CN113308430B - 一种香蕉炭疽病菌分生孢子的分散培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种香蕉炭疽病菌分生孢子的分散培养方法，从产孢菌落上粘取孢子并直接转移分散到测试平板上，孢子转移分散的操作步骤如下：1)孢子分散工具的灭菌；2)孢子的制备；3)测试平板的制备；4)孢子的粘取；5)堆集孢子的散化；6)孢子的点印；7)培养观察与测定。本发明的优点：1)不需要将关键的工作材料(香蕉炭疽病菌的分生孢子)配备成孢子悬浮液，减少污染风险；2)可以在长条状的培养平板上散布香蕉炭疽病菌分生孢子，并观测其萌发与生长活动，提高观测工作的效率与效果，有利于开展孢子萌发生物学研究中的多因素作用设计与批量测试比较。

Description

一种香蕉炭疽病菌分生孢子的分散培养方法
技术领域
本发明涉及植物病理学技术，具体是一种香蕉炭疽病菌分生孢子的分散培养方法。
背景技术
香蕉炭疽病是我国香蕉产业的一种重要病害，可给香蕉生产造成重大损失。该病害由香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)侵染引起。分生孢子是香蕉炭疽病菌的无性繁殖体，在香蕉炭疽病的病害循环和病害流行中发挥重要作用。充分认识分生孢子的萌发生物学对有效防控香蕉炭疽病的发生流行至关重要。在香蕉炭疽病菌繁殖体的萌发生物学及相关的研究工作中，经常需要将分生孢子移植到培养平板上进行观测培养，这种观测培养不仅要求培养平板上的孢子处于恰当的分散状态，也要求各个移植处理平板上的孢子数量及分布保持一致。只有这样才能高质量完成有关的研究任务。
当前将香蕉炭疽病菌分生孢子从菌落上转移及分散到培养平板的方法，几乎都是水液载体移植分散方法，该方法的主要程序是，先用适合的产孢培养基进行香蕉炭疽病菌的产孢培养，再用水将产孢培养菌落的孢子洗涤出来，配备成孢子悬浮液(简称孢子液)，然后用移液器将孢子液定量转移到培养基观测平板面上，并用工具将孢子液涂布分散到平板上，再进行有关的培养与观察等测试工作。该方法看似简单，但实践操作上仍存在相当的难度与繁琐，主要表现在，关键的工作材料(香蕉炭疽病菌的分生孢子)的获得技术操作中，往往需要采取过滤操作以脱减孢子液中的菌丝，也需要离心沉淀操作脱除孢子液中的培养基以及培养代谢产物等，这些操作过程均存在较大的污染风险，另外，需要将孢子液的孢子浓度调整到合适的范围，因此需要反复的调配与取样到计数板或载玻片，还要转到生物显微镜下观察计数，比较繁琐。
发明内容
本发明的目的是，提供一种香蕉炭疽病菌分生孢子的分散培养方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种香蕉炭疽病菌分生孢子的分散培养方法，从产孢菌落上粘取孢子并直接转移分散到测试平板上，孢子转移分散的操作步骤如下：
1.孢子分散工具的灭菌
将普通棉签包装于广口玻璃瓶内，常规高温高压灭菌后，备作香蕉炭疽病菌孢子分散移植的工具。
2.孢子的制备
用马铃薯蔗糖琼脂培养基，进行香蕉炭疽病菌的产孢培养，直至产孢平板上形成大量的分生孢子。
3.测试平板的制备
用常规琼脂培养基制备孢子培养观察的测试平板，用灭菌刀片将培养皿倒制的琼脂平板切成长条状，并将条状琼脂挑转到灭菌载玻片上，作为分生孢子培养测试平板。
4.孢子的粘取
取步骤1准备的灭菌棉签，将端部棉球碰触步骤2准备的产孢菌落，粘取菌落上的孢子。
5.堆集孢子的散化
将步骤4粘取孢子后的棉球转移到空白琼脂平板上抹涂和点印，将棉球上堆集的孢子进行稀释分散。
