异性结合IgE的M1’区段的抗IgE/M1’抗体或其功能性片段的方法，包括在适合于生成此类抗体或片段的条件下培养含有对于表达合适的形式的、编码此类抗体或片段的核酸的宿主细胞，并回收所述抗体或片段。
在又一个实施方案中，本发明提供了制品，其包含封装本文中所公开的组合物的容器和指明用于IgE介导的病症的治疗的用途的包装插页。在一个具体的方面，所述制品是管形瓶(vial)。在另一个具体的方面，所述制品是预装填注射器(pre-filled syringe)。在另又一个具体的方面，所述预装填注射器被进一步包含在注射装置(injection device)内。在又一个具体的方面，所述注射装置是自我注射器(auto-injector)。
在又一个实施方案中，本发明提供了特异性消减生成IgE的B细胞的方法，包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，其特异性结合IgE的M1’区段且在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。在一个具体的方面，所述抗体包含在图6A-6F任一中出现的抗体的重链和轻链HVR。在另一个具体的方面，所述方法降低总血清IgE。在另又一个具体的方面，所述方法降低游离血清IgE和总血清IgE二者。在又一个具体的方面，所述血清IgE是变应原特异的。在又一个具体的方面，所述抗体选自下组：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。在又一个具体的方面，所述抗体是47H4v5。在又一个具体的方面，所述抗体具有ADCC活性。
在又一个实施方案中，本发明提供了治疗IgE介导的病症的方法，包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，其特异性结合IgE的M1’区段且在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。在一个具体的方面，所述抗体特异性消减生成IgE的B细胞。在另一个具体的方面，所述抗体降低总血清IgE。在另又一个具体的方面，所述抗体降低总IgE和游离IgE二者。在又一个具体的方面，所述血清IgE是变应原特异的。在又一个具体的方面，所述抗体包含在图6A-6F任一中出现的抗体的重链和轻链HVR。在又一个具体的方面，所述抗体选自下组：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。在又一个具体的方面，所述抗体是47H4v5。在又一个具体的方面，所述抗体具有ADCC活性。在又一个具体的方面，所述IgE介导的病症选自下组：变应性鼻炎(allergic rhinitis)，哮喘(asthma)(例如变应性哮喘(allergic asthma)和非变应性哮喘(non-allergic asthma))，特应性皮炎(atopic dermatitis)，变应性胃肠病(allergic gastroenteropathy)，超敏反应(hypersensitivity)(例如过敏反应(anaphylaxis)，荨麻疹(urticaria)，食物过敏(food allergies)等)，变应性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis)，寄生虫病(parasitic diseases)，间质性膀胱炎(interstitial cystitis)，高IgE综合征(hyper-IgE syndrome)，共济失调性毛细血管扩张症(ataxia-telangiectasia)，威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)，无胸腺淋巴组织增生(athymic lymphoplasia)，IgE骨髓瘤(IgEmyeloma)和移植物抗宿主反应(graft-versus-host reaction)。在还有又一个方面，所述IgE介导的病症是食物过敏(food allergy)，过敏反应(anaphylaxis)，接触性皮炎(contact dermatitis)和变态反应性紫癜(allergic purpura)。
在又一个实施方案中，本发明提供了治疗IgE介导的病症的方法，包括与治疗有效量的至少一种选自下组的药物组合地施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，其特异性结合IgE的M1’区段且在表达IgE的B细胞中诱导凋亡：抗IgE抗体，抗组胺剂，支气管扩张药，糖皮质激素，NSAID，解充血药(decongestant)，镇咳剂(cough suppressant)，镇痛药(analgesic)，TNF拮抗剂，整联蛋白拮抗剂，免疫抑制剂，IL-4拮抗剂，IL-13拮抗剂，双重IL-4/IL-13拮抗剂，DMARD，与B细胞表面标志物结合的抗体和BAFF拮抗剂。在一个具体的方面，所述抗体特异性消减生成IgE的B细胞。在另一个具体的方面，所述抗体降低总血清IgE。在另又一个具体的方面，所述抗体降低总IgE和游离IgE二者。在又一个具体的方面，所述血清IgE是变应原特异的。在又一个具体的方面，所述抗体包含在图6A-6F任一中出现的抗体的重链和轻链HVR。在又一个具体的方面，所述抗体选自下组：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。在又一个具体的方面，所述抗体是47H4v5。在又一个具体的方面，所述抗体具有ADCC活性。
在又一个实施方案中，本发明提供了治疗IgE介导的病症的方法，包括在变应性病症(变态反应性病症)的已知治疗方法的施用之前、同时或之后施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体的组合治疗，所述抗IgE/M1’抗体特异性结合IgE的M1’区段且在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。在一个具体的方面，所述组合包含抗IgE抗体、抗组胺剂、支气管扩张药、糖皮质激素、非类固醇抗炎药、免疫抑制剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、双重IL-4/IL-13拮抗剂、解充血药、镇咳剂或镇痛药的施用。在另一个具体的方面，所述抗IgE/M1’抗体是与变应原脱敏的治疗方案组合施用的。在一个具体的方面，所述抗体特异性消减生成IgE的B细胞。在另一个具体的方面，所述抗体降低总血清IgE。在另又一个具体的方面，所述抗体降低总IgE和血清IgE二者。在又一个具体的方面，所述血清IgE是变应原特异的。在又一个具体的方面，所述抗体包含在图6A-6F任一中出现的抗体的重链和轻链HVR。在又一个具体的方面，所述抗体选自下组：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。在又一个具体的方面，所述抗体是47H4v5。在又一个具体的方面，所述抗体具有ADCC活性。
在又一个实施方案中，本发明提供了预防变应原诱导的IgE生成的方法，包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，其特异性结合IgE的M1’区段且在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。在一个具体的方面，所述抗体包含在图6A-6F任一中出现的抗体的重链和轻链HVR。在另一个具体的方面，所述方法特异性消减生成IgE的B细胞。在另又一个具体的方面，所述方法降低总血清IgE。在又另一个具体的方面，所述方法降低游离血清IgE和总血清IgE二者。在又一个具体的方面，所述血清IgE是变应原特异的。在又一个具体的方面，所述抗体选自下组：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。在又一个具体的方面，所述抗体是47H4v5。在又一个具体的方面，所述抗体具有ADCC活性。
在又一个实施方案中，本发明提供了降低变应原诱导的IgE生成的方法，包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，其特异性结合IgE的M1’区段且在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。在一个具体的方面，所述抗体包含在图6A-6F任一中出现的抗体的重链和轻链HVR。在另一个具体的方面，所述方法特异性消减生成IgE的B细胞。在另又一个具体的方面，所述方法降低总血清IgE。在又一个具体的方面，所述方法降低游离血清IgE和总血清IgE二者。在又一个具体的方面，所述血清IgE是变应原特异的。在又一个具体的方面，所述抗体选自下组：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。在又一个具体的方面，所述抗体是47H4v5。在又一个具体的方面，所述抗体具有ADCC活性。
在又一个实施方案中，本发明提供了对于任何先前所述方法有用的组合物。
在又一个实施方案中，本发明提供了组合物用于任何先前所述方法的用途。
在又一个实施方案中，本发明提供了于2007年3月21日保藏于ATCC的鼠杂交瘤，其名称选自下组：7A6.18，1C11.10.20，47G4.6.2，47H4.12.10，42H4.6.9，42A5.20.11，26A11.6.5，51D2.22.15，45C1.6.14，26B11.3.12，28E9.12.9。在一个具体的方面，本发明提供了由所保藏的杂交瘤分泌的抗体。
在又一个实施方案中，本发明提供了表达IgE的人M1’区段的转基因动物。
本发明涉及下述各项。
1.一种抗IgE/M1’抗体，其特异性结合IgE的M1’区段且其在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。
2.项1的抗体，其中所述抗体结合起源为人、恒河猴和猕猴的IgE。
3.一种抗IgE/M1’抗体，其特异性结合IgE的M1’区段且在以治疗有效量体内施用于哺乳动物时特异性消减生成IgE的B细胞。
4.项3的抗体，其降低总血清IgE。
5.项4的抗体，其降低游离血清IgE。
6.项4的抗体，其中所述IgE是变应原特异的。
7.项3的抗体，其是嵌合的。
8.项3的抗体，其是人源化的。
9.项3的抗体，其是人的。
10.一种抗IgE/M1’抗体，其特异性结合与选自下组的抗体所结合的表位相同的表位：47H4，7A6，26A11，47H4v5，7A6v1和26A11v6。
11.项10的抗体，其中所述表位对应于选自下组的肽：肽4(SEQ ID NO:8)，肽5(SEQID NO:9)，肽7(SEQ ID NO:11)或肽8(SEQ ID NO:12)。
12.项11的抗体，其中所述表位对应于肽4(SEQ ID NO:8)。
13.一种肽，其选自下组：肽4(SEQ ID NO:8)，肽5(SEQ ID NO:9)，肽7(SEQ ID NO:11)或肽8(SEQ ID NO:12)。
14.一种抗IgE/M1’抗体，其以与鼠抗IgE/M1’抗体47H4的Scatchard结合亲和力相当的Scatchard结合亲和力特异性结合IgE的M1’区段。
15.项14的抗体，其中所述亲和力介于0.30和0.83nm之间。
16.一种抗IgE/M1’抗体，其以与人源化抗IgE/M1’抗体47H4v5的Scatchard结合亲和力相当的Scatchard结合亲和力特异性结合IgE的M1’区段。
17.项16的抗体，其中所述亲和力为约1.5nm。
18.一种抗IgE/M1’抗体，其包含选自下组的抗体和其抗原结合片段的重链和轻链HVR：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。
19.项18的抗体，其包含选自下组的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。
20.项18的抗体，其包含47H4v1-6的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链。
21.项18的抗体，其是无岩藻糖基化的。
22.一种组合物，其包含与至少一种药学可接受载体组合的项1-21任一项的抗体。
23.一种组合物，其包含与至少一种药学可接受载体和一种或多种选自下组的药物组合的项1-21任一项的抗体：抗IgE抗体，抗组胺剂，支气管扩张药，糖皮质激素，NSAID，TNF拮抗剂，整联蛋白拮抗剂，免疫抑制剂，IL-4拮抗剂，IL-13拮抗剂，双重IL-4/IL-13拮抗剂，DMARD，与B细胞表面标志物结合的抗体和BAFF拮抗剂。
24.一种分离的核酸，其编码包含选自下组的凋亡性抗IgE/M1’抗体或其抗原结合片段的重链和轻链HVR的抗体或其抗原结合片段：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。
25.项24的核酸，还包含编码选自下组的抗体序列的重链和轻链可变区的核酸：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。
26.项25的核酸，其中所编码的抗体是无岩藻糖基化的。
27.一种载体，其中可操作连接了项25的核酸。
28.一种宿主细胞，其包含项27的载体。
29.项28的宿主细胞，其是哺乳动物的。
30.项29的宿主细胞，其是中国仓鼠卵巢的。
31.一种用于生成凋亡性抗IgE/M1’抗体或功能性片段的方法，包括在适合于所述抗体或片段表达的条件下培养项28的宿主细胞，并回收所述抗体或片段。
32.一种制品，其封装项22的组合物和包装插页，所述包装插页指明用于IgE介导的病症的治疗的用途。
33.项32的制品，其为管形瓶。
34.项32的制品，其为预装填注射器。
35.项34的制品，还包含注射装置。
36.项35的制品，其是自我注射器。
37.一种用于特异性消减生成IgE的B细胞的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，该抗体特异性结合IgE的M1’区段且在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。
38.项37的方法，其中所述抗体包含选自下组的抗体的重链和轻链HVR：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。
39.项38的方法，还包括总血清IgE的降低。
40.项39的方法，还包括游离血清IgE的降低。
41.项39的方法，其中所述IgE是变应原特异的。
42.项38的方法，其中所述抗体具有ADCC活性。
43.一种治疗IgE介导的病症的方法，包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，该抗体特异性结合IgE的M1’区段且在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。
44.项43的方法，其中所述抗体特异性消减表达IgE的B细胞。
45.项43的方法，其中所述抗体降低总血清IgE。
46.项45的方法，其中所述抗体降低游离血清IgE。
47.项45的方法，其中所述IgE是变应原特异的。
48.项43的方法，其中所述抗体包含选自下组的抗体的重链和轻链HVR：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。
49.项43的方法，其中所述IgE介导的病症选自下组：变应性鼻炎，变应性哮喘，非变应性哮喘，特应性皮炎，变应性胃肠病，过敏反应，荨麻疹，食物过敏，变应性支气管肺曲霉病，寄生虫病，间质性膀胱炎，高IgE综合征，共济失调性毛细血管扩张症，威斯科特-奥尔德里奇综合征，无胸腺淋巴组织增生，IgE骨髓瘤，移植物抗宿主反应和变应性紫癜。
50.一种治疗IgE介导的病症的方法，包括与治疗有效量的至少一种选自下组的药物组合地施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，该抗IgE/M1’抗体特异性结合IgE的M1’区段且诱导表达IgE的B细胞凋亡：抗IgE抗体，抗组胺剂，支气管扩张药，糖皮质激素，NSAID，解充血药，镇咳剂，镇痛药，TNF拮抗剂，整联蛋白拮抗剂，免疫抑制剂，IL-4拮抗剂，IL-13拮抗剂，双重IL-4/IL-13拮抗剂，DMARD，与B细胞表面标志物结合的抗体和BAFF拮抗剂。在一个具体的方面，所述抗体特异性消减生成IgE的B细胞。
51.一种治疗IgE介导的病症的方法，包括在变应性病症的已知治疗方法的施用之前、同时或之后施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体组合治疗方案，所述抗IgE/M1’抗体特异性结合IgE的M1’区段且诱导表达IgE的B细胞凋亡。
52.项51的方法，其中所述变应性病症的已知治疗方法包括抗IgE抗体、抗组胺剂、支气管扩张药、糖皮质激素、非类固醇抗炎药、免疫抑制剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、双重IL-4/IL-13拮抗剂、解充血药、镇咳剂或镇痛药的施用。
53.项51的方法，其中所述变应性病症的已知治疗方法包括变应原脱敏的治疗方案。
54.一种用于预防变应原诱导的IgE生成的方法，包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，该抗体特异性结合IgE的M1’区段且诱导表达IgE的B细胞凋亡。
55.一种用于降低变应原诱导的IgE生成的方法，包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，该抗体特异性结合IgE的M1’区段且诱导表达IgE的B细胞凋亡。
56.一种鼠杂交瘤，其于2007年3月21日保藏于ATCC，该杂交瘤选自下组：PTA-8260，PTA-8261，PTA-8262，PTA-8263，PTA-8264，PTA-8265，PTA-8266，PTA-8267，PTA-8268，PTA-8269，PTA-8270。
57.一种抗体，其是由项52的杂交瘤分泌的。
58.一种转基因动物，其表达IgE的人M1’区段。
附图简述
图1A-1B是人(SEQ ID NO:1)、恒河猴(SEQ ID NO:2)和猕猴(SEQ ID NO:3)的IgE的选定恒定链区的比对。显示了CH2、CH3、CH4、M1’、跨膜和胞内域的大致位置。
图2A-1至2C-6是显示了各种抗M1’抗体的特异性的FACS Scatchard图。图2A-1至2A-6显示了针对短型IgE(缺失M1’)的结合，而图2B-1至2B-6显示了针对长型(具有M1’)的结合。图2C-1至2C-6显示了针对由U266细胞系表达的IgE的结合。带阴影的曲线显示对照抗体的荧光强度，而不带阴影的曲线显示测试抗体的相对荧光。图2D-2F显示了鼠抗IgE/M1’抗体47H4、26A11和7A6的结合特异性。图2D显示了47H4结合人、恒河猴、和猕猴IgE/M1’，但不结合缺乏M1’的IgE。图2E显示了47H4结合U266，而26A11和7A6不然。图2F显示了47H4和7A6结合恒河猴和猕猴M1’二者，而26A11只结合恒河猴的。图2G-2I显示了人源化抗IgE/M1’抗体47H4v5、26A11v6和7A6v1的结合特异性。图2G显示了所有三种人源化变体47H4v5、26A11v6和7A6v1都是对IgE-M1’特异性的，但对缺乏M1’的IgE不然。图2H显示了变体47H4v5和26A11v6结合U266，而7A6v1不然。图2I显示了47H4v5和7A6v1结合恒河猴和猕猴M1’，而26A11v6只结合恒河猴M1’。
图3A-3L是显示各种抗M1’抗体(使用图3M中指示的连续稀释度)的相对结合亲和力的FACS图。图3N显示了每种抗体的相对亲和力。图3O总结了鼠抗体47H4、26A11和7A6的亲和力，如通过针对人、恒河猴和猕猴M1’的Scatchard分析所测量的。除非另有说明，所报告的数值是平均值均值。图3P总结了所指明的抗体47H4和26A11人源化变体的亲和力，如通过针对人、恒河猴和猕猴M1’的Scatchard分析所测定的。
图4A-1至4D显示了抗M1’抗体的相对结合/阻断研究。图4A-1至4A-20是显示阻断或部分阻断结合的抗体的FACS图。图4B是显示阻断其它抗体结合的相对能力(部分地或完全地，使用1:1摩尔比)的二维图。图4C是更加关注具体指明的抗体的二维图，其中以10:1的摩尔比重复了阻断研究。图4D是显示源自表位结合/阻断研究的分组的示意图。
图5A-5C显示了使用47H4、7A6和26A11实施的表位结合研究。图5A显示了用于测定表位结合的包括毗邻N端和C端残基的M1’区段(SEQ ID NO:3)及M1’肽1-15(SEQ ID NO:5-19)。图5B和5D显示了亲本鼠抗体47H4结合肽4，7A6结合肽4和5，而26A11结合肽7和8。图5C和5E显示了人源化变体47H4v5结合肽4，而7A67v1结合肽4和5，而26A11v6结合肽7和8，由此保留亲本鼠抗体的表位特异性。
图6A-6F显示了鼠抗体26A11、7A6和47H4及其各种人源化变体的可变轻链和重链序列。各位置是依照Kabat编号的，而且框示了嫁接至可变共有网络(network)(用于轻链的κI，用于重链的亚组III)的高变区。图6A相对于人κI轻链(SEQ ID NO:20)显示了26A11(SEQID NO:21)和人源化变体1,4(SEQ ID NO:22)、变体2,5(SEQ ID NO:23)、变体3,6(SEQ IDNO:24)、变体13,15(SEQ ID NO:25)和变体14,16(SEQ ID NO:26)的可变轻链。图6B相对于人κI轻链(SEQ ID NO:20)显示了7A6(SEQ ID NO:27)和人源化变体1(SEQ ID NO:28)的可变轻链。图6C相对于人κI轻链(SEQ ID NO:20)显示了47H4(SEQ ID NO:29)和人源化变体1,3(SEQ ID NO:30)和变体2,4-6(SEQ ID NO:31)的可变轻链。图6D相对于人III重链(SEQ IDNO:32)显示了26A11(SEQ ID NO:33)和人源化变体1-3,13,14(SEQ ID NO:34)和变体4-6,15,16(SEQ ID NO:35)的可变重链。图6E相对于人重链(SEQ ID NO:32)显示了7A6(SEQ IDNO:36)和人源化变体1(SEQ ID NO:37)的可变重链。图6F相对于人III重链(SEQ ID NO:32)显示了47H4(SEQ ID NO:38)和人源化变体1,2(SEQ ID NO:39)、变体3-4(SEQ ID NO:40)、变体5(SEQ ID NO:41)和变体6(SEQ ID NO:42)的可变重链。
图7A-7G显示了亲本抗M1’抗体在受IgE-M1’转染的Daudi细胞中的凋亡活性。图7A是基本上显示IgM以高于IgE的水平表达的FACS图。图7B显示了交联抗IgM[F(ab’)2]抗体和应用喜树碱分别在诱导凋亡中的影响。对膜联蛋白染色呈阳性但对PI染色呈阴性的细胞正在死去，而对膜联蛋白和PI二者染色都呈阳性的细胞是死的。图7C是总的观察到的凋亡的图示，其中浅色柱显示膜联蛋白呈(+)和PI呈(-)的细胞，而暗色柱显示膜联蛋白呈(+)和PI呈(+)的细胞。图7D-7G是抗M1’在25、10、1、0.1、0.01和0.001μg/ml的浓度诱导的凋亡的图示。图7D显示了应用A1表位组的M1’抗体的结果，包括7A6、47H4、47G4、42A5、42H4(以及对照MAE-11和GP120)，没有交联。图7E显示了应用A2表位组(包括1C11、26A11、51D2、45C1)和B/C表位组(包括26B11和28E9)的M1’抗体的结果，没有交联。图7F显示了有交联的表位组A1，而图7G显示了有交联的表位组A2和B/C。
图8A-8B显示了人源化抗M1’变体在用IgE-M1’转染的、用各种人源化抗M1’抗体变体在25、10、1、0.1、0.01和0.001μg/ml的浓度处理的Daudi细胞中的凋亡活性。图8A显示了人源化变体47H4v5、26A11v6和7A6v1在30-40％的较高浓度水平范围内诱导凋亡(即10-25μg/ml 47H4和26A11变体，1、10和25μg 7A6变体)。图8B显示了相同抗体对IgE-M1’转染的、在存在山羊抗人IgG F(ab’)2交联抗体的情况中处理的Daudi细胞的凋亡活性。所有抗体诱导70-90％的最大限度凋亡水平，其中凋亡活性在高浓度有一些降低(例如47H4-v1、-v2、26A11-v1、-v14)。图8C显示了野生型和无岩藻糖基化47H4v5二者能够在相似水平诱导凋亡。
图9A至9B1-2显示了鼠抗M1’抗体在Daudi-IgE/M1’细胞中诱导钙流的能力。图9A是显示抗IgM和MAE11的效果的对照，而图9B-1至9B-2显示应用所示鼠抗M1’抗体的效果。
图10显示了人源化抗IgE/M1’抗体47H4v5野生型和无岩藻糖基化变体诱导ADCC的能力。虽然野生型和无岩藻糖基化变体诱导类似的最大限度细胞毒性，但是无岩藻糖基化变体(“AF”)比野生型更有效力(EC50AF≈0.83nM，EC50wt≈6.6nM)。
图11A-11F是鼠抗IgE/M1’抗体的重链和轻链的全长序列。可变区以斜体显示，而HVR(高变区)标有下划线。图11A显示了鼠抗体7A6的重链和轻链(分别为SEQ ID NO:43和44)。图11B显示了鼠抗体47H4的重链和轻链(分别为SEQ ID NO:45和46)。图11C显示了鼠抗体26A11的重链和轻链(分别为SEQ ID NO:47和48)。图11D显示了鼠抗体45C1的重链和轻链(分别为SEQ ID NO:49和50)。图11E显示了鼠抗体28E9的重链和轻链(分别是SEQ ID NO:51和52)。图11F显示了鼠抗体1C11的重链和轻链(分别是SEQ ID NO:53和54)。
图12A-12I演示了鼠抗IgE/M1’抗体在特应性hu-SCID模型中抑制生成血清IgE和IgE的浆细胞的生成所述IgE的能力。图12A是实验设计的图示。图12B-12C显示了鼠抗IgE/M1’抗体处理将IgE水平降低65-84％。图12D-12E显示了在体内IgE生成细胞的减少为19-69％。图12F-12G显示了其它免疫球蛋白(例如IgG1-4、IgA、IgM)的水平相对不受影响。图12H-12I显示了没有观察到脾的浆细胞总数的减少。
图13A-13H显示了人源化变体47H4v5对特应性hu-SCID模型中免疫球蛋白水平的影响。图13A是实验设计的图示。图13B-13D显示血清IgE降低了79％，而且生成IgE的浆细胞降低了75％。图13E-13F显示了其它血清免疫球蛋白的水平没有降低。图13G-13H显示了总浆细胞水平没有降低，如此证明了47H4特异性减少生成IgE的浆细胞，其占总浆细胞的很小比例。
图14A-14D图示了huM1’敲入小鼠的生成。图14A显示了M1’外显子在小鼠IgE基因座上的定位。图14B显示了小鼠IgE基因座中导致目标等位基因创建的重组的示意图。图14C显示了野生型小鼠中668bp条带和M1’敲入小鼠中457bp条带的PCR基因分型。图14D显示了Southern印迹，其中野生型小鼠的7.4kB HindIII片段变成hu-M1’敲入小鼠中的3kB片段，而14.1kB BamHI片段变成hu-M1’敲入等位基因中的18.1片段。显示了野生型和杂合两种小鼠。
图15A-15I显示了抗IgE/M1’抗体在初次(primary)免疫应答中阻止IgE生成的能力。图15A是显示实验设计的时间线的示意图，包括施用TNP/OVA和抗IgE/M1’抗体。图15B是抗原特异性IgE水平随时间的图，显示了虽然对照动物中的抗原特异性IgE水平(即gp120)在第8天和第14天之间达到峰水平，但是抗IgE/M1’阻止任何升高，而且测量到的抗原特异性IgE水平与未免疫小鼠没有显著差异。图15C-15D显示了抗IgE/M1’处理阻止第8天和第14天抗原特异性血清IgE的升高，而且与未免疫小鼠没有统计学差异(图15E)。图15F-15I显示了在实验的28天里抗原特异性IgG1水平不受抗IgE/M1’的显著影响(除了第15天的适度差异)。
图16A-16K显示了抗IgE/M1’抗体在记忆或再次(second)免疫应答中阻止抗原特异性IgE生成的能力。图16A是显示二次加强免疫TNP-OVA和施用抗IgE/M1’抗体(其在第28天首次施用)的时间线的示意图。图16B是抗原特异性IgE水平随时间的图，显示了针对第28天TNP-OVA加强免疫的再次IgE应答更加快速，在4天后而非初次应答中的8-9天后达到峰值。图16C-16D显示了抗IgE/M1’处理的动物中的抗原特异性IgE水平与同种型对照相比显著降低，到第32天降低了59-65％，而到第35天降低了90-93％。图16E显示了到第42天(初始施用抗IgE 12天)，抗原特异性IgE水平降低至与未接触抗原的对照小鼠没有统计学差异的水平。图16F-16H显示了在第28天和第49天之间，施用抗IgE/M1’将血清IgE水平降低了74-84％，抗原特异性IgE的平均日水平也降低了74-83％。图16I-16K显示了抗原特异性IgG1水平不受抗IgE/M1’的显著影响。
图17A-17D图示了抗IgE/M1’抗体预防性降低IgE应答巴西钩虫(Nippostrongylusbrasiliensis)(“NB”)感染而生成的能力。图17A是显示实验设计的示意图。自第0天开始，直至第21天，每周三次处理动物。图17B显示了随时间的应答NB感染及抗IgE/M1’和对照抗体的IgE水平。图17C-17D显示了在第15天，抗IgE/M1’处理的动物具有降低的血清IgE水平，与未感染小鼠没有统计学显著差异。
图18A-18I图示了抗IgE/M1’抗体治疗性处理应答巴西钩虫(“NB”)感染的峰IgE的能力。图18A是显示实验设计的示意图。动物在第11天和第21天之间每周处理三次。图18B显示了随时间的应答NB感染及抗IgE/M1’和对照抗体的IgE水平。图18C-18D显示了抗IgE/M1’在处理4天内将血清IgE水平降低了82-89％。图18E显示了到第21天抗IgE/M1’处理动物中的IgE水平降低了97-98％，达到与未感染对照组没有统计学显著差异的水平。图18F-18G显示了淋巴结和脾中的生成IgE的浆细胞(如通过Elispot定量的)分别减少了88-94％和57-66％。图18H-18I显示了所有处理组中淋巴结和脾中的总浆细胞(CD138+)与未感染小鼠相比增加，而且抗IgE/M1’处理不显著改变任一器官中的浆细胞总数。这些结果证明了抗IgE/M1’抗体在体内通过消减IgE生成细胞来降低血清IgE水平的能力。
图19A-19G图示了抗IgE/M1’抗体治疗性处理巴西钩虫(“NB”)感染的感染周期的晚期发生的IgE应答的能力。图19A是显示实验设计的示意图，其中自第40天开始每周三次处理动物。图19B显示了峰IgE生成在第15天左右发生，而且所有抗IgE/M1’抗体均降低血清IgE。图19C-19D显示了抗IgE/M1’抗体在绝对和标准化IgE水平两个方面都显示相对于处理开始时的显著降低。图19E-19G显示了在第48天和第55天之间与抗gp120mIgG1同种型对照相比抗IgE/M1’处理显著降低血清IgE水平。
发明详述
通过述及明确收录本文中所提到的所有参考文献。
通用技术
除非另有说明，本发明的实施会采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。文献中充分阐述了这些技术，诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(Sambrook等,1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等编,1987,及定期更新)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis等编,1994)；A Practical Guide to Molecular Cloning(PerbalBernard V.,1988)；Phage Display:A Laboratory Manual(Barbas等,2001)。
淋巴细胞发育和活化
人类中的两大类淋巴细胞是T(胸腺衍生的)和B(骨髓衍生的)。这些细胞衍生自骨髓和胎肝中交付淋巴样发育途径的造血干细胞。这些干细胞的后代沿着有不同的途径，发育成B淋巴细胞或T淋巴细胞。人类B淋巴细胞发育完全在骨髓内发生。另一方面，T细胞自未成熟前体发育而成，所述未成熟前体离开骨髓并通过血流移动至胸腺，在那里它们增殖并分化成成熟T淋巴细胞。
自胸腺或骨髓出现的成熟淋巴细胞是处于休眠或“静止”状态的，即它们是没有有丝分裂活性的。当被分配入血流时，这些“未接触抗原的”或“处女”淋巴细胞移动入各种次级或周围淋巴样器官，诸如脾、淋巴结或扁桃体。大多数处女淋巴细胞具有内在的短寿命且在离开骨髓或胸腺后几天就死亡。然而，如果这样的细胞接受到指示抗原存在的信号，它们可活化和经历连续多轮细胞分裂。然后，一些所得后代细胞恢复成静止状态，以变成记忆淋巴细胞－为下一次遭遇所述刺激性变应原而本质上已被激发的B和T细胞。被活化的处女淋巴细胞的其它后代是效应细胞，其只存活几天，但是执行特异性防御活性。
淋巴细胞活化指一系列有序事件，即静止的淋巴细胞在它受到刺激以分裂和生成后代时所经历的，其中有些后代变成效应细胞。完全应答包括对细胞增殖(有丝分裂)的诱导和免疫学功能的表达二者。当特定配体结合至淋巴细胞表面上的受体时，该淋巴细胞变成活化的。针对T细胞和B细胞的配体是不同的，但是所致胞内生理学机制是相似的。
虽然外来抗原自身能诱导淋巴细胞活化，尤其是交联B细胞上的表面免疫球蛋白或T细胞上的其它糖蛋白的大型多聚体抗原。然而，大多数抗原不是多聚体的，而且甚至在直接结合大量B细胞而未能导致活化时。当B细胞受到近乎活化的辅助T淋巴细胞的共刺激时，B细胞是被这些更常见的抗原活化的。此类刺激可以是因T细胞所分泌的淋巴因子而发生的，但是通过B细胞与T细胞表面蛋白质(它们与某些B细胞表面受体相互作用以生成二级信号)的直接接触而最有效传播的。
B细胞
B细胞的定义性特征是合成免疫球蛋白的能力。免疫球蛋白(Ig)是极端多样的蛋白质家族，由称作重链和轻链的相关类型的多肽构成。每一种Ig以高亲和力特异性结合它自己的特定抗原。产生B细胞能表达两种不同类型的免疫球蛋白，其中每一种承担独特的功能。在静止B淋巴细胞(处女或记忆)中，免疫球蛋白只在细胞表面上表达，在那里它们本质上作为特定抗原的膜结合受体起作用。相反，B细胞效应细胞(浆细胞)将免疫球蛋白分泌入周围环境。此类分泌的免疫球蛋白保留识别和结合的能力(相对于静止B细胞上的膜结合形式)，而且通常称作抗体。
当活化的B淋巴细胞分裂时，它的一些后代变成记忆B细胞，而剩余后代分化成浆细胞。由于浆细胞具有相对较短的寿命，除非生成新的浆细胞，该群体很快死去且不再分泌免疫球蛋白。因此，B细胞的活化通常导致瞬时的增殖波，接着是在数天或几周里升高然后减退的抗体分泌爆发。B细胞是涉及体液免疫或经由组织液介导的保护效应的主要细胞类型。因为本发明的抗IgE/M1’抗体实际上消减B细胞，包括记忆B细胞，所以它们可用于“重设”记忆。如此，这样的效果可以是能削弱(如果不是消除的话)在个体中驱动变应性应答的B细胞成分。
T细胞
T淋巴细胞不表达免疫球蛋白，但是改为经由称作T细胞受体的表面蛋白质来探测外来物质的存在。这些受体或是通过直接接触或是经由影响其它免疫细胞的活性来识别抗原。与巨噬细胞一起，T细胞是涉及细胞介导的免疫的主要细胞类型。
与B细胞不同，T细胞只能在特定环境中探测外来物质。具体而言，只有外来蛋白质首先被切割成小肽，其继而展示在称作抗原呈递细胞(APC)的第二宿主细胞的表面上，T淋巴细胞才会识别外来蛋白质。许多类型的宿主细胞能在一些条件下呈递抗原，但是某些类型更特异性地适应此目的且在控制T细胞活性中是特别重要的，包括巨噬细胞和其它B细胞。抗原呈递作用部分依赖于呈递细胞表面上称作主要组织相容性复合物(MHC)蛋白质的特定蛋白质。如此，为了刺激细胞介导的免疫，必须将外来肽与MHC肽组合地呈递给T细胞，而且这种组合必须受到T细胞受体的识别。
有两个重要的T细胞子集：细胞毒性T淋巴细胞(TC细胞或CTL)和辅助T细胞(TH细胞)，它们粗略地能根据标志物CD8和CD4的细胞表面表达来鉴定。TC细胞在病毒防御中是重要的，而且能通过识别某些细胞表面表达的病毒肽而直接杀死病毒。TH细胞促进其它细胞类型的增殖、成熟和免疫学功能(例如淋巴因子分泌)以控制B细胞、巨噬细胞和细胞毒性T细胞的活性。处女和记忆T淋巴细胞二者通常保持在静止状态，而且在这种状态中它们不展示显著的辅助或细胞毒活性。当活化时，这些细胞经历数轮有丝分裂以生成子细胞。这些子细胞中的一些作为记忆细胞恢复成静止状态，但是其它变成积极表达细胞毒活性辅助物的效应细胞。这些子细胞像它们的亲本：CD4+细胞只能生成CD4+后代，而CD8+细胞只产生CD8+后代。效应器T细胞表达在静止T细胞上不表达的细胞表面标志物，诸如CD25、CD28、CD29、CD40L、运铁蛋白受体和II类MHC蛋白。当活化性刺激消退时，随着效应细胞死亡或恢复静止状态，细胞毒或辅助活性在数天的时间段里逐渐减退。
