CN113308512B - 一种香蕉枯萎病菌分生孢子的干式移植方法 - Google Patents

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Abstract

一种香蕉枯萎病菌分生孢子的干式移植方法，从产孢菌落上粘附孢子并直接移植及散布到观测平板上，孢子的干式移植操作步骤如下：1)分生孢子的培养准备；2)移孢棉签的无菌处理；3)观测琼脂平板的准备；4)密集孢子的分散；5)分生孢子的移印；6)分生孢子的培养处理。本发明的优点：1)不需要将关键的工作材料(香蕉枯萎病菌的分生孢子)配备成孢子悬浮液，减少污染风险。2)可以在条状的琼脂平板上散布香蕉枯萎病菌分生孢子，并观测其萌发与生长活动，提高观测工作的效率与效果，有利于开展孢子萌发生物学研究中的多因素作用设计与批量试比较。

Description

一种香蕉枯萎病菌分生孢子的干式移植方法
技术领域
本发明涉及植物病理学技术，具体是一种香蕉枯萎病菌分生孢子的干式移植方法。
背景技术
香蕉枯萎病是我国香蕉产业的一种重要病害，可给香蕉生产造成重大损失，严重的可以毁掉整个香蕉园。该病害由香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)侵染引起。分生孢子是香蕉枯萎病菌的无性繁殖体，在香蕉枯萎病的病害循环和病害流行中发挥重要作用。充分认识分生孢子的萌发生物学对有效防控香蕉枯萎病的发生流行至关重要。在香蕉枯萎病菌繁殖体的萌发生物学及相关的研究工作中，经常需要将分生孢子移植到培养平板上进行观测培养，这种观测培养不仅要求培养平板上的孢子处于恰当的分散状态，也要求各个移植处理平板上的孢子数量及分布保持一致。只有这样才能高质量完成有关的研究任务。
当前将香蕉枯萎病菌分生孢子从菌落上转移及分散到培养平板的方法，几乎都是水液载体移植方法，该方法的主要程序是，先用适合的产孢培养基进行香蕉枯萎病菌的产孢培养，再用水将产孢培养菌落的孢子洗涤出来，配备成孢子悬浮液(简称孢子液)，然后用移液器将孢子液定量转移到培养基观测平板面上，并用工具将孢子液涂布分散到平板上，再进行有关的培养与观察等测试工作。该方法看似简单，但实践操作上仍存在相当的难度与繁琐，主要表现在，关键的工作材料(香蕉枯萎病菌的分生孢子)的获得技术操作中，往往需要采取过滤操作以脱减孢子液中的菌丝，也需要离心沉淀操作脱除孢子液中的培养基以及培养代谢产物等，这些操作过程均存在较大的污染风险，另外，需要将孢子液的孢子浓度调整到合适的范围，因此需要反复的调配与取样到计数板或载玻片，还要转到生物显微镜下观察计数，比较繁琐。
发明内容
本发明的目的是，提供一种香蕉枯萎病菌分生孢子的干式移植方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种香蕉枯萎病菌分生孢子的干式移植方法，从产孢菌落上粘附孢子并直接移植及散布到观测平板上，孢子的干式移植操作步骤如下：
1.分生孢子的培养准备
用马铃薯蔗糖琼脂培养基，进行香蕉枯萎病菌的产孢培养，直至产孢菌落上形成密集的分生孢子。
2.移孢棉签的无菌处理
先用记号笔在普通棉签上点画标记，再将该棉签放入培养皿内，常规高压灭菌并烘干后备用。
3.观测琼脂平板的准备
用常规琼脂培养基制备孢子观测平板，用灭菌刀片将培养皿倒制的琼脂平板切成长条状，并将该琼脂条挑转到灭菌载玻片上，作为分生孢子观测平板。
4.密集孢子的分散
取步骤2准备的灭菌棉签，将棉签端部球面碰触步骤1准备的产孢菌落，接触菌落的球面粘附菌落上密集的孢子；然后转移到空白琼脂平板上抹涂和点印，稀散棉签球面上吸附的密集孢子。
5.分生孢子的移印
将步骤4稀散孢子后的棉签球面，在步骤3准备的孢子观测琼脂平板面的不同位置作有序连续点印，得到孢子数量一致、且孢子分散性良好的孢子印迹。
6.分生孢子的培养处理
将步骤5得到载有孢子印迹的观测琼脂平板放入具有保湿效果的培养皿内，置于工作设定的培养条件下培养，按工作要求观察与测定这些分生孢子的萌发与生长特征。
本发明的优点
1)不需要将关键的工作材料(香蕉枯萎病菌的分生孢子)配备成孢子悬浮液，减少污染风险。
2)可以在条状的琼脂平板上散布香蕉枯萎病菌分生孢子，并观测其萌发与生长活动，提高观测工作的效率与效果，有利于开展孢子萌发生物学研究中的多因素作用设计与批量试比较。
附图说明
图1是棉签端部球面在香蕉枯萎病菌产孢菌落上碰触粘附孢子一次，然后在琼脂平板面上多次点印，其中的4个印迹获得孢子的数量与分散状态。1-1图是在琼脂面上的首次点印，1-2图是在琼脂面上的第20次点印，1-3图是在琼脂面上的第30次点印，1-4图是在琼脂面上的第50次点印。图中的黑色椭圆点是显微镜下观察到的香蕉枯萎病菌的分生孢子。图中下部的黑色短棒长50μm
