CN103172734A

CN103172734A - 人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用

Info

Publication number: CN103172734A
Application number: CN2013101161627A
Authority: CN
Inventors: 朱进; 冯振卿; 汪楠
Original assignee: Inst Of Military Medicine Nanjing Military Area Pla
Current assignee: Inst Of Military Medicine Nanjing Military Area Pla
Priority date: 2013-04-07
Filing date: 2013-04-07
Publication date: 2013-06-26

Abstract

人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用。所述抗体的V_L链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：SEQIDNO.1所示的L-CDR1；SEQIDNO.2所示的L-CDR2；SEQIDNO.3所示的L-CDR3；并且所述抗体的V_H链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：SEQIDNO.8所示的H-CDR1；SEQIDNO.9所示的H-CDR2；SEQIDNO.10所示的H-CDR3。该抗体能够特异性结合炭疽保护性抗原（PA），阻断致死因子合LF进入细胞内，从而发挥保护性作用。

Description

人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用

技术领域

本发明属于基因工程抗体技术领域，尤其涉及利用噬菌体抗体库技术，筛选人源抗炭疽毒素保护性中和抗体Fab，用于制备炭疽病预防与治疗的药物。

背景技术

炭疽病（anthrax）是一种由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起的急性传染病，主要通过皮肤、呼吸道和消化道感染动物和人。炭疽芽孢杆菌在血液中可产生并释放两种炭疽毒素：致死毒素（lethal toxin， LeTx）和水肿毒素（edema factor， EF ）。炭疽致死毒素由：保护性抗原（protective antigen， PA ）和致死因子（lethal factor， LF）组成。保护性抗原（PA）与人体细胞膜蛋白结合，并Furin蛋白酶裂解成两个片段PA63和PA20。PA63分子连接形成七聚体，与EF或LF结合并进入细胞导致细胞死亡。在体外实验研究中，单独使用高纯度的致死毒素或水肿毒素可以使动物死亡或发生水肿。通过阻断保护性抗原与LF的结合或者PA与细胞膜受体的结合，可有效防止炭疽毒素的致病作用。因此，保护性抗原（PA）便成为炭疽病的理想治疗靶点。

本发明以保护性抗原PA63为靶分子，通过人源噬菌体抗体库的筛选，制备人源抗炭疽保护性抗原的中和抗体Fab（命名为PAFab），并对筛选获得的PAFab克隆进行表达、纯化以及功能鉴定。免疫学检测结果显示，该抗体能够与炭疽保护性抗原特异性结合，体外中和试验结果证实，该抗体能够有效阻断炭疽毒素的致病作用。

发明内容

解决的技术问题：本发明目的是提供一种人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用。

技术方案：人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab，所述抗体的V_L链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

SEQ ID NO.1所示的L-CDR1；

SEQ ID NO.2所示的L-CDR2；

SEQ ID NO.3所示的L-CDR3；

并且所述抗体的V_H链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

SEQ ID NO.8所示的H-CDR1；

SEQ ID NO.9所示的H-CDR2；

SEQ ID NO.10所示的H-CDR3。

所述抗体的V_L链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，V_H链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述表达抗体V_L链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，表达V_H链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在制备炭疽病治疗抗体相关药物中的应用。

所述核苷酸表达的人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在制备炭疽病治疗抗体相关药物中的应用。

人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在治疗炭疽病中的应用。

本发明的目的是通过下列措施实现的：利用抗原固相筛选的方法筛选人源噬菌体抗体库（Fab抗体库）。经五轮筛选后，用酶联免疫吸附反应(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)进行阳性克隆鉴定，筛选出人源抗炭疽保护性抗原（PA）的特异性抗体PAFab。经原核表达PAFab抗体，并用Protein L亲和层析柱纯化，纯化产物经ELISA进行分析和体外中和活性鉴定。