与B细胞活化类似，对大多数抗原的T淋巴细胞应答也需要两类同时刺激。第一个是抗原，其在由MHC蛋白适当地展示在抗原呈递细胞上时能被T细胞受体所识别和结合。虽然此抗原-MHC复合物确实将信号传递至细胞内部，但是这通常不足以导致T细胞活化。完全活化(诸如辅助T细胞所发生的)需要在抗原呈递细胞的表面上表达的称作共刺激物的其它特定配体的共刺激。另一方面，细胞毒性T细胞的活化一般需要IL-2，即由活化的辅助T细胞分泌的一种细胞因子。
免疫应答
哺乳动物免疫系统使之区别于身体其它防御的三项主要功能特性包括：(1)特异性－在大量的靶分子中个别地识别和应答或不应答的能力；(2)辨别－确定自身与非自身，从而与所有的无数种蛋白质和其它有机物质和平共处，但仍针对进入身体的外来物质强烈应答的能力；和(3)记忆－根据经验铸模，使得后续遭遇特定外来病原体时会引起比初次遭遇时所发生的更加迅速且强烈的响应的能力。因为本发明的IgE拮抗剂在携带IgE的B细胞中诱导凋亡，所以预期它们削弱或甚至消除对特定抗原的免疫记忆。当对常见变应原的强烈免疫应答是病理性的时候，诸如特应性病症的情况中，预期这是特别有益的。
处女淋巴细胞不断地自初次淋巴样器官释放入周围，每一个携带能够进行抗原结合的表面受体。B细胞中的抗原结合是经由表面结合的免疫球蛋白介导的，而在T细胞中这是由T细胞受体介导的。当处女淋巴细胞没有活化的时候，它们在进入周围后几天内死亡。那些被活化的存活并增殖，产生子细胞，它们然后可经历更多轮活化和增殖。对给定抗原的应答的速度和强度主要取决于克隆选择：对特定抗原特异性的子细胞或克隆群体越大，能识别和参与免疫应答的细胞的数目就越大。每一次免疫应答都是复杂的，而且错综复杂地调节涉及数种细胞类型的事件的顺序。当免疫原进入身体并遭遇称作抗原呈递细胞(APC)的专门化类别的细胞时，免疫应答被触发。这些APC捕捉微量的免疫原并以能被抗原特异性辅助T淋巴细胞识别的形式展示它。然后，辅助T细胞变成活化的，并继而促进其它类别的淋巴细胞活化，诸如B细胞或细胞毒性T细胞。然后，活化的淋巴细胞增殖并执行它们的特定效应器功能。在此过程中的每个阶段，淋巴细胞和APC经由直接接触或通过分泌调控性细胞因子而彼此通讯交流。
被APC捕获的外源抗原经历称作抗原加工的一系列改变。此类加工(尤其是蛋白质性质的免疫原)涉及变性和部分蛋白水解消化，使得免疫原被切割成短肽。然后，有限数目的所得肽与II类MHC蛋白非共价结合并转运至APC表面，即称作抗原呈递的过程。与APC直接接触的CD4+辅助T淋巴细胞可变成活化的，但是它只在它表达能识别和结合APC所呈递的特定肽-MHC复合物的T细胞受体蛋白时才会这样做。
辅助T(TH)细胞是免疫应答的主要协调者，因为它们是两种其它淋巴效应细胞的活化所需要的：细胞毒性T(TC)细胞和分泌抗体的浆细胞。TH活化在免疫应答早期发生，而且需要至少两种信号。一种信号是由T细胞抗原受体结合APC表面上的抗原肽-MHC复合物提供的，经由CD3蛋白复合物传播，而认为第二种，经由APC的共刺激信号源自T细胞表面上分开的信号传播蛋白与APC上的特定配体结合。一种已知的此类相互作用是T细胞蛋白CD28和称作B7的APC表面蛋白家族。其它表面蛋白对也可介导共刺激。
总之，这两种信号诱导辅助T细胞开始分泌称作白介素-2(IL-2)的细胞因子，还有开始在其表面上表达特异性高亲和力IL-2受体。IL-2是对T淋巴细胞高度有力的促有丝分裂因子，而且对应活化的T细胞的增殖应答是至关重要的。IL-2对分泌它的细胞起作用－一种称作自分泌效应的现象。已经进一步显示了，即使T细胞接受到这两种信号，如果它自己的表面IL-2受体被阻断，那么它也不会增殖。IL-2还能在所谓的旁分泌效应中作用于紧邻的细胞。这种效应对于活化TC细胞尤其重要，TC细胞一般不生成足够的IL-2来刺激它们自己的增殖。在IL-2之外，活化的TH细胞分泌其它细胞因子并促进B细胞、巨噬细胞和其它细胞类型的生长、分化、和功能。
APC与抗原特异性TH细胞之间的接触对APC也有影响－其中最重要的一条是释放IL-1。认为这种细胞因子以自分泌方式起作用，以提高II类MHC蛋白和多种粘附分子的表面表达，由此加强TH细胞的结合和增强抗原呈递。同时，IL-1以旁分泌方式作用于TH细胞以促进IL-2分泌和IL-2受体表达。
在TH细胞以先前所述方式活化期间，有些B细胞也可经由它们的抗原受体结合免疫球蛋白，其中所述抗原受体是B细胞稍后会分泌的抗体的模结合形式。与T细胞不同，B细胞识别游离的、未加工的形式的免疫原。特异性抗原结合提供了能导致B细胞活化的一类信号。第二类由活化的TH细胞提供，其表达通过结合B细胞表面上的非免疫球蛋白受体而有助于活化B细胞的蛋白质。这些不管B细胞的抗原特异性而作用于任何B细胞的、TH衍生的信号称作辅助因子。这些辅助因子包括IL-2、IL-4和IL-6。然而，辅助经由细胞－细胞接触而更加有效地实现，其中细胞－细胞接触容许T细胞表面上的蛋白质直接接触B细胞上的蛋白质。最有效形式的、接触介导的辅助在称作CD40配体(CD40L)的蛋白质结合B细胞上称作CD40的蛋白质时发生，其中CD40L只在TH细胞变成活化的TH细胞后在TH细胞上表达。在称作旁路活化(by-stander activation)的过程中，与活化的B细胞的接触甚至能足以活化静止B细胞，即使其表面免疫球蛋白尚未结合抗原。
TC淋巴细胞发挥根除在其表面上表达外来抗原的细胞的功能，诸如受到病毒感染的宿主细胞。大多数TC细胞表达CD8而不是CD4，并因此识别与I类而不是II类MHC蛋白结合的抗原。当体细胞受到表达感染时，有些免疫原性病毒蛋白质可以在细胞内发生加工，然后所得肽可以作为与I类MHC分子的表面复合物出现。然后，这些肽-MHC复合物可以受到抗原特异性克隆的T细胞受体的识别，提供TC细胞活化所必需的两种信号之一。此第一信号单独在TC细胞上诱导高亲和力IL-2受体。第二信号由自附近的活化的TH淋巴细胞分泌的IL-2提供。在接受到这两种信号时，活化的TC细胞获得了细胞毒性活性，使之能够杀死它所结合的细胞，以及携带相同肽-MHC I类复合物的任何其它细胞。在有些情况中，杀死是因为TC将特定毒素释放到靶细胞上而发生的；在其它情况中，TC诱导靶细胞通过凋亡进行自杀。活化的TC细胞还增殖，产生具有相同抗原特异性的别的TC细胞。
IgE/肥大细胞/调解途径
通过分子的Fc部分结合至称作FcεRI的高亲和力细胞表面受体，IgE抗体固定至肥大细胞和嗜碱性细胞的表面。在多价变应原分子结合占据这些受体的抗体时，变应性反应启动。结果是FcεRI的桥接，其继而在胞内发信号，引起炎症介导物的释放和活化：组胺，白三烯，趋化因子，血小板活化因子，和蛋白酶。这些被活化的介导物局部地发挥作用并引起升高的血管通透性、血管舒张、平滑肌收缩和粘液腺分泌。此类事件在临床上称作立即期或早期事件，而且在变应原暴露后的前15-30分钟内发生。在随后的12小时里，应答尚未完全了解的其它化学介导物，发生炎症细胞的渐进性组织浸润，自嗜中性细胞进行至嗜曙红细胞再至单个核细胞。变应原暴露后6-12小时的这段时间称作晚期且以细胞炎症的临床表现为特征。鉴于晚期反应，尤其是在肺中，是在早期反应缺失的情况中发生的，仍然尚未完全了解晚期反应是否必然是IgE介导的。
这种机制主要引起过敏反应、荨麻疹和特应性(变态反应性)疾病，诸如变应性鼻炎、变应性哮喘、特应性皮炎和变应性胃肠病。
效应器T淋巴细胞/淋巴因子途径
某些变应性疾病是由变应原反应介导的，其中效应器T淋巴细胞对来自在先暴露的特定变应原致敏。当遭遇变应原时，CD4+T细胞变成活化的，以生成淋巴因子，该结果持续数天，并伴有单个核细胞浸润物累计。
I.定义
“变应原”或“免疫原”指任何能触发免疫应答的分子。如本文中所使用的，该术语覆盖抗原性分子自身或其来源，诸如花粉粒、动物毛发皮屑、昆虫毒液或食品。这与术语抗原形成对比，后者指能被免疫球蛋白或T细胞受体特异性识别的分子。任何能够诱导免疫应答的外来物质是潜在的变应原。已知，天然的和合成的这两种来源的许多不同化学制品是变应原性的。复杂的天然有机化学制品，尤其是蛋白质，有可能引起抗体介导的变态反应，而简单的有机化合物、无机化学制品、和金属更优先引起T细胞介导的变态反应。在有些情况中，相同的变应原可负责超过一种变态反应。暴露于变应原可以经由吸入、注射、注射、或皮肤接触实现。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、双抗体、和单链分子，以及抗体片段(例如Fab、F(ab')2、和Fv)。在本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”可互换使用。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，而且包含10个抗原结合位点，而IgA抗体包含与J链组合的2-5个能聚合而形成多价装配物的基本4链单元。在IgG的情况中，4链单元通常是约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在N-末端具有一个可变区(VH)，接着是三个(对于α和γ链)或四个(对于μ和ε同种型)恒定区(CH)。每条轻链在N-末端具有一个可变区(VL)，接着是其另一端的一个恒定区(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链第一恒定区(CH1)排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。一个VH和一个VL一起配对而形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basicand Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and TristramG.Parsolw(编),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,page 71and Chapter 6。
根据其恒定区氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定区(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人类表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
“分离的”抗体指已经鉴定，自其生成环境(例如天然的或重组的)的一种成分分开和/或回收的抗体。优选地，分离的多肽与来自其生成环境的所有其它成分没有关联。其生成环境的污染性成分(诸如源自重组转染细胞的)指通常会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将多肽纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95％，而在有些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的多肽或抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链可变域和轻链可变域分别可以称为“VH”和“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分(相对于同一类的其它抗体而言)且包含抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域中的某些区段在抗体间序列差异广泛的实情。V结构域介导抗原结合且限定每种特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变域的整个跨度。而是，它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of ImmunologicalInterest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein.,Nature,256:495-97(1975)；Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nded.1988)；Hammerling et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Leeet al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovitset al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Markset al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild et al.,NatureBiotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；Lonbergand Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
术语“裸抗体(裸露的抗体)”指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
术语“全长抗体”和“完整抗体”可互换使用，指基本上完整形式的抗体，与抗体片段不同。具体而言，完整抗体包括那些具有重链和轻链(包括Fc区)的。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。在有些情况中，完整抗体可具有一项或多项效应器功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870,实施例2；Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由一条完整轻链及一条重链的可变区(VH)和第一恒定区(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即它具有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab')2片段，它大体相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应器功能由Fc区中的序列来决定，该区域也受到在某些类型的细胞上找到的Fc受体(FcR)识别。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中生发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”，也缩写成“sFv”或“scFv”，是包含连接成一条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得sFv能够形成结合抗原的期望结构。关于sFv的综述参见Pluckthun，于《The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。
本发明抗体的“功能性片段”包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合或可变区或抗体的保留或具有改良FcR结合能力的Fc区。抗体片段的例子包括线性抗体、单链抗体分子和自抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“双抗体”指通过在VH和VL结构域之间使用短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见上一段)而制备的小型抗体片段，由于接头短，使得V结构域实行链间而非链内配对，由此导致二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同多肽链上。双抗体更详细的描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过用感兴趣抗原免疫短尾猴(macaque monkey)而生成的抗体。如本文中所使用的，“人源化抗体”是“嵌合抗体”的一个子集。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物)的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白序列的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区，尽管FR区可包含一处或多处改进抗体性能(诸如结合亲和力、异构化、免疫原性等)的个别FR残基替代。FR中这些氨基酸替代的数目，H链中通常不超过6处，L链通常不超过3处。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk and van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失去能力的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.,Proc.Natl.Ascad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.Immunity 13:37-45(2000)；Johnson and Wu于:Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；及Sheriffet al.,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)的HVR是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.,见上文)。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或47-65(优选的实施方案)(H2)和93-102(H3)。对于这些延伸的HVR定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等,见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。
表述“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变体指Kabat et al.,见上文中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。在有些实施方案中，预先存在的氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变区序列亚型。通常，序列亚型是如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，亚型是如Kabat等人，见上文中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，亚型是如Kabat等人，见上文中的亚型III。
“VH亚型III共有框架”包含从Kabat等,见上文的可变重链亚型III中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VH亚型III共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个全部：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(H1)(SEQ ID NO:55),WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:56)(H2),RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:57)(H3),WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:58)(H4)。
“VL亚型I共有框架”包含从Kabat等,见上文的可变轻链κ亚型I中的氨基酸序列获得的共有序列。在一个实施方案中，VL亚型I共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整个：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:59)(L1),WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:60)(L2),GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:61)(L3),FGQGTKVEIKR(SEQ IDNO:62)(L4).
指定位置(例如Fc区的)处的“氨基酸修饰”指指定残基的替代或删除，或指定残基附近至少一个氨基酸残基的插入。指定残基“附近”的插入意味着其一个至两个残基内的插入。插入可以在指定残基的N端或C端。本文中优选的氨基酸修饰是替代。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。例如，Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变：例如，Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier etal.,Gene 169:147-155(1995)；Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位或者对其“特异”的抗体指结合该特定多肽或特定多肽上的表位且基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。例如本发明的M1’特异性抗体是对在B细胞上结合的IgE上找到的、但在分泌型IgE上不存在的IgE M1’胞外区段特异性的。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。在有些实施方案中，阻断性抗体或拮抗性抗体实质性地或完全地抑制抗原的生物学活性。本发明的凋亡性抗IgE抗体以降低游离血清IgE和总血清IgE二者的方式阻断IgE介导免疫应答的活性。
“诱导凋亡”的或“凋亡性的”抗体指那些根据标准凋亡测定法的测定，诱导程序性细胞死亡的抗体，所述测定法诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)形成。例如，本发明抗IgE抗体的凋亡活性可通过膜联蛋白V对表面结合的IgE的细胞染色来显示。
术语“总血清IgE”指样品中存在的IgE的总量，包括游离的或结合的二者，以及与结合配偶(例如抗IgE抗体、携带IgE的B细胞)复合的IgE。“游离血清IgE”指未结合至结合配偶的IgE。
术语“变应原特异性IgE”指对特定抗原特异性的，源自称作变应原致敏的过程中对变应原的初始暴露的，结合肥大细胞和嗜碱性细胞的表面且能在对相同变应原的后续暴露时导致肥大细胞和嗜碱性细胞活化的IgE。病毒(例如巨细胞病毒(CMV))、细菌(例如葡萄球菌)、蠕虫(例如蛔虫、血吸虫)中的数种促有丝分裂因子和空气污染中的辅助因子(例如烟、和柴油机废气)在不启动任何变应原特异性IgE致敏的情况下刺激IgE分子的生成。如此，因为IgE水平可以以不必然使宿主倾向于变成对IgE介导的病症更加易感的方式升高，所以有时在临床评估中使用变应原特异性IgE水平。
术语“特异性消减生成IgE的B细胞”意指特异性减少/降低专门分泌IgE的B细胞(即浆细胞)的群体或效力，但不显著影响分泌其它免疫球蛋白(诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM)的B细胞的群体或效力的能力。
术语“固相”描述本发明的抗体可粘着其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利No.4,275,149中所记载的。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是通过此机制杀死靶细胞所要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.,PNAS USA 95:652-656(1998)中所披露的。
除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat et al.,见上文中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一K447残基被消除的抗体群、或者混合了有和无K447残基的抗体的抗体群。对于在本发明的抗体中使用而言合适的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；deHaas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward,Immunol Today 18(12):592-8(1997)；Ghetie et al.,Nature Biotechnology,15(7):637-40(1997)；Hinton etal.,J.Biol.Chem 279(8):6213-6(2004)；and WO2004/92219(Hinton et al.))。
可测定人FcRn高亲和力结合多肽与FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO2000/42072(Presta)记载了对FcR的结合得到改良或消除的抗体变体。还可参见例如Shields et al.J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和MNK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所记载的。
具有更改的Fc区氨基酸序列及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1和WO 99/51642。在此明确收入那些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
IgG中的N-糖基化位点位于CH2结构域中的Asn297。本发明还提供了具有Fc区的结合CD20的人源化抗体的组合物，其中组合物中大约80-100％(优选大约90-99％)的抗体包含缺少岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构，附着于糖蛋白的Fc区。此类组合物在本文中证实展现出与FcγRIIIA(F158)结合方面惊人的改善，在与人IgG相互作用方面FcγRIIIA(F158)不像FcγRIIIA(V158)那样有效。如此，预期本文中的组合物优于先前记载的抗CD20抗体组合物，尤其是用于表达FcγRIIIA(F158)的人类患者的治疗。在正常的、健康的非洲裔美国人和高加索人中FcγRIIIA(F158)比FcγRIIIA(V158)更常见。参见Lehrnbecher etal.,Blood 94:4220(1999)。本申请进一步证明了组合本文中的糖基化变异与糖蛋白Fc区中的氨基酸序列修饰而引起的FcγRIII结合和/或ADCC功能的协同性升高。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了关于测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。
在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen,etal.,J Mol Biol 293:865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(DYNEX Technologies,Inc.)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白在室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta etal.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如约65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0.1％TWEEN-20TM表面活性剂的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一实施方案，Kd是通过表面等离振子共振测定法使用或仪器(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％TWEEN-20TM表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen et al.,J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS、pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
依照本发明的“结合速率”(on-rate,rate of association,association rate)或“kon”也可如上所述使用或系统(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)来测定。
短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值(通常一个与某分子有关而另一个与参照/比较分子有关)之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约40％，和/或大于约50％。
短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(例如，一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，和/或小于约10％。
关于肽、多肽或抗体序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”和“同源性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用由Genentech公司编写的序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2的源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco,California)得到ALIGN-2程序。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。
除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
“分离的”编码本文中抗体的核酸分子指已经鉴定且与生成它的环境中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。优选地，分离的核酸与同生成环境有关的所有成分没有关联。分离的编码本文中多肽和抗体的核酸分子处于不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与细胞中天然存在的编码本文中多肽和抗体的核酸有区别。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
术语“表位标记的”在用于本文时指包含本文中所描述的多肽或抗体且其与“标签多肽”融合的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8个和约50个氨基酸残基之间(优选在约10个和约20个氨基酸残基之间)。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。Ig融合体优选在Ig分子的至少一个可变域中包含本文中所描述的多肽或抗体的结构域的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的铰链、CH2和CH3，或铰链、CH1、CH2和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的生成，还可参见1995年6月27日公告的美国专利No.5,428,130。例如，作为对于本文中的组合疗法有用的第二药物的有用免疫粘附素包括包含BLyS受体的BLyS结合部分且BR3、TACI或BCMA的跨膜没有融合至免疫球蛋白序列恒定域的多肽。
“融合蛋白”和“融合多肽”指两个部分共价连接到一起的多肽，其中每个部分是具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物学特性，诸如体外或体内活性。所述特性还可以是简单的化学或物理特性，诸如结合靶分子、催化反应等。所述两个部分可以通过单一肽键或者经由肽接头直接相连，它们彼此会在同一读码框内。
“稳定的”配制剂指在贮存后其中的蛋白质基本上保持其物理和化学稳定性和完整性的配制剂。本领域有用于测量蛋白质稳定性的多种分析技术，综述见Peptide andProtein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee编,Marcel Dekker,Inc.,New York,NewYork,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。可以在选定的温度对选定的时间段测量稳定性。对于快速筛选，可以将配制剂于40℃保持2周至1个月，那时测量稳定性。若配制剂要于2-8℃贮存，则一般配制剂应于30℃或40℃稳定至少1个月和/或于2-8℃稳定至少2年。若配制剂要于30℃贮存，则一般配制剂应于30℃稳定至少2年和/或于40℃稳定至少6个月。例如，可以使用贮存期间的聚集程度作为蛋白质稳定性的指标。如此，“稳定的”配制剂可以是其中少于约10％且优选少于约5％的蛋白质以聚集物存在的配制剂。在其它实施方案中，可以测定配制剂贮存期间聚集物形成的任何增加。
“重建的”配制剂指如下制备的配制剂，即在稀释剂中溶解冻干的蛋白质或抗体配制剂，使得蛋白质到处散布。重建的配制剂适合于施用(例如胃肠外施用)于要用感兴趣蛋白质治疗的患者，而且，在本发明的某些实施方案中，可以是适用于皮下施用的。
“等渗的”配制剂指具有与人血液基本上相同的渗透压的配制剂。等渗的配制剂一般会具有约250-350mOsm的渗透压。术语“低渗的”描述渗透压低于人血液的配制剂。相应地，术语“高渗的”用于描述渗透压高于人血液的配制剂。可以使用例如蒸气压或结冰(ice-freezing)型渗压计来测量等渗性。本发明的配制剂因添加了盐和/或缓冲剂而是高渗的。
“载体”在用于本文时包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“包装插页”指通常包括在药物的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类药物应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品联合的其它药物和/或警告等的信息。
“药学可接受的酸”包括在配制它们的浓度和方式无毒的无机和有机酸。例如，合适的无机酸包括氢氯酸、高氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亚磺酸、对氨基苯磺酸(磺胺酸)、磷酸、碳酸、等。合适的有机酸包括直链和支链烃基的(alkyl)、芳香族的、环状的、环状脂肪族的、芳基脂肪族的、杂环的、饱和的、不饱和的、单羧酸的、双羧酸的和三羧酸的，包括例如甲酸、乙酸、2-羟基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、邻氨基苯甲酸(氨茴酸)、丙酸、2-羟基丙酸、2-氧丙酸、丙二酸、环戊烷丙酸、环戊烷丙酸、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、抗坏血酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、硬脂酸、粘康酸、苦杏仁酸(扁桃酸)、琥珀酸、embonic acid、富马酸、苹果酸、马来酸、羟基马来酸、丙二酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、乙醇酸(羟基乙酸)、葡糖酸(glyconic acid)、葡糖酸(gluconic acid)、丙酮酸、乙醛酸、草酸、mesylic acid、琥珀酸、水杨酸、酞酸、palmoic acid、palmeic acid、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4,4’-甲叉双-3-(羟基-2-烯-1-羧酸)、羟基萘甲酸。
