BR112016016035B1

BR112016016035B1 - Gene resistente à praga antropogênica, anticorpo de cadeia única de idiotípico de antitoxina cry1ab codificado pelo mesmo e aplicação

Info

Publication number: BR112016016035B1
Application number: BR112016016035-5A
Authority: BR
Inventors: Xianjin LIU; Chongxin XU; Xiao Zhang; Yuan Liu; Yajing XIE; Cunzheng ZHANG; Xiangyang YU; Donglan WANG
Original assignee: Jiangsu Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-01-26
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2022-02-08
Also published as: CN103773774B; WO2015109951A1; JP2017505109A; JP6236531B2; US9751952B2; EP3098315B1; WO2015109951A8; BR112016016035A2; US20170044272A1; EP3098315A4; CN103773774A; EP3098315A1

Abstract

gene resistente à praga antropogênica, anticorpo de cadeia única de idiotípico de toxina anti-cry1ab codificado pelo mesmo e aplicação. trata-se de um gene resistente à praga antropogênica que tem uma sequência nucleotídica conforme representado pela seq id no. 1, e um anticorpo de cadeia única idiotípico de toxina anti-cry1ab codificado pelo gene resistente à praga antropogênica, e que tem uma sequência nucleotídica conforme repre-sentado pela seq id no. 2.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de controle biológico e modificação genética, particularmente, a um gene resistente a inseto derivado de ser humano e um anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab codificado pelo mesmo, e aplicação do mesmo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Atualmente, o gene inseticida amplamente usado no mundo para controle biológico de pragas é o gene de toxina Bt de Bacillus thuringiensis (Bt) (como: Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1C e Cry1F et al.). Bacillus thuringiensis é a bactéria patogênica de inseto. A toxina Bt, gerada pelo mesmo, tem um efeito de eliminação específico em muitas espécies de pragas agrícolas e florestais. Desde que Belgian Plant Genetic Systems relatou primeiramente o sucesso de tabaco resistente a inseto de Bt transgênico, em 1987, até os dias atuais, o gene Bt foi transferido para as principais safras no mundo, como: milho-maís, arroz com casca, algodão, tomate, batata e tabaco. De acordo com as estatísticas do Serviço Internacional para a Aquisição de Aplicações de Agrobiotecnologia (ISAAA), em 2012, a área de algodão com Bt transgênico cultivado na China excedeu 3,9 milhões de hectares, considerando 71,5% da área total do algodão cultivado na China. Entretanto, após a aplicação e generalização de safras com Bt transgênico, é possível que potenciais perigos na fuga de gene, mudança de estrutura ecológica microbiana do solo, resistência a fármaco de espécies e perigo ao sistema imunológico normal tenham despertado gradualmente a atenção da sociedade. Os documentos “Diversity of Rhizospheric Microorganisms and Bacterial Physiological Groups of Transgenic Bt Maize” (Wang Min et al, Chinese Journal of Ecology, Edição de março de 2010) e “Influence of Transgenic Bt Maize on Bacterial Quantity and Diversity of Soil” (Liu Ling et al, Journal of Ecology and Rural Environment, Edição de março de 2011) analisaram a quantidade e a diversidade bacteriana do solo em que o milho-maís com Bt transgênico é cultivado em ambientes internos e externos, respectivamente. Os resultados mostram uma diferença significativa entre o grupo de cultivo de milho-maís com Bt transgênico e o grupo de controle.

