BR112016014689B1

BR112016014689B1 - Gene inseticida derivado de ser humano e peptídeo inseticida codificado pelo mesmo e aplicação dos mesmos

Info

Publication number: BR112016014689B1
Application number: BR112016014689-1A
Authority: BR
Inventors: Xianjin LIU; Yuan Liu; Yajing XIE; Aihua WU; Xiao Zhang; Chongxin XU; Yanyan Zhao; Jianfeng Zhong
Original assignee: Jiangsu Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2022-06-07
Also published as: WO2016086513A1; JP2017502655A; US20170088633A1; JP6211702B2; EP3067423A1; EP3067423B1; EP3067423A4; BR112016014689A2; US9725521B2; CN104498501B; CN104498501A

Abstract

GENE INSETICIDA DERIVADO DE SER HUMANO E PEPTÍDEO INSETICIDA CODIFICADO PELO MESMO E APLICAÇÃO DOS MESMOS. A presente invenção se refere a um gene inseticida derivado de ser humano e peptídeo inseticida codificado pelo mesmo e aplicação dos mesmos. A sequência de nucleotídeos do gene inseticida derivado de ser humano é conforme representado pela SEQ ID NO.1. A sequência de aminoácidos do peptídeo inseticida codificado por esse gene é conforme representado pela SEQ ID NO.2. O peptídeo inseticida pode ser expresso através do sistema procariótico. A cultura primária tem atividade de ligação ao BBMV de receptor específico de membrana peritrófica de intestino médio de Cnaphalocrocis medinalis. É obtida sem imunização animal e tem um ciclo de produção curto e uma sequência de aminoácidos. É adequada para produção em massa in vitro e pode reduzir os riscos de segurança resultantes do amplo uso de toxinas Bt existentes e pode até mesmo substituir Bt para controlar biologicamente as pragas no futuro. Tem significância científica importante e prática para reduzir o uso de inseticidas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO:

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de controle biológico e modificação genética, particularmente a um gene inseticida derivado de ser humano e peptídeo inseticida codificado pelo mesmo e aplicação dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO:

[0002] Atualmente, o gene inseticida amplamente usado no mundo para controle biológico de pragas é o gene de toxina Bt de Bacillus thuringiensis (Bt) (como: Cry1C, Cry1Ab, Cry1B, Cry1F e Cry2Aa, etc.). Bacillus thuringiensis é a bactéria patogênica de inseto. A toxina Bt gerada por Bacillus thuringiensis tem um efeito de eliminação específica em muitas espécies de pragas agrícolas e florestais. Desde que Belgian Plant Genetic Systems relatou primeiramente o sucesso de tabaco resistente a inseto de Bt transgênico em 1987 até os dias atuais, o gene Bt foi transferido para as principais safras no mundo, como: milho-maís, arroz em casca, algodão, tomate, batata e tabaco. De acordo com as estatísticas do Serviço Internacional para a Aquisição de Aplicações de Agro-biotecnologia (ISAAA) em 2012, a área de algodão com Bt transgênico cultivado na China excedeu 3,9 milhões de hectares, respondendo por 71,5% da área total do algodão cultivado na China. Entretanto, após a aplicação e generalização de safras com Bt transgênico, é possível que potenciais perigos na fuga de gene, mudança de estrutura ecológica microbiana do solo, resistência a fármaco de espécies e perigo ao sistema imunológico normal tenham despertado gradualmente a atenção da sociedade. No setor acadêmico, “Diversity of Rhizospheric Microorganisms and Bacterial Physiological Groups of Transgenic Bt Maize” (Wang Min et al, Chinese Journal of Ecology, Edição de 03 de 2010) e “Influence of Transgenic Bt Maize on Bacterial Quantity and Diversity of Soil” (Liu Ling et al, Journal of Ecology and Rural Environment, Edição de 03 de 2011) analisaram a quantidade e diversidade bacteriana do solo em que o milho-maís com Bt transgênico é cultivado em interior e em exterior, respetivamente. Os resultados mostram uma diferença significativa entre o grupo de cultivo de milho- maís com Bt transgênico e o grupo de controle de bloco bruto. “Cry1Ac protoxin from Bacillus thuringiensis sp. kurstaki HD73 binds to surface proteins in the mouse small intestine” (Vázquez-Padrón et al., Biochem Biophys Res Commun, Edição 01, 2000) constatou que quando a proteína tóxica intrínseca de Bt e proteína tóxica extrínseca de Bt tomada por um camundongo atingiu 10 mg/kg e 100 mg/kg durante o experimento em animais, taxa positiva de ANAE de célula T, índice de esplenomegalia e fagocitose de macrófago do camundongo foram todos inibidos, obviamente. Quanto maior é a admissão, mais óbvio o efeito inibidor será. Esse experimento também constatou que quando o coeficiente acumulativo da proteína de toxina Bt no corpo de animal era maior do que 6,24, podia resultar em uma lesão do fígado, rim e trato gastrointestinal e em anomalias de fígado e rim, anomalias de inchaço celular e degeneração vacuolar podiam ser observadas e lesão epitelial vascular glomerular podia ser vista. Obviamente, não se pode excluir que as mesmas foram causadas por reações imunológicas. Enquanto isso, o uso a longo prazo de proteína de toxina Bt em uma dose grande também pode resultar na redução significativa do total de células brancas do sangue (WBC) e hemoglobina (HGB) dos animais. Isso também indica que a proteína de toxina Bt tem uma toxicidade de óbvia de imunossupressão. Portanto, o desenvolvimento de efetores biológicos substitutos com a bioatividade de toxina Bt é um ponto ativo de pesquisa no campo de desenvolvimento de praga biológica.