6.孢子的点印
将经过步骤5孢子稀释分散的棉签棉球，在步骤3准备的孢子测试平板面的不同位置作有序连续点印，得到孢子数量相近、且孢子分散性良好的孢子印迹。
7.培养观察与测定
将步骤6得到载有孢子印迹的培养平板放入具有保湿作用的普通铝盒内，置于工作设定的培养条件下培养，按工作要求观察与测定这些分生孢子的萌发与生长特征。
本发明的优点
1)不需要将关键的工作材料(香蕉炭疽病菌的分生孢子)配备成孢子悬浮液，减少污染风险。
2)可以在长条状的培养平板上散布香蕉炭疽病菌分生孢子，并观测其萌发与生长活动，提高观测工作的效率与效果，有利于开展孢子萌发生物学研究中的多因素作用设计与批量测试比较。
附图说明
图1是棉签棉球在香蕉炭疽病菌产孢菌落上碰触粘附分生孢子一次，然后在琼脂平板面上进行连续多次点印，其中的4个印迹获得孢子的数量与分散状态。1-1图是在琼脂面上的首次点印，1-2图是在琼脂面上的第10次点印，1—3图是在琼脂面上的第20次点印，1—4图是在琼脂面上的第50次点印。图中的黑色椭圆点是显微镜下观察到的香蕉炭疽病菌的分生孢子。图中下部的黑色短棒长50μm。
图2是棉签棉球在香蕉炭疽病菌产孢菌落上碰触粘附分生孢子仅仅一次，然后转到9cm平皿倒制的马铃薯蔗糖琼脂培养基平板面上，连续有序点印孢子182次，再转到28℃条件下培养35小时，各个印迹位置上释放散落的孢子萌发生长所形成的菌落。点印顺序：首行在上、尾行在下；每行从左到右。图中相邻的多个印迹菌落的生长量一致。图中标记a的菌落是第1次印迹生长形成的菌落，标记b的菌落是第182次印迹生长形成的菌落。
图3是采用本发明的方法将香蕉炭疽病菌菌株Cm-2的分生孢子从产孢菌落转移到培养测试平板面上，分生孢子的分散状态，以及在28℃温度条件下培养8小时后，这些孢子的萌发生长状态。图中下部的黑色短棒长50μm。
具体实施方式
在香蕉炭疽病研究的日常工作中，用普通棉签的端部棉球碰触香蕉炭疽病菌的产孢菌落后，转到平板面上点印处理，发明人发现棉签棉球粘附的分生孢子可以释放散落到琼脂平板面上。不过，棉球表面仅仅碰触一次产孢菌落，却可以在琼脂平板上连续点印释放孢子180次以上，观察印迹中的孢子，发现大部分印迹中孢子的分散性良好，如图1所示，而且相邻印迹中孢子的数量相近。将有序连续点印孢子182次的培养平板置于28℃温度下培养35小时，所有印迹的孢子均萌发生长形成可见菌落，而且相邻多个印迹的菌落生长量接近，说明各印迹的孢子数量呈现逐印平缓递减的过程，如图2所示。结果表明在产孢菌落上只需要碰触一次，就能在培养平板上印出很多的孢子数量相近且分散性良好的孢子印迹，这样的效果正好是香蕉炭疽病菌繁殖体生物学的许多研究中，分生孢子移植所需要的技术效果。按照下面的具体步骤操作实施，本发明能取得这样的技术效果。
1.孢子分散工具的灭菌
用普通棉签转移香蕉炭疽病菌分生孢子能取得孢子分散的效果，因此，用棉签作为香蕉炭疽病菌分生孢子的转移分散工具，将棉签装入广口玻璃瓶或其它小容器内，常规高温高压灭菌后备用。
2.孢子的制备
可以用马铃薯蔗糖琼脂培养基等香蕉炭疽病菌的产孢培养基，进行香蕉炭疽病菌的常规产孢培养，直到产孢培养基上形成大量的分生孢子。通常用马铃薯蔗糖琼脂培养基在28℃温度下培养8～15天，菌落上能形成大量的分生孢子，而且形成的孢子往往堆集在红色液点上。
3.测试平板的制备