[0003] O documento “Cry1Ac protoxin from Bacillus thuringiensis sp. kurstaki HD73 binds to surface proteins in the mouse small intestine” (Vázquez-Padrón et al., Biochem Biophys Res Commun, Edição 01, 2000) constatou que, quando a proteína tóxica intrínseca de Bt e a proteína tóxica extrínseca de Bt tomadas por um camundongo atingiram 10 mg/kg e 100 mg/kg, a taxa positiva de ANAE de célula T, o índice de esplenomegalia e a fagocitose de macrófago do camundongo foram todos inibidos, obviamente, durante o experimento em animais. Quanto maior é a admissão, mais óbvio o efeito inibidor será. Esse experimento também constatou que, quando o coeficiente acumulativo da proteína de toxina Bt no corpo de animal era maior do que 6,24, pode resultar em uma lesão do fígado, do rim e do trato gastrointestinal, e em anomalias de fígado e rim, anomalias de inchaço celular e degeneração vacuolar podiam ser observadas, e lesão epitelial vascular glomerular podia ser vista. Obviamente, não se pode excluir que as mesmas tenham sido causadas por reações imunológicas. Enquanto isso, o uso a longo prazo de proteína de toxina Bt em uma dose grande também pode resultar na redução significativa do total células brancas do sangue (WBC) e hemoglobina (HGB) dos animais. Isso também indica que a proteína de toxina Bt tem uma toxicidade óbvia de imunossupressão. Portanto, o desenvolvimento de efetores biológicos substitutos com bioatividade de toxina Bt (como: anticorpo anti- idiotípico) é um ponto ativo de pesquisa no campo de desenvolvimento de praga biológica.

[0004] Visto que o gene de anticorpo humanizado é derivado do ser humano, o mesmo tem a vantagem da homologia genética com o sistema imunológico humano. O mesmo pode evitar danos de seu resíduo no alimento ao sistema imunológico humano após a aspersão de sua preparação ou expressão transgénica.

[0005] Em 1974, o imunologista dinamarquês Jerne introduziu o conceito de anticorpo anti-idiotípico em sua “Teoria da Rede Imunológica”. O anticorpo anti- idiotípico (doravante no presente documento denominado como “Anti-Id”) se refere ao anticorpo específico gerado para abordar o idiotipo (doravante no presente documento denominado como “Id”) nas regiões variáveis de moléculas de anticorpo. Bona, et al classificou o Anti-Id em quatro tipos (α, β, Y e ε), com base na reação serológica entre Id e Anti-Id, bem como a função de Anti-Id do tipo β de AId tem o efeito de “imagem interna”, isto é: tem um determinante antigênico igual ao antígeno (haptina), para que possa ter a função e bioatividade de antígeno.

[0006] Atualmente, é de conhecimento universal que o Anti-Id com um efeito semelhante ao antígeno alvo pode ser obtido por tecnologia de exibição de fagos através do estabelecimento de uma biblioteca de anticorpos em fago, e triagem específica. O processo de triagem de anticorpo específico por tecnologia de exibição de fagos é chamado de “panning”, e inclui, principalmente, quatro etapas: ligação, lavagem, eluição e amplificação. Raats et al. adotou o revestimento de anticorpo monoclonal anticortisol como antígeno de fase sólida para triagem direta. Antes da triagem, uma mesma espécie de anticorpo monoclonal negativo é testada negativamente para evitar testar fragmentos de anticorpo recombinante ligados à região constante de anticorpo, e testar com sucesso o Anti-Id contra cortisol. Goletz et al. também aplicou o sistema de exibição de anticorpos em fago, e pesquisou e comparou a influência de métodos de eluição diferentes em resultados de triagem de fragmento de Anti-Id. Dentre os 96 clones eventualmente testados, 28 foram clones positivos com características Anti-Id. Até o momento, nenhum material ou produto específico ao efetor ativo de Bt substituível, particularmente, anticorpo de cadeia única Anti-Id do tipo Antitoxina Bt (doravante no presente documento denominado como “Anti-Id ScFvs”), foi relatado.

CONTEÚDO DA INVENÇÃO

[0007] Para abordar o potencial risco de segurança da aplicação extensiva de safras de toxina Bt e preparações de toxina da mesma, hipersensibilidade e outros problemas, no presente, a presente invenção é concretizada através do desenvolvimento de um efetor biológico substituível com bioatividade de toxina Bt, e sua aplicação no controle biológico de pragas:

[0008] Um gene resistente a inseto derivado de ser humano, sendo que tem uma sequência nucleotídica representada por SEQ ID NO.1.