[0003] O peptídeo inseticida é um tipo de polipeptídeo bioativo gerado em corpos biológicos através de indução. Algumas proteínas de cristal inseticida de Bt podem ser decompostas em peptídeo inseticida em corpos de insetos para concretizar um efeito inseticida, então se tornou uma nova direção de desenvolvimento para efetores biológicos substitutos com bioatividade de toxina Bt no presente. Anticorpo anti-idiotipo (doravante no presente documento denominado como “Anti-Id”) é tal tipo de polipeptídeo com um efeito inseticida biológico. Anti-Id se refere ao anticorpo específico gerado para abordar o idiotipo (doravante no presente documento denominado como “Id”) nas regiões variáveis de moléculas de anticorpo. Bona, et al classificou o Anti-Id em quatro tipos (α, β, Y e ε) com base na reação serológica entre Id e Anti-Id bem como a função de Anti-Id do tipo β de AId. tem o efeito de “imagem interna”, isto é: tem um determinante antigénico igual ao antígeno (haptina), para que possa ter as funções e bioatividade de antígeno.

[0004] Atualmente, a tecnologia Phage Display é universalmente adotada. Ao estabelecer uma biblioteca de anticorpo de fago e através de triagem específica, o Anti- Id com um efeito semelhante ao antígeno alvo pode ser obtido. O processo de triagem de anticorpo específico por tecnologia de exibição de fagos é chamado de “panning” e inclui, principalmente, quatro etapas: ligação, lavagem, eluição e amplificação. Raats et al. adotaram o revestimento de anticorpo monoclonal anti-cortisol como antígeno de fase sólida para triagem direta triagem direta. Antes da triagem, uma mesma espécie de anticorpo monoclonal negativo é testada negativamente para evitar testar fragmentos de anticorpo recombinante ligados à região constante de anticorpo e o Anti-Id em relação ao cortisol é testado com sucesso. Goletz et al. também aplicou o sistema de exibição de anticorpos em fago e pesquisou e comparou a influência de métodos de eluição diferentes em resultados de triagem de fragmento de Anti-Id. De entre os 96 clones eventualmente testados, 28 foram clones positivos com características Anti-Id. Até o momento, nenhum material ou produto específico ao efetor ativo de Bt substituível, particularmente anticorpo de cadeia única Anti-Id do tipo Antitoxina Bt (doravante no presente documento denominado como “Anti-Id ScFvs”) polipeptídeo de micro molécula, foi relatado.