“药学可接受的碱”包括在配制它们的浓度和方式无毒的无机和有机碱。例如，合适的碱包括那些自无机碱形成金属形成的，所述金属诸如锂、钠、钾、镁、钙、铵、铁、锌、铜、锰、铝、N-甲基葡糖胺、吗啉、哌啶，及有机无毒碱，包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺、环胺和碱离子交换树脂(例如N(R’)4 +，其中R’独立地为H或C1-4烃基，例如铵、Tris)，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、trimethamine、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、hydrabamine、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂诸如此类。特别优选的有机无毒碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、trimethamine、二环己基胺、胆碱、和咖啡因。
本发明可用的别的药学可接受的酸和碱包括那些自氨基酸衍生的，例如组氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬酰胺。
“药学可接受的”缓冲剂和盐包括那些自上文所示酸和碱的酸和碱加成盐衍生的。具体的缓冲剂和/或盐包括组氨酸、琥珀酸盐/酯和乙酸盐/酯。
“药学可接受的糖”指在与感兴趣的蛋白质组合时显著阻止或降低蛋白质在贮存后的化学和/或物理不稳定性的分子。当配制剂意图要冻干，然后重建时，“药学可接受的糖”也可以称作“防冻剂”(lyoprotectant)。例示性的糖及其相应的糖醇包括：氨基酸，诸如谷氨酸或组氨酸单钠；甲胺，诸如甜菜碱；易溶盐，诸如硫酸镁；多元醇，诸如三氢的或更高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖(dextran)、赤藓糖醇、甘油(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；及其组合。别的例示性防冻剂包括甘油(glycerin)和明胶，及糖蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏四糖。还原糖的例子包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的例子包括选自糖醇和其它直链多元醇的多羟基化合物的非还原糖苷。优选的糖醇是单糖苷，尤其是那些通过二糖(诸如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖)还原获得的化合物。糖苷侧基可以是葡糖苷的或半乳糖苷的。糖醇的别的例子是葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的药学可接受的糖是非还原糖海藻糖或蔗糖。将药学可接受的糖以“保护量)添加至配制剂(例如冻干前)，这意谓着蛋白质在贮存期间(例如在重建和贮存后)基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。
本文中感兴趣的“稀释剂”指药学可接受的(对于给人施用而言安全的且无毒的)且对于制备液体配制剂(诸如在冻干后重建的配制剂)而言有用的。例示性的稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏(Ringer)溶液或右旋糖溶液。在一个备选的实施方案中，稀释剂可以包括盐和/或缓冲剂的水溶液。
“防腐剂”指能添加至本文中的配制剂以降低细菌活性的化合物。防腐剂的添加可以例如促进多次使用(多剂量)配制剂的生成。潜在防腐剂的例子包括十八烷基二甲基苯甲基铵氯化物、氯己双胺、苯扎氯铵(烃基苯甲基二甲基铵氯化物的混合物，其中烃基是长链化合物)、和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香族醇(诸如酚、丁醇和苯甲醇)、对羟基苯甲酸烃基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、和间甲酚。本文中最优选的防腐剂是苯甲酸。
“治疗”或“处理”指设计用于改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于试图延迟疾病或病症的发生/发展。如果一种或多种与IgE介导的病症有关的症状得到减轻，那么说例如使用本发明的凋亡性抗IgE抗体成功“治疗”了受试者。
“有效量”指至少在必需的剂量和时间上有效实现期望的或指定的效果(包括治疗或预防结果)的量。
“治疗有效量”至少指实现特定病症的可测量改善或预防所需要的最小浓度。本文中的治疗有效量可根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重及该抗体在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该抗体的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量可低于治疗有效量。
“长期”施用指与短期模式相反，以连续模式施用药物，从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。
为了治疗目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、家兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、猫等。优选的是，哺乳动物指人。
术语“药物配制剂”指其形式容许活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制备物。此类配制剂是无菌的。
“无菌”配制剂是无菌的或者不含所有活的微生物及其孢子。
如本文中所使用的，术语“约”或“大约”指本技术领域的技术人员容易知道的、相应数值的通常误差范围。
如本文中所使用的，“抗组胺药”指拮抗组胺的生理学效应的药剂。组胺对其受体H1和H2的结合导致特征性的变应性症状和效应或搔痒、发红、肿胀等。许多抗组胺药通过阻断组胺对其受体H1和H2的结合来起作用；然而，认为其它抗组胺药通过抑制组胺的释放来起作用。抗组胺药的例子有氯苯那敏(chlorpheniramine)、苯海拉明(diphenhydramine)、异丙嗪(promethazine)、色苷酸纳(cromolyn sodium)、阿丝咪唑(astemizole)、阿扎他定马来酸盐(azatadine maleate)、溴苯那敏马来酸盐(bropheniramine maleate)、卡比沙明马来酸盐(carbinoxamine maleate)、西替利嗪盐酸盐(cetirizine hydrochloride)、氯马斯汀延胡索酸盐(clemastine fumarate)、赛庚啶盐酸盐(cyproheptadinehydrochloride)、右溴苯那敏马来酸盐(dexbrompheniramine maleate)、右氯苯那敏马来酸盐(dexchlorpheniramine maleate)、茶苯海明(dimenhydrinate)、苯海拉明盐酸盐(diphenhydramine hydrochloride)、多西拉敏琥珀酸盐(doxylamine succinate)、fexofendadine盐酸盐、terphenadine盐酸盐、羟嗪盐酸盐(hydroxyzine hydrochloride)、loratidine、美克洛嗪盐酸盐(meclizine hydrochloride)、曲吡那敏柠檬酸盐(tripelannamine citrate)、曲吡那敏盐酸盐(tripelennamine hydrochloride)、曲普利啶盐酸盐(triprolidine hydrochloride)。
如本文中所使用的，“支气管扩张药”描述拮抗或逆转支气管收缩的药剂，支气管收缩是在早期哮喘反应中典型发生的生理学事件，导致肺容量降低和呼吸短促。支气管扩张药的例子包括肾上腺素(一种广泛作用的α和β-肾上腺素能药)，和β-肾上腺素能药，albuterol、吡布特罗(pirbuterol)、metaproterenol、沙美特罗(salmeterol)、和isoetharine。支气管扩张还可以通过施用黄嘌啉来实现，包括氨茶碱(aminophylline)和茶碱(theophylline)。
如本文中所使用的，“糖皮质激素”描述基于类固醇的、具有抗炎活性的药剂。糖皮质激素常用于减轻晚期哮喘反应。糖皮质激素的例子包括泼尼松(prednisone)、倍氯米松二丙酸盐(beclomethasone dipropionate)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、氟尼缩松(flunisolide)、倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松曲安西龙(desamehasone tramcinolone)、氟氢可的松乙酸盐(fludrocortisone acetate)、氟尼缩松(flunisolide)、氟替卡松丙酸盐(fluticasonepropionate)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松龙(prednisolone)[包括甲泼尼龙(methylprednisolone)，例如甲泼尼龙琥珀酸钠]、和曲安西龙(triamcinolone)。
如本文中所使用的，“非类固醇抗炎药”或“NSAID”描述不是基于类固醇的、具有抗炎活性的药剂。NSAID的例子包括阿西美辛(acematacin)、醋氨酚(acetaminophen)、阿司匹林(aspirin)、阿扎丙宗(azapropazone)、贝诺酯(benorylate)、溴芬酸钠(bromfenacsodium)、环氧合酶(COX)-2抑制剂(诸如GR 253035、MK966、塞来考昔(celecoxib)(4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺)和伐地考昔(valdecoxib))、双氯芬酸(diclofenac)、双氯芬酸迟缓剂(diclofenacretard)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、芬布芬(fenbufen)、非诺洛芬钙(fenoprofen calcium)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、布洛芬迟缓剂(ibuprofen retard)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、甲氯灭酸钠(meclofenamate sodium)、甲灭酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、萘普生钠(naproxen sodium)、羟布宗(oxyphenbutazone)、保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、替诺昔康(tenoxicam)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)、托美丁(tolmetin)、托美丁钠(tolmetin sodium)，包括其盐和衍生物等。
术语“IgE介导的病症”包括特应性病症，其特征在于对许多常见的、天然存在的吸入的和摄入的抗原产生免疫学应答的一般遗传倾向和持续生成IgE抗体。具体的特应性病症包括变应性哮喘、变应性鼻炎(结膜炎)、特应性皮炎、食物过敏、过敏反应、接触性皮炎、变应性胃肠病、变应性支气管肺曲霉病和变应性紫癜(Henoch-)。特应性患者常常具有多种变态反应，意味着他们具有针对许多环境变应原的IgE抗体和来自许多环境变应原的症状，所述环境变应原包括季节性的、终年性的和职业性的变应原。季节性变应原的例子包括花粉(例如草、树、黑麦(rye)、猫尾草(timothy)、豚草(ragweed))，而终年性变应原的例子包括真菌(例如霉菌、霉菌孢子)、羽毛、动物(例如宠物或其它动物毛发皮屑)和昆虫(例如尘螨)碎屑。职业性变应原的例子还包括动物(例如小鼠)和植物抗原以及药物、去污剂、金属和免疫增强剂诸如异氰酸盐/酯。能导致IgE介导的反应的非抗原特应性刺激包括感染、刺激物(诸如吸烟、燃烧烟雾、柴油机废气微粒和二氧化硫)、运动、冷和情绪压力。具有某种遗传背景的特应性和非特应性个体中的特定超敏感性反应可源自对食物(例如豆、花生)中蛋白质、毒液(例如昆虫、蛇)、疫苗、激素、抗血清、酶、胶乳、抗生素、肌肉松弛剂、维生素、细胞毒素、鸦片剂、和多糖诸如糊精、铁右旋糖苷和聚明胶肽的暴露。
其它与升高的IgE水平有关的病症(它们表现为IgE介导的且能用本发明的配制剂治疗的)包括：共济失调性毛细血管扩张症、丘-施二氏综合征、湿疹、肠炎、胃肠病、移植物抗宿主反应、高IgE(乔布)综合征、超敏感性(例如过敏性超敏反应、假丝酵母病、血管炎)、IgE骨髓瘤、炎性肠病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、不确定的结肠炎和传染性结肠炎)、粘膜炎(例如口腔粘膜炎、胃肠粘膜炎、鼻粘膜炎和直肠炎)、坏死性小肠结肠炎和食管炎、寄生虫病(例如锥虫病)、超敏感性血管炎、荨麻疹和维-奥二氏综合征。
另外，不管病症自身是否与升高的IgE有关，可以通过降低IgE水平来治疗，如此应当认为在“IgE介导的病症”的范围内的病症包括：阿狄森氏病(慢性肾上腺皮质功能减退)、脱发、遗传性血管性水肿、血管性水肿(班尼斯特氏病、血管神经性水肿)、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、动脉炎、淀粉样变、免疫性病症(诸如自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多内分泌腺衰竭、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性细胞减少、自身免疫性肾小球肾炎、贝切特氏病、支气管炎、伯格氏病、大疱性类天疱疮、卡普兰氏综合征(类风湿性尘肺)、心脏炎、口炎性腹泻、切-东二氏综合征、慢性梗阻性肺病(COPD)、科-李二氏综合征(虹膜角膜内皮综合征)、CREST综合征、疱疹样皮炎(杜林氏病)、糖尿病、嗜酸细胞性筋膜炎、嗜酸细胞性肾炎、巩膜外层炎、外源性变应性肺泡炎、家族性阵发性多浆膜炎、费尔提氏综合征、纤维化肺泡炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘氏综合征、粒细胞减少症、肉芽肿、肉芽肿病、肉芽肿肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征(多神经炎)、桥本氏甲状腺炎(淋巴结样甲状腺肿)、血色素沉积症、组织细胞增多症、嗜酸细胞增多综合征、肠易激综合征、幼年型关节炎、角膜炎、麻风、红斑狼疮、莱尔氏病、莱姆病、混合性结缔组织病、单神经炎、多发性单神经炎、穆-韦二氏综合征、粘膜皮肤淋巴样综合征(川崎氏病)、多中心网状组织细胞增多症、多发性硬化、重症肌无力、蕈样肉芽肿病、panninculitis、类天疱疮、天疱疮、心包炎、多神经炎、结节性多动脉炎、银屑病、银屑病关节炎、肺关节炎、肺腺瘤病、肺纤维化、复发性多软骨炎、风湿热、类风湿性关节炎、鼻窦炎症(鼻窦炎)、结节病、巩膜炎、硬化性胆管炎、血清病、塞扎里综合症、斯耶格伦氏综合征、史-约二氏综合征、系统性肥大细胞增多症、移植排斥、血小板减少性紫癜、胸腺淋巴发育不全、葡萄膜炎、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病。
“自身免疫性病症”在本文中指源于且针对个体自身组织或器官的疾病或病症或其共分离现象(co-segregation)或表现或由其导致的疾患。在这些自身免疫性和炎性病症的许多病症中，可以存在许多临床和实验室标志，包括但不限于：高丙种球蛋白血症、高水平自身抗体、组织中抗原-抗体复合物沉积、得益于皮质类固醇或免疫抑制治疗、及受侵害组织中的淋巴样细胞集合体。不限于任意一种有关B细胞介导的自身免疫性病症的理论，认为B细胞通过众多机制在人自身免疫病中表现出致病作用，包括自身抗体产生、免疫复合物形成、树突细胞和T细胞活化、细胞因子合成、直接趋化因子释放和提供用于异位新淋巴生成的巢。这些途径中的每一种可以以不同程度参与自身免疫病的病理学。
“自身免疫性疾病”可以是器官特异性疾病(即免疫应答特异性针对一种器官系统，诸如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝系统、肾系统、甲状腺、耳、神经肌肉系统、中枢神经系统等)或系统性疾病(其能影响多种器官系统，例如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、多肌炎(polymyositis)等)。优选的此类疾病包括自身免疫性风湿病学病症(诸如例如RA、斯耶格伦氏综合征(syndrome)、硬皮病、狼疮(诸如SLE和狼疮肾炎)、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征、和银屑病关节炎)、自身免疫性胃肠和肝病症(诸如例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn's disease))、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、和乳糜泻)、血管炎(诸如例如ANCA阴性血管炎和ANCA相关血管炎，包括丘施二氏血管炎(Churg-Straussvasculitis)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、和微观多脉管炎)、自身免疫性神经病学病症(诸如例如多发性硬化、视性眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、和自身免疫性多神经病)、肾病症(诸如例如肾小球肾炎、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、和贝格尔氏病(Berger’s disease))、自身免疫性皮肤病学病症(诸如例如银屑病、荨麻疹、hives、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、、和皮肤红斑狼疮)、血液学病症(诸如例如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听觉疾病(诸如例如内耳病和听力损失)、贝切特氏病(Behcet's disease)、雷诺氏综合征(Raynaud's syndrome)、器官移植、和自身免疫性内分泌病症(诸如例如糖尿病相关自身免疫病诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、和自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯氏病(Graves’disease)和甲状腺炎))。更优选的此类疾病包括例如RA、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、狼疮、多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、格雷夫斯氏病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎、和肾小球肾炎。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；培美曲塞(pemetrexed)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；TLK-286；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou et al.,Angew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星盐酸脂质体注射液(和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)埃坡霉素(epothilone)；和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、和imatinib(一种2-苯基氨基嘧啶衍生物)，以及其它c-Kit抑制剂；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine) 达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)、和多西他塞(doxetaxel)苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；雌激素受体拮抗剂，诸如氟维司群(fulvestrant)功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(和)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)依西美坦(exemestane)福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、依替膦酸钠(etidronate)NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如)；抗雌激素，诸如氟维司群(fulvestrant)；Kit抑制剂，诸如伊马替尼(imatinib)或EXEL-0862(一种酪氨酸激酶抑制剂)；EGFR抑制剂，诸如erlotinib或西妥昔单抗(cetuximab)；抗VEGF抑制剂，诸如贝伐单抗(bevacizumab)；arinotecan；rmRH(例如)；lapatinib和lapatinibditosylate(一种ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称作GW572016)；17AAG(格尔德霉素(geldanamycin)衍生物，其是热休克蛋白(Hsp)90毒物)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”指在体外或在体内抑制其生长依赖于受体活化的细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂包括显著降低处于S期的受体依赖性细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)和长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The MolecularBasis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他塞(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他塞(Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他塞(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15，包括rIL-2；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。
术语“激素”指多肽激素，其一般由具有导管的腺器官分泌。激素包括例如生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；雌二醇；激素代替疗法；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)或睾内酯(testolactone)；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；促乳素、胎盘催乳激素、小鼠促性腺激素相关肽、促性腺激素释放激素；抑制素；激活素；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；及血小板生成素。在用于本文时，术语激素包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列激素的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。
术语“生长因子”指促进生长的蛋白质，包括例如肝生长因子；成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；及集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)。在用于本文时，术语生长因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列生长因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。
术语“整联蛋白”指容许细胞结合和应答胞外基质且涉及多种细胞功能诸如伤口愈合、细胞分化、肿瘤细胞归巢和凋亡的受体蛋白质。它们是涉及细胞-胞外基质和细胞-细胞相互作用的细胞粘附受体大家族的一部分。功能性整联蛋白由非共价结合的两个跨膜糖蛋白亚基组成，称为α和β。α亚基彼此都享有一定同源性，β亚基也是如此。受体总是包含一条α链和一条β链。例子包括α6β1、α3β1、α7β1、LFA-1等。在用于本文时，术语“整联蛋白”包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列整联蛋白的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。
“TNF拮抗剂”在本文中定义为在体外、原位、和/或在体内降低、阻断、抑制、消除、或干扰TNFα活性的分子。合适的TNF拮抗剂还能降低、阻断、消除、干扰、阻止和/或抑制TNFRNA、DNA或蛋白质合成，TNFα释放，TNFα受体信号传导，膜TNFα切割，TNFα活性，TNFα生成和/或合成。此类TNF拮抗剂包括但不限于抗TNFα抗体、其抗原结合片段、其特异性结合TNFα且在结合至TNFα时破坏或消减哺乳动物中表达TNFα的细胞和/或干扰那些细胞的一项或多项功能的指定突变体或结构域、可溶性TNF受体(例如p55、p70或p85)或片段、其任何多肽、小分子TNF拮抗剂例如TNF结合蛋白I或II(TBP-I或TBP-II)、nerelimonmab、CDP-571、英夫利昔单抗(infliximab)、依那西普(enteracept)(ENBRELTM)、阿达木单抗(adalimulab)(HUMIRATM)、CDP-571、CDP-870、阿非莫单抗(afelimomab)、来那西普(lenercept)、诸如此类、其抗原结合片段、和特异性结合TNFα的受体分子；阻止和/或抑制TNFα合成、TNFα释放或其对靶细胞的作用的化合物，诸如沙利度胺(thalidomide)、替尼达普(tenidap)、磷酸二酯酶抑制剂(例如己酮可可碱(pentoxifylline)和咯利普兰(rolipram))、A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体增强剂；阻止和/或抑制TNFα受体信号传导的化合物，诸如丝裂原活化的蛋白质(MAP)激酶抑制剂；阻断和/或抑制膜TNFα切割的化合物，诸如金属蛋白酶抑制剂；阻断和/或TNFα活性的化合物，诸如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利(captopril))；及阻断和/或抑制TNFα生成和/或合成的化合物，诸如MAP激酶抑制剂。优选的拮抗剂包括抗体。
“肿瘤坏死因子-α”或“TNF-α”指包含Pennica et al.,Nature 312:721(1984)或Aggarwal et al.,JBC 260:2345(1985)的氨基酸序列的人TNF-α分子。“TNF-α抑制剂”在本文中指在一定程度上抑制TNF-α的生物学功能的药剂，一般通过结合TNF-α并中和其活性。本文中的TNFα抑制剂的例子包括依那西普(etanercept)英夫利昔单抗(infliximab)和阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRATM)。
本文中“整联蛋白拮抗剂或抗体”的例子包括LFA-1抗体，诸如可以从Genentech购买的efalizumab或α4整联蛋白抗体，诸如可以从Biogen购买的natalizumab或二氮杂环苯丙氨酸衍生物(WO 2003/89410)、苯丙氨酸衍生物(WO 2003/70709、WO 2002/28830、WO 2002/16329和WO 2003/53926)、苯基丙酸衍生物(WO 2003/10135)、烯胺衍生物(WO 2001/79173)、丙酸衍生物(WO 2000/37444)、链烷酸衍生物(WO 2000/32575)、取代苯基衍生物(美国专利No.6,677,339和6,348,463)、芳香胺衍生物(美国专利No.6,369,229)、ADAM解联蛋白结构域多肽(US 2002/0042368)、αvβ3整联蛋白的抗体(EP 633945)、氮桥二环氨基酸衍生物(WO 2002/02556)等。
术语“免疫抑制剂”指起抑制或掩盖本文中所治疗受试者的免疫系统作用的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(见U.S.4,665,077)；非类固醇抗炎药类(NSAID)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素类诸如皮质醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎剂类诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂类，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil,MMF)；托卡特(trocade)(Ro32-355)；外周西格马(σ)受体拮抗剂诸如ISR-31747；烷化剂类，诸如环磷酰胺(cyclophosphamide)、溴隐亭(bromocryptine)、达那唑(danazol)、氨苯砜(dapsone)、戊二醛(它掩盖MHC抗原，如U.S.4,120,649中所记载的)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素A；类固醇类，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)包括SOLU-甲泼尼龙琥珀酸钠、利美索龙(rimexolone)、和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；抗疟剂类，诸如氯喹(chloroquine)和羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子释放抑制剂诸如SB-210396和SB-217969单克隆抗体及MHC II拮抗剂诸如ZD2315；PG1受体拮抗剂诸如ZD4953；VLA4粘附阻断剂诸如ZD7349；抗细胞因子抗体或抗细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体，抗TNF-α抗体(英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab))，抗TNF-α免疫粘附素(依那西普(etanercept))，抗TNF-β抗体，白介素-1(IL-1)阻断剂诸如重组HuIL-1Ra和IL-1B抑制剂，抗白介素-2(IL-2)抗体和抗IL-2受体抗体；IL-2融合毒素；抗L3T4抗体；来氟米特(leflunomide)；异源抗淋巴细胞球蛋白；OPC-14597；NISV(免疫应答修饰剂)；必需脂肪酸诸如γ-亚麻酸或二十碳五烯酸；CD-4阻断剂；泛(pan)T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；共刺激修饰剂(例如CTLA4-Fc融合物，也称作ABATACEPTTM；抗白介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；包含LFA-3结合域的可溶性肽(WO 1990/08187)；链激酶；IL-10；抗IL-4拮抗剂，抗IL-13拮抗剂和双特异性抗IL-4/IL-13拮抗性抗体，转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；恩莫单抗(enlimomab)；CDP-855；PNP抑制剂；CH-3298；GW353430；4162W94；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(U.S.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.,Science 251:430-2(1991)；WO1990/11294；Janeway,Nature,341:482-483(1989)；WO 1991/01133)；BAFF拮抗剂，诸如BAFF抗体和BR3抗体；zTNF4拮抗剂(Mackay and Mackay,Trends Immunol.23:113-5(2002))；干扰T辅助细胞信号的生物制剂，诸如抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)，包括CD40-CD40配体的阻断性抗体(例如Durie et al.,Science,261:1328-30(1993)；Mohan etal.,J.Immunol.,154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck et al.,Science,265:1225-7(1994))；及T细胞受体抗体(EP 340,109)，诸如T10B9。本文中的一些优选免疫抑制剂包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、来氟米特、MMF、或甲氨蝶呤(MTX)。
“缓解病情的抗风湿药”或“DMARD”包括例如氯喹(chloroquine)、羟氯喹(hydroxycloroquine)、myocrisin、金诺芬(auranofin)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)(及口服和皮下MTX)、硫唑嘌呤(azathioprine)、D-青霉胺、金盐(口服)、金盐(肌肉内)、米诺环素(minocycline)、环孢霉素(cyclosporine)例如环孢霉素A和表面环孢霉素、葡萄球菌蛋白A(Goodyear and Silverman,J.Exp.Med.197:1125-39(2003))，包括其盐和衍生物，等。
“B细胞”指在骨髓中成熟的淋巴细胞，包括幼稚B细胞、记忆B细胞、或效应B细胞(浆细胞)。本文中的B细胞可以是正常的或非恶性的。
“B细胞表面标志物”或“B细胞表面抗原”在本文中指在B细胞表面上表达的抗原，可以用能结合它的拮抗剂来靶向它。例示性的B细胞表面标志物包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志物(有关说明参见《The Leukocyte Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等编，Academic Press，Harcourt Brace&Co.，New York)。其它B细胞表面标志物包括RP105、FcRH2、B-cell CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA、和239287。优选的B细胞表面标志物是在B细胞上较之哺乳动物的其它非B细胞组织优先表达的，而且可以是在前体和成熟B细胞二者上都表达的。最优选的此类标志物是CD20和CD22。
“CD20”抗原或“CD20”是在超过90％来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上找到的约35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上，但在干细胞上不表达。CD20在文献中的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”和“Bp35”。CD20抗原记载于例如Clark et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:1766(1985)。
