CN105131123B - 一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

通过生物信息学预测牛源化抗体重、轻链可变区的8个FR，并植入抗独特型单链抗体A12的6个CDR来确定牛源化改型抗体的序列，进行人工合成，从而构建A12的牛源化的改型抗体bovine‑A12‑PUC57，并通过替换易于噬菌体表达的PIT2载体，获得牛源化改型抗体bovine‑A12‑PIT2。ELISA分析表明牛源化改型抗体bovine‑A12‑PIT2与小菜蛾中肠BBMV具有一定的结合能力，生物活性验证表明其具有一定的杀虫活性。本发明利用生物信息学预测和人工合成的方法可快速高效的地获得动物来源的改型抗体（杀虫蛋白资源）。使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安全性高的杀虫蛋白资源的可能性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向。

Description

一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物农药领域，特别是一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用。

背景技术

来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)的Bt毒素蛋白是目前最为有效的抗虫资源，但经报道的新高效株系越来越少(Bravo et al., 2013；Bravo etal., 2011)而Bt毒素使用量增加使其在害虫抗药性及次生害虫上升等方面存在生态风险，这一现状促使高特异活性和新功能类的Bt毒素抗虫资源的积极开发(Bravo and Soberon,2008；Pigott et al., 2008)。因此，模拟Bt毒素杀虫蛋白的筛选，开发其它类型的杀虫蛋白，尤其是安全性更高的蛋白资源，是解决这些问题的有效途径之一。

独特型抗体（Anti- idiotypic antibody, Anti-Id）理论以及人源化的抗体库筛选技术可以获得具有模拟特定抗原（Bt Cry毒素）结构及功能的肽活性材料,目前所公开的模拟的Bt Cry毒素包括：Cry1Ab（公开号为CN103773774A的中国专利）、Cry 1B（公开号为CN103773775A的中国专利）、Cry 1C（公开号为CN103773776A的中国专利）、Cry 2A（公开号为CN104498501 A的中国专利），经过测鉴定，这些人源化的Cry毒素Anti-Id都具有一定的杀虫活性，由此可见，抗独特型抗体制备技术是开发新型杀虫蛋白的一个新途径。

抗体分子可以分为轻链（light chain）和重链（heavy chain）两部分，而轻链和重链又分别可以分为可变区（variable region, V区）和恒定区（constant region, C区）。抗体分子的恒定区是决定抗体分子结构中免疫原性的部位，而抗体的可变区则决定了抗体分子的特异性。轻链可变区（light chain variable，VL）或者重链可变区（heavy chainvariable，VH）都是由4个骨架区（framework region，FR）和3个互补决定区（complementarity determining region，CDR）交替排布连接而成。抗体V区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性（周光炎，2007）。将人源单链抗体的CDR移植至其他动物来源抗体可变区，替代其他动物来源抗体CDR，使其他动物来源抗体获得人源单链抗体的抗原结合特异性，扩展杀虫蛋白基因资源的来源谱系，类似的这种技术手段在医学研究上已见报道（Jones, et al., 1986；Irie et al., 1989；Sompuram et al., 1996；Wu et al., 1999；Hamann et al., 2002），这种改型抗体（reshaped antibody），也称CDR植入抗体（CDR grafting antibody），比嵌合抗体（chimeric antibody）更进了一步。

Cry1Ab毒素抗独特型单链抗体由于可模拟Cry毒素并与其竞争受体蛋白，将杀虫效果较好的抗独特型单链抗体CDR区取代到其他动物来源的单链抗体上相应的CDR区，穿插在各种来源抗体的8个FR之间，即在动物源抗体的基础上将动物源抗体CDR区基因替换为人源抗体CDR区基因，可快速获得多种动物来源的改型抗体，获得多种动物来源的杀虫蛋白资源，使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安全性高的杀虫蛋白资源的可能性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向，目前，上述抗虫基因分子改造的方法未见公开报道。

发明内容

为实现开拓多种动物来源的杀虫蛋白资源之目的，本发明提供一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用，该牛源改型抗体对小菜蛾（Plutella xylostella）具有较高的杀虫活性，本发明是这样实现的：

一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体的制备方法，具体步骤如下：

（a）由GenBank筛选牛源抗体，并分别对其VH和VL进行氨基酸序列比对分析，确定保守序列，再根据IMGT鉴定方法分别确定VH和VL的FR1、FR2、FR3 和FR4；

