TWI464178B - 細胞凋亡抗-ｉｇｅ抗體 - Google Patents

細胞凋亡抗-ｉｇｅ抗體 Download PDF

Info

Publication number
TWI464178B
TWI464178B TW097110305A TW97110305A TWI464178B TW I464178 B TWI464178 B TW I464178B TW 097110305 A TW097110305 A TW 097110305A TW 97110305 A TW97110305 A TW 97110305A TW I464178 B TWI464178 B TW I464178B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
ige
seq
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
TW097110305A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200848432A (en
Inventor
Lawren Wu
Mercedesz Balazs
Hans Brightbill
Andrew Chan
Yvonne Chen
Anan Chuntharapai
Mark Dennis
Terence Wong
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39709011&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI464178(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of TW200848432A publication Critical patent/TW200848432A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI464178B publication Critical patent/TWI464178B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

細胞凋亡抗－IGE抗體
本發明係關於細胞凋亡抗IgE抗體、編碼其之核酸、其治療組合物及其用於治療IgE介導之病症之用途。
過敏症係指對環境抗原之免疫反應引起組織炎症及器官功能異常之某些疾病。各過敏性疾病之臨床特徵反映在所涉及之器官或組織中免疫誘發之炎性反應。此等特徵一般與抗原之化學或物理特性無關。過敏性反應之多樣性係由涉及不同免疫效應路徑(各自產生獨特炎症模式)而產生。
過敏症在全世界較為常見。然而，特定疾病之偏好在不同年齡群、性別及種族之間不同。對特定過敏原之敏感性之流行率係由遺傳偏好及造成曝露於過敏原之地理及文化因素確定。過敏症之臨床病況僅影響一些遭遇各過敏原之個體。曝露於過敏原後過敏性疾病之發生不僅需要預先"敏化"，亦需要決定反應至特定器官之定位的其他因素。
在過敏原曝露後之過敏疾病前之生物過程誘發稱作"敏化"或敏化期之免疫反應。敏化發生後，個體不表現症狀直至隨後曝露於過敏原。敏化效應亦稱為免疫記憶。
誘發炎症之初始路徑中之一者係經由免疫球蛋白E(IgE)。IgE藉助於其作為肥大細胞及嗜鹼性細胞表面上之過敏原受體之作用而於過敏症中起重要作用。IgE抗體係於分子之Fc部分處固定於肥大細胞及嗜鹼性細胞表面之高親和力細胞表面受體，稱作FcεRI。過敏反應在多價過敏 原分子與佔據此等受體之抗體結合時啟始。該結果為FcεRI之橋接，其轉而以細胞內方式信號轉導引起釋放及活化炎症介體：組織胺、白三烯素、趨化因子、血小板活化因子及蛋白酶。此等活化介體局部起作用且引起增加之血管通透性、血管擴張、平滑肌收縮及黏液腺分泌。該等事件在臨床上稱為即刻或早期，且發生在過敏原曝露後最先15－30分鐘內。在後續之12小時中，存在回應於其他不完全瞭解之化學介體之進行性炎症細胞組織滲入，自嗜中性白血球至嗜伊紅細胞至單核細胞。將在過敏原曝露後6－12小時之此時間段表示為晚期且其特徵為細胞炎症之臨床顯現。假定在不存在早期反應下發生晚期反應(尤其在肺中)，仍不完全理解晚期反應是否必需為IgE所介導。
IgE係以膜結合形式及分泌形式存在。此等不同形式似乎為剪接變異體。先前方法藉由下調主要靶向分泌形式之IgE(例如XOLAIR奧馬佐單抗(omalizumab))達成治療效應，以防止或消除免疫系統進一步"戒備"。分泌形式之IgE為較短形式，基本上Fc區終止於CH4域(圖1)，而較長形式包括額外C端殘基，該等C端殘基包括由稱作M1/M1'及M2之外顯子編碼之肽。儘管有人已報導具有及不具有稱作M1'之52胺基酸區段之兩種不同形式的膜結合IgE[Batista等人，J.Exp.Med. 184 ：2197－2205(1996)]，但申請者不能夠驗證某一膜結合形式缺少此M1'區段。使用與分泌形式之IgE結合之抗IgE抗體的習知療法致使游離血清而非總血清IgE減少。Casale等人，J.Allergy Clin. Immunol. 100(1)：110－121(1997)。
另外已注意到在不存在抗原信號下，交聯之B細胞受體(亦即免疫球蛋白)易於細胞凋亡。令人驚奇地是，申請者已發現以抗IgE抗體靶向IgE之M1'區段可引起B細胞凋亡之誘發。由於活化B細胞之子代可產生製造且分泌該分泌形式之IgE之漿細胞，故經由細胞凋亡消耗產生IgE之B細胞提供治療過敏之新穎治療方法。
本發明提供細胞凋亡抗IgE抗體或其功能片段，及其用於治療IgE介導之病症之用途。本發明另外提供抑制自B細胞產生及分泌IgE之組合物及方法。本發明另外提供特異性消耗產生IgE之B細胞且降低總血清IgE之組合物及方法。
在一實施例中，本發明提供與IgE之M1'區段特異性結合且誘發表現IgE之B細胞中細胞凋亡的抗IgE/M1'抗體。在一特定態樣中，抗體特異性消耗產生IgE之B細胞。在另一特定態樣中，抗體減少總血清IgE。在另一特定態樣中抗體減少總血清及游離血清IgE。在另一特定態樣中，血清IgE具過敏原特異性。在另一特定態樣中，抗體與人類、恆河猴及獼猴來源之IgE結合。在另一特定態樣中，抗體為嵌合抗體。在另一特定態樣中，抗體為人類化抗體。在另一態樣中，抗體為人類抗體。
在另一實施例中，本發明提供與對應於圖5中所識別之肽之M1'抗原決定基中任一者特異性結合的抗IgE/M1'抗 體。在一特定態樣中，抗體特異性結合與選自由47H4、7A6、26A11、47H4v5、7A6v1及26A11v6組成之群之抗體所結合的抗原決定基相同之抗原決定基。在另一特定態樣中，抗體與對應於選自由下列肽組成之群之肽的抗原決定基結合：肽4(SEQ ID NO：8)、肽5(SEQ ID NO：9)、肽7(SEQ ID NO：11)或肽8(SEQ ID NO：12)。在另一特定態樣中，抗體與服4(SEQ ID NO：8)結合。
在另一實施例中，本發明提供選自由肽4(SEQ ID NO：8)、肽5(SEQ ID NO：9)、肽7(SEQ ID NO：11)或肽8(SEQ ID NO：12)組成之群的IgE之M1'抗原決定基。在一特定態樣中，M1'肽為肽4(SEQ ID NO：8)。
在另一實施例中，本發明提供與IgE之M1'區段特異性結合之抗IgE抗體，其與人類IgE之斯卡查德結合親和力(Scatchard binding affinity)等於鼠類抗IgE/M1'抗體47H4或其人類化變異體之結合親和力。在一特定態樣中，親和力等於47H4之結合親和力。在另一特定態樣中，親和力在0.30與0.83nm之間。在另一特定態樣中，親和力等於47H4v5之結合親和力。在另一特定態樣中，親和力為約1.5nm。
在另一實施例中，本發明提供包含圖6A-6F之任一者中所呈現之抗體之重鏈及輕鏈HVR的抗IgE/M1'抗體。在一特定態樣中，抗體另外包含圖6A-6F之任一者中所呈現之抗體序列之重鏈及輕鏈可變區。在另一特定態樣中，抗體包含圖6A-6F之任一者中所呈現之抗體 之全長重鏈及輕鏈。在另一特定態樣中，抗體序列之重鏈及輕鏈於圖6A－6F之任一者中呈現。在另一特定態樣中，抗體係選自由26A11、26A11 v1－16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1－6組成之群。在另一特定態樣中，抗體為47H4v5。在另一特定態樣中，抗體經去海藻糖基化。
在另一實施例中，本發明提供包含抗IgE/M1'抗體(包含圖6A－6F之任一者中所呈現之抗體重鏈及輕鏈HVR)以及至少一種醫藥學上可接受之載劑之組合物。在一特定態樣中，抗體係選自由26A11、26A11 v1－16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1－6組成之群。在另一特定態樣中，抗體為47H4v5。在另一特定態樣中，抗體經去海藻糖基化。
在另一實施例中，本發明提供包含抗IgE/M1'抗體(包含圖8－13之任一者中呈現之抗體之重鏈及輕鏈HVR)以及一或多種選自由下列藥物組成之群之藥物的組合物：抗IgE抗體、抗組織胺劑、支氣管擴張劑、糖皮質激素、NSAID、TNF－拮抗劑、整合素拮抗劑、免疫抑制劑、IL－4拮抗劑、IL－13拮抗劑、雙重IL－4/IL－13拮抗劑、DMARD、與B細胞表面標記結合之抗體及BAFF拮抗劑。在一特定態樣中，組合物另外包含至少一種醫藥學上可接受之載劑。
在另一實施例中，本發明提供編碼於圖6A－6F之任一者中呈現之抗IgE/M1'抗體重鏈HVR的經分離核酸。在一特定態樣中，經分離核酸另外包含編碼於圖6A－6F之任一者中呈現之抗體的輕鏈HVR之核酸。在另一特定態樣中，抗體為嵌合抗體。在另一特定態樣中，抗體為人類化抗體。 在另一態樣中，抗體為人類抗體。在另一特定態樣中，抗體係選自由26A11、26A11 v1－16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1－6組成之群。在另一特定態樣中，抗體為47H4v5。在另一特定態樣中，抗體經去海藻糖基化。在另一態樣中，核酸另外包含適於表現核酸之載體。在另一特定態樣中，載體另外包含適於表現核酸之宿主細胞。在另一特定態樣中，宿主細胞為真核細胞或原核細胞。在另一特定態樣中，真核細胞為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)。
在另一實施例中，本發明提供製造與IgE之M1'區段特異性結合之抗IgE/M1'抗體或其功能片段的方法，其包含在適於產生該抗體或片段之條件下以適於表現之形式培養含有編碼該抗體或片段之核酸的宿主細胞及回收抗體或片段。
在另一實施例中，本發明提供包含封閉本文中所揭示之組合物之容器及說明治療IgE介導之病症之用途的包裝插頁之製造物品。在一特定態樣中，製造物品為小瓶。在另一特定態樣中，製造物品為預填充注射器。在另一特定態樣中，預填充注射器另外含於注射裝置內。在另一特定態樣中，注射裝置為自動注射器。
在另一實施例中，本發明提供特異性消耗產生IgE之B細胞之方法，其包含投與治療有效量之與IgE之M1'區段特異性結合且誘發表現IgE之B細胞中之細胞凋亡的抗IgE/M1'抗體。在一特定態樣中，抗體包含圖6A－6F之任一者中所 呈現之抗體之重鏈及輕鏈HVR。在另一特定態樣中，該方法減少總血清IgE。在另一特定態樣中，該方法減少游離血清及總血清IgE。在另一特定態樣中，血清IgE具過敏原特異性。在另一特定態樣中，抗體係選自由26A11、26A11 v1－16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1－6組成之群。在另一特定態樣中，抗體為47H4v5。在另一特定態樣中，抗體具有ADCC活性。
在另一實施例中，本發明提供治療IgE介導之病症之方法，其包含投與治療有效量之與IgE之M1'區段特異性結合且誘發表現IgE之B細胞中細胞凋亡的抗IgE/M1'抗體。在一特定態樣中，抗體特異性消耗產生IgE之B細胞。在另一特定態樣中，抗體減少總血清IgE。在另一特定態樣中，抗體減少總IgE及游離IgE。在另一特定態樣中，血清IgE具過敏原特異性。在另一特定態樣中，抗體包含圖6A－6F之任一者中所呈現之抗體之重鏈及輕鏈HVR。在另一特定態樣中，抗體係選自由26A11、26A11 v1－16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1－6組成之群。在另一特定態樣中，抗體為47H4v5。在另一特定態樣中，抗體具有ADCC活性。在另一特定態樣中，IgE介導之病症係選自由下列病症組成之群：過敏性鼻炎、哮喘(例如過敏性哮喘及非過敏性哮喘)、異位性皮膚炎、過敏性胃腸病、超敏(例如過敏反應、蕁麻疹、食物過敏等)、過敏性支氣管肺麴菌病、寄生蟲疾病、間質性膀胱炎、高IgE症候群、共濟失調毛細血管擴張、維－奧二氏症候群(Wiskott－Aldrich syndrome)、無胸腺淋巴增殖、IgE骨髓瘤及移植物抗宿主反應。在另一特定態樣中，IgE介導之病症為食物過敏、過敏反應、接觸性皮炎及過敏性紫癜。
在另一實施例中，本發明提供治療IgE介導之病症之方法，其包含投與包含治療有效量之與IgE之M1'區段特異性結合且誘發表現IgE之B細胞中之細胞凋亡之抗IgE/M1'抗體以及治療有效量之至少一種選自由下列藥物組成之群之藥物的組合物：抗IgE抗體、抗組織胺劑、支氣管擴張劑、糖皮質激素、NSAID、解充血劑、止咳劑、止痛劑、TNF－拮抗劑、整合素拮抗劑、免疫抑制劑、IL－4拮抗劑、IL－13拮抗劑、雙重IL－4/IL－13拮抗劑、DMARD、與B細胞表面標記結合之抗體及BAFF拮抗劑。在一特定態樣中，抗體特異性消耗產生IgE之B細胞。在另一特定態樣中，抗體減少總血清IgE。在另一特定態樣中，抗體減少總IgE及游離IgE。在另一特定態樣中，血清IgE具過敏原特異性。在另一特定態樣中，抗體包含圖6A－6F之任一者中所呈現之抗體之重鏈及輕鏈HVR。在另一特定態樣中，抗體係選自由26A11、26A11 v1－16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1－6組成之群。在另一特定態樣中，抗體為47H4v5。在另一特定態樣中，抗體具有ADCC活性。
在另一實施例中，本發明提供治療IgE介導之病症之方法，其包含在施以治療過敏病症之已知方法之前、同時或之後投與治療有效量之與IgE之M1'區段特異性結合且誘發表現IgE之B細胞中之細胞凋亡的抗IgE/M1'抗體之組合治 療方案。在一特定態樣中，該組合包含投與抗IgE抗體、抗組織胺劑、支氣管擴張劑、糖皮質激素、非類固醇消炎藥、免疫抑制劑、IL－4拮抗劑、IL－13拮抗劑、雙重IL－4/IL－13拮抗劑、解充血劑、止咳劑或止痛劑。在另一特定態樣中，與過敏原脫敏治療方案組合投與抗IgE/M1'抗體。在一特定態樣中，抗體特異性消耗產生IgE之B細胞。在另一特定態樣中，抗體減少總血清IgE。在另一特定態樣中，抗體減少總IgE及游離IgE。在另一特定態樣中，血清IgE具過敏原特異性。在另一特定態樣中，抗體包含圖6A－6F之任一者中所呈現之抗體之重鏈及輕鏈HVR。在另一特定態樣中，抗體係選自由26A11、26A11 v1－16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1－6組成之群。在另一特定態樣中，抗體為47H4v5。在另一特定態樣中，抗體具有ADCC活性。
在另一實施例中，本發明提供防止過敏原誘發產生IgE之方法，其包含投與治療有效量之與IgE之M1'區段特異性結合且誘發表現IgE之B細胞中之細胞凋亡的抗IgE/M1'抗體。在一特定態樣中，該抗體包含圖6A－6F之任一者中所呈現之抗體之重鏈及輕鏈HVR。在另一特定態樣中，該方法特異性消耗產生IgE之B細胞。在另一特定態樣中，該方法減少總血清IgE。在另一特定態樣中，該方法減少游離血清及總血清IgE。在另一特定態樣中，血清IgE具過敏原特異性。在另一特定態樣中，抗體係選自由26A11、26A11 v1－16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1－6組成之群。 在另一特定態樣中，抗體為47H4v5。在另一特定態樣中，抗體具有ADCC活性。
在另一實施例中，本發明提供降低過敏原誘發產生IgE之方法，其包含投與治療有效量之與IgE之M1'區段特異性結合且誘發表現IgE之B細胞中之細胞凋亡的抗IgE/M1'抗體。在一特定態樣中，該抗體包含圖6A－6F之任一者中所呈現之抗體之重鏈及輕鏈HVR。在另一特定態樣中，該方法特異性消耗產生IgE之B細胞。在另一特定態樣中，該方法減少總血清IgE。在另一特定態樣中，該方法減少游離血清及總血清IgE。在另一特定態樣中，血清IgE具過敏原特異性。在另一特定態樣中，抗體係選自由26A11、26A11 v1－16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1－6組成之群。在另一特定態樣中，抗體為47H4v5。在另一特定態樣中，抗體具有ADCC活性。
在另一實施例中，本發明提供適用於先前所述方法中之任一者的組合物。
在另一實施例中，本發明提供組合物用於先前所述方法中之任一者中的用途。
在另一實施例中，本發明提供2007年3月21日寄存於ATCC之鼠類融合瘤，其名稱係選自由7A6.18、1C11.10.20、47G4.6.2、47H4.12.10、42H4.6.9、42A5.20.11、26A11.6.5、51D2.22.15、45C1.6.14、26B11.3.12、28E9.12.9組成之群。在一特定態樣中，本發明提供由寄存之融合瘤分泌之抗體。
在另一實施例中，本發明提供表現人類IgE之M1'區段之轉殖基因動物。
本文所提及之所有參考文獻係特別以引用的方式併入。
通用技術
除非另有所述，否則本發明之實踐將採用此項技術內之習知分子生物學技術(包括重組技術)、微生物學技術、細胞生物學技術、生物化學技術及免疫學技術。該等技術係於諸如以下之文獻中加以充分解釋：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版 (Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait編，1984)；Animal Cell Culture (R.I.Freshney編，1987)；Methods in Enzymology (Academic Press,Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel等人編，1987及定期更新材料)；PCR：The Polymerase Chain Reaction ,(Mullis等人編，1994)；A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V.,1988)；Phage Display：A Laboratory Manual (Barbas等人，2001)。
淋巴細胞發育及活化
人體內兩種主要類型之淋巴細胞為T(源自胸腺)及B(源自骨髓)。此等細胞係源自骨髓及胎兒肝臟中致力於淋巴發育路徑之造血幹細胞。此等幹細胞之子代按照不同路徑發育成熟為B或T淋巴細胞。人類B淋巴細胞發育完全發生於骨髓內。另一方面，T細胞自未成熟前驅體發育，該等 未成熟前驅體離開骨髓且經由血流行進至胸腺中，在胸腺中該等前驅體增殖且分化為成熟T淋巴細胞。
自胸腺或骨髓產生之成熟淋巴細胞係呈靜止或"停滯"狀態，亦即其無有絲分裂活性。當分散於血流中時，此等"原生"或"原始"淋巴細胞行進至各種次級或外周淋巴器官中，諸如脾、淋巴結或扁桃體。多數原始淋巴細胞具有天生較短之壽命且在離開骨髓或胸腺後不到幾天便死亡。然而，若該細胞接收指示抗原存在之信號，則其可活化且經受連續輪數之細胞分裂。接著所得子代細胞中有一些恢復至停滯狀態以變為基本上對下一次遇見刺激性過敏原敏感之記憶淋巴細胞B及T細胞。活化原始淋巴細胞之其他子代為效應細胞，其僅存活幾天，但執行特異性防禦行為。
淋巴細胞活化係指停滯淋巴細胞在其被刺激以分裂且產生子代(其中有一些變為效應細胞)時所經歷之一系列有序事件。完全反應包括細胞增殖之誘發(致有絲分裂)及免疫功能之表現。當特異性配位體與受體在其表面上結合時，淋巴細胞變為經活化的。T細胞及B細胞之配位體不同，但所得胞內生理機制類似。
外來抗原自身可誘發淋巴細胞活化，尤其使B細胞上之表面免疫球蛋白或T細胞上之其他醣蛋白交聯之較大聚合抗原。然而，多數抗原並非聚合的且即便在以大量與B細胞直接結合時仍不能引起活化。B細胞係在其與接近活化之輔助T淋巴細胞協同刺激時由此等更常見之抗原活化。該刺激可由T細胞所分泌之淋巴激素產生，但最有效地藉 由B細胞與T細胞表面蛋白直接接觸來傳遞，該等T細胞表面蛋白與某些B細胞表面受體相互作用以產生二次信號。
B細胞
B細胞之定義特徵為合成免疫球蛋白之能力。免疫球蛋白(Ig)為由稱作重鏈及輕鏈之相關類型多肽構成之極不同的蛋白家族。各Ig以高親和力與其自身特異性抗原特異性結合。成熟B細胞可表現兩種不同形式之免疫球蛋白，其各自用於獨特功能。在停滯B淋巴細胞(原始或記憶)中，免疫球蛋白僅於細胞表面上表現，在細胞表面上其基本上用作特異性抗原之膜結合受體。相比較而言，B細胞效應細胞(漿細胞)分泌免疫球蛋白至周圍。該分泌免疫球蛋白保持辨識及結合之能力(相對於停滯B細胞上之膜結合形式)，且通常稱作抗體。
當活化B淋巴細胞分裂時，其子代中有一些變為記憶B細胞，而其餘分化為漿細胞。由於漿細胞具有相對較短之壽命，故除非產生新漿細胞，否則該群體不久便消失且不再分泌免疫球蛋白。因此，B細胞之活化通常產生瞬間增殖波，隨後產生抗體分泌之叢發，其歷經若干天或數週增加且接著減退。B細胞為涉及於體液免疫或經由組織液介導之保護效應中之主要細胞類型。由於本發明之抗IgE/M1'抗體實際上消耗B細胞(包括記憶B細胞)，故其可用以"重置"記憶。因此，此效應可為促成個體內過敏性反應之B細胞要素可為衰減(若非消除)。
T細胞
T淋巴細胞不表現免疫球蛋白，但替代地藉助於稱作T細胞受體之表面蛋白偵測外來物質之存在。此等受體藉由直接接觸其他免疫細胞或經由影響其他免疫細胞之活性來辨識抗原。T細胞以及巨噬細胞為涉及於細胞介導之免疫中之主要細胞類型。
不同於B細胞，T細胞僅可於特定情形下偵測外來物質。詳言之，T淋巴細胞僅在其首先裂解為小肽，接著將小肽呈現於稱作抗原呈現細胞(APC)之第二宿主細胞表面上的條件下辨識外來蛋白。許多類型之宿主細胞可在一些條件下呈現抗原，但某些類型更特別適合於此目的且在控制T細胞活性中特別重要且包括巨噬細胞及其他B細胞。抗原呈現部分地視所呈現細胞表面上稱作主要組織相容性複合體(MHC)蛋白之特異性蛋白而定。因此，為刺激細胞介導之免疫，必須將外來肽呈現給與MHC肽組合之T細胞，且此組合必須由T細胞受體所辨識。
存在兩種重要的T細胞子集：細胞毒性T淋巴細胞(Tc 細胞或CTL)及輔助T細胞(TH )細胞，其可大致基於標記CD8及CD4之細胞表面表現而被識別。Tc 細胞在病毒防禦中較重要且可直接藉由辨識某些細胞表面表現之病毒肽而殺死病毒。TH 細胞促進其他細胞類型之增殖、成熟及免疫功能，例如淋巴激素分泌以控制B細胞、巨噬細胞及細胞毒性T細胞之活性。原始及記憶T淋巴細胞皆通常保持於停滯狀態，且呈此狀態時其不展現顯著輔助或細胞毒性活性。在經活化時，此等細胞經受數輪有絲分裂以產生子代細 胞。此等子代細胞中有一些恢復至停滯狀態作為記憶細胞，但其他子代細胞變為主動表現細胞毒性活性之輔助物之效應細胞。此等子代細胞類似其親本細胞：CD4＋細胞僅可產生CD4＋子代，而CD8＋細胞僅產生CD8＋子代。效因T細胞表現不於停滯T細胞上表現之細胞表面標記，諸如CD25、CD28、CD29、CD40L、運鐵蛋白受體及II類MHC蛋白。當撤回活化刺激時，隨著效應細胞死亡或恢復停滯狀態，細胞毒性或輔助活性在若干天之時段內逐漸減退。
類似於B細胞活化，T淋巴細胞對多數抗原之反應亦需要兩種類型之同時刺激。第一種為若適當由MHC蛋白呈現於抗原呈現細胞上之抗原可為T細胞受體所辨識且結合。儘管此抗原－MHC複合物確實將信號傳送至細胞內部，但其通常不足以引起T細胞活化。諸如使用輔助T細胞發生之完全活化需要與在抗原呈現細胞表面上表現之稱作協同刺激物之其他特異性配位體協同刺激。另一方面，細胞毒性T細胞之活化一般需要IL－2，一種由活化輔助T細胞分泌之細胞激素。
免疫反應
哺乳動物免疫系統區別於其他身體防禦之三個主要功能特徵包括：(1)特異性－在許多靶分子中辨識且個別反應或不反應之能力，(2)辨別－確定自身與非自身以便與所有無數種蛋白及其他有機物質和平共存，但仍針對引入體內之外來物質作出強烈反應的能力，及(3)記憶－憑經驗模製，使得隨後遇見特定外來病原體將激起比初始遇見所發生之 反應更快速且更強烈的反應。由於本發明之IgE拮抗劑誘發載有IgE之B細胞中之細胞凋亡，故預期其衰減或甚至消除對特定抗原之免疫記憶。預期其在對常見過敏原之強烈免疫反應為病態時特別有益，諸如在異位病症之情況下。
原始淋巴細胞自初級淋巴器官連續釋放至周邊，其各自攜帶能夠實現抗原結合之表面受體。B細胞中之抗原結合係經由表面結合免疫球蛋白介導，然而在T細胞中其係由T細胞受體介導。當原始淋巴細胞未經活化時，其於進入周邊後數天內死亡。經活化之彼等原始淋巴細胞存活且增殖，產生子代細胞，該等子代細胞接著可經歷進一步之活化及增殖循環。對給定抗原之反應之速度及強度大體上係由選殖選擇決定：對特定抗原具特異性之群體子代細胞或純系愈大，則可辨識及參與免疫反應之細胞數量愈多。每一免疫反應為複雜及雜亂調控的一系列涉及若干細胞類型之事件。當免疫原進入身體中且遇到稱作抗原呈現細胞(APC)之專屬種類之細胞時，觸發免疫反應。此等APC俘獲微量免疫原且將其以可由抗原特異性輔助T淋巴細胞辨識之形式呈現。接著輔助T細胞得以活化，且轉而促進其他種類之淋巴細胞(諸如B細胞或細胞毒性T細胞)活化。接著經活化之淋巴細胞增殖且執行其特異性效應功能。在此過程之各階段，淋巴細胞與APC經由直接接觸或藉由分泌調控細胞激素而彼此通信。
由APC俘獲之外原性抗原經歷一系列稱為抗原加工之改變。該加工，尤其蛋白質免疫原之加工涉及變性及部分蛋 白水解消化以使得免疫原裂解為短肽。接著使有限數量之所得肽與II類MHC蛋白非共價締合且輸送至APC表面，一種稱作抗原呈現之過程。與APC直接接觸之CD4＋輔助T淋巴細胞可得以活化，但僅在該CD4＋輔助T淋巴細胞表現可辨識且結合由APC呈現之特定肽－MHC複合物之T細胞受體蛋白的條件下方可實現該活化。
輔助T(TH )細胞為免疫反應之主要配合者，因為需要其來活化兩種其他淋巴效應細胞：細胞毒性T(Tc )細胞及分泌抗體之漿細胞。TH 活化發生於免疫反應早期且需要至少兩個信號。一個信號係藉由T細胞抗原受體與APC表面上之抗原肽－MHC複合物結合而提供，該信號係經由CD3蛋白複合物傳遞，而認為經由APC之第二協同刺激信號係由T細胞表面上之獨立信號傳遞蛋白與APC上之特異性配位體結合而產生。一種已知之此類相互作用為T細胞蛋白CD28與稱作B7之APC表面蛋白家族。其他表面蛋白對亦可介導協同刺激。
兩種信號一起誘發輔助T細胞開始分泌稱作介白素－2(IL－2)之細胞激素且亦開始在其表面上表現特異性高親和力IL－2受體。IL－2為高度有效的T淋巴細胞有絲分裂因子，且為活化T細胞之增殖反應所必需。IL－2對分泌其之細胞之效應－一種稱作自分泌效應之現象。已進一步展示即使T細胞已接收兩種信號，但若阻斷T細胞自身表面IL－2受體則其亦不增殖。IL－2亦可作用於近鄰細胞，此為所謂之旁分泌效應。此效應對於活化Tc 細胞特別重要，Tc 細胞一般不產 生足以刺激其自身增殖之IL－2。除IL－2以外，活化之TH 細胞分泌其他細胞激素且促進B細胞、巨噬細胞及其他細胞類型之生長、分化及功能。
APC與抗原特異性TH 細胞之接觸亦對APC具有效應－最重要之效應之一為釋放IL－1。咸信此細胞激素係以自分泌方式作用以增加II類MHC蛋白及各種黏著分子之表面表現，藉此增強TH 細胞之結合且提高抗原呈現。同時，IL－1以旁分泌方式作用於TH 細胞以促進IL－2分泌及IL－2受體表現。
在以先前所述之方式活化TH 細胞之過程中，一些B細胞亦可經由其抗原受體與免疫原接合，該等抗原受體為B細胞隨後分泌之膜結合形式抗體。不同於T細胞，B細胞辨識呈游離、未加工形式之免疫原。特異性抗原結合提供一種類型之可引起B細胞活化之信號。第二種類型係由活化之TH 細胞提供，該等活化之TH 細胞表現有助於藉由與B細胞表面上之非免疫球蛋白受體結合來使B細胞活化之蛋白。將此等TH 所衍生之信號(作用於任何B細胞而不管其抗原特異性如何)稱作輔助因子。此等輔助因子包括IL－2、IL－4及IL－6。然而，經由使得T細胞表面上之蛋白直接接觸B細胞上之彼等蛋白的細胞－細胞接觸更有效地達成輔助。接觸介導之輔助之最有效形式發生於稱作CD40配位體(CD40L)之蛋白(其僅在TH 細胞得以活化後表現於TH 細胞上)與B細胞上稱作CD40之蛋白結合時。在稱作旁觀活化之過程中，與活化之B細胞接觸甚至可足以活化停滯B細胞，即使該B細胞表面免疫球蛋白未接合於抗原中。
Tc 淋巴細胞用以清除於表面上表現外來抗原之細胞，諸如受病毒感染之宿主細胞。多數Tc 細胞表現CD8而非CD4且因此辨識與I類而非II類MHC蛋白締合之抗原。當體細胞為病毒感染時，一些免疫原性病毒蛋白可在細胞內經歷加工且接著所得肽可表現為與I類MHC分子之表面複合物。接著可由抗原特異性純系之T細胞受體辨識此等肽MHC複合物，提供Tc 細胞活化所需兩種信號中之一種。此第一信號單獨誘發Tc 細胞上之高親和力IL－2受體。第二信號係由自附近經活化之TH 淋巴細胞分泌之IL－2提供。接收兩個信號時，經活化之Tc 細胞獲取細胞毒性活性，使得其能夠殺死與其結合之細胞，以及帶有相同肽－I類MHC複合物之任何其他細胞。在一些情況下，由於Tc 釋放特異性毒素至靶細胞上而發生靶細胞之殺死；在其他情況下，Tc 誘發靶細胞藉由細胞凋亡自殺。活化Tc 細胞亦增殖，產生具有相同抗原特異性之額外Tc 細胞。
IgE/肥大細胞/介導路徑
IgE抗體係於分子之Fc部分處固定於肥大細胞及嗜鹼性細胞表面之高親和力細胞表面受體，稱作FcεRI。過敏反應在多價過敏原分子與佔據此等受體之抗體結合時啟始。該結果為FcεRI之橋接，其轉而以細胞內方式信號轉導引起釋放及活化炎症介體：組織胺、白三烯素、趨化因子、血小板活化因子及蛋白酶。此等活化介體局部起作用且引起增加之血管通透性、血管擴張、平滑肌收縮及黏液腺分泌。該等事件在臨床上稱為即刻或早期，且發生在過敏原 曝露後最先15－30分鐘之內。在後續之12小時中，存在回應於其他不完全瞭解之化學介體之進行性炎症細胞組織滲入，自嗜中性白血球至嗜伊紅細胞至單核細胞。將在過敏原曝露後6－12小時之此時間段表示為晚期且其特徵為細胞炎症之臨床顯現。假定在不存在早期反應下發生晚期反應(尤其在肺中)，仍不完全理解晚期反應是否必需為IgE所介導。
此機制主要負責過敏反應、蕁麻疹及異位性疾病(諸如過敏性鼻炎、過敏性哮喘、異位性皮膚炎及過敏性胃腸病)。
效應T淋巴細胞/淋巴激素路徑
某些過敏性疾病係為與由於預先曝露而對特異性過敏原敏感之效應T淋巴細胞之過敏原反應所介導。當遇見過敏原時，CD4＋ T細胞得以活化以產生淋巴激素，其在若干天之時段中伴隨單核細胞滲入物之積聚而產生。
I.定義
"過敏原"或"免疫原"為可觸發免疫反應之任何分子。本文中所使用之術語涵蓋抗原分子自身或其來源，諸如花粉粒、動物皮屑、昆蟲毒液或食品。其與術語抗原形成對照，抗原係指可為免疫球蛋白或T細胞受體特異性辨識之分子。能夠誘發免疫反應之任何外來物質為可能之過敏原。已知天然及合成來源之許多不同化學物質具過敏原性。複合天然有機化學物質(尤其蛋白質)可能引起抗體介導之過敏症，而簡單有機化合物、無機化學物質及金屬更 優先引起T細胞介導之過敏症。在一些情況下，相同過敏原可引起一種以上類型之過敏症。可經由吸入、注射、注射或皮膚接觸而曝露於過敏原。
術語"抗體"包括單株抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區之全長抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、雙功能抗體及單鏈分子，以及抗體片段(例如Fab、F(ab')2 及Fv)。本文中之術語"免疫球蛋白"(Ig)可與"抗體"互換使用。
基本4鏈抗體單元為由兩個相同輕鏈(L)及兩個相同重鏈(H)組成之異四聚醣蛋白。IgM抗體由基本異四聚體單元中之5個以及稱作J鏈之額外多肽組成，且含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包含可聚合以形成多價集合體之基本4鏈單元中之2－5個以及J鏈。在IgG之情況下，4鏈單元一般為約150,000道爾頓。各L鏈係由一個共價雙硫鍵與H鏈連接，而兩條H鏈視H鏈同型而定，由一或多個雙硫鍵彼此連接。各H及L鏈亦具有規則隔開之鏈內雙硫橋。各H鏈在N端具有可變域(VH )，隨後為α及γ鏈各自之三個恆定域(CH )及μ及ε同型之四個CH 域。各L鏈在N端具有可變域(VL )，隨後在其另一端具有恆定域。將VL 與VH 對準且將CL 與重鏈之第一恆定域(CH 1)對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。將VH 與VL 配對在一起形成單一抗原結合位點。關於不同種類抗體之結構及特性，參見例如Basic and Clinical Immunology ，第8版，Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(編)， Appleton & Lange,Norwalk,CT,1994，第71頁及第6章。
可將來自任何脊椎動物物種之L鏈基於其恆定域之胺基酸序列分配至兩個明顯不同類型(稱為及λ)中之一者。視重鏈(CH )恆定域之胺基酸序列，可將免疫球蛋白分成不同種類或同型。存在5種免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其具有分別命名為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。基於CH 序列及功能中相對較小之差異將γ及α種類進一步分為子類，例如人類表現以下子類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
"經分離"抗體為已自其產生環境之組份識別、分離及/或回收之抗體(例如天然或重組)。較佳地，經分離多肽不與來自其產生環境之所有其他組份締合。其產生環境之污染組份(諸如由重組轉染細胞產生之組份)為通常干擾抗體研究、診斷或治療用途之物質且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，多肽將被純化至：(1)如藉由(例如)Lowry法所測定大於95重量%抗體，且在一些實施例中，大於99重量%；(1)足以獲得藉由使用旋杯式序列分析儀所測定N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度，或(3)藉由SDS－PAGE在非還原或還原條件下使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色測定之均質。經分離抗體包括原位處於重組細胞內之抗體，若抗體天然環境中至少一種組份將不存在。然而，通常藉由至少一個純化步驟製備經分離多肽或抗體。
抗體之"可變區"或"可變域"係指抗體重鏈或輕鏈之胺基 末端域。重鏈及輕鏈可變域可分別稱為"VH "及"VL "。此等結構域一般為抗體最具可變性之部分(相對於相同種類之其他抗體)且含有抗原結合位點。
術語"可變"係指抗體之間可變域之某些區段之序列廣泛不同。V域介導抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性在可變域之整個範圍內並不均勻分布。實情為，在輕鏈及重鏈可變域中可變性集中在稱作高變區(HVR)之三個區段中。可變域之更高度保守部分稱作構架區(FR)。原生重鏈及輕鏈之可變域各自包含大體上採用β摺疊構型，由三個HVR連接之四個FR區，該三個高變區形成連接β摺疊結構且在一些情況下形成β摺疊結構之部分之環。各鏈中之HVR係由FR區緊密固持在一起，且與來自另一條鏈之HVR一起促進形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第五版，National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恆定域不直接涉及於抗體與抗原之結合中，但展現各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
本文中所使用之術語"單株抗體"係指獲自大體上同源抗體之群體之抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可少量存在之可能的天然產生之突變作用及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)外皆為相同的。單株抗體具高度特異性，其針對單一抗原位點。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相對比，各單株抗體 針對抗原上之單一決定子。除特異性外，單株抗體之有利之處在於其係藉由融合瘤培養而合成，未經其他免疫球蛋白污染。修飾語"單株"表示抗體係獲自大體上同源抗體群體之特徵且不應將其理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，待根據本發明使用之單株抗體可藉由各種技術製成，該等技術包括(例如)融合瘤法(例如Kohler及Milstein.,Nature ,256：495－97(1975)；Hongo等人，Hybridoma ,14(3)：253－260(1995),Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T－Cell Hybridomas 563－681 (Elsevier,N.Y.,1981))；重組DNA法(參見例如美國專利第4,816,567號)；噬菌體呈現技術(參見例如Clackson等人，Nature ,352：624－628(1991)；Marks等人，J.Moh Biol. 222：581－597(1992)；Sidhu等人，J.Moh Biol. 338(2)：299－310(2004)；Lee等人，J.Moh Biol. 340(5)：1073－1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467－12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1－2)：119－132(2004))；及用於在具有編碼人類免疫球蛋白序列之部分或所有人類免疫球蛋白基因座或基因之動物體內產生人類或人類樣抗體之技術(參見例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255－258 (1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol. 7：33(1993)；美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號及第5,661,016號；Marks等人，Bio/Technology 10；779－783(1992)；Lonberg等人，Nature 368；856－859(1994)；Morrison,Nature 368；812－813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol. 14：845－851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol. 14：826(1996)；及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol 13：65－93(1995)。
術語"裸抗體"係指不與細胞毒性部分或放射性標記結合之抗體。
術語"全長抗體"、"完整抗體"或"全抗體"可互換使用來指代相對於抗體片段，大體上完整形式之抗體。詳言之，全抗體包括具有重鏈及輕鏈(包括Fc區)之彼等抗體。該等恆定域可為原生序列恆定域(例如人類原生序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。在一些情況下，完整抗體可具有一或多種效應功能。
"抗體片段"包含完整抗體之一部分，較佳完整抗體之抗原結合區及/或可變區。抗體片段實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(參見美國專利5,641,870，實例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057－1062[1995])；由抗體片段形成之單鏈抗體分子及多特異性抗體。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生稱為"Fab"片段及殘餘"Fc"片 段(名稱反映易於結晶之能力)之兩個相同抗原結合片段。Fab片段由整個L鏈以及H鏈可變區(VH )，及一重鏈之第一恆定域(CH 1)組成。各Fab片段關於抗原結合為單價的，亦即其具有單一抗原結合位點。胃蛋白酶處理抗體產生大致對應於具有不同抗原結合活性且仍能夠交聯抗原之兩個雙硫鍵連接之Fab片段的單一大F(ab')2 片段。Fab'片段與Fab片段不同之處在於其在CH 1域之羧基端具有數個額外殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'－SH為本文中對恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基之Fab'的名稱。F(ab')2 抗體片段最初係以之間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對形式產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
Fc片段包含由雙硫鍵固持在一起之兩條H鏈之羧基末端部分。抗體之效應功能係由Fc區中之序列確定，Fc區為亦由見於特定類型細胞上之Fc受體(FcR)所辨識之區域。
"Fv"為含有完全抗原辨識位點及抗原結合位點之最小抗體片段。此片段由緊密、非共價締合之一個重鏈可變區域與一個輕鏈可變區域之二聚體組成。由該兩個結構域之摺疊產生六個高變環(自H及L鏈各3個環)，該等高變環提供用於抗原結合之胺基酸殘基且賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個對抗原具特異性之HVR之Fv的一半)亦具有辨識及結合抗原之能力，儘管其親和力低於整個結合位點。
亦縮寫為"sFv"或"scFv"之"單鏈Fv"為包含連接至單一多 肽鏈中之VH 及VL 抗體域之抗體片段。較佳地，sFv多肽另外包含介於VH 與VL 域之間的多肽連接子，其使得sFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。關於sFv之論述，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer－Verlag,New York，第269－315頁(1994)。
本發明抗體之"功能片段"包含完整抗體之一部分，一般包括完整抗體之抗原結合區或可變區，或保持或具有經改質FcR結合能力之抗體之F區。抗體片段之實例包括由抗體片段形成之線性抗體、單鏈抗體分子及多特異性抗體。
術語"雙功能抗體"係指藉由以下方法製備之小抗體片段：在VH 與VL 域之間使用短連接子(約5－10個殘基)以便達成V域之鏈間而非鏈內配對來建構sFv片段(參見前述段落)，藉此產生二價片段，亦即具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙功能抗體為兩個"交叉"sFv片段之雜二聚體，其中兩個抗體之VH 及VL 域係存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體係更詳細地描述於(例如)EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90－6448(1993)中。
本文之單株抗體尤其包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體種類或子類的抗體之相應序列相同或與其同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體種類或子類的抗體以及該等抗體之片段之相應序列相同或與其同源，其限 制條件為其展示所需生物活性(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,81 ：6851－6855(1984))。本文中所關注之嵌合抗體包括PRIMATIZED抗體，其中抗體之抗原結合區係源自藉由(例如)以所關注抗原使獼猴免疫而產生之抗體。本文中所使用之"人類化抗體"係以"嵌合抗體"之子類來使用。
非人類(例如鼠類)抗體之"人類化"形式為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在一實施例中，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體HVR之殘基係以來自具有所需特異性、親和力及/或能力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之HVR(供體抗體)的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。可進行此等修飾以進一步改善抗體效能，諸如結合親和力。一般而言，人類化抗體將包含大體上所有至少一個且通常兩個可變域，其中所有或大體上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白序列之彼等高變環且所有或大體上所有FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等FR區，儘管FR區可包括一或多個改良抗體效能(諸如結合親和力、異構化、免疫原性等)之個別FR殘基取代。FR中此等胺基酸取代之數量通常在H鏈中不超過6且在L鏈中不超過3。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。關於其他細節參見(例如)Jones等 人，Nature 321：522－525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323－329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol. 2：593－596(1992)。亦參見(例如)Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol. 1：105－115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23：1035－1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech. 5：428－433(1994)；及美國專利第6,982,321號及第7,087,409號。
"人類抗體"為胺基酸序列對應於由人類產生及/或使用本文所揭示之用於製造人類抗體之任何技術製造的抗體之胺基酸序列的抗體。此人類抗體之定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。使用於此項技術中已知之各種技術(包括噬菌體呈現庫)可產生人類抗體。Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol. ,227：381(1991)；Marks等人，J.Mol Biol. ,222：581(1991)。製備人類單株抗體亦可使用描述於Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol ,147(1)：86－95(1991)中之方法。亦參見van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol ,5：368－74(2001)。人類抗體可藉由將抗原投與轉殖基因動物來製備，該轉殖基因動物經修飾以回應於抗原激發產生該等抗體，但該轉殖基因動物之內源性基因座已去能，例如經免疫之異種小鼠(xenomice)(關於XENOMOUSETM 技術參見(例如)美國專利第6,075,181號及第6,150,584號)。關於經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦參見(例如)Li等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA ,103：3557－3562(2006)。
本文中所使用之術語"高變區"、"HVR"或"HV"係指序列高變及/或形成結構確定之環之抗體可變域之區。一般而言，抗體包含六個HVR：三個在VH 中(H1、H2、H3)且三個在VL 中(L1、L2、L3)。在原生抗體中，H3及L3呈現六個HVR之最大差異性，且尤其咸信H3在賦予抗體以優良特異性中起獨特作用。參見(例如)Xu等人Immunity 13：37－45(2000)；Johnson及Wu,Methods in Molecular Biology 248：1－25(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)。實際上，僅由重鏈組成之天然產生之駱馬抗體在不存在輕鏈下具有功能及穩定性。參見(例如)Hamers－Casterman等人，Nature 363：446－448(1993)及Sheriff等人，Nature Struct.Biol 3：733－736(1996)。
許多HVR描述處於使用中且涵蓋於本文中。為Kabat互補判定區(CDR)之HVR係基於序列可變性且為最常用的(Kabat等人，同上)。Chothia替代地提及結構環之位置(Chothia及LeskJ.Mol.Biol. 196：901－917(1987))。AbM HVR表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且為Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體所使用。"接觸"HVR係基於可用複合晶體結構之分析。來自此等HVR各自之殘基係如下所述。
HVR可包含如下"擴展HVR"：VL 中之24－36或24－34(L1)、46－56或50－56(L2)及89－97或89－96(L3)，及VH 中之26－35(H1)、50－65或47－65(較佳實施例)(H2)及93－102(H3)。對於此等擴展HVR定義各者而言，可變域殘基係根據Kabat等人(同上)編號。
"構架"或"FR"殘基為除本文中所定義之HVR殘基以外之彼等可變域殘基。
表述"按照Kabat之可變域殘基編號"或"按照Kabat之胺基酸位置編號"及其變形係指Kabat等人(同上)中用於抗體編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域FR或HVR縮短或插入其中之較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘基52後之單一胺基酸插入物(根據Kabat殘基52a)及在重鏈FR殘基82後之插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由在抗體序列之同源區與"標準" Kabat編號序列對準來確定給定抗體之殘基的Kabat編號。
為達成本文中之目的之"受體人類構架 "為包含源自人類免疫球蛋白構架或人類一致構架之VL 或VH 構架之胺基酸序 列之構架。"源自"人類免疫球蛋白構架或人類一致構架之受體人類構架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有預先存在之胺基酸序列變化。在一些實施例中，預先存在胺基酸變化之數量為10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少或2或更少。
"人類一致構架 "為表示在一系列所選人類免疫球蛋白VL 或VH 構架序列中最常產生之胺基酸殘基之構架。一般而言，該所選人類免疫球蛋白VL 或VH 序列系列係來自可變域序列之子群。一般而言，序列之子群為按照Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之子群。在一實施例中，對於VL 而言，子群為按照Kabat等人(同上)之子群I。在一實施例中，對於VH 而言，子群為按照Kabat等人(同上)之子群III。
"V H 子群III一致構架 "包含獲自Kabat等人(同上)之可變重鏈子群III中之胺基酸序列的一致序列。在一實施例中，VH 子群III一致構架胺基酸序列包含以下序列各者中之至少一部分或全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(H1)(SEQ ID NO：55)、WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：56)(H2)、RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：57)(H3)、WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：58)(H4)。
"V L 子群I一致構架 "包含獲自Kabat等人(同上)之可變輕鏈子群I中之胺基酸序列的一致序列。在一實施例中，VH 子群I一致構架胺基酸序列包含以下序列各者中之至少一部分或全部：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：59)(L1)、WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：60)(L2)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：61)(L3)、FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：62)(L4)。