[0009] Na presente invenção, um anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab codificado por SEQ ID NO.1, que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO.2;

[0010] Na presente invenção, um vetor de expressão procariótico que contém o gene resistente a inseto derivado de ser humano SEQ ID NO.1;

[0011] Na presente invenção, uma aplicação de gene resistente a inseto derivado de ser humano SEQ ID NO.1 no controle de pragas agrícolas;

[0012] Na presente invenção, um inseticida que contém o anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab com uma sequência de aminoácidos conforme representado por SEQ ID NO.2.

[0013] A presente invenção testou e obteve, a partir do banco genético humano, um anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab do tipo “β” - com atividade inseticida. Após a expressão pelo sistema procariótico, a cultura primária desse anticorpo de cadeia única tem atividade de ligação a BBM de receptor específico de membrana peritrófica de intestino médio de Cnaphalocrocis medinali. A presente invenção obtém anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab do tipo “β” sem imunização animal. O ciclo de preparação é curto. A sequência de aminoácidos é pequena. É adequado para produção em massa in vitro. Enquanto isso, a presente invenção, como um novo recurso de gene resistente a inseto, tem significância prática e científica importante para explorar e desenvolver novos tipos de recursos de gene resistente a inseto que simulam a bioatividade de toxina Bt para reduzir os riscos de segurança do amplo uso de toxinas Bt existentes, e até mesmo substituir Bt, no futuro, no controle biológico de pragas agrícolas, e reduzir o uso de pesticidas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] A Figura 1 é um esquema do resultado de detecção de B12 por ELISA.

[0015] A Figura 2 é um esquema do resultado de determinação biológica de B12.

[0016] A Figura 3 é um esquema que mostra a condição de morte de larvas de terceiro ínstar de Cnaphalocrocis medinalis após as mesmas serem alimentadas com folhas de arroz com casca embebidas com B12, CK+ e CK-, respectivamente.

[0017] A Figura 4 é um esquema que mostra a condição de morte de larvas de terceiro ínstar de Plutella xylostella após as mesmas serem alimentadas com folhas repolho embebidas com B12, CK+ e CK-, respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES

[0018] Fórmulas de meio e reagentes envolvidos na concretização:

[0019] (1) meio fluido de 2*TY:

[0020] Adicionar 16 g de triptona, 10 g de extrato de levedura e 5 g de NaCl em 900 mL de água bidestilada, misturar bem os mesmos, ajustar o volume para 1 L por água bidestilada, colocar o líquido em um autoclave, esterilizar a 121 °C por 20 minutos, resfriar o mesmo e armazenar o mesmo a 4 °C para uso futuro.

[0021] (2) meio fluido de 2*TY-AG:

[0022] Adicionar ampicilina com concentração final de 100 μg/mL e glicose com uma razão de massa de 1% para meio de cultura de 2xTY.

[0023] (3) meio fluido de 2xTY-AK:

[0024] Adicionar ampicilina com concentração final de 100 μg/mL e canamicina com uma concentração final de 50 μg/mL para meio de cultura de 2xTY.

[0025] (4) meio fluido de 2xTY-AKG:

[0026] Adicionar ampicilina com concentração final de 100 μg/mL, canamicina com concentração final de 50 μg/mL e glicose, com uma razão de massa de 1% para meio de cultura de 2*TY.

[0027] (5) meio sólido de TYE:

[0028] Adicionar 15,0 g de agarose, 8 g de NaCl, 10 g de triptona e 5 g de extrato de levedura em 900 mL de água bidestilada, ajustar o volume para 1 L por água bidestilada, colocar o líquido em um autoclave, esterilizar a 121 °C por 20 minutos, resfriar o mesmo e armazenar o mesmo a 4 °C para uso futuro.

[0029] (6) meio sólido de TYE-AG:

[0030] Adicionar ampicilina com concentração final de 100 μg/mL e glicose com uma razão de massa de 1% para meio sólido de TYE.

[0031] (7) solução de PBS

[0032] Pesar 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 2,9 g de Na2HPO412H2O e 0,2 g de KH2PO4, adicionar os mesmos em água destilada, respectivamente, dissolver os mesmos completamente e ajustar o volume para 1 L.