“CD22”抗原或“CD22”，也称为BL-CAM或Lyb8，是分子量约130(缩短的)至140kD(未缩短的)的1型整合膜糖蛋白。它在B淋巴细胞的细胞质和细胞膜二者中表达。CD22抗原在B细胞淋巴细胞分化的早期出现，大约在与CD19抗原相同的阶段。与其它B细胞标志不同，CD22膜表达局限于成熟B细胞(CD22+)与浆细胞(CD22-)之间包含的分化晚期。CD22抗原记载于例如Wilson et al.,J.Exp.Med.173:137(1991)和Wilson et al.,J.Immunol.150:5013(1993)。
“结合B细胞表面标志的抗体”指在结合B细胞表面标志后破坏或消减哺乳动物中的B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能(例如通过降低或阻止由B细胞引发的体液反应)的分子。优选的是，该抗体能够在用其处理的哺乳动物中消减B细胞(即降低循环中的B细胞水平)。这种消减可通过各种机制来实现，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖、和/或诱导B细胞死亡(如通过凋亡)。
CD20抗体的例子包括：“C2B8”，现在称作“rituximab”(美国专利No.5,736,137)；钇[90]标记的2B8鼠抗体，称作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”可从IDEC Pharmaceuticals公司购买(美国专利No.5,736,137；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，编号HB11388)；鼠IgG2a“B1”，也称作“Tositumomab”，任选用131I标记以产生“131I-B1”或“碘131tositumomab”抗体(BEXXARTM)，可从Corixa购买(还可参见美国专利No.5,595,721)；鼠单克隆抗体“1F5”(Press et al.,Blood 69(2):584-591(1987))及其变体，包括“框架修补的”或人源化的1F5(WO 2003/002607,Leung,S.；ATCC保藏物HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利No.5,677,180)；人源化2H7(WO 2004/056312,Lowman et al.及下文所列)；HUMAX-CD20TM完全人的高亲和力抗体，靶向B细胞细胞膜中的CD20分子(Genmab,Denmark；参见例如Glennie and van de Winkel,Drug DiscoveryToday 8:503-510(2003)；Cragg et al.,Blood 101:1045-1052(2003))；WO 2004/035607(Teeling et al.)中所列出的人单克隆抗体；AME-133TM抗体(Applied MolecularEvolution)；A20抗体或其变体，诸如嵌合的或人源化的A20抗体(分别是cA20和hA20)(US2003/0219433,Immunomedics)；及单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得(Valentine etal.,In:Leukocyte Typing III,McMichael编,p.440,Oxford University Press(1987))。本文中优选的CD20抗体是人源化的、嵌合的或人的CD20抗体，更优选rituximab、人源化2H7、嵌合的或人源化的A20抗体(Immunomedics)、及HUMAX-CD20TM人CD20抗体(Genmab)。
术语“利妥昔单抗”(rituximab)或在本文中指针对CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体，在美国专利No.5,736,137中称为“C2B8”，包括其保持结合CD20能力的片段。
纯粹为了本发明且除非另有说明，“人源化2H7”指人源化CD20抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在体内有效消减灵长类B细胞，该抗体包括US 2006/0062787及其附图中所列举的那些，而且包括型式114，其序列见US 2006/0188495。还可参见US 2006/0034835和US 2006/0024300。在本发明的各种优选实施方案的汇总中，除了下表中指明的氨基酸替代位置，基于US 2006/0062787中所披露的2H7型式16的变体的V区具有v16的氨基酸序列。除非另有说明，2H7变体具有与v16相同的L链。
一种优选的人源化2H7是具有型式16的序列的完整抗体或抗体片段。另一种优选的人源化2H7具有型式114的序列。
“BAFF拮抗剂”是任何阻断BAFF或BR3活性的分子。它们包括包含BR3、TACI或BCMA或其结合BAFF的变体中结合BAFF的一部分的免疫粘附素。在其它方面，BAFF拮抗剂是BAFF抗体。“BAFF抗体”是结合BAFF的抗体，优选在人BAFF中包含人BAFF的残基162-275的区域内结合BAFF。在另一个方面，BAFF拮抗剂是BR3抗体。“BR3抗体”是结合BR3，优选在人BR3中包含人BR3的残基23-38的区域内结合BR3的抗体。人BAFF和人BR3的序列可见于例如US 2006/0062787。BAFF结合多肽或BAFF抗体的其它例子可见于例如WO 2002/092620；WO 2003/014294；Gordon et al.,Biochemistry 42(20):5977-83(2003)；Kelley et al.,J.Biol.Chem.279:16727-35(2004)；WO 1998/18921；WO 2001/12812；WO 2000/68378；WO2000/40716。
“抗IgE抗体”包括任何在IgE结合至肥大细胞和嗜碱性细胞上的高亲和力受体时以不诱导交联的方式特异性结合IgE的抗体。例示性的抗体包括本发明的抗体以及rhuMabE25(E25,)、E26、E27，以及CGP-5101(Hu-901)和HA抗体。人源化抗IgE抗体E25、E26和E27的重链和轻链可变域氨基酸序列披露于例如U.S.P.6,172,213和WO99/01556。CGP-5101(Hu-901)抗体记载于Corne et al.,(1997)J.Clin.Invest.99(5):879-887；WO 92/17207；及ATCC保藏号BRL-10706、BRL-11130、BRL-11131、BRL-11132和BRL-11133。HA抗体记载于USSN 60/444,229；WO2004/070011和WO2004/070010。
II.实施本发明的模式
A.重组制备
本发明还提供了编码凋亡性抗IgE抗体的分离的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞、及用于生产所述抗体的重组技术。
为了重组生产抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
(1)信号序列构件
本发明的抗IgE抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然哺乳动物信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区(precursor region)的DNA以符合读码框的方式与编码IgE结合抗体的DNA连接。
(2)复制起点构件
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
(3)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取IgE结合抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一种竞争性拮抗剂的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的生长来选择经编码IgE结合抗体、野生型DHFR蛋白质、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。
适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb etal.,Nature 282:39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones,Genetics 85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤随之提供了用于通过在缺少色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van denBerg,Bio/Technology 8:135(1990)。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.,Bio/Technology 9:968-975(1991)。
(4)启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码IgE结合抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码IgE结合抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适地插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利地与酵母启动子一起使用。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录IgE结合抗体受到例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)基因组，从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes etal.,Nature 297:598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(5)增强子元件构件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明IgE结合抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于IgE结合抗体编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。
(6)转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码IgE结合抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
(7)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
可以在细菌中生产全长抗体、抗体片段和抗体融合蛋白，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在将治疗用抗体与细胞毒剂(例如毒素)偶联及免疫偶联物自身显示出破坏肿瘤细胞方面的效力时。全长抗体在循环中具有更长的半衰期。在大肠杆菌中的生产更快速且更低廉。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如U.S.5,648,237(Carter et al.),U.S.5,789,199(Joly et al.)和U.S.5,840,523(Simmons et al.)，它们记载了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列。表达后，在可溶性级分中从大肠杆菌细胞糊分离抗体，可以通过例如根据同种型选择蛋白A或G柱进行纯化。最终的纯化可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的过程类似的进行。
在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码IgE结合抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适于表达糖基化IgE结合抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti(蚊子)、白纹伊蚊Aedes albopictus(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographacalifornica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham etal.,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1,ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
用上文所述用于生产IgE结合抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
(8)培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明IgE结合抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
(9)抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5:1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
在任何预备性纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可进行低pH疏水相互作用层析，使用pH大约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度进行(例如大约0-0.25M盐)。
B.抗体制备
1)多克隆抗体
多克隆抗体一般通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是独立的低级烃基，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成二棒分枝菌酸海藻糖)。免疫方案可以由本领域技术人员无需过度试验就选出。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，凝聚剂诸如明矾对于增强免疫应答是合适的。
2)单克隆抗体
单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体相同，除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。由此，修饰语“单克隆”指明抗体的特征，即不是分立的抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可使用最初由Kohler et al.,Nature 256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。
免疫剂通常会包括抗原性蛋白质或其融合变体。通常，或是使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，若希望人起源的细胞，或是使用脾细胞或淋巴结细胞，若希望非人哺乳动物来源。然后，使用合适的融合剂，诸如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),pp.59-103)。
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，即阻止HGPRT缺陷细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些细胞中，优选的是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center,SanDiego,California,USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USA)获得的SP-2细胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur et al.,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。
对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
对杂交瘤细胞在其中培养的培养液测定针对期望抗原的单克隆抗体的存在。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，可测定单克隆抗体的结合亲和力和特异性。此类技术和测定法是本领域已知的。例如，结合亲和力可通过Munson et al.,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding,见上文)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为肿瘤进行体内培养。
通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。
单克隆抗体还可通过重组DNA方法来生成，诸如美国专利No.4,816,567中所记载的及上文中所描述的。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在又一个实施方案中，可以从使用McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库分离抗体。Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouseet al.,Nucl.Acids Res.21:2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。典型的是，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
本文中所描述的单克隆抗体可以是单价的，其制备是本领域公知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任何点处截短，从而防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基可以用另一种氨基酸残基替代或者删除，从而防止交联。体外方法也适于制备单价抗体。消化抗体以生成其片段，特别是Fab片段，可使用本领域已知的常规技术来实现。
还可以使用合成蛋白质化学中的已知方法，包括那些涉及交联剂的，在体外制备嵌合或杂合抗体。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适合于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
3)人源化抗体
本发明的抗体可以进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠源)抗体的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的抗体。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体和输入CDR或框架序列中都没有发现的残基。通常，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中所有或基本上所有CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗体任选还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-596(1992))。
用于人源化非人抗体的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体中引入了一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法(Jones et al.,Nature321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536(1988))，或通过用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中基本上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
用于构建人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
涵盖各种形式的人源化抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，它任选与一种或多种细胞毒剂偶联以产生免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是完整抗体。
4)人抗体
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggermann et al.,Year inImmuno.7:33(1993)；美国专利No.5,591,669和WO 97/17852。
或者，噬菌体展示技术可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段(McCafferty et al.,Nature 348:552-553(1990)；Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991))。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种格式进行；综述参见例如Johnson,Kevin S.and Chiswell,David J.,Curr.Opin Struct.Biol.3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗口恶唑酮抗体。可本质上遵循Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith et al.,EMBOJ.12:725-734(1993)所记载的技术，自未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)及Boerner etal.,J.Immunol.147(1):86-95(1991))。类似地，可以如下生成人抗体，即将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的小鼠。在攻击后，观察到人抗体的生成，在所有方面与在人中看到的密切相似，包括基因重排、装配、和抗体全集。这种方法记载于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806,5,569,825,5,625,126,5,633,425,5,661,016，及下列科学出版物：Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994),Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14:845-51(1996),Neuberger,NatureBiotechnology 14:826(1996)及Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
最后，还可以在体外由激活的B细胞来生成人抗体(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。
5)抗体片段
在某些情况中，使用抗体片段有优势，而不是完整抗体。较小的片段尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.,J Biochem Biophys.Method.24:107-117(1992)；Brennan et al.,Science 229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2记载于美国专利No.5,869,046。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及美国专利No.5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
6)抗体依赖性酶介导的前体药物疗法(ADEPT)
通过将抗体与前体药物活化酶偶联，本发明的抗体还可用于ADEPT，所述前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO 81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO88/07378和美国专利第4,975,278号。
可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更有活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用于本发明方法的酶包括但不限于糖苷酶，葡萄糖氧化酶，人溶菌酶，人葡糖醛酸糖苷酶，可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶(例如羧肽酶G2和羧肽酶A)和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将用β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey,Nature 328:457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。
可通过本领域众所周知的技术将上述酶与本文所述多肽或抗体共价结合，诸如使用上文所讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger et al.,Nature 312:604-608(1984))。
7)双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体(BsAb)指对至少两种不同表位(包括那些在相同或另一蛋白质上的)具有结合特异性的抗体。或者，一条臂可以武装成结合靶抗原，而另一条臂可以与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD3)、或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂联合在一起，使得细胞防御机制聚焦和定位于表达靶抗原的细胞。此类抗体可衍生自全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达靶抗原的细胞。此类抗体拥有结合期望抗原的一条臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的另一条臂。已知的双特异性抗体的例子包括抗ErbB2/抗FcgRIII(WO 96/16673)、抗ErbB2/抗FcgRI(U.S.P.5,837,234)、抗ErbB2/抗CD3(U.S.P.5,821,337)。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等,Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829及Traunecker et al.,EMBO J.10:3655-3659(1991)。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了容易的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh etal.,Methods in Enzymology 121:210(1986)。
依照WO 96/27011或U.S.P.5,731,168中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域CH3区。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
文献中记载了自抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.,Science 229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
可以从大肠杆菌直接回收Fab'片段，并化学偶联以形成双特异性抗体。Shalabyet al.,J.Exp.Med.175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。
还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离二价抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成二价异二聚体。Kostelny et al.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性/二价抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链恒定域(VH)和轻链恒定域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性/二价抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.,J.Immunol.152:5368(1994)。
设想了具有超过两价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)。
例示性的双特异性抗体可结合给定分子上的两种不同表位。或者，一条抗蛋白质臂可以与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)、或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的一条臂联合在一起，使得细胞防御机制聚焦于表达特定蛋白质的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达特定蛋白质的细胞。此类抗体拥有结合蛋白质的一条臂和结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂(诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的一条臂。感兴趣的另一种双特异性抗体结合感兴趣蛋白质且进一步结合组织因子(TF)。
8)多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文设想的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。
9)异源偶联抗体
异源偶联抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。例如，可以将异源偶联物中的一种抗体与亲合素偶联，而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)及用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/200373；及EP 0308936)。可以在体外使用合成蛋白质化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国专利4,676,980中所公开的。异源偶联抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利No.4,676,980。
10)效应器功能工程化改造
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如用以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过向抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸替代来实现。或者/另外，可以向抗体的Fc区中引入半胱氨酸残基，由此使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.,Cancer Research 53:2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。
为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利No.5,739,277中记载的将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
11)免疫偶联物
本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。此类ADC必须显示可接受的安全性概况。
ADC在癌症治疗中用于局部投递毒害细胞剂或抑制细胞试剂(例如用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos and Epenetos,Anticancer Research 19:605-614(1999)；Niculescu-Duvaz and Springer,Adv.Drug Del.Rev.26:151-72(1997)；美国专利4,975,278)理论上能将药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin et al.,Lancet 603-05(1986)；Thorpe，(1985)“Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，在《Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowlandet al.,Cancer Immunol.Immunother.21:183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler et al.,J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-81(2000)；Mandler et al.,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-28(2000)；Mandler et al.,Bioconjugate Chem.13:786-91(2002))、美登木素生物碱类(EP 1391213；Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-23(1996))、和加利车霉素(Lode et al.,Cancer Res.58:2928(1998)；及Hinman etal.,Cancer Res.53:3336-42(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其毒害细胞和抑制细胞的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂，包括BCNU、链佐星、长春新碱、长春碱、阿霉素和5-氟尿嘧啶。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见例如WO 1994/11026。
