CN105777899B - 抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体及产生该抗体的细胞株、制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体及其制备方法，即将保藏号为CCTCC NO:C201658的杂交瘤细胞株2C11接种于预先用石蜡油处理过的小鼠体内，以体内诱生法制备腹水，收集后以Protein G柱纯化腹水，即获得所述单克隆抗体；该抗体与Bt Cry1Ac毒素无交叉反应，可用于特异性检测Bt Cry1Ab毒素。

Description

抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体及产生该抗体的细胞株、制备方 法与应用

技术领域

本发明涉及一株保藏号为CCTCC NO: C201658杂交瘤细胞2C11及其分泌的单克隆抗体与应用，特别是该单克隆抗体在Bt Cry1Ab毒素特异性检测中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

Cry1Ab毒素是由苏云金芽胞杆菌(Bt)在孢子形成阶段产生的一种杀虫蛋白，对鳞翅目和鞘翅目类昆虫幼虫灭杀效果。其作用机理为：当Cry1Ab毒素被敏感昆虫幼虫摄取后，在碱性环境及中肠蛋白酶的作用下裂解为65 KD大小的活性蛋白，并与肠道细胞中的特定的受体结合，导致孔隙的形成和中肠上皮细胞的裂解，最终导致幼虫死亡。另一方面，由于哺乳动物体内缺乏Bt Cry1Ab毒素蛋白的受体，所以Bt Cry1Ab毒素被认为对人类和家畜是无毒的。目前，Bt Cry1Ab毒素基因已被广泛引入转基因作物中,包含Bt Cry1Ab基因的转基因作物，如水稻、棉花、大豆和玉米等的种植面积在全球范围内逐年增加。转Bt Cry1Ab毒素基因抗虫作物的不断出现并得到大面积的推广，产生了极其显著的经济、社会和生态效益，但其对生态安全的风险以及对人类和其它哺乳类动物的安全隐患也逐渐受到关注。目前，转Bt Cry1Ab毒素基因的作物种类愈来愈多，带来的政府安全监管和食品加工企业原料管控的技术制约愈来愈明显，尤其是当针对一些转基因食物中基因检测不能取得满意效果的时候，对毒素表达产物安全筛查检测就显的尤为迫切。

目前针对转基因产品中毒素蛋白的检测方法主要是集中在核酸和蛋白质分析领域，基于DNA-PCR的技术的检测方法由于具有高度的敏感性，成为目前使用最为广泛的Bt基因检测技术，然而，PCR方法需要由经验丰富的实验人员操作特定的仪器，不仅耗时而且不适用于现场快速检测。另一方面，基于蛋白质的检测方法，酶联免疫吸附测定试验(ELISA)克服了前者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、适用于现场批量检测等优点，已应用于食品、医疗等多个领域。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性结合反应和抗原、抗体上的标记物的生物、物理或活性放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，而抗体的特异性、灵敏度等直接影响检测结果，由于Bt Cry1Ab和Bt Cry1Ac毒素蛋白非常相似，现有技术制备的单克隆抗体无法将二者两个区分开（U. Walschus, S. Witt, C.Wittmann, Development of monoclonal antibodies against Cry1Ab protein fromBacillus thuringiensis and their application in an ELISA for detection oftransgenic Bt-maize, Food Agric. Immunol. 14 (2002) 231-240.），目前市场上使用的Bt Cry1Ab ELISA检测试剂盒实际上是Bt Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒，因此提供一种BtCry1Ab毒素特异性检测抗体，实现对Bt Cry1Ab毒素特异性ELISA检测，已成为本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一株保藏号为CCTCC NO: C201658杂交瘤细胞2C11，其分泌的单克隆抗体可针对Bt Cry1Ab毒素进行特异性检测，特异性强，操作步骤简单，本发明是这样实现的：

一种抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC C201658的杂交瘤细胞分泌产生的；其轻链可变区具有序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；重链可变区具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，该单克隆抗体可特异性识别Bt Cry1Ab毒素，且与Bt Cry1Ac毒素无交叉反应活性。