[0033] (8) solução de PBST

[0034] Adicionar Tween-20 com uma razão de volume de 0,05% para solução de PBS.

[0035] (9) solução de PEG/NaCl:

[0036] Pesar 20 g de PEG 8000 e 14,61 g de NaCl, adicionar 80 mL de água desionizada, ajustar o volume para 100 mL, colocar a solução em um autoclave, esterilizar a mesma a 121 °C por 20 minutos, resfriar a mesma e armazenar a mesma a 4 °C para uso futuro.

[0037] (10) solução tampão de citrato (CPBS,pH=5,5):

[0038] Pesar 21 g de C6H7O8 (ácido cítrico) e 71,6 g de Na2HPO4*12H2O, adicionar os mesmos à água destilada, respectivamente, dissolver os mesmos completamente e ajustar o volume para 1 L.

[0039] (11) solução de tetrametilbenzidina (TMB):

[0040] Pesar 10 mg de TMB, dissolver o mesmo em 1 mL de sulfóxido de dimetil, manter a solução em um lugar escuro e armazenar o mesmo a 4 °C para uso futuro.

[0041] (12) Solução cromogênica de substrato:

[0042] Composição de fórmula de 10 mL: 9,875 mL de CPBS, 100 μL de solução de TMB e 25 μL de H2O2, com razão de volume de 20%.

[0043] Fontes dos materiais envolvidos na concretização:

[0044] Anticorpo policlonal anti-cry1Ab, BBMV, anticorpo de cadeia única Anti-Id irrelevante, Anti-Id ScFv de tipo não “β”, folhas de repolho e larvas de terceiro ínstar de Plutella xylostella foram fornecidos pelo Key Laboratory for Agricultural Product Quality and Safety Control Technology and Standard of the Ministry of Agriculture, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences;

[0045] Biblioteca de anticorpos em fago humanizados, bactérias de TGl e fago auxiliar KM13 foram adquiridos junto à British Source BioScience;

[0046] IgG de cabra anti-M13 com HRP foi adquirida junto à Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.;

[0047] A toxina Cry1Ab foi adquirida junto à Shanghai Youlong Biotech Co., Ltd.;

[0048] As folhas de arroz com casca e larvas de terceiro ínstar de Cnaphalocrocis medinalis foram fornecidas pela Yangzhou Luyuan Bio-Chemical Co., Ltd.

MODALIDADE 1: Testar anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab

[0049] (1) Adicionar 20 μL de líquido de bactéria de biblioteca de anticorpos em fago humanizada a 200 mL de meio fluido de 2*TY-AG, cultivar o mesmo em uma temperatura constante de 37 °C até a OD600 ser 0,4, medir 50 mL do líquido de bactéria, adicionar 1*1012 pfu de fago auxiliar KM13 para superinfecção, incubar o líquido a 37 °C por 30 minutos e, então, centrifugar a mesma a 3.300 g por 10 minutos, descartar o sobrenadante, usar 100 mL de meio fluido de 2xTY-AKG para ressuspender o precipitado e cultivar o mesmo a 30 °C de um dia para o outro; centrifugar o mesmo a 3.300 g por 30 minutos até o próximo dia, colher o sobrenadante, adicionar 20 mL de solução de PEG/NaCl, manter a mesma em banho frio por 1 hora e, então, centrifugar a mesma a 3.300 g por 30 minutos e ressuspender o precipitado por 4 mL de PBS; centrifugar a solução de ressuspensão a 11.600 g por 10 minutos; e o sobrenadante é a biblioteca de anticorpos em fago amplificada;