特定位置處，例如Fc區之"胺基酸修飾"係指特定殘基之取代或缺失，或鄰近特定殘基之至少一個胺基酸殘基之插入。"鄰近"特定殘基之插入意謂插入其一至兩個殘基內。插入可為特定殘基之N末端或C末端。本文中較佳之胺基酸修飾為取代。
"親和力成熟"抗體為在其一或多個HVR中具有一或多處改變之抗體，與不具有彼等改變之親本抗體相比，該等改變使抗體對抗原之親和力改良。在一實施例中，親和力成熟抗體對靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳親和力。藉由在此項技術中已知之程序產生親和力成熟抗體。舉例而言，Marks等人，Bio/Technology 10：779－783(1992)描述藉由VH 及VL 域改組進行之親和力成熟。(例如)Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809－3813(1994)；Scier等人，Gene 169：147－155(1995)；Yelton等人，J.Immunol. 155：1994－2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol. 154(7)：3310－9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol Biol. 226：889－896(1992)描述HVR及/或構架殘基之隨機突變。
與特定多肽或特定多肽上之抗原決定基"特異性結合 "或對特定多肽或特定多肽上之抗原決定基"具特異性 "的抗體 為與彼特定多肽或特定多肽上之抗原決定基結合而大體上不與任何其他多肽或多肽抗原決定基結合的抗體。舉例而言，本發明之M1'特異性抗體對結合於B細胞上之IgE上所見，但不呈現於所分泌之IgE上之IgE M1'胞外區段具特異性。
"阻斷"抗體或"拮抗"抗體為抑制或降低其結合之抗原之生物活性的抗體。在一些實施例中，阻斷抗體或拮抗抗體大體上或完全抑制抗原之生物活性。本發明之細胞凋亡抗IgE抗體以減少游離血清IgE及總血清IgE之方式阻斷IgE介導免疫反應之活性。
"誘發細胞凋亡 "或具"細胞凋亡性 "之抗體為如藉由標準細胞凋亡檢定所測定誘發漸進式細胞死亡(諸如膜聯蛋白V結合、DNA斷裂、細胞萎縮、內質網擴張、細胞斷裂及/或膜囊(稱為細胞凋亡體)形成)之彼等抗體。舉例而言，本發明抗IgE抗體之細胞凋亡活性可藉由以膜聯蛋白V將表面結合IgE之細胞染色來展示。
術語"總血清IgE "係指存在於樣品中之IgE總量，包括游離IgE或未經結合之IgE，以及與結合搭配物(例如抗IgE抗體，帶有IgE之B細胞)複合之IgE。"游離血清IgE "係指未與結合搭配物結合之IgE。
術語"過敏原特異性IgE "係指由在稱作過敏性致敏之過程中初始曝露於過敏原產生且與肥大細胞及嗜鹼性細胞表面結合且可致使肥大細胞及嗜鹼性細胞在隨後曝露於相同過敏原後活化並對特定抗原具特異性的IgE。病毒(例如細 胞巨大病毒－CMV)、細菌(例如葡萄球菌(Staphylococcus ))、蠕蟲(例如蛔蟲(Ascaris )、血吸蟲(Schistosoma ))之若干有絲分裂因子及空氣污染之輔助因子(例如煙及柴油廢氣)刺激產生IgE分子而不引發任何過敏原特異性IgE致敏。因此，由於IgE含量可以不必使宿主傾向於對IgE介導之病症較敏感之方式升高，故有時將過敏原特異性IgE含量用於臨床評估。
術語"特異性消耗產生IgE之B細胞 "意謂特異性減少特異性分泌IgE之B細胞(亦即漿細胞)之群體或降低其有效性，但不顯著影響分泌其他免疫球蛋白(諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgM)之B細胞之群體或有效性的能力。
術語"固相 "描述本發明抗體可黏附之非水性基質。本文中所涵蓋之固相之實例包括部分或完全由玻璃(例如可控孔度玻璃)、多醣(例如瓊脂糖)、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇及聚矽氧形成之彼等固相。在某些實施例中，視上下文而定，固相可包含檢定盤之孔；在其他情形下，固相為純化管柱(例如親和力層析管柱)。此術語亦包括離散粒子之不連續固相，諸如描述於美國專利第4,275,149號中之彼等固相。
抗體"效應功能 "係指可歸因於抗體Fc區(原生序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)且隨抗體同型而變化之彼等生物活性。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體之負調節(例如B細胞受體)及B細胞活化。
"抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 "或ADCC 係指結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)上之經分泌Ig使此等細胞毒性效應細胞能夠與帶有抗原之靶細胞特異性結合且隨後以細胞毒素殺死靶細胞之細胞毒性形式。抗體"武裝"細胞毒性細胞且因此機制而為殺死靶細胞所需。用於介導ADCC、NK細胞之初級細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之Fc表現概括於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol. 9 ：457－92(1991)第464頁之表3中。為評定所關注分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC檢定，諸如描述於美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中之檢定。適用於該等檢定之效應細胞包括外周血液單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。其他或另外，可於活體內，例如在諸如揭示於Clynes等人，PNAS USA 95 ：652－656(1998)中之動物模型中評定所關注分子之ADCC活性。
除非另外指明，否則，免疫球蛋白重鏈中之殘基編號為按照Kabat等人(同上)之EU係數編號。"按照Kabat之EU係數"係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
本文中之術語"Fc區 "係用以定義免疫球蛋白重鏈之C末端區，包括原生序列Fc區及變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常界定為 自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230至其羧基末端之區段。可(例如)在抗體之產生或純化期間，或藉由將編碼抗體重鏈之核酸重組式工程化來將Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)移除。因此，完整抗體之組成可包括移除所有K447殘基之抗體群體，未移除K447殘基之抗體群體及含有具有及不具有K447殘基之抗體混合物之抗體群體。用於本發明抗體中之合適原生序列Fc區包括人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
"Fc受體 "或"FcR "描述與抗體Fc區結合之受體。較佳FcR為原生序列人類FcR。此外，較佳FcR為與IgG抗體結合之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及不同剪接型，FcγRII受體包括FcγRIIA("活化受體")及FcγRIIB("抑制受體")，該等受體具有主要在其細胞質域方面不同之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基抑制基元(ITIM)。參見M.Daron,Annu.Rev.Immunol. 15：203－234(1997)。FcR係論述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol. 9 ：457－92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4 ：25－34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med. 126：330－41(1995)中。本文之術語"FcR"包涵其他FcR，包括有待於將來識別之彼等FcR。
術語"Fc受體 "或"FcR "亦包括新生受體，FcRn，其負責將母系IgG轉移至胎兒。Guyer等人，J.Immunol. 117 ：587 (1976)及Kim等人，J.Immunol. 24 ：249(1994)。量測與FcRn結合之方法為已知的(參見例如Ghetie及Ward,Immunol.Today 18 ：(12)：592－8(1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology 15 (7)：637－40(1997)；Hinton等人，J.Biol.Chem. 279 (8)：6213－6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人))。
可(例如)在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染人類細胞株或在投與具有變異Fc區之多肽之靈長類動物體內檢定活體內FcRn結合及人類FcRn高親和力結合多肽之血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述與FcR之結合得以改良或減弱之抗體變異體。亦參見(例如)Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591－6604(2001)。
"人類效應細胞 "為表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球。較佳地，該等細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括外周血液單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球，其中PBMC及MNK細胞較佳。可自原生來源(例如血液)分離效應細胞。
"補體依賴性細胞毒性 "或"CDC "係指靶細胞在補體存在下之溶解。經典補體路徑之活化係藉由補體系統之第一組份(C1q)與結合至其同源抗原上之抗體(適當子類)結合而啟始。為評定補體活化，可進行(例如)描述於Gazzano－Santoro等人，J.Immunol Methods 202 ：163(1996)中之CDC檢定。
Fc區胺基酸序列改變且C1q結合能力增加或降低之多肽變異體係描述於美國專利第6,194,551B1號及WO 99/51642中。彼等專利公開案之內容係特別以引用的方式併入本文中。亦參見Idusogie等人J.Immunol. 164：4178－4184(2000)。
IgG中之N糖基化位點在CH 2域之Asn297處。本發明亦提供具有Fc區之CD20結合、人類化抗體之組合物，其中組合物中約80－100%(且較佳約90－99%)之抗體包含缺少海藻糖，附於醣蛋白之Fc區之成熟核心碳水化合物結構。本文中表明該等組合物展現在與Fc_RIIIA(F158)(其在與人類IgG相互作用中不如Fc_RIIIA(V158)般有效)結合中令人驚奇的改良。因此，預期本文中之組合物尤其對於治療表現Fc_RIIIA(F158)之人類患者而言，優於先前所述之抗CD20抗體組合物。在正常健康之非洲裔美國人及白種人體內Fc(RIIIA(F158)比Fc(RIIIA(V158)更常見。參見Lehrnbecher等人Blood 94：4220(1999)。本發明申請案進一步表明由將本文中之糖基化變化與醣蛋白Fc區中之胺基酸序列修飾組合而產生之Fc_RIII結合及/或ADCC功能的協同增加。
"結合親和力 "一般係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用總和之強度。除非另外指明，否則本文中所使用之"結合親和力"係指反映結合對成員(例如抗體與抗原)之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解 離常數(Kd )來表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文中所描述之彼等方法)來量測。低親和力抗體一般緩慢地與抗原結合且趨向於易於解離，而高親和力抗體一般較快地與抗原結合且趨向於保持較久結合。量測結合親和力之各種方法於此項技術中已知，且其中之任何方法均可用於本發明目的。以下描述用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例。
在一實施例中，本發明之"Kd "或"Kd值 "係如藉由以下檢定所描述，藉由使用Fab型式之所關注抗體及其抗原進行之放射性標記抗原結合檢定(RIA)量測。Fab與抗原之溶解結合親和力係藉由在滴定系列之未經標記抗原存在下，以最小濃度之(125 I)標記抗原平衡Fab，接著以經抗Fab抗體塗覆之盤俘獲所結合之抗原來量測(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol. 293：865－881(1999))。為確立用於檢定之條件，將微量滴定盤(DYNEX Technologies,Inc.)以50 mM碳酸鈉(pH值為9.6)中之5 μg/ml俘獲抗Fab抗體(Cappel Labs)塗覆隔夜，且隨後以PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白在室溫(約23℃)下阻斷二至五小時。在非吸附性盤(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM[125 I]－抗原與連續稀釋之所關注Fab混合(例如按照Presta等人，Cancer Res. 57：4593－4599(1997)中對抗VEGF抗體，Fab－12之評定)。接著將所關注Fab培育隔夜，然而，可持續培育更長時段(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至俘獲盤上以在室溫下培育(例如歷時一小時)。接著移除溶液且將盤以PBS 中之0.1% TWEEN－20TM 界面活性劑洗滌八次。在盤已乾燥時，添加每孔150微升閃爍體(MICROSCINT－20TM ；Packard)，且將盤於TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上計數十分鐘。選擇得到小於或等於最大結合之20%之各Fab濃度以用於競爭性結合檢定。
根據另一實施例，藉由使用表面電漿共振檢定，使用BIACORE－2000或BIACORE－3000儀器(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下，以約10個反應單位(RU)之固定抗原CM5晶片來量測Kd 。簡言之，根據供應商說明，以N－乙基－N'－(3－二甲基胺基丙基)－碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N－羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器晶片(CM5,BIAcore Inc.)。將抗原以pH值為4.8之10 mM乙酸鈉稀釋至5 μg/ml(約0.2 μM)，隨後以每分鐘5微升之流動速率注射以達成大約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測而言，在25℃下，以約25 μl/min之流動速率注射兩倍連續稀釋於含有0.05% TWEEN 20TM 界面活性劑(PBST)之PBS中之Fab(0.78 nM至500 nM)。締合速度(kon )及解離速率(koff )係使用簡單一對一朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)(BIAcore評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合及解離感應譜來計算。以比率koff /kon 來計算平衡解離常數(Kd)。參見(例如)Chen等人，J.Mol.Biol. 293：865－881(1999)。若根據以上表面電漿共振檢定，締合速率超過106 M－1 s－1 ，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定 締合速率，該技術量測在如具有攪拌比色管之光譜儀(諸如停流裝備型光譜光度計(Aviv Instruments)或8000系列SLM－AMINCOTM 光譜光度計(ThermoSpectronic))中所量測之增加濃度之抗原存在下，在25℃下pH值為7.2之PBS中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)的螢光發射強度(激發＝295 nm；發射＝340 nm，16 nm帶通)之增減。
亦可如上所述使用BIACORE－2000或BIACORE－3000系統(BIAcore,Ine.,Piscataway,NJ)來測定本發明之"締合速率"或"kon "。
本文中所使用之短語"大體上降低 "或"大體上不同 "表示兩個數值(一般一個與分子相關且另一個與參照/比較分子相關)之間的差異程度足夠高，以使得熟習此項技術者將認為兩個值之間的差異在該等值(例如Kd值)所量測之生物特徵之情境下具有統計顯著性。該兩個值之問的差異(例如)以參照/比較分子之值為函數大於約10%，大於約20%，大於約30%，大於約40%，及/或大於約50%。
本文中所使用之術語"大體上類似"或"大體上相同"表示兩個數值(例如一個與本發明抗體相關且另一個與參照/比較抗體相關)之間的類似程度足夠高，以使得熟習此項技術者將認為兩個值之間的差異在該等值(例如Kd值)所量測之生物特徵之情境下幾乎不具有或不具有生物及/或統計顯著性。該兩個值之間的差異(例如)以參照/比較值為函數小於約50%，小於約40%，小於約30%，小於約20%，及/或小於約10%。
關於肽、多肽或抗體序列之"胺基酸序列一致性百分比(%)"及"同源性"係定義為在將序列對準且引入空位(必要時)以達成最大序列一致性百分比之後，且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分，候選序列中等同於特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之對準可以此項技術內之各種方式達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST－2、ALIGN或MEGALIGNTM (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於量測對準之適當參數，包括在所比較之序列全長中達成最大對準所需之任何演算法。然而，出於本文中之目的，使用Genentech,Inc.設計之序列比較電腦程式ALIGN－2來產生胺基酸序列一致性值%。ALIGN－2源編碼已隨使用者文件備案於U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，於此處其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN－2程式可經由Genentech,Inc.,South San Francisco,California公開獲得。應編譯ALIGN－2程式以用於UNIX操作系統，較佳數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數係由ALIGN－2程式設定且不改變。
在使用ALIGN－2進行胺基酸序列比較之情況下，給定胺基酸序列A對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表述為具有或包含與給定胺基酸序列B之特定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)係如下計算：100×分數X/Y， 其中X為在A與B之序列對準程式ALIGN－2之對準中由彼程式計分為一致匹配之胺基酸殘基數，且其中Y為B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A對B之胺基酸序列一致性%不等於B對A之胺基酸序列一致性%。
除非另外特別指出，否則本文中所使用之所有胺基酸序列一致性%值係如上一段中所述使用ALIGN－2電腦程式獲得。
編碼本文中抗體之"經分離"核酸分子為經識別且與至少一種污染核酸分子分離之核酸分子，該核酸分子在其產生環境中通常與該污染核酸分子締合。較佳地，經分離核酸不與其產生環境所締合之所有組份締合。編碼本文中多肽及抗體之經分離核酸分子為不同於其於自然界中所見之形式或設定之形式。因此，經分離核酸分子不同於天然存在於細胞中之編碼本文中多肽及抗體之核酸。
術語"控制序列"係指為可操作性連接之編碼序列於特定宿主生物體中表現所必需之DNA序列。適於原核生物之控制序列包括(例如)啟動子，視情況操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺嘌呤信號及強化子。
當使核酸與另一核酸序列功能相關時，該核酸經"可操作性連接"。舉例而言，若前序列或分泌前導子之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA可操作性連接；若啟動子或強化子影響序列之轉錄，則其與編碼 序列可操作性連接；或若核糖體結合位點經定位以便促進轉譯，則其與編碼序列可操作性連接。一般而言，"可操作性連接"意謂所連接之DNA序列為鄰接的且在分泌前導子之情況下，鄰接且處於閱讀相中。然而強化子不必鄰接。藉由在適宜限制性位點接合實現連接。若該等位點並不存在，則根據習知實務使用合成寡核苷酸接附子或連接子。
本文中所使用之術語"抗原決定基標記 "係指包含與"標記多肽"融合之本文所述之多肽或抗體的嵌合多肽。標記多肽具有足夠殘基以提供抗體可針對之抗原決定基，然而足夠短使得其不干擾其所融合多肽之活性。標記多肽較佳亦相當獨特，以使該抗體大體上不與其他抗原決定基交叉反應。適當標記多肽一般具有至少六個胺基酸殘基且通常介於約8與50個胺基酸殘基之間(較佳介於約10與20個胺基酸殘基之間)。
本文中所使用之術語"免疫黏附素"表示組合異源蛋白("黏附素")之結合特異性與免疫球蛋白恆定域之效應功能的抗體樣分子。在結構上，免疫黏附素包含具有所需結合特異性之不同於抗體之抗原辨識及結合位點的(亦即為"異源"的)胺基酸序列與免疫球蛋白恆定域序列之融合體。免疫黏附素分子之黏附素部分通常為至少包含受體或配位體之結合位點的鄰接胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可獲自任何免疫球蛋白，諸如IgG－1、IgG－2、IgG－3或IgG－4亞型、IgA(包括lgA－1及IgA－2)、IgE、 IgD或IgM。Ig融合體較佳包括本文所述之多肽或抗體結構域替代lg分子內至少一個可變區之取代。在一特別較佳實施例中，免疫球蛋白融合體包括IgG1分子之鉸鏈區、CH 2區及CH 3區，或鉸鏈區、CH 1區、CH 2區及CH 3區。關於免疫球蛋白融合體之產生，亦參見1995年6月27日頒布之美國專利第5,428,130號。舉例而言，本文中適用作適用於組合療法之第二藥劑之免疫黏附素包括包含BLyS受體之BLyS結合部分，而無BR3、TACI或BCMA跨膜融合至免疫球蛋白序列之恆定域的多肽。
"融合蛋白"及"融合多肽"係指具有共價連接在一起之兩個部分之多肽，其中各部分為具有不同特性之多肽。該特性可為生物特性，諸如活體外或活體內活性。該特性亦可為簡單化學或物理特性，諸如與靶分子結合、催化反應等。兩個部分可直接由單一肽鍵或經由肽連接子於閱讀框架中彼此連接。
"穩定"調配物為在儲存時其中之蛋白質基本上保持其物理及化學穩定性及完整性之調配物。量測蛋白質穩定性之各種分析技術可自此項技術中獲得且係論述於Peptide and Protein Drug Delivery ,247－301,Vincent Lee編，Marcel Dekker,Inc.,New York,New York,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev. 10 ：29－90(1993)中。可在選定之溫度下量測穩定性歷時選定之時間段。為達成快速篩檢，可將調配物保持在40℃下歷時2週至1個月，於該時間量測穩定性。當將調配物儲存在2－8℃下時，一般調配物應在 30℃或40℃下穩定歷時至少1個月及/或在2－8℃下穩定歷時至少2年。當將調配物儲存在30℃下時，一般調配物應在30℃下穩定歷時至少2年，及/或在40℃下穩定歷時至少6個月。舉例而言，可使用儲存期間之凝集程度作為蛋白質穩定性之指示。因此，"穩定"調配物可為小於約10%且較佳小於約5%之蛋白質以凝集體形式存在於調配物中之調配物。在其他實施例中，可測定調配物儲存期間凝集物形成之任何增加。
"復水"調配物為藉由將凍乾蛋白質或抗體調配物溶解於稀釋劑中以使得蛋白質完全分散而製備之調配物。復水調配物適用於投與(例如非經腸投與)待以所關注蛋白質治療之患者且在本發明之某些實施例中可為適用於皮下投與之調配物。
"等滲"調配物為具有與人類血液基本上相同之滲透壓之調配物。等滲調配物一般具有約250至350 mOsm之滲透壓。術語"低滲"描述滲透壓低於人類血液之調配物。相應地，使用術語"高滲"描述滲透壓高於人類血液之調配物。例如可使用蒸氣壓或冰凍型滲透壓計來量測等滲性。由於添加鹽及/或緩衝劑，本發明之調配物為高滲調配物。
本文中所使用之"載劑"包括在所採用之劑量及濃度下對曝露其中之細胞或哺乳動物無毒的醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。通常，生理上可接受之載劑為pH值緩衝水溶液。生理上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞 血酸；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他醣，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽平衡離子，諸如鈉離子；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM 、聚乙二醇(PEG)及PLURONICSTM 。
"包裝插頁 "係指通常包括於商業藥劑包裝中的說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症、待與包裝產品組合之其他藥劑及/或關於使用該等藥劑之警告等之資訊。
"醫藥學上可接受之酸 "包括在調配其之濃度及方式下無毒之無機酸及有機酸。舉例而言，合適無機酸包括鹽酸、高氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亞磺酸、對胺基苯磺酸、磷酸、碳酸等。合適有機酸包括直鏈及支鏈烷基、芳族、環狀、環脂族、芳脂族、雜環、飽和、不飽和、一元、二元及三元羧酸，包括(例如)甲酸、乙酸、2－羥基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、第三丁基乙酸、鄰胺基苯甲酸、丙酸、2－羥基丙酸、2－氧代丙酸、丙二酸、環戊烷丙酸、環戊烷丙酸、3－苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3－(4－羥基苄醯基)苯甲酸、2－乙醯氧基－苯甲酸、抗壞血酸、肉桂酸、十二基硫酸、硬脂酸、黏康酸、扁桃酸、丁二酸、恩波酸(embonic acid)、反丁烯二 酸、蘋果酸、順丁烯二酸、羥基順丁烯二酸、丙二酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、乙二醇酸、醣酸、葡糖酸、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、丁二酸、水楊酸、鄰苯二甲酸、帕莫酸(palmoic acid)、棕櫚酸、硫氰酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2－乙烷二磺酸、2－羥基乙烷磺酸、苯磺酸、4－氯苯磺酸、萘－2－磺酸、對甲苯磺酸、樟腦磺酸、4－甲基雙環[2,2,2]－辛－2－烯－1－羧酸、葡糖庚酸、4,4'－亞甲基雙－3－(羥基－2－烯基－1－羧酸)、羥基萘酸。
"醫藥學上可接受之鹼"包括在調配其之濃度及方式下無毒之無機鹼及有機鹼。舉例而言，合適鹼包括由形成無機鹼之金屬(諸如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、銨、鐵、鋅、銅、錳、鋁)形成之鹼、N－甲基葡萄胺、嗎啉、哌啶及包括第一胺、第二胺及第三胺、經取代之胺、環狀胺及鹼性離子交換樹脂[例如N(R')4 ＋ (其中R'獨立為H或C1－4 烷基，例如銨，Tris)]之有機無毒鹼，例如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2－二乙基胺基乙醇、三甲胺、二環己胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡鹼、普魯卡因(procaine)、海卓胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡糖胺、甲基葡萄胺、可可豆鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、N－乙基哌啶、多元胺樹脂及其類似物。
特別較佳之有機無毒鹼為異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己胺、膽鹼及咖啡鹼。
本發明可使用之額外醫藥學上可接受之酸及鹼包括源自胺基酸(例如組胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、天冬胺酸、麩 胺酸、離胺酸及天冬醯胺酸)之彼等酸及鹼。
"醫藥學上可接受之 "緩衝劑及鹽包括源自上述酸及鹼之酸加成鹽及鹼加成鹽之彼等緩衝劑及鹽。特定緩衝劑及/或鹽包括組胺酸、丁二酸鹽及乙酸鹽。
"醫藥學上可接受之糖 "為當與所關注蛋白質組合時在儲存時顯著防止或降低蛋白質之化學及/或物理不穩定性之分子。當意欲將調配物凍乾且接著復水時，亦可將"醫藥學上可接受之糖"稱為"凍乾保護劑"。例示性糖及其對應糖醇包括：胺基酸，諸如麩胺酸單鈉或組胺酸；甲胺，諸如甜菜鹼；易溶鹽(lyotropic salt)，諸如硫酸鎂；多元醇，諸如三元或更高分子量之糖醇，例如甘油、葡聚糖、赤藻糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；PLURONICS及其組合。額外例示性凍乾保護劑包括甘油及明膠，及糖，蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖及水蘇糖。還原糖之實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖及乳酮糖。非還原糖之實例包括選自糖醇及其他直鏈多元醇之多羥基化合物之非還原糖苷。較佳糖醇為單糖苷，尤其藉由還原二醣(諸如乳糖、麥芽糖、乳酮糖及麥芽酮糖)獲得之彼等化合物。糖苷側基可為葡萄糖苷或半乳糖苷。糖醇之額外實例為葡糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及異麥芽酮糖。較佳醫藥學上可接受之糖為非還原糖海藻糖或蔗糖。將醫藥學上可接受之糖以"保護量"添加至調配物中(例如預凍乾)，其意謂蛋白質在儲存期間(例如復水及儲存後)基本上保持其物 理及化學穩定性及完整性。
本文中所關注之"稀釋劑 "為醫藥學上可接受(對於投與人類而言安全且無毒)且適用於製備液體調配物(諸如於凍乾後復水之調配物)之稀釋劑。例示性稀釋劑包括無菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH值緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝生理食鹽水)、無菌生理食鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。在一替代實施例中，稀釋劑可包括鹽及/或緩衝劑之水溶液。
"防腐劑 "為可添加至本文中之調配物中以降低細菌活性之化合物。添加防腐劑可(例如)有助於產生多次使用(多劑量)調配物。可能之防腐劑之實例包括氯化十八基二甲基苄銨、氯化六羥季銨、氯苄烷銨(氯化烷基苄基二甲基銨之混合物，其中烷基為長鏈化合物)及苄索氯銨。其他類型之防腐劑包括芳族醇，諸如苯酚、丁醇及苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3－戊醇及間甲酚。本文中最佳防腐劑為苄醇。
"治療"係指經設計以改變所治療個體或細胞之自然過程之臨床介入，且可為達成預防目的或在臨床病理過程中進行。所需治療效應包括預防疾病出現或復發，預防轉移，降低疾病進展速率，改善或緩解疾病病況，及減輕或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體以延遲疾病或病症之發展。(例如)使用本發明細胞凋亡抗IgE抗體，若與IgE介導之病症相關之一或多種症狀得以減輕，則受檢者 得以成功"治療"。
"有效量 "係指至少在必需劑量下且在必需時段內有效達成所需或指定效應(包括治療或預防結果)之量。
"治療有效量 "為至少達成特定病症之可量測改良或預防所需之最低濃度。本文中之治療有效量可根據諸如患者之疾病病況、年齡、性別及體重以及抗體引發個體所需反應之能力之因素而變化。治療有效量亦為治療有益效應優於抗體之任何毒性或不利效應的量。"預防有效量"係指在必需劑量下且在必需時間段內有效達成所需預防結果之量。通常但不一定，因為預防劑量係在發生疾病之前或在疾病早期用於受檢者，因此預防有效量可低於治療有效量。
"長期 "投藥係指與短期模式相對連續投與藥劑以便維持初始治療效應(活性)歷時延長之時間段。"間歇"投藥為並非不中斷連續進行，而實際上循環之治療。
用於治療目的之"哺乳動物"係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜及農場動物及動物園動物、體育動物或寵物，諸如大、馬、兔、牛、豬、倉鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、貓等。哺乳動物較佳為人類。
術語"醫藥調配物 "係指呈允許活性成份之生物活性有效之形式且不含有對投與調配物之受檢者具有不可接受之毒性之額外組份的製劑。該等調配物為無菌的。
"無菌 "調配物為無菌的或不含所有活微生物及其孢子。
本文中所使用之術語"約"係指熟習此技術領域者易於知曉之個別值之常見誤差範圍。
本文中所使用之"抗組織胺劑 "為拮抗組織胺生理效應之藥劑。組織胺與其受體H1 及H2 之結合產生特徵性過敏症狀及效應，或發癢、發紅、腫脹等。許多抗組織胺劑藉由阻斷組織胺與其受體(H1 ，H2 )之結合而起作用；然而咸信其他抗組織胺劑藉由抑制組織胺之釋放而起作用。抗組織胺劑之實例為氯芬尼拉明(chlorpheniramine)、苯海拉明(diphenhydramine)、異丙嗪(promethazine)、色甘酸鈉(cromolyn sodium)、阿司咪唑(astemizole)、順丁烯二酸哌吡庚啶(azatadine maleate)、順丁烯二酸溴苯那敏(bropheniramine maleate)、順丁烯二酸氯苯吡醇胺(carbinoxamine maleate)、鹽酸西替利嗪(cetirizine hydrochloride)、反丁烯二酸氯馬斯汀(clemastine fumarate)、鹽酸賽庚啶(cyproheptadine hydrochloride)、順丁烯二酸右溴苯那敏(dexbrompheniramine maleate)、順丁烯二酸右氯苯那敏(dexchlorpheniramine maleate)、茶苯海明(dimenhydrinate)、鹽酸苯海拉明(diphenhydramine hydrochloride)、丁二酸杜克西拉明(doxylamine succinate)、鹽酸非索那定(fexofendadine hydrochloride)、鹽酸特非那丁(terphenadine hydrochloride)、鹽酸羥嗪(hydroxyzine hydrochloride)、氯雷他定(loratidine)、鹽酸敏克靜(meclizine hydrochloride)、檸檬酸曲吡那敏(tripelannamine citrate)、鹽酸曲吡那敏(tripelennamine hydrochloride)、鹽酸曲普利啶(triprolidine hydrochloride)。
本文中所使用之"支氣管擴張劑 "描述拮抗或逆轉支氣管收縮之藥劑，支氣管收縮為通常發生於早期哮喘反應過程中，致使肺活量降低及氣促之生理事件。支氣管擴張劑實例包括腎上腺素，廣效α－腎上腺素及廣效β－腎上腺素，及β－腎上腺素、沙丁胺醇(albuterol)、吡布特羅(pirbuterol)、奧西那林(metaproterenol)、沙美特羅(salmeterol)及異他林(isoetharine)。支氣管擴張亦可經由投與黃嘌呤(包括胺茶鹼及茶鹼)達成。
本文中所使用之"糖皮質激素 "描述具有消炎活性之基於類固醇之藥劑。糖皮質激素常用以削減晚期哮喘反應。糖皮質激素之實例包括強的松(prednisone)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、氟尼縮松(flunisolide)、倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松曲安西龍(desamehasone tramcinolone)、醋酸氟氫可的松(fludrocortisone acetate)、氟尼縮松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、氫化可的松(hydrocortisone)、強的松龍(prednisolone)[包括甲潑尼龍(methylprednisolone)(例如SOLU－MEDROL甲潑尼龍丁二酸鈉)及曲安西龍(triamcinolone)。
本文中所使用之"非類固醇消炎藥 "或"NSAID "描述具有消炎活性但非基於類固醇之藥劑。NSAID之實例包括阿西美辛(acematacin)、乙醯胺苯酚(acetaminophen)、阿司匹林 (aspirin)、阿紮丙宗(azapropazone)、貝諾酯(benorylate)、溴芬酸鈉(bromfenac sodium)、環加氧酶(COX)－2抑制劑(諸如GR 253035、MK966、賽利克西(celecoxib)(CELEBREX；4－(5－(4－甲基苯基)－3－(三氟甲基)－1H－吡唑－1－基)苯－磺醯胺)及伐地考昔(valdecoxib)(BEXTRA))、雙氯芬酸(diclofenac)、雙氯芬酸緩釋劑(diclofenac retard)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、二氟尼柳(diflunisal)、依託度酸(etodolac)、芬布芬(fenbufen)、非諾洛芬鈣(fenoprofen calcium)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、布洛芬緩釋劑(ibuprofen retard)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、美洛芬鈉(meclofenamate sodium)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美儂西康(meloxicam)(MOBIC)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、萘普生鈉(naproxen sodium)、羥布宗(oxyphenbutazone)、保泰松(phenylbutzone)、吡羅昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、替諾昔康(tenoxicam)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)、托美丁(tolmetin)、托美丁鈉(tolmetin sodium)，包括其鹽及衍生物等。
術語"IgE介導之病症 "包括異位性病症，其特徵為對許多常見天然產生之吸入及攝入抗原作出免疫反應之一般遺傳傾向及IgE抗體之不斷產生。特定異位性病症包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎(結膜炎)、異位性皮膚炎、食物過敏、過敏反應、接觸性皮炎、過敏性胃腸病、過敏性支氣管肺麴菌病及過敏性紫癜(Henoch－Schnlein)。異位性患 者通常具有多種過敏症，意謂其具有對多種環境過敏原之IgE抗體及源自多種環境過敏原之症狀，該等環境過敏原包括季節過敏原、常年性過敏原及職業性過敏原。季節性過敏原之實例包括花粉(例如草、樹、裸麥、梯牧草、豚草)，而常年性過敏原實例包括真菌(例如黴菌、黴菌孢子)、羽毛、動物(例如寵物或其他動物皮屑)及昆蟲(例如塵蟎)殘骸。職業性過敏原之實例亦包括動物(例如小鼠)及植物抗原以及藥物、清潔劑、金屬及免疫增強劑，諸如異氰酸酯。可引起IgE介導之反應之非抗原特異性刺激包括感染、刺激物(諸如煙、燃燒煙、柴油廢氣顆粒及二氧化硫)、運動、冷及情緒壓力。具有特定遺傳背景之異位性及非異位性個體之特定超敏反應可由曝露於食物(例如豆類、花生)中之蛋白質、毒液(例如昆蟲、蛇)、疫苗、激素、抗血清、酶、乳汁、抗生素、肌肉鬆弛劑、維生素、細胞毒素、鴉片劑及多醣(諸如糊精、右旋糖酐鐵及聚明膠肽)而產生。
似乎為IgE所介導且可使用本發明調配物治療之與IgE含量升高相關的其他病症包括：共濟失調毛細血管擴張、丘－施症候群(Churg－Strauss Syndrome)、濕疹、腸炎、胃腸病、移植物抗宿主反應、高IgE(Job's)症候群、超敏(例如過敏性超敏、念珠菌病、脈管炎)、IgE骨髓瘤、發炎性腸道疾病(例如克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、不確定結腸炎及感染性結腸炎)、黏膜炎(例如口黏膜炎、胃腸黏膜炎、鼻黏膜炎及直腸炎)、壞死性小腸結腸 炎及食管炎、寄生蟲疾病(例如錐蟲病)、超敏性脈管炎、蕁麻疹及維－奧二氏症候群。
此外，無論病症自身是否與IgE升高相關均可藉由降低IgE含量來治療，且因此應視為在"IgE介導之病症"範疇內之病症包括：阿狄森氏病(Addison's disease)(慢性腎上腺皮質功能不全)、脫髮、遺傳性血管性水腫、血管性水腫(班氏病(Bannister's disease)、血管神經性水腫)、強直性脊椎炎、再生障礙性貧血、動脈炎、澱粉樣變性病、免疫病症(諸如自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性卵巢炎、自體免疫性睾丸炎、自體免疫性多內分泌腺障礙、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性血球減少、自體免疫性絲球體腎炎)、白塞氏病(Behcet's disease)、支氣管炎、伯格氏病(Buerger's disease)、大疱性類天疱瘡、卡氏症候群(Caplan's syndrome)(類風濕性肺塵埃沈著病)、心臟炎、口炎性腹瀉、齊－希二氏症候群(Chediak－Higashi syndrome)、慢性阻塞性肺病(COPD)、科－里二氏症候群(Cogan－Reese syndrome)(虹膜角膜內皮症候群)、CREST症候群、疱疹樣皮炎(杜林病(Duhring's disease))、糖尿病、嗜伊紅細胞筋膜炎、嗜伊紅細胞腎炎、鞏膜表層炎、外源性過敏性肺泡炎、家族性突發性多漿膜炎、費爾提氏症候群(Felty's syndrome)、纖維化肺泡炎、絲球體腎炎、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、粒性白細胞減少症、肉芽腫、肉芽腫病、肉芽腫肌炎、葛端夫茲氏病(Graves' disease)、古立安－白端症候群(Guillain－Barre syndrome)(多發性神經炎)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)(淋巴結樣甲狀腺腫)、血色素沈著症、組織細胞增生、嗜伊紅性白細胞增多症候群、大腸急躁症、幼年型關節炎、角膜炎、麻風、紅斑性狼瘡、萊氏病(Lyell's disease)、萊姆病(Lyme disease)、混合性結締組織病、單神經炎、多發性單神經炎、馬可－威爾斯症候群(Muckle－Wells syndrome)、黏膜皮膚淋巴症候群(川崎病(Kawasaki's disease))、多中心網狀組織細胞增多症、多發性硬化症、重症肌無力、蕈樣肉芽腫病、脂膜炎、類天疱瘡、天疱瘡、心包炎、多神經炎、結節性多動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、肺部關節炎、肺腺瘤病、肺纖維化、復發性多軟骨炎、風濕熱、類風濕性關節炎、鼻竇炎(竇炎)、類肉瘤病、鞏膜炎、硬化性膽管炎、血清病、西澤里症候群(Szary syndrome)、修格蘭氏症候群(Sjgren's syndrome)、史蒂芬－瓊森症候群(Stevens－Johnson syndrome)、全身性肥大細胞增多症、移植排斥反應、血小板減少性紫癜、胸腺淋巴發育不全、葡萄膜炎、白斑症、韋格納肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)。
本文中之"自體免疫病症 "為出現於且針對個體自身組織或器官之疾病或病症或其共分離形式或表現形式或由其引起之病狀。在許多此等自體免疫及炎性病症中，可存在許多臨床及實驗室標誌，包括(但不限於)高丙球蛋白血症、高含量自體抗體、組織中之抗原抗體複合物沈積、源於皮質類固醇或免疫抑制治療之益處及受影響組織中之淋巴樣 細胞聚集體。在不受限於關於B細胞介導之自體免疫病症之任何理論下，咸信B細胞經由多條機械路徑顯示人類自體免疫疾病之病原效應，該等路徑包括自體抗體產生、免疫複合物形成、樹突狀細胞及T細胞活化、細胞激素合成、趨化激素直接釋放及提供異位新淋巴生成之病灶。此等路徑各自可以不同程度參與自體免疫疾病之病理。
"自體免疫疾病 "可為器官特異性疾病(亦即免疫反應特別針對一種器官系統，諸如內分泌系統、造血系統、皮膚、心肺系統、胃腸及肝臟系統、腎系統、甲狀腺、耳、神經肌肉系統、中樞神經系統等)或可影響多個器官系統之全身性疾病(例如全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、多肌炎等)。較佳該等疾病包括自體免疫風濕性病症(諸如RA、修格蘭氏症候群、硬皮病、狼瘡諸如SLE及狼瘡腎炎、多肌炎－皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗體症候群及牛皮癬性關節炎)、自體免疫性胃腸及肝臟病症(諸如發炎性腸疾病(例如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)、自體免疫性胃炎及惡性貧血、自體免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化症、原發性硬化性膽管炎及乳糜瀉)、脈管炎(諸如ANCA陰性脈管炎及ANCA相關脈管炎，包括丘－施脈管炎、韋格納肉芽腫病及顯微性(microscopic)多血管炎)、自體免疫性神經病症(諸如多發性硬化症、眼陣攣－肌陣攣症候群、重症肌無力、視神經脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)及自體免疫性多發性神經病)、腎病症(諸如絲球體腎炎、 古德帕斯徹氏綜合症及伯傑氏病)、自體免疫性皮膚病症(諸如牛皮癬、蕁麻疹、尋常天疱瘡、大疱性類天疱瘡及皮膚紅斑性狼瘡)、血液學病症(諸如血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血後紫癜及自體免疫性溶血性貧血)、動脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自體免疫性聽力疾病(諸如內耳疾病及聽力喪失)、白塞氏病、雷諾氏症候群(Raynaud's syndrome)、器官移植及自體免疫性內分泌病症(諸如糖尿病相關自體免疫疾病諸如胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病及自體免疫性甲狀腺病(例如葛瑞夫茲氏病及甲狀腺炎))。更佳該等疾病包括例如RA、潰瘍性結腸炎、ANCA相關脈管炎、狼瘡、多發性硬化症、修格蘭氏症候群、葛瑞夫茲氏病、IDDM、惡性貧血、甲狀腺炎及絲球體腎炎。
本文中所使用之術語"細胞毒性劑 "係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語包括放射性同位素(例如At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 及Lu之放射性同位素)，及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素或其片段。
"化學治療劑 "為適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烷化劑，諸如塞替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴 (meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基三聚氰胺包括六甲密胺、曲他胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲密胺；乙醯精寧(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ－9－四氫大麻酚(屈大麻酚、MARINOL)；β－拉帕酮(beta－lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(包括合成類似物拓朴替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT－11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙醯基喜樹鹼、東莨菪素(scopolectin)及9－胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；培美曲唑(pemetrexed)；卡利斯坦汀(callystatin)；CC－1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；足葉草酸(podophyllinic acid)；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycins)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成類似物，KW－2189及CB1－TM1)；艾榴素(eleutherobin)；盤克斯坦汀(pancratistatin)；TLK－286；CDP323，一種口服α4整合素抑制劑；沙考的汀(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、苯乙醯膽固醇氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、 曲洛磷胺(trofosfamide)、脲嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及拉甯司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如刺孢黴素(calicheamicin)，尤其刺孢黴素γII及刺孢黴素ωI1(參見(例如)Nicolaou等人，Angew.Chem Intl.Ed.Engl. ,33：183－186(1994))；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；艾斯帕米辛(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、重氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6－重氮基－5－側氧基－L－正白胺酸、阿黴素(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、嗎啉基－阿黴素、氰基嗎啉基－阿黴素、2－吡咯啉－阿黴素、鹽酸阿黴素脂質體注射液(DOXIL)及脫氧阿黴素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(諸如絲裂黴素C、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素 (peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegafur)(UFTORAL)、卡西他濱(capecitabine)(XELODA)、埃博黴素(epothilone)及5－氟尿嘧啶(5－FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6－巰基嘌呤(6－mercaptopurine)、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6－氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、脫氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷及伊馬替尼(imatinib)(2－苯基胺基嘧啶衍生物)以及其他c－Kit抑制劑；抗腎上腺素，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；乙炔尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺 (demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗利散(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；羅尼達寧(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托脈腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；硝拉維林(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2－乙醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"－三氯三乙胺；單端孢黴烯(尤其T－2毒素、弗納庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及胺癸叮(anguidine))；胺基甲酸乙酯；長春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖(arabinoside)("Ara－C")；塞替派；紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL)、白蛋白工程化之太平洋紫杉醇奈米顆粒調配物(ABRAXANE)及歐洲紫杉醇(doxetaxel)(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；6－硫代鳥嘌呤； 巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼(vinblastine)(VELBAN)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP－16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN)；奧賽力鉑(oxaliplatin)；盧考弗文(leucovovin)；長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE)；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，諸如視黃酸；以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上兩種或兩種以上之組合，諸如CHOP，其為環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼及強的松龍組合療法之縮寫；及FOLFOX，其為使用奧賽力鉑(ELOXATINTM )與5－FU及盧考弗文組合之治療方案之縮寫。