进一步，本发明所述的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体，制备方法如下：将保藏号为CCTCC C201658的杂交瘤细胞接种于预先用石蜡油处理过的小鼠体内，以体内诱生法制备腹水，收集后以Protein G柱纯化腹水，即获得浓度为0.6 mg/mL的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体。

进一步，如本发明所述的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体在检测Bt Cry1Ab毒素中的应用。

进一步，本发明还提供一株杂交瘤细胞株2C11，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO: C201658，保藏时间为2016年3月22日。

本发明根据Bt Cry1Ab和Bt Cry1Ac毒素蛋白三维结构上的差异，设计了一种特异性抗原多肽，将其与载体蛋白KLH偶联后，免疫BALB/c小鼠，成功获得了针对Bt Cry1Ab毒素检测用的特异性单克隆抗体，其保藏号为CCTCC NO: C201658；实验表明，浓度为0.6 mg/mL的该抗体稀释128000倍后，对Bt Cry1Ab毒素的OD₄₅₀值仍然高于1.0，具有较高效价，该抗体与Bt Cry1Ac毒素无交叉反应，可用于特异性检测Bt Cry1Ab毒素。

附图说明

图1为选定肽段的抗原性和亲水性分析结果示意图；

图2为Bt Cry1Ab，Cry1Ac及选定肽段的三维结构模型示意图；

图3为单克隆抗体2C11 间接ELISA检测结果示意图。

图4 为Bt Cry1Ab毒素双抗夹心ELISA标准曲线

图5为金标垫结构示意图。

图6为金标垫检测结果示意图。

具体实施方式

实施例中涉及溶液的制备方法：

（1）磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）：

NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，KH₂PO₄0.2 g，加蒸馏水定容至1L；

（2）洗涤液（PBST）：含有0.05%Tween-20的PBS；

（3）封闭液（MPBS）：含有3%脱脂奶粉的PBS；

（4）柠檬酸盐缓冲液（CPBS，底物缓冲液，pH 5.5）：

C₆H₇O₈（柠檬酸）21 g，Na₂HPO₄·12H₂O 71.6 g，加蒸馏水定容至1L；

（5）底物：10 mg/mL的TMB和25 μL 0.65%H₂O₂溶于9.875 mL CPBS中，现配现用；

（6）四甲基联苯胺（TMB）母液：

称取10 mg四甲基联苯胺溶于1 mL二甲基亚砜，4 ℃保存；

（7）终止液（2 M H₂SO₄）：

取11.8 mL 98%的浓硫酸（18 M）溶于80 mL蒸馏水，冷却后定容到100 mL；

（8）碳酸盐缓冲液（CBS）：

Na₂CO₃ 1.59 g；NaHCO₃ 2.93 g，定容到1 L；

实施例中所涉及的试剂：

弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂均购于Sigma公司；

Bt Cry1Ab和Bt Cry1Ac标准毒素购自上海佑隆生物科技有限公司；

实施例中所涉及的氨基酸序列：

SEQ ID NO.1: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKSNELWLHHL；

SEQ ID NO.2: MALEVQLQQSGAELVRSGASVKMSCTASGYKFISYNIHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGVTDYNQSFKGKATLTADTFSSTAYMQITSLTSEDSAVYFCAREDYRYDEGFDYWGPGTTLTVSS；

SEQ ID NO.3: SGTVDSLDEIPPQNNNVPPR；

SEQ ID NO.4: CSGTVDSLDEIPPQNNNVPPR。

实施例1：杂交瘤细胞株2C11的制备

具体步骤如下：

（1）在GenBank数据库中检索到Bt Cry1Ab和Bt Cry1Ac的氨基酸序列；

（2）利用DNAStar软件找出Bt Cry1Ab和Bt Cry1Ac序列中抗原性和亲水性较强的部分，肽段的抗原性和亲水性分析结果如图1所示；

（3）利用SWISS-MODEL网站构建Bt Cry1Ab和Bt Cry1Ac毒素的三维结构模型，用Swiss-PdbViewer 4.1.0软件对三维结构模型进行分析，找出两种毒素三维结构不同的区域；