[0050] (2) Usar a biblioteca de anticorpos em fago amplificada obtida na etapa 1 por quatro ciclos de Panning: no primeiro ciclo de Panning, revestir 4 mL de 100 μg/mL anticorpo policlonal anti-cry1Ab ao fundo de um frasco de cultura celular, manter o mesmo a 4 °C de um dia para o outro, lavar o frasco de cultura celular com 1 mL de PBS por 3 vezes no próximo dia e, então, adicionar 1 mL de biblioteca de anticorpos em fago amplificada misturada completamente, e 4 mL de solução de MPBS a 3%, colocar o frasco sobre uma mesa oscilante, sacudir lentamente o mesmo em temperatura ambiente por 1 hora, deixar o mesmo descansar por 1 hora, remover o líquido no frasco de cultura, lavar o frasco com 1 mL de solução de PBST por 20 vezes e adicionar 1 mL de 10 mg/mL de tripsina para eluir o anticorpo em fago ligado especificamente. O eluente é o anticorpo em fago obtido no primeiro ciclo de Panning. As concentrações do anticorpo policlonal anti-cry1Ab submetido a panning no segundo, no terceiro e no quarto ciclos são 50 μg/mL, 25 μg/mL e 10 μg/mL, respectivamente. O anticorpo em fago usado é o anticorpo em fago obtido a partir do ciclo anterior de panning. O método de panning é o mesmo que o adotado no primeiro ciclo. 10 μL do anticorpo em fago submetido a panning no quarto ciclo são usados para infectar 1 mL de bactérias TG1 em uma fase logarítmica. Após o mesmo ter sido incubado a 37 °C por 1 hora, o mesmo é revestido em um meio sólido de TYE-AG e cultivado a 37 °C de um dia para o outro; no próximo dia, colónias unitárias são captadas aleatoriamente, incubadas em uma placa de 96 poços que contém 100 μL/poço de meio fluido de 2xTY-AG e cultivada a 37 °C de um dia para o outro; no próximo dia, 2 μL de líquido de bactéria são sugados da placa de poço, transferidos para uma nova placa com 96 poços e incubados a 37 °C por 2 horas. 25 μL de fago auxiliar KM13 com titulador de 1012 são adicionados a cada poço, incubados a 30 °C por 2 horas, centrifugados em 1.800 g por 10 minutos, o precipitado é ressuspenso com 150 μL de meio fluido de 2*TY-AK e, então, cultivado a 30 °C de um dia para o outro. No próximo dia, o mesmo é centrifugado em 1.800 g por 30 minutos. O sobrenadante é colhido;

[0051] (3) 4 μg /mL de anticorpo policlonal anti-cry1Ab são medidos e adicionados a uma placa com 96 poços, 100 μL/poço, e armazenados a 4 °C de um dia para o outro. No próximo dia, 100 μL do sobrenadante obtido na etapa 2 são adicionados a cada poço. 100 μL de meio fluido de 2xTY-AK são adicionados ao controle negativo. Os mesmos são mantidos em banho de água a 37 °C por 2 horas. Após a placa ser lavada com 250 μL/poço de PBST, 100 μL de IgG de cabra anti-M13 com HRP com diluição de 1: 5.000 são adicionados a cada poço e incubados a 37 °C por 2 horas. 100 μL de solução cromogênica de substrato são adicionados a cada poço e reagem em temperatura ambiente por 10 a 20 minutos até que um azul apareça. Finalmente, 50 μL de 2 mol/l de H2SO4 são adicionados a cada poço para terminar rapidamente a reação. OD450 é determinada por ELISA. Se a OD450 da solução/ OD450 de controle negativo for maior do que 2,1, a mesma será considerada positiva. O sobrenadante na etapa 2 correspondente a essa solução é o sobrenadante testado que contém o anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab.

[0052] A sequência nucleotídica do anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab testado determinado pelo método de sequenciamento de Sanger é SEQ ID NO.1, conforme mostrado abaixo: caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg caaattctat 60 ttcaaggaga cagtcataat gaaataccta ttgcctacgg cagccgctgg attgttatta 120 ctcgcggccc agccggccat ggccgaggtg cagctgttgg agtctggggg aggcttgtac 180 agcctggggg ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt tagcagctat 240 gccatgagct gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtctc atatatttcg 300 aatgagggta cgacgacaat gtacgcagac tccgtgaagg gccggttcac catctccaga 360 gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga ggacacggcc 420 gtatattact gtgcgaaacc ttggtcggcg tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 480 accgtctcga gcggtggagg cggttcaggc ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgacg 540 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 600 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 660 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca 720 aggttcagtg gcagtggatc ctgggacaga tttcactctc accatcagca gtctgcaacc 780 tgaagatttt gaacttacta ctgtcaacag acttctcatc ctcctctgac gttcggccaa 840 gggaccaagg tggaaatcaa acgggcggcc gcacatcatc atcaccatca cggggccgca 900 gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatggggccg catag 935