此定義中亦包括用以調控、降低、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素之作用的抗激素劑，且通常為全身治療之形式。其可為激素自身。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX三苯氧胺)、雷洛昔芬(EVISTA)、曲洛昔芬(droloxifene)、4－羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；抗孕酮；雌激素受體下調劑(ERD)；雌激素受體拮抗劑，諸如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX)；用以抑制或關閉卵 巢之藥劑，例如促黃體激素釋放激素(LHRH)促效劑，諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON及ELIGARD)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)及曲特瑞林(tripterelin)；抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及抑制芳香酶之芳香酶抑制劑，其調控腎上腺中之雄激素產生，諸如4(5)－咪唑、胺魯米特(aminoglutethimide)、甲地孕酮乙酸酯(megestrol acetate)(MEGASE)、依西美坦(AROMASIN)、弗米斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole)(RIVISOR)、雷曲唑(letrozole)(FEMARA)及安美達錠(anastrozole)(ARIMIDEX)。此外，該化學治療劑定義包括雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸鹽(etidronate)(DIDROCAL)、NE－58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(zoledronate)(ZOMETA)、阿侖膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3－二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制黏附細胞增殖中所涉及之信號轉導路徑中基因表現之彼等反義寡核苷酸，諸如PKC－α、Raf、H－Ras及表皮生長因子受體(EGF－R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及VAXID疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN)；抗雌激素，諸如氟維司群；Kit抑制劑，諸如伊馬替尼(imatinib)或EXEL－0862(酪胺酸激酶抑制劑)；EGFR抑制劑，諸如埃羅替尼(erlotinib)或西妥昔單抗(cetuximab)；抗VEGF抑制劑，諸如貝伐單抗(bevacizumab)；阿雷諾替康(arinotecan)；rmRH(例如ABARELIX)；拉帕替尼(lapatinib)及二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB－2及EGFR雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為GW572016)；17AAG(格爾德黴素衍生物(geldanamycin derivative)，亦即熱休克蛋白(Hsp)90毒物)及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
"生長抑制劑 "係指抑制細胞生長之化合物或組合物，該細胞之生長視活體外或活體內受體活化而定。因此，生長抑制劑包括顯著降低S期中受體相關細胞百分比之藥劑。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進程(在除S期以外之時期)之藥劑，諸如誘發G1停滯及M期停滯之藥劑。傳統M期阻斷劑包括長春鹼類及長春花生物鹼(vinca alkaloids)(長春新鹼及長春鹼)、紫杉烷(taxanes)及拓撲異構酶II抑制劑(諸如阿黴素、表柔比星、道諾黴素、依託泊苷及博來黴素(bleomycin))。使G1停滯之彼等藥劑亦擴溢以引起S期停滯，例如DNA烷基化劑，諸如他莫西芬、強的松、達卡巴嗪、二氯甲基二乙胺、順鉑、甲胺喋呤、5－氟尿嘧啶及阿拉伯糖苷。其他資訊可見於Murakami等人之The Molecular Basis of Cancer ,Mendelsohn及Israel編，第 1章，題為"Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"(WB Saunders：Philadelphia,1995)，尤其第13頁中。紫杉烷(太平洋紫杉醇及歐洲紫杉醇)皆為源自紫杉樹之抗癌藥物。源自歐洲紫杉之歐洲紫杉醇(TAXOTERE,Rhone－Poulenc Rorer)為半合成太平洋紫杉醇類似物(TAXOL,Bristol－Myers Squibb)。
術語"細胞激素 "為對由一個細胞群體所釋放並作為細胞間介體作用於另一細胞之蛋白質的通稱。該等細胞激素之實例為淋巴激素、單核球激素；介白素(IL)，諸如IL－1、IL－1α、IL－2、IL－3、IL－4、IL－5、IL－6、IL－7、IL－8、IL－9、IL－11、IL－12、IL－13、IL－15，包括PROLEUKINrIL－2；腫瘤壞死因子，諸如TNF－α或TNF－β；及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體(KL)。本文中所使用之術語細胞激素包括來自天然源或來自重組性細胞培養物之蛋白質及原生序列細胞激素之生物學活性等效物，其包括以合成方式製備之小分子實體及醫藥學上可接受之衍生物及其鹽。
術語"激素 "係指通常由具有導管之腺器官分泌之多肽激素。激素包括(例如)：生長激素，諸如人類生長激素、N－甲硫胺醯基人類生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；鬆弛素；雌二醇；激素替代療法；雄激素，諸如二甲睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)或睾內脂酮(testolactone)；前鬆弛素；糖蛋白激素，諸如促卵泡激素 (FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體激素(LH)；促乳素、胎盤生乳素、小鼠促性腺激素相關肽、促性腺激素釋放激素；抑制素；活化素；苗勒抑制物(mullerian－inhibiting substance)；及血小板生成素。本文中所用之術語激素包括來自天然源或來自重組細胞培養物之蛋白質及原生序列激素之生物學活性等效物，其包括以合成方式產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。
術語"生長因子 "係指促進生長之蛋白質，且包括(例如)肝生長因子；纖維母細胞生長因子；血管內皮生長因子；神經生長因子，諸如NGF－β；血小板衍生之生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF－α及TGF－β；胰島素樣生長因子I及II；紅血球生成素(EPO)；骨生成誘發因子；干擾素，諸如干擾素α、β及γ；及群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞－CSF(M－CSF)；粒細胞－巨噬細胞CSF(GM－CSF)；及粒細胞－CSF(G－CSF)。本文中所使用之術語生長因子包括來自天然源或來自重組性細胞培養物之蛋白質及原生序列生長因子之生物學活性等效物，其包括以合成方式製備之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。
術語"整合素 "係指使兩個細胞皆結合至胞外基質並對胞外基質作出應答且涉及於諸如傷口癒合、細胞分化、腫瘤細胞復位及細胞凋亡之多種細胞功能中的受體蛋白。其為涉及於細胞－胞外基質及細胞－細胞相互作用中之細胞黏附受體大家族的一部分。功能性整合素由非共價結合之兩個跨膜醣蛋白次單位(稱為α及β)組成。α次單位彼此均共有 一定同源性，β次單位亦如此。受體總含有一條α鏈及一條β鏈。實例包括α6β1、α3β1、α7β1、LFA－1等。本文中所使用之術語"整合素 "包括來自天然源或來自重組性細胞培養物之蛋白質及原生序列整合素之生物學活性等效物，其包括以合成方式產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。
本文中將"TNF拮抗劑 "定義為降低、阻斷、抑制、消除或干擾活體外、原位及/或較佳活體內TNFα活性之分子。合適TNF拮抗劑亦可降低、阻斷、消除、干擾、防止及/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白質合成、TNFα釋放、TNFα受體信號轉導、膜TNFα裂解、TNFα活性、TNFα產生及/或合成。該等TNF拮抗劑包括(但不限於)與TNFα特異性結合，在與TNFα結合之後破壞或消耗哺乳動物體內表現TNFα之細胞及/或干擾彼等細胞之一或多種功能的抗TNFα抗體、其抗原結合片段、其特定突變體或結構域；可溶TNF受體(例如p55、p70或p85)或其片段、融合多肽；小分子TNF拮抗劑，例如TNF結合蛋白I或II(TBP－I或TBP－II)、奈瑞利單抗(nerelimonmab)、CDP－571、英利昔單抗(infliximab)、伊那西普(enteracept)(ENBRELTM )、阿達木單抗(adalimulab)(HUMIRATM )、CDP－571、CDP－870、阿非莫單抗(afelimomab)、來那西普(lenercept)及其類似物，其抗原結合片段及與TNFα特異性結合之受體分子；防止及/或抑制TNFα合成、TNFα釋放或其對靶細胞作用之化合物，諸如沙力度胺(thalidomide)、替尼達普(tenidap)、磷 酸二酯酶抑制劑(例如己酮可可鹼(pentoxifylline)及咯利普蘭(rolipram))、A2b腺核苷受體促效劑及A2b腺核苷受體增強劑；防止及/或抑制TNFα受體信號轉導之化合物，諸如絲裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制劑；阻斷及/或抑制膜TNFα裂解之化合物，諸如基質金屬蛋白酶抑制劑；阻斷及/或抑制TNFα活性之化合物，諸如血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑(例如卡托普利(captopril))；及阻斷及/或抑制TNFα產生及/或合成之化合物，諸如MAP激酶抑制劑。較佳拮抗劑包含抗體。
"腫瘤壞死因子α "、"TNFα"或"TNFα"係指包含Pennica等人，Nature ,312：721(1984)或Aggarwal等人，JBC ,260：2345(1985)之胺基酸序列之人類TNFα分子。本文中之"TNFα抑制劑"為一般經由與TNFα結合且中和其活性而在一定程度上抑制TNFα生物功能之藥劑。本文中TNFα抑制劑之實例包括依那西普(ENBREL)、英利昔單抗(REMICADE)及阿達木單抗(HUMIRATM )。
本文中之"整合素拮抗劑或抗體"之實例包括LFA－1抗體，諸如可自Genentech購得之依法利珠單抗(efalizumab)(RAPTIVA)；或α4整合素抗體，諸如可自Biogen購得之那他利珠單抗(natalizumab)(ANTEGREN)；或二氮環苯丙胺酸衍生物(WO 2003/89410)；苯丙胺酸衍生物(WO 2003/70709、WO 2002/28830、WO 2002/16329及WO 2003/53926)；苯基丙酸衍生物(WO 2003/10135)；烯胺衍生物(WO 2001/79173)；丙酸衍生物(WO 2000/37444)； 烷酸衍生物(WO 2000/32575)；經取代之苯基衍生物(美國專利第6,677,339號及第6,348,463號)；芳族胺衍生物(美國專利第6,369,229號)；ADAM解整合素域多肽(US 2002/0042368)；αvβ3整合素之抗體(EP 633945)；氮雜橋接雙環胺基酸衍生物(WO 2002/02556)等。
術語"免疫抑制劑 "係指用以抑制或遮蔽本文中所治療之受檢者之免疫系統的物質。其包括抑制細胞激素產生、下調或抑制自體抗原表現或遮蔽MHC抗原之物質。該等藥劑之實例包括2－胺基－6－芳基－5－取代之嘧啶(參見U.S.4,665,077)；非類固醇消炎藥(NSAID)；更昔洛韋(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮質激素(諸如皮質醇或醛甾酮)、消炎劑(諸如環加氧酶抑制劑、5－脂氧合酶抑制劑或白三烯素受體拮抗劑)；嘌呤拮抗劑，諸如硫唑嘌呤(azathioprine)或嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil)(MMF)；曲卡德(trocade)(Ro32－355)；外周σ受體拮抗劑，諸如ISR－31747；烷化劑，諸如環磷醯胺；溴隱定(bromocryptine)；達那唑(danazol)；胺苯碸(dapsone)；戊二醛(其遮蔽MHC抗原，如美國U.S.4,120,649所述)；MHC抗原及MHC片段之抗遺傳型抗體；環孢素A；類固醇，諸如皮質類固醇或糖皮類固醇或糖皮質激素類似物，例如強的松、甲潑尼龍(包括SOLU－MEDROL甲潑尼龍丁二酸鈉)、利美索龍(rimexolone)及地塞米松；二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如甲胺喋呤(口服或皮下)；抗瘧疾劑，諸如氯喹及羥氯喹；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特 (leflunomide)；細胞激素釋放抑制劑，諸如SB－210396及SB－217969單株抗體及MHC II拮抗劑，諸如ZD2315；PG1受體拮抗劑，諸如ZD4953；VLA4黏附阻斷劑，諸如ZD7349；抗細胞激素或抗細胞激素受體抗體，包括抗干擾素α、β或γ抗體、抗TNFα抗體(英利昔單抗(REMICADE)或阿達木單抗)、抗TNFα免疫黏附素(依那西普)、抗TNFβ抗體、介白素－1(IL－1)阻斷劑(諸如重組HuIL－1Ra及IL－1B抑制劑、抗介白素－2(IL－2)抗體及抗IL－2受體抗體)；IL－2融合毒素；抗L3T4抗體；來氟米特；異源抗淋巴細胞球蛋白；OPC－14597；NISV(免疫反應改質劑)；必需脂肪酸，諸如γ亞麻酸或十二碳五烯酸；CD－4阻斷劑、泛－T抗體，較佳抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；協同刺激改質劑(例如CTLA4－Fc融合體，亦稱作ABATACEPTTM )；抗介白素6(IL－6)受體抗體及拮抗劑；抗LFA－1抗體，包括抗CD11a及抗CD18抗體；含有LFA－3結合域之可溶性肽(WO 1990/08187)；鏈激酶；IL－10；抗IL－4拮抗劑、抗IL－13拮抗劑及雙特異性抗IL－4/IL－13拮抗劑抗體、轉化生長因子β(TGFβ)；鏈球菌去氧核糖核酸酶；來自宿主之RNA或DNA；FK506；RS－61443；恩莫單抗(enlimomab)；CDP－855；PNP抑制劑；CH－3298；GW353430；4162W94、苯丁酸氮芥；晶狀去氧精脈啉(deoxyspergualin)；雷帕黴素(rapamycin)；T細胞受體(US 5,114,721)；T細胞受體片段(Offner等人，Science,251：430－2(1991)；WO 1990/11294；Janeway,Nature,341： 482－483(1989)；及WO 1991/01133)；BAFF拮抗劑，諸如BAFF抗體及BR3抗體；zTNF4拮抗劑(Mackay及Mackay,Trends Immunol.,23：113－5(2002))；干擾T細胞輔助信號之生物藥劑，諸如抗CD40受體或抗CD40配位體(CD154)，包括CD40－CD40配位體之阻斷抗體(例如Durie等人，Science,261：1328－30(1993)；Mohan等人，J.Immunol.,154：1470－80(1995))及CTLA4－Ig(Finck等人，Science,265：1225－7(1994))；及T細胞受體抗體(EP 340,109)，諸如T10B9。本文中一些較佳免疫抑制劑包括環磷醯胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、來氟米特、MMF或甲胺喋呤(MTX)。
"改變病情之抗風濕性藥 "或"DMARD "包括(例如)氯喹、羥基氯喹、硫代苯酸金鈉、金諾芬(auranofin)、柳氮磺胺吡啶、甲胺喋呤、來氟米特、依那西普、英利昔單抗(及口服及皮下MTX)、硫唑嘌呤、D－青黴胺(D－penicillamine)、金鹽(口服)、金鹽(肌肉內)、二甲胺四環素、環孢菌素(例如環孢菌素A及局部環孢菌素)、葡萄球菌蛋白A(Goodyear及Silverman,J.Exp.Med.,197：1125－39(2003))，包括其鹽及衍生物等。
"B細胞 "為在骨髓內成熟之淋巴細胞，且包括原生B細胞、記憶B細胞或效應B細胞(漿細胞)。本文中之B細胞可為正常或非惡性細胞。
本文中之"B細胞表面標誌"或"B細胞表面抗原"為於B細胞表面上表現並可使用與其結合之拮抗劑靶向之抗原。例 示性B細胞表面標誌包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85及CD86白血球表面標誌(關於描述，參見The Leukocyte Antigen Facts Book ，第2版1997,Barclay等人編Academic Press,Harcourt Brace & Co.,New York)。其他B細胞表面標誌包括RP105、FcRH2、B細胞CR2、CCR6、P2X5、HLA－DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA及239287。與哺乳動物之其他非B細胞組織相比，較佳之B細胞表面標誌優先表現於B細胞上，且可表現於前驅B細胞及成熟B細胞上。最佳之該等標誌為CD20及CD22。
"CD20"抗原或"CD20"為見於超過90%之來自外周血液或淋巴器官之B細胞表面上的約35 kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在於正常B細胞以及惡性B細胞上，但不表現於幹細胞上。文獻中CD20之其他名稱包括"B淋巴細胞受限之抗原"及"Bp35"。CD20抗原係描述於(例如)Clark等人，Proc.Natl.Acad.Sci. (USA)82：1766(1985)中。
亦稱作BL－CAM或Lyb8之"CD22"抗原或"CD22"為具有約130(經還原)至140 kD(未還原)分子量之1型整體膜糖蛋白。其表現於B淋巴細胞之細胞質及細胞膜中。CD22抗原在大致與CD19抗原相同階段之B細胞淋巴細胞分化早期出 現。不同於其他B細胞標誌，CD22膜表現限於包含於成熟B細胞(CD22＋)與漿細胞(CD22－)之間的晚期分化階段。CD22抗原描述於(例如)Wilson等人，J.Exp.Med. 173：137(1991)及Wilson等人，J.Immunol. 150：5013(1993)中。
"與B細胞表面標誌結合之抗體"為在與B細胞表面標誌結合之後破壞或消耗哺乳動物體內之B細胞及/或干擾一或多種B細胞功能(例如藉由降低或阻止由B細胞引出之體液反應)之分子。抗體較佳能夠消耗以其治療之哺乳動物體內之B細胞(亦即降低循環B細胞含量)。該消耗可經由各種機制(諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)、抑制B細胞增殖及/或誘發B細胞死亡(例如經由細胞凋亡))來達成。
CD20抗體之實例包括：現稱為"利妥昔單抗(rituximab)("RITUXAN")之"C2B8"(美國專利第5,736,137號)；可自IDEC Pharmaceuticals,Inc.購得之命名為"Y2B8"或"替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)"(ZEVALIN)之釔－[90]標記之2B8鼠類抗體(美國專利第5,736,137號；1993年6月22日以寄存編號第HB11388號寄存在ATCC之2B8)；可自Corixa購得，亦稱作"托西莫單抗(Tositumomab)"，視情況經131 I標記以產生"131 I－B1"或"碘I131 托西莫單抗"抗體(BEXXARTM )之鼠類IgG2a"B1"(亦參見美國專利第5,595,721號)；鼠類單株抗體"1F5"(Press等人Blood 69(2)：584－591(1987))及其變異體，包括"構架貼補"或人類化1F5(WO 2003/002607,Leung,S.；ATCC寄存編號HB－96450)；鼠類2H7及嵌合 2H7抗體(美國專利第5,677,180號)；人類化2H7(WO 2004/056312(Lowman等人)及以下所列)；B細胞之細胞膜中之CD20分子處所靶向的HUMAX－CD20TM 完全人類高親和力抗體(Genmab,Denmark；參見例如,Glennie及van de Winkel,Drug Discovery Today 8：503－510(2003)及Cragg等人，Blood 101：1045－1052(2003))；列於WO 04/035607(Teeling等人)中之人類單株抗體；AME－133TM 抗體(Applied Molecular Evolution)；A20抗體或其變異體，諸如嵌合或人類化A20抗體(分別為cA20、hA20)(US 2003/0219433,Immunomedics)；及可自International Leukocyte Typing Workshop購得之單株抗體L27、G28－2、93－1B3、B－C1或NU－B2(Valentine等人，Leukocyte Typing III McMichael編，第440頁，Oxford University Press(1987))。本文中之較佳CD20抗體為嵌合、人類化或人類CD20抗體，更佳為利妥昔單抗(rituximab)、人類化2H7、嵌合或人類化A20抗體(Immunomedics)及HUMAX－CD20TM 人類CD20抗體(Genmab)。
本文中之術語"利妥昔單抗(rituximab)"或"RITUXAN"係指美國專利第5,736,137號中針對CD20抗原且命名為"C2B8"之遺傳工程化之嵌合鼠類/人類單株抗體，包括其保持與CD20結合之能力之片段。
單純出於本文中之目的且除非另外指明，否則"人類化2H7"係指人類化CD20抗體或其抗原結合片段，其中抗體有效地在活體內消耗靈長類動物B細胞。該抗體包括列於 US 2006/0062787及其圖中且包括形式114之彼等抗體，該抗體之序列係提供於US 2006/0188495中。亦參見US 2006/0034835及US 2006/0024300。總結本發明之各種較佳實施例，如US 2006/0062787中所揭示之基於2H7形式16之變異體V區除在下表指定之胺基酸取代位置處以外，將具有v16胺基酸序列。除非另有所述，否則2H7變異體將具有與v16之L鏈相同之L鏈。
一種較佳人類化2H7為具有形式16之序列之完整抗體或抗體片段。另一較佳人類化2H7具有形式114之序列。
"BAFF拮抗劑"為阻斷BAFF或BR3活性之任何分子。其包括包含結合BAFF之BR3、TACI或BCMA或其變異體之一部分的免疫黏附素。在其他態樣中，BAFF拮抗劑為BAFF抗體。"BAFF抗體"為結合BAFF且較佳於包含人類BAFF之殘基162－275之人類BAFF區內結合BAFF的抗體。在另一態樣中，BAFF拮抗劑為BR3抗體。"BR3抗體"為結合BR3且較佳於包含人類BR3之殘基23－38之人類BR3區內結合BR3 的抗體。人類BAFF及人類BR3之序列係見於(例如)US 2006/0062787中。BAFF結合多肽或BAFF抗體之其他實例可見於(例如)WO 2002/092620、WO 2003/014294；Gordon等人，Biochemistry 42(20)：5977－83(2003)；Kelley等人，J.Biol.Chem.279(16)：16727－16735(2004)；WO 1998/18921、WO 2001/12812、WO 2000/68378及WO 2000/40716中。
"抗IgE抗體"包括以在IgE與肥大細胞及嗜鹼性細胞上之高親和力受體結合時不誘發交聯之方式與IgE特異性結合的任何抗體。例示性抗體包括本發明抗體以及rhuMabE25(E25,XOLAIR)、E26、E27以及CGP－5101(Hu－901)及HA抗體。人類化抗IgE抗體E25、E26及E27之重鏈及輕鏈可變域之胺基酸序列係揭示於(例如)U.S.P.6,172,213及WO 99/01556中。CGP－5101(Hu－901)抗體係描述於Corne等人，(1997)J.Clin.Invest.99(5)：879－887、WO 92/17207及ATCC寄存編號BRL－10706、BRL－11130、BRL－11131、BRL－11132及BRL－11133中。HA抗體係描述於USSN 60/444,229、WO 2004/070011及WO 2004/070010中。
II.實施本發明之模式 A.重組製備
本發明亦提供編碼細胞凋亡抗IgE抗體的經分離核酸，包含該核酸之載體及宿主細胞，及用於產生抗體之重組技術。
對於重組產生抗體而言，將編碼其之核酸分離且插入可複製載體中以便進一步選殖(DNA放大)或表現。編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)分離及定序。可利用許多載體。載體組份一般包括(但不限於)以下組份中之一或多種：信號序列、複製起點、一或多種標誌基因、強化要素、啟動子及轉錄終止序列。
(1)信號序列組份 本發明之抗IgE抗體不僅可直接重組產生，亦可以與異源多肽之融合多肽之形式重組產生，該異源多肽較佳為於成熟蛋白質或多肽之N末端具有特定裂解位點之信號序列或其他多肽。所選擇之異源信號序列較佳為由宿主細胞辨識及加工(亦即由信號肽酶裂解)之序列。對於不辨識及加工原生哺乳動物信號序列之原核宿主細胞而言，由(例如)選自鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定腸毒素II前導之群之原核信號序列來取代信號序列。對於酵母分泌而言，原生信號序列可經(例如)酵母轉化酶前導子、因子前導子(包括酵母(Saccharomyces )及刻魯維拉菌(Kluyveromyces )因子前導子)或酸性磷酸酶前導子、白色念珠菌(C.albicans )葡糖澱粉酶前導子或WO 90/13646中所述之信號來取代原生信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導子，例如單純疱疹gD信號。
該前驅體區之DNA於閱讀框架中接合至編碼IgE結合抗體之DNA。
(2)複製起點 表現載體與選殖載體皆含有使得載體能夠在一或多種所選擇之宿主細胞中複製之核酸序列。一般而言，在選殖載體中，此序列為使得載體能夠獨立於宿主染色體DNA複製之序列，且包括複製起點或自主複製序列。熟知多種細菌、酵母及病毒之該等序列。來自質體pBR322之複製起點適合於多數革蘭氏陰性細菌，2μ質體起點適合於酵母且各種病毒起點(SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點組份(通常可僅使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。
(3)選擇基因組份 表現載體及選殖載體可含有亦稱為可選擇性標誌之選擇基因。典型選擇基因編碼(a)賦予對抗生素或例如胺苄青黴素(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤或四環素(tetracycline)之其他毒素之抗性的蛋白質；(b)補充營養缺陷型不足的蛋白質；或(c)供應不可自複合培養基獲得之關鍵營養素(例如編碼芽胞桿菌(Bacilli )之D－丙胺酸消旋酶之基因)的蛋白質。
選擇機制之一個實例利用藥物以使宿主細胞生長停滯。經異源基因成功轉化之彼等細胞產生賦予抗藥性且因此使選擇方案存活之蛋白質。該顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及勻黴素。
哺乳動物細胞之合適可選擇標誌之另一實例為使得能夠 溶解IgE結合抗體核酸之細胞能夠得以識別的彼等標誌(諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I及II，較佳靈長類動物金屬硫蛋白基因、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等)。
舉例而言，首先藉由將所有轉化子在含有甲胺喋呤(Mtx)、DHFR競爭性拮抗劑之培養基中培養來識別經DHFR選擇基因轉化之細胞。當採用野生型DHFR時，適當宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如ATCC CRL－9096)。
或者，可藉由於含有用於可選擇標誌之選擇劑(諸如胺基糖苷類抗生素，例如卡那黴素(kanamycin)、新黴素或G418)之培養基中細胞生長來選擇以編碼IgE結合抗體、野生型DHFR蛋白及另一可選擇標誌(諸如胺基糖苷3'－磷酸轉移酶(APH))之DNA序列轉化或協同轉化之宿主細胞(尤其含有內源性DHFR之野生型宿主)。參見美國專利第4,965,199號。
用於酵母之合適選擇基因為存在於酵母質體YRp7中之trp1 基因(Stinchcomb等人，Nature,282：39(1979))。trp1 基因為缺乏在色胺酸中生長之能力的突變酵母菌株(例如ATCC第44076號或第PEP4－1號)提供選擇標記。Jones,Genetics,85：12(1977)。酵母宿主細胞基因組中trp1 病變之存在為藉由在不存在色胺酸下生長來偵測轉化提供有效環境。相似地，由帶有Leu2 基因之已知質體來補充Leu2 缺乏酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，可將源自1.6 μm環質體pKD1之載體用於刻魯維拉 菌酵母之轉化。或者，對於乳酸刻魯維酵母(K.lactis )已報導大規模產生重組小牛凝乳酶之表現系統。Van den Berg,Bio/Technology ,8：135(1990)。亦已揭示由刻魯維拉菌之工業菌株分泌成熟重組人類血清白蛋白之穩定多複本表現載體。Fleer等人，Bio/Technology ,9：968－975(1991)。
(4)啟動子組份 表現載體及選殖載體通常含有由宿主生物體辨識且可操作性連接至編碼IgE結合抗體之核酸的啟動子。適用於原核宿主之啟動子包括phoA 啟動子、內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶啟動子、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子(諸如tac啟動子)。然而，其他已知細菌啟動子為合適的。用於細菌系統之啟動子亦將含有與編碼IgE結合抗體之DNA可操作性連接的Shine－Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因均具有位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處之AT富集區。見於許多基因之轉錄起始位點上游70至80個鹼基處之另一序列為N可為任何核苷酸之CNCAAT區。多數真核基因之3'端為可為向編碼序列之3'端增加多聚腺苷酸尾之信號的AATAAA序列。將所有此等序列均合適地插入真核表現載體中。
用於酵母宿主之合適啟動子序列之實例包括用於以下各酶之啟動子：3－磷酸甘油酸激酶及其他糖解酶，諸如烯醇化酶、甘油醛－3－磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、 磷酸果糖激酶、葡糖－6－磷酸異構酶、3－磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡糖異構酶及葡糖激酶。
為具有受生長條件控制之轉錄之額外優勢的誘發型啟動子的其他酵母啟動子為用於以下各酶之啟動子區：乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛－3－磷酸脫氫酶及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶。用於酵母表現之適當載體及啟動子進一步描述於EP 73,657中。酵母強化子亦有利地與酵母啟動子一起使用。
lgE結合抗體自哺乳動物宿主細胞中之載體的轉錄受(例如)自(諸如)多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒及最佳猿猴病毒40(SV40)之病毒的基因組，自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)，自熱休克啟動子獲得之啟動子控制，其限制條件為該等啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子係以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段形式便利地獲得。人類巨細胞病毒之即刻早期啟動子係以HindIII E限制片段形式便利地獲得。使用牛乳頭瘤病毒作為載體於哺乳動物宿主中表現DNA之系統係揭示於美國專利第4,419,446號中。此系統之改進係描述於美國專利第4,601,978號中。亦參見關於在來自疱疹單純型病毒之胸苷激酶啟動子控制下，於小鼠細胞 中表現人類干擾素cDNA之Reyes等人，Nature 297：598－601(1982)。或者，可將Rous肉瘤病毒較長末端重複序列用作啟動子。
(5)強化子要素組份 編碼本發明IgE結合抗體之DNA經較高等真核生物之轉錄通常藉由將強化子序列插入載體中而增加。現自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白及胰島素)已知許多強化子序列。然而，通常吾人使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點之後側(bp 100－270)上的SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點之後側上的多形瘤強化子及腺病毒強化子。亦參見關於活化真核啟動子之增強要素之Yaniv,Nature 297：17－18(1982)。強化子可在IgE結合抗體編碼序列之位置5'或3'處剪接至載體中，但較佳位於自啟動子起之位點5'。
(6)轉錄終止組份 用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞有機體之有核細胞)之表現載體亦將含有轉錄終止及使mRNA穩定所必需的序列。該等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'且有時3'未轉譯區獲得。此等區域含有在編碼lgE結合抗體之mRNA的未轉譯部分中轉錄為多聚腺嘌呤化片段之核苷酸片段。一種適用之轉錄終止組份為牛生長激素多聚腺嘌呤區。參見WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。
(7)選擇及轉化宿主細胞 用於在本文之載體中選殖或表現DNA之合適宿主細胞為上述原核生物、酵母或較高等真核生物細胞。用於此目的之合適原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia )，例如大腸桿菌(E.coli )；腸桿菌屬(Enterobacter )；歐文菌屬(Erwinia )；克雷伯氏菌屬(Klebsiella )；變形桿菌屬(Proteus )；沙門氏菌屬(Salmonella )，例如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium )；沙雷氏菌屬(Serratia )，例如黏質沙雷菌(Serratia marcescans )及志賀菌屬(Shigella )；以及芽胞桿菌屬，諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis )及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis )(例如揭示於1989年4月12日公開之DD 266,710中所揭示之地衣芽孢桿菌41P)；假單胞桿菌屬(Pseudomonas )，諸如綠膿桿菌(P.aeruginosa )及鏈黴菌(Streptomyces )。一種較佳之大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294(ATCC 31,446)，儘管諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)之其他菌株亦為合適的。此等實例為說明性而非限制性。
尤其當不需要糖基化及Fc效應功能時，諸如當將治療抗體結合至細胞毒性劑(例如毒素)且免疫結合物自身於腫瘤細胞破壞中展示有效性時，可於細菌中產生全長抗體、抗體片段及抗體融合蛋白。全長抗體在循環中具有較大半衰期。於大腸桿菌中產生較快且成本上更有效。對於在細菌中表現抗體片段及多肽而言，參見例如描述優化表現及分 泌之轉譯起始區(TIR)及信號序列之U.S.5,648,237(Carter等人)、U.S.5,789,199(Joly等人)及U.S.5,840,523(Simmons等人)。表現後，將抗體自大腸桿菌細胞糊狀物以可溶部分分離且可視同型而定(例如)經由蛋白A或G管柱純化。可類似於用於純化(例如)表現於CHO細胞中之抗體之方法來進行最終純化。
除原核生物以外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為IgE結合抗體編碼載體的合適選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )或常見麵包酵母(baker's yeast )為最常用之低等真核宿主微生物。然而，許多其他屬類、物種及菌株為通常可用的且在本文中適用，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；刻魯維拉菌宿主，諸如乳酸刻魯維酵母、脆壁克魯維酵母(K.fragilis )(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus )(ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母(K.wickeramii )(ATCC 24,178)、克魯雄酵母菌(K.waltii )(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum )(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans )及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus )；耶氏酵母(yarrowia )(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )(EP 183,070)；念珠菌屬(Candida )；里氏木黴(Trichoderma reesia )(EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa )；許旺酵母(Schwanniomyces )，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )及絲狀真菌(filamentous fungi )，諸如鏈孢黴(Neurospora )、青黴菌 (Penicillium )、彎頸黴菌(Tolypocladium )及麯黴屬宿主(Aspergillus hosts )，諸如構巢麯黴(A.nidulans )及黑麯黴(A.niger )。
用於表現糖基化IgE結合抗體之合適宿主細胞源自於多細胞有機體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別許多桿狀病毒株及變異體以及來自諸如以下宿主之相應許可昆蟲宿主細胞：草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti )(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus )(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )(果蠅)及家蠶(Bombyx mori )。用於轉染之多種病毒株可公開獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica )NPV之L－1變異體及家蠶NPV之Bm－5菌株，且該等病毒在本文中可根據本發明用作病毒，尤其用以轉染草地黏蟲細胞之病毒。
亦可利用棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及煙草之植物細胞培養物作為宿主。
然而，最關注脊椎動物細胞，且脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中之繁殖已成為常規程序。適用之哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40(COS－7，ATCC CRL 1651)轉化之猴腎臟CV1細胞株；人類胚胎腎臟細胞株(經次選殖以在懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人，J.Gen Virol. 36：59(1977))；幼倉鼠腎臟細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/－DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77：4216(1980))；小鼠足細胞 (TM4，Mather,Biol.Reprod. 23：243－251(1980))；猴腎臟細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎臟細胞(VERO－76，ATCC CRL－1587)；人類宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎臟細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝臟細胞(buffalo rat liver cells)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138、ATCC CCL 75)；人類肝臟細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci. 383：44－68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌細胞株(Hep G2)。
將宿主細胞以上述用於IgE結合抗體產生之表現載體或選殖載體轉化且在視情況經改質之習知培養基中培養以誘發啟動子、選擇轉化子或放大編碼所需序列之基因。
(8)培養宿主細胞 可在多種培養基中培養用以產生本發明之IgE結合抗體的宿主細胞。諸如漢姆F10(Ham's F10)(Sigma)、最低必需培養基((MEM)(Sigma))、RPMI－1640(Sigma)及杜貝科氏改質之伊格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)，Sigma)之市售培養基適合於培養宿主細胞。此外，Ham等人，Merh.Enz. 58：44(1979)；Barnes等人，Anal.Biochem. 102：255(1980)；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195或美國專利Re.30,985中所述之培養基中的任一 者可用作宿主細胞之培養基。若需要，任何此等培養基可補充有激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或上皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM 藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍內之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能量源。亦可以熟習此項技術者已知之適當濃度包括任何其他必要補充物。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為先前用於經選擇用以表現之宿主細胞的彼等培養條件，且對於普通熟習此項技術者而言將為顯而易見的。
(9)抗體純化 當使用重組技術時，抗體可以細胞內方式於壁膜間隙中產生或可直接分泌至培養基中。若抗體係以細胞內方式產生，則作為第一步，(例如)藉由離心或超濾將微粒碎片(宿主細胞或溶胞碎片)移除。Carter等人，Bio/Technology 10：163－167(1992)描述用於分離分泌至大腸桿菌壁膜間隙中之抗體之程序。簡言之，在乙酸鈉(PH值為3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯氟(PMSF)存在下歷經約30 min使細胞糊狀物解凍。可藉由離心移除細胞碎片。當抗體係分泌至培養基中時，一般首先使用可購得之蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自該等表現系統之上清液。上述步驟中之任一者中可包括蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)以抑制蛋白水解且可包括抗生素以防止外來污染物之生長。
可使用(例如)羥磷灰石層析、凝膠電泳、滲析及親和性層析來純化由細胞製備之抗體組合物，其中親和力層析為較佳之純化技術。蛋白A作為親和力配位體之適用性視存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型而定。可使用蛋白A來純化基於人類1、2或4重鏈之抗體(Lindmark等人，J.Immunol.Meth. 62：1－13(1983))。蛋白G推薦用於所有小鼠同型及人類3(Guss等人，EMBO J. 5：15671575(1986))。親和力配位體所附著之基質最通常為瓊脂糖，但可利用其他基質。諸如受控孔度玻璃或聚(苯乙烯－二乙烯基)苯之機械穩定基質允許比使用瓊脂糖可達成者較快之流動速率及較短之加工時間。抗體包含CH 3域時，Bakerbond ABXTM 樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。亦可視待回收之抗體而使用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換管柱分餾、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSETM 層析、陽離子或陰離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS－PAGE及硫酸銨沈澱。
任何初步純化步驟後，可使包含所關注抗體及污染物之混合物經受使用pH值在約2.5－4.5之間的溶離緩衝劑，較佳在低鹽濃度(例如約0－0.25 M鹽)下進行之低pH值疏水性相互作用層析。
B.抗體製備
1)多株抗體 一般藉由多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原及佐劑 來於動物體內產生多株抗體。可使用雙功能劑或衍生劑(例如順丁烯二醯亞胺苄醯基磺酸丁二醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N－羥基丁二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2 或R1 N＝C＝NR，其中R及R1 獨立地為低碳烷基)使相關抗原結合至在待免疫之物種內具免疫原性之蛋白質，例如匙孔螺血氰蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用之佐劑之實例包括傅氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)及MPL－TDM佐劑(單磷醯基脂質A、合成海藻糖二棒桿黴菌酸酯(trehalose dicorynomycolate))。可由熟習此項技術者在無過度實驗下選擇免疫方案。
藉由將(例如)100 μg或5 μg蛋白質或結合物(分別對於兔或小鼠)與3體積傳氏完全佐劑組合且於多處皮內注射溶液而使動物對抗原、免疫原性結合物或衍生物免疫。一個月以後，以於傳氏完全佐劑中之1/5至1/10原始量之肽或結合物藉由在多處皮下注射來對動物加強免疫。七至十四天後，對動物進行取血且檢定血清之抗體力價。對動物加強免疫直至力價平穩。結合物亦可於重組細胞培養物中以蛋白融合體形式製成。又，諸如礬之凝集劑適合於增強免疫反應。
2)單株抗體 單株抗體係獲自大體上同源抗體之群體，亦即構成該群體之個別抗體除可以微量存在之可能天然產生之突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)以外皆為相同的。因 此，修飾語"單株"表明抗體不為離散抗體之混合物之特徵。