（4）将二级抗原性和亲水性分析结果及三维结构分析结果进行综合比较，选择BtCry1Ab中抗原性和亲水性较强、空间构象与Bt Cry1Ac不同的一个多肽片段为最有可能产生特异性Bt Cry1Ab抗体的抗原多肽，做为免疫半抗原，该肽段三维结构如图2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；将该序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，为了与载体蛋白KLH偶联，在肽链的一端添加Cys残基，合成肽段序列如SEQ ID NO.4所示；

（5）免疫原制备，以血蓝蛋白（KLH）为载体蛋白，采用MBS法合成免疫原，具体步骤如下：称取5 mg KLH-NH₂溶于1 mL 0.1mM的PBS中，然后加入终浓度为1 mM的Sulfo-MB，4℃下反应2 h；再过G25 Sephadex凝胶过滤层析柱进行脱盐去除多余的交联剂；

接着将脱盐处理后的KLH-NH₂和等摩尔数的多肽SEQ ID NO.4混合，于4 ℃反应2h后，然后在4 ℃温度下，置于PBS溶液中透析72 h，透析期间每隔4-6 h换液一次，即获得免疫原，然后分装，于-20 ℃冻存备用；

（6）杂交瘤细胞株的制备：利用步骤（5）获得的免疫原免疫8周龄左右BALB/c雌性小鼠3只，首次免疫时，将浓度为1 mg/mL的免疫原和弗式完全佐剂按体积比1:1比例混合后，以腹腔注射的方式免疫小鼠，免疫剂量为100 μg/只；以后每隔两周加强免疫一次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂与免疫原混合，第四次免疫结束后一周采血测效价，效价达到理想值（血清稀释10000倍且OD₄₅₀值大于1.0）时，再按照常规杂交瘤融合技术（参见吴建祥等，“稻瘟病菌单克隆抗体的研制及其对附着胞形成的影晌”微生物学报,2000,40 (6): 638-645）与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，采用间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆，并用有限稀释法连续克隆2-3次，得到一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，申请人将其自命名为杂交瘤细胞2C11。

所述间接ELISA法步骤如下：

①包被：用包被液CBS将包被原Bt Cry1Ab和Bt Cry1Ac稀释成4 μg/mL的浓度，分别加入到96孔酶标板内，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；

②封闭：PBST洗板三次，加入3%的MPBS，250 μL/孔，置37℃温箱中孵育2 h；

③加培养上清：PBST洗板三次，吸取待检测细胞孔的培养上清100 μL，加入到96孔酶标板内，置37 °C温箱中孵育1 h，同时设阴性血清和阳性血清（1/2000加样）及无细胞孔培养上清对照；

④加酶标二抗：PBST洗板三次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（购自KPL公司，工作浓度1/5000，稀释液为MPBS），每孔100 μL，置37 ℃温箱中孵育1 h；

⑤显色：PBST洗板四次，加底物（TMB-过氧化氢脲），每孔100 μL，37 ℃温箱中孵育15 min；

⑥终止：加2M H₂SO₄，每孔50 μL；

⑦结果判定：用酶标仪测定OD₄₅₀值，P/N≥2.1的孔判为阳性孔。

申请人将获得的杂交瘤细胞株2C11保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type CultureCollection，CCTCC)，地址：湖北省武汉市武汉大学；邮编430072；保藏编号CCTCC NO: C201658,保藏日期保藏日期2016年3月22日。

实施例2：抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体的制备纯化及灵敏度检测

1、制备抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体

（1）向8周龄左右BALB/c雌性小鼠体内接种实施例1获得的杂交瘤细胞株2C11，利用体内诱生法制备腹水，具体步骤如下：

将生长良好的杂交瘤细胞2C11轻轻吹洗下来，离心收集，用RPMI-1640基础培养液重悬计数，细胞数量控制在1～2×10⁶个/mL范围内，腹腔注射已提前用石蜡油预处理过的小鼠，每株细胞注射2只小鼠，每只小鼠0.5 mL。密切观察小鼠的健康状况和腹水征象，约10天左右，小鼠腹部开始膨大，待腹水尽可能多时，拉颈处死小鼠，剖腹吸取腹水。