其中，VH和VL序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

（b）将人源化抗独特型单链抗体A12的6个CDR植入牛源抗体的相对应部分，再加上连接重、轻链的(GGGGS)₃ Linker，即获得牛源抗体，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

反向翻译所述牛源抗体氨基酸序列，并且在获得的核苷酸序列两端加上Nco I 、Not I 酶切位点及对应的碱基保护核酸序列，最终获得的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；将核苷酸序列SEQ ID No.5连接载体pUC57上，获得合成质粒bovine-A12-pUC57。

（c）利用Nco I 、Not I对合成质粒bovine-A12-pUC57进行双酶切，回收目的片段，利用T4 DNA连接酶将回收的目片段接到pIT2载体上，次日将连接产物转入TG1化学转化感受态细胞中，然后将转化菌涂布于TYE-AG平板，37℃培养过夜；次日随机挑取单克隆菌落至1mL 2×TY-A培养基中，于37°C，250 rpm摇床过夜培养，获得bovine-A12-pIT2菌液；

（d）以SEQ ID No.6和SEQ ID No.7为引物，以bovine-A12-pIT2菌液为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，所获得的920 bp的单一条带，即为所述牛源化改型抗体。

进一步，本发明所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体的制备方法，步骤（d）所述PCR扩增是指：

PCR扩增体系为：2× PCR Premix 10μl、10 μM的引物各1μl、bovine-A12-pIT2菌液2μl、ddH₂O补足至20μl；

PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 30 个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保持；

一种如本发明所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体核苷酸序列的原核载体。

一种如本发明所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体在农业虫害防治中的应用。

一种如本发明所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体的基因材料。

本发明通过生物信息学预测牛源化抗体重、轻链可变区的8个FR，并植入抗独特型单链抗体A12的6个CDR来确定牛源化改型抗体的列，进行人工合成，从而构建A12的牛源化的改型抗体bovine-A12-pUC57，并通过更换易于噬菌体表达的pIT2载体，获得与小菜蛾中肠BBMV具有结合活性的牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

（1）本发明利用生物信息学预测和人工合成的方法可快速高效的获得动物来源的改型抗体，获得多种动物来源的杀虫蛋白资源，使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安全性高的杀虫蛋白资源的可能性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向。

（2）本发明获得的牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2可变区的FR属于牛源，而CDR属于人源，也可称为人-牛嵌合抗体，因此将bovine-A12-pIT2应用于农业虫害防治时，对人体危害小。

（3）牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2与昆虫BBMV的亲和力同人源化抗体A12相当，也可替代Cry1Ab毒素用于生物防治，以防治害虫逐年增加的抗药性。

附图说明

图1为牛源抗体的VH结构。

图2为牛源抗体的VL结构。

图3是Cry1Ab毒素抗独特型单链抗体A12的氨基酸序列结构示意图。

图4 是合成的bovine-A12-pUC57质粒图谱；其中合成的基因部分长度733 bp，连接到pUC57载体而构成bovine-A12-pUC57质粒。

图5是NcoI 、Not I对bovine-A12-pUC57质粒双酶切的电泳图；其中，1、2为Nco I、Not I双酶切后的图谱，714 bp为切下的目的片段；3为完整的bovine-A12-pUC57质粒图谱；M为5000 bp的DNA ladder。

图6是pIT2载体图谱，其中包含Nco I 、Not I酶切位点。

图7 是牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2同小菜蛾BBMV结合的ELISA鉴定分析，其中A12为人源化抗体，CK-为阴性对照D5，“**”表示经单因素方差分析后数据间差异显著（P<0.01）。

具体实施方式

为方便理解本发明所述技术方案，以下结合附图和具体实施例做进一步阐述，下列实施例仅用于说明而非是对本发明权利要求范围的限制；下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。

实施例中所涉及的实验材料：

A12菌液制备方法为：依据公开号为CN103773774A专利实施例1制备获得的A12菌株（申请人自命名），与该实施例步骤（2）对应的单菌落（不同于该文献公开的B12），挑取该单菌落，加入 2×TY-AG液体培养基培养至平台期，菌液OD₄₅₀值为1.2；