舉例而言，單株抗體可使用由Kohler等人，Nature ,256：495(1975)首次描述之融合瘤法製成，或可由重組DNA法(美國專利第4,816,567號)製成。
在融合瘤法中，如上文所述使小鼠或其他適當宿主動物(諸如倉鼠)免疫以引出產生或能夠產生將特異性結合用於免疫之蛋白質之抗體的淋巴細胞。或者，淋巴細胞可於活體外免疫。接著使用合適融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice ，第59－103頁(Academic Press,1986))。
免疫劑通常將包括抗原蛋白或其融合變異體。一般而言，若需要人類來源之細胞，則使用外周血液淋巴細胞("PBL")；或若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾臟細胞或淋巴結細胞。接著使用合適融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細胞與永生細胞株融合以形成融合瘤細胞。Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, Academic Press(1986)，第59－103頁。
永生細胞株通常為經轉化之哺乳動物細胞，尤其齧齒動物、牛及人類來源之骨髓瘤細胞。通常採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。將因此製備之融合瘤細胞接種於合適之培養基中且於其中生長，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。舉例而言，若親本 骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質阻止HGPRT缺乏細胞之生長。
較佳之永生骨髓瘤細胞為有效融合、支持所選抗體產生細胞穩定高量產生抗體且對諸如HAT培養基之培養基敏感的彼等骨髓瘤細胞。其中，較佳為鼠類骨髓瘤細胞株，諸如可由Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA購得之源自MOPC－21及MPC－11小鼠腫瘤的彼等骨髓瘤細胞株，及可由美國菌種保存中心(American Type Culture Collection),Manassas,Virginia USA購得之SP－2細胞(及其衍生物，例如X63－Ag8－653)。亦描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠－人類雜合骨髓瘤細胞株(Kozbor,J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，第51－63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
檢定用於生長融合瘤細胞之培養基中針對抗原之單株抗體的產生。較佳地，由融合瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性係由免疫沈澱或由活體外結合檢定(諸如放射免疫檢定(RIA)或酶聯免疫吸附檢定(ELISA))來測定。
可檢定培養融合瘤細胞之培養基中針對所需抗原的單株抗體之存在。較佳地，單株抗體之結合親和力及特異性可由免疫沈澱或由活體外結合檢定(諸如放射免疫檢定(RIA) 或酶聯檢定(ELISA))來測定。該等技術及檢定在此項技術中為已知的。舉例而言，結合親和力可由Munson等人，Anal.Biochem. ,107：220(1980)之斯卡查德分析來測定。
識別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體之融合瘤細胞後，該等純系可藉由限制稀釋程序次選殖且藉由標準方法生長(Goding同上文)。為達此目的之合適培養基包括(例如)D－MEM或RPMI－1640培養基。此外，融合瘤細胞可如哺乳動物體內之腫瘤於活體內生長。
合適地藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如蛋白A－瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和力層析)自培養基、腹水或血清中分離由次純系分泌之單株抗體。
亦可由諸如描述於美國專利第4,816,567號中之彼等方法之重組DNA方法且如本文所述製造單株抗體。編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈基因特異性結合之寡核苷酸探針)分離及定序。融合瘤細胞充當該DNA之較佳來源。分離後，可將DNA置於表現載體中，隨後將其經轉染至不會以其他方式產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中以在該等重組宿主細胞中合成單株抗體。關於細菌中編碼抗體之DNA之重組表現的綜述包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol ,5 ：256－262(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs. 130 ：151－188(1992)。
在另一實施例中，可將抗體自使用描述於McCafferty等 人，Nature ,348 ：552－554(1990)中之技術產生之抗體噬菌體庫分離。Clackson等人，Nature ,352 ：624－628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol. ,222 ：581－597(1991)分別描述使用噬菌體庫分離鼠類及人類抗體。後續出版物描述藉由鏈改組(Marks等人，Bio/Technology ,10 ：779－783(1992))以及作為構築極大噬菌體庫之策略的組合感染及活體內重組(Waterhouse等人，Nucnucl.Acidsnucl.Resnucl. ,21：2265－2266(1993))來產生高親和力(nM範圍)人類抗體。因此，此等技術為分離單株抗體之常規單株抗體融合瘤技術的可行替代方案。
亦可(例如)藉由以人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列替代同源鼠類序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA ,81：6851(1984))或藉由將非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列與免疫球蛋白多肽編碼序列共價接合來修飾DNA。通常該等非免疫球蛋白多肽係取代抗體之恆定域或其取代抗體之一個抗原組合位點之可變域以產生嵌合二價抗體，該抗體包含一個對抗原具特異性之抗原組合位點及另一個對不同抗原具特異性之抗原組合位點。
本文中所述之單株抗體可為單價抗體，其製備在此項技術中為熟知的。舉例而言，一種方法涉及重組表現免疫球蛋白輕鏈及經修飾之重鏈。一般在Fc區中之任一點將重鏈截斷以防止重鏈交聯。或者，可以另一胺基酸殘基取代相關半胱胺酸殘基或使相關半胱胺酸殘基缺失以防止交聯。 活體外方法亦適用於製備單價抗體。可使用於此項技術中已知之常規技術來完成抗體消化以產生其片段，尤其Fab片段。
亦可使用合成蛋白質化學中已知之方法(包括涉及交聯劑之彼等方法)活體外製備嵌合或雜合抗體。舉例而言，可使用雙硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於此目的之合適試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及甲基－4－巰基丁醯亞胺酯。
3)人類化抗體 本發明之抗體可另外包含人類化抗體或人類抗體。人類化形式之非人類(例如鼠類)抗體為含有最少之源自非人類免疫球蛋白之序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈或片段(諸如抗體之Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 或其他抗原結合子序列)。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之互補判定區(CDR)之殘基經來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR(供體抗體)的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架殘基經相應非人類殘基置換。人類化抗體亦可包含既非見於受體抗體中亦非見於所引入CDR或構架序列中之殘基。一般而言，人類化抗體將包含大體上至少一個且通常兩個可變域之全部，其中所有或大體上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之彼等CDR區，且所有或大體上所有FR區為人類免疫球蛋白一致序列之彼等FR區。人類化抗體最佳亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至 少一部分，通常人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。Jones等人，Nature 321：522－525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323－329(1988)及Presta,Curr.Opin.Struct.Biol. 2：593－596(1992)。
在此項技術中熟知使非人類抗體人類化之方法。一般而言，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為"引入"殘基，其通常係取自"引入"可變域。可基本上根據Winter及同事之方法(Jones等人，Nature ,321：522－525(1986)；Riechmann等人，Nature ,332：323－327(1988)；Verhoeyen等人，Science ,239：1534－1536(1988))或經由以齧齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行人類化。因此，該等"人類化"抗體為嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中大體上不及完整之人類可變域經來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為某些CDR殘基及可能某些FR殘基經來自齧齒動物抗體中之類似位點之殘基取代的人類抗體。
有待用於製造人類化抗體之人類可變域(輕鏈及重鏈)之選擇對於降低抗原性而言極其重要。根據所謂"最佳擬合"法，對照已知人類可變域序列之完整庫來篩選齧齒動物抗體之可變域序列。接著接受最接近齧齒動物序列之人類序列作為人類化抗體人類構架(FR)。Sims等人，J.Immunol ,151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol ,196：901(1987)。另一方法使用源自特定輕鏈或重鏈子群之所有人 類抗體的一致序列之特定構架區。可將相同構架用於若干不同人類化抗體。Carter等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA ,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol ,151：2623(1993)。
更重要的是在保留對抗原之高親和力及其他有利生物特性下使抗體人類化。為實現此目標，根據一較佳方法，藉由使用親本序列及人類化序列之三維模型對親本序列及各種設想人類化產物進行分析的方法來製備人類化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可用且為熟習此項技術者所熟知。可使用說明及呈現所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構之電腦程式。對此等呈現之檢視允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列起作用過程中之可能作用(亦即分析殘基對候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的影響)。以此方式，可自受體及引入序列選擇並組合FR殘基以便達成所需抗體特徵，諸如對靶抗原之親和力增加。一般而言，CDR殘基與對抗原結合之影響直接且最為實質性地相關。
涵蓋各種形式之人類化抗體。舉例而言，人類化抗體可為視情況與一或多種細胞毒性劑結合以產生免疫結合物之抗體片段(諸如Fab)。或者，人類化抗體可為完整抗體，諸如完整IgG1抗體。
4)人類抗體 作為人類化之替代方式，可產生人類抗體。舉例而言，現可能產生免疫後能夠在不產生內源免疫球蛋白之情況下產生全人類抗體譜的轉基因動物(例如小鼠)。舉例而言， 已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈接合區(JH )基因之純合子缺失導致對內源抗體產生之完全抑制。人類生殖系免疫球蛋白基因陣列至該等生殖系突變小鼠中之轉移將使得抗原激發後產生人類抗體。參見例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,90 ：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature ,362 ：255－258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno. ,7 ：33(1993)；美國專利第5,591,669號及WO 97/17852。
或者，噬菌體呈現技術可用以自來自未經免疫供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜活體外產生人類抗體及抗體片段。McCafferty等人，Nature 348：552－553(1990)；Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol. 227：381(1991)。根據此技術，將抗體V域基因同框選殖至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要鞘蛋白基因中，且作為功能性抗體片段呈現於噬菌體顆粒之表面上。由於絲狀顆粒含有噬菌體基因組之單股DNA複本，故基於抗體功能性之選擇亦引起編碼展示彼等特性之抗體基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細胞之某些特性。噬菌體可以論述於(例如)Johnson,Kevin S.及Chiswell,David J.,Curr.Opin Struct.Biol. 3：564－571(1993)中之多種形式呈現。V－基因區段之若干來源可用於噬菌體呈現。Clackson等人，Nature,352：624－628(1991)由源自免疫小鼠之脾臟之V基因的小型隨機組合庫分離出一批不同抗噁唑酮抗體。可構築來自未經免疫人類供體之V基因譜且可基本上按照由Marks等人J.Mol.Biol. 222：581－597(1991)或Griffith等人EMBO J.12：725－734(1993)所述之技術來分離針對一批不同抗原(包括自體抗原)之抗體。亦參見美國專利第5,565,332號及5,573,905號
Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)及Boerner等人，J.Immunol. 147 (1)：86－95(1991))。類似地，人類抗體可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物(例如內源性免疫球蛋白基因已經部分或完全失活之小鼠)而製成。激發後，觀測人類抗體產生，其在所有方面(包括基因重排，組裝及抗體譜)與人類體內所見極為類似。此方法係描述於(例如)美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號及以下科學出版物中：Marks等人，Bio/Technology 10 ：779－783(1992)；Lonberg等人，Nature 368 ：856－859(1994)；Morrison,Nature 368 ：812－13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14 ：845－51(1996),Neuberger,Nature Biotechnology 14：826(1996)及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol. 13 ：65－93(1995)。
最終，亦可藉由活化之B細胞在活體外產生人類抗體(參見美國專利第5,567,610號及第5,229,275號)。
5)抗體片段 在某些環境下，使用抗體片段而非整個抗體存在優勢。較少片段尺寸允許快速清除，且可使對實體腫瘤之可接近 性得以改良。
已開發出多種用於產生抗體片段之技術。傳統上，經由蛋白水解消化完整抗體而獲得此等片段(參見例如Morimoto等人，J Biochem Biophys.Method. 24 ：107－117(1992)及Brennan等人，Science 229 ：81(1985))。然而，此等片段現可直接由重組宿主細胞產生。Fab、Fv及scFv抗體片段均可於大腸桿菌中表現且自大腸桿菌分泌，從而允許容易地產生大量此等片段。可自以上所討論之抗體噬菌體庫分離抗體片段。或者，Fab'－SH片段可直接自大腸桿菌中回收且化學偶合以形成F(ab')2 片段(Carter等人，Bio/Technology 10 ：163－167(1992))。根據另一方法，F(ab')2 片段可直接自重組宿主細胞培養物分離。活體內半衰期增加之Fab及F(ab')2 係描述於美國專利第5,869,046號中。在其他實施例中，所選抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；及美國專利第5,587,458號。抗體片段亦可為(例如)如美國專利5,641,870中所述之"線性抗體"。該等線性抗體片段可具單特異性或雙特異性。
6)抗體依賴性酶介導之前藥療法(ADEPT) 亦可藉由將抗體與將前藥(例如肽基化學治療劑，參見WO 81/01145)轉化為活性抗癌藥之前藥激活酶結合而將本發明抗體用於ADEPT。參見例如WO 88/07378及美國專利第4,975,278號。
適用於ADEPT之免疫結合物之酶組份包括能夠以將前藥 轉化為其更具活性、細胞毒性形式之方式作用於前藥的任何酶。
適用於本發明方法之酶包括(但不限於)糖苷酶、葡萄糖氧化酶、人類溶菌酶、人類葡糖醛酸酶、適用於將含有磷酸根之前藥轉化為游離藥物之鹼性磷酸酶；適用於將含有硫酸根之前藥轉化為游離藥物之芳基硫酸酶；適用於將無毒5－氟胞嘧啶轉化為抗癌藥5－氟尿嘧啶之胞嘧啶脫胺酶；適用於將含肽前藥轉化為游離藥物之蛋白酶，諸如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶(例如羧肽酶G2及羧基肽酶A)及組織蛋白酶(組織蛋白酶B及L)；適用於轉化含有D胺基酸取代基之前藥之D－丙胺醯基羧基肽酶；適用於將糖基化前藥轉化為游離藥物之碳水化合物裂解酶，諸如β－半乳糖苷酶及神經胺酸酶；適用於將以β－內醯胺衍生之藥物轉化為游離藥物之β－內醯胺酶；及適用於將在胺氮處分別以苯氧基乙醯基或苯乙醯基衍生之藥物轉化為游離藥物之青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶。或者，在此項技術中亦稱作"抗體酶"之具酶活性之抗體可用以將本發明前藥轉化為游離活性藥物(參見例如Massey,Narure 328 ：457－458(1987))。可如本文所述製備用於將抗體酶傳遞至腫瘤細胞群體之抗體－抗體酶結合物。
可藉由此項技術中熟知之技術(諸如使用上述異雙功能交聯劑)使以上酶與本文中所述之多肽或抗體共價結合。或者，可使用此項技術中熟知之重組DNA技術構築至少包 含至少與本發明酶之功能活性部分連接之本發明抗體的抗原結合區之融合蛋白(參見例如Neuberger等人，Nature 312 ：604－608(1984))。
7)雙特異性及多特異性抗體 雙特異性抗體(BsAb)為對至少兩個不同抗原決定基(包括在同一或另一蛋白上之彼等抗原決定基)具有結合特異性之抗體。或者，一臂可經武裝以與靶抗原結合且另一臂可與結合至白血球上之觸發分子(諸如T細胞受體分子(例如CD3)或IgG之Fc受體(FcγR)，諸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16))之臂組合以使細胞防禦機制集中及定位於表現靶抗原之細胞。該等抗體可源自全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2 雙特異性抗體)。
雙特異性抗體亦可用以將細胞毒性劑定位於表現靶抗原之細胞。該等抗體具有結合所需抗原之一臂及結合細胞毒性劑(例如沙泊寧(saporin)、抗干擾素a、長春生物鹼、蓖麻毒素A鏈，甲胺喋呤或放射性同位素半抗原)之另一臂。已知雙特異性抗體之實例包括抗ErbB2/抗FcgRIII(WO 96/16673)、抗ErbB2/抗FcgRI(U.S.P.5,837,234)、抗ErbB2/抗CD3(U.S.P.5,821,337)。
製造雙特異性抗體之方法在此項技術中已知。全長雙特異性抗體之傳統產生方法係基於兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共表現，其中兩條鏈具有不同特異性。Millstein等人，Nature ,305 ：537－539(1983)。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機搭配，此等融合瘤(四源雜交瘤)產生10個不同 抗體分子(其中僅一個具有正確的雙特異性結構)之可能混合物。通常由親和力層析步驟進行之正確分子之純化相當麻煩且產物產率較低。類似程序係揭示於WO 93/08829中及Traunecker等人，EMBO J. ,10：3655－3659(1991)中。
根據不同方法，將具有所需結合特異性(抗體－抗原組合位點)之抗體可變域融合於免疫球蛋白恆定域序列。較佳與包含鉸鏈區、CH 2區及CH 3區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈恆定域融合。較佳含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區(CH 1)存在於融合體之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入單獨表現載體中且使其共轉染至合適宿主生物體中。此舉為當構築中所用之不等比率之三條多肽鏈提供最佳產率時，調節實施例中三種多肽片段之相互比例提供極大靈活性。然而，當至少兩條等比率之多肽鏈之表現產生高產率時或當比率不具有特別顯著性時，可能在一個表現載體中插入兩條或所有三條多肽鏈之編碼序列。
在此方法之一較佳實施例中，雙特異性抗體包含在一臂中之具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及在另一臂中之雜交免疫球蛋白重鏈－輕鏈對(提供第二結合特異性)。發現由於僅一半雙特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈提供較容易之分離方式，故此不對稱結構有利於所需雙特異性化合物自不當免疫球蛋白鏈組合中分離。此方法揭示於WO 94/04690中。對於產生雙特異性抗體之其他細節參見例如Suresh等人：Methods in Enzymology 121 ：210 (1986)。
根據描述於WO 96/27011或U.S.P.5,731,168中之另一方法，可將抗體分子對之間的界面工程化以使自重組細胞培養物中回收之雜二聚體百分比最大。較佳界面包含抗體恆定域之CH 3區之至少一部分。在此方法中，一或多條來自第一抗體分子之界面的小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換。藉由以較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換較大胺基酸側鏈而於第二抗體分子之界面上產生尺寸與較大側鏈相同或類似之補償性"空腔"。其提供使雜二聚體之產率增加以超過不當最終產物(諸如同二聚體)的機制。
由抗體片段產生雙特異性抗體之技術已描述於文獻中。舉例而言，雙特異性抗體可使用化學鍵製備。Brennan等人，Science,229 ：81(1985)描述使完整抗體以蛋白水解方式裂解以產生F(ab')2 片段之程序。此等片段在二硫醇複合劑亞砷酸鈉存在下還原以穩定鄰近二硫醇且防止分子間雙硫鍵形成。接著將所產生之Fab'片段轉化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著將Fab'－TNB衍生物中之一者再轉化為Fab'－TNF衍生物以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作選擇性固定酶之試劑。
可直接自大腸桿菌回收Fab'片段且將其化學偶合以形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med. 175 ；217－225(1992)描述完全人類化之雙特異性抗體F(ab')2 分子之產生。使各Fab'獨立自大腸桿菌分泌且進行活體外定向化學 偶合以形成雙特異性抗體。如此形成之雙特異性抗體能夠與過度表現ErbB2受體之細胞及正常人類T細胞結合，且觸發人類細胞毒性淋巴細胞對抗人類乳房腫瘤靶之溶解活‘性。
亦描述多種直接由重組細胞培養物製造且分離二價抗體片段之技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生二價雜二聚體。Kostelny等人，J.Immunol. ,148 (5)：1547－1553(1992)。藉由基因融合使來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽與兩種不同抗體之Fab'部分連接。使抗體同二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，且接著使其再氧化以形成抗體雜二聚體。由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,90 ：6444－6448(1993)所描述之"雙功能抗體"技術提供製造雙特異性/二價抗體片段之替代性機制。該等片段包含由連接子與輕鏈可變域(VL )連接之重鏈可變域(VH )，該連接子過短而無法使在同一鏈上之兩個結構域之間配對。因此，迫使一個片段之VH 及VL 域與另一片段之互補VL 及VH 域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦報導藉由使用單一鏈Fv(sFv)二聚體製造雙特異性/二價抗體片段之另一策略。參見Gruber等人，J.Immunol,152 ：5368(1994)。
涵蓋具有兩價以上的抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol. 147 ：60(1991)。
例示性雙特異性抗體可與給定分子上之兩個不同抗原決定基結合。或者，可將抗蛋白臂與結合至白血球上之觸發分子(諸如T細胞受體分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)， 或IgG之Fc受體(FcγR)(諸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)))之臂組合以使細胞防禦機制集中於表現特定蛋白質之細胞。雙特異性抗體亦可用以將細胞毒性劑定位於表現特定蛋白質之細胞。該等抗體具有蛋白質結合臂及結合細胞毒性劑或放射性核螯合劑(諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)之臂。所關注之另一雙特異性抗體與所關注之蛋白質結合且另外與組織因子(TF)結合。
8)多價抗體 多價抗體可比二價抗體更快地為表現抗體所結合之抗原的細胞內化(及/或異化)。本發明抗體可為具有三個或三個以上抗原結合位點之多價抗體(除IgM種類以外)(例如四價抗體)，其可易於藉由重組表現編碼抗體多肽鏈之核酸而產生。多價抗體可包含二聚化域及三個或三個以上抗原結合位點。較佳之二聚化域包含Fc區或鉸鏈區(或由Fc區或鉸鏈區組成)。在此情境中，抗體包含Fc區及三個或三個以上在Fc區之胺基末端之抗原結合位點。本文中較佳之多價抗體包含三個至約八個，但較佳四個抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一條多肽鏈(且較佳兩條多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或兩個以上可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1－(X1)n －VD2－(X2)n －Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區之一條多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含：VH－CH1－可撓性連接子－VH－CH1－Fc區鏈；或VH－CH1－VH－CH1－Fc區鏈。本文中之多價抗體較佳另外 包含至少兩個(且較佳四個)輕鏈可變域多肽。本文中之多價抗體可(例如)包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文中所涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情況另外包含CL域。
9)雜結合抗體 雜結合抗體亦在本發明之範疇內。雜結合抗體包含兩個共價接合之抗體。舉例而言，雜結合物中之一個抗體可與抗生物素蛋白偶合，另一者與生物素偶合。提出該等抗體以(例如)使免疫系統細胞靶向不當細胞(U.S.P.4,676,980)且治療HIV感染。WO 91/00360、WO 92/200373及EP 0308936。預期可使用於合成蛋白質化學中已知之方法(包括涉及交聯劑之彼等方法)而於活體外製備抗體。舉例而言，可使用雙硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於此目的之合適試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及甲基－4－巰基丁醯亞胺酯及揭示於(例如)美國專利第4,676,980號中之彼等試劑。可使用任何便利之交聯法製造雜結合抗體。合適交聯劑以及許多交聯技術在此項技術中熟知且揭示於美國專利第4,676,980號中。
10)效應功能工程化 可能需要關於效應功能修飾本發明抗體以便(例如)增強抗體之抗原依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。其可藉由在抗體之Fc區中引入一或多個胺基酸取代來達成。其他或另外，可將半胱胺酸殘基引入Fc區中，藉此允許在此區域內形成鏈間雙硫鍵。因 此產生之同二聚抗體可具有經改良之內化能力及/或增加之補體介導之細胞殺傷性及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人，J.Exp Med. 176：1191－1195(1992)及Shopes,B.J.Immunol. 148：2918－2922(1992)。具有增強之抗腫瘤活性之同二聚抗體亦可使用如Wolff等人，Cancer Research 53：2560－2565(1993)中所述之異雙功能交聯劑來製備。或者，具有雙重Fc區之抗體可經工程化且可藉此具有增強之補體溶胞及ADCC能力。參見Stevenson等人，Anti－Cancer Drug Design 3：219－230(1989)。
舉例而言，為增加抗體之血清半衰期，吾人可如美國專利5,739,277中所述將補救受體結合抗原決定基併入抗體(尤其抗體片段)中。本文中所使用之術語"補救受體結合抗原決定基"係指IgG分子(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 )之Fc區之抗原決定基，其負責增加IgG分子之活體內血清半衰期。
11)免疫結合物 本發明亦係關於免疫結合物或抗體－藥物結合物(ADC)，其包含與細胞毒性劑結合(諸如化學治療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或與放射性同位素結合(亦即放射性結合物))之抗體。該ADC必須展示可接受之安全概況。
在癌症治療中使用ADC局部傳遞細胞毒性劑或細胞生長抑制劑(例如殺死或抑制腫瘤細胞之藥物)[Syrigos及 Epenetos,Anticancer Research 19 ：605－14(1999)；Niculeascu－Duvaz及Springer,Adv.Drug Del Rev. 26 ：151－72(1997)；US 4,975,278]理論上允許藥物部分靶向傳遞至腫瘤及於其中胞內積累，而全身投與此等未經結合之藥劑可對正常細胞以及設法消除之腫瘤細胞產生不可接受程度之毒性(Baldwin等人，Lancet ,603－05(1986)；Thorpe,(1985)Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review ,inMonoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications ,A.Pinchera等人(編)，第475－506頁)。藉此搜尋具有最小毒性之最大功效。已報導多株抗體與單株抗體均適用於此等策略(Rowland等人，Cancer Immunol.Immunother.21：183－87(1986))。用於此等方法之藥物包括道諾黴素、阿黴素、甲胺喋呤及長春地辛。用於抗體－毒素結合物之毒素包括細菌毒素(諸如白喉毒素)；植物毒素(諸如蓖麻毒素)；小分子毒素(諸如格爾德黴素)(Mandler等人J.Nat.Cancer Inst. 92 (19)：1573－81(2000)；Mandler等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 10 ：1025－28(2000)；Mandler等人Bioconjugate Chem. 13 ：786－91(2002))；類美登素(EP 1391213；Liu等人，Proc.Natl.Aead.Sci.USA 93 ：8618－23(1996))及刺孢黴素(Lode等人，Cancer Res. 58 ：2928(1998)；及Hinman等人，Cancer Res. 53 ：3336－42(1993))。該等毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來發揮其細胞毒性及細胞生長抑制 作用。一些細胞毒性藥物在與較大抗體或蛋白質受體配位體結合時傾向於失活或活性較低。
適用於產生該等免疫結合物之化學治療劑已如上所述且包括BCNU、鏈脲菌素、長春新鹼、長春鹼、阿德力黴素(adriamycin)及5－氟尿嘧啶。
可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α帚麴菌素(alpha－sarcin)、油桐(Aleurites fordii )蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸(Phytolaca americana )蛋白(PAPI、PAPII及PAP－S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻風樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、天堂果蛋白(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。可利用各種放射性核來產生放射性結合抗體。實例包括212 Bi、131 I、131 In、90 Y及186 Re。抗體與細胞毒性劑之結合物係使用各種雙功能蛋白偶合劑製得，該等偶合劑諸如N－丁二醯亞胺基－3－(2－吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)－乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6－二異氰酸甲苯 酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5－二氟－2,4－二硝基苯)。舉例而言，可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述製備蓖麻毒素免疫毒素。經碳14標記之1－異硫氰酸酯基苄基－3－甲基二伸乙三胺－五乙酸(MX－DTPA)為用於使放射性核苷結合至抗體之例示性螯合劑。參見例如WO 1994/11026。
抗體與細胞毒性劑之結合物係使用各種雙功能蛋白偶合劑製得，該等偶合劑諸如N－丁二醯亞胺基－3－(2－吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)－乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6－二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5－二氟－2,4－二硝基苯)。舉例而言，可如Vitetta等人，Science ,238 ：1098(1987)中所述製備蓖麻毒素免疫毒素。經碳14標記之1－異硫氰酸酯基苄基－3－甲基二伸乙三胺五乙酸(MX－DTPA)為用於使放射性核苷結合至抗體之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。連接子可為促進於細胞中釋放細胞毒性藥物之"可裂解連接子"。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、二甲基連接子或含有雙硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Res. 52 ：127－131(1992))。
此外，亦涵蓋諸如刺孢黴素、美登素(U.S.P.5,208,020)、黴菌毒素及CC1065之小分子毒素作為用於本 發明調配物之可結合毒素。在一實施例中，可將全長抗體或其抗原結合片段結合至一或多個類美登素分子(例如每個抗體分子約1至約10個類美登素分子)。類美登素為藉由抑制微管蛋白聚合起作用之有絲分裂抑制劑。已描述自天然來源分離或合成式製備之類美登素，包括美登素、美登醇及其衍生物及類似物，參見例如美國專利第5,208,020號及其中所引用之參考文獻(參見第2卷，第53行至第3卷第10行)及美國專利第3,896,111號及第4,151,042號。製備抗體－類美登素結合物之方法亦描述於美國專利第5,208,020號中。在一較佳實施例中，類美登素係經由雙硫鍵或其他含硫連接子基團與抗體連接。例如可將美登素轉化為May－SS－Me，May－SS－Me可被還原為May－SH3且與經修飾抗體反應以產生類美登素－抗體免疫結合物。Chari等人，Cancer Res. 52 ：127－131(1992)。可藉由已知方法修飾抗體且接著使含有游離或受保護硫醇基之抗體與含有類美登素之二硫化物反應以產生結合物。可藉由已知方法及所測定之IC50 活體外或活體內量測抗體－類美登素結合物之細胞毒性。
刺孢黴素為所關注之另一免疫結合物。刺孢黴素家族之抗生素能夠產生在亞皮莫耳濃度下斷裂之雙股DNA。可使用之刺孢黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1 1 、α2 1 、α3 1 、N－乙醯基－γ1 1 、PSAG及θ1 1 (Hinman等人，Cancer Res.53：3336－3342(1993)及Lode等人，Cancer Res.58：2925－2928(1998))。可與抗體結合之其他抗腫瘤藥物包括為抗 葉酸劑之QFA。刺孢黴素與QFA皆具有胞內作用位點且不易跨過質膜。因此，此等藥劑經由抗體介導之內化作用所達成之細胞吸收極大增強其細胞毒性作用。
亦涵蓋在抗體與具有酵素核分解活性之化合物之間所形成的免疫結合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如脫氧核糖核酸酶，DNase)。
在本發明之ADC中，經由連接子(L)使抗體(Ab)與一或多個藥物部分(D)(例如每抗體約1至約20個藥物部分)結合。可藉由若干途徑，採用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑來製備式I之ADC：(1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成Ab－L，隨後與藥物部分D反應；及(2)使藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D－L，隨後與抗體親核基團反應。
Ab－(L－D)p 式I 抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N末端胺基，(ii)側鏈胺基，例如離胺酸，(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸，及(iv)糖羥基或胺基，抗體在該等糖羥基或胺基處糖基化。胺、硫醇及羥基具親核性且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應以形成共價鍵，該等親電子基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及醯鹵；(ii)烷基鹵化物及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈間雙硫鍵，亦即半胱胺酸橋。可藉由以諸如 DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑處理來使抗體對於與連接子試劑結合而言具反應性。因此，理論上每一半胱胺酸橋形成兩個反應性硫醇親核體。可經由離胺酸與2－亞胺基硫雜環戊烷(Traut氏試劑)反應使胺轉化為硫醇來將額外親核基團引入抗體中。
亦可藉由修飾抗體以引入可與連接子試劑或藥物上之親核性取代基反應之親電子部分來產生本發明ADC。糖基化抗體之糖可例如經高碘酸氧化劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應之醛或酮基。所得亞胺席夫鹼基團(imine Schiff base group)可形成穩定鍵或可(例如)由氫硼化物試劑還原以形成穩定胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可於蛋白質中產生可與藥物上之適當基團反應之羰基(醛及酮)基團(Domen等人，J.Chromatog. ,510：293－302(1990))。在另一實施例中，可使含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質與偏過碘酸鈉反應，從而在第一胺基酸之位置上產生醛(Geoghegan及Stroh,Bioconjugate Chem. 3：138－46(1992)；US 5,362,852)。可使該醛與藥物部分或連接子親核體反應。
同樣，藥物部分上之親核基團包括(但不限於)：能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應以形成共價鍵之胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫代半卡巴腙(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，該等親電子基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲 酸酯及醯鹵；(ii)烷基鹵化物及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。
或者，可(例如)藉由重組技術或肽合成來製造包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白。DNA長度可包含編碼結合物之兩個部分之各別區域，該等區域彼此相鄰或由不破壞所需結合物特性，編碼連接子肽之區域分隔。
在另一實施例中，可將抗體結合至用於預靶向腫瘤之"受體"(諸如抗生蛋白鏈菌素)，其中將抗體－受體結合物投與患者，隨後使用清除劑自循環中移除未經結合之結合物且接著投與與細胞毒性劑(例如放射性核苷)結合之"配位體"(例如抗生物素蛋白)。
本文中之ADC視情況由可購得(例如Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL)之交聯試劑製備：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC－SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基－EMCS、磺基－GMBS、磺基－KMUS、磺基－MBS、磺基－SIAB、磺基－SMCC及磺基－SMPB及SVSB(丁二醯亞胺基－(4－乙烯基碸)苯甲酸酯)。
亦可將抗體結合至高放射性原子。可利用各種放射性核來產生放射性結合之抗體。實例包括At211 、Bi212 、I131 、In131 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、P32 及Pb212 及Lu之放射性同位素。當將結合物用於診斷時，其可包含用於閃爍造影術研究之放射性原子，例如Tc99 或I123 ；或用於核磁共振(nmr)成像之自旋標記(亦稱作磁共振成像，mri)，諸如碘－ 123、碘－131、銦－111、氟－19、碳－13、氮－15、氧－17、釓、錳或鐵。
可以已知方式將放射性標記或其他標記併入結合物中。舉例而言，肽可經生物合成或可藉由使用合適胺基酸前驅體進行化學胺基酸合成來合成(涉及(例如)氟－19替代氫)。標記(諸如Tc99 或I123 、Re186 、Re188 及In111 )可經由肽中之半胱胺酸殘基來連接。釔－90可經由離胺酸殘基來連接。IODOGEN法可用以併入碘－123，Fraker等人，Biohem.Biophys.Res.Commun. 80 ：49－57(1978)。結合放射性核之其他方法係描述於"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy,"(Chatal,CRC Press 1989)中。
或者，可藉由重組技術或肽合成來製造包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白。DNA長度可包含編碼結合物之兩個部分之各別區域，該等區域彼此鄰近或藉由不破壞所需結合物特性，編碼連接子肽之區域分隔。
在另一實施例中，可將抗體結合至用於預靶向腫瘤之"受體"(諸如抗生蛋白鏈菌素)，其中將抗體－受體結合物投與患者，隨後使用清除劑自循環中移除未經結合之結合物且接著投與與細胞毒性劑(例如放射性核苷)結合之"配位體"(例如抗生物素蛋白)。
12)其他胺基酸序列修飾 涵蓋本文中所述之抗體之胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體係藉由於抗體核酸中引入適當核苷 酸變化或藉由肽合成來製備。該等修飾包括(例如)抗體之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代之任何組合以達成最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變抗體之後轉譯加工，諸如改變糖基化位點之數目或位置。
適用於識別抗體作為較佳突變位置之特定殘基或區域的方法稱作如由Cunningham及Wells，Science 244 ：1081－1085(1989)所描述之"丙胺酸掃描突變"。此處，識別殘基或靶殘基群(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且使其經中性或帶負電之胺基酸(最佳丙胺酸或多聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點上或對取代位點引入另外或其他變異體來改進彼等對取代顯示功能敏感性之胺基酸位置。因此，儘管可預定引入胺基酸序列變化之位點，但突變本身之性質不必預定。舉例而言，為分析在給定位點上突變之效能，在靶密碼子或區域上進行ala掃描或隨機突變且針對所需活性篩選所表現之抗體變異體。
胺基酸序列插入包括長度範圍介於一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽之間的胺基末端及/或羧基末端融合以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯殘基之抗體或與細胞毒性多肽融合之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體N或C末端與增加抗體血清半衰期之酶(例如ADEPT)或多肽融合。
另一類型之變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中至少有一個胺基酸殘基經不同殘基置換。最受關注之取代突變位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。下表A中"較佳取代"項下展示保守性取代。若該等取代引起生物活性變化，則可引入更具實質性之變化(在表A中稱為"例示性取代"，或如下關於胺基酸種類進一步描述)且篩選產物。
藉由選擇取代來達成抗體生物特性之實質性修飾，該等取代在其對維持以下各項之影響方面顯著不同：(a)取代區域內多肽骨架之結構，例如呈摺疊或螺旋構形，(b)靶位點 分子處之電荷或疏水性或(c)側鏈大小。基於常見側鏈特性將天然產生之殘基分組：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：asn、gln、his、lys、arg；(5)影響鏈取向之殘基：gly、pro；及(6)芳族性：trp、tyr、phe。
非保守性取代將需要將此等種類之一者之成員與另一種類交換。
不涉及維持抗體之合適構形之任何半胱胺酸殘基亦可通常經絲胺酸取代以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改良其穩定性(尤其在抗體為抗體片段，諸如Fv片段時)。
特別較佳類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步開發之所得變異體將具有相對於產生其之親本抗體改良之生物特性。產生該等取代變異體之便利方式包括使用噬菌體呈現進行之親和力成熟。簡而言之，使若干高變區位點(例如6－7位點)突變以在各位點處產生所有可能之胺基取代。如此產生之抗體變異體以單價形式自絲狀噬菌體顆粒呈現為與封裝於各顆粒內之M13基因III產物之融合體。接著如本文中所揭示針對生物活性(例如結合親和力)來篩選經噬菌體呈現之變異體。為識別用 於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變以識別顯著促進抗原結合之高變區殘基。其他或另外，其可有益於分析抗原抗體複合物之晶體結構以識別抗體與IgE之間的接觸點。該等接觸殘基及鄰近殘基為根據本文中所詳述之技術取代的候選者。產生該等變異體後，對變異體組進行如本文中所描述之篩選且可選擇在一或多種相關檢定中具有優良特性之抗體用於進一步開發。
抗體之另一類型之胺基酸變異體改變抗體之原始糖基化模式。改變意謂使見於抗體中之一或多個碳水化合物部分缺失，及/或添加一或多個不存在於抗體中之糖基化位點。
抗體之糖基化通常為N－連接或O連接。N－連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺酸殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺酸－X－絲胺酸及天冬醯胺酸－X－蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為碳水化合物部分與天冬醯胺酸側鏈之酶促連接的辨識序列。因此，在多肽中此等三肽序列中任一者之存在產生可能的糖基化位點。O－連接糖基化係指糖N－乙醯半乳胺糖胺、半乳糖或木糖中之一者與羥胺基酸(最通常為絲胺酸或蘇胺酸)連接，但亦可使用5－羥脯胺酸或5－羥離胺酸。
藉由改變胺基酸序列使得其含有上述三肽序列中之一或多者來便利地完成抗體中糖基化位點之添加(對於N連接糖基化位點而言)。亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至原始抗體之序列中，或由一或多個絲胺酸或蘇胺 酸殘基取代原始抗體之序列來進行變化(對於O－連接糖基化位點而言)。
藉由此項技術中已知之多種方法製備編碼抗IgE抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子。此等方法包括(但不限於)：自天然源分離(在天然產生胺基酸序列變異體之情況下)或由早期製備之抗IgE抗體之變異或非變異形式的寡聚核苷酸介導(或位點定向)之突變、PCR突變及盒式突變來製備。