将收集的腹水在4 ℃下5000 rpm 离心10 m in，除去脂肪及血细胞等，在离心后的腹水中加等量甘油，于-20°C冰箱保存。

（2）将步骤（1）获得的腹水用Protein G柱进行纯化，纯化步骤按说明书操作，获得浓度为0.6 mg/mL的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体。该抗体的重链氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体灵敏度检测

抗体灵敏度的测定：采用间接ELISA法进行测定。

包被原采用Bt Cry1Ab和Bt Cry1Ac毒素，浓度为4 μg/mL；

抗体为上述步骤1（2）中获得的浓度为0.6 mg/mL抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体，将抗体分别依次以PBS缓冲液稀释8000倍、16000倍、32000倍、64000倍、128000倍；

具体检测步骤如下：

①包被：将抗原Bt Cry1Ab和Bt Cry1Ac毒素蛋白分别包被于96孔酶标板中，100μL/孔，4°C包被过夜；

②封闭：PBST洗板三次，加入3%的MPBS，250μL/孔，置37 ℃温箱中孵育2 h；

③加抗体：PBST洗板三次，分别按100 μL/孔加入稀释后不同浓度的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体，同时以PBS代替单克隆抗体作为阴性对照；

④加酶标二抗：PBST洗板三次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（购自KPL公司，用MPBS按照1：5000的比例稀释），每孔100 μL，置37 ℃温箱中孵育1 h；

⑤显色：PBST洗板四次，加底物（TMB-过氧化氢脲），每孔100 μL，37 ℃温箱中孵育15 min；

⑥终止：加2 M H₂SO₄，每孔50 μL；

⑦结果判定：用酶标仪测定OD₄₅₀值；

单克隆抗体效价测定结果如图3所示，由图3可见，阴性对照值均小于0.1，当抗体稀释128000倍时，对Bt Cry1Ab的OD₄₅₀仍然高于1.0，表明单克隆抗体的效价较高，且与BtCry1Ac无交叉反应活性，可以应用于Bt Cry1Ab毒素的特异性检测。

实施例3：酶标抗Bt Cry1Ab毒素多克隆抗体的制备

具体步骤如下：

（1）抗Bt Cry1Ab毒素多克隆抗体的制备

用Bt Cry1Ab毒素免疫新西兰大白兔2只，首次免疫时，将浓度为1 mg/mL的免疫原和弗式完全佐剂按体积比1:1比例混合后，以背部多点注射方式进行免疫，免疫剂量为500μg/只；以后每隔两周加强免疫一次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂与免疫原混合，第三次免疫结束后一周采血测效价，效价达到理想值（血清稀释10000倍且OD₄₅₀值大于1.0）时，耳静脉注射未添加弗氏佐剂的Bt Cry1Ab毒素500 μg进行冲击免疫，随后心脏取全血，4 ℃放置过夜，次日离心取血清，抗血清经饱和硫酸铵沉淀纯化后，存于-20 ℃，用于后续HRP标记。

（2）抗Bt Cry1Ab多克隆抗体的HRP标记

① 称取5 mg HRP溶于1 mL蒸馏水中，于上清中加入0.2 mL新配置的0.1 M NaIO₄溶液，室温下避光反应20 min。

② 将上述溶液装入透析袋中，4 ℃条件下，1 mM pH 4.4醋酸钠缓冲液中透析过夜。同时，抗体用0.01 M pH 9.5碳酸盐缓冲液透析过夜。

③ 向透析过夜的上述溶液中加入20 μL 0.2 M pH 9.5碳酸盐缓冲液，使醛化HRP的pH升高为9.0-9.5，然后立即加入10 mg透析后的IgG（在1 mL 0.01 M碳酸盐缓冲液中）。室温避光搅拌2 h后加入0.1 mL新配的4 mg/mL NaBH₄，混匀，4 ℃放置2 h。

④ 将上述溶液装入透析袋中，0.15 M pH 7.4 PBS透析过夜。

⑤ 在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃放置1 h。

⑥ 3000 rpm离心30 min，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵溶液洗两次，最后沉淀溶于0.15 M PBS中。