D5菌液由江苏省农业科学院农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室提供，为含有非“β”类型的Anti-Id scFv，细菌处于生长平台期，菌液OD₄₅₀值为1.2；

噬菌体载体pIT2是提取A12质粒后，由Nco I 、Not I双酶切所得；

Nco I 、Not I酶、T4 DNA连接酶、辅助噬菌体M13K07均购于NEB公司；

PCR试剂购于东盛公司；

质粒提取试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒购于Axygen公司；

大肠杆菌TG1菌株购于英国Source BioScience公司；

TG1化学转化感受态细胞：按照J.莎姆布鲁克所著《分子克隆实验指南》（第三版）（黄培堂译，2005）所述方法制备；

HRP-Anti-M13标签抗体购于GE 公司；

Cry lAb毒素购于上海佑隆生物科技有限公司；

96孔酶标板(Costar 2592)购于美国Corning公司；

实施例涉及的培养基：

TYE培养基：在900 ml双蒸水中加入15.0 g琼脂糖，8 g NaCl，10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，用双蒸水定容到1 L，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用；

TYE-AG平板：在TYE培养基中加入终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素和质量比为1 %葡萄糖；

2×TY 液体培养基：在900 mL双蒸水中加入16 g胰蛋白胨，10 g酵母提取物和5 gNaCl，搅拌混匀，用双蒸水定容到1 L，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用；

2×TY-A培养基：在2×TY的培养基中加入终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素；

TY-甘油培养基：2×TY液体培养基中加入终浓度为的15%甘油；

2×TY-AKG培养基：在2×TY的培养基中加入终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml卡那霉素和质量比为1 %葡萄糖；

2×TY-AG培养基：在2×TY的培养基中加入终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素和质量比为1 %葡萄糖；

2×TY-AK培养基：在2×TY的培养基中加入终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素、50 μg/ml卡那霉素；

PBS：称取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KH2PO4 0.2 g，分别加入到蒸馏水中，充分溶解后，定容到1 L；

PBST：在PBS中加入体积比为0.05%的吐温-20；

3 % MPBS：PBS中加入质量比为3%的脱脂奶粉；

PEG/NaCl：称取20 g PEG 8 000，14.61 g NaCl，加80 ml去离子水，定容到100ml，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。

实施例涉及的引物SEQ ID No.6、SEQ ID No.7均由上海生工公司合成；

实施例涉及的改型抗体核酸序列SEQ ID No.5由南京金斯瑞公司合成，并连接到pUC57载体上，构成bovine-A12-pUC57质粒；

牛源改型抗体bovine-A12-pIT2测序由南京金斯瑞公司完成；

小菜蛾生物测定由江苏省农业科学院农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室完成。

实施例1 牛源化改型抗体序列的确定及合成

1.1参考Almagro等（2006）的方法并略加改进，牛源抗体的VH和VL序列从GenBank得到，分别利用关键词“Bos taurus immunoglobulin heavy chain variable ”（“牛源抗体重链可变区”，VH）和“Bos taurus immunoglobulin light chain variable”（“牛源抗体轻链可变区”VL）搜索“protein”（“蛋白”），结果VH搜到126个蛋白，VL搜到75个蛋白，分别对VH和VL进行氨基酸序列比对及分析，从而确定保守部分，并根据IMGT的鉴定方法（Lefrancet al., 2003）（Lefranc, M. P.; Pommie, C.; Ruiz, M.; Giudicelli, V.;Foulquier, E.; Truong, L.; Thouvenin-Contet, V.; Lefranc, G. IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27: 55-77.）从而确定VH和VL的FR1、FR2、FR3 和FR4，牛源抗体的VH和VL氨基酸序列结构SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2分别为如图1、图2所示。

1.2 依据公开号为CN103773774A专利实施例1公开的筛选方法，获得人源化抗独特型单链抗体，申请人将该抗体自命名为A12（不同于B12），挑取产生A12抗体的单菌落（即与该实施例1步骤（2）所对应的上清液），加入 2×TY-AG液体培养基培养至平台期，菌液OD₄₅₀值为1.2。

A12的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中下划线部分为CDR，其他为FR序列；

SEQ ID No.3：

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISTLGNLTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPSPEFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPNTFGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGPQTK

A12的具体结构如图3所示，图1中，H（重链）CDR1：48-57;CDR2：72-86;CDR3：121-127;L(轻链)CDR1：178-188;CDR2：204-210;CDR3：243-251。