抗体和细胞毒剂的偶联物使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science,238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂(参见WO94/11026)。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992))。
另外，还涵盖抗体与小分子毒素，诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(U.S.P.5,208,020)、单端孢菌毒素(trichothene)和CC1065作为与本发明配制剂一起使用的可偶联毒素。在一个实施方案中，可以将全长抗体或其抗原结合片段与一个或多个美登木素生物碱类分子偶联(例如每个抗体分子偶联约1个至约10个美登木素生物碱类分子)。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝分裂抑制剂。自自然来源分离的或合成制备的美登木素生物碱类(包括美登素、美登醇及其衍生物和类似物)已有记载，参见例如美国专利No.5,208,020及其中引用的参考文献(见第2栏第53行－第3栏第10行)及美国专利3,896,111和4,151,042。制备抗体-美登木素生物碱类偶联物的方法还记载于美国专利No.5,208,020。在一个优选的实施方案中，美登木素生物碱类是经二硫化物或其它含硫接头基团连接至抗体的。例如，可将美登素转变为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰抗体反应以生成美登木素生物碱类-抗体免疫偶联物(Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992))。可通过已知方法来修饰抗体，然后使含有游离或受保护的硫醇基的抗体与含有二硫化物的美登木素生物碱类起反应以生成偶联物。抗体-美登木素生物碱类偶联物的细胞毒性可通过已知方法在体外或在体内测量，并可测定IC50。
加利车霉素是另一种感兴趣的免疫偶联物。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI 1(Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)及Lode等,CancerRes.58:2925-2928(1998))。可以与抗体偶联的其它抗肿瘤药物包括QFA，它是一种抗叶酸药。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂的经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效应。
还涵盖抗体和具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶、DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
在本发明的ADC中，抗体(Ab)经接头(L)偶联有一个或多个药物模块(D)，例如大约1个到大约20个药物模块每个抗体。可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件、和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。
Ab-(L-D)p 式I
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺、硫醇、和羟基基团是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；和(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理，从而具有与接头试剂偶联的反应性。每个半胱氨酸桥理论上会形成两个反应性硫醇亲核体。可将额外亲核基团引入抗体中，经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇。
还可通过修饰抗体以导入能与接头试剂或药物上的亲核取代基起反应的亲电子模块来生成本发明的ADC。可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在蛋白质中生成羰基(醛和酮)，其能与药物上的适宜基团反应(Domen et al.,J.Chromatog.,510:293-302(1990))。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质能与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan and Stroh,Bioconjugate Chem.3:138-46(1992)；US 5,362,852)。此类醛能与药物模块或接头亲核体反应。
类似的，药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烃基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；和(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含各自编码偶联物的两部分的区域，彼此或是毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可以将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。
本文中的ADC任选用下列交联接头试剂来制备：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们可通过商业途径获得(例如Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.)。
抗体还可偶联高度放射性原子。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括At211、Bi212、I131、In131、Y90、Re186、Re188、Sm153、P32、和Pb212及Lu的放射性同位素。在将偶联物用于诊断时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(nmr)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。法可用于掺入碘-123(Fraker et al.,Biohem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978))。《Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy》(Chatal,CRC Press,1989)中记载了偶联放射性核酸的其它方法。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含各自编码偶联物的两部分的区域，彼此或是毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在另一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲合素)。
12)其它氨基酸序列修饰
设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有期望特性，可进行删除、插入和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989)中所记载的。在此，鉴定了一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展现出功能敏感性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析给定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的抗体变体筛选期望活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但也设想了FR改变。保守替代在下文表A中显示在标题“优选替代”下。如果此类替代导致生物学活性的变化，那么可以引入表A中称为“例示替代”的更实质性变化，或者如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。
表A：氨基酸替代
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的成员交换另一个类别的。
任何不涉及保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改良的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和IgE之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，就如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变意味着删除在抗体中找到的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点是通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利地完成的(用于N-连接的糖基化位点)。还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(用于O-连接的糖基化位点)。
编码抗IgE抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的抗IgE抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
13)其它抗体修饰
可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的疗法等。此类技术和其它合适的配制剂披露于Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第20版,Alfonso Gennaro编,Philadelphia College ofPharmacy and Science(2000)。
C.药物配制剂
通过将具有期望纯度的活性成分与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington:The Science和Practice of Pharmacy,第20版,Lippincott Williams&Wiklins,Pub.,Gennaro编,Philadelphia,PA 2000)混合来制备治疗配制剂，供贮存用。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠；防腐剂；等渗调节剂(isotonicifier)；稳定剂；金属复合物，例如Zn-蛋白质复合物；螯合剂，诸如EDTA；和/或非离子表面活性剂。
当治疗剂是抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质结合结构域的最小抑制性片段。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白质序列的能力的抗体片段或甚至肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术来生成(参见例如Marasco等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7889-7893[1993])。
使用缓冲剂来将pH控制在优化治疗功效的范围内，尤其在稳定性依赖于pH的情况中。缓冲剂优选以范围为约50mM至约250mM的浓度存在。适于与本发明一起使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸两者及其盐，例如柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可以由组氨酸和三甲胺盐诸如Tris构成。
添加防腐剂来延迟微生物生长，而且通常以0.2％-1％(w/v)的范围存在。适于与本发明一起使用的防腐剂包括氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双铵；苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、苄索氯铵；硫柳汞；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚。
存在等渗剂(有时称为“稳定剂”)以调节或维持组合物中液体的等渗性本发明的液体组合物的张性/张力。当与大的、带电荷的生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时，它们常常称作“稳定剂”，因为它们能与氨基酸侧链的带电荷基团相互作用，由此减轻分子间和分子内相互作用的势(potential)。等渗剂可以以0.1％至25％(以重量计)、优选1-5％之间的任何量存在，其中考虑了其它成分的相对量。优选的等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基的或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
别的赋形剂包括能承担以下一项或多项功能的药剂：(1)填充剂(bulkingagent)；(2)增溶剂；(3)稳定剂；和(4)防止变性或对容器壁的粘着的药剂。此类赋形剂包括：多羟基糖醇(上文列举的)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖、肌肉肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫的还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖；三糖，诸如棉子糖；和多糖，诸如糊精或葡聚糖(dextran)。
存在非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及以保护治疗用蛋白质免于搅动诱导的聚集，其还容许配制剂在暴露于剪切表面应力时不引起活性治疗用蛋白质或抗体变性。非离子型表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
合适的非离子型表面活性剂包括Polysorbate(20,40,60,65,80等)，Polyoxamer(184,188等)，多元醇，聚氧乙烯山梨聚糖单醚(等)，Lauromacrogol 400，Polyoxyl 40硬脂酸酯，聚氧乙烯氢化蓖麻油10,50和60，甘油单硬脂酸酯，蔗糖脂肪酸酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子去污剂包括十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和十六烷基磺酸钠。阳离子去污剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了配制剂用于体内施用，它们必须是无菌的。通过无菌滤膜过滤，可以使得配制剂变成无菌的。一般将本文中的治疗性组合物置入具有无菌存取口的容器中，例如具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶。
施用路径依照已知的和可接受的方法，诸如通过合适方式的一次或多次推注或一长段时间里的输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病变内或关节内路径的注射或输注，表面施用，吸入或通过持续释放或延长释放手段。
本文中的配制剂还可以含有超过一种的、所治疗特定适应症所必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。或者/另外，组合物可包含细胞毒剂、细胞因子或生长抑制剂。此类分子合适地以对于预定目的有效的量组合存在。
活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或粗滴乳状液。此类技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版,见上文。
通过使用无毒的“水溶性多价金属盐”，可以增强本文中所描述的蛋白质和抗体的稳定性。例子包括Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn4+、Al2+、和Al3+。能与上述多价金属阳离子形成水溶性盐的例示性阴离子包括那些自无机酸和/或有机酸形成的。此类水溶性盐在水中(于20℃)具有至少约20mg/ml、或至少约100mg/ml、或至少约200mg/ml的溶解度。
能用于形成“水溶性多价金属盐”的合适无机酸包括氢氯酸、乙酸、硫酸、硝酸、硫氰酸和磷酸。能使用的合适有机酸包括脂肪族羧酸和芳香族酸。此定义内的脂肪族酸可以定义为饱和的或不饱和的C2-9羧酸(例如脂肪族单、双或三羧酸)。例如，此定义内的例示性单羧酸包括饱和的C2-9单羧酸，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和capryonicacid，及不饱和的C2-9单羧酸，丙烯酸、丙炔酸、甲基丙烯酸、巴豆酸和异巴豆酸。例示性的二羧酸包括饱和的C2-9二羧酸，丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不饱和的C2-9二羧酸包括马来酸、延胡索酸、柠康酸和中康酸。例示性的三羧酸包括饱和的C2-9三羧酸，丙三羧酸和1,2,3-丁烷三羧酸。另外，属于此定义的羧酸还可以含有一个或多个羟基以形成羟基羧酸。例示性的羟基羧酸包括乙醇酸/羟基乙酸、乳酸、甘油酸、丙醇二酸/羟基丙二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸。此定义内的芳香族酸包括苯甲酸和水杨酸。
可用于帮助装囊的本发明多肽稳定的常用水溶性多价金属盐包括例如：(1)属于卤化物(例如氯化锌、氯化钙)、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫氰酸盐的无机酸金属盐；(2)脂肪族羧酸金属盐(例如乙酸钙、乙酸锌、丙酸钙、乙醇酸锌、乳酸钙、乳酸锌和酒石酸锌)；和(3)属于苯甲酸盐(例如苯甲酸锌)和水杨酸盐的芳香族羧酸金属盐。
D.治疗方法
为了疾病的预防或治疗，活性剂的适宜剂量会取决于所要治疗的疾病的类型(如上文所定义的)、疾病的严重程度和进程、施用药剂是出于预防目的还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对药剂的响应、及主治医师的判断。所述药剂适合于在一次或一系列的治疗中施用于患者。
一种优选的治疗方法是IgE介导的病症的治疗。IgE介导的病症包括特应性病症，其特征在于对许多常见的、天然存在的吸入的和摄入的抗原产生免疫学应答的遗传倾向和持续生成IgE抗体。具体的特应性病症包括变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和变应性胃肠病。特应性患者常常具有多种变态反应，意味着他们具有针对许多环境变应原的IgE抗体和来自许多环境变应原的症状，所述环境变应原包括花粉、真菌(例如霉菌)、动物和昆虫碎屑及某些食物。
然而，与升高的IgE水平有关的病症不限于那些具有遗传(特应性)病因学的病症。其它与升高的IgE水平有关的病症(它们表现为IgE介导的且能用本发明的配制剂治疗的)包括超敏感性(例如过敏性超敏感性)、湿疹、荨麻疹、变应性支气管肺曲霉病、寄生虫病、高IgE综合征、共济失调性毛细血管扩张症、威斯科特-奥尔德里奇综合征、胸腺淋巴发育不全、IgE骨髓瘤和移植物抗宿主反应。
变应性鼻炎(也称作变应性鼻结膜炎或干草热)是对吸入的变应原的特应性反应的最常见表现，其严重程度和持续时间常常与对变应原的暴露的强度和时间长度有关。它是一种慢性病，可首次出现于任何年龄，但是通常在儿童期或青少年期发作。典型发作包括大量水样鼻漏，阵发性打喷嚏，鼻塞，及鼻和腭的搔痒。鼻后粘液引流也引起咽喉痛，清嗓和咳嗽。还可以有变应性睑缘结膜炎的症状，带有结膜和眼睑的强烈搔痒、发红、流泪、和畏光。严重发作常常伴有全身不适，虚弱，疲劳，和有时，强烈喷嚏期后的肌肉酸痛。
哮喘(也称作可逆阻塞性气道疾病)的特征在于气管支气管树对呼吸刺激和支气管收缩性化学药品的高应答性，产生哮鸣、呼吸困难、胸部紧迫感、和咳嗽的发作，它们是自发可逆的或借助治疗可逆的。它是一种涉及整个气道的慢性病，但是严重程度自偶见的轻度暂时发作至重度、长期、危及生命的支气管梗阻而变化。哮喘和特应性可共存，但是只有大约一半的哮喘病人也是特应性的，而且甚至更小百分比的特应性患者也具有哮喘。然而，特应性和哮喘并非是完全独立的，因为与非特应性个体相比，哮喘更加频繁地在特应性个体中发生，尤其是在儿童期。哮喘在组织学上进一步地被分成两个亚组，即外源性哮喘和内源性哮喘。
外源性哮喘(也称作变应性、特应性或免疫学哮喘)描述一般在生命早期，通常在婴儿期或儿童期发生哮喘的患者。特应性的其它表现(包括湿疹或变应性鼻炎)常常共存。哮喘发作可在花粉季期间，在存在动物的情况中，或在暴露于室尘、羽毛枕、或其它变应原时发生。皮试显示对致病变应原的阳性风团和潮红反应。有趣的是，总血清IgE浓度常常是升高的，但是有时是正常的。
内源性哮喘(也称作非变应性或特发性哮喘)通常首次发生于成人期，在表观呼吸道感染之后。症状包括与花粉季或暴露于其它变应原无关的慢性或复发性支气管梗阻。对常见特应性变应原的皮试是阴性的，血清IgE浓度是正常的。别的症状包括痰血和嗜酸粒细胞增多。将哮喘归入亚组(像阿司匹林敏感性的、运动诱发的、感染性的和心理性的)的其它方案仅仅限定了比其它因素更多地影响某些患者的外部触发因素。
最后，重要的是要注意，虽然有些分类在组织学上只将变应性哮喘与IgE依赖性联系起来，但是现在有强烈的统计学显著数据显示IgE与哮喘(变应性的和非变应性的二者)之间的关联。第27章,“The Atopic Diseases”,A.I.Terr于Medical Immunology,第9版,Simon和Schuster,Stites等编(1997)。结果是，为本专利申请的目的，术语“IgE介导的病症”包括变应性和非变应性这两种哮喘。
哮喘发作的体征包括呼吸急促、听得到的哮鸣、和使用辅助呼吸肌。通常还存在脉速和血压升高，正如鼻分泌和外周血中升高的嗜酸性细胞水平。肺功能显示流量(flowrate)和1秒钟用力呼吸量(FEV1)的降低。肺总量和功能残气量通常是正常的或略微升高的，但是可以降低且带有极度支气管痉挛。
哮喘的病理学可以区分为早期和晚期反应。早期的特征在于平滑肌收缩、水肿和分泌过多，而晚期反应的特征在于细胞炎症。哮喘可以由多种非特异性触发物来诱发，包括感染(例如病毒性呼吸道感染)、生理因素(例如运动、通气过度、深呼吸、心理因素)、大气因素(例如二氧化硫、氨、冷空气、臭氧、蒸馏水蒸气)、食入物(例如普萘洛尔、阿司匹林、非类固醇抗炎药)、实验吸入物(例如高张溶液、柠檬酸、组胺、乙酰甲胆碱(methacholine)、前列腺素F2α)和职业吸入物(例如异氰酸盐/酯)。引起变应性哮喘的各种别的职业性或环境性变应原可以包括动物产品、昆虫尘、海洋生物、植物产品、果实、种子、叶和花粉、有机染料和墨水、微生物媒介物、酶、治疗剂、杀菌剂、和无机和有机化学药品。
特应性皮炎(也称作湿疹、神经性皮炎、特应性湿疹或贝尼埃氏(Besnier)痒疹)是对一个患者亚群特异的常见慢性皮肤病症，该患者亚群具有家族性和免疫学特征的特应性。本质特征是搔痒性皮肤炎症应答，其诱导特征性的、对称性分布的皮肤斑疹，对某些部位有偏爱。B淋巴细胞还常常过度生成IgE。虽然特应性皮炎被归为皮肤形式的特应性(因为它与变应性鼻炎和哮喘和高IgE水平有关)，但是皮试时皮炎的严重程度并非总是与变应原暴露有关，而且脱敏(与其它变应性疾病不同)不是有效治疗方法。虽然高血清IgE能证实变应性哮喘的诊断，但是正常水平也不能排除变应性哮喘的诊断。该疾病的发作可发生于任何年龄，而且病变开始急，有红斑水肿丘疹或带有脱皮的斑块。搔痒导致渗液和结痂，然后是慢性苔藓样变。在细胞水平，急性病变是水肿性的，而且真皮浸润有单个核细胞，即CD4淋巴细胞。嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞和嗜碱性粒细胞是罕见的，但是存在脱粒的肥大细胞。慢性病变的特征为表皮增生、过度角化和角化不全，而且真皮浸润有单个核细胞、朗格汉斯氏(Langerhans)细胞和肥大细胞。还可以有纤维化的病灶区，包括小神经的神经束膜的参与。
变应性胃肠病(也称作嗜酸细胞性胃肠病)是一种不常见的特应性表现，其中多种IgE食物敏感性与局部胃肠道粘膜反应有关。它在成人中罕见，但是在婴儿中更加常见，但是是暂时的。当所摄入的食物变应原与局部IgE抗体反应时，该疾患导致空肠粘膜释放肥大细胞介导物，在餐后不久导致胃肠症状。持续暴露产生慢性炎症，导致胃肠蛋白质丢失和低蛋白血症性水肿。经由发炎肠粘膜的失血可以是严重的，足以引起缺铁性贫血。变应性反应在变应原暴露后在上胃肠道粘膜中局部发生，但是随避开变应原而解决。
过敏反应和荨麻疹显然是IgE介导的，但是它们缺乏遗传决定子，而且没有对特应性个体的偏爱。过敏反应是一种急性、全身性(generalized)变应性反应，同时涉及数种器官系统，通常是心血管、呼吸、皮肤和胃肠。该反应是免疫学介导的，而且它在暴露于受试者先前致敏的变应原时发生。荨麻疹和血管性水肿指身体肿胀、红斑和搔痒(其源自浅表皮肤血管中受组胺刺激的受体)，而且是系统性过敏反应的标志性皮肤特征。系统性过敏反应是源自药物、昆虫毒液或食物，在多种器官中同时发生的IgE介导的反应。它是由变应原诱导、肥大细胞加载IgE而突然引起的，导致深刻的和危及生命的、多种生命器官的机能的改变。血管塌陷、急性气道阻塞、皮肤血管舒张和水肿、及胃肠和泌尿生殖肌肉痉挛几乎同时发生，虽然并非总是相同程度。
过敏反应的病理学包括血管性水肿和肺充气过度，带有气道粘液填塞和局灶性肺不张。在细胞水平，肺的表现与急性哮喘发作期类似，带有支气管粘膜下层腺分泌过多、粘膜和粘膜下层水肿、支气管周围血管淤血/充血(congestion)和支气管壁中的嗜酸粒细胞增多。可存在肺水肿和出血。也可以存在支气管肌肉痉挛、充气过度、和甚至肺泡破裂。人过敏反应的主要特征包括水肿、血管淤血/充血、及喉、气管、会厌和下咽的固有层中的嗜酸粒细胞增多。
对变应原的暴露可以经由摄食、注射、吸入或皮肤或粘膜接触。反应在暴露于变应原后数秒或数分内开始。可以有厄运迫近的初始畏惧或感觉，紧接着是一个或多个靶器官系统：心血管、呼吸、皮肤或胃肠中的症状。
对过敏反应负有责任的变应原不同于那些通常与特应性有关的变应原。食物、药物、昆虫毒液或胶乳是常见来源。食物变应原包括那些在甲壳动物、软体动物(例如龙虾、虾、蟹)、鱼、豆(例如花生、豌豆、菜豆(bean)、甘草)、种子(例如芝麻、棉籽、葛缕子(caraway)、芥子、亚麻子、向日葵)、坚果、浆果、蛋白、荞麦粉和乳中找到的。药物变应原包括那些在异源蛋白质和多肽、多糖和半抗原药物中找到的。昆虫变应原包括膜翅目昆虫，包括蜜蜂、小黄蜂(yellow jacket)、大黄蜂(hornet)、黄蜂(wasp)和火蚁。
虽然肾上腺素是过敏反应的典型治疗，但是抗组胺剂或其它组胺阻断剂通常在处方中用于减轻严重的荨麻疹或血管水肿反应。
E.联合疗法
本发明的方法可以与治疗IgE介导的病症的已知方法组合，或是作为组合的和另外的治疗步骤，或是作为治疗配制剂中另外的成分。
例如，可以在本发明的抗IgE抗体之前、之后、或同时施用抗组胺剂，尤其是非镇静的抗组胺剂。合适的抗组胺剂包括属于烃基胺(例如氯苯那敏(chlorpheniramine))、乙醇胺(例如苯海拉明(diphenhydramine))和吩噻嗪(例如异丙嗪(promethazine))的抗组胺剂。虽然许多抗组胺剂通过阻断组胺在效应细胞上的受体位点来拮抗组胺的药理学效应，但是其它常见抗组胺剂药物通过阻断已经被变应原特应性IgE(例如色苷酸纳)致敏和武装的肥大细胞释放组胺来运作。例示性的抗组胺剂包括阿丝咪唑(astemizole)、马来酸阿扎他定(azatadine maleate)、马来酸马来酸溴苯那敏(bropheniramine maleate)、马来酸卡比沙明(carbinoxamine maleate)、盐酸西替利嗪(cetirizine hydrochloride)、延胡索酸氯马斯汀(clemastine fumarate)、盐酸赛庚啶(cyproheptadine hydrochloride)、马来酸右溴苯那敏(dexbrompheniramine maleate)、马来酸右氯苯那敏(dexchlorpheniraminemaleate)、茶苯海明(dimenhydrinate)、盐酸苯海拉明(diphenhydraminehydrochloride)、琥珀酸多西拉敏(doxylamine succinate)、fexofendadinehydrochloride、terphenadine hydrochloride、盐酸羟嗪(hydroxyzine hydrochloride)、loratidine、盐酸美克洛嗪(meclizine hydrochloride)、柠檬酸曲吡那敏(tripelannamine citrate)、盐酸曲吡那敏(tripelennamine hydrochloride)、盐酸曲普利啶(triprolidine hydrochloride)。
拟交感神经药或具有支气管舒张效果的药物能改善IgE介导的病症(例如早期反应)的具体症状。肾上腺素是一种广泛作用的α和β-肾上腺素能药，常常以0.2-0.5mL 1:100水溶液的剂量皮下施用。当想要效果的持续时间更长时，也使用更长作用形式的、1:200悬浮液中的肾上腺素(即特布他林(terbutaline))。合适的别的β-肾上腺素能药包括沙丁胺醇(albuterol)、吡布特罗(pirbuterol)、奥西那林(metaproterenol)、沙美特罗(salmeterol)、乙基异丙肾上腺素(isoetharine)和福美特罗(formeterol)，其用于经鼻(例如手持式雾化器、间歇加压呼吸装置、或剂量计量式增压吸入器)或经口施用。
支气管扩张也可通过施用黄嘌啉来实现，尤其在它们与上述拟交感神经药物组合施用时。例示性的黄嘌啉包括氨茶碱(aminophylline)(静脉内，250-500mg)和茶碱(theophylline)(口服，10-20μg/ml血清浓度)。
通过用糖皮质激素或具有抗炎效果的其它药物进行的治疗，能减轻各种IgE介导的病症(例如晚期反应)的其它症状。对严重发作系统性施用泼尼松(每天30-60mg)，而以雾化形式施用倍氯米松二丙酸盐(beclomethasone dipropionate)、曲安萘德(triamcinolone acetonide)和氟尼缩松(flunisolide)作为长期维持疗法。具有抗炎效果的别的皮质类固醇包括：倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸氟氢可的松(fludrocortisone acetate)、氟尼缩松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone)。
也可以与本发明的治疗方法组合使用的非类固醇抗炎药包括醋氨酚(acetaminophen)、阿司匹林(aspirin)、溴芬酸钠(bromfenac sodium)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬钙(fenoprofen calcium)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、甲氯灭酸钠(meclofenamate sodium)、甲灭酸(mefenamic acid)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、萘普生钠(naproxensodium)、羟布宗(oxyphenbutazone)、苯基保泰松(phenylbutzone)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、托美丁钠(tolmetin sodium)。
另外，通过施用解充血药(例如苯肾上腺素(phenylephrine)、苯丙醇胺(phenylpropanolamine)、伪麻黄碱(pseudoephadrin))、镇咳剂(例如右美沙芬(dextromethorphan)、可待因(codeine)、或氢可酮(hydrocodone))或镇痛药(例如醋氨酚、阿司匹林)，也可实现最大治疗收益。
变应原脱敏指其中出于降低或消除变应性应答的目的将变应原注射入患者中的治疗形式。它也称作变应原免疫疗法、降敏(hyposensitization)或变态反应注射疗法。它常常与其它变态反应治疗组合使用，但是并非经常作为主要治疗。已经在不可能实现规避变应原时成功地采用了这种疗法。典型的变应原脱敏治疗包括每周一次或两次以渐增剂量皮下注射无菌变应原，直至达到在注射部位产生暂时的、局部的小面积炎症的剂量。然后每2-4周一次以维持日程表给予剂量。变应性脱敏最常见地用于变应性哮喘和变应性鼻炎的治疗，但是它已经在治疗过敏反应中获得成功。通过使用佐剂，诸如弗氏佐剂，即水性抗原在矿物油中的乳状液，也已经有效地使用了脱敏疗法。生理效应产生不溶性液体储库，自此逐渐释放变应原微滴。另一种形式的变应原脱敏是用戊二醛使单体变应原聚合以产生具有相对较低变应原性(即引起变应性应答)、同时保留有效程度免疫原性的分子。
F.药物剂量
本发明药物组合物的剂量和期望药物浓度可以随所设想的特定用途而变化。适宜施用剂量或路径的确定完全在普通技术人员的技术范围内。动物实验为人体治疗的有效剂量的确定提供了可靠指导。可以遵循Mordenti,J.和Chappell,W."The Use ofInterspecies Scaling in Toxicokinetics,"于Toxicokinetics and New DrugDevelopment,Yacobi等编,Pergamon Press,New York 1989,pp.42-46中所述原理进行有效剂量的物种间定标。
当采用体内施用本文所述多肽或抗体时，正常剂量的范围可以是每天约10ng/kg至高达约100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选约1mg/kg/天至10mg/kg/天，取决于施用路径。文献中提供了有关具体剂量和投递方法的指导；参阅例如美国专利No.4,657,760；5,206,344；或5,225,212。在本发明的范围内的是，不同配制剂会对不同治疗和不同病症有效，而且意图治疗一种特定器官或组织的施药可能必须以不同于另一器官或组织的方式投递。此外，可以通过一次或多次分开的施用，或者通过连续输注来施用药剂。对于根据状况，在数天或更长时间里进行重复施用来说，持续进行治疗，直到出现期望的疾病症状被抑制。然而，其它剂量方案可能也是有用的。此疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
G.配制剂的施用
依照已知方法，诸如静脉内施用，像推注或通过持续一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔、表面、或吸入路径，将本发明的配制剂(包括但不限于重建的配制剂)施用于需要用蛋白质治疗的哺乳动物，优选人。
在优选的实施方案中，所述配制剂是通过皮下(即在皮肤之下)施用而施用于哺乳动物的。为了此类目的，可以使用注射器来注射配制剂。然而，可得到用于施用配制剂的其它装置，诸如注射装置(例如INJECT-EASETM和GENJECTTM装置)；注射笔(诸如GENPENTM)；自我注射器装置，无针头装置(例如MEDIJECTORTM和BIOJECTORTM)；和皮下贴片投递系统。
在一个具体的实施方案中，本发明致力于单剂施用单位的试剂盒。此类试剂盒包含治疗性蛋白质或抗体的水性配制剂的容器，包括单室或多室预装填注射器。例示性预装填注射器可以自Vetter股份有限公司(Ravensburg,Germany)获得。
蛋白质的适宜剂量(“治疗有效量”)将取决于例如要治疗的疾患、疾患的严重程度和进程、施用蛋白质是用于预防目还是治疗目的、先前的疗法、患者临床史和对该蛋白质的响应、所使用的蛋白质的类型、及主治医生的判断。适合地在一次或在一连串治疗中将蛋白质施用于患者，而且可以在诊断之后的任何时间将蛋白质施用于患者。可以作为唯一的治疗或与在治疗所讨论疾患方面有用的其它药物或疗法组合地施用所述蛋白质。
若所选择的蛋白质是抗体，则约0.1-20mg/kg是给患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开的施用。然而，其它剂量方案也可能是有用的。此疗法的进展易于通过常规技术来监测。