⑦ 最后在0.15 M pH 7.4的PB中透析，去除铵离子即得酶标抗体，即获得浓度为2mg/mL的酶标抗Bt Cry1Ab毒素多克隆抗体。

实施例4抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体在检测Bt Cry1Ab毒素中的应用

（1） ELISA方法：将杂交瘤细胞株2C11分泌的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体用于BtCry1Ab毒素的添加回收试验。具体包括以下步骤：

①包被：将实施例2获得的0.6 mg/mL的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体用PBS缓冲液稀释16000倍后，包被于96-孔酶标板，100 μL/孔，4 ℃包被过夜，使形成固相抗体；

②封闭：PBST洗板三次，加入3%的MPBS，250 μL/孔，置37 ℃温箱中孵育2 h；

③加抗原：PBST洗板三次后，分别加入浓度为1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL的Bt Cry1Ab标准溶液（CBS缓冲液配制），100 μL/孔，孵育1 h，使抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物；

④加酶标抗体：PBST洗板三次，除去其他未结合物质，加入实施例3获得的酶标抗Bt Cry1Ab多克隆抗体（浓度为2 mg/mL，使用时用PBS按1：5000稀释），100μL/孔，孵育1 h，使形成固相抗体待测抗原-酶标抗体夹心复合物，洗涤除去未结合的酶标抗体；

⑤显色：PBST洗板四次，加底物（TMB-过氧化氢脲），每孔100 μL，37 ℃温箱中孵育5 min；

⑥终止：加2 M H₂SO₄，每孔50 μL；

⑦结果判定：用酶标仪测定OD₄₅₀值；

⑧绘制标准曲线，如图4所示；

⑨添加回收试验：称取粉碎后的水稻叶片（1 g/份）置于10 mL离心管中，分别向其中添加1，0.5，0.1 μg/g的标准Bt Cry1Ab毒素。样品室温下震荡10 min后置于4 ℃冰箱中静置过夜。第二天，向样品中加入1 mL含0.05%吐温-20的CBS缓冲液，室温下震荡提取2 h。随后，混合物3000 rpm离心10 min，上清液用CBS稀释10倍后直接用于双抗夹心ELISA检测。结果表明，水稻叶片样品中的添加回收率依次为108.6%，107.2%和109.3%。

（2）免疫层析试纸条：将杂交瘤细胞株2C11分泌的抗Bt Cry1Ab毒素特异性单克隆抗体用于制备快速检测Bt Cry1Ab毒素的高灵敏度免疫层析试纸条。

①将1.0 mg/mL的羊抗鼠二抗与2.0 mg/mL的Bt Cry1Ab毒素兔多克隆抗体划线于硝酸纤维素膜上，间隔为5 mm，速度为1.0 μL/cm，分别得到质控线和检测线，放置于37 ℃条件下干燥1 h后，放于27 ℃培养箱中待用；

②吸水垫的制备：将吸水垫裁剪成长17 mm宽4 mm的规格，即得吸水垫。

③样品垫的制备：将纤维素膜裁剪成长17 mm宽4 mm的规格，放入封闭液A中浸湿，取出，放置于37 ℃条件下干燥过夜，得到样品垫，然后置于27 ℃培养箱中保存；

所述封闭液A为： 0.01 mol/L pH7.4 PBS + 2% BSA + 2.5% 蔗糖 + 0.02%NaN3。

④金标垫的制备：将玻璃纤维膜裁剪成长8 mm宽4 mm的规格，放入封闭液B中浸湿，取出，放置于37 ℃条件下干燥过夜，得到金标垫，在处理好的金标垫上将纳米金标记好的抗Bt Cry1Ab毒素特异性单克隆抗体点到膜上，每厘米金标垫所需纳米金标记的抗BtCry1Ab毒素特异性单克隆抗体为700 ng，真空冷冻干燥5 h后置于27 ℃培养箱中保存；