CONTEÚDO DA INVENÇÃO

[0005] Para abordar o potencial perigo de segurança da aplicação extensiva de safras de toxina Bt e preparações de toxina da mesma, hipersensibilidade e outros problemas no presente, a presente invenção é concretizada através do fornecimento de bioatividade de toxina Bt bem como polipeptídeo inseticida codificado pelo mesmo:

[0006] Um gene inseticida derivado de ser humano, sendo que tem uma sequência nucleotídica representada por SEQ ID NO.1.

[0007] Um peptídeo inseticida codificado pelo gene inseticida derivado de ser humano conforme descrito na presente invenção, que tem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO.2;

[0008] Um vetor procariótico que contém o gene inseticida derivado de ser humano conforme descrito na presente invenção;

[0009] Uma aplicação do peptídeo inseticida codificado pelo gene inseticida derivado de ser humano conforme descrito na presente invenção no controlo de pragas agrícolas;

[0010] Um inseticida que contém o peptídeo inseticida codificado pelo gene inseticida derivado de ser humano conforme descrito na presente invenção;

[0011] A presente invenção testou e obteve a partir dos bancos genéticos revelados um anticorpo de cadeia única de idiotipo antitoxina Cry2Aa do tipo “β” (peptídeo inseticida) com atividade inseticida e determinou sua sequência de aminoácidos e sequência de nucleotídeos. Após ser expressa pelo sistema de expressão procariótico, a cultura primária do peptídeo inseticida tem atividade de ligação a BBM de receptor específico de membrana peritrófica de intestino médio de Cnaphalocrocis medinalis e é obtido sem imunização animal. O ciclo de preparação é curto. A sequência de aminoácidos é pequena. É adequado para produção em massa in vitro. Enquanto isso, a presente invenção como um novo recurso de gene inseticida tem significância prática e científica importante para explorar e desenvolver novos tipos de recursos de gene inseticida que simulam a bioatividade de toxina Bt para reduzir os riscos de segurança do amplo uso de toxinas Bt existentes e até mesmo substituir Bt no futuro no controle biológico de pragas agrícolas e reduzir o uso de inseticidas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A Figura 1 é um esquema do resultado de detecção de F2 ELISA.

[0013] A Figura 2 é um esquema do resultado de determinação biológica de F2.

[0014] A Figura 3 é um esquema que mostra a condição de morte de larvas de terceiro instar de Cnaphalocrocis medinalis após as mesmas serem alimentadas com folhas de arroz com casca embebidas com F2, CK+ e CK- respetivamente.

[0015] A Figura 4 é um esquema que mostra a condição de morte de larvas de terceiro instar de Plutella xylostella após as mesmas serem alimentadas com folhas repolho embebidas com F2, CK+ e CK- respetivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES

[0016] Fórmulas de meio e reagentes envolvidos na concretização:

[0017] (1) meio fluido de 2xTY:

[0018] Adicionar 16 g de triptona, 10 g de extrato de levedura e 5 g de NaCl em 900 mL de água bidestilada, misturar os mesmos bem, ajustar o volume para 1L por água bidestilada, colocar o líquido numa autoclave, esterilizar a 121 °C por 20 minutos, resfriar o mesmo e armazenar o mesmo a 4 °C para uso futuro.

[0019] (2) meio fluido de 2xTY-AG:

[0020] Adicionar ampicilina com concentração final de 100 μg/mL e glicose com uma razão de massa de 1% para meio de cultura de 2xTY.

[0021] (3) meio fluido de 2xTY-AK:

[0022] Adicionar ampicilina com concentração final de 100 μg/mL e canamicina com uma concentração final de 50 μg/mL para meio de cultura de 2xTY.

[0023] (4) meio fluido de 2xTY-AKG:

[0024] Adicionar ampicilina com concentração final de 100 μg/mL, canamicina com concentração final de 50 μg/mL e glicose com uma razão de massa de 1% para meio de cultura de 2xTY.

[0025] (5) meio sólido de TYE:

[0026] Adicionar 15,0 g de agarose, 8 g NaCl, 10 g de triptona e 5 g de extrato de levedura em 900 mL de água bidestilada, ajustar o volume para 1L por água bidestilada, colocar o líquido numa autoclave, esterilizar a 121 °C por 20 minutos, resfriar o mesmo e armazenar o mesmo a 4 °C para uso futuro.