采用含琼脂的常规培养基，如马铃薯琼脂培养基，制备孢子测试平板。培养基经加热熔化后，倒入平底培养皿制成普通平皿平板，平板冷凝后，用灭菌手术刀片将培养基平板切割成细长的条块，并用刀片将该长条状的培养基平板挑起转移到灭菌载玻片上，作为香蕉炭疽病菌分生孢子萌发生物学培养测试平板。该测试平板的长度可以与载玻片长度一致，宽度可略宽于棉签的棉球。
4.孢子的粘取
取出步骤1准备好的灭菌棉签，将棉签的端部棉球轻轻碰触一下步骤2准备的产孢培养菌落上的红色液点，棉球的接触面可以粘取堆集的分生孢子。
5.堆集孢子的散化
将步骤4粘取孢子后的棉球转移到空白琼脂平板上，把粘取红色液点的球面对正琼脂平板，在平板面上进行轻轻抹涂，粘取在该棉球面的堆集孢子可以快速释放稀散，通常在平板面上轻轻抹涂3～4次，该棉签球面上留下的孢子分散状态符合工作要求，实际操作可以在抹涂操作后，将棉球面上的孢子以点印方式印到琼脂面上，再把这些孢子印迹转到显微镜下检查，确认孢子的分散程度或分散间距符合工作要求。需要注意的是，香蕉炭疽病菌分生孢子长时间处于干燥环境容易失活，为了避免棉签球面上的孢子失活，在镜检期间，可以将已粘取孢子的棉签置于保湿容器内保护。
6.孢子的点印
步骤5确认棉签球面留下的孢子状态符合工作要求之后，将该棉签转移到步骤3制备的孢子培养测试平板面上，将有孢子的棉球面对准测试平板面不同位置，作有序连续逐次点印，棉球面上的孢子逐次释放散落在测试平板面的各个点印位置上，根据工作需要确定点印的次数，点印完毕后即得到孢子数量相近且分散性良好的孢子印迹。
7.培养观察与测定
将步骤6得到载有分生孢子印迹的观测平板，放入内部垫有湿纸/或湿纱布的普通铝盒或其它保湿小容器内，再将孢子连同保湿小容器一起置于工作设定的培养条件下培养，按工作要求观察与测定这些分生孢子的萌发与生长特征。
实施例1
采用本发明一种香蕉炭疽病菌分生孢子的分散培养方法，将香蕉炭疽病菌菌株Cm-2的分生孢子从马铃薯蔗糖培养基上的产孢菌落，转移点印到孢子培养测试平板，结果测试平板面上分生孢子的分散性良好；将该测试平板置于28℃温度条件下培养8小时后，取出在显微镜下检查各个点印印迹，能清晰识别各个印迹中的孢子及其萌发的芽管，如图3所示，随机观察其中一个印迹中的200个孢子，正常萌发的孢子萌发率为96％。

Claims (1)

1.一种香蕉炭疽病菌（ Colletotrichum musae） 分生孢子的分散培养方法，其特征是，从产孢菌落上粘取孢子并直接转移分散到测试平板上，孢子转移分散的操作步骤如下：
1)孢子分散工具的灭菌：将普通棉签包装于广口玻璃瓶内，常规高温高压灭菌后，备作香蕉炭疽病菌孢子分散移植的工具；
2)孢子的制备：用马铃薯蔗糖琼脂培养基，进行香蕉炭疽病菌的产孢培养，直至产孢平板上形成大量的分生孢子；
3)测试平板的制备：用常规琼脂培养基制备孢子培养观察的测试平板，用灭菌刀片将培养皿倒制的琼脂平板切成长条状，并将条状琼脂挑转到灭菌载玻片上，作为分生孢子培养测试平板；
4)孢子的粘取：取步骤1)准备的灭菌棉签，将端部棉球碰触步骤2)准备的产孢菌落，粘取菌落上的孢子；
5)堆集孢子的散化：将步骤4)粘取孢子后的棉球转移到空白琼脂平板上抹涂和点印，将棉球上堆集的孢子进行稀释分散；
6)孢子的点印：将经过步骤5)孢子稀释分散的棉签棉球，在步骤3)准备的孢子测试平板面的不同位置作有序连续点印，得到孢子数量相近、且孢子分散性良好的孢子印迹；
7)培养观察与测定：将步骤6)得到载有孢子印迹的培养平板放入具有保湿作用的普通铝盒内，置于工作设定的培养条件下培养，按工作要求观察与测定这些分生孢子的萌发与生长特征。
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