将人源单链抗体A12的6个CDR植入牛源抗体的相对应部分，再加上连接重、轻链的(GGGGS)3 Linker即构建成功了牛源抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.4表示，其中下划线部分为CDR，其他为FR序列；

SEQ ID No.4：

QVQLRESGPILVKPSQTLSLTCTISGFTFSSYAMSWVRQAPGKALEWLGSISTLGNLTFYADSVRLSIAKDNSRSQVSLSVSSVTTEDTATYYCAKPSPEFDYWGQGLLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPSSVSGSLGQRVSITCRASQSISSYLNWFQQIPGSAPRTLIYAASSLQSGVPDRFSGSRSGNTATLTITSLQAEDEADYFCQQSYSTP NTFGSGTTLTVL

经过反向翻译并且在两端加上Nco I 、Not I 酶切位点及相对应保护碱基的核酸序列如SEQ ID No.5表示，Nco I酶切位点识别序列：CATGG；Not I 酶切位点识别序列：GCGGCCGC；首端下划线部分Nco I酶切位点及相对应保护碱基，尾部下划线部分Not I酶切位点及相对应保护碱基，其他部分碱基就是要合成牛源抗体的核酸序列：

SEQ ID No.5：

CATGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCGCGAAAGCGGCCCGATTCTGGTGAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCATTAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGCGCTGGAATGGCTGGGCAGCATTAGCACCCTGGGCAACCTGACCTTTTATGCGGATAGCGTGCGCCTGAGCATTGCGAAAGATAACAGCCGCAGCCAGGTGAGCCTGAGCGTGAGCAGCGTGACCACCGAAGATACCGCGACCTATTATTGCGCGAAACCGAGCCCGGAATTTGATTATTGGGGCCAGGGCCTGCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGCGGTGCTGACCCAGCCGAGCAGCGTGAGCGGCAGCCTGGGCCAGCGCGTGAGCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTAGCAGCTATCTGAACTGGTTTCAGCAGATTCCGGGCAGCGCGCCGCGCACCCTGATTTATGCGGCGAGCAGCCTGCAGAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCCGCAGCGGCAACACCGCGACCCTGACCATTACCAGCCTGCAGGCGGAAGATGAAGCGGATTATTTTTGCCAGCAGAGCTATAGCACCCCGAACACCTTTGGCAGCGGCACCACCCTGACCGTGCTGGCGGCCGCTAAACTAT

将SEQ ID No.5核酸序列送南京金斯瑞公司进行人工合成，所得到的片段连接到该公司的通用载体pUC57上，即为合成的bovine-A12-pUC57质粒。

实施例2 牛源化改型抗体的表达载体替换成pIT2

金斯瑞公司合成得到的核酸片段连接的载体是pUC57（图4），为了能在噬菌体展示通用的载体pIT2上表达，利用所设Nco I 、Not I的酶切位点对其进行双酶切，如图5所示，可见完整质粒被切成2个部分，将较小的714bp的目的片段，使用PCR产物凝胶回收试剂盒购进行回收，并用T4 DNA连接酶16 ^oC下连接过夜，连接载体是pIT2（如图6所示），次日获得连接产物；

取5 µl连接产物加入到100 µl TG1化学感受态细胞中，混匀，置于冰上放置30min；然后将混合物转移至42℃热击1 min，并迅速冰浴2 min；再向混合物中加入900 µl 2×TY液体培养基，37°C，200 rpm复苏1小时；然后将复苏产物均匀涂布于TYE-AG平板中，37°C过夜培养；

次日，随机挑取单克隆菌落至1 mL 2×TY-A培养基中，共挑取5个，37°C，250rpm过夜培养，制备成bovine-A12-pIT2菌液，此时细菌处于平台期，菌液OD₄₅₀值为1.2。将这5份菌液彻底混匀并分别分装成两部分，一部分用于PCR鉴定及测序，另一部分加甘油（终浓度为15%）混匀后于-80 ℃保存备用。

验证bovine-A12-pIT2菌液及测序所涉及的引物序列：

SEQ ID No.6 (LMB3-F): CAGGAAACAGCTATGAC;

SEQ ID No.7 (pHENseq-R): CTATGCGGCCCCATTCA;