[0027] (6) meio sólido de TYE-AG:

[0028] Adicionar ampicilina com concentração final de 100 μg/mL e glicose com uma razão de massa de 1% para meio sólido de TYE.

[0029] (7) solução de PBS

[0030] Pesar 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 2,9 g de Na2HPO4 12H2O e 0,2 g de KH2PO4, adicionar os mesmos em água destilada respetivamente, dissolver os mesmos completamente e ajustar o volume para 1 L.

[0031](8) solução de PBST

[0032] (8) PSBT solução de PBST o adicionar a 0,05% é preparado a Tween-20 com uma razão de volume de 0,05% para solução de PBS.

[0033] PSBT a 0,1% é preparado ao adicionar Tween-20 com uma razão de volume de 0,1% para solução de PBS.

[0034](9) solução de PEG/NaCl:

[0035] Pesar 20 g de PEG 8000 e 14,61 g de NaCl, adicionar 80 mL de água deionizada, ajustar o volume para 100 mL, colocar a solução em uma autoclave, esterilizar a mesma a 121°C por 20 minutos, resfriar a mesma e armazenar a mesma a 4 °C para uso futuro.

[0036] (10) solução tampão de citrato (CPBS, solução tampão de substrato, pH 5): 5):

[0037] Pesar 21 g de C6H7O8 (ácido cítrico) e 71,6 g de Na2HPO412H2O, adicionar os mesmos a água destilada respetivamente, dissolver os mesmos completamente e ajustar o volume para 1 L.

[0038] (11) solução de tetrametil benaidina (TMB):

[0039] Pesar 10 mg de TMB, dissolver o mesmo em 1 mL de sulfóxido de dimetil, manter a solução em um lugar escuro e armazenar o mesmo a 4°C para uso futuro.

[0040] (12) solução cromogênica de substrato:

[0041] Composição de fórmula de 10 mL: 9,875 mL de CPBS, 100 μL de solução de TMB e 25 μL de H2O2 com razão de volume de 20%.

[0042] (13) solução de MPBS a 3%

[0043] Pesar 3 g de pó de leite magro, dissolver em 80 mL de solução de PBS e adicionar solução de PBS para estabelecer o volume como 100 mL.

[0044] IgG de cabra anticoelho com HRP descrito na concretização é diluído com solução de MPBS diluído a 3%.

[0045] Fontes dos materiais envolvidos na concretização:

[0046] BBMV, anticorpo de cadeia única Anti-Id irrelevante, Anti-Id ScFv de não tipo “β”, folhas de repolho e larvas de terceiro instar de Plutella xylostella foram fornecidos pelo Key Laboratory para Padrão e Tecnologia de Controle de Segurança e Qualidade de Produto Agrícola do Ministério de Agricultura, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences;

[0047] Soro negativo: O soro negativo é coletado do coelho branco macho da Nova Zelândia de raça pura de 1,5 a 2,0 kg. O tempo de coleta é uma semana antes da imunização;

[0048] Anticorpo policlonal anti-Cry2Aa: A substância padrão de proteína Cry2A (Shanghai Youlong Biotech Co., Ltd.) é usada como imunógeno. Três coelhos brancos Nova Zelândia machos de raça pura de 1,5 a 2,0 kg são selecionados como animais de laboratório. O procedimento imunológico concreto é como a seguir: na primeira imunização, 200 microgramas de imunógeno por coelho é misturado com FCA isovolumétrico (adjuvante completo de Freund). Após a mistura é emulsificado em uma estrutura de óleo em água, é injetado subcutaneamente em múltiplos pontos da região dorsal (cerca de 40 pontos). Duas semanas depois, é acentuado pelo imunógeno na mesma dose e FIA isovolumétrico (adjuvante incompleto de Freund). Após isso, é acentuado uma vez a cada duas semanas. Na última vez, o imunógeno é diluído com solução salina normal isovolumétrica e então injetada de modo intravenoso diretamente na margem da orelha. Oito dias depois, sangue é coletado do coração, soro é preparado, tiomersalato com concentração final de 0,01% é adicionado, e, então, o soro é purificado pelo método registrado em “Contemporary Immunological Technology and Application” (Ba Denian, United Press of Peking Medical University and Peking Union Medical College, 1998. 309 a 322) para obter o anticorpo policlonal anti-Cry2Aa.