13)其他抗體修飾 本發明抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之額外非蛋白性部分。較佳地，適用於抗體衍生作用之部分為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯咯啶酮、聚1,3－二氧戊環、聚－1,3,6－三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(N－乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚合物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中穩定而可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量且可分枝或未分枝。與抗體連接之聚合物數目可變化，且若連接一種以上聚合物，則該等聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良之抗體之具體特性或功能，抗體衍生物是否用於指 定條件下之療法等考慮因素來確定。該等技術及其他合適調配物係揭示於Remington：The Science and Practice of Pharmacy ，第20版，Alfonso Gennaro編，Philadelphia College of Pharmacy and Science(2000)。
C.醫藥調配物
藉由將具有所需純度之活性成份與可選之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備治療調配物以供儲存(Remington：The Science and Practice of Pharmacy ，第20版，Lippincott Williams & Wiklins,Pub.,Gennaro編，Philadelphia,PA 2000)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對受體無毒且包括緩衝劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑、等滲劑、穩定劑、金屬錯合物(例如Zn蛋白質錯合物)；螯合劑(諸如EDTA及/或非離子界面活性劑)。當治療劑為抗體片段時，與靶蛋白之結合域特異性結合之最小抑制性片段較佳。舉例而言，基於抗體之可變區序列，可設計保持與靶蛋白序列結合之能力之抗體片段或乃至肽分子。該等肽可化學合成及/或藉由重組DNA技術產生(參見例如Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7889－7893[1993])。
使用緩衝劑以將pH值控制在使療效最佳之範圍內，尤其在穩定性與pH值相關時更係如此。緩衝劑較佳以約50 mM至約250 mM範圍內之濃度存在。為本發明使用之合適緩衝劑包括有機酸及無機酸及其鹽。舉例而言，檸檬酸鹽、 磷酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。此外，緩衝劑可由組胺酸及三甲胺鹽(諸如Tris)組成。
添加防腐劑以延遲微生物生長，且防腐劑通常存在於0.2%－1.0%(w/v)之範圍內。為本發明使用之合適防腐劑包括氯化十八基二甲基苄銨；氯化六羥季銨；苯甲烴銨鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯銨；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇、3－戊醇及間甲酚。
存在張力劑(有時稱作"穩定劑")以調節或維持組合物中液體之張力。當與較大帶電生物分子(諸如蛋白質及抗體)一起使用時，其通常被稱作"穩定劑"，因為其可與胺基酸側鏈之帶電基團相互作用，藉此減小分子間及分子內相互作用之可能性。考慮其他成份之相對量，滲透劑可以0.1重量%至25重量%之間，較佳1至5%之間的任何量存在。較佳之張力劑包括多元糖醇，較佳三元或更高元數之糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。
額外賦形劑包括可用作以下試劑中之一或多種之試劑：(1)膨化劑，(2)增溶劑，(3)穩定劑及(4)及防止變性或黏著於容器壁之試劑。該等賦形劑包括：多元糖醇(以上所列)；胺基酸，諸如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2－苯 丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環多醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫之還原劑，諸如尿素、麩胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫代甘油、α－單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二醣(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三糖，諸如棉子糖；及多醣，諸如糊精或葡聚糖。
存在非離子界面活性劑或清潔劑(亦稱作"濕潤劑")以助於溶解治療劑以及保護治療性蛋白質使其免於攪拌誘發之凝集，其亦允許調配物曝露於剪切表面應力而不引起活性治療性蛋白質或抗體之變性。非離子界面活性劑存在於約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml，較佳約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml之範圍內。
合適非離子界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、68、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、PLURONIC多元醇、TRITON、聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN－20、TWEEN－80等)、聚桂醇400、硬脂酸聚烴氧40、聚氧化乙烯氫化蓖麻油10、50及60、單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基纖維素。可使用之陰離子清潔劑包括月桂基硫酸鈉、二辛基磺基丁二酸鈉及二辛基磺酸鈉。陽離子清潔劑包括氯苄烷銨或苄索氯 銨。
為使調配物可用於活體內投藥，其必須無菌。可藉由經由無菌過濾膜過濾來使調配物無菌。一般將本文中之治療組合物置於具有無菌接取口之容器中，例如靜脈內溶液袋或具有可為皮下注射針刺穿之塞子的小瓶。
投藥途徑係根據已知及已接受之方法，諸如藉由以合適方式單次或多次團式注射或經較長時間段輸液(例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內或關節內途徑注射或輸液)、局部投藥、吸入或藉由持續釋放或延長釋放方式。
本文中之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需的活性化合物，較佳具有互補活性但彼此並無不利影響之彼等活性化合物。其他或另外，組合物可包含細胞毒性劑、細胞激素或生長抑制劑。該等分子合適地以有效達成預定目標之量存在於組合中。
亦可將活性成份囊包於以下各者中：(例如)藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微囊，分別例如羥甲基纖維素或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊；膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米囊；或巨乳液。該等技術係揭示於同上文之Remington's Pharmaceutical Sciences 第18版中。
本文中所述之蛋白質及抗體之穩定性可經由使用無毒"水溶性多價金屬鹽"來增強。實例包括Ca2＋ 、Mg2＋ 、Zn2＋ 、Fe2＋ 、Fe3＋ 、Cu2＋ 、Sn2＋ 、Sn4＋ 、Al2＋ 及Al3＋ 。可與 以上多價金屬陽離子形成水溶性鹽之陰離子實例包括由無機酸及/或有機酸形成之彼等陰離子。該等水溶性鹽在水中(在20℃下)具有至少約20 mg/ml，或至少約100 mg/ml，或者至少約200 mg/ml之溶解度。
可用以形成"水溶性多價金屬鹽"之合適無機酸包括鹽酸、乙酸、硫酸、硝酸、硫氰酸及磷酸。可使用之合適有機酸包括脂族羧酸及芳族酸。可將此定義內之脂族酸定義為飽和或不飽和C2－9 羧酸(例如脂族單羧酸、二羧酸及三羧酸)。舉例而言，此定義內之例示性單羧酸包括飽和C2－9 單羧酸乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸及癸酸及不飽和C2－9 單羧酸丙烯酸、丙酸甲基丙烯酸、丁烯酸及異丁烯酸。例示性二羧酸包括飽和C2－9 二羧酸丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸及庚二酸，而不飽和C2－9 二羧酸包括順丁烯二酸、反丁烯二酸、甲基順丁烯二酸及甲基反丁烯二酸。例示性三羧酸包括飽和C2－9 三羧酸丙三羧酸及1,2,3－丁三羧酸。此外，此定義之羧酸亦可含有一或兩個羥基以形成羥基羧酸。例示性羥基羧酸包括乙二醇酸、乳酸、甘油酸、羥丙二酸、蘋果酸、酒石酸及檸檬酸。此定義內之芳族酸包括苯甲酸及水楊酸。
可用以促進穩定經囊封之本發明多肽之常用水溶性多價金屬鹽包括，例如：(1)鹵化物之無機酸金屬鹽(例如氯化鋅、氯化鈣)、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽及硫氰酸鹽；(2)脂族羧酸金屬鹽(例如乙酸鈣、乙酸鋅、丙酸鈣、羥乙酸鋅、乳酸鈣、乳酸鋅及酒石酸鋅)；及(3)芳族羧酸金屬鹽 苯甲酸鹽(例如苯甲酸鋅)及水楊酸鹽。
D.治療方法
對於預防或治療疾病而言，活性劑之適當劑量將視如上所定義之待治療之疾病類型、疾病嚴重程度及進程、藥劑係出於預防目的抑或治療目的投與、先前療法、患者臨床病史及對藥劑之反應，及主治醫師判斷而定。一次性或經一系列治療將抗體合適地投與患者。
較佳治療方法為治療IgE介導之病症。IgE介導之病症包括異位性病症，其特徵為對許多常見天然產生之吸入及攝入抗原作出免疫反應之一般遺傳傾向及IgE抗體之不斷產生。特定異位性病症包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎及過敏性胃腸病。異位性患者通常具有多種過敏症，意謂其具有對多種環境過敏原之IgE抗體及源自多種環境過敏原之症狀，該等環境過敏原包括花粉、真菌(例如黴菌)、動物及昆蟲殘骸及某些食物。
然而，與IgE含量升高相關之病症不限於具有遺傳(異位性)病原學之彼等病症。似乎為IgE介導且可以本發明調配物治療之與IgE含量升高相關的其他病症包括超敏(例如過敏性超敏)、濕疹、蕁麻疹、過敏性支氣管肺麴菌病、寄生蟲疾病、高IgE症候群、共濟失調毛細血管擴張、維－奧二氏症候群、胸腺淋巴發育不全、IgE骨髓瘤及移植物抗宿主反應。
亦稱為過敏性鼻結膜炎或花粉熱之過敏性鼻炎為對吸入過敏原之異位性反應的最常見表現，其嚴重程度及持續時 間通常與曝露於過敏原之強度及時間相關。其為一種可首次出現在任何年齡，但通常在兒童或青春期發作之慢性病。典型發作由大量水樣鼻漏、突發性噴嚏、鼻阻塞及鼻及齶瘙癢組成。鼻後黏液排泄引起喉嚨痛、清嗓及咳嗽。亦可存在具有結膜及眼瞼劇烈瘙癢、發紅、流淚及畏光之過敏性瞼結膜炎症狀。嚴重發作通常在劇烈噴嚏期後伴隨全身性不適、虛弱、疲憊且有時伴隨肌肉疼痛。
哮喘亦稱作可逆阻塞性氣管疾病，特徵為氣管支氣管樹對於呼吸刺激物及支氣管收縮化學物質之高反應性，產生自發性或治療可逆之喘鳴、呼吸困難、胸悶及咳嗽發作。其為涉及整個氣管之慢性病，但嚴重程度不同，由偶然輕度瞬時急性發作至嚴重慢性危急生命的支氣管阻塞。哮喘及異位性(atopy)可共存，但僅約一半哮喘亦為異位性，且甚至更小百分比之異位性患者亦有哮喘。然而，異位性與哮喘並非完全無關，哮喘發生於異位性個體較非異位性個體更頻繁，尤其在兒童時期。哮喘在歷史上已進一步分為兩個子群，外因性哮喘及內因性哮喘。
外因性哮喘亦稱作過敏性、異位性或免疫學哮喘，描述一般年幼(通常在嬰兒或兒童時期)發生哮喘之患者。異位性之其他表現包括濕疹或過敏性鼻炎通常共存。哮喘發作可發生在花粉季節期間，動物存在下，或曝露於室內塵埃、羽毛枕或其他過敏原時。皮膚測試顯示對病因性過敏原之陽性風疹塊及潮紅反應(wheal－and－flare reaction)。有趣的是總血清IgE濃度時常升高，但有時正常。
內因性哮喘亦稱為非過敏性或特發性哮喘，通常首先發生在成人時期，於明顯呼吸道感染之後。症狀包括與花粉季節或曝露於其他過敏原無關之慢性或復發性支氣管阻塞。皮膚測試對於常見異位性過敏原為陰性，血清IgE濃度正常。其他症狀包括痰血及嗜伊紅血球增多。將哮喘分為子群之其他機制，如阿司匹林敏感型、運動誘發型、感染型及心理型，僅定義影響某些患者比其他因素更大之外部觸發因素。
最後，重要的是應注意，儘管一些分類在歷史上僅使過敏性哮喘與IgE依賴性相關聯，但現在強有力統計上顯著之資料顯示IgE與哮喘(過敏性與非過敏性)之間相關。第27章，"The Atopic Diseases",A.I.Terr於Medical Immunology，第9版，Simon and Schuster,Stites等人編(1997)。因此，對於本專利申請案，術語"IgE介導之病症"包括過敏性及非過敏性哮喘。
哮喘發作之身體徵象包括呼吸急促、可聞之喘鳴及使用副呼吸肌。通常亦存在疾脈及血壓升高，外周血液及鼻分泌物中嗜伊紅細胞含量升高。肺功能顯示流率及1秒用力呼氣量(FEV1 )減少。總肺活量及功能性餘氣量通常正常或略有增加，但可能在極度支氣管痙攣下減少。
哮喘病理可區分為早期及晚期反應。早期之特徵為平滑肌收縮、水腫及高分泌，而晚期反應之特徵為細胞炎症。哮喘可為各種非特異性觸發因素誘發，該等非特異性觸發因素包括感染(例如病毒性呼吸道感染)、生理因素(例如運 動、換氣過度、深呼吸、心理因素)、大氣因素(例如二氧化硫、氨、冷空氣、臭氧、蒸餾水蒸氣)、攝取物(例如普萘洛爾(propranolol)、阿司匹林、非類固醇消炎藥)、實驗性吸入劑(例如高滲溶液、檸檬酸、組織胺、乙醯甲膽鹼、前列腺素F2α )及職業性吸入物(例如異氰酸酯)。引起過敏性哮喘之各種額外職業性或環境過敏原可包括動物產品、昆蟲粉末、海洋生物、植物產品、果實、種子、葉子及花粉、有機染料及墨水、微生物劑、酶、治療劑、殺菌劑，及無機及有機化學物質。
亦稱為濕疹、神經性皮膚炎、異位性濕疹或貝氏癢疹(Besnier's prurigo)之異位性皮膚炎為對具有家族及免疫學異位性特徵之患者子集具特異性的常見慢性皮膚病症。基本特徵為瘙癢皮膚炎性反應，其誘發偏向於特定部位之特徵性對稱分布皮膚斑疹。亦存在頻繁的B淋巴細胞過度產生IgE。儘管由於異位性皮膚炎與過敏性鼻炎及哮喘及高IgE含量相關聯，故將其歸類為皮膚異位性形式，然而皮膚炎之嚴重程度不一定與皮膚測試時曝露於過敏原相關，且脫敏(不像其他過敏性疾病)並非有效治療。儘管高血清IgE證實過敏性哮喘之診斷，但正常含量並不排除過敏性哮喘。疾病發作可發生於任何年齡，且病變以紅斑狀水腫丘疹或伴隨剝落之斑塊急性起始。瘙癢引起滲出及結痂，接著引起慢性苔蘚樣硬化。在細胞層級上，急性病變為水腫性病變且單核細胞、CD4淋巴細胞滲入真皮。嗜中性白血球、嗜伊紅細胞、漿細胞及嗜鹼性細胞較少見，但存在 去顆粒化之肥大細胞。慢性病變以表皮增生、表皮角化病及角化不全為特徵且單核細胞、郎格罕氏細胞(Langerhans' cell)及肥大細胞滲入真皮。亦可存在纖維化之病灶區(包括涉及小神經之神經束膜)。
亦稱作嗜伊紅細胞胃腸病之過敏性胃腸病為多種IgE食物敏感性與局部胃腸道黏膜反應相關聯之異常異位性表現。其在成人中較少見，但在嬰兒中更常見，但為短暫的。該病況在所攝取之食物過敏原與局部IgE抗體反應時致使空腸黏膜釋放肥大細胞介體，從而在進食不久後產生消化系統症狀。持續曝露產生慢性炎症，致使胃腸蛋白損失及低蛋白水腫。經由發炎腸黏膜失血可足夠顯著地引起缺鐵性貧血。過敏性反應在過敏原曝露後局部發生於上胃腸道黏膜中，但藉由避開過敏原而消除。
過敏反應及蕁麻疹明顯為IgE所介導，但其缺乏遺傳決定子且不偏向於異位性個體。過敏反應為同時涉及若干器官系統(通常為心血管系統、呼吸系統、皮膚系統及胃腸系統)之急性、全身性過敏反應。該反應為免疫學上介導的，且其發生於曝露於先前致敏受檢者所針對之過敏原時。蕁麻疹及血管性水腫係指由淺表皮膚血管中組織胺刺激之受體產生之身體腫脹、紅斑及瘙癢且為全身過敏之特徵性皮膚特徵。全身過敏為在多個器官中同時出現由藥物、昆蟲毒液或食物產生之IgE介導之反應。其係由過敏原誘發之負載肥大細胞之IgE突然引起，致使各種重要器官功能產生嚴重且危急生命之改變。血管衰竭、急性氣管 阻塞、皮膚血管擴張及水腫及胃腸及泌尿生殖器肌肉痙攣幾乎同時發生，儘管不一定達到相同程度。
過敏反應之病理包括血管性水腫及肺過度膨脹，伴有氣管黏液阻塞及病灶性肺不張。在細胞層級上，肺呈現類似於急性哮喘發作期間之表現，伴有支氣管黏膜下腺過度分泌，黏膜及黏膜下水腫、支氣管周邊血管充血及支氣管壁中嗜伊紅血球增多。可存在肺水腫及出血。亦可存在支氣管肌肉痙攣、肺泡過度膨脹且甚至破裂。人類過敏反應之重要特徵包括喉、氣管、會厭及下嚥部固有層中之水腫、血管充血及嗜伊紅血球增多。
曝露於過敏原可經由攝取、注射、吸入或與皮膚或黏膜接觸。反應在曝露於過敏原後之數秒或數分鐘內開始。可能存在瀕臨死亡之恐懼或感覺，隨後快速轉為一或多種靶器官系統中之症狀：心血管系統、呼吸系統、皮膚系統或胃腸系統。
造成過敏反應之過敏原不同於常與異位性相關之彼等過敏原。食物、藥物、昆蟲毒液或乳汁為常見來源。食物過敏原包括見於甲殼動物、軟體動物(例如龍蝦、蝦、蟹)、魚、豆類(例如花生、豌豆、黃豆、甘草)、種子(例如芝麻、棉籽、葛縷子、芥末、亞麻子、向日葵)、堅果、漿果、蛋白、蕎麥及乳液之彼等食物過敏原。藥物過敏原包括見於異源蛋白質及多肽、多醣及半抗原藥物之彼等過敏原。昆蟲過敏原包括膜翅目昆蟲，包括蜜蜂、小黃蜂、大黃蜂、黃蜂及火蟻。
儘管腎上腺素為過敏反應之典型治療，但通常開抗組織胺劑或其他組織胺阻斷劑用於不太嚴重之蕁麻疹或血管性水腫反應。
E.組合療法
本發明方法可與IgE介導之病症之已知療法以經組合或額外治療步驟或作為治療調配物之額外組份組合。
舉例而言，可在本發明之抗IgE抗體之前或同時投與抗組織胺劑，尤其非鎮靜性抗組織胺劑。合適抗組織胺劑包括烷基胺(例如氯芬尼拉明)、乙醇胺(例如苯海拉明)及啡噻嗪(例如異丙嗪)。儘管許多抗組織胺劑藉由阻斷組織胺在效應細胞上之受體位點來拮抗組織胺之藥理作用，但其他常用抗組織胺藥藉由阻斷已經致敏且武裝有過敏原特異性IgE(例如色甘胺酸鈉)之肥大細胞釋放組織胺而起作用。抗組織胺劑之實例為阿司咪唑、順丁烯二酸哌吡庚啶、順丁烯二酸溴苯那敏、順丁烯二酸氯苯吡醇胺、鹽酸西替利嗪、反丁烯二酸氯馬斯汀、鹽酸賽庚啶、順丁烯二酸右溴苯那敏、順丁烯二酸右氯苯那敏、茶苯海明、鹽酸苯海拉明、丁二酸杜克西拉明、鹽酸非索那定、鹽酸特非那丁、鹽酸羥嗪、氯雷他定、鹽酸敏克靜、檸檬酸曲吡那敏、鹽酸曲吡那敏、鹽酸曲普利啶。
IgE介導之病症之特定症狀(例如早期反應)可用擬交感神經藥或具有支氣管擴張作用之藥物改善。腎上腺素為通常以0.2－0.5 mL劑量之1：100水溶液皮下投與之廣效α及β腎上腺素。在需要較長作用持續時間時亦使用1：200懸浮液中 長效形式之腎上腺素(亦即特布他林(terbutaline))。合適之額外β腎上腺素包括經鼻(例如手持式霧化器、間歇式正壓呼吸裝置或計量加壓吸入器)或經口投與之沙丁胺醇、吡布特羅、奧西那林、沙美特羅、異他林及福美特羅(formeterol)。
亦可經由投與黃嘌呤，尤其在與以上擬交感神經藥組合投與時達成支氣管擴張。黃嘌呤之實例包括胺茶鹼(靜脈注射，250－500 mg)及茶鹼(口服，10－20 μg/ml血清濃度)。各種IgE介導之病症之其他症狀(例如晚期反應)可藉由以糖皮質激素或其他具有消炎作用之藥物治療而減弱。全身投與強的松(每日30－60 mg)用於嚴重發作，而以氣霧形式投與二丙酸倍氯米松、曲安奈德及氟尼縮松作為長期維持療法。具有消炎作用之額外皮質類固醇包括：倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氟氫可的松、氟尼縮松、丙酸氟替卡松、氫化可的松、甲潑尼龍、強的松龍、強的松、曲安西龍。
亦可與本發明治療法組合使用之非類固醇消炎藥包括：乙醯胺苯酚、阿司匹林、溴芬酸鈉、雙氯苯胺苯乙酸鈉、二氟尼柳、依託度酸、非諾洛芬鈣、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、美洛芬鈉、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、萘普生鈉、羥布宗、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、托美丁鈉。
此外，亦可藉由投與解充血劑(例如苯腎上腺素、苯丙醇胺、假麻黃素(pseudoephadrin))、咳嗽抑制劑(例如右甲 嗎喃(dextromethorphan)、可待因(codeine)或氫可酮(hydrocodone))或止痛劑(例如乙醯胺苯酚、阿司匹林)來達成最大治療效益。
過敏原脫敏為出於減輕或消除過敏性反應之目的將過敏原注射至患者體內之治療形式。其亦稱為過敏原免疫療法、減敏作用或過敏症注射療法。其通常與其他過敏症治療組合使用，但不常作為主要治療。其在不可能避開過敏原時成功地加以採用。典型過敏原脫敏治療併入以遞增劑量每週一次或兩次皮下注射無菌過敏原直至達到在注射部位產生瞬時小局部區域炎症之劑量。接著按維持時程以每2－4週一次給予該劑量。過敏性脫敏最常用於治療過敏性哮喘及過敏性鼻炎，儘管其已在治療過敏反應中取得成功。亦經由使用佐劑(諸如作為含水抗原於礦物油中之乳液之弗氏不完全佐劑)來有效地使用脫敏。生理作用產生逐漸釋放過敏原液滴之不溶性液體儲槽。另一種形式之過敏原脫敏為將單體過敏原與戊二醛聚合以產生具有相對較低過敏原性(亦即引起過敏性反應)之分子，同時保持免疫原性之有效度。
F.藥物劑量 ：
本發明醫藥組合物之劑量及所需藥物濃度可視所預想之特定用途而定。適當投藥劑量或途徑之確定完全處於普通熟習此項技術者之技能範圍內。動物實驗提供確定人類療法有效劑量之可靠指導。可根據Mordenti,J.及Chappell,W."The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,"Toxicokinetics and New Drug Development 中，Yacobi等人編，Pergamon Press,New York 1989，第42－46頁中所制定之原則來進行有效劑量之種間按比例縮放。
當使用本文所述之多肽或抗體之活體內投與時，正常劑量可視投藥途徑自每天每公斤哺乳動物體重約10毫微克至約100毫克，較佳每天每公斤體重約1毫克至每天每公斤體重10毫克變化。文獻中提供關於特定劑量及傳遞方法之指導；參見例如美國專利第4,657,760號、第5,206,344號或第5,225,212號。在本發明之範疇內，不同調配物將對不同治療及不同病症有效，且意欲治療特定器官或組織之投藥可能必需以不同於意欲治療另一器官或組織之方式傳遞。此外，劑量可藉由一或多次獨立投藥，或藉由連續輸液投與。對於在數天或更長時間內重複投藥而言，視病況而定，持續治療直至發生所需疾病症狀抑制。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及檢定監控。
G.投與調配物
根據已知方法(諸如以團式注射形式或藉由經一段時間連續輸液靜脈內投藥，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑)，向需要以蛋白質治療之哺乳動物(較佳人類)投與本發明之調配物(包括但不限於復水調配物)。
在較佳實施例中，藉由皮下(亦即在皮膚下)投藥來向哺乳動物投與調配物。對於該等目的而言，可使用注射器注 射調配物。然而，可利用用於投與調配物之其他裝置，諸如注射裝置(例如INJECT－EASETM 及GENJECTTM 裝置)；注射筆(諸如GENPENTM )；自動注射裝置、無針裝置(例如MEDIJECTORTM 及BIOJECTORTM )及皮下貼片傳遞系統。
在一特定實施例中，本發明係關於用於單一劑量投與單元之套組。該等套組包含治療性蛋白質或抗體之含水調配物之容器，包括單腔室或多腔室預填充注射器。例示性預填充注射器可自Vetter GmbH,Ravensburg,Germany購得。
蛋白質之適當劑量("治療有效量")將視(例如)待治療病況、病況之嚴重程度及進程、蛋白質係出於預防目的抑或治療性目的投與，先前療法、患者之臨床病史及對蛋白質之反應，所使用之蛋白質類型及主治醫師判斷而定。蛋白質係一次性或經一系列治療合適地投與患者且可在自診斷起之任何時間投與患者。蛋白質可以單獨治療或與適用於治療所討論病況之其他藥物或療法聯合投與。
當所選蛋白質為抗體時，無論(例如)藉由一次抑或多次獨立投藥，投與患者之初始候選劑量皆為約0.1－20 mg/kg。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術監控。
抗IgE調配物(例如rhuMAbE－25、rhMAbE－26、Hu－901)之用途包括(例如)治療或預防IgE介導之過敏性疾病、寄生蟲感染、間質性膀胱炎及哮喘。視待治療之疾病或病症而定，向患者投與治療有效量(例如約1－15 mg/kg)之抗IgE抗體。
H.製造物品
在本發明之另一實施例中，提供含有調配物且較佳提供其使用說明之製造物品。製造物品包含容器。合適容器包括(例如)瓶子、小瓶(例如雙腔室小瓶)、注射器(諸如單一腔室或雙腔室注射器)及試管。容器可由諸如玻璃或塑膠之各種材料形成。容器保存調配物。容器上或與容器相聯之標記可指示復水及/或使用說明。標記可進一步指示調配物適用於或意欲用於皮下投與。保存調配物之容器可為容許重複投與(例如2－6次投與)復水調配物之多次使用小瓶。製造物品可進一步包含第二容器，該第二容器包含合適稀釋劑(例如BWFI)。在將稀釋劑與凍乾調配物混合後，復水調配物中之最終蛋白質濃度一般將為至少50 mg/ml。製造物品可另外包括為商業及使用者觀點所需之其他材料，其包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明之包裝插頁。
將參考以下實例更詳細地瞭解本發明。然而，不應將其視為限制本發明之範疇。整個揭示案中之所有引用係明確地以引用的方式併入本文中。
在另一實施例中，本發明提供包含用於以自動注射裝置投與之本文所述調配物之製造物品。可將自動注射器描述為在活化後無需由患者或投藥者額外操作而傳遞其內容物之注射裝置。其特別適用於傳遞速率必須恆定且傳遞時間並非短時間時治療調配物之自療。
實例1
分離靈長類動物IgE 自人類IgE骨髓瘤細胞株U266(ATCC,Manassas,VA,TIB#196)選殖人類IgE。藉由自源自經刺激產生IgE轉換細胞(PBMC)之恆河猴及大外周血液單核細胞之cDNA選殖且定序IgE來確定恆河猴及犬IgE序列。由人類IgE序列設計正向及反向引子(如下所示)。恰好在CH2域上游設計上游正向引子。在跨膜域末端設計反向引子。恆河猴及犬PBMC係獲自California National Primate Research Center(Davis,CA)。將5×106 PBMC與IL－4(100 ng/ml)及CD40L(3 μg/ml)(R&D Systems,Minneapolis,MN,分別為#204－IL及#617－CL)一起培養4天。接著收集細胞，製備RNA(RNeasy Mini Kit,#74106,Qiagen,Valencia,CA)且使用BD Sprint Powerscript寡dT引子套組(BD Biosciences,San Jose,CA,#639558)製造cDNA。接著進行RT－PCR[94℃下2分鐘；94℃下15秒；60℃下30秒；68℃下2分鐘；循環30次；68℃下10分鐘]。在指定次數之循環後添加Taq聚合酶(10分鐘，72℃)以添加用於TA選殖之A懸垂物(Invitrogen,Carlsbad,CA,#45－0641)。藉由TOPO－TA選殖來選殖PCR產物且接著對純系進行序列驗證(Genentech,Inc.)。使用內部分析程序(Genentech,Inc.)來對準人類序列、恆河猴序列及犬序列。以下同源性係針對CH2域與跨膜域之間的序列。在恆河猴(432胺基酸)與犬(431胺基酸)之間，存在6處差異，同源性大約為98.6%。在人類與恆河猴之間，存在53處差異，相當於87.7%同源性。人類與犬之間存在56處差異， 相當於87%同源性(參見圖1)。
用於選殖之引子： CH2序列上游之正向引子：5'－ccgcccaccgtgaagatcttacagtc (SEQ IDNO：63) 跨膜域末端之反向引子：5'－cggctcgagactaggcgtggggctggaggacgttg (SEQ ID NO：64)
實例2
分離抗IgE/M1' Ab 產生CH3－CH4－M1'/Fc融合蛋白 藉由人類IgE CH3－CH4－M1'域之PCR擴增，加上來自由U266細胞(ATTC Manassas,VA,TIB#196)製備之cDNA之M1'域緊接下游之額外15個胺基酸產生人類IgE CH3－CH4－M1'/Fc融合蛋白。由U266細胞製備RNA(RNeasy Mini Kit,#74106,Qiagen,Valencia,CA)且使用BD Sprint Powerscript寡dT引子(BD Biosciences,San Jose,CA,#639558)製造cDNA。進行RT－PCR且藉由TOPO－AT選殖(Invitrogen,Carlsbad,CA,#45－0641)來選殖PCR產物。藉由PCR突變添加N末端信號序列以於哺乳動物細胞中表現，且將信號序列＋CH3＋CH4＋M1'＋15個胺基酸選殖至表現載體(pRK huIgG1 Fc；Genentech)中以產生與人類IgG1Fc區之C末端融合。最終蛋白質之序列(包括信號序列及人類IgG1 Fc)如下：
藉由瞬間轉染CHO細胞(Genentech)產生蛋白質，且使用標準蛋白A瓊脂糖管柱層析技術自細胞培養物上清液純化蛋白質。
融合瘤之免疫及產生 使用CH3－CH4－M1'/Fc蛋白產生選擇性結合人類IgE－M1'之M1'部分之泛特異性抗體組。以3至4天之時間間隔，對BALB/c小鼠之各後足注射1 μg再懸浮於單磷酸－脂質A及海藻糖二棒桿黴菌酸酯(MPLTM ＋TDM)佐劑(Corixa,Hamilton,MT)中之CH3－CH4－M1'/Fc。8次加強免疫後獲取血清且藉由酶聯免疫吸附檢定(ELISA)及螢光活化細胞分選術及流式細胞量測術(FACS篩選，參見下一段)來測定力價以確保小鼠對CH3－CH4－M1'/Fc具有良好免疫反應。最終加強免疫三天後，使膕窩結細胞與小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag.U.1融合(參見例如Chuntharapai等人，1997,Methods Enzymol. 288：15－27)。使用由ClonaCell融合瘤選擇套組(StemCell Technologies,Inc.,Vancouver,BC,Canada)於培養基D中之次黃嘌呤－胺基蝶呤－胸苷(HAT)選擇自未經融合之膕窩結或骨髓瘤細胞選擇融合之融合瘤細胞，引起4224純系之產生。
篩選泛特異性抗人類M1'抗體 針對與CH3－CH4－M1'/Fc蛋白之M1'區、穩定表現於A20 小鼠B細胞淋巴瘤細胞株表面上之人類IgE－M1'(IgE－M1'/A20)之M1'區，及穩定表現於BJAB人類B細胞淋巴瘤細胞株表面上之人類IgE－M1'(IgE－M1'/BJAB)之M1'區結合之單株抗體的產生篩選如先前所述產生之融合瘤純系。陰性對照包括人類CD－4/Fc、穩定表現於A20小鼠B細胞淋巴瘤細胞株表面上之人類IgE(IgE/A20)、A20小鼠B細胞淋巴瘤細胞株(A20)、穩定表現於BJAB人類B細胞淋巴瘤細胞株表面上之人類IgE(IgE/BJAB)及BJAB人類B細胞淋巴瘤細胞株(BJAB)。
ELISA篩選 為篩選4224純系，一般如Baker等人，2002,Trends Biotechnol. ,20：149－156中所述進行酶聯免疫吸附檢定(ELISA)。於384及96孔盤中進行檢定。簡言之，以50 μl在塗覆緩衝劑(0.05 M碳酸鹽緩衝劑，pH值為9.6)中濃度為2 μg/ml之山羊抗人類IgG Fc(MP Biomedicals,Irvine,CA)塗覆384(或96)孔盤，將其密封且在4℃下儲存隔夜。移除塗覆溶液後，向各孔中添加80 μl(或對於96孔盤而言200 μl)含有0.5%牛血清白蛋白及0.05% Tween－20於PBS(pH值為7.4)(ELISA稀釋劑)中之檢定/阻斷溶液，且在攪拌下將培養盤在室溫下培育一小時。接著以100 μl(或對於96孔盤而言300 μl)在PBS(洗滌緩衝劑)中之0.05% Tween－20洗滌孔三次。
洗滌步驟後，向各孔中添加50 μl(或對於96孔盤而言100 μl)含有0.4 μg/ml CH3－CH4－M1'/Fc或人類CD－4/Fc於ELISA 稀釋劑中之抗原溶液，且在攪拌下將培養盤在室溫下培育一小時。以如前所述之洗滌緩衝劑洗滌孔三次。添加來自個別融合瘤純系之上清液使得一個具有CH3－CH4－M1'/Fc之孔及一個具有人類CD－4/Fc之孔各自接收50 μl(或對於96孔盤而言100 μl)來自單一融合瘤純系之上清液。在攪拌下將培養盤在室溫下培育一小時，且以如前所述之洗滌緩衝劑洗滌孔三次。
洗滌後，向各孔中添加50 μl(或對於96孔盤而言100 μl)在ELISA稀釋劑中與辣根過氧化物酶偶合之綿羊抗小鼠IgG之1：1000稀釋液(與人類IgG(MP Biomedicals)無交叉反應性)。將培養盤在攪拌下在室溫下培育一小時，以如前所述之洗滌緩衝劑洗滌三次且拍乾。藉由向各孔中添加50 μl(或對於96孔盤而言100 μl)四甲基聯苯胺(TMB)微孔過氧化物酶受質(BioFX Laboratories,Owing Mills,MD,目錄號TMBW－0100－01)且在室溫下培育5－10分鐘或直至觀測到優良變色來使孔顯色。藉由向各孔中添加50 μl(或對於96孔盤而言100 μl)TMB終止溶液(BioFX Laboratories目錄號BSTP－0100－01)來終止顯色。使用Sunrise盤讀取器(Tecan US,Inc.,Research Triangle Park,NC)在650 nm下分析培養盤。
使用預放血樣本及聚血清樣本作為對照。預放血樣本在免疫前含有小鼠血清，且聚血清樣本含有10次免疫後獲得之小鼠抗血清。
FACS篩選 為篩選實例1中產生之3221純系，使用IgE－M1'/A20及IgE－M1'/BJAB細胞株進行螢光活化細胞分選(FACS)。將IgE/A20、IgE/BJAB、A20及BJAB細胞株用作陰性對照。在4℃下將細胞再懸浮且在500 g下離心5分鐘。吸出培養基且將細胞再懸浮於4℃具有1%胎牛血清之FACSFlow(BD Biosciences,San Jose,CA)緩衝劑(細胞染色緩衝劑)中。將細胞如前所述離心，吸出培養基，且在4℃下將細胞以每毫升細胞染色緩衝劑2×106 個細胞再懸浮。以每孔50微升(每孔1×105 個細胞)將細胞添加至96孔圓底盤中，且向各孔中添加100 μl來自個別融合瘤純系之上清液使得各融合瘤上清液以一個含有各細胞株之孔培育。將培養盤在冰上培育30分鐘。在4℃下將培養盤在500g下離心5分鐘且吸出上清液。在4℃下將各孔再懸浮於200 μl細胞染色緩衝劑中，且如前所述將培養盤離心。吸出細胞染色緩衝劑。
洗滌步驟後，在4℃下將各孔中之細胞再懸浮於100 μl在細胞染色緩衝劑中與R－藻紅蛋白(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)偶合之山羊抗小鼠IgG Fc之1：1000稀釋液且將培養盤在黑暗中在冰上培育30分鐘。將培養盤在4℃下在500 g下離心5分鐘，且吸出上清液。在4℃下將各孔再懸浮於200 μl細胞染色緩衝劑中且如前所述將培養盤離心。吸出細胞染色緩衝劑。將各孔中之細胞在4℃下再懸浮於200 μl細胞染色緩衝劑中且轉移至1.2 ml微量滴定管(Quality Scientific Plastics,Petaluma,CA)中。在FACScan或FACSCalibur(BD Biosciences)上進行FACS。
N末端定序/RNA分離/定序及選殖 自抗IgE/M1'融合瘤上清液純化抗體，且對其分析N末端定序以在磷酸鹽緩衝生理食鹽水中測定選殖性。在還原條件下，於Precast 4－20% Tris HCl SDS－PAGE(Invitrogen,Carlsbad,CA)上分離各抗體。如Henzel等人Analytical Biochemistry 267,148－160(1999)所述，使用Procise 494 N末端定序儀(Applied Biosystems,Foster City,CA)，使用20 min循環對經解析之重鏈(HC)及輕鏈(LC)各自進行N末端定序。對頭25個殘基定序以確立單選殖性。當以焦麩胺醯基團阻斷Ab之HC或LC鏈以使N末端胺基酸難以進行Edman定序時，在定序之前移除保護基團。使用Pham等人Electrophoresis 2005,26 4243－4251所述之方案以焦麩胺酸胺肽酶(PGAP,Sigma,St Louis,MO)來移除焦麩胺醯基團。
重鏈(HC)及輕鏈(LC)M1'抗體7A6、1C11、47H4、26A11、45C1及28E9之序列確定如下：
為確定全長序列，由N末端胺基酸序列及已知Ig基因片段設計5'簡幷引子，且使用簡幷下游重鏈及輕鏈保守性序列來進行PCR。
反向引物
自抗IgE/M1'融合瘤(RNeasy Mini Kit,#74106,Qiagen,Valencia,CA)收集RNA且使用BD Sprint Powerscript寡dT引子套組(BD Biosciences,San Jose,CA,#639558)製備cDNA。使用以上引子來進行PCR且使用TOPO－TA套組(Invitrogen,Carlsbad,CA,#45－0641)選殖PCR產物。在PCR條件下使用鉑Pfx高保真度聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,# 11708－039)進行PCR[94℃下，2分鐘；94℃下15秒；60℃下30秒；68℃下2分鐘；30次循環；68℃下10分鐘]。針對插入物篩選純系且將多個純系定序(Genentech,Inc.)以驗證原始抗IgE/M1'重鏈及輕鏈基因序列。
將抗M1'抗體可變域次選殖至具有不同Fc區之表現載體中以產生具有不同物種及/或同型Fc之嵌合抗體。設計引子以將可變域(CDR＋構架)選殖至小鼠IgG2a、小鼠IgG2a－DANA及人類IgG1 Fc區中。
設計引子以將限制位點併入重鏈及輕鏈序列中。使用BsiWI及ApaI選殖重鏈。使用EcoRV及KpnI選殖輕鏈。接著消化新PCR產物且將其接合至mIgG2a(LPG10)、mIgG2a－DANA(pErk－E27DANA)或huIgG1(對於重鏈)或m(LPG2)或hu表現載體(Genentech,Inc.)。對最終純系進行序列驗證(Genentech,Inc.)。
選殖可變CDR序列之3'引子及正向及反向引子組合如 下：
反向引子
引子組合：
47H4輕鏈具有排除定向選殖至m及hu表現載體中之內 部KpnI位點。使用Quick Change XL定向突變套組(Stratagene,Cedar Creek,Texas,#200517－5)使內部KpnI位點突變[在95℃下，1分鐘；在95℃下，50秒；在60℃下，50秒；在68℃下，4.5分鐘；在68℃下，7分鐘]。根據套組要求設計引子以使KpnI位點內之單一核苷酸突變而不改變胺基酸序列。使TAC突變為於彼位置處保留酪胺酸(Y)之TAT。對最終純系進行序列驗證(Genentech,Inc.)。
用於突變之引子為： FOR 5'－cc tat tta cat tgg tat ctg cag aag cca ggc c (SEQ ID NO：104) REV 5'－ggc ctg gct tct gca gat acc aat gta aat agg (SEQ ID NO：105)
實例2A
抗IgE/M1'抗體之人類化 此實例描述鼠類抗IgE/M1'抗體26A11、7A6及47H4之人類化。
材料及方法 將膜相關人類IgE之M1'域於CHO細胞中表現為Fc融合體且藉由習知方法純化。表現抗體26A11、7A6及47H4之融合瘤係藉由以重組M1'－Fc融合蛋白使小鼠免疫而獲得且藉由ELISA使用以M1'－Fc塗覆之培養盤識別。藉由與表現M1'之細胞結合及促進細胞凋亡之能力來識別功能性抗體。
選殖鼠類26A11、7A6及47H4可變域 －使用標準方法自產生26A11、7A6或47H4之融合瘤細胞中提取總RNA。使用RT－PCR，以重鏈及輕鏈之簡幷引子來擴增可變輕鏈(VL )域及可變重鏈(VH )域。正向引子對VL 及VH 區之N末端胺基酸 序列具特異性。分別設計LC及HC反向引子以黏接至物種間高度保守之恆定輕鏈域(CL )及恆定重鏈域1(CH 1)之區域。使用常規定序法來確定插入物之聚核苷酸序列。26A11、7A6及47H4 VL 及VH 胺基酸序列分別展示於圖6A及6D、6B及6E，及6C及6F中。
至受體人類一致構架上之直接高變區移植物 －用於此研究之噬菌粒為單價Fab－g3呈現載體且由在單一phoA啟動子控制下之2個開放閱讀框架組成。第一開放閱讀框架由與受體輕鏈之VL 及CH 1域融合之stII信號序列組成且第二開放閱讀框架由與受體重鏈VH及CH1域融合融合之stII信號序列及隨後之次要噬菌體鞘蛋白P3組成。
將來自鼠類26A11、7A6或47H4抗體(mu26A11、mu7A6或mu47H4)之VL 及VH 域與人類VL I(huKI)及人類VH 子群III(huIII)一致序列對準。為製造CDR移植物，將來自mu26A11、mu7A6或mu47H4之高變區移植至huKI及huIII一致受體構架中以產生直接CDR移植物(26A11.v1、7A6.v1或47H4.v1)(圖6A－6F )。在VL 域中，將以下區域移植至人類一致受體中：位置24－34(L1)、50－56(L2)及89－97(L3)。在VH 域中，移植位置26－35(H1)、49－65(H2)及94－102(H3)。MacCallum等人[MacCallum等人J.Mol.Biol. 262 ：732－745(1996))]已分析抗體及抗原複合晶體結構且發現重鏈之位置49及94為接觸區之部分，因此當使抗體人類化時，於CDR－H2及CDR－H3定義中包括此等位置似乎為合理的。
藉由使用各高變區之獨立寡核苷酸進行LC及HC表現載體的Kunkel突變來產生人類化抗IgE/M1'抗體26A11.v1、7A6.v1及47H4.v1作為IgG抗體。亦使用Kunkel突變進行胺基酸改變以增加穩定性。Kunkel等人，J.Biol.Chem. 263(29)：14784－14789(1988)。藉由DNA定序來識別正確純系。
IgG產生 －出於篩選之目的，最初於293細胞中產生IgG變異體。使用FuGene系統將編碼VL及VH之載體(25 μg)轉染至293細胞中。將500 μl FuGene與4.5 ml不含FBS之DMEM培養基混合且在室溫下培育5 min。將各鏈(25 μg)添加至此混合物中且在室溫下培育20 min且接著轉移至五個T－150燒瓶中以在37℃下，在5% CO2 中轉染隔夜。次日，移除含有轉染混合物之培養基且以含有0.1 ml/L微量元素(A0934)及10 mg/L胰島素(A0940)之23 ml PS04培養基更換。將細胞再培育5天，其後以1000 rpm歷時5 min收集培養基且使用0.22 μm低蛋白質結合過濾器將其無菌過濾。每125 ml培養基添加2.5 ml 0.1% PMSF後將樣本儲存在4℃下。
親和力測定 －藉由斯卡查德分析，一種細胞結合ELISA且藉由使用BIAcoreTM －2000或A100進行表面電漿共振來進行親和力測定。
斯卡查德分析 －製備Daudi人類、恆河猴及犬IgE/M1'細胞用於在由基本培養基以及pH值為7.4之10 mM HEPES及2% FBS以及40 μg/ml人類IgG組成之冷結合緩衝劑中結合。將細胞稀釋至每毫升1.7×106 個細胞之濃度且保持於冰上直至 將其添加至檢定中。以Iodogen法使蛋白/抗體碘化。使用1：2稀釋液製備多個濃度之冷蛋白(一式三份)，以飽和濃度起始且以零濃度終止，總共14個濃度。將單一濃度之熱蛋白添加至所有稀釋液中以與冷蛋白競爭。最後，將細胞添加至熱蛋白與冷蛋白混合物中，使用每個樣本250,000個細胞。將檢定保持在4℃下歷時4小時，震盪。接著收集各樣本且將其於膜上過濾，以結合緩衝劑洗滌至少3次，使其乾燥且接著使用Perkin Elmer Wizard 1470自動γ計數器計數1分鐘。
競爭性電化學發光細胞結合檢定 －使用競爭性電化學發光細胞結合檢定來量測人類化變異體之相對結合親和力。將經轉染之表現IgE－M1'之BJAB細胞(BJAB－IgE/M1')(長)或經對照轉染之不表現M1'之細胞(BJAB－IgE)(短)以磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌且以每孔25,000個細胞接種於96孔MULTI－ARRAY高結合培養盤(Meso Scale Discovery)上之25 μl PBS中。將細胞在室溫下在培養盤上培育一小時，以使細胞附著至孔上。為阻斷非特異性結合，向各孔中添加25 μl於PBS中之30% FBS。接著在輕微震盪下，將培養盤在室溫下培育30分鐘。傾析阻斷溶液，且添加於含有2% FBS之25 μl PBS(檢定緩衝劑)中補充有固定量結合生物素之抗IgE M1'抗體(33.3 nM 26A11或47H4)之人類化變異體(0.022－1333 nM)的連續稀釋液。在輕微攪拌下在室溫下培育一小時後，使用微定量盤洗滌劑(ELx405 Select,Bio－Tek Instruments,Inc.,Winooski,VT)將培養盤以PBS (每孔300微升)洗滌三次。藉由添加25 μl在檢定緩衝劑中之0.25 μg/ml釕標記之抗生蛋白鏈菌素來偵測經結合抗體。在室溫下培育一小時後，洗滌培養盤且添加基於Tris之讀取緩衝劑T(1x，無界面活性劑)(Meso Scale Discovery)(每孔150微升)。使用Sector Imager 6000讀取器記錄電化學發光信號(Meso Scale Discovery)。
Biacore 2000 －使用兩個定位；將M1'－Fc或特定抗體變異體固定(約100 RU，在CM5感應器晶片上pH值為4.8之10 mM乙酸鈉中)且將對應配位體(分別為抗體變異體或M1'Fc)用作分析物(以30 μl/min之流動速率注射，使用PBST中0.5至1000 nM之2倍連續稀釋)。以3分鐘締合及10分鐘解離來分析各樣本。各次注射後，使用pH值為1.7之10 mM甘胺酸使晶片再生。
Biacore A－100 －將M1'固定(約100 RU，在CM－5感應器晶片上，pH值為4.8之10 mM乙酸鈉中)且將抗體變異體用作分析物(以30 μl/min之流動速率注射，使用PBST中0.5至1000 nM之2倍連續稀釋)。以5分鐘締合及5分鐘解離來分析各樣本。各次注射後，使用pH值為1.7之10 mM甘胺酸使晶片再生。
藉由自18F7變異體IgG流動細胞減去控制流動細胞來校正結合反應。將同時擬合kon 及koff 之1：1朗繆爾模型用於動力學分析。
結果及討論 26A11、7A6及47H4之CDR移植物 －用於人類化之人類受 體構架係基於一致人類I VL 域及一致人類子群III VH 域。將mu26A11、mu7A6及mu47H4之VL及VH域與人類I及子群III域對準；識別各互補判定區(CDR)且將其移植至人類受體構架中以產生可表現為IgG之CDR移植物(圖6A－6F )。
親和力評估 －使用細胞結合ELISA且藉由表面電漿共振來評估26A11.v1、7A6.v1及47H4.v1(表1 )。此等檢定指示CDR移植物具有與其各別融合瘤抗體極類似之親和力。
消除26A11及47H4之CDR－L1中可能之脫醯胺基化及異天冬胺酸形成位點 －為避免可能之製造問題，47H4.v1之CDR－L1中可能之異天冬胺酸形成位點Asn28 －Gly29 及26A11.v1之CDR－L1中可能之異天冬胺酸形成位點Asn31 －Ser32 係藉由對其他抗體中此等位置處發現之殘基取樣來消除(圖6A、6C，表I )。發現47H4.v1(47H4.v2及47H4.v5)之CDR－L1中Gly29 變為Ala29 及26A11(26A11.v3及26A11.v6)之CDR－L1中Ser32 變為Tyr32 或Ala32 (26A11.v2或26A11.v5)為合適的置換。此外，Asn31 變為Ser31 (26A11.v13或26A11.v15)或Gln31 (26A11.v14或26A11.v16)亦用以消除可能之脫醯胺基化及異天冬胺酸形成且提供具有類似於其各別融合瘤抗體之親和力之候選物。
藉由在不影響M1'結合下，在兩個抗體中使此殘基改變為Ile34 來避免26A11.v1或47H4.v1之CDR－H1中Met34 之可能氧化。
實例3
抗M1' Ab之特異性 測試抗IgE/M1'抗體對以具有M1'序列之IgE("較長形式")或缺少M1'序列之IgE("較短形式")轉染的人類B細胞株BJAB(ATCC Manassas,VA,#HB－136)之特異性。藉由使用pMSCV表現載體(Washington University,St.Louis,MO)進行BJAB細胞逆轉錄病毒轉導產生IgE BJAB細胞株。自人類IgE骨髓瘤細胞株U266(ATCC,Manassas,VA,TIB#196)獲得人類IgE B細胞受體之全長重鏈及輕鏈cDNA且將其與IRES(內部核糖體輸入序列)組合次選殖至逆轉錄病毒載體中以允許雙順反子共轉染且共表現抗體重鏈及輕鏈。以下提供逆轉錄病毒轉導方法之進一步描述。
將PG13包裝細胞(ATCC CRL－10686)以每盤2×106 個細胞接種於10 cm組織培養盤中(DMEM高葡萄糖、10% FBS、青黴素、鏈黴素、2 mM L－麩胺醯胺)歷時24小時。使用FuGENE 6以pMSCV DNA構築體轉染細胞且將其在37℃，5% CO2 下培養2天。收集含有逆轉錄病毒顆粒之細胞培養物上清液且將其經由0.4微米過濾器過濾。添加無菌硫酸精蛋白至10 μg/ml之最終濃度，且使用4 ml上清液以藉由在32℃下旋轉感染90分鐘來感染約1×106 個BJAB細胞，隨後在37℃下，於5% CO2 中，在逆轉錄病毒上清液中持續培養3－4小時。回收經感染之BJAB細胞，將其轉移至RPMI細胞培養基(RPMI，10% FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青黴素、鏈黴素、2 mM L－麩胺醯胺)中且使其膨脹以供分選。藉由流式細胞儀使用MAE11(Genentech)抗人類IgE抗體偵測表面IgE來識別經陽性轉 染之細胞。
如藉由BJAB IgE較短形式及較長形式細胞株之流式細胞術染色所測定，抗IgE/M1'抗體對較長形式而非較短形式之膜IgE具特異性。使用抗人類IgE(Mae11)抗體(Genentech,Inc.)作為其與較長形式及較短形式IgE結合能力之陽性對照。將抗gp120 mIgG1或抗豚草mIgG2a抗體用作同型對照(Genentech,Inc)。
使BJAB細胞於RPMI 10% FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青黴素/鏈黴素、2 mM L－麩胺醯胺(Genentech,Inc.)中生長。於冰上在100 μl FAC洗滌緩衝劑(1X PBS中之2% FBS)(Genentech,Inc.)中，以小鼠血清(10 μl)(VWR,#RLD 108－0100)及人類血清(10 μl)(Sigma,St.Louis,MO,#S－2257)阻斷0.5×106 BJAB長或BJAB短細胞歷時15分鐘。接著將細胞於冰上以1 μg/ml各抗M1'抗體再染色20分鐘且接著以1 ml FAC洗滌緩衝劑洗滌且在1200 rpm下離心5分鐘。將細胞再懸浮於100 μl FAC洗滌緩衝劑中且接著於冰上以山羊抗小鼠IgG－PE(5 μl)(Caltag/Invitrogen,Carlsbad,CA,#M30004－4)染色20分鐘。將細胞如前所述洗滌且再懸浮於1 ml FAC洗滌緩衝劑中以於FAC Calibur機(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上分析。所測試之所有抗體均對較長形式之IgE具特異性且其與BJAB－IgE/短細胞之結合不超過同型對照。吾人基於染色強度觀測到廣泛範圍之相對親和力。
吾人亦評定抗M1'抗體與U266細胞株(ATCC,Manassas, VA,#TIB196)之結合，U266細胞株於細胞表面上天然表現低含量之含有M1'之人類IgE。將U266細胞以高密度(1－2×106 /ml)維持於融合瘤培養基[RPMI 1640、15%胎牛血清、2 mM L－麩胺醯胺、10 mM HEPES、4.5 g/L葡萄糖、1.5 g/L碳酸氫鹽]中。將U266細胞以1 μg/ml之抗M1'抗體染色。47H4、47G4及42A5以與Mae11類似之程度使U266染色。抗體42H4、45C1及28E9以極低程度使U266染色。7A6、1C11、26A11、51D2及26B11不使U266染色(圖2C)。
實例3A
鼠類抗IgE/M1'結合特異性 圖2D－F展示鼠類抗IgE/M1'抗體47H4、26A11及7A6與表現人類恆河猴或犬IgE/M1'之細胞株集合的結合。