[0053] Após a tradução de nucleotídeo, a sequência de aminoácidos do anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab testado determinado pelo método de sequenciamento de Sanger é SEQ ID NO.2, conforme mostrado abaixo: H-CDR1 MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR 60 H-CDR2 QAPGKGLEWVSRIHTSGDSTQYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK 120 H-CDR3 Link DYRWFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS 180 L-CDR1 L-CDR2 QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY 240 L-CDR3 His-tag YCQQASEAPSTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAASTP 291

[0054] O depositante nomeia esse anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab como B12.

MODALIDADE 2: Preparar cultura primária de B12

[0055] (1) O sobrenadante obtido através da triagem na Modalidade 1, e que contém o anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab, é transferido para 10 mL de meio fluido de 2*TY-AG em uma razão de volume de 1: 100, e incubado a 37 °C por 2 horas. 100 μL de fago auxiliar KM13 com titulador de 1012 são adicionados para recuperação, incubados a 30 °C por 2 horas e centrifugados em 1.800 g por 10 minutos. O sobrenadante é removido. O meio fluido de 2xTY-AK é usado para ressuspender as bactérias precipitadas. O mesmo é cultivado enquanto é sacudido a 30 °C e 250 rpm de um dia para o outro. No próximo dia, o mesmo é centrifugado em 1.800 g por 30 minutos. Seu sobrenadante é o sobrenadante que contém a cultura primária de B12.

MODALIDADE 3 Identificação de subtipo de B12

[0056] (1) Experimento de detecção por ELISA da inibição competitiva

[0057] O experimento adota 6 grupos experimentais e grupos de controle correspondentes. As soluções são preparadas com base na Tabela 1.TABELA 1 Preparação de soluções para experimento de detecção por ELISA de inibição competitive

[0058] Na Tabela 1, B12 é o sobrenadante obtido na Modalidade 2 e que contém a cultura primária de B12;

[0059] Adicionar 50 μL de 10μg/mL de anticorpo policlonal anti-cry1Ab às soluções preparadas na Tabela 1, respectivamente, incubar as mesmas a 37 °C por 2 horas, adicionar as mesmas a uma placa com 96 poços revestida com 2 μg/mL de toxina Cry1Ab, respectivamente (a placa com 96 poços revestida 2 μg/mL de toxina Cry1Ab é obtida adicionando-se 2 μg /mL de toxina Cry1Ab a uma placa com 96 poços no dia anterior, 100 μL/poço e manter a 4 °C de um dia para o outro), reagir por 2 horas; lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de IgG de cabra anti-M13 com HRP com diluição de 1: 5.000, incubar em temperatura ambiente por 1 hora; lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de solução cromogênica de substrato, reagir em temperatura ambiente por 10~20 minutos, até que um azul apareça, e, no fim, adicionar 50 μL/poço de 2 mol/l de H2SO4 para terminar rapidamente a reação; determinar OD450 por ELISA.

[0060] Os resultados experimentais são conforme mostrado na Figura 1. A razão de inibição aumenta com o aumento de teor de B12. Os grupos de controle não têm o fenômeno de inibição competitiva, sugerindo que B12 é o anticorpo de cadeia única Anti-Id do tipo β, e pode simular a toxina Cry1Ab para se ligar de forma competitiva ao anticorpo policlonal anti-toxina cry1Ab.