图2是棉签端部球面在香蕉枯萎病菌产孢菌落上碰触粘附分生孢子仅仅一次，然后转到9cm平皿倒制的马铃薯蔗糖琼脂培养基平板面上，连续有序点印孢子195次，再转到28℃温度下培养35小时，各个印迹位置上释放散落的孢子萌发生长所形成的菌落。点印顺序：首行在上、尾行在下；每行从左到右。图中相邻的多个印迹菌落的生长量一致。图中标记a的菌落是第1次印迹生长形成的菌落，标记b的菌落是第195次印迹生长形成的菌落。
图3是用本发明的方法将香蕉枯萎病菌菌株Foc4-2的分生孢子从产孢菌落移植及散布到观测平板面上，分生孢子的分散状态，以及在28℃温度条件下培养13小时后，这些孢子的萌发生长状态。图中下部的黑色短棒长50μm
具体实施方式
在香蕉枯萎病研究的日常工作中，发明人用普通棉签的端部球面碰触香蕉枯萎病菌的产孢菌落后，转到平板面上点印处理，棉签球面粘附的分生孢子可以释放散落到琼脂平板面上。很意外的是，棉签球面仅仅碰触一次产孢菌落，却可以在琼脂平板上连续点印释放孢子170次以上，观察印迹中的孢子，发现大部分印迹中孢子的分散性良好，如图1所示，而且相邻印迹中孢子的数量一致。将有序连续点印孢子195次的培养平板置于28℃温度下培养35小时，所有印迹的孢子均萌发生长形成可见菌落，而且相邻多个印迹的菌落生长量一致，说明各印迹的孢子数量呈现逐印平缓递减的过程，如图2所示。结果表明在产孢菌落上只需要碰触一次，就能在培养平板上印出很多的孢子数量一致且分散性良好的孢子印迹，这样的效果正好是香蕉枯萎病菌繁殖体生物学的许多研究中，分生孢子移植所需要的技术效果。按照下面的具体步骤操作实施，本发明能取得这样的技术效果。
1.分生孢子的培养准备
可以用马铃薯蔗糖琼脂等香蕉枯萎病菌的产孢培养基，进行香蕉枯萎病菌的常规产孢培养，直到产孢基质上形成大量的分生孢子，通常28℃温度下培养7～10天，平板菌落上能形成大量密集的分生孢子。
2.移孢棉签的无菌处理
用普通棉签作为香蕉枯萎病菌分生孢子的移植工具，通常棉签端部的棉球圆周的方向方位不易识别，可以用记号笔在棉球附近点画标记，以利于棉球方位的识别，将标记后的棉签装入培养皿或其它小容器内，常规高压灭菌并烘干后备用。
3.观测琼脂平板的准备
采用含琼脂的常规培养基，如马铃薯琼脂培养基，制备孢子观测平板。培养基经加热熔化后，倒入平底培养皿制成普通平皿平板，平板冷凝后，用灭菌手术刀片将培养基平板切割成细长的条块，并用刀片将该长条状的培养基平板挑起转移到灭菌载玻片上，作为香蕉枯萎病菌分生孢子萌发生物学的观察与测定用平板。该观测平板的长度可以与载玻片长度一致，宽度可略宽于棉签的棉球。
4.密集孢子的分散
取出步骤2准备好的有方位记号的灭菌棉签，将棉签的端部球面在步骤1准备的产孢菌落表面上碰触，棉签球面通常能粘附上大量密集的分生孢子，然后将该棉签转移到普通空白琼脂平板面上，依据棉球附近的方位标记，将棉签碰触菌落的球面对正琼脂平板，在平板面上进行轻轻抹涂操作，吸附在该棉球面的密集孢子可以快速释放稀散，通常在平板面上轻轻抹涂2～3次，该棉签球面上留下的孢子分散状态符合工作要求，实际操作可以在抹涂操作后，将棉球面以点印方式印到琼脂面上，再把这些孢子印迹转到显微镜下检查，确认孢子的分散程度或分散间距符合工作要求。需要注意的是，香蕉枯萎病菌分生孢子长时间处于干燥环境容易失活，为了避免棉签球面上的孢子失活，在镜检期间，可以将已粘取孢子的棉签置于保湿容器内保护。
5.分生孢子的移印
步骤4确认棉签球面留下的孢子状态符合工作要求之后，将该棉签转移到步骤3制备的孢子观测平板面上，依据棉签的方位标记，将有孢子的球面对准观测平板面不同位置，作有序连续逐次点印，球面上的孢子逐次释放散落在观察平板面的各个点印位置上，根据工作需要确定点印的次数，点印完毕后即得到孢子数量一致且分散性良好的孢子印迹。
6.分生孢子的培养处理
将步骤5得到载有分生孢子印迹的观测琼脂平板，放入皿底内部垫有湿纸/或湿纱布的培养皿或其它保湿小容器内，再将孢子连同保湿小容器一起置于工作设定的培养条件下培养，按工作要求观察与测定这些分生孢子的萌发与生长特征。
实施例1
采用本发明一种香蕉枯萎病菌分生孢子的干式移植方法，将菌株Foc4-2的分生孢子从马铃薯蔗糖培养基上的产孢菌落，移植点印到孢子观测琼脂平板，结果观测琼脂平板面上分生孢子的分散性良好；将该观测琼脂平板置于28℃温度条件下培养13小时后，取出在显微镜下观察各个点印印迹，能清晰识别各个印迹中的孢子及其萌发的芽管，如图3所示，随机观察其中一个印迹中的150个孢子，正常萌发的孢子萌发率为91％。