測試抗IgE/M1'抗體純系對由逆轉錄病毒感染以表現具有M1'序列之較長形式IgE或缺少M1'序列之較短形式IgE的人類B細胞株BJAB(ATCC Manassas,VA,#HB－136)及Daudi(ATCC #CCL－213)之特異性。使BJAB細胞於RPMI 10% FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青黴素/鏈黴素、2 mM L－麩胺醯胺(Genentech,Inc.)中生長。於冰上，在100 μl FAC洗滌緩衝劑(1X PBS中之2% FBS(Genentech,Inc.))中以小鼠血清(10 μl)(VWR,#RLD 108－0100)及人類血清(10 μl)(Sigma,St.Louis,MO,#S－2257)阻斷0.5×106 BJAB長細胞或BJAB短細胞歷時15分鐘。接著將細胞於冰上以1 μg/ml各抗M1'抗體再染色20分 鐘且接著以1 ml FAC洗滌緩衝劑洗滌且在1200 rpm下離心5分鐘。將細胞再懸浮於100 μl FAC洗滌緩衝劑中且接著於冰上以山羊抗小鼠IgG－PE(5 μl)(Caltag/Invitrogen,Carlsbad,CA,#M30004－4)染色20分鐘。將細胞如前所述洗滌且再懸浮於1 ml FAC洗滌緩衝劑中以於FAC Calibur機(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上分析。所測試之所有抗體均對較長形式之IgE具特異性且與BJAB－IgE/短細胞之結合不超過同型對照。吾人基於染色強度觀測到廣泛範圍之相對親和力。
測試抗IgE/M1'抗體純系對由逆轉錄病毒感染以表現具有M1'序列之膜IgE(較長形式)或缺少M1'序列之膜IgE(較短形式)之人類B細胞株Daudi的特異性。抗IgE/M1'抗體(47H4、26A11、7A6)對較長形式而非較短形式具特異性(圖2D)。將抗gp120 mIgG1抗體用作同型對照(Genentech,Inc)。
對於恆河猴或犬或人類IgE/M1'而言，以含有人類IgE/靈長類M1'序列盒之逆轉錄病毒來轉導人類B細胞株Daudi。轉導後，藉由FAC分選機，經3－4次分選之過程分選表現人類、恆河猴或犬IgE/M1'之細胞至>98%之純度。
圖2F表明抗IgE/M1'抗體與恆河猴及犬M1'結合之能力。47H4及7A6與恆河猴及犬M1'結合，而26A11僅結合恆河猴M1'。
除Daudi轉染細胞株以外，吾人亦評定抗IgE/M1'抗體與U266、人類IgE骨髓瘤細胞株(ATCC,Manassas,VA, #TIB196)之結合。將U266細胞以高密度(1－2×106 /ml)維持於融合瘤培養基[RPMI 1640、15%胎牛血清、2 mM L－麩胺醯胺、10 mM HEPES、4.5 g/L葡萄糖、1.5 g/L碳酸氫鹽]中。將U266細胞以1 μg/ml之抗M1'抗體染色。抗IgE/M1'抗體47H4結合U266，而26A11及7A6不結合U266(圖2E)。
實例3B
人類化抗IgE/M1'結合特異性 實例3B展示人類化抗IgE/M1'抗體與表現人類、恆河猴或犬IgE/M1'之細胞株集合的結合。
使用論述於實例3A中相同之過度表現人類、恆河猴及犬M1'之Daudi或BJAB人類B細胞株測試人類化抗IgE/M1'抗體純系對由逆轉錄病毒感染以表現具有M1'序列之較長形式IgE或缺少M1'序列之較短形式IgE的人類B細胞株Dauidi之特異性。人類化抗IgE/M1'抗體(47H4v5、26A11v6、7A6v1)對較長形式而非較短形式(無M1')具特異性[圖2G]。使用HERCEPTIN抗Her2 MAb huIgG1作為同型對照(Genentech,Inc.)。此外，人類化抗IgE/M1'抗體(47H4v5及26A11v6)與U266細胞株結合(圖2H)。
圖2I展示人類化抗IgE/M1'抗體與恆河猴及犬M1'結合之能力。抗體47H4v5及7A6v1與恆河猴及犬M1'結合，而26A11v6僅與恆河猴M1'結合。
實例4
抗M1'抗體之相對結合親和力 吾人觀測到1 μg/ml下廣泛範圍之抗IgE/M1'抗體結合強度。為評定此等抗體對IgE長受體之相對親和力，吾人以連續稀釋之抗M1'抗體(1、0.1、0.01、0.001 μg/ml)使BJAB長細胞染色。於冰上以小鼠及人類血清(10 μl)阻斷BJAB長細胞歷時20分鐘。將細胞以適當量之抗M1'抗體染色，或以抗gp120 mIgG1或抗豚草mIgG2a同型對照再染色20分鐘。接著將細胞於FAC洗滌緩衝劑(1 ml)中洗滌，離心(1200 rpm，歷時5分鐘)且接著再懸浮於100 μl含有山羊抗小鼠IgG－PE抗體(5 μl)之FAC洗滌緩衝劑(CALTAG/Invitrogen,Carlsbad,CA #M30004－4)中以供偵測。將細胞如上所述再次洗滌且接著在FAC Calibur機(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上分析。電壓設定係基於0.001 μg/ml同型對照。由此等結果，根據相對結合親和力對抗IgE/M1'抗體候選物進行分等：42H4>7A6、47H4、47G4>42A5、26A11、45C1>51D2、26B11>1C11>28E9
除藉由抗體滴定及FAC偵測進行相對親和力測定以外，吾人亦使用斯卡查德分析來測定所選抗M1'抗體與表現IgE長形式之BJAB細胞株之親和力。製備BJAB長細胞用於在由基本培養基，以及pH值為7.4之10 mM HEPES，及2% FBS以及40 μg/ml人類IgG組成之冷結合緩衝劑中結合。將細胞稀釋至每毫升1.7×106 個細胞之濃度，且將其保持在冰上直至添加至檢定中。以Iodogen法使抗體碘化。使用1：2稀釋液製備多個濃度之未標記抗體(一式三份)，以飽和濃度起始且以零濃度終止，總共14個濃度。將單一濃度之碘 化抗體添加至所有競爭性未經標記抗體之稀釋液中。最後，將250,000個BJAB長細胞添加至碘化且未經標記之抗體之各混合物中。將樣本在4℃下培育4小時，震盪。接著收集各樣本且將其在膜上過濾，以結合緩衝劑洗滌至少3次，使其乾燥且接著使用Perkin Elmer Wizard 1470自動γ計數器量測1分鐘。
實例4A
鼠類抗IgE/M1'抗體之斯卡查德親和力 製備表現具有或不具有M1'(人類、恆河猴、犬)之各種形式IgE之BJAB或Daudi細胞以於由基本培養基，以及pH值為7.4之10 mM HEPES及2% FBS，以及40 μg/ml人類IgG組成之冷結合緩衝劑中結合。將細胞稀釋至每毫升1.7×106 個細胞之濃度，且將其保持在冰上直至將其添加至檢定中。以Iodogen法使蛋白質/抗體碘化。使用1：2稀釋液製備多個濃度之冷蛋白(一式三份)，以飽和濃度起始且以零濃度終止，總共14個濃度。將單一濃度之熱蛋白添加至所有稀釋液中以與冷蛋白競爭。最後，將細胞添加至熱蛋白與冷蛋白混合物中，使用每個樣本250,000個細胞。將檢定保持在4℃下歷時4小時，震盪。接著收集各樣本且將其於膜上過濾，以結合緩衝劑洗滌至少3次，使其乾燥且接著使用Perkin Elmer Wizard 1470自動γ計數器計數1分鐘。
圖3O匯總藉由斯卡查德分析量測之鼠類抗M1'抗體之親和力。鼠類抗體47H4 mIgG1結合之人類、恆河猴、犬M1'分別具有0.79、0.77及0.97 nM之親和力。鼠類抗體26A11 mIgG1及7A6 mIgG1結合之人類M1'分別具有2.3及0.64 nM之親和力。
圖3P匯總人類化抗IgE/M1'抗體與人類、恆河猴及大M1'之結合親和力。人類化抗體47H4v5 huIgG1結合之人類、恆河猴及犬M1'分別具有1.5、1.3及2.5 nM之親和力。人類化抗體47H4 v2、47H4 v1、26A11 v6、26A11 v14及26A11 v1結合之人類M1'分別具有0.54、0.37、1.85、1.5及1.06之親和力。
實例5
抗IgE/M1'抗原決定基結合/阻斷研究 在抗IgE/M1'抗體候選物之間進行阻斷研究來測定重疊或不同結合抗原決定基。當阻斷及偵測抗體具有不同同型(亦即IgG1對IgG2a)時，利用此等同型差異以藉由使用同型特異性二次抗體(CALTAG/Invitrogen,Carlsbad,CA,山羊抗小鼠IgG1－PE #32004或山羊抗小鼠IgG2a #M32204)偵測來測定阻斷程度。當阻斷及結合抗體具有相同同型時，將抗體結合至生物素(Pierce,Rockford,IL,EZ－聯－磺基－NHS－LC－生物素#CAS 127062－220)且以抗生蛋白鏈菌素PE(BD #554061)偵測，或結合至Alexa－647(Molecular Probes/Invitrogen,Carlsbad,CA,#A20173)。使用1：1比率(10 μg/ml)之初始阻斷抗體及偵測抗體(圖4A－4B)。使用10：1阻斷抗體與偵測抗體比來進一步測試最初不提供阻斷或僅提供部分阻斷之抗體組合。將BJAB長細胞以小鼠及人類血清阻斷(如上所述)，且接著在冰上以FAC洗滌緩衝 劑(2% FBS/1X PBS)中之阻斷抗體(10 μg/ml)染色20分鐘。將細胞於FAC洗滌緩衝劑中洗滌且接著在冰上以1：1(10 μg/ml)或10：1比率(1 μg/ml)之偵測抗體染色20分鐘。將細胞如上所述再次洗滌且接著在FACS Calibur機(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上分析。將經染色之細胞與同型對照抗體(抗gp120 mIgG1(Genentech,Inc.)或抗豚草mIgG2a(Genentech,Inc.))比較(圖4C)。為進行比較，(若可能)藉由以未經結合之相同抗體染色來測定完全阻斷。阻斷研究揭示三種主要結合組A及B及C。基於部分重疊抗原決定基將組A進一步分為兩組A1(47H4、47G4、42H4、42A5)及A2(45C1、51D2、26A11)(圖4D)。組C(26B11)與其他抗體候選物具有極小重疊。三個候選物比其他候選物更廣泛重疊。1C11似乎與組A1及A2具有重疊結合，且僅為組B(28E9)所部分阻斷。7A6主要屬於組A1，但與組A2候選物具有部分相互作用。28E9屬於完全為其自身之組。28E9僅與組A2候選物具有部分相互作用。
實例5A
抗原決定基定位 圖5A－E展示使用抗IgE/M1'抗體進行之抗原決定基結合研究。鼠類抗體47H4、7A6及26A11係展示於圖5B及5D中，而人類化變異體47H4v5、7A6v1及26A11v6係展示於圖5C及5E中。
抗原決定基定位：鼠類候選物 產生跨越環繞且包括人類M1'之序列(Clifford Quan)之15肽(圖5A)。將肽再懸浮於dH20或50% DMSO中。將肽以於塗覆緩衝劑(0.05 M碳酸鹽/碳酸氫鹽(pH值為9.6))中之1 μg/ml塗覆於96孔盤(NUNC Maxisorp高蛋白結合力ELISA培養盤#44－2404)上(每孔100 μl)。將M1'－Fc融合蛋白用作結合之陽性對照。陰性對照包括以人類IgE(U266)塗覆之孔及未經塗覆之孔。使肽在4℃下塗覆隔夜。次日早晨，以洗滌緩衝劑(PBS/0.05% Tween－20(pH值為7.4))將培養盤洗滌3次。接著在輕微攪拌下，將培養盤在阻斷緩衝劑(PBS，0.5% BSA(pH值為7.4))中阻斷1小時。於Magic緩衝劑[PBS(pH值為7.4)、0.5% BSA、0.05% Tween－20、10 ppm Proclin、0.2% BgG、0.25% Chaps、5 mM EDTA、0.35 M NaCl]中製備待測試之抗體(47H4 mIgG1、47H4v5 huIgG1、26A11 mIgG1、26A11v6 huIgG1、7A6 mIgG1、7A6v1 huIgG1)之稀釋液(40 ng/ml及1 ng/ml)。分別使用抗gp120 mIgG1及HERCEPTINhuIgG1抗體作為鼠類及人類抗IgE/M1'抗體之對照。充分阻斷(0.5% BSA/1X PBS)培養盤後，將培養盤洗滌3次，且接著將抗體一式三份添加至培養盤中(每孔100 μl)。接著將培養盤在室溫下培育2小時。將鼠類抗體培養盤洗滌3次且接著添加抗小鼠IgG1－生物素(BD Biosciences(A85－1)#553441)(1：10,000，每孔100 μl)且在RT下培育1小時。洗滌3次後，添加SA－HRP(BD Biosciences #554066)(1：20000，每孔100 μl)且將其培育1小時。如前所述洗滌人類IgG1抗體培養盤且添加抗 huIgG.Fc－HRP(Jackson ImmunoResearch(#109－036－098))(1：10000，每孔100 μl)且將其在RT下培育1小時。二級培育完成後，將培養盤洗滌6次且添加TMB受質(BD OptEIA #555214)(每孔100 μl)。約4分鐘後，以1 M H3 PO4 終止受質－HRP反應。接著在450/650下讀取培養盤。數據呈現為相對OD(OD450/CD650)。
圖5B及5D說明鼠類47H4、26A11及7A6抗IgE/M1'候選物與M1'肽之結合。此等候選物之結合與抗原決定基分組界定之抗體阻斷研究相關。47H4 mIgG1結合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQ ID NO：8)。7A6 mIgG1結合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQ ID NO：8)及5(RAPDRVLCHSGQQQG)(SEQ ID NO：9)。26A11 mIgG1結合肽7(GQQQGLPRAAGGSVP)(SEQ ID NO：11)及8(PRAAGGSVPHPRCH)(SEQ ID NO：12)。
圖5C及5E說明人類化抗IgE/M1'抗體與M1'肽之結合。除使用不同之二次抗體以外，如上所述進行對應鼠類抗體之抗原決定基定位。如前所述洗滌人類IgG1抗體培養盤且添加抗IgG.Fc－HRP二次抗體(Jackson ImmunoResearch(#109－036－098))(1：10000，每孔100 μl)且在RT下培育1小時。抗原決定基結合與以親本鼠類抗體觀測到之結合平行。47H4 v5結合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQ ID NO：8)。7A6 v1結合肽4(SAQSQRAPDRVLCHS)(SEQ ID NO：8)及5(RAPDRVLCHSGQQQG)(SEQ ID NO：9)。26A11 mIgG1結合肽7(GQQQGLPRAAGGSVP)(SEQ ID NO：11)及 8(PRAAGGSVPHPRCH)(SEQ ID NO：12)。
實例6
Daudi－IgE/長細胞中鼠類抗IgE/M1'對細胞凋亡之誘發 使用Daudi－長(IgE/M1')細胞來測試交聯表面IgE對誘發細胞凋亡之影響。Daudi細胞(ATCC,Manassas,VA,#CCL－213)為已知易回應於BCR交聯而發生細胞凋亡之人類伯基特淋巴瘤細胞株(human Burkitt Lymphoma cell line)。表現長形式IgE之Daudi細胞係如以上關於產生BJAB IgE長細胞所述，藉由逆轉錄病毒轉導具有M1'之IgE之U266重鏈及輕鏈而產生。使用對抗內源性IgM及經轉染之IgE B細胞受體之抗體進行的Daudi－IgE/長細胞之流式細胞術分析指示比IgE高之IgM表現。於在培養基[RPMI、10% FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青黴素/鏈黴素(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA #15140－122)、2 mM麩醯胺酸(Genentech,Inc.)、10 mM HEPES(7.2)(Genentech,Inc.)、1 mM丙酮酸鈉(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA #11360)、1.59 g/L碳酸氫鈉溶液(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA #25080－094)]中培養至每1.5毫升0.2×106 之密度的細胞中研究Daudi－IgE/長細胞之細胞凋亡。在細胞凋亡檢定開始之前，經發克梯度(ficoll gradient)(GE Healthcare #17－1440－03)移除死亡細胞以降低檢定中細胞死亡之背景水平。在溶液中，在具有及不具有抗M1'抗體或對照抗體下培養0.2×106 細胞歷時72小時(一式三份)。接著收集細胞且使用膜聯蛋白V(Annexin V)－FITC細胞凋亡偵測套組I(BD Biosciences,San Jose,CA #556547)來分析其細胞凋亡水平。將細胞於冷PBS(Genentech,Inc.)中洗滌兩次且接著再懸浮於100 μl 1X結合緩衝劑(0.1 M Hepes/NaOH(pH值為7..4)，1.4 M NaCl，25 mM CaCl2 )(BD Biosciences,San Jose,CA,#51－66121E)中。接著在黑暗中將細胞以2.5 μl膜聯蛋白V－FITC抗體(BD Biosciences,San Jose,CA #51－65874X)及5 μl碘化丙啶(PI)(BD Biosciences,San Jose,CA #51－66211E)染色。15分鐘後，將400 μl 1X結合緩衝劑添加至各管中且將細胞於FAC Calibur流式細胞儀(BD,Inc.Franklin Lakes,NJ)上分析。對於各樣本收集約10－20000次事件。將垂死細胞定義為膜聯蛋白－V陽性及PI陰性。死亡細胞對於膜聯蛋白－V及PI而言皆為陽性。使用FlowJo FAC分析軟體(Tree Star,Inc.,Ashland,Oregon)來計算各群體(死亡及垂死)之百分比。將一式三份之數據取平均值且計算標準差。以死亡及垂死細胞之總和來計算細胞凋亡百分比且使用Excel(Microsoft,Inc.)作圖。
使用喜樹鹼(Camptothecin)(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO,#C9911－100mg)及抗IgM抗體(Jacksonlmmuno Research,West Grove,PA,#109－006－120)作為誘發Daudi－IgE/長細胞株中之細胞凋亡的陽性對照。使用抗gp120 mIgG1或抗豚草mIgG1抗體(Genentech,Inc.)作為此檢定之陰性對照。以一系列抗IgE/M1'或同型對照抗體濃度(25、10、1、0.1、0.01、0.001 μg/ml)培養Daudi－IgE/長細胞。所測試之抗IgE/M1'抗體為7A6、47H4、47G4、42A5、 42H4、1C11、26A11、51D2、45C1、26B11及28E9(Genentech,Inc.)。亦使用抗人類IgE抗體(Mae11 mIgG1)以作比較。
同型對照抗gp120及抗豚草抗體對細胞凋亡之誘發不超過未經處理之細胞。各實驗中細胞凋亡之背景水平在10－15%之範圍內。抗IgE/M1'抗體7A6(>10 μg/ml)、47H4(>10 μg/ml)及47G4(25 μg/ml)誘發Daudi IgE長細胞之細胞凋亡。26A11以低得多的濃度(>0.1 μg/ml)誘發類似程度之細胞凋亡(~30－50%)。42A5、51D2、45C1、26B11及28E9對細胞凋亡之誘發不超過背景水平。Mae11對細胞凋亡之誘發亦不超過背景水平。
吾人亦在山羊抗小鼠IgG F(ab')2 二次抗體(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA #115－006－062)存在下進行細胞凋亡檢定以使Daudi細胞株上之IgE B細胞受體超交聯。交聯實驗係在山羊抗小鼠IgG F(ab')2 抗體(30 μg)(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,#115－006－062)存在下進行。除26B11(30%)以外，所有抗體均誘發70－80%之最大細胞凋亡水平，但濃度不同。將此等抗體分為兩組。7A6、1C11、26A11、51D2、45C1及28E9在最高濃度下誘發最大細胞凋亡。另一組47H4、47G4、42A5及42H4及MAE11在較高濃度下展現減少之細胞凋亡。
實例6A
Daud/IgE長細胞中人類化抗IgE/M1'抗體之細胞凋亡誘發 使用Daudi－長(IgE/M1')細胞來測試交聯表面IgE對誘發 此細胞株中細胞凋亡之影響。Daudi細胞(ATCC,Manassas,VA,#CCL－213)為已知易回應於BCR交聯而發生細胞凋亡之人類伯基特淋巴瘤細胞株。前一天晚上將Daudi－IgE/長細胞在培養基[RPMI、10% FBS(Hyclone,Logun,UT,#SH30071.03)、青黴素/鏈黴素(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA #15140－122)、2 mM麩醯胺酸(Genentech,Inc.)、10 mM HEPES(7.2)(Genentech,Inc.)、1 mM丙酮酸鈉(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA #11360)、1.59 g/L碳酸氫鈉溶液(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA #25080－094)]中以每1.5毫升0.2×106 之密度培養且接著次日經發克梯度(GE Healthcare #17－1440－03)移除死亡細胞。此舉降低檢定中細胞死亡之背景水平。在溶液中，在具有及不具有抗M1'抗體或對照抗體下培養0.2×106 細胞歷時72小時(一式三份)。接著收集細胞且使用膜聯蛋白V－FITC細胞凋亡偵測套組I(BD Biosciences,San Jose,CA #556547)來分析其細胞凋亡水平。將細胞於冷PBS(Genentech,Inc.)中洗滌兩次且接著再懸浮於100 μl 1X結合緩衝劑(0.1 M Hepes/NaOH(pH值為7.4)，1.4 M NaCl，25 mM CaCl2 )(BD Biosciences,san Jose,CA,#51－66121E)中。接著在黑暗中將細胞以2.5 μl膜聯蛋白V－FITC抗體(BD Biosciences,San Jose,CA #51－65874X)及5 μl碘化丙啶(PI)(BD Biosciences,San Jose,CA #51－66211E)染色。15分鐘後，向各管中添加400 μl 1X結合緩衝劑，且於FAC Calibur流式細胞儀(BD,Inc.Franklin Lakes,NJ)上分析細胞。對於各樣本收集約 10－20000次事件。將垂死細胞定義為膜聯蛋白－V陽性及PI陰性。死亡細胞對於膜聯蛋白－V及PI而言皆為陽性。使用FlowJo FAC分析軟體(Tree Star,Inc.,Ashland,Oregon)來計算各群體(死亡及垂死)之百分比。將一式三份之數據取平均值且計算標準差。以死亡及垂死細胞之總和來計算細胞凋亡百分比且使用Excel(Microsoft,Inc.)作圖。
使用抗IgM抗體(Jacksonlmmuno Research,West Grove,PA,#109－006－120)作為誘發Daudi－IgE/長細胞株中之細胞凋亡的陽性對照。使用HERCEPTINhuIgG1(Genentech,Inc.)作為此檢定之陰性對照。以一系列抗IgE/M1'或同型對照抗體濃度(25、10、1、0.1、0.01、0.001 μg/ml)培養Daudi－IgE/長細胞。在山羊抗人類IgG F(ab')2抗體(50 μg)(Biosource #AHI1301)存在下進行二級交聯實驗。所測試之抗IgE/M1'抗體為47H4v5、26A11v6、7A6v1 huIgG1。
同型對照HERCEPTINhuIgG1對細胞凋亡之誘發不超過未經治療之細胞。各實驗中細胞凋亡之背景水平在10－15%之範圍內。抗IgE/M1'抗體47H4v5、26A11v6及7A6v1誘發30－40%範圍內之細胞凋亡(圖8A)。
吾人在山羊抗人類IgG F(ab')2 二次抗體(Biosource #AHI1301)存在下重複相同檢定以使Daudi細胞株上之IgE受體交聯。所有抗體誘發70－90%之最大細胞凋亡水平，其中在高初級抗IgE/M1'抗體濃度下細胞凋亡活性有一定程度的降低(圖8B)。
在無二級交聯下誘發細胞凋亡中，野生型對去海藻糖基化47H4v5 使用BIOWA細胞株(Genentech,Inc.)產生去海藻糖基化(AF)形式之47H4 v5。WT及AF形式之47H4 v5皆能夠誘發類似水平之細胞凋亡(圖8C)。
實例7
所誘發之鈣流通 吾人研究抗M1'抗體誘發Daudi－IgE/長細胞中鈣流通之能力，其證明此等抗體可誘發IgE B細胞受體下游之細胞信 號轉導。以0.2×106 /ml之輕密度將過度表現較長形式IgE/M1'之Daudi細胞(ATCC,Manassas,VA,#CCL-213)培養隔夜。次日早晨，經發克梯度(GE Healthcare #17-1440-03)移除死亡細胞。使細胞負載大量Indo-1以確保均勻負載所有刺激物。將細胞以5×106 /ml再懸浮於培養基(RPMI-10% FBS(Hyclone)、青黴素/鏈黴素、2mM L-麩胺醯胺)中且與鈣偵測染色Indo-1(5μM)(Molecular probes/Invitrogen,Carlsbad,CA,#11223)組合。接著將細胞於培養基中洗滌且以106 /ml再懸浮。每刺激物使用106 個細胞。將樣本於37℃水浴中溫熱5分鐘，隨後於FAC Vantage機(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上運作。最初使樣本運作1分鐘以產生基線且接著以20μg各抗體(除抗IgM(10μg)以外)刺激樣本。收集數據歷時8-10分鐘。於FlowJo FAC分析軟體(Tree Star,Inc.,Ashland,Oregon)上進行動力學分析。數據係報導為經結合之Indo-1 405/游離Indo-1 1530之比率。比較所有抗M1'抗體與同型對照抗gp120 mIgG1(20μg)。使用抗人類IgM(Jackson Immuno-Research,West Grove,PA,#109-005-129)及抗IgE(Mae11，Genentech,Inc.)作為陽性對照。7A6、47H4、47G4、26A11及1C11誘發Daudi IgE長細胞中之鈣流通。28E9及42A5誘發低水平之鈣流通。45C1、26B11及51D2不誘發鈣流通。
實例8
wt及去海藻糖基化抗IgE/M1' 47H4 v5對ADCC之誘發
抗體依賴性細胞介導之毒性(ADCC)使得細胞毒性細胞能夠(經 由抗體)與抗原結合靶細胞結合且隨後以細胞毒素殺死靶細胞。具有ADCC活性或ADCC活性得以增強之抗IgE/M1'抗體在治療IgE介導之病症中可具有增強之治療價值。
已發現在哺乳動物細胞中產生之去海藻糖基化抗體具有增強之ADCC活性。以下實驗描述去海藻糖基化抗IgE/M1'抗體之產生。
自100 ml全血(RosetteSep #15065,Stem Cell Technologies)分離NK細胞。藉由抗人類CD56染色來測定NK細胞之純度。在各檢定中使用純度>70%之CD56＋ NK細胞。連續滴定抗IgE/M1'抗體及HERCEPTIN抗Her2 MAb huIgG1同型對照。將此等抗體(50 μl)與在細胞表面上過度表現人類IgE/M1'之BJAB細胞一起在室溫下於含有1% FBS之RPMI－1640(無酚紅)(BioWhitaker #12－918F)中培育30分鐘(細胞株係如上所概述產生)。接著以15：1之比率(150,000 NK細胞比10,000靶(BJAB長))將NK細胞(50 μl)添加至細胞株中。以一式三份進行檢定。接著將BJAB－hu長、抗體及NK細胞在37℃下培育4小時。培養後，將96孔U底盤旋轉沈降且收集上清液(100 μl)。接著使用LDH反應檢定(Roche #1644793)測試上清液之LDH釋放。使用單獨之靶及經溶胞之靶來計算細胞毒性百分比。如製造商所概述，將上清液以等體積與LDH反應混合物一起培育30－60分鐘。接著在490 nm下讀取培養盤。如下計算細胞毒性%：＝(實驗值－單獨之靶)/(經溶胞之靶－單獨之靶)。使用Kaleidagraph將數據繪圖且使用最佳擬合曲線產生ED50值。
在圖10中，HERCEPTINhuIgG1同型對照抗體誘發低水平細胞毒性。抗IgE/M1'抗體誘發特異性細胞毒性。野生型及去海藻糖基化形式之抗IgE/M1' 47H4v5誘發類似最大細胞毒性%(~70－80%)。去海藻糖基化47H4v5比野生型形式更有效(去海藻糖基化47H4v5之EC50為~0.83 nM；野生型47H4v5之EC50為~6.6 nM)。
實例9
異位性hu－SCID小鼠中鼠類抗IgE/M1'抗體之作用 圖12A及13A表明抗IgE/M1'抗體(分別為鼠類及人類化)於異位性hu－SCID模型中抑制血清IgE及產生IgE之漿細胞之產生的能力。實驗1(#07－0377)測試鼠類抗IgE/M1'候選物且實驗2(#07－1232)測試人類化抗IgE/M1'候選物。
由吾人之內部Leukopack血液工體程式來篩選供體之血清IgE含量。選擇兩個供體來提供自身識別為患有過敏症且具有1696及1152 ng/ml血清IgE含量之異位性hu－SCID模型之細胞。正常供體通常具有<100至300 ng/ml範圍內之IgE。
hu－SCID實驗係概述於圖12A及13A中。將PBMC藉由白血球分離(Leukophoresis)及發克密度梯度(GE Healthcare #17－1440－03)分離且計數。在第0天將108 PBMC細胞(每100微升108 )腹膜內注射至經照射之SCID米色小鼠體內。為使反應偏向IgE產生，在第0天及第3天將小鼠以抗IFNγ(BD Biosciences,San Jose,CA,#554698)及抗IL12抗體(每劑100微克)(BD Biosciences,San Jose,CA,#554659)處理； 且在第2、3、4天以rhIL－4(每劑100毫微克)(R&D Systems,Minneapolis,MN,#204－IL－010)處理。於第0天起始，每週三次(約每三天)以實驗抗體(亦即抗IgE/M1')處理小鼠直至研究結束。在7與14天之間容許人類細胞膨脹，接著對小鼠施以安樂死。於第7天及在研究結束時取血。實驗最後一天，對小鼠施以安樂死且分離脾細胞。將單細胞懸浮液用於IgE Elispot檢定及FAC來測定人類細胞重生及IgE漿細胞消耗之程度。
將數據表示為平均值±標準差。使用JMP統計軟體計算P值。鄧恩氏測試(Dunnett's test)比較組平均值，其中相對於參照組測試所有測試組。各對司徒頓氏t(Student's t)使用司徒頓氏t測試比較各組對。接著應用邦弗朗尼校正(Bonferroni Correction)來調節各對司徒頓氏t之p值以避免逐對比較。所有p值臨限為0.05。在未標準化至基線水平下，計算治療組與對照組之間圖12 A－I及13 A－H中所報導數據之百分比變化。
使用人類ELISA程序來測定游離IgE含量，其中將Maxisorp 384孔ELISA培養盤(Nalge Nunc International,Rochester,NY)在4℃下以pH值為9.6之50 mM碳酸鹽緩衝劑中之1 μg/ml單株抗體MAE11塗覆隔夜，且在室溫下以PBS中之0.5%牛血清白蛋白阻斷1小時。將含有0.5%牛血清白蛋白、0.05%聚山梨醇酯20、10 ppm Proclin 300(Supelco,Bellefonte,PA)、0.25% CHAPS(Sigma,St.Louis,MO)、0.2%牛g球蛋白(Biocell,Rancho Dominguez,CA)及5 mM EDTA之PBS中樣本之標準(0.098－12.5 ng/ml)及三倍連續稀釋液(最小稀釋1：10以避免任何血清效應)在室溫下在培養盤上培育1小時。藉由將過氧化物酶標記之山羊抗人類IgE抗體(Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)於孔中培育1小時來偵測經結合之IgE。添加受質3,3',5,5'－四甲基聯苯胺(Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)且藉由添加1 M磷酸終止反應。在步驟之間洗滌培養盤。於Titertek疊式讀取器(ICN,Costa Mesa,CA)上，在450 nm下讀取吸收率。使用四參數非線性回歸曲線擬合程式(Genentech所研發)擬合標準曲線。將落於標準曲線線性範圍內之數據點用於計算樣本中之IgE濃度。
人類免疫球蛋白同型組係藉由取小鼠抗人類IgG1單株抗體(mAb)(純系2C11，Abeam Inc.,Cambridge,MA)來進行，將其於pH值為9.6之0.05 M碳酸鈉緩衝劑中稀釋至4 μg/ml，且在4℃下隔夜培育期間塗覆於ELISA培養盤(384孔，高結合培養盤，Greiner Bio One,Monroe,NC)上。以洗滌緩衝劑(PBS/0.05% Tween－20)洗滌3次後，將培養盤以PBS/0.5%牛血清白蛋白(BSA)阻斷1至2小時。在室溫下於軌道震盪器上進行此培育及所有其他培育。使用檢定緩衝劑(PBS/0.5% BSA/0.05% Tween 20/0.25% CHAPS/5 mM EDTA/15PPM Proclin)將小鼠血清樣本1：100稀釋，隨後連續1：3稀釋。使用相同緩衝劑，製備IgG1之連續稀釋液用於標準曲線(12.20－1560 ng/ml)。使在標準曲線較高、中間及較低區域之預稀釋冷凍對照解凍。阻斷步驟後，將培養 盤洗滌且將樣本、標準物及對照物添加至384孔盤中且培育2小時。將培養盤洗滌且將結合生物素之小鼠抗人類IgG1 mAb(Zymed Laboratories,South San Francisco,CA)於檢定緩衝劑中1：500稀釋且添加至經洗滌之培養盤中培育1小時。將抗生蛋白鏈菌素－辣根過氧化物酶(SA－HRP)(GE Healthcare,Piscataway,NJ)於檢定緩衝劑中1：40,000稀釋且在洗滌後添加至培養盤中。培育30 min及最後之洗滌步驟後，添加四甲基聯苯銨(TMB)(Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)且顯色10至15分鐘。藉由添加1 M磷酸終止反應。使用微定量盤讀取器(450 nm、650 nm參考波長)獲得光學密度，且由標準曲線之4參數擬合來計算樣本濃度。小鼠血清樣本中最小可計量之人類IgG1濃度為1.22 μg/ml。
如上所述之此總ELISA法亦用於分析其他Ig同型。
IgG2 將小鼠抗人類IgG2 mAb(γ2 鏈特異性)(Southern Biotech,Birmingham,AL)以4 μg/ml塗覆於ELISA培養盤上。人類IgG2標準曲線範圍為12.20－1560 ng/ml。將結合生物素之小鼠抗人類IgG2 mAb(γ2 鏈特異性)(Southern Biotech)稀釋至0.5 μg/ml且用作偵測抗體。以1：10,000稀釋將SA－HRP添加至384孔盤中。小鼠血清樣本中最小可計量之人類IgG2濃度為1.22 μg/ml。
IgG3 將小鼠抗人類IgG3 mAb(Zymed Laboratories)稀釋至1 μg/ml且塗覆至ELISA盤上。人類IgG3標準曲線範圍為0.78－100 ng/ml。將結合生物素之小鼠抗人類IgG3 mAb(γ3 鏈特異性)(Southern Biotech)稀釋至0.1 μg/ml且用作偵測抗體。以1：20,000稀釋將SA－HRP添加至384孔盤中。小鼠血清樣本中最小可計量之人類IgG3濃度為78.1 ng/ml。
IgG4 將經純化之小鼠抗人類IgG4 mAb(BD Pharmingen,San Jose,CA)稀釋至0.25 μg/ml且塗覆至ELISA盤上。人類IgG4標準曲線範圍為0.20－25 ng/ml。將結合生物素之小鼠抗人類IgG4 mAb(BD Pharmingen)稀釋至0.25 μg/ml且用作偵測抗體。以1：20,000稀釋將SA－HRP添加至384孔盤中。小鼠血清樣本中最小可計量之人類IgG4濃度為39.1 ng/ml。
IgA 將經純化之小鼠抗人類IgA1 /A2 mAb(BD Pharmingen)稀釋至2 μg/ml且塗覆至ELISA培養盤上。人類IgA標準曲線範圍為0.20－25 ng/ml。將結合生物素之小鼠抗人類IgA1 /A2 mAb(BD Pharmingen)稀釋至1 μg/ml且用作偵測抗體。以1：80,000稀釋將SA－HRP添加至384孔盤中。小鼠血清樣本中最小可計量之人類IgA濃度為39.1 ng/ml。
IgM 將經純化之小鼠抗人類IgM mAb(BD Pharmingen)稀釋至0.5 μg/ml且塗覆至ELISA盤上。人類IgM標準曲線範圍為0.78－100 ng/ml。將結合生物素之小鼠抗人類IgM mAb(BD Pharmingen)稀釋至0.5 μg/ml且用作偵測抗體。以1：40,000稀釋將SA－HRP添加至384孔盤中。小鼠血清樣本中最小可計量之人類IgM濃度為156 ng/ml。
使用Fluoresbrite YG微球體(Polysciences,Inc.#18862)於FAC Calibur流式細胞儀(BD(San Jose,CA))上對Hu－SCID脾細胞、小鼠脾細胞或淋巴結細胞進行計數。
使用Elispot檢定來測定以rhuIL－4、抗IFNγ及抗IL－12抗體處理15天後，hu－SCID小鼠中產生IgE之漿細胞之頻率。在4℃下，以初級未經結合之抗人類IgE抗體(AXXORA,San Diego,CA,#BET－A80－108A)於塗覆緩衝劑[Genentech,Inc.(A3323)]中之1：500稀釋液以每孔100微升塗覆Elispot盤(Millipore,Billerica,MA,#MSIPS4510,透明)。接著傾析初級抗體溶液，且以洗滌緩衝劑(1X PBS、0.05% Tween－20)將培養盤洗滌兩次。在37℃下，以每孔200微升1X PBS中之0.5% BSA將膜阻斷0.5－1小時。移除阻斷溶液且將陽性對照細胞或hu－SCID脾細胞添加至培養盤中。將產生人類骨髓瘤IgE之U266細胞株(ATCC,Manassas,VA,#TIB196)用作檢定之陽性對照。將U266細胞添加至培養盤中，以每0.1毫升融合瘤培養基[RPMI 1640、15%胎牛血清、2 mM L－麩胺醯胺、10 mM HEPES、4.5 g/L葡萄糖、1.5 g/L碳酸氫鹽]3000個細胞(＝0.032×106 /ml)之濃度起始，接著進行7次連續稀釋(1：2)。將全脾單細胞懸浮液再懸浮於1 ml培養基中。將100 μl添加至第一孔中。接著進行七次1：2連續稀釋。將U266融合瘤及脾細胞在37℃下培育隔 夜。次日，將培養盤以洗滌緩衝劑(1X PBS，0.05% Tween－20)洗滌三次且接著向各孔中添加每孔100微升1：2000於0.5% BSA/1X PBS中之二次抗體、抗人類IgE－鹼性磷酸酶結合物(Sigma,St.Louis,MO,A－3525)且在37℃下培育2小時。將培養盤洗滌三次且接著以ddH2 O(Genentech,Inc.)沖洗一次。向各孔中添加每孔100微升BCIP/NBT溶液(R&D Systems,Minneapolis,MN,Elispot Blue Color Module,#SEL002)且將其在黑暗中培育30分鐘。接著將培養盤以ddH2 O沖洗一次且使培養盤在室溫下乾燥。將培養盤送至BD Biosciences以供計數(BD,Inc.,Franklin Lakes,NJ)。使用所偵測之點數、稀釋倍數(細胞輸入)及總脾細胞計數來計算漿細胞數目。
藉由於第15天，自經抗體處理之hu－SCID小鼠移除脾來製備人類漿細胞。製備單一細胞懸浮液且將其過濾。將將5×106 個細胞以人類血清(Sigma,St.Louis,MO,#S－2257)及小鼠血清(VWR,#RLD 108－0100)阻斷且接著於冰上以FAC洗滌緩衝劑(2% FBS，1X PBS)中之抗人類CD38 PE(BD Biosciences,San Jose,CA,#555460)及抗人類PC FITC(Dakocytomation,Glostrup,Denmark,#K2311)抗體染色20分鐘。接著將細胞洗滌且在FAC Calibur機(BD,Inc,Franklin Lakes,NJ)上分析。將人類CD38表現用作成功人類PBMC轉移之陽性對照。將漿細胞定義為CD38高，PC＋。
在實驗#07－0377(圖12A)中，參照同型對照抗gp120－ muIgG1測試三種抗IgE/M1'抗體(47H4、26A11及7A6)。經同型對照處理之小鼠至第9天產生高含量之人類IgE。以抗IgE/M1'候選物處理使IgE含量降低65－84%(圖12B－C)。抗IgE/M1'處理亦使活體內產生IgE之細胞降低19－69%(圖12D－E)。其他血清Ig相對不受抗IgE/M1'處理之影響(對於一些huIg1、IgG3及IgG4之抗M1'抗體觀測到約30%之降低(圖12 F－G))。未觀測到在抗IgE/M1'處理下脾總漿細胞之百分比降低(圖12 H－I)。
實驗#07－1232(圖13A中)，參照同型對照抗體HERCEPTIN－huIgG1測試人類化抗IgE/M1'(47H4v5)。經同型對照處理之小鼠至第8天產生高含量血清IgE。以抗IgE/M1' huIgG1處理使IgE含量降低79%(圖13 B－D)且使產生IgE之漿細胞降低75%(圖13 C－D)。觀測到其他血清Ig(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA)(圖13 E－F)或脾中總漿細胞百分比未降低(圖13 G－H)。此等研究表明抗IgE/M1'抗體特異性降低血清IgE及產生IgE之細胞，而不降低其他同型免疫球蛋白。
實例10
人類M1'轉殖基因小鼠 產生huM1'轉殖基因"基因敲入"小鼠 由於小鼠不通常表現類似於人類之M1'域，故吾人產生具有"基因敲入"小鼠IgE基因座之人類M1'域之小鼠(圖14A)。人類M1'序列使用上游小鼠M1剪接受體位點且接著融合至下游小鼠M1序列(圖14B)。IRES－EGFPpA－Neo序列 盒亦敲入小鼠M2序列之3'。此基因敲入亦允許具有人類M1'域之小鼠IgE於IgE＋ B細胞表面上表現。M1'序列將不於經分泌IgE上表現。
篩選M1'基因敲入株(PCR) 藉由PCR使用對小鼠IgE基因座及人類M1'序列具特異性之引子來將人類M1'基因敲入小鼠基因定型。所使用之引子如下：WT FOR 5'－GGCCAAAGACCCTAAGACAGTC (SEQ ID NO：106) huM1' FOR 5'－GGGCTGGCTGGCGGCTCCGC (SEQ ID NO：107) WT REV 5'－CTATGCCCTGGTCTGGAAGATG (SEQ ID NO：108)
藉由以上引子，使用以下程式之32次循環[在94℃下，4 min；在94℃下，1 min；在60℃下，30秒；在72℃下，1 min(30次循環)；在72℃下，10 min]分析經純化之染色體組DNA。接著使PCR產物於2%瓊脂0.5X TBE凝膠上流出。野生型PCR基因型提供668 bp產物且hu－M1'基因敲入產生457 bp產物(圖14C)。
篩選M1'基因敲入株(南方) 篩選huM1'基因敲入ES細胞及最終小鼠株且藉由南方墨點法驗證。以HindIII(對於左臂而言)或BamHI(對於右臂而言)消化10 μg經純化之ES細胞或尾部染色體組DNA隔夜。接著使經消化之DNA於0.8%瓊脂糖1X TAE凝膠上流出。使用變性緩衝劑(1.5 M NaCl；0.5 M NaOH)將DNA轉移至耐綸(nylon)膜(Roche #1417240)隔夜。將膜沖洗，UV交聯且接著在46℃下，在旋轉下浸泡於DIG Easy Hyb溶液 (Roche #1585762)中。藉由PCR使用PCR DIG探針合成套組如製造商說明(Roche #11636090910)產生探針。
左臂引子為：FOR 5'－TGTCTGGTGGTGGACCTGGAAAGCG (SEQ ID NO：109) Rev 5'－TCCTCGCTCTCCTCCTCTGGTGGTG (SEQ ID NO：110) 右臂引子為：FOR 5'－CCATGCAACCTAGTATCCTATTCTC (SEQ ID NO：111) Rev 5'－CTTTATACAGGAGAACCTAGCCCAG (SEQ ID NO：112)
針對未經標記之PCR產物測試探針以確保增加之尺寸及良好DIG標記。接著在46℃下，在旋轉下以經蒸煮之探針探測墨點隔夜。次日，接著根據製造商說明將墨點洗滌且以抗DIG抗體顯色。將墨點曝露於薄膜歷時15－20分鐘。圖14D說明南方墨點結果。野生型小鼠產生於hu－M1'基因敲入等位基因中變為3 kB片段之左臂7.4 kB HindHIII片段。野生型小鼠產生於hu－M1'基因敲入等位基因中變為18.1 kB片段之右臂14.1 kB BamHI片段。展示野生型及雜合小鼠(圖14D)。
實例11
Hu－M1'轉殖基因模型：TNP－OVA免疫 此實例說明抗IgE/M1'候選物防止在對TNP－OVA之免疫初級反應(實驗#07－0234F；圖15A－I)或記憶反應(實驗#07－0234B；圖16A－K)免疫反應中，因受TNP－OVA刺激而產生IgE之能力。TNP－OVA或三硝基苯基－卵白蛋白為常用以產生有效抗體免疫反應之高度有效免疫原。
將數據表示為平均數±標準差。使用JMP統計軟體計算P值。鄧恩氏測試比較組平均值，其中相對於參照組測試所有測試組。各對司徒頓氏t使用司徒頓氏t測試比較各組對。接著應用邦弗朗尼校正來調節各對司徒頓氏t之p值以避免逐對比較。所有p值臨限為0.05。藉由自小鼠各值中減去未經感染或未經免疫組平均值來計算所報導之初級反應(圖15 A－I)與記憶反應(圖A－K)數據之百分比變化，再計算組平均值且接著計算各時間點相對於對照組之百分比變化。
人類IgE/M1'基因敲入小鼠(C57BL/6)之TNP－OVA免疫誘發活體內平衡Th1/Th2反應。初級免疫及激發後抗原特異性IgE含量達到約10－200 ng/ml之含量。在實驗#07－0234F中，於第0天，以TNP－OVA(Biosearch Technologies,Novato,CA)(每隻小鼠腹膜內注射於2 mg礬中之100 μg)TNP－OVA(Biosearch Technologies,Novato,CA)使huM1'基因敲入小鼠(C57B1/6)免疫(圖15A)。接著在第0天至第28天之間，每週三次以0.1 mg/kg抗體處理小鼠(圖15A)。在實驗#07－0234B中，於第0天以TNP－OVA/礬使huM1'基因敲入小鼠(C57B1/6)免疫(如前所述)且接著於第28天，以TNP－OVA(每隻小鼠腹膜內注射100 μg)激發huM1'基因敲入小鼠(圖16A)。於第28天與第49天之間，以10 mg/kg抗體處理小鼠(圖16A)。在免疫反應過程中對小鼠採血以監測抗原特異性血清IgE及IgG1含量。
使用在2－8℃下，以在pH值為9.6之50 mM碳酸鈉/碳酸氫 鈉中稀釋至0.5 μg/ml之TNP－OVA(TNP：OVA比率為13：1)(Biosearch Technologies,Novato,CA)，以每孔25微升塗覆12－18小時之ELISA盤(384孔，具有MaxiSorpTM 表面，Nunc,Neptune,NJ)量測TNP－OVA特異性IgE IgG1。接著傾析培養盤且將其吸乾。經1－2小時將阻斷緩衝劑(PBS，0.5% BSA，pH值為7.2，每孔50微升)添加至培養盤中。在室溫下在輕微攪拌下進行此培育及所有後續培育。將樣本於檢定稀釋劑(PBS、0.5% BSA、0.05% Tween－20、0.01% Proclin 300)中1/50稀釋，隨後經11點1/3連續稀釋。將標準物經七點於檢定稀釋劑中兩倍連續稀釋，以1 ng/ml(對於抗TNP OVA IgG1而言)及3 ng/ml(對於抗TNP OVA IgE而言)起始。將培養盤以洗滌緩衝劑(PBS、0.05% Tween－20，pH值為7.2)洗滌三次，且將標準物、樣本及對照物(每孔25微升)添加至一式兩份之培養盤中以用於獨立偵測IgG1及IgE同型。培育1.5－2小時後，將培養盤以洗滌緩衝劑洗滌六次。將結合生物素之大鼠抗小鼠IgG1及IgE mAb(BD Biosciences,San Diego,CA)於檢定稀釋劑中稀釋至0.5 μg/mL(對於IgG1而言)或1.0 μg/mL(對於IgE而言)且添加至適當培養盤中(每孔25微升)。將培養盤培育1－1.5小時，且以洗滌緩衝劑洗滌六次。將抗生蛋白鏈菌素－辣根過氧化物酶結合物(AMDEX,GE Healthcare,Piscataway,NJ)以1/80000稀釋(對於IgG1而言)或1/5000稀釋(對於IgE而言)，且添加至培養盤中(每孔25微升)歷時30 min。以洗滌緩衝劑洗滌六次後，藉由添加每孔25微升之四甲基聯苯胺 (Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)且培育15分鐘(對於IgG1而言)或25 min(對於IgE而言)來使培養盤顯色。藉由添加每孔25微升1 M H3 PO4 使反應終止且以620 nm為參照，在450 nm下讀取吸收率。自標準曲線之4參數擬合內插未知樣本結果。
首先藉由分離CD138＋細胞來識別來自脾或淋巴結之小鼠漿細胞。藉由Elispot法定量此等產生IgE之漿細胞。對於總產生IgE之細胞而言，將使用ELISA塗覆緩衝劑1：2稀釋之抗IgE抗體(來自BD OptEIA mIgE組#555248)以每孔50微升塗覆於MultiScreen HTS培養盤(Millpore #MSIPS4W10)上。在4℃下進行塗覆隔夜。次日早晨，於組織培養罩中使用多通道吸管以200 μl無菌PBS－tween 20(0.05%)洗滌培養盤5次。接著在室溫下使培養盤在300 μl PBS/5% BSA或細胞培養基(RPMI－1640，10% FBS)中阻斷兩小時。由脾臟或淋巴結製備單一細胞懸浮液且藉由FACS對細胞進行計數(如上所概述)。製備細胞以供塗覆，對於TNP－OVA免疫模型而言，以107 個細胞起始，隨後3－4倍稀釋，或對於鉤蟲屬(Nippostrongylus)感染模型而言，以4×106 個細胞起始，隨後2倍稀釋。使用小鼠A20 B細胞株作為陰性對照且使用TIB－141細胞株作為陽性對照。於細胞培養基(RPMI－1640＋10% FBS)中製備細胞稀釋液。阻斷步驟後，將培養盤以細胞培養基洗滌一次且吸出。以每孔100微升塗覆細胞。接著將培養盤在37℃，5% CO2 下培育隔夜。次日，使用SkanWasher 300(Molecular Devices (Sunnyvale,CA))，以PBS－tween 20(0.05%)洗滌培養盤6次。接著以製造商說明之濃度(通常介於1：250－1：500之間)，以每孔100微升使用來自BD OptEIA mIgE組(#555248)之結合生物素之二次抗體。於PBS/1% BSA中製備二次抗體。接著將培養盤在室溫下培育1小時且接著使用SkanWasher300以PBS－tween 20(0.05%)洗滌培養盤6次。接著以每孔100微升添加1：60稀釋之抗生蛋白鏈菌素AP(R&D #SEL002)，將其再次製備於PBS/1% BSA中，且在室溫下培育1小時。接著如前所述將培養盤以DI水洗滌3次且接著以DI水沖洗兩次。於紙巾上吸去任何剩餘液體。接著添加顯色試劑、BCIP/NBT(每孔100微升)且在室溫下在黑暗中將培養盤培育30分鐘。接著傾析受質且將培養盤以DI水沖洗兩次。翻轉培養盤以移除任何過量水且使其乾燥。使用解剖顯微鏡定量斑點。
實驗#07－0234F測試抗IgE/M1'防止對TNP－OVA初級免疫之IgE反應之能力。經抗gp120同型對照處理之小鼠產生血清IgE，於第8天至第14天達到峰值含量(約25 ng/ml)(圖15B)。抗IgE/M1'處理防止至第8天(98%)及第14天(99%)之血清IgE增加(圖15C－D)。此降低顯著不同於經同型處理之動物且並不顯著不同於未經免疫之小鼠(圖15C－E)。在貫穿實驗之28天中，抗原特異性IgG1含量僅受抗IgE/M1'適度影響(圖15F－I)。
實驗#07－0234B測試抗IgE/M1'防止對TNP－OVA之二級/記憶IgE反應之能力。第28天，對TNP－OVA加強免疫之二 級IgE反應更快速，4天後達到峰值，而非初級反應中之8－9天(圖16B)。於第28天以加強免疫起始以抗IgE/M1'候選物處理縮減第28天與第35天之間的IgE增加(圖16B)。與同型對照相比，經抗IgE/M1'處理之IgE含量至第32天顯著降低59－75%且至第35天顯著降低90－93%(圖16C－D)。至第35－42天，IgE含量並不顯著不同於未經免疫之小鼠(圖16E)。第28天與第49天之間此等處理組之分析曲線下面積進一步表明抗IgE/M1'使血清IgE含量降低74－84%，且使抗原特異性IgE之平均每天含量亦降低74－83%(圖16 F－H)。在以抗IgE/M1'處理後未觀測到抗原特異性IgG1顯著降低(圖16 I－K)。
實例12
HHu－M1'轉殖基因模型：巴西鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)感染模型 此實例說明抗IgE/M1'抗體預防IgE產生(圖17A－D)以及治療性降低先前由誘發之巴西鉤蟲感染中IgE產生的能力。藉由在免疫反應之峰值IgE含量(圖18 A－I)下及當在免疫反應晚期應用(圖19 A－G)時，投與抗IgE/M1'抗體來評估IgE產生之降低。
巴西鉤蟲為感染大鼠及小鼠之胃腸線蟲。蟲卵於糞便中孵化且成熟為感染期幼蟲L3。L3幼蟲經由皮膚進入宿主且遷移至血管中，接著於一至兩天後行進至肺中。於肺中發育為L4階段幼蟲後，其沿宿主氣管及食道行進且在第2天至第3天達到空腸。幼蟲成熟為成蟲且交配，且大約在第5 天產卵。巴西鉤蟲卵連同糞便自宿主排出。
感染巴西鉤蟲之小鼠表現初始先天免疫反應，隨後為強烈2型免疫性以清除感染。於感染早期發現補體及纖維結合蛋白沈積以促進白血球募集及黏著。募集效應細胞(諸如嗜伊紅細胞、嗜鹼性細胞及CD4＋ Th2細胞)至肺中來對抗感染。Th2細胞激素，IL－4及IL－13在於肺中持續免疫反應中起必需作用且為腸中蠕蟲清除所需。2型反應之特徵為高含量之抗體產生(包括IgE)。