抗IgE配制剂(例如rhuMAbE-25、rhMAbE-26、Hu-901)的用途包括例如IgE介导的变应性疾病、寄生虫感染、间质性膀胱炎和哮喘的治疗或预防。取决于要治疗的疾病或病症，将治疗有效量(例如约1-15mg/kg)的抗IgE抗体施用于患者。
H.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了制品，该制品含有配制剂且优选提供关于其使用的说明书。所述制品包含容器。合适的容器包括例如瓶、管形瓶(例如双室管形瓶)、注射器(诸如单室或双室注射器)和试管。所述容器可以用各种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器装有配制剂。所述容器上的或与所述容器相连的标签可指明关于重建和/或使用的说明。所述标签可进一步指明所述配制剂可用于或意图用于皮下施用。所述装有配制剂的容器可以是多次使用的管形瓶，其容许重建配制剂的重复施用(例如2-6次施用)。所述制品可进一步包含第二容器，其中装有合适的稀释剂(例如BWFI)。在混和稀释剂和冻干配制剂后，重建的配制剂中的最终蛋白质浓度一般会是至少50mg/ml。所述制品可进一步包括从商业和使用者立场看想要的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明书的包装插页。
通过参照以下实施例会更加完全地理解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。明确将贯穿本公开文本的所有引用收入本文作为参考。
在另一个实施方案中，本发明提供了制品，该制品包含本文中所描述的配制剂，其用于在自我注射器装置中施用。自我注射器可以描述成在开动后无需别的来自患者或施用者的必需动作就会投递其内容物的注射装置。当投递速率必须恒定且投递时间大于少许片刻(a few moment)的时候，它们特别适于治疗性配制剂的自我药疗。
实施例
实施例1：灵长类IgE的分离
自人IgE骨髓瘤细胞系U266(ATCC,Manassas,VA,TIB#196)克隆了人IgE。通过自衍生自恒河猴和猕猴外周血单个核细胞(它们已经受到刺激以生成IgE转换的细胞(PBMC))的cDNA对IgE的克隆和测序，测定了恒河猴和猕猴IgE序列。自人IgE序列设计了正向和反向引物(在下文中显示)。上游正向引物是刚好在CH2结构域的上游设计的。反向引物是在跨膜结构域的末端处设计的。自加利福尼亚国家灵长类研究中心(California National PrimateResearch Center,Davis,CA)获得了恒河猴和猕猴PBMC。将5x 106个PBMC用IL-4(100ng/ml)和CD40L(3μg/ml)(R&D Systems,Minneapolis,MN,分别为#204-IL和#617-CL)培养4天。然后收获细胞，制备RNA(RNeasy Mini Kit,#74106,Qiagen,Valencia,CA)，并使用BDSprint Powerscript寡dT引发试剂盒(BD Biosciences,San Jose,CA,#639558)制备cDNA。然后实施RT-PCR[94℃ 2分钟；94℃ 15秒钟；60℃ 30秒钟；68℃ 2分钟；30个循环；68℃ 10分钟]。在指定循环后添加Taq聚合酶(10分钟72℃)以添加A突出端，供TA克隆用(Invitrogen,Carlsbad,CA,#45-0641)。通过TOPO-TA克隆来克隆PCR产物，并且然后检验克隆的序列(Genentech,Inc.)。使用公司内部的分析程序(Genentech,Inc.)比对人、恒河猴和猕猴序列。以下同源性是关于CH2和跨膜结构域之间的序列的。在恒河猴(432个氨基酸)与猕猴(431个氨基酸)之间，有6处不同，大约98.6％的同源性。在人与恒河猴之间，有53处不同，等于87.7％的同源性。在人与猕猴之间，有56处不同，等于87％的同源性(见图1A-1B)。
用于克隆的引物：
CH2序列上游的正向引物：
5’-ccgcccaccgtgaagatcttacagtc (SEQ ID NO:63)
跨膜结构域末端处的反向引物：
5’-cggctcgagactaggcgtggggctggaggacgttg (SEQ ID NO:64)
实施例2：抗IgE/M1’抗体的分离
CH3-CH4-M1’/Fc融合蛋白的生成
如下生成了人IgE CH3-CH4-M1’/Fc融合蛋白，即自制备自U266细胞(ATTCManassas,VA,TIB#196)的cDNA PCR扩增人IgE CH3-CH4-M1’结构域，加上刚好在M1’结构域下游的另外的15个氨基酸。自U266细胞(RNeasy Mini Kit,#74106,Qiagen,Valencia,CA)制备RNA，并使用BD Sprint Powerscript寡dT引发试剂盒(BD Biosciences,San Jose,CA,#639558)制备cDNA。实施RT-PCR，并通过TOPO-TA克隆(Invitrogen,Carlsbad,CA,#45-0641)来克隆PCR产物。通过PCR诱变添加N-端信号序列，供在哺乳动物细胞中表达用，并将信号序列+CH3+CH4+M1’+15个氨基酸克隆入表达载体(pRK huIgG1 Fc；Genentech)以生成与人IgG1 Fc区的C-端融合物。最终蛋白质的序列(包括信号序列和人IgG1 Fc)如下：
MGWSCIILFLVATATGVHSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTSGPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQQQGLPRAAGGSVPHPRCHCGAGRADWPGPPELDVCVEEAEGEAPWRAQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:65)
通过瞬时感染CHO细胞来生成蛋白质(Genentech)，并使用标准蛋白A Sepharose柱层析技术自细胞培养物上清液纯化蛋白质。
免疫和杂交瘤的创建
使用CH3-CH4-M1’/Fc蛋白生成了一组选择性结合人IgE-M1’的M1’部分的泛特应性抗体。以3-4天间隔给BALB/c小鼠的每个后足垫注射在单磷酰-脂质A和二棒分枝菌酸海藻糖(MPLTM+TDM)佐剂(Corixa,Hamilton,MT)中重悬的1μg CH3-CH4-M1’/Fc。8次加强注射后采集血清，并通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)和荧光激活细胞分拣和流式细胞术(FACS筛选，见下一个部分)滴定以确保小鼠具有好的对CH3-CH4-M1’/Fc的免疫应答。最后一次加强注射后3天，将腘(淋巴)结细胞与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag.U.1(参见例如Chuntharapai等,1997,Methods Enzymol.288:15-27)融合。使用来自杂交瘤选择试剂盒(StemCell Technologies,Inc.,Vancouver,BC,Canada)的培养基D中的次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择，自未融合的腘结或骨髓瘤细胞选择出融合的杂交瘤细胞，导致4224个克隆的生成。
对泛特应性抗人M1’抗体的筛选
对如先前所述生成的杂交瘤克隆筛选结合CH3-CH4-M1’/Fc蛋白的M1’区、在A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞系的表面上稳定表达的人IgE-M1’的M1’区(IgE-M1’/A20)、和在BJAB人B细胞淋巴瘤细胞系的表面上稳定表达的人IgE-M1’的M1’区(IgE-M1’/BJAB)的单克隆抗体的生成。阴性对照包括人CD-4/Fc、在A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞系的表面上稳定表达的人IgE(IgE/A20)、A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞系(A20)、在BJAB人B细胞淋巴瘤细胞系的表面上稳定表达的人IgE(IgE/BJAB)、和BJAB人B细胞淋巴瘤细胞系(BJAB)。
ELISA筛选
为了筛选这4224个克隆，实施了酶联免疫吸附测定法(ELISA)，大体上如Baker等,2002,Trends Biotechnol.,20:149-156中所述。测定法是在384孔和96孔两种板中实施的。简言之，将384孔(或96孔)板用50μl在包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)中浓度为2μg/ml的山羊抗人IgG Fc(MP Biomedicals,Irvine,CA)包被，密封，并于4℃保存过夜。除去包被液后，向每个孔添加80μl(或200μl，用于96孔板)在PBS(pH 7.4)(ELISA稀释剂)中含有0.5％牛血清清蛋白和0.05％的测定/封闭液，并将板在摇动中于室温温育1小时。然后将孔用100μl(或300μl，用于96孔板)含0.05％的PBS(清洗缓冲液)清洗3次。
清洗步骤后，向每个孔添加50μl(或100μl，用于96孔板)在ELISA稀释剂中含有0.4μg/ml CH3-CH4-M1’/Fc或人CD-4/Fc的抗原溶液，并将板在摇动中于室温温育1小时。像之前那样将孔用清洗缓冲液清洗3次。添加来自各个杂交瘤克隆的上清液，使得加有CH3-CH4-M1’/Fc的一个孔和加有人CD-4/Fc的一个孔各接受50μl(或100μl，用于96孔板)来自单个杂交瘤克隆的上清液。将板在摇动中于室温温育1小时，并像之前那样将孔用清洗缓冲液清洗3次。
清洗后，向每个孔添加50μl(或100μl，用于96孔板)在ELISA稀释剂中的1:1000稀释的偶联有辣根过氧化物酶的绵羊抗小鼠IgG(对人IgG没有交叉反应性(MPBiomedicals))。将板在摇动中于室温温育1小时，像之前那样用清洗缓冲液清洗3次，并拍干。如下对孔进行显色，即向每个孔添加50μl(或100μl，用于96孔板)四甲基联苯胺(TMB)微孔过氧化物酶底物(BioFX Laboratories,Owing Mills,MD,产品目录#TMBW-0100-01)并于室温温育5-10分钟或直至观察到好的颜色反应。通过向每个孔添加50μl(或100μl，用于96孔板)TMB终止液(BioFX Laboratories,产品目录#BSTP-0100-01)来终止显色。用Sunrise读板仪(Tecan US,Inc.,Research Triangle Park,NC)于650nm分析板。
使用预采血(prebleed)和多血清(polysera)作为对照。预采血样品含有免疫之前的小鼠血清，而多血清样品含有10次免疫后获得的小鼠抗血清。
FACS筛选
为了筛选实施例1中生成的3221个克隆，使用IgE-M1’/A20和IgE-M1’/BJAB细胞系实施了荧光激活细胞分拣(FACS)。IgE/A20、IgE/BJAB、A20、和BJAB细胞系充当阴性对照。将细胞重悬，并于4℃以500g离心5分钟。吸掉培养基，并将细胞重悬于4℃含1％胎牛血清的FACSFlow(BD Biosciences,San Jose,CA)缓冲液(细胞染色缓冲液)。像之前那样将细胞离心，吸掉培养基，并将细胞以2x106个细胞/ml细胞染色缓冲液(于4℃)重悬。将细胞以50μl/孔(1x105个细胞/孔)添加至96孔圆底板，并向每个孔添加100μl来自各个杂交瘤克隆的上清液，使得每种杂交瘤上清液与含有每一种细胞系的一个孔一起温育。将板在冰上孵育30分钟。将板于4℃以500g离心5分钟，并吸掉上清液。将每个孔重悬于4℃ 200μl细胞染色缓冲液，并像之前那样将板离心。吸掉细胞染色缓冲液。
清洗步骤后，将每个孔中的细胞重悬于4C 100μl在细胞染色缓冲液中的1:1000稀释的偶联有R-藻红蛋白的山羊抗小鼠IgG Fc(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)，和将板在黑暗中在冰上孵育30分钟。将板于4℃以500g离心5分钟，并吸掉上清液。将每个孔重悬于4℃ 200μl细胞染色缓冲液，并像之前那样将板离心。吸掉细胞染色缓冲液。将每个孔中的细胞重悬于4℃ 200μl细胞染色缓冲液，并转移至1.2ml微量滴定管(QualityScientific Plastics,Petaluma,CA)。在FACScan或FACSCalibur(BD Biosciences)上实施FACS。
N-端测序/RNA的分离/测序和克隆
自抗IgE/M1’杂交瘤的上清液纯化了抗体，并在磷酸盐缓冲盐水分析了N-端测序，以确定克隆性(clonality)。在Precast 4-20％Tris HCl SDS-PAGE(Invitrogen,Carlsbad,CA)上在还原性条件下分开每一种抗体。使用Procise494N端测序仪(AppliedBiosystems,Foster City,CA)，使用20分钟循环，如Henzel等,Analytical Biochemistry267,148-160(1999)所述，将每一种解析出的重链(HC)和轻链(LC)进行N端测序。对前25个残基测序以确立单克隆性。当抗体的HC或LC链被焦谷氨酰基封闭，使得Edman测序无法触及N端氨基酸残基时，在测序之前消除封闭基团。焦谷氨酰基是用焦谷氨酸氨肽酶(PGAP,Sigma,St Louis,MO)消除的，使用Pham等,Electrophoresis 2005,26 4243-4251记载的方案。
经测定，M1’抗体7A6、1C11、47H4、26A11、45C1和28E9的重链(HC)和轻链(LC)序列如下：
7A6
HC QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKAS (SEQ ID NO:66)
LC DIVMSQSPSSLTVSVGEKVTLSCKS (SEQ ID NO:67)
1C11
HC QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKAS (SEQ ID NO:68)
LC DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKS (SEQ ID NO:69)
47H4
HC EVKLVESGGGLVQPGGSRKLSCAAS (SEQ ID NO:70)
LC DVVLTQTPLSLPVSLGDQASI (SEQ ID NO:71)
26A11
HC EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO:72)
LC DIQMTQTTSSLSASLGDRVTITCRS (SEQ ID NO:73)
45C1
HC QIQLVQSGPELKKPGETVK (SEQ ID NO:74)
LC DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCK (SEQ ID NO:75)
28E9
HC EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATS (SEQ ID NO:76)
LC DIQMTQSPASLSVSVGETVTFTCR (SEQ ID NO:77)
为了测定全长序列，自N端氨基酸序列和已知的Ig基因区段设计了5’简并引物，并用简并下游重链和轻链保守序列实施了PCR。
正向引物
7A6
HC FOR.BsiWI 5’-tcgacgtacgctcaggttcagctgcagcaatctggggctgagctgg(SEQ IDNO:78)
LC FOR.EcoRV 5’-gatcgatatcgtgatgtcccagtctccctcctccctaac(SEQ ID NO:79)
1C11
HC FOR.BsiWI 5’-tcgacgtacgctcaggttcaattgcagcagtctggggctgagctgg(SEQ IDNO:80)
LC FOR.EcoRV 5’-gatcgatatcgtaatgtctcagtctccttcctccctagc(SEQ ID NO:81)
47H4
HC 9.1HCF.BsiWI 5’-tcgacgtacgctgaggtgaagttggtggagtctgggggaggcttag(SEQID NO:82)
LC 47H4LCF.EcoRV 5’-gatcgatatcgtgctgactcagactccactctccctgcc(SEQ IDNO:83)
26A11
HC C7F7HCF.BsiWI 5’-tcgacgtacgctgaggtccagctccagcagtctggacctgagc(SEQID NO:84)
LC 2B4LCF.EcoRV 5’-gatcgatatccagatgacccaaactacatcctccctg(SEQ ID NO:85)
45C1
HC 2G6HCF.BsiWI 5’-tcgacgtacgctcagatccagttggtgcagtctggacctgagctg(SEQID NO:86)
LC 9C10LCF.EcoRV 5’-gatcgatatcgtgatgacgcagactccactcactttgtcgg(SEQ IDNO:87)
28E9
HC 9.1HCFBsiWI 5’-tcgacgtacgctgaggtgaagctggtggagtctgaaggaggcttgg(SEQID NO:88)
LC 5E10.LCF.EcoRV 5’-gatcgatatccagatgacccagtctccagcctccctatc(SEQ IDNO:89)
反向引物
重链引物(HCR) 5’-ctggacagggatccagagttccaggtcactgtcactggctcaggg(SEQ IDNO:90)
轻链引物(LCR) 5’-ctgtaggtgctgtctttgctgtcctgatcagtccaactg(SEQ ID NO:91)
自抗IgE/M1’杂交瘤(RNeasy Mini Kit,#74106,Qiagen,Valencia,CA)收获RNA，并使用BD Sprint Powerscript寡dT引发试剂盒(BD Biosciences,San Jose,CA,#639558)制备cDNA。使用上述引物实施PCR，并使用TOPO-TA试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,#45-0641)克隆PCR产物。使用白金级Pfx高保真聚合酶(Platinum Pfx High FidelityPolymerase)(Invitrogen,Carlsbad,CA,#11708-039)进行PCR，PCR条件为[94℃ 2分钟；94℃ 15秒钟；60℃ 30秒钟；68℃ 2分钟；30个循环；68℃ 10分钟]。对克隆筛选插入物，并对多个克隆测序(Genentech,Inc.)以检验初始抗IgE/M1’重链和轻链基因序列。
将抗M1’抗体可变域与不同Fc区一起亚克隆入表达载体以生成含不同物种和/或同种型Fc的嵌合抗体。设计引物，用以将可变域(CDR+框架)克隆入小鼠IgG2a、小鼠IgG2a-DANA、和人IgG1 Fc区。
设计引物，用以与重链和轻链序列一起掺入限制性位点。重链是使用BsiWI和ApaI克隆的。轻链是使用EcoRV和KpnI克隆的。然后消化新的PCR产物，并连接入mIgG2a(LPG10)、mIgG2a-DANA(pErk-E27DANA)、或huIgG1(这些用于重链)，或mκ(LPG2)或huκ表达载体(Genentech,Inc.)。检验最终克隆的序列(Genentech,Inc.)。
用于克隆可变CDR序列的3’引物及正向与反向引物组合如下：
反向引物
7A6
HC REV.ApaI 5’-accgatgggcccttggtggaggctgaagagactgtgag(SEQ ID NO:92)
LC REV.KpnI 5’-ccttggtaccccctccgaacgtgtacggatagctataatattg(SEQ ID NO:93)
1C11
HC REV.ApaI 5’-gaccgatgggcccttggtggaggctgaggagactgtg(SEQ ID NO:94)
LC REV.KpnI 5’-ccttggtaccccctccgaacgtgtacggatagctataa(SEQ ID NO:95)
47H4
HC 47H4HCR.ApaI 5’-tgggcccttggtggaggctgaggagacggtgactgag(SEQ ID NO:96)
LC 47H4LCR.KpnI 5’-ttccaacttggtacctccacc(SEQ ID NO:97)
26A11
HC 7G8HCR.ApaI 5’-gaccgatgggcccttggtggargctgcagagacagtgaccagag(SEQ IDNO:98)
LC 47H4LCR.KpnI 5’-ttccaacttggtacctccacc(SEQ ID NO:99)
45C1
HC 45C1HCR.ApaI 5’-cgatgggcccttggtggargckgaggagacggtgagaatg(SEQ IDNO:100)
LC 5C2LCR.KpnI 5’-agcttggtaccccctccg(SEQ ID NO:101)
28E9
HC 28E9.HC.REV.ApaI 5’-cgatgggcccttggtggaggctgaggagacggcgactgag(SEQID NO:102)
LC 1D5.2LCR,KpnI 5’-ttccaacttggtacccgagccg(SEQ ID NO:103)
引物组合：
47H4轻链具有一个内部KpnI位点，这妨碍直接将mKappa和huKappa克隆入表达载体。使用快速变化XL定点诱变试剂盒(Stratagene,Cedar Creek,Texas,#200517-5)突变了这个内部KpnI位点[95℃ 1分钟；95℃ 50秒钟；60℃ 50秒钟；68℃ 4.5分钟；68℃ 7分钟]。依照试剂盒的要求来设计引物以突变KpnI位点内的单个核苷酸且不改变氨基酸序列。将TAC突变成TAT，这在该位置保留了酪氨酸(Y)。检验最终克隆的序列(Genentech,Inc.)。
用于诱变的引物为：
FOR 5’-cc tat tta cat tgg tat ctg cag aag cca ggc c (SEQ ID NO:104)
REV 5’-ggc ctg gct tct gca gat acc aat gta aat agg (SEQ ID NO:105)
实施例2A：抗IgE/M1’抗体的人源化
此实施例描述了鼠抗IgE/M1’抗体26A11、7A6和47H4的人源化。
材料和方法
在CHO细胞中以Fc融合物的形式表达膜结合型人IgE的M1’结构域，并通过常规手段来纯化。表达抗体26A11、7A6和47H4的杂交瘤是通过用重组M1’-Fc融合蛋白免疫小鼠获得的，并通过使用经M1’-Fc包被的板进行的ELISA鉴定的。功能性抗体是通过它们结合表达M1’的细胞和促进凋亡的能力而鉴定的。
使用标准方法自生成26A11、7A6或47H4的杂交瘤细胞提取总RNA。使用RT-PCR用针对重链和轻链的简并引物扩增轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)。正向引物是对VL和VH区的N端氨基酸序列特异性的。相应地，LC和HC反向引物设计成与轻链恒定域(CL)和重链第一恒定域(CH1)(它们在物种中是高度保守的)中的区域退火。使用常规测序方法测定了插入物的多核苷酸序列。26A11、7A6和47H4VL和VH氨基酸序列分别显示于图6A和6D、6B和6E、及6C和6F。
用于此项工作的噬菌粒是单价Fab-g3展示载体，由在单一phoA启动子控制下的2个可读框组成。第一可读框由与受体轻链的VL和CH1结构域融合的stII信号序列组成，而第二可读框由与受体重链VH和CH1结构域及随后的次要噬菌体外壳蛋白P3融合的stII信号序列组成。
将来自鼠26A11、7A6或47H4抗体(mu26A11、mu7A6或mu47H4)的VL和VH结构域与人VLκI(huKI)和人VH亚组III(huIII)共有序列比对。为了制备CDR嫁接物，将来自mu26A11、mu7A6或mu47H4的高变区嫁接到huκI和huIII共有受体框架中以生成直接CDR-嫁接物(26A11.v1、7A6.v1或47H4.v1)(图6A-6F)。在VL结构域中，将下述区域嫁接至人共有受体：第24-34位(L1)、第50-56位(L2)和第89-97位(L3)。在VH结构域中，嫁接第26-35位(H1)、第49-65位(H2)和第94-102位(H3)。MacCallum等[MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996)]已经分析了抗体和抗原复合物晶体结构，并发现重链的第49位和第94位是接触区的一部分，如此当人源化抗体时在CDR-H2和CDR-H3的限定中包括这些位置似乎是合理的。
使用针对每个高变区分开的寡核苷酸通过LC和HC表达载体的Kunkel诱变生成了IgG抗体形式的人源化抗IgE/M1’抗体26A11.v1、7A6.v1和47H4.v1。还使用Kunkel诱变进行了用以提高稳定性的氨基酸变化。Kunkel等,J.Biol.Chem.263(29):14784-14789(1988)。通过DNA测序鉴定了正确的克隆。
出于筛选目的，最初在293细胞中生成IgG变体。使用FuGene系统将编码VL和VH的载体(25μg)转染入293细胞中。将500μl FuGene与4.5ml不含FBS的DMEM培养基混和，并于室温温育5分钟。将每条链(25μg)添加至混合物，并于室温温育20分钟，然后转移至五个T-150烧瓶，在5％CO2中于37℃转染过夜。次日，除去含有转染混合物的培养基，并更换成23ml含0.1ml/L痕量元素(A0934)和10mg/L胰岛素(A0940)的PS04培养基。将细胞再温育5天，之后以1000rpm 5分钟收获培养基，并使用0.22μm低蛋白质结合滤器无菌过滤。在每125ml培养基添加2.5ml 0.1％PMSF后，样品可以保存于4℃。
通过Scatchard分析、细胞结合ELISA和通过使用BIAcoreTM-2000或A100进行的表面等离振子共振实施亲和力测定。
Scatchard分析–制备Daudi-人、恒河猴和猕猴IgE/M1’细胞供冷结合缓冲液中的结合用，所述冷结合缓冲液由基础培养基及10mM HEPES pH 7.4和2％FBS以及40μg/ml人IgG构成。将细胞稀释至1.7x 106个细胞/ml的浓度，并保持在冰上，直至将它们添加至测定体系。用Iodogen法碘化蛋白质/抗体。一式三份地制备各种浓度的冷蛋白质，使用1:2稀释，从饱和浓度开始，以零浓度结束，总共14个浓度。将单一浓度的热蛋白质添加至所有稀释度，以与冷蛋白质竞争。最后，将细胞添加至热和冷蛋白质混合物，每份样品使用250,000个细胞。将测定体系在摇动中于4℃保持4小时。然后收集每份样品并在膜上过滤，用结合缓冲液清洗至少3次，让它们干燥，然后使用Perkin Elmer Wizard 1470自动伽马计数器计数1分钟。
竞争性电化学发光细胞结合测定法–使用竞争性电化学发光细胞结合测定法测量人源化变体的相对结合亲和力。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗表达IgE-M1’的经转染BJAB细胞(BJAB-IgE/M1’)(长)或不表达M1’的对照转染细胞(BJAB-IgE)(短)，并以25,000个细胞/孔在25μl PBS中在96孔多阵列高结合板(Meso Scale Discovery)上接种。将细胞在板上于室温温育一小时，让细胞附着至孔。为了封闭非特异性结合，向每个孔添加25μl含30％FBS的PBS。然后将板在温和摇动中于室温温育30分钟。倒掉封闭液，并添加25μl含2％FBS的PBS(测定缓冲液)中补充有固定量的生物素化抗IgE M1’抗体(33.3nM 26A11或47H4)的连续稀释度的人源化变体(0.022-1333nM)。在温和摇动中于室温温育一小时后，使用微量板清洗仪(ELx405Select,Bio-Tek Instruments,Inc.,Winooski,VT)将板用PBS(300μl/孔)清洗三次。为了检测结合的抗体，添加25μl含0.25μg/ml钌标记的链霉亲合素的测定缓冲液。于室温温育一小时后，清洗板并添加(150μl/孔)基于Tris的读数缓冲液T(1x，不含表面活性剂)(Meso Scale Discovery)。使用Sector Imager 6000读数仪(Meso Scale Discovery)记录电化学发光信号。
Biacore 2000–使用两种方向；将M1’-Fc或特定抗体变体固定化(大约100RU，在10mM乙酸钠pH 4.8中，在CM5传感器芯片上)，而相应的配体(分别是抗体变体或M1’Fc)充当分析物(以30μL/min的流速注射，使用PBST中0.5-1000nM的2倍连续稀释度)。对每份样品分析3分钟结合和10分钟解离。每次注射后，使用10mM甘氨酸pH 1.7再生芯片。
Biacore A-100–将M1’固定化(大约100RU，在10mM乙酸钠pH 4.8中，在CM-5传感器芯片上)，而抗体变体充当分析物(以30μL/min的流速注射，使用PBST中0.5-1000nM的2倍连续稀释度)。对每份样品分析5分钟结合和5分钟解离。每次注射后，使用10mM甘氨酸pH 1.7再生芯片。
通过自18F7变体IgG流动室减去对照流动室来修正结合响应。使用同时拟合kon和koff的1:1朗格缪尔(Languir)模型来进行动力学分析。
结果和讨论
用于人源化的人受体框架基于共有人κI VL结构域和共有人亚组III VH结构域。比对了mu26A11、mu7A6和mu47H4的VL和VH结构域与人κI和亚组III结构域；鉴定出每一个互补决定区(CDR)并嫁接到人受体框架中，生成了能作为IgG表达的CDR嫁接物(图6A-6F)。
使用细胞结合ELISA和通过表面等离振子共振评估了26A11.v1,7A6.v1和47H4.v1(表1)。这些测定法指出了CDR嫁接物具有与它们的相应杂交瘤抗体非常相似的亲和力。
为了避免潜在的制造问题，消除了潜在的异天冬氨酸形成位点，即47H4.v1的CDR-L1中的Asn28-Gly29和26A11.v1的CDR-L1中的Asn31-Ser32，这是通过尝试(sampling)在其它抗体中发现位于这些位置的残基而实现的(图6A、6C，表I)。发现将47H4.v1的CDR-L1中的Gly29变成Ala29(47H4.v2和47H4.v5)和将26A11的CDR-L1中的Ser32变成Tyr32(26A11.v3和26A11.v6)或Ala32(26A11.v2或26A11.v5)是合适的置换。另外，将Asn31变成Ser31(26A11.v13或26A11.v15)或Gln31(26A11.v14或26A11.v16)也有助于消除潜在的脱酰胺和异天冬氨酸形成，并提供了具有与它们的相应杂交瘤抗体相似的亲和力的候选者。
通过将26A11.v1或47H4.v1的CDR-H1中的Met34变成Ile34，避免了这两种抗体中的此残基的潜在氧化，且不影响M1’结合。
实施例3：抗M1’抗体的特异性
在经带有M1’序列的IgE(“长型”)或缺乏M1’序列的IgE(“短型”)转染的人B细胞系BJAB(ATCC Manassas,VA,#HB-136)上测试了抗IgE/M1’抗体克隆的特异性。IgE BJAB细胞系是通过使用pMSCV表达载体(Washington University,St.Louis,MO)进行的BJAB细胞的逆转录病毒转导而生成的。自人IgE骨髓瘤细胞系U266(ATCC,Manassas,VA,TIB#196)获得人IgE B细胞受体的全长重链和轻链的cDNA，并与IRES(内部核糖体进入序列)组合地亚克隆入逆转录病毒载体中，以容许抗体重链和轻链的双顺反子共转染和共表达。下文提供了逆转录病毒转导方法的进一步描述。
将PG13包装细胞(ATCC CRL-10686)在10cm组织培养板上以2x 106个细胞/板(DMEM高葡萄糖、10％FBS、青霉素、链霉素、2mM L-谷氨酰胺)接种24小时。使用FuGENE 6用pMSCV DNA构建物转染细胞，并于37℃、5％CO2培养2天。收获含有逆转录病毒颗粒的细胞培养物上清液，并通过0.4微米滤器过滤。添加无菌硫酸鱼精蛋白至终浓度10μg/ml，并如下所述使用4ml上清液来感染大约1x 106个BJAB细胞，即将感染体系于32℃旋转90分钟，接着在逆转录病毒上清液中于37℃在5％CO2中继续培养3-4小时。收获受感染的BJAB细胞，转移至RPMI细胞培养培养基(RPMI、10％FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青霉素、链霉素、2mM L-谷氨酰胺)，并扩增，供分选用。通过流式细胞术来鉴定阳性转染细胞，其中使用MAE11(Genentech)抗人IgE抗体来检测表面IgE。
根据BJAB IgE短型和长型细胞系的流式细胞术染色的测定，抗IgE/M1’抗体是对长型而不是短型膜IgE特异性的。由于抗人IgE(Mae11)抗体(Genentech,Inc.)结合长型和短型IgE二者的能力，使用其作为阳性对照。使用抗gp120mIgG1或抗豚草mIgG2a抗体作为同种型对照(Genentech,Inc)。
在RPMI 10％FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺(Genentech,Inc.)中培养BJAB细胞。将0.5x 106个BJAB-长或BJAB-短细胞用小鼠(10μl)(VWR,#RLD108-0100)和人血清(10μl)(Sigma,St.Louis,MO,#S-2257)在100μl FACS清洗缓冲液(含2％FBS的1X PBS(Genentech,Inc.))中在冰上封闭15分钟。然后将细胞用1μg/ml每种抗M1’抗体在冰上染色20分钟，然后用1ml FACS清洗缓冲液清洗，并以1200rpm离心5分钟。将细胞重悬于100μl FACS清洗缓冲液，然后用山羊抗小鼠IgG-PE(5μl)(Caltag/Invitrogen,Carlsbad,CA,#M30004-4)在冰上染色20分钟。像之前那样清洗细胞，并重悬于1ml FACS清洗缓冲液，供FACS Calibur仪器(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上的分析用。所测试的所有抗体都是对长型IgE特异性的，且不以超过同种型对照的程度结合BJAB-IgE/短细胞。基于染色强度，我们观察到广泛的相对亲和力。
我们还评估了抗M1’抗体对在细胞表面上天然表达低水平的含M1’的人IgE的U266细胞系(ATCC,Manassas,VA,#TIB196)的结合。在杂交瘤培养基[RPMI 1640、15％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氢盐]中以高密度(1-2x 106/ml)维持U266细胞。将U266细胞用1μg/ml的抗M1’抗体染色。47H4、47G4和42A5以与Mae11类似的水平将U266染色。抗体42H4、45C1和28E9以很低的水平将U266染色。7A6、1C11、26A11、51D2、和26B11不对U266染色(图2C-1至2C-6)。
实施例3A：鼠抗IgE/M1’结合特异性
图2D-2F显示鼠抗IgE/M1’抗体47H4、26A11和7A6对一组表达人、恒河猴或猕猴IgE/M1’的细胞系的结合。
在经逆转录病毒感染以表达带有M1’序列的长型IgE或缺乏M1’序列的短型IgE的人B细胞系BJAB(ATCC Manassas,VA,#HB-136)和Daudi(ATCC#CCL-213)上测试了抗IgE/M1’抗体克隆的特异性。在RPMI、10％FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺(Genentech,Inc.)中培养BJAB细胞。将0.5x106个BJAB-长或BJAB-短细胞用小鼠(10μl)(VWR,#RLD108-0100)和人血清(10μl)(Sigma,St.Louis,MO,#S-2257)在100μl FACS清洗缓冲液(含2％FBS的1X PBS(Genentech,Inc.))中在冰上封闭15分钟。然后将细胞用1μg/ml每种抗M1’抗体在冰上再染色20分钟，然后用1ml FACS清洗缓冲液清洗，并以1200rpm离心5分钟。将细胞重悬于100μl FACS清洗缓冲液，然后用山羊抗小鼠IgG-PE(5μl)(Caltag/Invitrogen,Carlsbad,CA,#M30004-4)在冰上染色20分钟。像之前那样清洗细胞，并重悬于1ml FACS清洗缓冲液，供FACS Calibur仪器(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上的分析用。所测试的所有抗体都是对长型IgE特异性的，且不以超过同种型对照的程度结合BJAB-IgE/短细胞。基于染色强度，我们观察到广泛的相对亲和力。