有益效果：该抗体能够特异性结合炭疽保护性抗原（PA），阻断致死因子合LF进入细胞内，从而发挥保护性作用。

附图说明

图1炭疽保护性抗原PA63融合基因在大肠杆菌系统中的表达，1、3：:细菌超声上清，2、4：细菌的超声沉淀，M：蛋白marker；

图2纯化的保护性抗原PA63 SDS-PAGE分析，1、3:非特异性洗脱，2：纯化的目的蛋白，M：蛋白marker；

图3噬菌体抗体库筛选的ELISA检测；

图4 诱导抗炭疽保护性抗原Fab表达的Western blot分析，M：Marker；1:阳性工程菌的超声上清；2: 阳性工程菌的超声沉淀；

图5 纯化的抗炭疽保护性抗原Fab (PAFab) SDS-PAGE分析，M：Marker；1:纯化的Fab；

图6纯化的抗炭疽保护性抗原Fab (PAFab) 的Western blot分析，M：Marker；1:纯化的Fab；

图7纯化后抗PA63人源抗体Fab片段的ELISA检测；

图8抗PA基因工程抗体Fab的中和活性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明

实施例1

炭疽保护性抗原(PA63)抗原蛋白的表达与纯化

根据genebank中AF306782的基因序列，合成保护性抗原(PA63)抗原基因，用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切并克隆于原核表达载体pColdII中，氯化钙法转入大肠杆菌BL21（DE3）中并涂布于LB琼脂平板（100μg/mL氨苄青霉素抗性）上37℃孵育12小时。将含有重组质粒的BL21 菌株接种到含氨苄青霉素(100 μg/ L) 的LB 中，37 ℃震荡过夜；次日转接， 37 ℃培养至菌液吸光度(A)值600 约0.6时，加异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达蛋白，至终浓度为1 mmol/ L，25 ℃190 r/min 震荡；诱导12小时。用12％SDS-PAGE分析保护性抗原PA63抗原蛋白表达，结果如图1所示，在55-72KD间出现明显的蛋白条带。

保护性抗原(PA63)抗原蛋白的纯化。离心收集表达保护性抗原PA63菌液。用PBS 45 mL重悬细菌，超声碎菌。4℃收集上清过滤；将含有保护性抗原PA63的上清，经亲和层析柱纯化，收集蛋白；SDS-PAGE 分析蛋白表达含量，纯度达90%以上（图2），样品于- 70 ℃ 贮存备用。

人源抗PA特异性抗体Fab的筛选

噬菌体抗体库的富集筛选：用纯化的保护性抗原(PA63)抗原蛋白包被固相筛选ELISA板，每孔1μg，洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体；加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增殖，加入辅助噬菌体VCSM13超感染；重复以上筛选步骤，共进行五轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选；

ELISA鉴定阳性克隆：将最后一轮筛选得到的噬菌体稀释后铺于培养板上培养过夜，挑取64个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔中分别转移5μL菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体VCSM13超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm计算每孔吸光值；当P/N值(Positive/Negative)大于2.1时，该菌株为阳性单克隆噬菌体菌株（图3）。阳性克隆经核酸序列分析后，发现有1株Fab克隆与PA63重组蛋白有较强的结合活性。Fab重、轻链可变区基因序列分析应用以下两个服务器：

http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=mouseIg

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Fab的核酸序列及氨基酸序列如下：

重链可变区核苷酸序列：

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGCTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAACGAAACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCCCA

重链可变区氨基酸序列：

EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERNYFDYWGQGTLVTVSP

重链互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列

H-CDR1：GFTFSSYG

H-CDR2：IWYDGSNK

H-CDR3：ARERNYFDY

轻链可变区核苷酸序列：

GAGCTCGTGATGACTCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

轻链可变区氨基酸序列：

ELVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPYTFGQGTKLEIK

轻链互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列

L-CDR1：QSVLYSSNNKNY

L-CDR2：WAS

L-CDR3：QQYYSTPYT

实施例2

人源抗PA特异性抗体Fab的表达与纯化

阳性克隆的大量表达和纯化：实施例1获得阳性克隆噬菌体感染非抑制型E.coli.Top10F’，含有重组质粒pComb3x-Fab的菌株接种于10mL的SB液体培养基中（含有100ug/mL的氨苄青霉素），37℃摇床培养至OD600nm至0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，25℃诱导过夜。12000rpm 离心收集菌体，超声破菌后收集超声裂解上清，用0.2mm滤膜过滤后，用Western blot检测Fab的表达（图4）。阳性克隆经大量表达后，采用AKTA 的FPLC蛋白纯化仪，Protein L柱纯化。该条件下，可从细菌超声裂解上清中纯化得到纯度较高的Fab，纯化后的Fab用SDS-PAGE和Western blot进行检测（图5、6）。