人類IgE/M1'基因敲入小鼠(C57BL/6)對巴西鉤蟲感染產生強IgE反應，於第15－20天達到峰值(圖17B、18B、19B)。接著血清IgE含量降至較低但持續升高之含量。在第0天，以巴西鉤蟲感染小鼠。所有三次巴西鉤蟲感染實驗係以10 mg/kg抗IgE/M1' mIgG1抗體或抗gp120 mIgG1同型對照處理。在預防性研究(圖17A)中，於第0天起始至第21天，每週三次處理huM1'基因敲入小鼠。在峰值產生研究(圖18A)中，在第11天與第21天之間，每週三次處理huM1'基因敲入小鼠。在後期介入研究(圖19A)中，在第41天與第62天之間，每週三次處理huM1'基因敲入小鼠。
將數據表示為平均數±標準差。使用JMP統計軟體計算P值。鄧恩氏測試比較組平均值，其中相對於參照組測試所有測試組。各對司徒頓氏t使用司徒頓氏t測試比較各組對。接著應用邦弗朗尼校正來調節各對司徒頓氏t之p值以避免逐對比較。所有p值臨限為0.05。藉由自小鼠各值中減去未經感染或未經免疫組平均值來計算所報導之預防性 及峰值產生研究數據之百分比變化，再計算組平均值且接著計算各時間點相對於對照組之百分比變化。在後期介入研究中，藉由將第48天及第55天與第41天比較，計算各治療組內之百分比變化。
藉由如先前於實例12中所述之Elispot來定義及評估產生IgE之漿細胞。
預防性研究測試抗IgE/M1'防止IgE回應初級鉤蟲屬感染而增加之能力。對照(經同型處理)小鼠於感染後第15天達到高含量IgE產生(約3000 ng/ml)。經抗IgE/M1'處理之小鼠在感染後IgE產生降低(與抗gp120 mIgG1相比降低93－94%)，其並不顯著不同於未經感染之小鼠(圖17B－D)。
峰值產生研究測試抗IgE/M1'在對巴西鉤蟲感染之IgE反應峰值下治療性降低IgE含量之能力。所有治療組在鉤蟲屬感染後第11天達到高IgE含量(約2000 ng/ml)(圖18B)。抗IgE/M1'治療於第11天，在此反應峰值下起始。抗IgE/M1' mIgG1候選物在處理四天內使血清IgE含量降低82－89%(圖18 C－D)。至第21天，經抗IgE/M1'處理之小鼠之IgE含量降低97－98%，達到與未經感染對照組無統計上差異之含量(圖18E)。藉由抗IgE Elispot定量產生IgE之漿細胞。巴西鉤蟲感染於腸系膜淋巴結(每4×106 中約30個細胞；圖18F)及脾臟(每4×106 中約10個細胞；圖18G)中皆誘發顯著數目之產生IgE之細胞。至第21天，抗IgE/M1'處理使腸系膜淋巴結中產生IgE之細胞降低88－94%且使脾臟中產生IgE之細胞降低57－66%。所有治療組中腸系膜淋巴結及脾臟中總漿 細胞(CD138＋細胞)之頻率與未經感染之小鼠相比均增加，且由於以抗IgE/M1'處理，故在任一器官中均不存在總漿細胞頻率之顯著變化(圖18 H－I)。此等結果表明抗IgE/M1'抗體即使在於IgE產生之峰值含量下應用仍能藉由活體內消耗產生IgE之細胞來使血清IgE減少至標稱含量。
晚期介入研究測試抗IgE/M1'降低感染週期晚期達成之持續低含量IgE之能力。所有治療組在大約第15天達到IgE產生之峰值。在第41天啟始抗IgE/M1'處理後，治療組中血清IgE含量存在一定程度的差異(圖19 B－C)，其係藉由參照第41天含量作為100%而正規化(圖19D)。在第48天與第55天之間，抗IgE/M1'治療與抗gp120 mIgG1同型對照相比顯著降低血清IgE含量(圖19 E－G)。至第48天及第55天，IgE含量與分別降低20%及37%之同型對照(抗gp120 mIgG1)相比分別降低64－75%及75－84%(圖19 F－G)。在抗IgE/M1'療法開始前，治療組之間的平均IgE含量差異並不顯著不同於同型對照組(gp120)(圖19E)。然而，以抗IgE/M1'抗體處理展示至第48天(圖19F)及第55天(圖19G)與對照組中所觀測相比更明顯且顯著之血清IgE含量降低。藉由將第48天或第55天之各治療組與治療前第41天同一組之起始值比較來計算百分比變化及p值(d41)。
實例13
抗IgE/M1'抗體於哺乳動物細胞中之表現 此實例說明藉由於哺乳動物細胞中重組表現來製備可能糖基化形式之所需蛋白質或抗體。
將載體pRK5(參見於1989年3月15日公開之EP 307,247)用作表現載體。視情況，使用諸如Sambrook等人(同上)所述之接合法，將編碼抗IgE/M1'抗體輕鏈及/或重鏈之DNA以所選限制酶接合至pRK5中以允許插入該DNA。
在一實施例中，所選之宿主細胞可為293細胞。使人類293細胞(ATCC CCL 1573)於組織培養盤中，在諸如補充有胎牛血清及視情況之營養組份及/或抗生素之DMEM的培養基中生長至融合。將約10 μg接合至pRK5之編碼抗IgE/M1'抗體之DNA與約1 μg編碼VA RNA基因之DNA混合[Thimmappaya等人，Cell,31：543(1982)]且溶解於500 μl 1 mM Tris－HCl、0.1 mM EDTA、0.227 M CaCl2 中。向此混合物中逐滴添加500 μl 50 mM HEPES(pH值為7.35)、280 mM NaCl、1.5 mM NaPO4 且在25℃下，使沈澱物得以形成歷時10分鐘。將沈澱物懸浮且添加至293細胞中且使其在37℃下沈降約四個小時。吸出培養基且添加2 ml於PBS中之20%甘油歷時30秒。接著將293細胞以不含血清之培養基洗滌，添加新鮮培養基且將細胞培育約5天。
轉染後約24小時，將培養基移除且以培養基(單獨)或含有200 μCi/ml35 S－半胱胺酸及200 μCi/ml35 S－甲硫胺酸之培養基更換。培育12小時後，收集改良性培養基，將其於旋轉過濾器上濃縮且負載於15% SDS凝膠上。將經加工之凝膠乾燥且曝露於薄膜歷時所選之時間段以揭示抗IgE/M1'抗體之存在。含有經轉染細胞之培養基可進行進一步培育(在不含血清之培養基中)且於所選生物檢定中測試培養 基。
在替代技術中，可使用Somparyrac等人，Proc.Natl.Acad.Sci .,12 ：7575(1981)所述之硫酸葡聚糖法將抗IgE/M1'抗體瞬間引入293細胞中。使293細胞於旋轉燒瓶中生長至最大密度且添加700 μg接合至pRK5之編碼抗IgE/M1'抗體之DNA。首先藉由離心由旋轉燒瓶濃縮細胞且將其以PBS洗滌。將DNA－葡聚糖沈澱物於細胞離心塊上培育四小時。將細胞以20%甘油處理90秒，以組織培養基洗滌且再引入含有組織培養基、5 μg/ml牛胰島素及0.1 μg/ml牛運鐵蛋白之旋轉燒瓶中。約四天後，將改良性培養基離心且過濾以移除細胞及碎片。接著可將含有經表現之抗IgE/M1'抗體之樣本濃縮且藉由任何所選方法(諸如滲析及/或管柱層析)純化。
在另一實施例中，抗IgE/M1'抗體可於CHO細胞中表現。可使用已知試劑(諸如CaPO4 或DEAE－葡聚糖)將接合至pRK5之編碼抗IgE/M1'抗體之DNA轉染至CHO細胞中。如上所述，可培育細胞培養物，且以培養基(單獨)或含有放射性標記(諸如35 S－甲硫胺酸)之培養基更換培養基。確定抗IgE/M1'抗體存在後，可以不含血清之培養基更換培養基。較佳地，將培養物培育約6天，且接著收集改良性培養基。接著可將含有經表現之抗IgE/M1'抗體之培養基濃縮且藉由任何所選方法純化。
經抗原決定基標記之抗IgE/M1'抗體變異體亦可於宿主CHO細胞中表現。接合至pRK5之編碼抗IgE/M1'抗體之 DNA亦可次選殖出pRK5載體。次選殖插入物可進行PCR以與所選抗原決定基標記(諸如聚his標記)同框融合至桿狀病毒表現載體中。接著可將編碼抗IgE/M1'抗體插入物之聚his標記之DNA次選殖至含有用以選擇穩定純系之選擇標誌(諸如DHFR)的SV40驅動載體。最終，可以SV40驅動載體轉染CHO細胞(如上所述)。可如上所述進行標記以驗證表現。接著可將含有經表現之聚His標記之抗IgE/M1'抗體之培養基濃縮且藉由任何所選方法(諸如藉由Ni2＋ －螯合物親和力層析)純化。
亦可使抗IgE/M1'抗體藉由瞬間表現程序於CHO及/或COS細胞中表現或藉由另一穩定表現程序於CHO細胞中表現。
使用以下程序進行於CHO細胞中之穩定表現。將蛋白質表現為IgG構築體(免疫黏附素)，其中將可溶形式(例如胞外域)之各別蛋白質之編碼序列與含有鉸鏈域、CH2域及CH2域之IgG1恆定區序列融合及/或為聚His標記形式。
PCR擴增後，使用Ausubel等人，Currenr Protocols of Molecular Biology ，單元3.16,John Wiley and Sons(1997)所述之標準技術，將各別DNA次選殖至CHO表現載體中。建構CHO表現載體以便具有所關注DNA之可相容限制位點5＝及3＝從而容許cDNA＝s便利地穿梭。使用載體於CHO細胞中表現係如Lucas等人，Nucl.Acids Res. 24 ：9 1774－1779(1996)所述且使用SV40早期啟動子/強化子來驅動所關注cDNA及二氫葉酸還原酶(DHFR)之表現。DHFR表現允許 選擇轉染後質體之穩定維持。
使用可購得之轉染試劑SUPERFECT(Quiagen)、DOSPER或FUGENE(Boehringer Mannheim)將十二微克所需質體DNA引入約一千萬CHO細胞中。細胞係如同Lucas等人(同上)所述生長。如下所述將約3×10－7 個細胞於安瓿中冷凍以進一步生長且生產。
將含有質體DNA之安瓿藉由置放於水浴中解凍且藉由渦流混合。將內容物吸入含有10 mL培養基之離心管中且在1000 rpm下離心5分鐘。將上清液吸出且將細胞再懸浮於10 mL選擇性培養基(含有5% 0.2 Φm滲濾胎牛血清之0.2 Φm過濾PS20)中。接著將細胞等分至含有90 mL選擇性培養基之100 mL旋轉器中。1－2天後，將細胞轉移至填充有150 mL選擇性生長培養基之250 mL旋轉器中且在37℃下培育。再2－3天後，將250 mL、500 mL及2000 mL旋轉器以每毫升3×105 個細胞接種。藉由離心及再懸浮於生產培養基中來將細胞培養基與新鮮培養基交換。儘管可採用任何合適CHO培養基，但實際上可使用描述於在1992年6月16日頒予之美國專利第5,122,469號中之生產培養基。將3 L生產旋轉器以每毫升1.2×106 個細胞接種。在第0天，測定細胞數目及pH值。在第1天，對旋轉器取樣且開始以經過濾空氣噴射。第2天，對旋轉器取樣，將溫度變換至33℃，且獲取30 mL 500 g/L葡萄糖及0.6 mL 10%消泡劑(例如35%聚二甲基矽氧烷乳液，Dow Corning 365醫藥級乳液)。在整個生產中，根據需要調節pH值以使其保持在約7.2。10 天後，或直至生存力降低至70%以下，藉由離心且經由0.22 Φm過濾器過濾來收集細胞培養物。將濾液儲存在4℃下或即刻負載於管柱上以供純化。
對於聚His標記之構築體而言，使用Ni－NTA管柱(Qiagen)純化蛋白質。純化前，向改良性培養基中添加咪唑至5 mM之濃度。將改良性培養基以4－5 ml/min之流動速率泵至在4℃下於含有0.3 M NaCl及5 mM咪唑之20 mM Hepes緩衝劑(pH值為7.4)中平衡之6 ml Ni－NTA管柱上。負載後，將管柱以額外平衡緩衝劑洗滌且以含有0.25 M咪唑之平衡緩衝劑溶離蛋白質。隨後使高度純化之蛋白質以25 ml G25 Superfine(Pharmacia)管柱脫鹽至含有10 mM Hepes、0.14 M NaCl及4%甘露醇，pH值為6.8之儲存緩衝劑中且儲存在－80℃下。
如下自改良性培養基純化免疫黏附素(含有Fc)構築體。將改良性培養基泵至於pH值為6.8之20 mM磷酸鈉緩衝劑中平衡之5 ml蛋白A管柱(Pharmacia)上。負載後，將管柱以平衡緩衝劑廣泛洗滌，隨後以pH值為3.5之100 mM檸檬酸溶離。藉由將1 ml溶離份收集於含有275 ΦL pH值為9之1 M Tris緩衝劑之管中來將所溶離之蛋白質即刻中和。隨後將高度純化之蛋白質脫鹽至如上文對於聚His標記之蛋白質所述之儲存緩衝劑中。藉由SDS聚丙烯醯胺凝膠及藉由以Edman降解進行N末端胺基酸定序來評定均質性。
材料之寄存 以下材料已寄存於美國菌種保存中心，10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110－2209,USA(ATCC)：
此等寄存係依據國際認可出於專利程序目的之微生物寄存之布達佩斯合約(Budapest Treaty)及其相關細則(布達佩斯合約)的規定進行。其確保寄存物之活培養物自寄存之日起維持三十(30)年，且在對樣本之最近請求後至少五(5)年。該等寄存物可由ATCC按照布達佩斯合約之條款使用，且服從Genentech,Inc.與ATCC之間的協定，該協定確保相關美國專利頒發後或任何美國或國外專利申請案公諸於眾後(無論何種情況首先出現)，寄存物之培養物之子代可永久且無限制地為公眾所用，且確保子代可為由經授權之美國專利及商標局專員根據35 USC § 122命名及依據其之主管規則(包括37 CFR § 1.14，尤其參考886 OG 638)確 定的人員使用。
本申請案之受讓人已同意若寄存之材料培養物當在適當條件下培養時死亡或消失或遭破壞，則將在通知後立即以另一相同材料替換材料。所寄存材料之可用性不應理解為批准在違反任何政府權威下根據其專利法授予之權利的情況下實踐本發明。
認為上述書面描述足以使熟習此項技術者能夠實踐本發明。本發明之範疇不應受本文中所提供之實例限制。實際上，除本文中所展示及描述之彼等以外，自上述描述本發明之各種修正對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的且其屬於隨附申請專利範圍之範疇。
圖1A－B 為人類IgE(SEQ ID NO：1)、恆河猴IgE(SEQ ID NO：2)及非洲綠猴IgE(SEQ ID NO：3)之所選恆定鏈區之對準。展示CH2、CH3、CH4、M1'、跨膜域及胞內域之大致位置。
圖2A－2C 為展示各種抗M1'抗體之特異性之FACS斯卡查德曲線。圖2A－1 至2A－6 展示對較短形式之IgE(缺失M1')之結合，而圖2B－1 至2B－6 展示對較長形式(具有M1')之結合。圖2C－1 至2C－6 展示對由U266細胞株表現之IgE之結合。陰影曲線展示對照Ab之螢光強度，而無陰影曲線展示所測試抗體之相對螢光。圖2D－F 展示鼠類抗IgE/M1'抗體47H4、26A11及7A6之結合特異性。圖2D 展示47H4與人類、恆河猴及犬IgE/M1'結合，但不與缺少M1'之IgE結 合。圖2E 展示47H4與U266結合，而26A11及7A6不與U266結合。圖2F 展示47H4及7A6與恆河猴及犬M1'結合，而26A11僅與恆河猴結合。圖2G-I 展示人類化抗IgE/M1'抗體47H4 v.5、26A11 v6及7A6 v1之結合特異性。圖2G 展示所有三種人類化變異體47H4v5、26A11v6及7A6v1對IgE-M1'，而非缺少M1'之IgE具特異性。圖2H 展示變異體47H4v5及26A11v6(而非7A6v1)與U266結合。圖2I 展示47H4v5及7A6v1與恆河猴及犬M1'結合，而26A11v6僅與恆河猴M1'結合。
圖3A-L 為展示使用圖3M 中所示之連續稀釋液各種抗M1'抗體之相對結合親和力的FACS曲線。圖3N 展示各抗體之相對親和力。圖3O 匯總如藉由斯卡查德分析所量測，鼠類抗體47H4、26A11及7A6對人類、恆河猴及犬M1'之親和力。除非另有所述，否則所報導之數目為平均值。圖3P 匯總如藉由斯卡查德分析所量測，抗體47H4及26A11之指定人類化變異體對人類、恆河猴及犬M1'之親和力。
圖4A-D 展示抗M1'抗體之相對結合/阻斷研究。圖4A-1至4A-20 為展示經阻斷或部分阻斷結合之抗體之FACS曲線。圖4B 為展示阻斷其他抗體結合(部分或完全使用1：1莫耳比)之相對能力之二維曲線。圖4C 為更集中於特別指定之抗體且以10：1之莫耳比重複阻斷研究的二維曲線。圖4D 為展示由抗原決定基結合/阻斷研究產生之分組之示意圖。
圖5A-C 展示使用47H4、7A6及26A11進行之抗原決定基結合研究。圖5A 展示用以確定抗原決定基結合之分別包括 相鄰N及C末端殘基(SEQ ID NO：3)及M1'肽1-15(SEQ ID NO：5-19)之M1'區段。圖5B及5D 展示親本鼠類抗體47H4與肽4結合，7A6與肽4及5結合且26A11與肽7及8結合。圖5C及5E 展示人類化變異體47H4v5與肽4結合，而7A67v1與肽4及5結合且26A11v6與肽7及8結合，藉此保持親本鼠類抗體之抗原決定基特異性。
圖6A-F 展示鼠類抗體26A11、7A6及47H4及其各種人類化變異體之可變輕鏈及重鏈序列。位置係根據Kabat編號且將移植至可變一致網路之高變區(輕鏈之κI，重鏈之子群III)加框。圖6A 展示相對於人類κI輕鏈(SEQ ID NO：20)之26A11可變輕鏈(SEQ ID NO：21)及人類化變異體1，4可變輕鏈(SEQ ID NO：22)、變異體2，5可變輕鏈(SEQ ID NO：23)、變異體3，6可變輕鏈(SEQ ID NO：24)、變異體13，15可變輕鏈(SEQ ID NO：25)及變異體14，16可變輕鏈(SEQ ID NO：26)。圖6B 展示相對於人類κI輕鏈(SEQ ID NO：20)之7A6可變輕鏈(SEQ ID NO：27)及人類化變異體1可變輕鏈(SEQ ID NO：28)。圖6C 展示相對於人類κI輕鏈(SEQ ID NO：20)之47H4可變輕鏈(SEQ ID NO：29)及人類化變異體1，3可變輕鏈(SEQ ID NO：30)及變異體2，4-6可變輕鏈(SEQ ID NO：31)。圖6D 展示相對於人類III重鏈(SEQ ID NO：32)之26A11可變重鏈(SEQ ID NO：33)及人類化變異體1-3，13，14可變重鏈(SEQ ID NO：34)及變異體4-6、15、16可變重鏈(SEQ ID NO：35)。圖6E 展示相對於人類重鏈(SEQ ID NO：32)之7A6可變重鏈(SEQ ID NO：36)及人類化變異體1 可變重鏈(SEQ ID NO：37)。圖6F 展示相對於人類III重鏈(SEQ ID NO：32)之47H4可變重鏈(SEQ ID NO：38)及人類化變異體1，2可變重鏈(SEQ ID NO：39)、變異體3-4可變重鏈(SEQ ID NO：40)、變異體5可變重鏈(SEQ ID NO：41)及變異體6可變重鏈(SEQ ID NO：42)。
圖7A-G 展示經IgE-M1'轉染之Daudi細胞中親本抗M1'抗體之細胞凋亡活性。圖7A 為展示基本上IgM係以高於IgE之量表現之FACS曲線。圖7B 展示交聯抗IgM[F(ab')2 ]抗體及應用喜樹鹼(camptothecin)分別於誘發細胞凋亡中之作用。對於膜聯蛋白染色為陽性但對於PI染色為陰性之細胞正在死亡，而對於膜聯蛋白及PI染色皆為陽性之細胞已死亡。圖7C 為所觀測之總細胞凋亡之圖解描述，其中淺色條形展示細胞為膜聯蛋白-(+)及PI-(-)，而深色條形展示膜聯蛋白-(+)且PI-(+)。圖7D-7G 為在25、10、1、0.1、0.01及0.001μg/ml之濃度下抗M1'誘發之細胞凋亡之圖解表示。圖7D 展示在無交聯下應用抗原決定基組A1之M1'抗體(包括7A6、47H4、47G4、42A5、42H4(連同對照物MAE-11及GP120))之結果。圖7E 展示在無交聯下應用抗原決定基組A2之M1'抗體(包括1C11、26A11、51D2、45C1)及抗原決定基組B/C(包括26B11及28E9)之結果。圖7F 展示交聯下之抗原決定基組A1且圖7G 展示交聯下之抗原決定基組A2及B/C。
圖8A-B 展示人類化抗M1'變異體在以濃度為25、10、1、0.1、0.01及0.001μg/ml之各種人類化抗M1'抗體變異體 處理，經IgE－M1'轉染之Daudi細胞中的細胞凋亡活性。圖8A 展示人類化變異體47H4v5、26A11v6及7A6v1在較高濃度水平(亦即10－25 μg/ml 47H4及26A11變異體，1、10及25 μg 7A6變異體)下誘發30－40%範圍內之細胞凋亡。圖8B 展示相同抗體對在山羊抗人類IgG F(ab')2 交聯抗體存在下處理之經IgE－M1'轉染之Daudi細胞的細胞凋亡活性。所有抗體均誘發70－90%之最大細胞凋亡水平，其中細胞凋亡活性在高濃度下具有一定程度的降低(例如47H4 －v1、－v2、26A11 －v1、－v14)。圖8C 展示野生型及去海藻糖基化47H4v5皆能夠以類似水平誘發細胞凋亡。
圖9A－B1－2 展示鼠類抗M1'抗體誘發Daudi－IgE/M1'細胞中鈣流通之能力。圖9A 為展示抗IgM及MAE11之作用之對照，而圖9B1－B2 展示應用指定鼠類抗M1'抗體之作用。
圖10 展示人類化抗IgE/M1'抗體47H4 v5 wt及去海藻糖基化變異體誘發ADCC之能力。儘管wt及去海藻糖基化變異體誘發類似最大細胞毒性，但去海藻糖基化變異體("AF")比野生形式更有效(EC50 AF0.83 nM，EC50 wt6.6 nM)。
圖11A－11F 為鼠類抗IgE/M1'抗體之重鏈及輕鏈之全長序列。可變區係以斜體展示，而HVR(高變區)加下劃線。圖11A 分別展示鼠類抗體7A6之重鏈及輕鏈(SEQ ID NO：43及44)。圖11B 分別展示鼠類抗體47H4之重鏈及輕鏈(SEQ ID NO：45及46)。圖11C 分別展示鼠類抗體26A11之重鏈及輕鏈(SEQ ID NO：47及48)。圖11D 分別展示鼠類抗體45C1之 重鏈及輕鏈(SEQ ID NO：49及50)。圖11E 分別展示鼠類抗體28E9之重鏈及輕鏈(SEQ ID NO：51及52)。圖11F 分別展示鼠類抗體1C11之重鏈及輕鏈(SEQ ID NO：53及54)。
圖12A－I 顯示鼠類抗IgE/M1'抗體於異位性hu－SCID模型中抑制血清IgE及產生IgE之漿細胞之產生的能力。圖12A 為實驗設計之圖解描述。圖12B－C 展示以鼠類抗IgE/M1'抗體處理使IgE含量降低65－84%。圖12D－E 展示活體內產生IgE之細胞降低19－69%。圖12F－G 展示其他免疫球蛋白(例如IgG1－4，IgA，IgM)之含量相對不受影響。圖12H－I 展示未觀測到脾漿細胞總量降低。
圖13A－H 展示在異位性hu－SCID模型中人類化變異體47H4v5對免疫球蛋白含量之影響。圖13A 為實驗設計之圖解描述。圖13B－D 展示血清IgE降低79%且產生IgE之漿細胞降低75%。圖13E－F 展示其他血清免疫球蛋白之含量未降低。圖13G－H 展示總漿細胞含量未降低，從而表明47H4特異性減少佔總漿細胞極小比例之產生IgE之漿細胞。
圖14A－D 說明huM1'敲入小鼠之產生。圖14A 展示M1'外顯子在小鼠IgE基因座上之位置。圖14B 展示致使產生靶等位基因之小鼠IgE基因座中重組之示意圖。圖14C 展示wt小鼠中668 bp區帶及M1'敲入小鼠中457 bp區帶之PCR基因定型。圖14D 展示南方墨點，其中wt小鼠中7.4 kB HindIII片段在hu－M1'敲入小鼠中變為3 kB片段，且14.1 kB BamHI片段在hu－M1'敲入等位基因中變為18.1片段。展示野生型及雜合小鼠。
圖15A－I 展示抗IgE/M1'抗體防止初級免疫反應中產生IgE之能力。圖15A 為展示實驗設計之時間線(包括投與TNP/OVA及抗IgE/M1'抗體)之示意圖。圖15B 為抗原特異性IgE含量隨時間之圖表且展示當對照動物(亦即gp120)體內抗原特異性IgE含量在第8天與第14天之間達到峰值含量時，抗IgE/M1'防止任何增加，且所量測之抗原特異性IgE含量並不顯著不同於未經免疫之小鼠。圖15C－D 分別展示第8天及第14天抗IgE/M1'治療防止抗原特異性血清IgE之增加，且與未經免疫之小鼠無統計上差異(圖15E )。圖15F－I 展示在貫穿實驗之28天中抗原特異性IgG1之含量不受抗IgE/M1'之顯著影響(除在第14天適度差異以外)。
圖16A－K 展示抗IgE/M1'抗體於記憶或二級免疫反應中防止抗原特異性IgE產生之能力。圖16A 為展示TNP－OVA之二級加強免疫，及投與抗IgE/M1'抗體(其首先於第28天投與)之時間線之示意圖。圖16B 為抗原特異性IgE含量隨時間之圖表且展示第28天對TNP－OVA加強免疫之二級IgE反應較快，在4天後達到峰值而非初級反應中之8－9天。圖16C－D 展示經抗IgE/M1'處理之動物體內抗原特異性IgE含量與同型對照相比顯著至第32天降低59－65%且至第35天降低90－93%。圖16E 展示至第42天(最初投與抗IgE 12天)，抗原特異性IgE含量降低至並不在統計上不同於原生對照小鼠之含量。圖16F－H 展示在第28天與第49天之間，投與抗IgE/M1'使血清IgE含量降低74－84%，且使抗原特異性IgE之平均每天含量亦降低74－83%。圖16I－K 展示抗原特異性 IgG1之含量不受抗IgE/M1'之顯著影響。
圖17A－D 說明抗IgE/M1'抗體預防性降低回應於巴西鉤蟲("NB")感染之IgE產生。圖17A 為展示實驗設計之示意圖。於第0天起始至第21天每週處理動物三次。圖17B 展示使用抗IgE/M1'及對照抗體，回應於NB感染隨時間變化之IgE含量。圖17C－D 展示在第15天，經抗IgE/M1'處理之動物具有在統計上與未感染小鼠無顯著差異之降低之血清IgE含量。
圖18A－I 說明抗IgE/M1'抗體藉此治療性處理對巴西鉤蟲("NB")感染之峰值IgE反應的能力。圖18A 為展示實驗設計之示意圖。在第11天與第21天之間每週處理動物三次。圖18B 展示使用抗IgE/M1'及對照抗體，回應於NB感染隨時間變化之IgE含量。圖18C－D 展示抗IgE/M1'使血清IgE含量在治療之四天內降低82－89%。圖18E 展示至第21天，抗IgE/M1'處理之動物體內之IgE含量為97－98%，且達到與未感染對照組在統計上無顯著差異之含量。圖18F－G 展示淋巴結及脾中產生IgE之漿細胞(如Elispot所定量)分別減少88－94%及57－66%。圖18H－I 展示所有治療組中淋巴結及脾中之總血漿細胞(CD138＋)與未感染小鼠相比均增加，且以抗IgE/M1'處理不顯著改變任一器官中之漿細胞總數目。此等結果表明抗IgE/M1'抗體藉由消耗活體內產生IgE之細胞來降低血清IgE含量之能力。
圖19A－G 說明抗IgE/M1'抗體治療性處理發生在感染週期晚期對巴西鉤蟲("NB")感染之IgE反應之能力。圖19A 為展 示實驗設計之示意圖，其中於第40天起始每週處理動物三次。圖19B 展示峰值IgE產生發生於約第15天且展示所有抗IgE/M1'均減少血清IgE。圖19C－D 分別展示抗IgE/M1'抗體展示相對於治療開始時，絕對及正規化IgE含量顯著降低。圖19E－G 展示在第48天與第55天之間，與抗gp120 mIgG1同型對照相比抗IgE/M1'治療顯著降低血清IgE含量。
<110> 美商建南德克公司<120> 細胞凋亡抗－IGE抗體<130> P2474R1 WO <140> 097110305 <141> 2008－03－21 <150> US 60/896,339 <151> 2007－03－22 <160> 112 <210> 1 <211> 431 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> 人類IgE <400> 1 <210> 2 <211> 432 <212> PRT <213> 獼猴<220> <221> Other... <223> ‘恆河猴IgE <400> 2 <210> 3 <211> 431 <212> PRT <213> 食蟹猴<220> <221> Other... <223> 犬IgE <400> 3 <210> 4 <211> 104 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> 人類IgE片段<400> 4<210> 5 <2111> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽1 <400> 5<210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽2 <400> 6<210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽3 <400> 7<210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽4 <400> 8<210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽5 <400> 9<210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽6 <400> 10<210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽7 <400> 11<210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽8 <400> 12<210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> M1'肽9 <400> 13<210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽10 <400> 14<210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽11 <400> 15<210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽12 <400> 16<2110> 17 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽13 <400> 17<2110> 18 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽14 <400> 18<210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> M1'肽15 <400> 19<210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> 人類I抗體輕鏈<400> 20<210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類26A11抗體輕鏈<400> 21<210> 22 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化26A11 v 1,4抗體輕鏈<400> 22<210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化26A11 v2,5抗體輕鏈<400> 23<210> 24 <211> 108 <2112> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化26A11 v3,6抗體輕鏈<400> 24 <210> 25 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化26A11 v13,15抗體輕鏈<400> 25<210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化26A11 v14,16抗體輕鏈<400> 26 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類7A6抗體輕鏈<400> 27<210> 28 <211> 114 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化7A6 V.1抗體輕鏈<400> 28 <210> 29 <211> 113 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 人類化47H4抗體輕鏈<400> 29<210> 30 <211> 113 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化47H4 V.1,3抗體輕鏈<400> 30<210> 31 <211> 113 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化47H4 V.24－6抗體輕鏈<400> 31<210> 32 <211> 113 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> 人類III抗體重鏈<400> 32<210> 33 <211> 112 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類26A11抗體重鏈<400> 33<210> 34 <211> 112 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化26A11 V.1－3,13,14抗體重鏈<400> 34<210> 35 <211> 112 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化26A11 V.4－6,15,16抗體重鏈<400> 35 <210> 36 <211> 122 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類7A6抗體重鏈<400> 36<210> 37 <211> 122 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化7A6 V.1抗體重鏈<400> 37 <210> 38 <211> 117 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類47H4抗體重鏈<400> 38<210> 39 <211> 117 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化47H4 V.1,2抗體重鏈<400> 39 <2110> 40 <211> 117 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化47H4 V.3,4抗體重鏈<400> 40<210> 41 <211> 117 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化47H4 V.5抗體重鏈<400> 41 <210> 42 <211> 117 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 人類化47H4 V.6抗體重鏈<400> 42<210> 43 <211> 446 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類7A6抗體重鏈全長<400> 43 <210> 44 <211> 220 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類7A6抗體輕鏈全長<400> 44 <210> 45 <211> 442 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類47H4抗體重鏈全長<400> 45 <210> 46 <211> 219 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類47H4輕鏈全長<400> 46<210> 47 <211> 436 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類26A11抗體重鏈全長<400> 47 <210> 48 <211> 214 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類26A11抗體輕鏈全長<400> 48<210> 49 <211> 449 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類45C1抗體重鏈全長<400> 49 <210> 50 <211> 219 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類45C1抗體輕鏈全長<400> 50<210> 51 <211> 446 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類28E9抗體重鏈全長<400> 51 <210> 52 <211> 214 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類28E9抗體輕鏈全長<400> 52<210> 53 <211> 442 <212> PRT <213> 小家鼠 <220> <221> Other... <223> 鼠類1C11抗體重鏈全長<400> 53 <210> 54 <211> 220 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> 鼠類1C11抗體輕鏈全長<400> 54 <210> 55 <211> 25 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> VH人類一致構架－H1 <400> 55<210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> VH人類一致構架－H2 <400> 56<210> 57 <211> 32 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> VH人類一致構架－H3 <400> 57<210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> VH人類一致構架－H4 <400> 58<210> 59 <211> 23 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> VL人類一致構架－L1 <400> 59<210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> VL人類一致構架－L2 <400> 60<210> 61 <211> 32 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> VL人類一致構架－L3 <400> 61<210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> 智人<220> <221> Other... <223> VL人類一致構架－L4 <400> 62<210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用於實例1中之正向選殖引子<400> 63<210> 64 <211> 35 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 用於實例1中之反向選殖引子 <400> 64<210> 65 <211> 542 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> IgE Ch3－Ch4－M'－Fe融合體<400> 65 <210> 66 <211> 25 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，重鏈7AG <400> 66<210> 67 <211> 25 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，輕鏈7AG <400> 67<210> 68 <211> 25 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，重鏈1C11 <400> 68<210> 69 <211> 25 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，輕鏈1C11 <400> 69<210> 70 <211> 25 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，重鏈47H4 <400> 70<210> 71 <211> 21 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，輕鏈47H4 <400> 71<210> 72 <211> 25 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，重鏈26A11 <400> 72<210> 73 <211> 25 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，輕鏈26A11 <400> 73<210> 74 <211> 19 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，重鏈45C1 <400> 74<210> 75 <211> 24 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，輕鏈45C1 <400> 75<210> 76 <211> 25 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，重鏈28E9 <400> 76<210> 77 <211> 24 <212> PRT <213> 小家鼠<220> <221> Other... <223> N末端序列，輕鏈28E9 <400> 77<210> 78 <211> 46 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> FOR.BsiWI 7AG HC正向引子<400> 78<210> 79 <211> 39 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> FOR.EcoRV 7A6 LC正向引子<400> 79<210> 80 <211> 46 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> FOR.BsiWI 1C11 HC正向引子<400> 80<210> 81 <211> 39 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> FOR.EcoRV 1C11 LC正向引子<400> 81<210> 82 <211> 46 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 9.1HCF.BsiWI 47H4 HC正向引子<400> 82<210> 83 <211> 39 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 47H4LCF.EcoRV 47H4 LC正向引子<400> 83<210> 84 <211> 43 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> C7F7HCF.BsiWI 26A11 HC正向引子<400> 84<210> 85 <211> 37 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 2B4LCF.EcoRV 26A11 LC正向引子<400> 85<210> 86 <211> 45 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 2G6HCF.BSiWI 45C1 HC正向引子<400> 86<210> 87 <211> 41 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 9C10LCF.EcoRV 45C1 LC正向引子<400> 87<210> 88 <211> 46 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 9.1HCFBsiWI 28E9 HC正向引子<400> 88<210> 89 <211> 39 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 5E10.LCF.EcoRV 28E9 LC正向引子<400> 89<210> 90 <211> 45 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 重鏈引子(HCR) <400> 90<210> 91 <211> 39 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 輕鏈引子(LCR) <400> 91<210> 92 <211> 38 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> REV.ApaI 7A6 HC反向引子<400> 92<210> 93 <211> 43 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> REV.KpnI 7A6 LC反向引子<400> 93<210> 94 <211> 37 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> REV.ApaI 1C11 HC反向引子<400> 94<210> 95 <211> 38 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> REV.KpnI 1C11 LC反向引子<400> 95<210> 96 <211> 37 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 47H4HCR.ApaI 47H4 HC反向引子<400> 96<210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 47H4LCR.KpnI 47H4 LC反向引子<400> 97<210> 98 <211> 44 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 7G8HCR.ApaI 26A11 HC反向引子<400> 98<210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 47H4LCR.KpnI 26A11 LC反向引子<400> 99<210> 100 <211> 40 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 45C1HCR.ApaI 45C1 HC反向引子<400> 100<210> 101 <211> 18 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 5C2LCR.KpnI 45C1 LC反向引子<400> 101<210> 102 <211> 40 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 28E9.HC.REV.ApaI 28E9 HC反向引子 <400> 102<210> 103 <211> 22 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 1D5.2LCR,KpnI 28E9 LC反向引子<400> 103<210> 104 <211> 33 <212> DNA <213> 小家鼠<400> 104<210> 105 <211> 33 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 反向突變引子<400> 105<210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> M1'篩選WT正向引子<400> 106<210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> M1'篩選huM1'正向引子<400> 107<210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> M1'篩選WT反向引子<400> 108<210> 109 <211> 25 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 左臂正向引子<400> 109<210> 110 <211> 25 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 左臂反向引子<400> 110<210> 111 <211> 25 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 右臂正向引子<400> 111<210> 112 <211> 25 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 右臂反向引子<400> 112
(無元件符號說明)

Claims (77)

  1. 一種抗IgE/M1'抗體，其特異性結合IgE之M1'區段中之由SEQ ID NO：1之第317至351殘基所定義之抗原決定基(epitope)，且誘發表現IgE之B細胞之細胞凋亡。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體結合人類、恆河猴及獼猴(cynomolgus)來源之IgE。
  3. 一種抗IgE/M1'抗體，其以治療有效量活體內投與哺乳動物時特異性結合IgE之M1'區段中之由SEQ ID NO：1之第317至351殘基所定義之抗原決定基，且特異性消耗產生IgE之B細胞。
  4. 如請求項3之抗體，其減少總血清IgE。
  5. 如請求項4之抗體，其減少游離血清IgE。
  6. 如請求項4之抗體，其中該IgE具過敏原特異性。
  7. 如請求項3之抗體，其為嵌合抗體。
  8. 如請求項3之抗體，其為人類化抗體。
  9. 如請求項3之抗體，其為人類抗體。
  10. 一種抗IgE/M1'抗體，其特異性結合於與一種選自由47H4、7A6、26A11、47H4v5、7A6v1及26A11v6組成之群之抗體所結合之抗原決定基(epitope)相同的抗原決定基；其中26A11包含具有SEQ ID NO：21所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：33所示胺基酸序列之重鏈可變區；26A11v6包含具有SEQ ID NO：24所示胺基酸序列之 輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：35所示胺基酸序列之重鏈可變區；7A6包含具有SEQ ID NO：27所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：36所示胺基酸序列之重鏈可變區；7A6v1包含具有SEQ ID NO：28所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：37所示胺基酸序列之重鏈可變區；47H4包含具有SEQ ID NO：29所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：38所示胺基酸序列之重鏈可變區；及47H4v5包含具有SEQ ID NO：31所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：41所示胺基酸序列之重鏈可變區。
  11. 如請求項10之抗體，其中該抗原決定基對應於一種選自由下列組成之群之肽：肽4(SEQ ID NO：8)、肽5(SEQ ID NO：9)、肽7(SEQ ID NO：11)或肽8(SEQ ID NO：12)。
  12. 如請求項11之抗體，其中該抗原決定基對應於肽4(SEQ ID NO：8)。
  13. 一種肽，其係選自由下列組成之群：肽4(SEQ ID NO：8)、肽5(SEQ ID NO：9)、肽7(SEQ ID NO：11)或肽8(SEQ ID NO：12)。
  14. 一種抗IgE/M1'抗體，其特異性結合於IgE之M1'區段中之由SEQ ID NO：1之第317至351殘基所定義之抗原決定 基，且其斯卡查德結合親和力(Scatchard binding affinity)等於鼠類抗IgE/M1'抗體47H4之斯卡查德結合親和力；其中鼠類抗IgE/M1'抗體47H4包含具有SEQ ID NO：29所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：38所示胺基酸序列之重鏈可變區。
  15. 如請求項14之抗體，其中該親和力係介於0.30與0.83nm之間。
  16. 一種抗IgE/M1'抗體，其特異性結合於IgE之M1'區段中之由SEQ ID NO：1之第317至351殘基所定義之抗原決定基，且其斯卡查德結合親和力等於人類化抗IgE/M1'抗體47H4v5之斯卡查德結合親和力；其中人類化抗IgE/M1'抗體47H4v5包含具有SEQ ID NO：31所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：41所示胺基酸序列之重鏈可變區。
  17. 如請求項16之抗體，其中該親和力為約1.5nm。