[0049] Biblioteca de anticorpos em fago humanizados, bactérias de TGl e fago auxiliar KM13 foram adquiridos pela British Source BioScience;

[0050] IgG de cabra anti-M13 com HRP foi adquirida pela Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.;

[0051] As toxinas Cry2Aa e Cry1Ab foram adquiridas junto à Shanghai Youlong Biotech Co., Ltd.;

[0052] As folhas de arroz com casca e larvas de terceiro instar de Cnaphalocrocis medinalis foram fornecidas pela Yangzhou Luyuan Bio-Chemical Co., Ltd.

[0053] Concretização 1 Teste de peptídeo inseticida

[0054] (1) Adicionar 20 μL de líquido de bactéria de biblioteca de anticorpos em fago humanizada a 200 mL de meio fluido de 2xTY-AG, cultivar o mesmo em uma temperatura constante de 37 °C até a OD600 ser 0,4, medir 50 mL do líquido de bactéria, adicionar 1x1012 pfu de fago auxiliar KM13 para superinfeção, incubar o líquido a 37 °C por 30 minutos, então centrifugar a mesma a 3.300 g por 10 minutos, descartar o sobrenadante, usar 100 mL de meio fluido de 2xTY-AKG para ressuspender o precipitado e cultivar o mesmo a 30 °C de um dia para o outro; centrifugar o mesmo a 3.300 g por 30 minutos até o próximo dia, coletar o sobrenadante, adicionar 20 mL de solução de PEG/NaCl, manter a mesma em banho frio por 1 hora, então centrifugar a mesma a 3.300 g por 30 minutos e ressuspender o precipitado por 4 mL de PBS; centrifugar a solução de ressuspensão a 11.600 g por 10 minutos. O sobrenadante é a biblioteca de anticorpo de fago amplificada;

[0055] (2) Usar a biblioteca de anticorpo de fago amplificada obtida na etapa 1 por quatro ciclos de Panning: O método de triagem é triagem positiva e negativa. O soro negativo é usado para triagem negativa e o anticorpo policlonal anti-Cry2Aa é usado para triagem positiva. Uma sequência de primeira triagem negativa então triagem positiva é adotada. O soro negativo é revestido no frasco de cultura de celular negativa. O anticorpo policlonal anti-Cry2Aa é revestido no frasco de cultura celular positiva. O método de eluição adota quatro ciclos de eluição competitiva:

[0056] O primeiro ciclo de triagem: Revestir 4 mL de soro negativo em concentração de 100 μg/mL e 4 mL de anticorpo policlonal anti-Cry2Aa em concentração de 100 μg/mL ao fundo do frasco de cultura de célula negativo e aquele do frasco de cultura de célula positivo respetivamente, manter os mesmos a 4 °C de um dia para o outro, lavar o frasco de cultura de célula negativo com PBS 3 vezes no próximo dia, adicionar 1 mL de biblioteca de anticorpo de fago amplificada obtida na etapa 1, e 4 mL de solução de MPBS a 3%, colocar o frasco em uma mesa oscilante, oscilar lentamente o mesmo em temperatura ambiente por 1 hora, deixar o mesmo repousar por 1 hora, lavar o frasco de cultura de célula positivo com PBS, sugar o líquido no frasco de cultura de célula negativo, que repousou por 1 hora, no interior do frasco de cultura de célula positivo, colocar o frasco em uma mesa oscilante, sacudir lentamente o mesmo em temperatura ambiente por 1 hora, deixar o mesmo repousar por 1 hora novamente, descartar o líquido no frasco de cultura de célula positivo, lavar o frasco positivo com 1 mL de PBST a 0,05% 10 vezes, adicionar 1 mL de tripsina em concentração de 10 mg/mL para eluir o anticorpo de fago ligado especificamente por 30 minutos. O eluente é o anticorpo de fago obtido no primeiro ciclo de Panning.