Claims (1)

1.一种香蕉枯萎病菌分生孢子的干式移植方法，其特征是，从产孢菌落上粘附孢子并直接移植及散布到观测平板上，孢子的干式移植操作步骤如下：
1)分生孢子的培养准备：用马铃薯蔗糖琼脂培养基，进行香蕉枯萎病菌的产孢培养，直至产孢菌落上形成密集的分生孢子；
2)移孢棉签的无菌处理：先用记号笔在普通棉签上点画标记，再将该棉签放入培养皿内，常规高压灭菌并烘干后备用；
3)观测琼脂平板的准备：用常规琼脂培养基制备孢子观测平板，用灭菌刀片将培养皿倒制的琼脂平板切成长条状，并将该琼脂条挑转到灭菌载玻片上，作为分生孢子观测平板；
4)密集孢子的分散：取步骤2)准备的灭菌棉签，将棉签端部球面碰触步骤1)准备的产孢菌落，接触菌落的球面粘附菌落上密集的孢子；然后转移到空白琼脂平板上抹涂和点印，稀散棉签球面上吸附的密集孢子；
5)分生孢子的移印：将步骤4)稀散孢子后的棉签球面，在步骤3)准备的孢子观测琼脂平板面的不同位置作有序连续点印，得到孢子数量一致、且孢子分散性良好的孢子印迹；
6)分生孢子的培养处理：将步骤5)得到载有孢子印迹的观测琼脂平板放入具有保湿效果的培养皿内，置于工作设定的培养条件下培养，按工作要求观察与测定这些分生孢子的萌发与生长特征。
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