其中，LMB3-F是扩增片段全长的上游引物，pHENseq-R是扩增片段全长的下游引物。分别以SEQ ID No.6 (LMB3-F)和SEQ ID No.7 (pHENseq-R)为引物，bovine-A12-pIT2菌液为模板扩增PCR ；

PCR扩增体系为：2× PCR Premix 10μl、10 μM的LMB3-F引物和pHENseq-R引物各1μl、bovine-A12-pIT2菌液2μl、ddH₂O补足至20μl；

PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 30 个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保持；

PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否为920 bp的单一产物，若是即可将对应的菌液或者质粒送南京金斯瑞公司测序。测序的结果经过氨基酸序列比对，所送的菌液序列同SEQ ID No.4完全一致，表明已准确的替换了表达载体，成功构建了bovine-A12-pIT2质粒。

实施例3 牛源化改型抗体的ELISA鉴定

3.1小菜蛾BBMV制备

参照Wolfersberger的实验方法（Wolfersberger，1987），使用Mg-EGTA沉降法制备小菜蛾中肠BBMV，具体做法为：取小菜蛾4龄末期幼虫，提取中肠，在预冷的0.15 M NaCl中清洗，每500只中肠加入3 mL匀浆缓冲液；3次反复匀浆冰浴后，取适量加入24 mM MgCl₂后涡旋混匀，冰浴并离心后将上清液转入新的高速离心管中再离心；弃上清后倒置离心管待液体流尽后，将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，分装后于-80℃贮存备用；BBMV蛋白浓度通过Bradford法测定。

3.2具有杀虫活性的牛源改型抗体的ELISA鉴定

取实施例2中处于平台期的牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2菌液、A12菌液（人源化对照）、D5菌液（阴性对照）各300 μL，分别加入到30 mL 2×TY-AG 培养基中，于250 rpm、37℃条件下振荡培养至OD₆₀₀=0.4 (约2 h)后，分别加入2×10¹¹ 辅助噬菌体M13K07，200rpm、37 ℃振荡培养1 h；于1800 g 条件下离心10 min，去上清液，用30 mL 2×TY-AK培养基重悬沉淀，200 rpm、30 ℃振荡培养过夜；次日于1800 g条件下离心10 min，分别加入7.5mL PEG/NaCl充分混匀后冰浴1 h；然后于3300 g 条件下离心30 min，弃上清，分别再用10mL PBS 重新悬浮沉淀，最后再于11600g 条件下离心10 min，分别取上清液。这样就有swine-A12-pIT2菌液、A12菌液（人源化对照）、D5菌液（阴性对照）3种表达上清液，作为牛源化改型样品用于后续样品检测及生物测定；

取30 ug/mL小菜蛾中肠BBMV包被96微孔板过夜，100μL /孔，次日每孔加入200μL3% MPBS溶液，37 ^oC静置孵育2 h进行封闭；每孔用250μL PBST洗板，然后加入100μL /孔的上清液（一抗），37 ^oC孵育2 h ；每孔用250μL PBST洗板，加入1:5000稀释的HRP-Anti-M13标签抗体，37 ^oC孵育1 h；PBST洗板后加入100μL /孔的四甲基联苯胺（ TMB）显色液，37 ^oC下反应10～20 min，最后加入浓度为2 M的H₂SO₄快速终止反应，并用Thermo全自动酶标仪，测定OD₄₅₀值。

本实施例测定具有杀虫活性的牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2的OD₄₅₀值，检测结果如图7所示，图7中A12为人源化对照，CK-为阴性对照D5，牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2的OD₄₅₀值略低于人源化的A12，但经单因素方差分析表明二者之间无明显差异，但都显著高于阴性对照D5。可见牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2同小菜蛾中场BBMV的结合能力同人源化的A12基本相当，初步推测其具有杀虫活性。

实施例4 牛源化改型抗体对小菜蛾的生物测定

将新鲜甘蓝叶片分别放入10mL实施例3制备的牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2表达上清液中，浸渍10 s后取出晾干；人源化对照为实施例3制备的A12表达上清液，阴性对照为实施例3制备的D5表达上清液，空白对照为清水。