[0057] As concentrações do anticorpo policlonal anti-Cry2Aa submetido a panning nos segundo, terceiro e quarto ciclos e soro negativo são ainda 100 μg/mL, respetivamente. Todos os anticorpos em fago são os anticorpos em fago obtidos a partir do ciclo anterior de panning. O método de panning ainda adota a estratégia de triagem positiva e negativa adotada no primeiro ciclo. Diferente do primeiro ciclo, no segundo ciclo, o frasco positivo é lavado com solução de a PBST a 0,1% 10 vezes, 1 mL de tripsina em concentração de 10mg/mL é adicionado para executar a eluição competitiva por 1 hora; no terceiro e quatro ciclos, o frasco positivo é lavado com solução de PBST a 0,1% 20 vezes e então 500 μL de anticorpo policlonal de Cry2Aa em concentração de 100 μg/mL é adicionado para substituir tripsina para eluição competitiva, o tempo de eluição competitiva no terceiro ciclo é 1 hora, e o tempo de eluição competitiva no quarto ciclo é 30 minutos.

[0058] 10 μL do anticorpo de fago submetido a panning no quarto ciclo é usado para infetar 1 mL de bactérias TG1 em uma fase logarítmica. Após o mesmo ter sido incubado a 37 °C por 1 hora, o mesmo é revestido em um meio sólido de TYE-AG e cultivado a 37 °C de um dia para o outro; no próximo dia, colónias unitárias são captadas aleatoriamente, incubadas em uma placa de 96 poçopoços que contém 100 μL/poçopoço de meio fluido de 2xTY-AG e cultivada a 37°C de um dia para o outro; no próximo dia, 2 μL de líquido de bactéria é sugado da placa de poços, transferido para uma nova placa com 96 poços e incubada a 37 °C por 2 horas. 25 μL de fago auxiliar KM13 com titulador de 1012 é adicionado a cada poço, incubado a 30 °C por 2 horas, centrifugada a 1.800 g por 10 minutos, o precipitado é ressuspenso com 150 μL de meio fluido de 2xTY-AK e, então, cultivado a 30 °C de um dia para o outro. No próximo dia, o mesmo é centrifugado a 1.800 g por 30 minutos. O sobrenadante é coletado;

[0059] (3) 4μg/mL de anticorpo policlonal anti-Cry2Aa é medido e adicionado a uma placa com 96 poços, 100 μL/poço, e armazenado a 4 °C de um dia para o outro. No próximo dia, 100 μL do sobrenadante obtido na etapa 2 é adicionado a cada poço. 100 μL de meio fluido de 2xTY-AK é adicionado ao controle negativo. Os mesmos são mantidos em banho de água a 37 °C por 2 horas. Após a placa ser lavada com 250 μL/poço de PBST, 100 μL de IgG de cabra anti-M13 com HRP com diluição de 1: 5.000 é adicionado a cada poço e incubado a 37 °C por 2 horas. 100 μL de solução cromogênica de substrato é adicionada a cada poço e reage em temperatura ambiente por 10 a 20 minutos até que um azul apareça. Finalmente, 50 μL de H2SO2 em concentração de 2 mol/L é adicionado a cada poço para terminar rapidamente a reação. OD450 é determinada por ELIASA. Se a OD450 da solução/ OD450 de controle negativo for maior do que 2,1, a mesma será considerada positiva. O sobrenadante na etapa 2 correspondente a essa solução é o sobrenadante testado que contém o anticorpo de cadeia única de idiotipo antitoxina Cry2Aa, isto é, o sobrenadante do peptídeo inseticida.

[0060] A sequência de nucleotídeos do peptídeo inseticida testado determinada pelo método de sequenciamento de Sanger é SEQ ID NO.1, conforme mostrado abaixo: ccggcccttt ggcatgcaat ttctatttca ggagacagtc ataatgaaat acctattgcc 60 tacggcagcc gctggattgt tattactcgc ggcccagccg gccatggccg aggtgcagct 120 gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc 180 ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc cgccaggctc cagggaaggg 240 gctggagtgg gtctcaagta ttgattctta tggtactaat acagattacg cagactccgt 300 gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa 360 cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg aaagctttta attcttttga 420 ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcggt ggaggcggtt caggcggagg 480 tggcagcggc ggtggcgggt cgacggacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc 540 tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca agtcagagca ttagcagcta 600 tttaaattgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct atgctgcatc 660 cgctttgcaa agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac 720 tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact tactactgtc aacagtatag 780 ttctagtcct tctacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacggg cggccgcaca 840 tcatcatcac catcacgggg ccgcagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatgg 900 ggccgcatag actgttgaaa gttgtttagc aaaacctcat acagaaaatt catttactaa 960 cgtctggaaa gacgacaaaa ctttaaatcg ttacgctaac 1000