[0061] (2) Experimento de determinação biológica

[0062] O experimento tem grupo experimental 1, grupo experimental 2, grupo experimental 3, grupo de controle positivo, grupo de controle negativo 1, grupo de controle negativo 2 e grupo de controle negativo 3; sendo que o procedimento experimental é conforme o seguinte:

[0063] (a) Bloqueio: Revestir 100 μL /poço de 5 μg/mL BBMV em uma placa com 96 poços, manter a mesma a 4 °C de um dia para o outro, lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes no próximo dia, adicionar 200 μL de BAS com uma razão de massa de 3%, respectivamente, incubar em temperatura ambiente por 2 horas, e executar o bloqueio;

[0064] (b) Adição de amostra: Lavar a placa com 96 poços bloqueada na etapa 1 com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, e adicionar amostras à placa com 96 poços de acordo com a Tabela 2:TABELA 2 Preparação de Soluções para experimento de determinação biológica de B12

[0065] Na Tabela 2, B12 é o sobrenadante obtido na Modalidade 2, e que contém a cultura primária de B12;

[0066] (c) Incubar a placa com 96 poços adicionada com a amostra na etapa b em temperatura ambiente por 2 horas, lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de 10 μg/mL de anticorpo policlonal anti-cry1Ab e, então, lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de IgG de cabra anti-M13 com HRP com diluição de 1: 5.000, e incubar em temperatura ambiente por 1 hora; lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de solução cromogênica de substrato por poço, reagir em temperatura ambiente por 10~20 minutos, até que um azul apareça, e, no fim, adicionar 50 μL/poço de 2 mol/l de H2SO4 para terminar rapidamente a reação e determinar OD450 por ELISA.

[0067] O resultado experimental é conforme mostrado na Figura 2. Em comparação ao controle positivo, o anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab B12 (grupos experimentais 1, 2 e 3) pode inibir a ligação entre a toxina Cry1Ab e seu receptor BBMV; o controle negativo do tipo não “β” não tem o fenômeno de inibição, o que prova, adicionalmente, que B12 é do tipo “β”.

MODALIDADE 4: Verificar a atividade inseticida do anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab

[0068] O experimento tem grupos experimentais e grupos de controle:

[0069] Os grupos experimentais usam o sobrenadante (B12) obtido na Modalidade 2 e que contém a cultura primária de B12;

[0070] Os grupos de controle positivo adotam 0,2 g/l de toxina Cry1Ab (CK+);

[0071] Os grupos de controle negativo adotam Anti-Id ScFvs do tipo não “β”(CK-);

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:

[0072] Medir os grupos experimentais, grupos de controle positivo e grupos de controle negativo, cada um, 10 mL, colocar os mesmos em pratos de cultura esterilizados, adicionar 6 folhas de arroz com casca e 6 folhas de repolho, respectivamente, embeber as mesmas por 30 minutos, retirar as mesmas e secar as mesmas no ar; alimentar larvas de terceiro ínstar de Cnaphalocrocis medinalis e larvas de terceiro ínstar de Plutella xylostella com folhas secas.

[0073] O resultado experimental é conforme mostrado na Figura 3 e na Figura 4. A Figura 3 mostra a condição de morte das larvas de terceiro ínstar de Cnaphalocrocis medinalis, respectivamente, alimentadas com folhas de arroz com casca, que foram embebidas com B12, toxina Cry1Ab (CK+) e Anti-Id ScFvs do tipo não “β” (CK-). A Figura 4 mostra a condição de morte das larvas de terceiro ínstar de Plutella xylostella, respectivamente, alimentadas com folhas de repolho, que foram embebidas com B12, toxina Cry1Ab (CK+) e Anti-Id ScFvs do tipo não “β” (CK-). Pode ser visto que B12 tem um bom efeito inseticida.

Claims

1. Gene resistente a inseto derivado de ser humano caracterizado por ter uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO.1.

2. Anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti- toxina cry1Ab codificado pelo gene resistente a inseto derivado de ser humano, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ter uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO.2.

3. Vetor procariótico caracterizado por conter o gene resistente a inseto derivado de ser humano, conforme definido na reivindicação 1.

4. Uso do gene resistente a inseto derivado de ser humano, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser no controle de pragas agrícolas.

5. Inseticida caracterizado por conter o anticorpo de cadeia única de idiotipo de anti-toxina cry1Ab, conforme definido na reivindicação 2.