在经逆转录病毒感染以表达带有M1’序列的膜IgE(长型)或缺乏序列的膜IgE(短型)的人B细胞系Daudi上测试了抗IgE/M1’抗体克隆的特异性。抗IgE/M1’抗体(47H4、26A11、7A6)是对长型而非短型特异性的(图2D)。使用抗gp120mIgG1抗体作为同种型对照(Genentech,Inc)。
用含有恒河猴或猕猴或人IgE/M1’之人IgE/灵长类M1’盒的逆转录病毒转导人B细胞系Daudi。转导后，在3-4次分选的过程里通过FACS分选仪将表达人、恒河猴、或猕猴IgE/M1’的细胞分选至纯度>98％。
图2F演示了抗IgE/M1’抗体结合恒河猴和猕猴M1’的能力。47H4和7A6结合恒河猴和猕猴M1’二者，而26A11只结合恒河猴M1’。
在Daudi转染子细胞系之外，我们评估了抗IgE/M1’抗体对U266，即一种人IgE骨髓瘤细胞系(ATCC,Manassas,VA,#TIB196)的结合。在杂交瘤培养基[RPMI 1640、15％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氢盐]中以高密度(1-2x 106/ml)维持U266细胞。将U266细胞用1μg/ml的抗M1’抗体染色。抗IgE/M1’抗体47H4结合U266，而26A11和7A6不然(图2E)。
实施例3B：人源化抗IgE/M1’结合特异性
实施例3B显示人源化抗IgE/M1’抗体对一组表达人、恒河猴或猕猴IgE/M1’的细胞系的结合。
使用实施例3A中所讨论的相同的过表达人、恒河猴和猕猴M1’的Daudi或BJAB人B细胞系，在经逆转录病毒感染以表达带有M1’序列的长型IgE或缺乏M1’序列的短型IgE的人B细胞系Daudi上测试了人源化抗IgE/M1’抗体克隆的特异性。人源化抗IgE/M1’抗体(47H4v5、26A11v6、7A6v1)是对长型而非短型(无M1’)特异性的(图2G)。使用抗Her2单抗huIgG1作为同种型对照(Genentech,Inc.)。另外，人源化抗IgE/M1’抗体(47H4v5和26A11v6)结合U266细胞系(图2H)。
图2I显示了人源化抗IgE/M1’抗体结合恒河猴和猕猴M1’二者的能力。抗体47H4v5和7A6v1结合恒河猴和猕猴M1’二者，而26A11v6只结合恒河猴M1’。
实施例4：抗M1’抗体的相对结合亲和力
我们在1μg/ml观察到宽范围的抗IgE/M1’抗体结合强度。为了评估这些抗体对IgE长受体的相对亲和力，我们用连续稀释的抗M1’抗体(1，0.1，0.01，0.001μg/ml)将BJAB-长细胞染色。将BJAB-长细胞用小鼠和人血清(10μl)在冰上封闭20分钟。将细胞用适宜量的抗M1’抗体、或抗gp120mIgG1或抗豚草mIgG2a同种型对照再染色20分钟。然后将细胞在FACS清洗缓冲液(1ml)中清洗，离心(1200rpm，5分钟)，并重悬于100μl含山羊抗小鼠IgG-PE抗体(5μl)(CALTAG/Invitrogen,Carlsbad,CA#M30004-4)的FACS清洗缓冲液，供检测用。如上所述再次清洗细胞，然后在FACS Calibur仪器(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上分析。电压设置基于0.001μg/ml同种型对照。根据这些结果，依照相对结合亲和力将抗IgE/M1’抗体候选者排序：
42H4>7A6，47H4，47G4>42A5，26A11，45C1>51D2，26B11>1C11>28E9
在通过抗体滴定和FACS检测测定相对亲和力之外，我们还使用Scatchard分析测定了选定抗M1’抗体对表达IgE长型的BJAB细胞系的亲和力。制备BJAB-长细胞，供冷结合缓冲液中的结合用，所述冷结合缓冲液由基础培养基及10mM HEPES pH 7.4和2％FBS以及40μg/ml人IgG构成。将细胞稀释至1.7x 106个细胞/ml的浓度，并保持在冰上，直至将它们添加至测定体系。用Iodogen法碘化抗体。一式三份地制备各种浓度的未标记抗体，使用1:2稀释，以饱和浓度开始，以零浓度结束，总共14个浓度。将单一浓度的碘化抗体添加至竞争者未标记抗体的所有稀释度。最后，将250,000个BJAB-长细胞添加至每份碘化和未标记抗体混合物。将样品在摇动中于4℃温育4小时。然后收集每份样品并在膜上过滤，用结合缓冲液清洗至少3次，让它们干燥，然后使用Perkin Elmer Wizard 1470自动伽马计数器测量1分钟。
实施例4A：鼠抗IgE/M1’抗体的Scatchard亲和力
制备表达各种形式的带有或没有M1’(人、恒河猴、猕猴)的IgE的BJAB或Daudi细胞，供冷结合缓冲液中的结合用，所述冷结合缓冲液由基础培养基及10mM HEPES pH 7.4和2％FBS以及40μg/ml人IgG构成。将细胞稀释至1.7x 106个细胞/ml的浓度，并保持在冰上，直至将它们添加至测定体系。用Iodogen法碘化蛋白质/抗体。一式三份地制备各种浓度的冷蛋白质，使用1:2稀释，以饱和浓度开始，以零浓度结束，总共14个浓度。将单一浓度的热蛋白质添加至所有稀释度，与冷蛋白质竞争。最后，将细胞添加至热和冷蛋白质混合物，每份样品使用250,000个细胞。将测定体系在摇动中于4℃保持4小时。然后收集每份样品并在膜上过滤，用结合缓冲液清洗至少3次，让它们干燥，然后使用Perkin Elmer Wizard 1470自动伽马计数器计数1分钟。
图3O总结了通过Scatchard分析测量得到的鼠抗M1’抗体的亲和力。鼠抗体47H4mIgG1分别以0.79、0.77和0.97nM的亲和力结合人、恒河猴、猕猴M1’。鼠抗体26A11mIgG1和7A6mIgG1分别以2.3和0.64nM的亲和力结合人M1’。
图3P总结了人源化抗IgE/M1’抗体对人、恒河猴和猕猴M1’的结合亲和力。人源化抗体47H4v5 huIgG1分别以1.5、1.3和2.5nm的亲和力结合人、恒河猴和猕猴M1’。人源化抗体47H4v2、47H4v1、26A11v6、26A11v14和26A11v1分别以0.54、0.37、1.85、1.5和1.06的亲和力结合人M1’。
实施例5：抗IgE/M1’表位结合/阻断研究
在抗IgE/M1’抗体候选者之间实施了阻断研究以测定交叠的或独特的结合表位。当阻断和检测抗体属于不同同种型时(即IgG1对IgG2a)，利用这些同种型差异，通过用同种型特异性二抗(CALTAG/Invitrogen,Carlsbad,CA,山羊抗小鼠IgG1-PE#32004或山羊抗小鼠IgG2a#M32204)进行检测来测定阻断程度。当阻断和结合抗体属于同一同种型时，将抗体偶联至生物素(Pierce,Rockford,IL,EZ-link-sulfo-NHS-LC-Biotin#CAS 127062-220)，并用链霉亲合素-PE(BD#554061)检测，或者偶联至Alexa-647(Molecular Probes/Invitrogen,Carlsbad,CA,#A20173)。最初以1:1的比例(10μg/ml)使用阻断和检测抗体(图4A-1至4B)。使用10:1的阻断抗体对检测抗体比进一步测试最初不给出阻断或只给出部分阻断的抗体组合。将BJAB-长细胞用小鼠和人血清封闭(如上所述)，然后用阻断抗体(10μg/ml)在FACS清洗缓冲液(2％FBS/1X PBS)中在冰上染色20分钟。将细胞在FACS清洗缓冲液中清洗，然后用检测抗体以1:1(10μg/ml)或10:1的比例(1μg/ml)在冰上染色20分钟。如上所述再次清洗细胞，然后在FACS Calibur仪器(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上分析。将染上色的细胞与同种型对照抗体，即抗gp120mIgG1(Genentech,Inc.)或抗豚草mIgG2a(Genentech,Inc.)比较(图4C)。为了比较，在可能时，通过用未偶联的相同抗体染色来测定完全阻断。
阻断研究揭示了三个主要结合群，即A和B和C。基于部分交叠表位，A群进一步分成两组，即A1(47H4、47G4、42H4、42A5)和A2(45C1、51D2、26A11)(图4D)。C群(26B11)与其它抗体候选者具有很少的交叠。三种候选者比其它候选者更广泛地交叠。1C11表现出与A1和A2组具有交叠表位，而且只被B群(28E9)部分阻断。7A6主要属于A1组，但是与A2组候选者具有部分相互作用。28E9属于只有它一个的一个群。28E9与A2组候选者只有部分相互作用。
实施例5A：表位作图
图5A-5E显示使用抗IgE/M1’抗体实施的表位结合研究。鼠抗体47H4、7A6和26A11显示于图5B和5D，而人源化变体47H4v5、7A6v1和26A11v6显示于图5C和5E。
表位作图研究：鼠候选者
生成了跨越围绕并包含人M1’(Clifford Quan)的序列的15种肽(图5A)。将肽重悬于dH2O或50％DMSO。以包被缓冲液(0.05M碳酸盐/碳酸氢盐pH9.6)中1μg/ml将肽包被到96孔板(NUNC Maxisorp高蛋白质结合容量ELISA板#44-2404)上(100μl每孔)。使用M1’-Fc融合蛋白作为结合的阳性对照。阴性对照包括用人IgE(U266)包被的孔和未包被的孔。让肽于4℃包被过夜。次日上午，将板用清洗缓冲液(PBS/0.05％Tween-20(pH 7.4))清洗3次。然后将板在温和摇动中在封闭缓冲液(PBS,0.5％BSA(pH 7.4))封闭1小时。在Magic缓冲液[PBS(pH7.4)、0.5％BSA、0.05％Tween-20、10ppm Proclin、0.2％BgG、0.25％Chaps、5mM EDTA、0.35M NaCl]中制备要测试的抗体(47H4mIgG1、47H4v5huIgG1、26A11mIgG1、26A11v6huIgG1、7A6mIgG1、7A6v1huIgG1)的稀释液(40ng/ml和1ng/ml)。分别使用抗gp120mIgG1和huIgG1抗体作为鼠和人抗IgE/M1’抗体的对照。一旦板充分封闭(0.5％BSA/1X PBS)，将板清洗3次，然后一式三份地将抗体添加至板(100μl每孔)。然后将板于室温温育2小时。将鼠抗体板清洗3次，然后添加抗小鼠IgG1-生物素(BDBiosciences(A85-1)#553441)(1:10,000，100μl每孔)，并于RT温育1小时。3次清洗后，添加SA-HRP(BD Biosciences#554066)(1:20,000，100μl每孔)，并温育1小时。像之前那样清洗人IgG1抗体板，添加抗huIgG.Fc-HRP(Jackson ImmunoResearch(#109-036-098))(1:10,000，100μl每孔)并于RT温育1小时。一旦第二温育完成，将板清洗6次，并添加TMB底物(BDOptEIA#555214)(100μl每孔)。约4分钟后用1M H3PO4终止底物-HRP反应。然后在450/650读板。数据表述为相对OD(OD450/CD650)。
图5B和5D图示了鼠47H4、26A11和7A6抗IgE/M1’候选者对M1’肽的结合。这些候选者的结合与表位分组限定的抗体阻断研究相关。47H4mIgG1结合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQ ID NO:8)。7A6mIgG1结合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQ ID NO:8)和肽5(RAPDRVLCHSGQQQG)(SEQ ID NO:9)。26A11 mIgG1结合肽7(GQQQGLPRAAGGSVP)(SEQ ID NO:11)和肽8(PRAAGGSVPHPRCH)(SEQ ID NO:12)。
图5C和5E图示了人源化抗IgE/M1’抗体对M1’肽的结合。如上文关于相应鼠抗体所述实施表位作图，只是使用不同的二抗。像之前那样清洗人IgG1抗体板，并添加抗IgG.Fc-HRP二抗(Jackson ImmunoResearch,#109-036-098)(1:10,000，100μl每孔)，并于RT温育1小时。表位结合与对亲本鼠抗体所观察到的平行。47H4v5结合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQID NO:8)。7A6v1结合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQ ID NO:8)和肽5(RAPDRVLCHSGQQQG)(SEQID NO:9)。26A11mIgG1结合肽7(GQQQGLPRAAGGSVP)(SEQ ID NO:11)和肽8(PRAAGGSVPHPRCH)(SEQ ID NO:12)。
实施例6：鼠抗IgE/M1’在Daudi-IgE/长细胞中对凋亡的诱导
使用Daudi-长(IgE/M1’)细胞来测试交联表面IgE对诱导凋亡的影响。Daudi细胞(ATCC,Manassas,VA,#CCL-213)是一种已知对应答BCR交联而发生的凋亡易感的人伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤细胞系。如上文关于BJAB IgE长细胞的生成所描述的，通过带有M1’的IgE的U266重链和轻链的逆转录病毒转导生成了表达长型IgE的Daudi细胞。使用针对内源IgM和经转染IgE B细胞受体的抗体进行的Daudi-IgE/长细胞的流式细胞术分析指示IgM的表达高于IgE。在培养基[RPMI,10％FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青霉素/链霉素(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#15140-122)、2mM谷氨酰胺(Genentech,Inc.)、10mMHEPES(7.2)(Genentech,Inc.)、1mM丙酮酸钠(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#11360)、1.59g/L碳酸氢钠溶液(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#25080-094)]中培养至0.2x 106/1.5ml密度的细胞中研究了Daudi-IgE/长细胞的凋亡。在开始凋亡测定法之前，在Ficoll梯度(GE Healthcare#17-1440-03)上除去死细胞以降低测定法中细胞死亡的背景水平。一式三份地将0.2x 106个细胞在有和没有抗M1’抗体或对照抗体的情况中在溶液中培养72小时。然后收获细胞，并使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒I(BD Biosciences,San Jose,CA#556547)分析凋亡水平。将细胞在冷PBS(Genentech,Inc.)中清洗两次，然后重悬于100μl 1X结合缓冲液(0.1M Hepes/NaOH(pH7.4)、1.4M NaCl、25mM CaCl2)(BD Biosciences,San Jose,CA,#51-66121E)。然后将细胞用2.5μl膜联蛋白V-FITC抗体(BD Biosciences,San Jose,CA#51-65874X)和5μl碘化丙啶(PI)(BD Biosciences,San Jose,CA#51-66211E)在黑暗中染色。15分钟后，向每个管添加400μl 1X结合缓冲液，并在FACS Calibur流式细胞术仪器(BD,Inc.Franklin Lakes,NJ)分析细胞。为每份样品收集到大约10-20,000例事件。正在死去的细胞定义为膜联蛋白-V呈阳性且PI呈阴性。死细胞是膜联蛋白-V和PI二者都呈阳性。使用FlowJo FACS分析软件(Tree Star,Inc.,Ashland,Oregon)计算每种群体(死的和正在死去的)的百分比。对三份重复的数据取平均值和计算标准偏差。使用Excel(Microsoft,Inc.)以死的和正在死去的细胞之和计算百分比凋亡并绘图。
使用喜树碱(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,#C9911-100mg)和抗IgM抗体(JacksonImmuno Research,West Grove,PA,#109-006-120)作为在Daudi-IgE/长细胞系中诱导凋亡的阳性对照。使用抗gp120mIgG1或抗豚草mIgG1抗体(Genentech,Inc.)作为此测定法的阴性对照。将Daudi-IgE/长细胞与一定范围的抗IgE/M1’或同种型对照抗体浓度(25、10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml)一起培养。所测试的抗IgE/M1’抗体是7A6、47H4、47G4、42A5、42H4、1C11、26A11、51D2、45C1、26B11和28E9(Genentech,Inc.)。还使用抗人IgE抗体(Mae11-mIgG1)进行比较。
同种型对照抗gp120和抗豚草抗体不以超过未处理细胞的程度诱导凋亡。每次实验的凋亡背景水平在10-15％范围中。抗IgE/M1’抗体7A6(>10μg/ml)、47H4(>10μg/ml)、和47G4(25μg/ml)诱导Daudi IgE长细胞凋亡。26A11诱导在低得多的浓度(>0.1μg/ml)诱导程度类似的凋亡(约30-50％)。42A5、51D2、45C1、26B11、和28E9不以超过背景水平的程度诱导凋亡。Mae11也不以超过背景水平的程度诱导凋亡。
我们还在存在山羊抗小鼠IgG F(ab’)2二抗(Jackson ImmunoResearch,WestGrove,PA#115-006-062)(用以超交联Daudi细胞系上的IgE B细胞受体)的情况中实施了凋亡测定法。交联实验是在存在山羊抗小鼠IgG F(ab’)2抗体(30μg)(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA,#115-006-062)的情况中进行的。除了26B11(30％)以外，所有抗体都诱导70-80％的最大凋亡水平，但是在不同的浓度发生。这些抗体可分成两组。7A6、1C11、26A11、51D2、45C1、和28E9在最高浓度诱导最大凋亡。另一组，即47H4、47G4、42A5、和42H4、及MAE11在较高浓度展现渐减的凋亡。
实施例6A：人源化抗IgE/M1’抗体在Daud/IgE-长细胞中对凋亡的诱导
使用Daudi-长(IgE/M1’)细胞来测试交联表面IgE对在此细胞系中诱导凋亡的影响。Daudi细胞(ATCC,Manassas,VA,#CCL-213)是一种已知对应答BCR交联而发生的凋亡易感的人伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤细胞系。前夜以0.2x106/1.5ml的密度在培养基[RPMI、10％FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青霉素/链霉素(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#15140-122)、2mM谷氨酰胺(Genentech,Inc.)、10mM HEPES(7.2)(Genentech,Inc.)、1mM丙酮酸钠(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#11360)、1.59g/L碳酸氢钠溶液(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA#25080-094)]中培养Daudi-IgE/长细胞，然后次日在Ficoll梯度(GE Healthcare#17-1440-03)上除去死细胞。这降低测定法中细胞死亡的背景水平。一式三份地将0.2x 106个细胞在有和没有抗M1’抗体或对照抗体的情况中在溶液中培养72小时。然后收获细胞，并使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒I(BD Biosciences,San Jose,CA#556547)分析凋亡水平。将细胞在冷PBS(Genentech,Inc.)中清洗两次，然后重悬于100μl 1X结合缓冲液(0.1M Hepes/NaOH(pH7.4)、1.4M NaCl、25mM CaCl2)(BDBiosciences,San Jose,CA,#51-66121E)。然后将细胞用2.5μl膜联蛋白V-FITC抗体(BDBiosciences,San Jose,CA#51-65874X)和5μl碘化丙啶(PI)(BD Biosciences,San Jose,CA#51-66211E)在黑暗中染色。15分钟后，向每个管添加400μl 1X结合缓冲液，并在FACSCalibur流式细胞术仪器(BD,Inc.Franklin Lakes,NJ)分析细胞。为每份样品收集到大约10-20,000例事件。正在死去的细胞定义为膜联蛋白-V呈阳性且PI呈阴性。死细胞是膜联蛋白-V和PI二者都呈阳性。使用FlowJo FACS分析软件(Tree Star,Inc.,Ashland,Oregon)计算每种群体(死的和正在死去的)的百分比。对三份重复的数据取平均值和计算标准偏差。使用Excel(Microsoft,Inc.)以死的和正在死去的细胞之和计算百分比凋亡并绘图。
使用抗IgM抗体(JacksonImmuno Research,West Grove,PA,#109-006-120)作为在Daudi-IgE/长细胞系中诱导凋亡的阳性对照。使用huIgG1(Genentech,Inc.)作为此测定法的阴性对照。将Daudi-IgE/长细胞与一定范围的抗IgE/M1’或同种型对照抗体浓度(25、10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml)一起培养。在存在山羊抗人IgG F(ab’)2抗体(50μg)(Biosource#AHI1301)的情况中进行第二交联实验。所测试的抗IgE/M1’抗体是47H4v5、26A11v6、7A6v1 huIgG1。
同种型对照huIgG1不以超过未处理细胞的程度诱导凋亡。每次实验的凋亡背景水平在10-15％范围中。抗IgE/M1’抗体47H4v5、26A11v6和7A6v1在30-40％的范围中诱导凋亡(图8A)。
我们在存在山羊抗人IgG F(ab’)2二抗(Biosource#AHI1301)(用以交联Daudi细胞系上的IgE受体)的情况中重复了相同测定法。所有抗体都诱导70-90％的最大凋亡水平，在存在高浓度的抗IgE/M1’一抗时凋亡活性有一些降低(图8B)。
野生型对无岩藻糖基化47H4v5，在没有二级交联的情况中诱导凋亡
使用BIOWA细胞系(Genentech,Inc.)生成了无岩藻糖基化(AF)型式的47H4v5。WT和AF两种型式的47H4v5都能够诱导凋亡至相似的水平(图8C)。
表1：人源化抗IgE/M1’结合亲和力
实施例7：诱导的钙流
我们调查了抗M1’抗体在Daudi-IgE/长细胞中诱导钙流的能力，作为这些抗体能诱导IgE B细胞受体下游细胞信号传导的证据。将过表达长型IgE/M1’的Daudi细胞(ATCC,Manassas,VA,#CCL-213)以0.2x 106/ml的低密度培养过夜。次日上午，在Ficoll梯度(GEHealthcare#17-1440-03)上除去死细胞。给细胞大量(in bulk)加载Indo-1，以确保在所有刺激间均匀加载。将细胞以5x106/ml重悬于培养基(RPMI-10％FBS(Hyclone)、青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺)，并与钙检测染料Indo-1(5μM)(Molecular probes/Invitrogen,Carlsbad,CA,#I1223)组合。然后将细胞在培养基中清洗，并以106/ml重悬。每次刺激使用106个细胞。将样品在37℃水浴中温热5分钟，之后在FACS Vantage仪器(BD,Inc,FranklinLakes,NJ)上运行。首先将样品运行1分钟以生成基线，然后用20μg每种抗体刺激样品，除了抗IgM(10μg)。收集数据8-10分钟。在FlowJo FACS分析软件(Tree Star,Inc.,Ashland,Oregon)上实施动力学分析。以结合的Indo-1 405/游离的Indo-1 1530之比报告数据。将所有抗M1’抗体与同种型对照抗gp120mIgG1(20μg)比较。使用抗人IgM(Jackson Immuno-Research,West Grove,PA,#109-005-129)和抗IgE(Mae11,Genentech,Inc.)作为阳性对照。7A6、47H4、47G4、26A11、和1C11在Daudi IgE长细胞中诱导钙流。28E9和42A5诱导低水平的钙流。45C1、26B11、和51D2不诱导钙流。
实施例8：抗IgE/M1’47H4v5wt和无岩藻糖基化对ADCC的诱导
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)使得细胞毒性细胞能够结合(经由抗体)抗原结合靶细胞，并随后以细胞毒素杀死靶细胞。拥有ADCC活性或增强的ADCC活性的抗IgE/M1’抗体在IgE介导的病症的治疗中可具有增强的治疗价值。
已经发现在无岩藻糖基化的哺乳动物细胞中生成的抗体具有增强的ADCC活性。以下实验描述了无岩藻糖基化抗IgE/M1’抗体的生成。
自100ml全血(RosetteSep#15065,Stem Cell Technologies)分离NK细胞。通过抗人CD56染色测定NK细胞的纯度。在每次测定法中使用>70％纯的CD56+NK细胞。连续滴定抗IgE/M1’抗体和抗Her2单抗huIgG1同种型对照。将这些抗体(50μl)与在细胞表面上过表达人IgE/M1’的BJAB细胞在含1％FBS的RPMI-1640(无酚红)(BioWhitaker#12-918F)中于室温温育30分钟(细胞系是如上文所概述的那样生成的)。然后将NK细胞(50μl)以15:1的比例(150,000个NK细胞对10,000个靶(BJAB-长))添加至细胞系。一式三份地进行测定。然后将BJAB-人长、抗体、和NK细胞于37℃温育4小时。培养后，将96孔U底板离心，并收获上清液(100μl)。然后使用LDH反应测定法(Roche#1644793)对上清液测试LDH释放。使用单独的靶物和溶解的靶物来计算百分比细胞毒性。如制造商所概述的那样，将上清液以等体积与LDH反应混合液一起温育30-60分钟。然后在490nm处读板。如下计算％细胞毒性：＝(实验值–单独的靶)/溶解的靶–单独的靶)。使用Kaleidagraph将数据绘图，并使用最佳拟合曲线来生成ED50值。
在图10中，huIgG1同种型对照抗体诱导低水平的细胞毒性。抗IgE/M1’抗体诱导特异性细胞毒性。野生型和无岩藻糖基化形式的抗IgE/M1’47H4v5诱导相似的最大％细胞毒性(约70-80％)。无岩藻糖基化47H4v5比野生型更有效力(无岩藻糖基化47H4v5的EC50为约0.83nM；野生型47H4v5的EC50为约6.6nM)。
实施例9：鼠抗IgE/M1’抗体在特应性hu-SCID小鼠中的效果
图12A和13A演示了抗IgE/M1’抗体(分别为鼠的和人源化的二者)在特应性hu-SCID模型中抑制血清IgE和生成IgE的浆细胞的生成所述IgE的能力。实验1(#07-0377)测试鼠抗IgE/M1’候选者，而实验2(#07-1232)测试人源化抗IgE/M1’候选者。
来自我们公司内部的Leukopack血液供体程序的对供体筛选血清IgE水平。被选出来为特应性hu-SCID模型提供细胞的两名供体自身鉴定为具有变态反应和具有1696和1152ng/ml的血清IgE水平。正常供体通常具有范围为<100-300ng/ml的IgE。
hu-SCID实验概述于图12A和13A。通过Leukophoresis和Ficoll密度梯度(GEHealthcare#17-1440-03)分离PBMC并计数。在第0天将108个PBMC细胞(108个每100μl)腹膜内注射入经照射的SCID-米色小鼠。为了使应答偏向IgE生成，在第0天和第3天用抗IFNγ(BD Biosciences,San Jose,CA,#554698)和抗IL12抗体(100μg/剂)(BD Biosciences,SanJose,CA,#554659)；及在第2、3、4天用rhIL-4(100ng/剂)(R&D Systems,Minneapolis,MN,#204-IL-010)处理小鼠。在第0天开始，每周三次(大约每三天)用实验抗体(即抗IgE/M1’)处理小鼠，直至研究结束。让人细胞扩增7-14天，此时对小鼠处以安乐死。在第7天和研究结束时采集血液。在实验的最后一天，对小鼠处以安乐死，并分离脾细胞。将单细胞悬浮液用于IgE Elispot测定法和FACS，以测定人细胞重建和IgE浆细胞消减的程度。
数据表述成均值+标准偏差。使用JMP统计软件计算p值。Dunnett氏检验比较组均值，其中针对参照组检验了所有测试组。每对Student氏t使用Student氏t检验比较每个组对。然后应用Bonferroni修正来调整每对Student氏t的p值，以避免(safeguard against)成对比较。所有p值阈值为0.05。在没有相对于基线水平标准化的情况下，在治疗组与对照组之间计算图12A-12I和13A-13H中所报告的数据的百分比变化。
使用人ELISA规程测定游离IgE水平，其中将Maxisorp 384孔ELISA板(Nalge NuncInternational,Rochester,NY)用1μg/ml单克隆抗体MAE11在50mM碳酸盐缓冲液pH 9.6中于4℃包被过夜，并用0.5％牛血清清蛋白PBS中于室温封闭1小时。将含0.5％牛血清清蛋白、0.05％聚山梨酯20、10ppm Proclin 300(Supelco,Bellefonte,PA)、0.25％CHAPS(Sigma,St.Louis,MO)、0.2％牛g球蛋白(Biocell,Rancho Dominguez,CA)和5mM EDTA的PBS中的标准品(0.098-12.5ng/ml)和三倍连续稀释样品(最小稀释度1:10，以避免任何血清效应)在板上于室温温育1小时。如下检测结合的IgE，即将过氧化物酶标记的山羊抗人IgE抗体(Kirkegaard&Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)在孔中温育1小时。添加底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(Kirkegaard&Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)，并通过添加1M磷酸来终止反应。在各步骤间清洗板。在Titertek叠式读数仪(ICN,Costa Mesa,CA)在450nm处读取吸光度。使用四参数非线性回归曲线拟合程序(在Genentech开发的)拟合标准曲线。将落在标准曲线的线性范围中的数据点用于计算样品中的IgE浓度。
如下实施人免疫球蛋白同种型组，即将针对人IgG1的小鼠单克隆抗体(单抗)(克隆2C11,Abcam Inc.,Cambridge,MA)在0.05M碳酸钠缓冲液pH9.6中稀释至4μg/ml，并在4℃过夜温育过程中包被到ELISA板(384孔，高结合板，Greiner Bio One,Monroe,NC)上。用清洗缓冲液(PBS/0.05％Tween-20)清洗3次后，将板用PBS/0.5％牛血清清蛋白(BSA)封闭1-2小时。此温育和所有其它温育都是于室温在定轨摇床上实施的。使用测定缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.05％Tween 20/0.25％CHAPS/5mM EDTA/15PPM Proclin)，将小鼠血清样品1:100稀释，接着连续1:3稀释。使用相同的缓冲液，制备连续稀释的IgG1，供标准曲线用(12.20-1560ng/ml)。融化在标准曲线的高、中、和低区预稀释的冷冻对照。封闭步骤后，清洗板，并将样品、标准品、和对照添加至384孔板，并温育2小时。清洗板，并将生物素化的针对人IgG1的小鼠单抗(Zymed Laboratories,South San Francisco,CA)在测定缓冲液中1:500稀释，并添加至清洗后的板，温育1小时。将链霉亲合素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)(GEHealthcare,Piscataway,NJ)在测定缓冲液中1:40,000稀释，并添加至清洗后的板。温育30分钟和最后的清洗步骤后，添加四甲基联苯胺(TMB)(Kirkegaard&Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)，并显色10-15分钟。通过添加1M磷酸来终止反应。使用微量板读数仪(450nm，650nm参照波长)获得光密度，并自标准曲线的4参数拟合计算样品浓度。小鼠血清样品中人IgG1的最小可计量浓度为1.22μg/ml。
上文所述这种总体ELISA法还用于分析其它Ig同种型。
IgG2
将小鼠抗人IgG2单抗(γ2链特异性的)(Southern Biotech,Birmingham,AL)以4μg/ml包被到ELISA板上。人IgG2标准曲线的范围为12.20-1560ng/ml。将生物素化的小鼠抗人IgG2单抗(γ2链特异性的)(Southern Biotech)稀释至0.5μg/ml，并用作检测抗体。将SA-HRP以1:10,000的稀释度添加至384孔板。小鼠血清样品中人IgG2的最小可计量浓度为1.22μg/ml。
IgG3
将小鼠抗人IgG3单抗(Zymed Laboratories)稀释至1μg/ml，并包被到ELISA板上。人IgG3标准曲线的范围为0.78-100ng/ml。将生物素化的小鼠抗人IgG3单抗(γ3链特异性的)(Southern Biotech)稀释至0.1μg/ml，并用作检测抗体。将SA-HRP以1:20,000的稀释度添加至384孔板。小鼠血清样品人IgG3的最小可计量浓度为78.1ng/ml。
IgG4
将纯化的小鼠抗人IgG4单抗(BD Pharmingen,San Jose,CA)稀释至0.25μg/ml，并包被到ELISA板上。人IgG4标准曲线的范围为0.20-25ng/ml。将生物素偶联的小鼠抗人IgG4单抗(BD Pharmingen)稀释至0.25μg/ml，并用作检测抗体。将SA-HRP以1:20,000的稀释度添加至384孔板。小鼠血清样品中人IgG4的最小可计量浓度为39.1ng/ml。
IgA
将纯化的小鼠抗人IgA1/A2单抗(BD Pharmingen)稀释至2μg/ml，并包被到ELISA板上。人IgA标准曲线的范围为0.20-25ng/ml。将生物素偶联的小鼠抗人IgA1/A2单抗(BDPharmingen)稀释至1μg/ml，并用作检测抗体。将SA-HRP以1:80,000的稀释度添加至384孔板。小鼠血清样品中人IgA的最小可计量浓度为39.1ng/ml。
IgM
将纯化的小鼠抗人IgM单抗(BD Pharmingen)稀释至0.5μg/ml，并包被到ELISA板上。人IgM标准曲线的范围为0.78-100ng/ml。将生物素偶联的小鼠抗人IgM单抗(BDPharmingen)稀释至0.5μg/ml，并用作检测抗体。将SA-HRP以1:40,000的稀释度添加至384孔板。小鼠血清样品中人IgM的最小可计量浓度为156ng/ml。
在FACS Calibur流式细胞仪(BD(San Jose,CA))上使用Fluoresbrite YG微球(Polysciences,Inc.#18862)对Hu-SCID脾细胞、小鼠脾细胞或淋巴结细胞计数。