[0061] A sequência de aminoácidos do peptídeo inseticida testado determinada pelo método de sequenciamento de Sanger é SEQ ID NO.2, conforme mostrado abaixo: MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVR 60 H-CDR2 QAPGKGLEWVSSIDSYGTNTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK 120 H-CDR3 Link AFNSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS 180 L-CDRl L-CDR2 QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY 240 L-CDR3 His-tag YCQQYSSSPSTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA 288

[0062] O depositante denomina esse peptídeo inseticida como F2.

[0063] Concretização 2 Preparar cultura primária de F2

[0064] O sobrenadante obtido através da triagem na Concretização 1 e que contém o peptídeo inseticida é transferido para 10 mL de meio fluido de 2xTY- AG em uma razão de volume de 1: 100 e incubado a 37 °C por 2 horas. 100 μL de fago auxiliar KM13 com titulador de 1012 é adicionado para recuperação, incubado a 30 °C por 2 horas e centrifugado a 1.800 g por 10 minutos. O sobrenadante é removido. O meio fluido de 2xTY-AK é usado para ressuspender as bactérias precipitadas. O mesmo é cultivado enquanto é sacudido a 30 °C com 250 rpm de um dia para o outro. No próximo dia, o mesmo é centrifugado a 1.800 g por 30 minutos. Seu sobrenadante é o sobrenadante que contém a cultura primária de F2.

[0065] Concretização 3 Identificação de subtipo de F2

[0066] (1) Experimento de detecção por ELISA da inibição competitiva

[0067] O experimento adota 6 grupos experimentais e grupos de controle correspondentes. As soluções são preparadas com base na Tabela 1. Tabela 1 Preparação de soluções para experimento de detecção por ELISA de inibição competitiva

[0068] Na Tabela 1, F2 é o sobrenadante obtido na Concretização 2 e que contém a cultura primária de F2;

[0069] Adicionar 50 μL de anticorpo policlonal anti-Cry2Aaem concentração de 10 μg/mL às soluções preparadas na Tabela 1 respetivamente, incubar as mesmas a 37 °C por 2 horas, adicionar as mesmas a uma placa com 96 poços revestida com 2 μg/mL de toxina Cry2Aa respetivamente (a placa com 96 poços revestida 2 μg/mL de toxina Cry2Aa é obtida adicionando-se 2 μg /mL de toxina Cry2Aa a uma placa com 96 poços no dia anterior, 100 μL/poço e manter a 4 °C de um dia para o outro), reagir por 2 horas; lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de IgG de cabra anti-coelho com HRP com diluição de 1: 5.000, incubar em temperatura ambiente por 1 hora; lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de solução cromogênica de substrato, reagir em temperatura ambiente por 10 a 20 minutos até que um azul apareça e no fim adicionar 50 μL/poço de H2SO4 em concentração de 2 mol/L para terminar rapidamente a reação; determinar OD450 por ELISA.

[0070] Os resultados experimentais são conforme mostrado na Figura 1. A razão de inibição aumenta com o aumento de teor de F2. Os grupos de controle não têm o fenômeno de inibição competitiva, sugerindo que F2 é o anticorpo de cadeia única Anti-Id do tipo β e pode simular a toxina Cry2Aa para se ligar de forma competitiva ao anticorpo policlonal antitoxina Cry2Aa.