所述封闭液B为：0.01 mol/L pH 7.4 PBS + 0.25% BSA + 5%Sucrose + 0.25%PVP。

所述的纳米金标记的抗Bt Cry1Ab毒素特异性单克隆抗体溶液制备：取10 mL质量浓度为0.01%的纳米金溶液，加80 μL 0.1 mol/L K₂CO₃溶液，然后缓慢加入340 μL 0.6 mg/mL的抗Bt Cry1Ab毒素特异性单克隆抗体溶液，室温标记30 min，加入1 mL 10%BSA溶液，继续室温放置30 min后，1500 rpm离心15 min，吸出上请，弃沉淀，再以12000 rpm离心35min,弃上清，沉淀用标记洗涤保存液重悬至原体积后，再次以12000 rpm离心35 min，弃上清，沉淀用1 mL标记洗涤保存液重悬，得到的金标抗体置于4 ℃冰箱备用；

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为30 nm；

所述的0.1 mol/L K₂CO₃溶液为：13.8 g K₂CO₃溶于超纯水中定容至1 L，用时0.22μm滤膜过滤；所述的0.6 mg/mL的抗Bt Cry1Ab毒素特异性单克隆抗体溶液为10 mMTris透析后所得；所述10%BSA溶液为10 g BSA溶解于100 mL超纯水，过0.22 μm滤膜所得；所述的标记洗涤保存液为：0.1 g硼酸、2.0 g PEG20000、0.2 g NaN₃，溶于超纯水中，待完全溶解后，用超纯水定容至1 L，0.22 μm滤膜过滤所得；

试纸条的组装：在背板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交替连接，交替长度约为1 mm，即得快速检测Bt Cry1Ab毒素的高灵敏免疫层析试纸条，见图5的 A（正面图）和图 5的 B（侧面图）。

上述快速检测Bt Cry1Ab毒素的高灵敏免疫层析试纸条的应用：

称取粉碎后的水稻叶片（1 g/份）置于10 mL离心管中，分别向其中添加5和2 μg/g的标准Bt Cry1Ab毒素和500 μg/g的标准Bt Cry1Ac毒素。样品室温下震荡10 min后置于4℃冰箱中静置过夜。第二天，向样品中加入1 mL含0.05%吐温-20的CBS缓冲液，室温下震荡提取2 h。随后，混合物3000 rpm离心10 min，上清液用CBS稀释10倍后用于试纸条测定（终浓度为0.5 和0.2 μg/mL Bt Cry1Ab毒素及50 μg/mL Bt Cry1Ac毒素）。将高灵敏检测层析试纸条的样品垫插入100 μL Bt Cry1Ab样品溶液中，作为检测试纸条，同时，取另两个高灵敏检测层析试纸条分别插入100 μL Bt Cry1Ac样品溶液和100 μL空白样品溶液中作为对照试纸条，5-6 min读取结果。

检测结果：1号检测试纸条的质控线和检测线均显色，判定为阳性结果，表明待测样品中含有Bt Cry1Ab毒素，见图6的 A；2号检测试纸条的质控线和检测线均显色，判定为阳性结果，表明待测样品中含有Bt Cry1Ab毒素，见图6的 B；3号检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线未显色，待测样品中不含有Bt Cry1Ab毒素，也证明与Bt Cry1Ac毒素无交叉反应活性，见图6的 C；4号检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线未显色，待测样品中不含有Bt Cry1Ab毒素见图6的 D。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体及产生该抗

体的细胞株、制备方法与应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Ser Asn Glu Leu

100 105 110

Trp Leu His His Leu

115

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Ala Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

1 5 10 15

Ser Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Lys Phe

20 25 30

Ile Ser Tyr Asn Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Val Thr Asp Tyr Asn

50 55 60

Gln Ser Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Phe Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ala Tyr Met Gln Ile Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

85 90 95

Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Arg Tyr Asp Glu Gly Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Pro Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn

1 5 10 15

Val Pro Pro Arg

20

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Cys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn

1 5 10 15

Asn Val Pro Pro Arg

20

Claims (4)

1.一种抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC NO: C201658的杂交瘤细胞株2C11分泌产生的。

2.根据权利要求1所述的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：将保藏号为CCTCC NO: C201658的杂交瘤细胞株2C11接种于预先用石蜡油处理过的小鼠体内，以体内诱生法制备腹水，收集后以Protein G柱纯化腹水，即获得浓度为0.6 mg/mL的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体在检测Bt Cry1Ab毒素中的应用。

4.一株保藏号为CCTCC NO: C201658的杂交瘤细胞株2C11。

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