使用Elispot测定法来测定用rhuIL-4、抗IFNγ和抗IL-12抗体处理15天后hu-SCID小鼠中生成IgE的浆细胞的频率。将Elispot板(Millipore,Billerica,MA,#MSIPS4510,透明的)用1:500稀释的未偶联的抗人IgE抗体(AXXORA,San Diego,CA,#BET-A80-108A)在包被缓冲液[Genentech,Inc.(A3323)]中以100μl/孔于4℃包被过夜。然后倒掉一抗溶液，并将板用清洗缓冲液(1X PBS，0.05％Tween-20)清洗两次。将膜用200μl/孔含0.5％BSA的1X PBS于37℃封闭0.5-1小时。除去封闭液，并将阳性对照细胞或hu-SCID脾细胞添加至板。使用人骨髓瘤生成IgE的U266细胞系(ATCC,Manassas,VA,#TIB196)作为测定法的阳性对照。将U266细胞添加至板，以3000个细胞/0.1ml(＝0.032x106/ml)杂交瘤培养基[RPMI 1640、15％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氢盐]的浓度开始，然后进行七个连续稀释(1:2)。将全脾单细胞悬浮液重悬于1ml培养基。将100μl添加至第一个孔。然后实施七次1:2连续稀释。将U266杂交瘤和脾细胞于37℃温育过夜。次日，将板用清洗缓冲液(1XPBS,0.05％Tween-20)清洗三次，然后向每个孔添加100μl/孔在0.5％BSA/1X PBS中1:2000稀释的二抗，即抗人IgE-碱性磷酸酶偶联物(Sigma,St.Louis,MO,A-3525)，并于37℃温育2小时。将板清洗三次，然后用ddH2O(Genentech,Inc.)漂洗一次。向每个孔添加100μl/孔BCIP/NBT溶液(R&D Systems,Minneapolis,MN,Elispot Blue Color Module,#SEL002)，并在黑暗中温育30分钟。然后将板用ddH2O漂洗一次，并让板于室温干燥。将板送达BD Biosciences进行计数(BD,Inc.,Franklin Lakes,NJ)。使用检测到的点的数目、稀释倍数(细胞输入)、和总脾细胞计数来计算浆细胞的数目。
如下制备人浆细胞，即在第15天自抗体处理的hu-SCID小鼠取出脾。制备单细胞悬浮液，并过滤。将5x106个细胞用人(Sigma,St.Louis,MO,#S-2257)和小鼠血清(VWR,#RLD108-0100)封闭，然后用抗人CD38PE(BD Biosciences,San Jose,CA,#555460)和抗人PCFITC(Dakocytomation,Glostrup,Denmark,#K2311)抗体在FACS清洗缓冲液(2％FBS,1XPBS)中在冰上染色20分钟。然后清洗细胞，并在FACS Calibur仪器(BD,Inc.,FranklinLakes,NJ)上分析。使用人CD38表达作为人PBMC转移成功的阳性对照。浆细胞定义为CD38高、PC+。
在实验#07-0377中(图12A)，针对同种型对照抗gp120-muIgG1测试了三种抗IgE/M1’抗体(47H4、26A11、和7A6)。到第9天，同种型对照处理的小鼠生成高水平的人IgE。抗IgE/M1’候选者处理将IgE水平降低65-84％(图12B-12C)。抗IgE/M1’处理在体内也将IgE生成细胞降低19-69％(图12D-12E)。其它血清Ig相对不受抗IgE/M1’处理的影响(用有些抗M1’抗体观察到huIg1、IgG3和IgG4的约30％降低)(图12F-12G)。用抗IgE/M1’处理没有观察到脾的总浆细胞百分比的降低(图12H-12I)。
在实验#07-1232中(图13A)，针对同种型对照抗体-huIgG1测试了人源化抗IgE/M1’(47H4v5)。到第8天，同种型对照处理的小鼠生成高水平的血清IgE。抗IgE/M1’huIgG1处理将IgE水平降低了79％(图13B-13D)，将生成IgE的浆细胞降低了75％(图13C-13D)。没有观察到其它血清Ig(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA)(图13E-13F)或脾中总浆细胞百分比的降低(图13G-13H)。这些研究证明了抗IgE/M1’抗体特异性降低血清IgE和IgE生成细胞，但是不降低其它同种型的免疫球蛋白。
实施例10：人M1’转基因小鼠
huM1’转基因“敲入”小鼠的生成
因为小鼠在正常情况下不表达与人相似的M1’结构域，所以我们生成了在小鼠IgE基因座中“敲入”了人M1’结构域的小鼠(图14A)。所述人M1’序列利用上游小鼠M1剪接受体位点，然后融合至下游小鼠M1序列(图14B)。还将IRES-EGFPpA–Neo盒敲入小鼠M2序列的3’。此敲入会容许在IgE+B细胞的表面上表达具有人M1’结构域的小鼠IgE。所述M1’序列不会在分泌型IgE上表达。
M1’敲入系的筛选(PCR)
通过PCR使用对小鼠IgE基因座和人M1’序列特异性的引物对人M1’敲入小鼠进行基因分型。所使用的引物如下：
WT正向 5’-GGCCAAAGACCCTAAGACAGTC (SEQ ID NO:106)
huM1’正向 5’-GGGCTGGCTGGCGGCTCCGC (SEQ ID NO:107)
WT反向 5’-CTATGCCCTGGTCTGGAAGATG (SEQ ID NO:108)
使用32个循环的如下程序[94℃ 4分钟；94℃ 1分钟；60℃ 30秒钟；72℃1分钟(30个循环)；72℃ 10分钟]，用上述引物分析纯化的基因组DNA。然后在2％琼脂糖0.5X TBE凝胶上运行PCR产物。野生型PCR基因型给出668bp的产物，而hu-M1’敲入生成457bp的产物(图14C)。
M1’敲入系的筛选(Southern)
通过Southern印迹筛选和检验huM1’敲入ES细胞和最终的小鼠系。用HindIII(用于左臂)和BamHI(用于右臂)消化10μg纯化的ES细胞或尾基因组DNA过夜。然后在0.8％琼脂糖1X TAE凝胶上运行经过消化的DNA。然后使用变性缓冲液(1.5M NaCl；0.5M NaOH)将DNA转移至尼龙膜(Roche#1417240)过夜。将膜漂洗，UV交联，然后在旋转中在DIG简易杂交液(Roche#1585762)中于46℃浸泡4小时。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche#11636090910)如制造商指导的那样通过PCR生成探针。
用于左臂的引物为：
正向5’-TGTCTGGTGGTGGACCTGGAAAGCG (SEQ ID NO:109)
反向5’-TCCTCGCTCTCCTCCTCTGGTGGTG (SEQ ID NO:110)
用于右臂的引物为：
正向5’-CCATGCAACCTAGTATCCTATTCTC (SEQ ID NO:111)
反向5’-CTTTATACAGGAGAACCTAGCCCAG (SEQ ID NO:112)
针对未标记的PCR产物测试探针，以确保增加的大小和好的DIG标记。然后在旋转中于46℃用煮沸过夜过的探针探查印迹过夜。次日，清洗印迹，并用抗DIG抗体依照制造商的指示显色。将印迹对胶片曝光15-20分钟。图14D图示了Southern结果。野生型小鼠生成左臂7.4kB HindIII片段，其在hu-M1’敲入等位基因中变成3kB片段。野生型小鼠生成右臂14.1kB BamHI片段，其在hu-M1’敲入等位基因中变成18.1kB片段。显示了野生型和杂合小鼠(图14D)。
实施例11：Hu-M1’转基因模型：TNP-OVA免疫
此实施例例示抗IgE/M1’候选者在针对TNP-OVA的初次免疫应答(实验#07-0234F；图15A-15I)或记忆应答(实验#07-0234B；图16A-16K)两种免疫应答中阻止由TNP-OVA刺激的IgE生成的能力。TNP-OVA或三硝基苯基-卵清蛋白是高度有力的免疫原，常常用于产生有力的抗体免疫应答。
数据表述成均值±标准偏差。使用JMP统计软件计算p值。Dunnett氏检验比较组均值，其中针对参照组检验了所有测试组。每对Student氏t使用Student氏t检验比较每个组对。然后应用Bonferroni修正来调整每对Student氏t的p值，以避免(safeguard against)成对比较。所有p值阈值为0.05。通过自每个小鼠值减去未感染或未免疫组均值，计算为初次应答(图15A-15I)和记忆免疫应答(图16A-K)报告的数据的百分比变化，再次计算组均值，然后对每个时间点相对于对照组计算百分比变化。
用TNP-OVA免疫人IgE/M1’敲入小鼠(C57BL/6)在体内诱导平衡的Th1/Th2应答。初次免疫和攻击后的抗原特异性IgE水平达到约10-200ng/ml的水平。在实验#07-0234F中，在第0天给huM1’敲入小鼠(C57Bl/6)免疫TNP-OVA(Biosearch Technologies,Novato,CA)(i.p.，每只小鼠100μg，在2mg明矾(alum)中)(图15A)。然后在第0天和第28天之间每周三次用0.1mg/kg抗体处理小鼠(图15A)。在实验#07-0234B中，在第0天给huM1’敲入小鼠(C57Bl/6)免疫TNP-OVA/明矾(向之前那样)，然后在第28天用TNP-OVA(i.p.，每只小鼠100μg)攻击(图16A)。在第28天和第49天之间用10mg/kg抗体处理小鼠(图16A)。在免疫应答的过程里对小鼠采血，以监测抗原特异性血清IgE和IgG1水平。
如下测量TNP-OVA特异性IgE IgG1，用25μL/孔TNP-OVA(TNP:OVA比例为13:1)(Biosearch Technologies,Novato,CA)(在50mM碳酸钠/碳酸氢钠pH9.6中稀释至0.5μg/mL)将ELISA板(384孔，具有MaxiSorpTM表面,Nunc,Neptune,NJ)于2-8℃包被12-18小时。然后将板倒空并扣干。将封闭缓冲液(PBS,0.5％BSA,pH 7.2,50μL/孔)添加至板1-2小时。此温育和所有后续温育均于室温在温和摇动中实施。将样品在测定稀释剂(PBS,0.5％BSA,0.05％Tween-20,0.01％Proclin 300)中1/50稀释，接着在11个点上连续1/3稀释。将标准品在测定稀释剂中在7个点上连续两倍稀释，抗TNP OVA IgG1自1ng/ml开始，而抗TNP OVAIgE自3ng/ml开始。经板用清洗缓冲液(PBS,0.05％Tween-20,pH 7.2)清洗3次，将标准品、样品和对照一式两份地添加(25μL/孔)至板，用于分开检测IgG1和IgE同种型。温育1.5-2小时后，将板用清洗缓冲液清洗6次。将生物素化的大鼠抗小鼠IgG1和IgE单抗(BDBiosciences,San Diego,CA)在测定稀释剂中稀释至0.5μg/mL(IgG1)或1.0μg/mL(IgE)，并添加至适宜的板(25μL/孔)。将板温育1-1.5小时，并用清洗缓冲液清洗6次。将链霉亲合素-辣根过氧化物酶偶联物(AMDEX,GE Healthcare,Piscataway,NJ)1/80,000(用于IgG1)或1/5,000(用于IgE)稀释，并添加至板(25μL/孔)30分钟。用清洗缓冲液清洗6次后，将板显色，即添加25μL/孔四甲基联苯胺(Kirkegaard&Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)并温育15分钟(用于IgG1)或25分钟(用于IgE)。通过添加25μL/孔1M H3PO4来终止反应，并读取450nm处的吸光度，以620nm为参照。未知样品的结果通过内插法自标准曲线的4参数拟合获得。
首先通过分离CD138+细胞来鉴定来自脾或淋巴结的小鼠浆细胞。通过Elispot法对这些生成IgE的浆细胞定量。对于总IgE生成细胞，以50μl/孔使用ELISA包被缓冲液以1:2稀释度将抗IgE抗体(来自BD OptEIA mIgE套装#555248)包被到MultiScreen HTS板(Millpore#MSIPS4W10)上。包被于4℃实施过夜。次日上午，在组织培养橱中使用多道移液器将板用200μl无菌PBS-Tween 20(0.05％)清洗5次。然后将板在300μl PBS/5％BSA或细胞培养基(RPMI-1640,10％FBS)中于室温封闭2小时。自脾或淋巴结制备单细胞悬浮液，并通过FACS(如上文所概述的)对细胞计数。将细胞准备好铺板，以107个细胞开始，接着3-4倍稀释(用于TNP-OVA免疫模型)，或者以4x106个细胞开始，接着2倍稀释(用于钩虫Nippostrongylus感染模型)。使用小鼠A20B细胞系作为阴性对照，并使用TIB-141细胞系作为阳性对照。细胞稀释物是在细胞培养基(RPMI-1640+10％FBS)中制备的。封闭步骤后，将板用细胞培养基清洗一次，并吸干。以100μl每孔铺细胞。然后将板于37℃、5％CO2温育过夜。次日，使用SkanWasher 300(Molecular Devices(Sunnyvale,CA))将板用PBS-Tween 20(0.05％)清洗6次。然后以制造商注明的浓度使用生物素化的二抗(来自BD OptEIA mIgE套装#555248)，通常在1:250–1:500之间，100μl/孔。所述二抗在PBS/1％BSA中配制。然后将板于室温温育1小时，然后使用SkanWasher300用PBS-Tween 20(0.05％)清洗6次。然后以1:60的稀释度添加100μl/孔链霉亲合素AP(R&D#SEL002)，同样是在PBS/1％BSA中配制的，并于室温温育1小时。然后像之前那样将板清洗3次，然后用DI水漂洗2次。在纸巾上扣掉任何剩余的液体。然后添加显色试剂即BCIP/NBT(100μl/孔)，并将板在黑暗中于室温温育30分钟。然后倒掉底物，并将板用DI水漂洗2次。将板倒转以除去任何过量的水，并让其干燥。使用解剖显微镜对点定量。
实验#07-0234F测试抗IgE/M1’阻止针对TNP-OVA初次免疫(primaryimmunization)的IgE应答的能力。抗gp120同种型对照处理的小鼠产生血清IgE，在第8天和第14天之间达到峰水平(约25ng/ml)(图15B)。抗IgE/M1’处理到第8天(98％)和第14天(99％)阻止了血清IgE的升高(图15C-15D)。此降低显著不同于同种型处理的动物，而且显著不同于未免疫的小鼠(图15C-15E)。贯穿实验的28天，抗原特异性IgG1的水平只受到抗IgE/M1’的适度影响(图15F-15I)。
实验#07-0234B测试抗IgE/M1’阻止针对TNP-OVA的再次IgE应答/记忆IgE应答的能力。针对第28天TNP-OVA加强免疫的再次IgE应答是更加快速的，在4天后达到峰值，而不是初次应答中的8-9天(图16B)。自第28天的加强免疫开始的抗IgE/M1’候选者处理缩小了第28天和第35天之间IgE的升高(图16B)。与同种型对照相比，抗IgE/M1’处理的IgE水平显著降低，到第32天降低59-75％，而到第35天降低90-93％(图16C-16D)。到第35-42天，IgE水平与未免疫小鼠没有显著差异(图16E)。第28天和第49天之间这些处理组的曲线下面积分析进一步证明了抗IgE/M1’将血清IgE水平降低了74-84％，而且还将抗原特异性IgE的平均日水平降低了74-83％(图16F-16H)。用抗IgE/M1’处理后没有观察到抗原特异性IgG1的显著降低(图16I-16K)。
实施例12：Hu-M1’转基因模型：巴西钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)感染模型
此实施例例示了抗IgE/M1’抗体阻止IgE生成(图17A-17D)，以及在先前诱导的巴西钩虫感染中治疗性降低IgE生成的能力。IgE生成的降低是通过在免疫应答的峰值IgE水平时(图18A-18I)和在免疫应答晚期应用时(图19A-19G)两个时间施用抗IgE/M1’抗体来评估的。
巴西钩虫是一种感染大鼠和小鼠的胃肠线虫。它的卵在粪便中孵化，并成熟成感染期幼虫L3。L3幼虫经皮肤进入宿主，并移动至血管，然后在1-2天后行进至肺。在肺中发育成L4期幼虫后，它们沿宿主的气管和食管行进，并在第2-3天到达空肠。幼虫成熟成成体蠕虫并交配，并在第5天前后产卵。巴西钩虫的卵随粪便一起排出宿主。
感染了巴西钩虫的小鼠展示出初始先天免疫应答，接着是强烈的2型免疫以清除感染。在感染的早期发现补体和纤连蛋白沉积以促进白细胞募集和粘附。效应细胞(诸如嗜曙红粒细胞、嗜碱性粒细胞、和CD4+Th2细胞)被募集至肺以抗击感染。Th2细胞因子、IL-4和IL-13在肺中维持免疫应答中发挥至关重要的作用，而且是肠中清除蠕虫所需要的。2型应答的特征在于高水平的抗体生成，包括IgE。
人IgE/M1’敲入小鼠(C57BL/6)产生强烈的针对巴西钩虫感染的IgE应答，在第15-20天达到峰值(图17B、18B、19B)。然后血清IgE水平下降至较低的，但是升高的维持水平。在第0天用巴西钩虫感染小鼠。用10mg/kg抗IgE/M1’mIgG1抗体或抗gp120mIgG1同种型对照处理所有3项巴西钩虫感染实验。在预防研究中(图17A)，在第0天至第21天每周三次处理huM1’敲入小鼠。在峰生成研究中(图18A)，在第11天和第21天之间每周三次处理huM1’敲入小鼠。在晚期干预研究中(图19A)，在第41天和第62天之间每周三次处理huM1’敲入小鼠。
数据表述成均值+标准偏差。使用JMP统计软件计算p值。Dunnett氏检验比较组均值，其中针对参照组检验了所有测试组。每对Student氏t使用Student氏t检验比较每个组对。然后应用Bonferroni修正来调整每对Student氏t的p值，以避免(safeguard against)成对比较。所有p值阈值为0.05。通过自每个小鼠值减去未感染或未免疫组均值，计算在预防和峰生成研究中报告的数据的百分比变化，再次计算组均值，然后对每个时间点相对于对照组计算百分比变化。在晚期干预研究中，通过将第48天和第55天与第41天进行比较来计算每个处理组内的百分比变化。
生成IgE的浆细胞是通过Elispot来定义和评估的，如实施例12先前所描述的。
预防研究测试抗IgE/M1’阻止IgE应答初次钩虫感染而升高的能力。对照(同种型处理的)小鼠到感染后第15天达到高水平的IgE生成(约3000ng/ml)。抗IgE/M1’处理的小鼠在感染后具有降低的IgE生成(与抗gp120mIgG1相比降低93-94％)，与未感染小鼠没有显著差异(图17B-17D)。
峰生成研究测试抗IgE/M1’在针对巴西钩虫感染的IgE应答的峰值时治疗性降低IgE水平的能力。所有处理组到钩虫感染后第11天达到高IgE水平(约2000ng/ml)(图18B)。抗IgE/M1’处理在此应答达到峰值时的第11天开始。抗IgE/M1’mIgG1候选者在处理的4天内将血清IgE水平降低了82-89％(图18C-18D)。到第21天，抗IgE/M1’处理小鼠中的IgE水平降低了97-98％，达到与未感染对照组没有显著差异的水平(图18E)。生成IgE的浆细胞是通过抗IgE Elispot来定量的。巴西钩虫感染诱导了肠系膜淋巴结(约30个细胞每4x106；图18F)和脾(约10个细胞每4x106；图18G)二者中显著数目的生成IgE的细胞。到第21天，抗IgE/M1’处理将肠系膜淋巴结和脾中的生成IgE的细胞分别降低了88-94％和57-66％。与未感染小鼠相比，所有处理组中肠系膜淋巴结和脾中的总浆细胞(CD138+细胞)频率均升高，而且由于抗IgE/M1’处理，这两种器官中的总浆细胞频率没有显著变化(图18H-18I)。这些结果证明了抗IgE/M1’抗体通过在体内消减IgE生成细胞而将血清IgE降低至额定水平(甚至在IgE生成达到峰水平时应用的情况中)的能力。
晚期干预研究测试抗IgE/M1’降低在感染周期晚期达到的低水平维持的IgE的能力。到第15天前后，所有处理组均达到IgE生成峰值。在第41天启动抗IgE/M1’处理后，血清IgE水平在各处理组间有一些差异(图19B-19C)，其通过参照作为100％的第41天水平进行标准化(图19D)。与抗gp120mIgG1同种型对照相比，在第48天和第55天之间，抗IgE/M1’处理显著降低血清IgE水平(图19E-19G)。到第48天和第55天，IgE水平分别降低了64-75％和75-84％，比较而言，同种型对照(抗gp120mIgGI)分别降低了20％和37％(图19F-19G)。在开始抗IgE/M1’疗法之前，各处理组间IgE水平均值的差异没有显著不同于同种型对照组(gp120)(图19E)。然而，到第48天(图19F)和第55天(图19G)，抗IgE/M1’抗体处理显示出比在对照组中所观察到的要更加突出和显著的血清IgE水平降低。通过将每个处理组的第48天或第55天与同一组在处理前即第41天的起始值比较，计算了百分比变化和p值(d41)。
实施例13：抗IgE/M1’抗体在哺乳动物细胞中的表达
此实施例例示了通过哺乳动物细胞中的重组表达来制备潜在糖基化形式的期望蛋白质或抗体。
采用载体pRK5(参见1989年3月15日公布的EP 307,247)作为表达载体。任选地，用选定的限制酶将编码抗IgE/M1’抗体轻链和/或重链的DNA连接入pRK5，以容许使用连接法(诸如Sambrook等(见上文)所记载的)插入此类DNA。
在一个实施方案中，选定的宿主细胞可以是293细胞。将人293细胞(ATCC CCL1573)在组织培养板中在诸如补充有胎牛血清和任选的营养成分和/或抗生素的DMEM的培养基中培养至汇合。将约10μg连接入pRK5的编码抗IgE/M1’抗体的DNA与约1μg编码VA RNA基因的DNA[Thimmappaya等,Cell,31:543(1982)]混和，并溶解于500μl 1mM Tris-HCl,0.1mM EDTA,0.227M CaCl2。向此混合物中逐滴添加500μl 50mM HEPES(pH 7.35),280mMNaCl,1.5mM NaPO4，并容许于25℃形成沉淀10分钟。将沉淀物重悬并添加至293细胞，并容许于37℃沉降约4小时。吸掉培养基，并添加2ml含20％甘油的PBS，达30秒钟。然后用无血清培养基清洗293细胞，添加新鲜的培养基，并将细胞温育约5天。
转染后约24小时，取出培养液，并更换成培养基(单独的)或含有200μCi/ml 35S-半胱氨酸和200μCi/ml 35S-甲硫氨酸的培养基。温育12小时后，收集条件培养基，在离心滤器上浓缩，并加载到15％SDS凝胶上。可以将处理后的凝胶干燥，并对胶片曝光选定的一段时间以揭示抗IgE/M1’抗体的存在。可以对含有经转染细胞的培养物进行进一步温育(在无血清培养基中)，并在选定的生物测定法中测试培养液。
在另一种技术中，使用Somparyrac等,Proc.Natl.Acad.Sci.,12:7575(1981)记载的硫酸葡聚糖法，可以将抗IgE/M1’抗体瞬时导入293细胞。将293细胞在旋转烧瓶中培养至最大密度，并添加700μg连接入pRK5的编码抗IgE/M1’抗体的DNA。首先通过离心自旋转烧瓶浓缩细胞，并用PBS清洗。将DNA-葡聚糖沉淀物在细胞沉淀物上温育4小时。将细胞用20％甘油处理90秒钟，用组织培养基清洗，并重新装入装有组织培养基、5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛运铁蛋白的旋转烧瓶。约4天后，将条件培养基离心并过滤以除去细胞和碎片。然后通过任何选定的方法，诸如透析和/或柱层析，可以浓缩和纯化含有所表达的抗IgE/M1’抗体的样品。
在另一个实施方案中，可以在CHO细胞中表达抗IgE/M1’抗体。使用已知的试剂，诸如CaPO4或DEAE-葡聚糖，可以将连接入pRK5的编码抗IgE/M1’抗体的DNA转染入CHO细胞。如上文所描述的，可以将细胞培养物温育，并用培养基(单独的)或含有放射性标记物诸如35S-甲硫氨酸的培养基更换所述培养基。在测定到抗IgE/M1’抗体的存在后，可以用无血清培养基更换所述培养基。优选地，将培养物温育约6天，然后收获条件培养基。然后通过任何选定的方法，可以浓缩和纯化含有所表达的抗IgE/M1’抗体的培养液。
抗IgE/M1’抗体的带表位标签的变体也可以在宿主CHO细胞中表达。可以将连接入pRK5的编码抗IgE/M1’抗体的DNA亚克隆出pRK5载体。可以对亚克隆插入物进行PCR，以符合读码框的方式与选定的表位标签诸如聚His标签一起融合入杆状病毒表达载体。然后可以将带聚His标签的编码抗IgE/M1’抗体插入物的DNA亚克隆入含有用于选择稳定克隆的选择标志诸如DHFR的SV40驱动载体。最后，可以用SV40驱动载体转染CHO细胞(如上文所描述的)。可以如上所述实施标记，以检验表达。然后通过任何选定的方法，诸如通过Ni2+-螯合物亲和层析，可以浓缩和纯化含有所表达的带聚His标签的抗IgE/M1’抗体的培养液。
抗IgE/M1’抗体也可以通过瞬时表达规程在CHO和/或COS细胞中表达或通过另一种稳定表达规程在CHO细胞中表达。
使用如下规程实施CHO细胞中的稳定表达。将蛋白质表达成IgG构建体(免疫粘附素)(其中将相应蛋白质的可溶形式(例如胞外结构域)的编码序列融合至含有铰链、CH2和CH2结构域的IgG1恒定区序列)和/或是带聚His标签的形式。
PCR扩增后，使用标准技术，如Ausubel等,Current Protocols of MolecularBiology,单元3.16,John Wiley和Sons(1997)中所记载的，将相应的DNA亚克隆到CHO表达载体中。CHO表达载体构建成在目的DNA的5’和3’具有相容限制性位点，以容许cDNA的方便穿梭。用于在CHO细胞中表达的载体如Lucas等,Nucl.Acids Res.24:9(1774-1779(1996)中所记载的，而且利用SV40早期启动子/增强子来驱动目的cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达容许在转染后选择稳定维持的质粒。
使用商品化的转染试剂(Quiagen)、或(Boehringer Mannheim)，将12μg期望质粒DNA导入约1x107个CHO细胞。如Lucas等(见上文)所记载的那样培养细胞。在安瓿中冷冻约3x 107个细胞，供培养和生产用，如下文所描述的。
将装有质粒DNA的安瓿通过放置在水浴中来融化，并通过旋涡震动来混匀。将内容物转移入装有10mL培养基的离心管，并以1000rpm离心5分钟。吸掉上清液，并将细胞重悬于10mL选择培养基(0.2μm过滤的PS20，含5％0.2μm渗滤的胎牛血清)。然后将细胞等分入装有90mL选择培养基的100mL旋转烧瓶。1-2天后，将细胞转移入装有150mL选择培养基的250mL旋转烧瓶，并于37℃温育。又过了2-3天后，以3x 105个细胞/mL接种250mL、500mL和2000mL旋转烧瓶。通过离心和重悬，将细胞培养基更换成生产培养基的新鲜培养基。虽然可以采用任何合适的CHO培养基，但是实际上可使用1992年6月16日公告的美国专利No.5,122,469中记载的生产培养基。以1.2x 106个细胞/mL接种3L生产旋转烧瓶。第0天，测定细胞数和pH。第1天，对旋转烧瓶采样，并开始用经过过滤的空气鼓泡。第2天，对旋转烧瓶采样，将温度改成33℃，并添加30mL 500g/L葡萄糖和0.6mL 10％消泡剂(例如35％聚二甲基硅氧烷乳液，Dow Corning 365医用级乳液)。在整个生产过程中，根据需要调节pH以保持在7.2左右。10天后，或直至生存力下降至70％以下，通过离心来收获细胞培养物，并经由0.22μm滤器过滤。滤出液或是保存于4℃或是立即加载到柱上纯化。
对于带聚His标签的构建体，使用Ni-NTA柱(Qiagen)来纯化蛋白质。纯化前，将咪唑添加至条件培养基至5mM的浓度。以4-5ml/min的流速将条件培养基泵到6ml Ni-NTA柱上，该柱于4℃在含有0.3M NaCl和5mM咪唑的20mM Hepes,pH 7.4缓冲液中平衡过。加载后，用另外的平衡缓冲液清洗柱，并用含有0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白质。随后用25mlG25Superfine(Pharmacia)柱将高度纯化的蛋白质脱盐入含有10mM Hepes,0.14M NaCl和4％甘露醇,pH 6.8的贮存缓冲液，并储存于-80℃。
如下所述自条件培养基纯化免疫粘附素(含Fc的)构建体。将条件培养基泵到5ml蛋白A柱(Pharmacia)上，该柱已经在20mM磷酸钠缓冲液pH6.8中平衡过。加载后，将柱用平衡缓冲液大量清洗，之后用100mM柠檬酸pH3.5洗脱。通过将1ml级分收集到装有275μL 1MTris缓冲液pH9的管中，立即中和洗脱的蛋白质。如上文关于带聚His标签的蛋白质所描述的，随后将高度纯化的蛋白质脱盐到贮存缓冲液中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶和通过N端氨基酸测序(通过Edman降解)来评估同质性(homogeneity)。
材料保藏
以下材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,10801University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209,USA)(ATCC)：
这些保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(BudapestTreaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起保存保藏的存活培养物三十(30)年，和最近一次要求样品后至少五(5)年。保藏物可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech公司与ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申请向公众公开后，以两者中居先者为准，公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代，而且保证了依据35 USC§122及依照它的管理章程(包括37 CFR§1.14，特别要提及886 OG 638)由美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得保藏培养物的后代。
本申请的受让人已同意，若保藏材料的培养物在合适条件下培养时死亡、丢失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一培养物的另一份材料更换。所保藏材料的可获得性并不解释为对违反任何政府机构依据其专利法所授予的权利实施本发明的许可。
认为前述书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明并不限于本文所呈现实施例的范围。实际上，根据上面的描述，在本文所显示和描述之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。

Claims (51)

1.抗IgE/M1’抗体在制备用于特异性消减生成IgE的B细胞的药物中的用途，其中所述消减包括给哺乳动物施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，该抗体特异性结合IgE的M1’区段，该区段由SEQ ID NO:1的残基317至351限定。
2.权利要求1的用途，其中所述抗体在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。
3.权利要求1的用途，其中所述抗体包含选自下组的抗体的重链和轻链HVR：26A11，26A11 v1-16，7A6，7A6v1，47H4和47H4v1-6。
4.权利要求3的用途，其中所述抗体包含47H4v1-6的重链和轻链HVR。
5.权利要求4的用途，其中所述抗体包含47H4v5的重链和轻链HVR。
6.权利要求5的用途，其中所述抗体是无岩藻糖基化的。
7.权利要求1的用途，其中所述抗体包含选自下组的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区：26A11，26A11 v1-16，7A6，7A6v1，47H4，47H4v1-6。
8.权利要求7的用途，其中所述抗体选自下组：47H4v1，47H4v2，47H4v3，47H4v4，47H4v5和47H4v6。
9.权利要求7的用途，其中所述抗体为47H4v5。
10.权利要求1-9任一项的用途，其中所述消减还包括总血清IgE的降低。
11.权利要求10的用途，其中所述IgE是变应原特异的。
12.权利要求1-9任一项的用途，其中所述抗体具有ADCC活性。
13.抗IgE/M1’抗体在制备用于治疗IgE介导的病症的药物中的用途，其中所述治疗包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，该抗体特异性结合IgE的M1’区段，该区段由SEQ IDNO:1的残基317至351限定。
14.权利要求13的用途，其中所述抗体在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。
15.权利要求13的用途，其中所述抗体特异性消减生成IgE的B细胞。
16.权利要求13的用途，其中所述抗体降低总血清IgE。
17.权利要求13的用途，其中所述IgE是变应原特异的。
18.权利要求13的用途，其中所述抗体具有ADCC活性。
19.权利要求13的用途，其中所述抗体是无岩藻糖基化的。
20.下述抗体在制备用于治疗IgE介导的病症的药物中的用途，其中所述治疗包括施用治疗有效量的下述抗体，该抗体包含选自下组的抗体的重链和轻链HVR：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4和47H4v1-6。
21.权利要求20的用途，其中所述抗体选自下组：47H4 v1-6。
22.权利要求21的用途，其中所述抗体为47H4v5。
23.权利要求20的用途，其中所述治疗还包括总血清IgE的降低。
24.权利要求20的用途，其中所述IgE是变应原特异的。
25.权利要求20的用途，其中所述抗体具有ADCC活性。
26.权利要求20的用途，其中所述抗体是无岩藻糖基化的。
27.下述抗体在制备用于治疗IgE介导的病症的药物中的用途，其中所述治疗包括施用治疗有效量的下述抗体，该抗体包含选自下组的抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区：26A11，26A11v1-16，7A6，7A6v1，47H4和47H4v1-6。
28.权利要求27的用途，其中所述抗体选自下组：47H4v1-6。
29.权利要求28的用途，其中所述抗体为47H4v5。
30.权利要求27的用途，其中所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:41，且所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:31。
31.权利要求27的用途，其中所述治疗还包括总血清IgE的降低。
32.权利要求27的用途，其中所述IgE是变应原特异的。
33.权利要求27的用途，其中所述抗体具有ADCC活性。
34.权利要求27的用途，其中所述抗体是无岩藻糖基化的。
35.权利要求27的用途，其中所述IgE介导的病症为过敏反应。
36.权利要求27的用途，其中所述IgE介导的病症选自下组：变应性鼻炎，变应性哮喘，非变应性哮喘，特应性皮炎，变应性胃肠病，荨麻疹，食物过敏，变应性支气管肺曲霉病，寄生虫病，间质性膀胱炎，高IgE综合征，共济失调性毛细血管扩张症，威斯科特-奥尔德里奇综合征，无胸腺淋巴组织增生，IgE骨髓瘤，移植物抗宿主反应和变应性紫癜。
37.权利要求35或36的用途，其中所述抗体与施用治疗有效量的至少一种选自下组的药物组合施用：抗IgE抗体，抗组胺剂，支气管扩张药，糖皮质激素，NSAID，解充血药，镇咳剂，镇痛药，TNF拮抗剂，整联蛋白拮抗剂，免疫抑制剂，IL-4拮抗剂，IL-13拮抗剂，双重IL-4/IL-13拮抗剂，DMARD，与B细胞表面标志物结合的抗体和BAFF拮抗剂。
38.权利要求37的用途，其中所述药物与所述抗体组合，在其之前，与其同时施用。
39.权利要求35或36的用途，其中所述抗体与变应原脱敏的治疗方案组合施用。
40.抗IgE/M1’抗体在制备用于预防变应原诱导的IgE生成的药物中的用途，其中所述预防包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，该抗体特异性结合IgE的M1’区段，该区段由SEQ ID NO:1的残基317至351限定。
41.权利要求40的用途，其中所述抗体在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。
42.权利要求40的用途，其中所述预防还包括总血清IgE的降低。
43.权利要求42的用途，其中所述IgE是变应原特异的。
44.权利要求40的用途，其中所述抗体具有ADCC活性。
45.权利要求40的用途，其中所述抗体是无岩藻糖基化的。
46.抗IgE/M1’抗体在制备用于降低变应原诱导的IgE生成的药物中的用途，其中所述降低包括施用治疗有效量的抗IgE/M1’抗体，该抗体特异性结合IgE的M1’区段，该区段由SEQ ID NO:1的残基317至351限定。
47.权利要求46的用途，其中所述抗体在表达IgE的B细胞中诱导凋亡。
48.权利要求46的用途，其中所述降低还包括总血清IgE的降低。
49.权利要求48的用途，其中所述IgE是变应原特异的。
50.权利要求46的用途，其中所述抗体具有ADCC活性。
51.权利要求46的用途，其中所述抗体是无岩藻糖基化的。
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