[0071] (2) Experimento de determinação biológica

[0072] O experimento tem grupo experimental 1, grupo experimental 2, grupo experimental 3, grupo de controle positivo, grupo de controle negativo 1, grupo de controle negativo 2 e grupo de controle negativo 3; sendo que o procedimento experimental é conforme a seguir:

[0073] (a) Bloqueio: Revestir 100 μL /poço de 5μg/mL BBMV em uma placa com 96 poços, manter a mesma a 4°C de um dia para o outro, lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, no próximo dia, adicionar 200 μL de BAS com uma razão de massa de 3% respectivamente, incubar em temperatura ambiente por 2 horas, e executar o bloqueio;

[0074] (b) Adição de amostra: Lavar a placa com 96 poços bloqueada na etapa 1 com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, e adicionar amostras à placa com 96 poços de acordo com a Tabela 2: Tabela 2 Preparação de Soluções para experimento de determinação biológica de F2

[0075] Na Tabela 2, F2 é o sobrenadante obtido na Concretização 2 e que contém a cultura primária de F2;

[0076] (c) Incubar a placa com 96 poços adicionada com a amostra na etapa b em temperatura ambiente por 2 horas, lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de anticorpo policlonal anti-Cry2Aa em concentração de 10 μg/mL, então lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de IgG de cabra anti-coelho com HRP com diluição de 1: 5.000 e incubar em temperatura ambiente por 1 hora; lavar a placa com 250 μL/poço de PBST 3 vezes, adicionar 100 μL/poço de solução cromogênica de substrato por poço, reagir em temperatura ambiente por 10 a 20 minutos até que um azul apareça e no fim adicionar 50 μL/poço de H2SO4 em concentração de 2 mol/L para terminar rapidamente a reação e determinar OD450 por ELISA.

[0077] O resultado experimental é conforme mostrado na Figura 2. Em comparação ao controle positivo, o peptídeo inseticida F2 (grupos experimentais 1, 2 e 3) pode inibir a ligação entre a toxina Cry2Aa e seu receptor BBMV; o controle negativo do tipo não “β” não tem o fenômeno de inibição, o que prova adicionalmente que F2 é do tipo “β”.

[0078] Concretização 4 Verificar a atividade inseticida do peptídeo inseticida F2

[0079] O experimento tem grupos experimentais e grupos de controle:

[0080] Os grupos experimentais usam o sobrenadante (F2) obtido na Concretização 2 e que contém a cultura primária de F2;

[0081] Os grupos de controle positivo adotam 0,2 g/L de toxina Cry1Ab (CK+);

[0082] Os grupos de controle negativo adotam Anti-Id ScFvs do tipo não “β” (CK-);

[0083] Procedimento Experimental:

[0084] Medir os grupos experimentais, grupos de controle positivo e grupos de controle negativo, cada um 10 mL, colocá-los em pratos de cultura esterilizados, adicionar 6 folhas de arroz com casca e 6 folhas de repolho respetivamente, embebe-las por 30 minutos, retirar as mesmas e secar as mesmas no ar; alimentar larvas de terceiro instar de Cnaphalocrocis medinalis e larvas de terceiro instar de Plutella xylostella com folhas secas.

[0085] O resultado experimental é conforme mostrado na Figura 3 e na Figura 4. A Figura 3 mostra a condição de morte das larvas de terceiro ínstar de Cnaphalocrocis medinalis respetivamente alimentadas com folhas de arroz com casca, que foram embebidas com os grupos experimentais (F2), grupos de controlo positivo (CK+) e grupos de controlo negativo (CK-). A Figura 4 mostra a condição de morte das larvas de terceiro ínstar de Plutella xylostella respetivamente alimentadas com folhas de repolho, que foram embebidas com o grupo experimental (F2), grupo de controlo positivo (CK+) e grupo de controlo negativo (CK-). Pode ser visto que o peptídeo inseticida F2 nos grupos experimentais tem um bom efeito inseticida.

Claims

1. Gene inseticida derivado de ser humano caracterizado por consistir na sequência nucleotídica de SEQ ID NO.1.

2. Peptídeo inseticida codificado pelo gene inseticida derivado de ser humano, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por consistir na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.2.

3. Vetor procariótico caracterizado por compreender o gene inseticida derivado de ser humano, conforme definido na reivindicação 1.

4. Uso do peptídeo inseticida, conforme definido na reivindicação 2, caracterizado por ser no controle de pragas agrícolas.