将处理后的甘蓝叶片分别放入垫有滤纸的培养皿，每皿接入30头已饥饿4 h的小菜蛾3龄幼虫，然后置培养皿于温度为25±1 ^oC，相对湿度65±5 %，光周期L: D = 14: 10的培养箱内饲养。24、48、72 h后分别观察、记录死亡虫数，并于每次观察后更换新的处理叶或对照叶继续饲养直到实验结束。取出幼虫检查时以小毛笔轻触虫体，无明显反应者为死亡。各处理使用30头3龄幼虫，每处理3次重复。试虫死亡率采用Abbott公式对死亡率进行校正，并以平均数±标准误表示（3 次重复试验）。

校正死亡率＝（处理死亡率－对照死亡率）／（1－对照死亡率）×100％

各处理时间相同时各个样品之间的比较采用单因素方差分析（One －way ANOVA）和Tukey 显著性检验，使用SPSS软件进行数据处理，处理结果如表1所示：

表1 牛源化改型抗体对小菜蛾的杀虫效果

注：表中各列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.01）。

由表1可见，经过24 、48、72 h的处理，牛源化杀虫蛋白bovine-A12-pIT2跟人源化A12杀虫效果无明显差异，但是杀虫效果都显著的高于阴性对照的D5（CK-）， 所以牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2具有显著的杀虫活性，且与小菜蛾BBMV具有较高亲和力。

由上述实施例可见，这种在动物源抗体的基础上将动物源抗体CDR区基因替换为人源抗体CDR区基因的抗体改造方法，可快速获得多种动物来源的改型抗体。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用

<130> 7

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 82

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ile Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

20 25 30

Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Arg Leu Ser Ile Ala Lys Asp Asn Ser

35 40 45

Arg Ser Gln Val Ser Leu Ser Val Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr

50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Trp Gly Gln Gly Leu Leu Val Thr Val

65 70 75 80

Ser Ser

<210> 2

<211> 79

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys Trp Phe Gln Gln Ile Pro Gly Ser Ala Pro

20 25 30

Arg Thr Leu Ile Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser

35 40 45

Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Ala Glu Asp Glu

50 55 60

Ala Asp Tyr Phe Cys Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu

65 70 75

<210> 3

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Thr Leu Gly Asn Leu Thr

65 70 75 80

Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

85 90 95

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Ser Pro Glu Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His Gly

260 265 270

Pro Gln Thr Lys

275

<210> 4

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ile Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Ser Ile Ser Thr Leu Gly Asn Leu Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Leu Ser Ile Ala Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Ser Leu Ser

65 70 75 80

Val Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys

85 90 95

Pro Ser Pro Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Leu Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly

130 135 140

Gln Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

145 150 155 160

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Ile Pro Gly Ser Ala Pro Arg Thr Leu Ile

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Ala

195 200 205

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn

210 215 220

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu

225 230 235

<210> 5

<211> 733

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

catgccatgg cccaggtgca gctgcgcgaa agcggcccga ttctggtgaa accgagccag 60

accctgagcc tgacctgcac cattagcggc tttaccttta gcagctatgc gatgagctgg 120

gtgcgccagg cgccgggcaa agcgctggaa tggctgggca gcattagcac cctgggcaac 180

ctgacctttt atgcggatag cgtgcgcctg agcattgcga aagataacag ccgcagccag 240

gtgagcctga gcgtgagcag cgtgaccacc gaagataccg cgacctatta ttgcgcgaaa 300

ccgagcccgg aatttgatta ttggggccag ggcctgctgg tgaccgtgag cagcggcggc 360

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcc aggcggtgct gacccagccg 420

agcagcgtga gcggcagcct gggccagcgc gtgagcatta cctgccgcgc gagccagagc 480

attagcagct atctgaactg gtttcagcag attccgggca gcgcgccgcg caccctgatt 540

tatgcggcga gcagcctgca gagcggcgtg ccggatcgct ttagcggcag ccgcagcggc 600

aacaccgcga ccctgaccat taccagcctg caggcggaag atgaagcgga ttatttttgc 660

cagcagagct atagcacccc gaacaccttt ggcagcggca ccaccctgac cgtgctggcg 720

gccgctaaac tat 733

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

caggaaacag ctatgac 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctatgcggcc ccattca 17

Claims (3)

1.一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种含如权利要求1中所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体核苷酸序列的原核载体。

3.如权利要求1所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体在农业虫害防治中的应用；所述农业虫害为小菜蛾虫害。