所述的纯化是指a）把ProteinL亲和层析柱安装至蛋白质纯化仪上，b）用10个柱床体积的结合缓冲液（0.05 mol/L Na₂HPO₄， 0.05mol/L NaH₂PO₄， 0.35mol/L NaCl， pH 7.2）平衡柱床，c）上样品，流速为1mL/分钟。d）用结合缓冲液洗涤柱床至A280nm吸光度到基线，用5-10个柱床体积的洗脱缓冲液（0.1mol/L Glycine，0.15mol/L NaCl， pH 2.7）洗脱目的蛋白，用SDS-PAGE鉴定。

实施例3

人源抗PA特异性抗体Fab的免疫学特性分析

酶联免疫检测法

用包被液（0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释重组保护性抗原PA63至2μg/mL包被ELISA 96孔板，每孔加入50μL ，4℃过夜；PBST（PBS含0.5%wt Tween20），5%wt BSA洗涤缓冲液封闭，37℃孵育2h；PBST洗涤5次后，每个孔中加入50μL 梯度稀释人源抗PA63抗体4℃过夜；以1：2000体积比稀释的羊抗人Fab二抗50μL/孔加入到孔内，37℃孵育30分钟；过氧化物酶底物显色液50μL/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中止反应，酶标仪选择双波长450 nm/630 nm检测。结果如图7示， Fab抗体片段可与重组保护性抗原PA63结合并具有浓度依赖性关系。

抗体的体外中和活性检测

将被试细胞(J774A.1)培养在含有10%wt小牛血清（FBS）和1%wt抗生素（P/S）的DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)培养基中，37℃ 5%二氧化碳条件下培养。待细胞培养良好后转种在96微孔细胞培养板上，过夜培养当细胞生长在96微孔细胞培养板上达70%时，无菌条件下按不同剂量加按比例稀释好的炭疽致死毒素（PA:0.1ug/mL， LF:10ug/mL）和人源抗PA抗体Fab（0.05ug/mL），继续培养3小时，显微镜下观察细胞死亡，然后加Cell Titer 96 aqueous nonradioactive cell Proliferation assay(Promega MI)检查LDH，计算分析细胞死亡百分数，实验重复三次。结果如图8所示，该抗体在10 ug/mL的LF浓度下的细胞保护率仍超过80%以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军南京军区军事医学研究所

<120> 人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab及应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Ala Ser

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagctcgtga tgactcagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120

tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300

ccgtacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339

<210> 5

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 6

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagct atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaacga 300

aactactttg actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcccca 348

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Pro

115

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Phe Asp Tyr

1 5

Claims

1.人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab，其特征在于，所述抗体的V_L链的互补决定区具有以下的CDRs氨基酸序列：

SEQ ID NO.1所示的L-CDR1；

SEQ ID NO.2所示的L-CDR2；

SEQ ID NO.3所示的L-CDR3；

SEQ ID NO.8所示的H-CDR1；

SEQ ID NO.9所示的H-CDR2；

SEQ ID NO.10所示的H-CDR3。

2.根据权利要求1所述的人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab，其特征在于，所述抗体的V_L链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，V_H链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.表达权利要求1所述人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab的核苷酸，其特征在于，所述表达抗体V_L链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，表达V_H链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.权利要求1～2所述任一人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在制备炭疽病治疗抗体相关药物中的应用。

5.权利要求3所述核苷酸表达的人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在制备炭疽病治疗抗体相关药物中的应用。

6.权利要求1～2所述任一人源抗炭疽毒素保护性抗原中和抗体Fab在治疗炭疽病中的应用。