  18. 一種抗IgE/M1'抗體，其包含一種選自由26A11、26A11 v1-6及26A11 v13-16、7A6、7A6v1、47H4及47H4v1-6組成之群之抗體或其抗原結合片段的重鏈及輕鏈高變區(HVRS)；其中26A11包含具有SEQ ID NO：21所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：33所示胺基酸序列之重鏈可變區；26A11v1-6及26A11v13-16包含具有選自由SEQ ID NOs：22至26所組成群之胺基酸序列之輕鏈可變區及 具有選自由SEQ ID NOs：34及35所組成群之胺基酸序列之重鏈可變區；7A6包含具有SEQ ID NO：27所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：36所示胺基酸序列之重鏈可變區；7A6v1包含具有SEQ ID NO：28所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：37所示胺基酸序列之重鏈可變區；47H4包含具有SEQ ID NO：29所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：38所示胺基酸序列之重鏈可變區；及47H4v1-6包含具有選自由SEQ ID NOs：30及31所組成群之胺基酸序列之輕鏈可變區及具有選自由SEQ ID NOs：39至42所組成群之胺基酸序列之重鏈可變區。
  19. 如請求項18之抗體，其包含選自由26A11、26A11 v1-6及26A11v13-16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1-6組成之群之抗體或其抗原結合片段的重鏈及輕鏈之可變區。
  20. 如請求項18之抗體，其包含47H4v1-6抗體或其抗原結合片段之重鏈及輕鏈HVRs。
  21. 如請求項18之抗體，其具有抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性。
  22. 如請求項18之抗體，其經去海藻糖基。
  23. 如請求項18之抗體，其中該重鏈及輕鏈HVRs係來自選自由下列所組成之群之抗體：26A11、26A11 v1、26A11 v2、 26A11 v3、26A11 v4、26A11 v5,26A11 v6、26A11 v13、26A11 v14、26A11 v15、26A11 v16、7A6、7A6v1、47H4、47H4v1、47H4v2、47H4v3、47H4v4、47H4v5及47H4v6.。
  24. 如請求項23之抗體，其中該重鏈及輕鏈HVRs係來自抗體47H4v5。
  25. 如請求項24之抗體，其具有ADCC活性。
  26. 如請求項24之抗體，其經去海藻糖基。
  27. 如請求項19之抗體，其中該重鏈及輕鏈之可變區係來自抗體47H4v5。
  28. 如請求項27之抗體，其具有ADCC活性。
  29. 如請求項27之抗體，其經去海藻糖基。
  30. 一種抗IgE/M1'抗體，其包含一可變重鏈及一可變輕鏈，其中該可變重鏈為SEQ ID NO：41及該可變輕鏈為SEQ ID NO：31。
  31. 如請求項30之抗體，其具有ADCC活性。
  32. 如請求項30之抗體，其經去海藻糖基。
  33. 一種抗IgE/M1'抗體，其包含一可變重鏈及一可變輕鏈，其中該可變重鏈進一步包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，及該可變輕鏈進一步包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3，且：(a)HVR-H1為SEQ ID NO：41之殘基26-35，(b)HVR-H2為SEQ ID NO：41之殘基49-66，(c)HVR-H3為SEQ ID NO：41之殘基97-106，(d)HVR-L1為SEQ ID NO：31之殘基24-39， (e)HVR-L2為SEQ ID NO：31之殘基55-61，(f)HVR-L3為SEQ ID NO：31之殘基94-102。
  34. 如請求項33之抗體，其具有ADCC活性。
  35. 如請求項33之抗體，其經去海藻糖基。
  36. 如請求項33至35中任一項之抗體，其進一步包含人類一致構架(consensus framework)。
  37. 如請求項36之抗體，其中該可變重鏈包含子群III一致構架。
  38. 如請求項33至35中任一項之抗體，其中該可變輕鏈包含κ 子群I一致構架。
  39. 如請求項37之抗體，其中該可變輕鏈包含κ 子群I一致構架。
  40. 一種組合物，其包含如請求項1-12及14-39中任一項之抗體或如請求項13之肽與至少一種醫藥學上可接受之載劑組合。
  41. 一種組合物，其包含如請求項1-12及14-39中任一項之抗體或如請求項13之肽組合至少一種醫藥學上可接受之載劑及一或多種選自由下列組成之群之藥物：抗IgE抗體、抗組織胺劑、支氣管擴張劑、糖皮質激素、非類固醇消炎藥(NSAID)、TNF拮抗劑、整合素拮抗劑、免疫抑制劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、雙重IL-4/IL-13拮抗劑、改變病情之抗風濕性藥(DMARD)、與B細胞表面標記結合之抗體及B細胞活化因子(BAFF)拮抗劑。
  42. 一種分離之核酸，其編碼一種抗體或其抗原結合片段， 該抗體或其抗原結合片段包含一種選自由26A11、26A11 v1-6及26A11 v13-16、7A6、7A6v1、47H4及47H4v1-6組成之群的細胞凋亡抗IgE/M1'抗體或其抗原結合片段之重鏈及輕鏈HVRs；其中26A11包含具有SEQ ID NO：21所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：33所示胺基酸序列之重鏈可變區；26A11v1-6及26A11 v13-16包含具有選自由SEQ ID NOs：22至26所組成群之胺基酸序列之輕鏈可變區及具有選自由SEQ ID NOs：34及35所組成群之胺基酸序列之重鏈可變區；7A6包含具有SEQ ID NO：27所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：36所示胺基酸序列之重鏈可變區；7A6v1包含具有SEQ ID NO：28所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：37所示胺基酸序列之重鏈可變區；47H4包含具有SEQ ID NO：29所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：38所示胺基酸序列之重鏈可變區；及47H4v1-6包含具有選自由SEQ ID NOs：30及31所組成群之胺基酸序列之輕鏈可變區及具有選自由SEQ ID NOs：39至42所組成群之胺基酸序列之重鏈可變區。
  43. 如請求項42之核酸，其進一步包含編碼選自由26A11、26A11 v1-6及26A11 v13-16、7A6、7A6v1、47H4及47H4v1-6組成之群的抗體序列之重鏈及輕鏈之可變區的核酸。
  44. 如請求項43之核酸，其中該編碼抗體經去海藻糖基。
  45. 一種載體，其中如請求項43之核酸係可操作地連接。
  46. 一種宿主細胞，其包含如請求項45之載體。
  47. 如請求項46之宿主細胞，其為哺乳動物細胞。
  48. 如請求項47之宿主細胞，其為中國倉鼠卵巢細胞。
  49. 一種用於產生細胞凋亡抗IgE/M1'抗體或功能片段之方法，其包含如請求項46之宿主細胞在適合表現該抗體或片段之條件下培養及回收該抗體或片段。
  50. 一種製品，其封裝如請求項40或41之組合物及說明用於治療IgE介導之病症之用途的說明書。
  51. 如請求項50之製品，其為小瓶。
  52. 如請求項50之製品，其為預先填充之注射器。
  53. 如請求項52之製品，其另外包含注射裝置。
  54. 如請求項53之製品，其為自動注射器。
  55. 一種抗IgE/M1'抗體之用途，其係用於製造特異性消耗產生IgE之B細胞之藥物，其中該抗IgE/M1'抗體特異性結合於IgE之M1'區段且誘發表現IgE之B細胞之細胞凋亡。
  56. 如請求項55之用途，其中該抗體包含選自由26A11、26A11v1-6及26A11v13-16、7A6、7A6v1、47H4及47H4v1-6組成之群的抗體之重鏈及輕鏈HVRs；其中 26A11包含具有SEQ ID NO：21所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：33所示胺基酸序列之重鏈可變區；26A11v1-6及26A11 v13-16包含具有選自由SEQ ID NOs：22至26所組成群之胺基酸序列之輕鏈可變區及具有選自由SEQ ID NOs：34及35所組成群之胺基酸序列之重鏈可變區；7A6包含具有SEQ ID NO：27所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：36所示胺基酸序列之重鏈可變區；7A6v1包含具有SEQ ID NO：28所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：37所示胺基酸序列之重鏈可變區；47H4包含具有SEQ ID NO：29所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：38所示胺基酸序列之重鏈可變區；及47H4v1-6包含具有選自由SEQ ID NOs：30及31所組成群之胺基酸序列之輕鏈可變區及具有選自由SEQ ID NOs：39至42所組成群之胺基酸序列之重鏈可變區。
  57. 如請求項56之用途，其中該抗體另外減少總血清IgE。
  58. 如請求項57之用途，其中該抗體另外減少游離血清IgE。
  59. 如請求項57之用途，其中該IgE具過敏原特異性。
  60. 如請求項56之用途，其中該抗體具有ADCC活性。
  61. 一種抗IgE/M1'抗體之用途，其係用於製造治療IgE介導之病症的藥物，其中該抗IgE/M1'抗體特異性結合IgE之M1'區段，誘發表現IgE之B細胞之細胞凋亡。
  62. 如請求項61之用途，其中該抗體特異性消耗表現IgE之B細胞。
  63. 如請求項61之用途，其中該抗體減少總血清IgE。
  64. 如請求項63之用途，其中該抗體減少游離血清IgE。
  65. 如請求項63之用途，其中該IgE具過敏原特異性。
  66. 如請求項61之用途，其中該抗體包含一種選自由26A11、26A11v1-6及26A11v13-16、7A6、7A6v1、47H4及47H4v1-6組成之群的抗體之重鏈及輕鏈HVRS；其中26A11包含具有SEQ ID NO：21所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：33所示胺基酸序列之重鏈可變區；26A11v1-6及26A11v13-16包含具有選自由SEQ ID NOs：22至26所組成群之胺基酸序列之輕鏈可變區及具有選自由SEQ ID NOs：34及35所組成群之胺基酸序列之重鏈可變區；7A6包含具有SEQ ID NO：27所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：36所示胺基酸序列之重鏈可變區；7A6v1包含具有SEQ ID NO：28所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：37所示胺基酸序列之重 鏈可變區；47H4包含具有SEQ ID NO：29所示胺基酸序列之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：38所示胺基酸序列之重鏈可變區；及47H4v1-6包含具有選自由SEQ ID NOs：30及31所組成群之胺基酸序列之輕鏈可變區及具有選自由SEQ ID NOs：39至42所組成群之胺基酸序列之重鏈可變區。
  67. 如請求項61之用途，其中該IgE介導之病症係選自由下列組成之群：過敏性鼻炎、過敏性哮喘、非過敏性哮喘、鼻竇炎、異位性皮膚炎、過敏性胃腸病、過敏反應、蕁麻疹、食物過敏、過敏性支氣管肺麴菌病、寄生蟲疾病、間質性膀胱炎、高IgE症候群、共濟失調毛細血管擴張、維-奧二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、無胸腺淋巴增生、IgE骨髓瘤、移植物抗宿主反應及過敏性紫癜。
  68. 一種組合之用途，其係用於製造治療IgE介導之病症的藥物，其中該組合包含治療有效量之特異性結合於IgE之M1'區段且誘發表現IgE之B細胞之細胞凋亡的抗IgE/M1'抗體以及治療有效量之至少一種選自由下列組成之群之藥物：抗IgE抗體、抗組織胺劑、支氣管擴張劑、糖皮質激素、NSAID、解充血劑、止咳劑、止痛劑、TNF拮抗劑、整合素拮抗劑、免疫抑制劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、雙重IL-4/IL-13拮抗劑、DMARD、 與B細胞表面標記結合之抗體及BAFF拮抗劑，在一特定態樣中，該抗體特異性消耗產生IgE之B細胞。
  69. 一種抗IgE/M1'抗體之用途，其係用於製造治療IgE介導之病症的藥物，其中該抗IgE/M1'抗體特異性結合於IgE之M1'區段且誘發表現IgE之B細胞之細胞凋亡，在施以一種已知之過敏性病症治療方法之前、同時或之後。
  70. 如請求項69之用途，其中該已知之過敏性病症之治療包含投與抗IgE抗體、抗組織胺劑、支氣管擴張劑、糖皮質激素、非類固醇消炎藥、免疫抑制劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、雙重IL-4/IL-13拮抗劑、解充血劑、止咳劑或止痛劑。
  71. 如請求項69之用途，其中該已知之過敏性病症之治療方法包含過敏原脫敏之治療方案。
  72. 一種抗IgE/M1'抗體之用途，其係用於製造防止過敏原誘發IgE產生的藥物，其中該抗IgE/M1'抗體特異性結合於IgE之M1'區段中由SEQ ID NO：1之第317至351殘基所定義之抗原決定基且誘發表現IgE之B細胞之細胞凋亡。
  73. 一種抗IgE/M1'抗體之用途，其係用於製造降低過敏原誘發IgE產生的藥物，其中該抗IgE/M1'抗體特異性結合於IgE之M1'區段中由SEQ ID NO：1之第317至351殘基所定義之抗原決定基且誘發表現IgE之B細胞之細胞凋亡。
  74. 一種鼠類融合瘤，其係選自由BCRC 960354(ATCC No.PTA-8260)、BCRC 960355(ATCC No.PTA-8261)、BCRC 960356(ATCC No.PTA-8262)、BCRC 960357(ATCC No. PTA-8263)、BCRC 960358(ATCC No.PTA-8264)、BCRC 960359(ATCC No.PTA-8265)、BCRC 960360(ATCC No.PTA-8266)、BCRC 960361(ATCC No.PTA-8267)、BCRC 960362(ATCC No.PTA-8268)、BCRC 960363(ATCC No.PTA-8269)、BCRC 960364(ATCC No.PTA-8270組成之群。
  75. 一種鼠類融合瘤，其係編號為BCRC 960364(ATCC No.PTA-8270)。
  76. 一種抗體，其係由如請求項74之融合瘤分泌。
  77. 一種抗體，其係由如請求項75之融合瘤分泌。
TW097110305A 2007-03-22 2008-03-21 細胞凋亡抗-ｉｇｅ抗體 TWI464178B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89633907P 2007-03-22 2007-03-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200848432A TW200848432A (en) 2008-12-16
TWI464178B true TWI464178B (zh) 2014-12-11

Family

ID=39709011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW097110305A TWI464178B (zh) 2007-03-22 2008-03-21 細胞凋亡抗-ｉｇｅ抗體

Country Status (32)

Country Link
US (6) US8071097B2 (zh)
EP (2) EP2132230B1 (zh)
JP (3) JP5723594B2 (zh)
KR (1) KR101555068B1 (zh)
CN (2) CN103554263B (zh)
AR (1) AR066198A1 (zh)
AU (1) AU2008228778B2 (zh)
BR (1) BRPI0808291A2 (zh)
CA (1) CA2681341A1 (zh)
CL (1) CL2008000839A1 (zh)
CO (1) CO6241138A2 (zh)
CR (1) CR11035A (zh)
CY (1) CY1115257T1 (zh)
DK (1) DK2132230T3 (zh)
EC (1) ECSP099645A (zh)
ES (1) ES2478242T3 (zh)
HK (1) HK1194743A1 (zh)
HR (1) HRP20140661T1 (zh)
IL (1) IL200752A0 (zh)
MA (1) MA31312B1 (zh)
MX (1) MX2009010092A (zh)
NZ (1) NZ580553A (zh)
PE (2) PE20140771A1 (zh)
PL (1) PL2132230T3 (zh)
PT (1) PT2132230E (zh)
RS (1) RS53402B (zh)
RU (1) RU2500686C2 (zh)
SI (1) SI2132230T1 (zh)
TW (1) TWI464178B (zh)
UA (1) UA102994C2 (zh)
WO (1) WO2008116149A2 (zh)
ZA (1) ZA201205868B (zh)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003057881A1 (fr) * 2001-12-28 2003-07-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede de stabilisation d'une proteine
JP4571620B2 (ja) * 2003-04-01 2010-10-27 インセルム（アンスティチュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） 肝炎ｃウイルスｅ１ｅ２複合体に対する抗体、ｈｃｖ粒子の組成物及び医薬組成物
CA2624081C (en) 2005-09-29 2014-09-16 Medimmune, Inc. Method of identifying membrane ig specific antibodies and use thereof for targeting immunoglobulin-producing precursor cells
UA102994C2 (ru) 2007-03-22 2013-09-10 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ СПЕЦИФИЧНО СВЯЗЫВАЕТСЯ С IgE/M1' И ИНДУЦИРУЕТ АПОПТОЗ В ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ IgE В-КЛЕТКАХ
JP6161233B2 (ja) 2008-03-31 2017-07-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 喘息の治療及び診断のための組成物及び方法
AU2014203008B2 (en) * 2009-02-25 2016-03-31 Academia Sinica Anti-CepsilonmX antibodies capable of binding to human mIgE on B lymphocytes
CN102482351B (zh) * 2009-02-25 2015-03-18 中央研究院 能与人B淋巴细胞上的mIgE结合的抗CεmX抗体
ES2495367T3 (es) * 2009-04-29 2014-09-17 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Anticuerpos monoclonales de ERG
EP2427497B1 (fr) 2009-05-07 2016-12-07 Stallergenes Utilisation d'immunoglobulines igg1 et/ou de ligands du récepteur cd32 pour le traitement de maladies et manifestations inflammatoires par voie mucosale
US8263581B2 (en) 2009-07-03 2012-09-11 Jdp Therapeutics, Inc. Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof
US8513259B2 (en) 2009-07-03 2013-08-20 Jdp Therapeutics, Inc. Non-sedating antihistamine injection formulations and methods of use thereof
US8741591B2 (en) 2009-10-09 2014-06-03 The Research Foundation For The State University Of New York pH-insensitive glucose indicator protein
EP2384766A1 (en) * 2010-05-03 2011-11-09 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Novel antibody to a carbonic anhydrase
US10017762B2 (en) * 2010-11-24 2018-07-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Compositions and methods for treating or preventing lupus
CN105175542B (zh) 2010-12-16 2018-12-18 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 与th2抑制相关的诊断和治疗
US9795618B2 (en) * 2014-02-28 2017-10-24 University Of Cincinnati Methods and compositions for suppressing IgE-mediated anaphylaxis
US10086005B2 (en) 2011-04-12 2018-10-02 University Of Cincinnati Methods for suppressing allergic reactions
CA2838952C (en) 2011-06-13 2020-11-24 Stefan Bassarab Anti-psgl-1 antibodies and uses thereof
EP3378535B1 (en) 2011-10-28 2023-01-04 Prothena Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
AR089434A1 (es) 2011-12-23 2014-08-20 Genentech Inc Procedimiento para preparar formulaciones con alta concentracion de proteinas
CA2863953A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Neotope Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
JP2015506950A (ja) * 2012-01-31 2015-03-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｇ−ｅｍ１’抗体およびそれを用いる方法
WO2013158274A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Academia Sinica ANTI-MIGE ANTIBODIES THAT BIND TO THE JUNCTION BETWEEN CH4 AND CεMX DOMAINS
WO2013173687A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Genentech, Inc. High-concentration monoclonal antibody formulations
US10543278B2 (en) 2012-09-12 2020-01-28 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Immunoparticles and methods of generating and using same
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
CN105143260A (zh) * 2013-03-13 2015-12-09 中央研究院 特异于人类膜结合型IgE的CEMX上的新颖抗原决定部位的抗体及其用于治疗IgE介导的疾病的用途
CN105121471A (zh) * 2013-04-16 2015-12-02 豪夫迈·罗氏有限公司 帕妥珠单抗变体及其评估
TWI755763B (zh) 2013-06-04 2022-02-21 美商再生元醫藥公司 藉由投與il-4r抑制劑以治療過敏及增強過敏原-特異之免疫療法的方法
CN105324746B (zh) * 2013-06-19 2019-08-13 索尼公司 显示控制设备、显示控制方法和程序
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
TWI634900B (zh) 2013-07-11 2018-09-11 再生元醫藥公司 藉由投與ｉｌ－４ｒ抑制劑治療嗜酸性食道炎的方法
CN105849280B (zh) 2013-10-23 2020-11-06 豪夫迈·罗氏有限公司 诊断和治疗嗜酸性粒细胞紊乱的方法
US20170101460A1 (en) * 2014-01-10 2017-04-13 Allermabs Co. Ltd. Transgenic animals capable of producing humanized ige at much higher levels than mouse ige
RU2704999C2 (ru) 2014-02-28 2019-11-01 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Способ лечения кожной инфекции путем введения антагониста il-4r
US10562973B2 (en) 2014-04-08 2020-02-18 Prothena Bioscience Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
PT3157951T (pt) * 2014-06-17 2020-08-24 Academia Sinica Anticorpos anti-ige humanizados que reticulam cd23 em linfócitos b, mas não sensibilizam mastócitos
CN107074938A (zh) * 2014-10-16 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 抗‑α‑突触核蛋白抗体和使用方法
RS61781B1 (sr) 2014-12-05 2021-06-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antitela koja ciljaju antigen za sazrevanje b-ćelija i postupci upotrebe
SG11201704549UA (en) 2014-12-05 2017-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
TWI691512B (zh) * 2015-02-20 2020-04-21 日商橘生藥品工業股份有限公司 Ｆｃ融合高親和性ＩｇＥ受體α鏈
EP3283520B1 (en) * 2015-04-13 2020-05-06 Pfizer Inc Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
US20180186896A1 (en) 2015-07-07 2018-07-05 Affiris Ag Vaccines for the treatment and prevention of ige mediated diseases
WO2017011728A1 (en) * 2015-07-15 2017-01-19 Washington University ANTIBODIES TO TUMOR ASSOCIATED COMPLEX N-GLYCANS WITH TERMINAL GlcNAcBeta RESIDUES AND METHODS OF USE THEREOF
JP6068582B2 (ja) * 2015-08-07 2017-01-25 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂリンパ球上のヒトｍＩｇＥに結合可能な抗ＣεｍＸ抗体
WO2017132457A1 (en) * 2016-01-28 2017-08-03 Janssen Biotech, Inc. BISPECIFIC ANTI-TNF-α/IL-17A ANTIBODIES AND ANTI-TNF-α ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
EP3484517A4 (en) 2016-07-18 2020-04-15 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. MODULAR PLATFORM FOR TARGETED THERAPEUTICS
US11384156B2 (en) 2016-07-25 2022-07-12 The Nemours Foundation Adoptive T-cell therapy using EMPD-specific chimeric antigen receptors for treating IgE-mediated allergic diseases
MX2019002344A (es) 2016-09-01 2019-09-06 Regeneron Pharma Metodos de prevenir o tratar la alergia administrando un antagonista de il-4r.
WO2018057776A1 (en) 2016-09-22 2018-03-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating severe atopic dermatitis by administering an il-4r inhibitor
WO2018089335A1 (en) * 2016-11-09 2018-05-17 North Carolina State University Treatment of allergic diseases with chimeric protein
EP3558366A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods and formulations for reducing reconstitution time of lyophilized polypeptides
EP4269594A3 (en) 2017-02-17 2023-12-20 Fred Hutchinson Cancer Center Combination therapies for treatment of bcma-related cancers and autoimmune disorders
IL266873B2 (en) * 2017-04-21 2024-04-01 Ami Pharm Co Ltd An injectable preparation for local fat reduction without pain, edema and side effects, and a method for its preparation
US11053309B2 (en) 2017-08-04 2021-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating active eosinophilic esophagitis
JP7286665B2 (ja) 2017-10-31 2023-06-05 ワンネス バイオテック カンパニー リミティド ＩｇＥ介在アレルギー性疾患の治療
EP3703688A2 (en) 2017-11-01 2020-09-09 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
WO2019090003A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen (bcma)
CA3226165A1 (en) 2018-02-09 2019-08-15 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for mast cell-mediated inflammatory diseases
CA3099066A1 (en) 2018-05-13 2019-11-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating atopic dermatitis by administering an il-4r inhibitor
US20220034880A1 (en) * 2018-10-01 2022-02-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High specificity and sensitivity immunosorbent diagnostic assays with simultaneous resolution of multiple antibody isotypes
US11964016B2 (en) * 2019-03-21 2024-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of IL-4/IL-13 pathway inhibitors and plasma cell ablation for treating allergy
IL289613B2 (en) 2019-08-05 2023-09-01 Regeneron Pharma IL-4R antagonist in combination with a scit regimen to increase immunotherapeutic efficacy and tolerability to a grass-specific allergen
CN111411066B (zh) * 2020-03-30 2022-08-23 江南大学 一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法
CN117467016B (zh) * 2023-12-27 2024-03-12 北京索莱宝科技有限公司 人IgA的抗体、抗体组合及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5274075A (en) * 1987-12-31 1993-12-28 Tanox Biosystems, Inc. Newly identified human epsilon immunoglobulin peptides and related products

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4714759A (en) * 1985-12-02 1987-12-22 Whitaker Jr Robert B Immunotoxin therapy of allergy
US5514776A (en) 1987-12-31 1996-05-07 Tanox Biosystems, Inc. Peptides representing antigenic epitopes of dog IgE present on B cell but not basophil surface
US5449760A (en) 1987-12-31 1995-09-12 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies that bind to soluble IGE but do not bind IGE on IGE expressing B lymphocytes or basophils
US5254671A (en) 1990-04-27 1993-10-19 Tanox Biosystems, Inc. Extracellular segments of human e immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor
US5362643A (en) 1989-06-21 1994-11-08 Tanox Biosystems Antibodies to epitopes present on membrane-bound but not secreted IGA
US5079344A (en) 1989-06-21 1992-01-07 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted IgA
US5428133A (en) 1987-12-31 1995-06-27 Tanox Biosystems, Inc. Chimeric anti-human IgE-monoclonal antibody which binds to secreted IgE and membrane-bound IgE expressed by IgE-expressing B cells but notto IgE bound to FC receptors on basophils
US5614611A (en) 1987-12-31 1997-03-25 Tanox Biosystems, Inc. Humanized monoclonal antibodies binding to IgE-bearing B cells but not basophils
US5089603A (en) 1989-06-21 1992-02-18 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga
US5091313A (en) 1988-08-05 1992-02-25 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface
US5231026A (en) 1987-12-31 1993-07-27 Tanox Biosystems, Inc. DNA encoding murine-human chimeric antibodies specific for antigenic epitopes of IgE present on the extracellular segment of the membrane domain of membrane-bound IgE
US5484907A (en) 1989-06-21 1996-01-16 Tanox Biosystems, Inc. Nucleotides coding for the extracellular membrane-bound segment of IgA
US5342924A (en) 1987-12-31 1994-08-30 Tanox Biosystems, Inc. Extracellular segments of human ε immunoglobulin anchoring peptides and antibodies specific therefor
US5690934A (en) 1987-12-31 1997-11-25 Tanox Biosystems, Inc. Peptides relating to the extracellular membrane-bound segment of human alpha chain
EP0617127A1 (en) 1987-12-31 1994-09-28 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes on B cell-bound IgE Immunoglobulins
US5260416A (en) 1987-12-31 1993-11-09 Tanox Biosystems, Inc. Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted IgE
US5252467A (en) 1987-12-31 1993-10-12 Tanox Biosystems, Inc. Method of making antibodies to antigenic epitopes of IGE present on B cells but not basophil cell surface or secreted, soluble IGE
US5422258A (en) 1987-12-31 1995-06-06 Tanox Biosystems, Inc. Methods for producing high affinity anti-human IgE-monoclonal antibodies which binds to IgE on IgEabearing B cells but not basophils
US5292867A (en) 1988-11-16 1994-03-08 Tanox Biosystems, Inc. Chimeric monoclonal antibodies which bind to the extracellular segment of the membrane-bound domain of a human membrane-bound immunoglobulin
US5310875A (en) 1989-06-21 1994-05-10 Tanox Biosystems, Inc. Peptides corresponding to membrane-bound IgA
ES2107454T3 (es) 1990-01-23 1997-12-01 Tanox Biosystems Inc Segmentos extracelulares de peptidos de anclaje de la inmunoglobulina ige humana, y anticuerpos especificos para los mismos.
US5625126A (en) * 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992017207A1 (en) 1991-03-26 1992-10-15 Tanox Biosystems, Inc. MONOCLONAL ANTIBODIES WHICH BIND TO SECRETED AND MEMBRANE-BOUND IgE, BUT NOT TO IgE ON BASOPHILS
EP0787150A1 (en) 1994-10-25 1997-08-06 United Biomedical, Inc. SYNTHETIC IgE MEMBRANE ANCHOR PEPTIDE IMMUNOGENS FOR THE TREATMENT OF ALLERGY
US6172213B1 (en) 1997-07-02 2001-01-09 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides
US5994511A (en) 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
WO2004070010A2 (en) 2003-02-01 2004-08-19 Tanox, Inc. A method for generating high affinity antibodies
CN1926149A (zh) * 2004-02-02 2007-03-07 泰勒公司 新的IgE表位的鉴别
ES2337473T3 (es) 2004-02-19 2010-04-26 Genentech, Inc. Anticuerpos reparadores con cdr.
CA2624081C (en) * 2005-09-29 2014-09-16 Medimmune, Inc. Method of identifying membrane ig specific antibodies and use thereof for targeting immunoglobulin-producing precursor cells
UA102994C2 (ru) 2007-03-22 2013-09-10 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ СПЕЦИФИЧНО СВЯЗЫВАЕТСЯ С IgE/M1' И ИНДУЦИРУЕТ АПОПТОЗ В ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ IgE В-КЛЕТКАХ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5274075A (en) * 1987-12-31 1993-12-28 Tanox Biosystems, Inc. Newly identified human epsilon immunoglobulin peptides and related products

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chen, et al., Monoclonal Antibodies against the CεmX Domain of Human Membrane-Bound IgE and Their Potential Use for Targeting IgE-Expressing B Cells, Int. Arch. Allergy Immunol., 128, 315-324, 2002. Chang TW. Developing antibodies for targeting immunoglobulin and membrane-bound immunoglobulin E. Allergy Asthma Proc. 2006 Mar-Apr;27(2 Suppl 1):S7-14. *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201205868B (en) 2014-04-30
EP2132230A2 (en) 2009-12-16
PE20090726A1 (es) 2009-06-23
PT2132230E (pt) 2014-07-17
WO2008116149A2 (en) 2008-09-25
BRPI0808291A2 (pt) 2018-12-11
US8618274B2 (en) 2013-12-31
JP2017048190A (ja) 2017-03-09
NZ580553A (en) 2012-05-25
ECSP099645A (es) 2009-10-30
IL200752A0 (en) 2010-05-17
PL2132230T3 (pl) 2014-09-30
JP2015017103A (ja) 2015-01-29
AU2008228778A1 (en) 2008-09-25
CO6241138A2 (es) 2011-01-20
JP5723594B2 (ja) 2015-05-27
CY1115257T1 (el) 2017-01-04
US20120144512A1 (en) 2012-06-07
US8071097B2 (en) 2011-12-06
EP2644621B1 (en) 2017-12-13
CN101679528B (zh) 2013-11-06
CN103554263B (zh) 2016-09-28
MA31312B1 (fr) 2010-04-01
RU2009138932A (ru) 2011-04-27
US20120178127A1 (en) 2012-07-12
US8586040B2 (en) 2013-11-19
DK2132230T3 (da) 2014-06-30
AR066198A1 (es) 2009-08-05
US8632775B2 (en) 2014-01-21
ES2478242T3 (es) 2014-07-21
HRP20140661T1 (hr) 2014-10-10
KR101555068B1 (ko) 2015-10-06
RS53402B (en) 2014-10-31
AU2008228778B2 (en) 2014-05-22
EP2644621A1 (en) 2013-10-02
CN101679528A (zh) 2010-03-24
CN103554263A (zh) 2014-02-05
HK1194743A1 (zh) 2014-10-24
UA102994C2 (ru) 2013-09-10
JP2010521989A (ja) 2010-07-01
PE20140771A1 (es) 2014-07-07
KR20100015754A (ko) 2010-02-12
WO2008116149A3 (en) 2008-11-06
US20120149881A1 (en) 2012-06-14
CR11035A (es) 2009-12-03
MX2009010092A (es) 2010-02-09
US20120177635A1 (en) 2012-07-12
US20140115729A1 (en) 2014-04-24
SI2132230T1 (sl) 2014-07-31
CA2681341A1 (en) 2008-09-25
TW200848432A (en) 2008-12-16
RU2500686C2 (ru) 2013-12-10
US20090010924A1 (en) 2009-01-08
EP2132230B1 (en) 2014-04-16
CL2008000839A1 (es) 2008-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI464178B (zh) 細胞凋亡抗-ｉｇｅ抗體
JP2010521989A5 (zh)
US20130243750A1 (en) Anti-ige antibodies and methods using same
JP5128935B2 (ja) ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
KR20190117489A (ko) 항-bcma 중쇄-단독 항체
KR20050086628A (ko) Ｃｄ25에 대한 인간 모노클로날 항체
US20140286950A1 (en) Use of anti-cd83 agonist antibodies for treating autoimmune diseases
JP2008524241A (ja) 従来の治療の効果がなかった患者の自己免疫性疾患の血管新生阻害治療
AU2014215990A1 (en) Apoptotic anti-IgE antibodies binding the membrane-bound IgE

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees