CN111454969B

CN111454969B - 带有双标签猪细小病毒全长感染性克隆制备方法及应用

Info

Publication number: CN111454969B
Application number: CN201910825513.9A
Authority: CN
Inventors: 童德文; 黄勇; 陈松彪; 苗碧琛
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2039-09-02
Also published as: CN111454969A

Abstract

本发明提供了一种带有His和Flag双标签的猪细小病毒(PPV)全长感染性克隆的制备方法，包括如下步骤：1)以PPV DNA为模板，分别使用序列如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4所示引物扩增，再将所得扩增产物为模板，以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示引物进行融合PCR扩增，得F3片段；2)将pKQLL‑T质粒经Stu I和SnaB I产生平末端切口的限制性内切酶线性化质粒，再将F3片段与其连接，得重组质粒；3)使用限制性内切酶BamH I和Xba I双酶切重组质粒，回收带有His和Flag双标签的PP PPV全长片段；4)将带有His和Flag双标签的PPV全长片段转染动物细胞，即可。本发明的方法能够成功产生高滴度的PPV，可用于抗猪细小病毒药物的筛选，具有良好的应用前景。

Description

带有双标签猪细小病毒全长感染性克隆制备方法及应用

技术领域

本发明属于猪细小病毒领域，具体涉及携带双标签的猪细小病毒全长感染性克隆的构建及其在抗病毒药物筛选中的应用。

背景技术

猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)属于细小病毒科细小病毒属，其基因组为单股负链DNA病毒，长度约为5.0kb，基因组编码两个开放性阅读框ORF1和ORF2，编码三个非结构蛋白NS1、NS2和NS3，二个结构蛋白VP1和VP2。ORF两侧为别为5’端和3’端发夹结构的非编码区，另外在3’非编码区末端含有有个多聚腺苷酸(polyA)。

猪细小病毒是引起母猪繁殖障碍重要病原之一，主要引起初孕母猪流产、死胎和木乃伊胎等，给全球养猪业造成巨大的经济损失。其传播途径主要经生殖道传播感染。自1965年在德国慕尼黑由Anton Mary在经典猪瘟病毒培养物中首次分离，在以后几年里这个病毒被发现与生殖异常有关，并且呈全球分布。PPV在猪场中分离率较高，常常和猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV2)等混合感染，市场上目前防控PPV的疫苗主要是灭活疫苗，而灭活疫苗存在着接种剂量大、免疫期短、免疫途径单一，并且灭活疫苗不能较好的诱导粘膜免疫等缺点，并且PPV毒株变异较快，目前已经发现PPV血清型7。针对严肃的现状，广大的科学工作者以PPV为研究对象，从病毒的生物学特性、致病机制、诊断试剂以及预防疫苗等方面的研究做了大量的工作。但是，目前仍然缺乏行之有效的方法来阻断PPV的感染。因此，继续开展对病毒分子生物学特性、复制机制以及致病机理等，将有助于人类对PPV更深入的研究，从而为设计有效的治疗药物、准确的诊断方法和试剂以及预防疫苗提供理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种带有双标签的猪细小病毒全长感染性克隆及其制备方法。

本发明的技术方案包括：

一种带有His和Flag双标签的猪细小病毒全长感染性克隆的制备方法，包括如下步骤：

1)以猪细小病毒DNA为模板，分别使用序列如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4所示引物扩增，再将所得扩增产物为模板，以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示引物进行融合PCR扩增，得F3片段；

2)将pKQLL-T质粒经Stu I和SnaB I产生平末端切口的限制性内切酶线性化质粒，再将F3片段与其连接，得重组质粒；

3)使用限制性内切酶BamH I和Xba I双酶切重组质粒，回收带有His和Flag双标签的猪细小病毒全长片段；

4)将带有His和Flag双标签的猪细小病毒全长片段转染动物细胞，即可；

步骤2)所述的pKQLL-T质粒是通过人工合成猪细小病毒基因组两末端的回文序列，在两末端序列之间通过Stu I和SnaB I平末端连接，并在5′末端和3′末端引入BamHI和XbaI酶切位点，然后连接至低拷贝质粒pKQLL上构建得到。

如前述的制备方法，步骤2)中限制性内切酶线性化质粒与F3片段的摩尔比是2∶1。

如前述的制备方法，步骤4)的转染方法是PEI法。

前述任一所述方法制备得到的带有His和Flag双标签的猪细小病毒全长感染性克隆。

前述带有His和Flag双标签的猪细小病毒全长感染性克隆在抗病毒药物筛选中的用途。

本发明具有如下有益效果：

额外添加标签序列通常会降低病毒滴度，而本发明的方法能够成功产生带有双标签的高滴度(与亲本病毒相当)的猪细小病毒，利于纯化和检测，可用于抗猪细小病毒药物的筛选。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是病毒诱导细胞病变的显微观察图；A，正常PK-15细胞；B，亲本PPV毒株感染后的PK-15细胞；C，本发明带His、Flag双标签的PPV感染后的PK-15细胞。

图2是电泳鉴定图。

图3是Flag标签免疫荧光图。

图4是His标签免疫荧光图。

图5是Flag标签Western blot检测图。

图6是His标签Western blot检测图。

图7是PPV衣壳蛋白3C9的Western blot检测图。

图8是亲本PPV毒株和带双标签PPV感染PK-15细胞后的DNA拷贝数检验(A)和TCID50检验(B)图。

图9是LiCl对PK-15细胞最大药物安全浓度测试图。

图10是不同浓度LiCl处理下PPV DNA拷贝数的检测图。

注：图中出现PPV和D-PPV的平行对比时，PPV指亲本PPV毒株，而D-PPV指本发明带His、Flag双标签的PPV。

具体实施方式

实施例1带有His和Flag双标签的PPV全长感染性克隆质粒的构建和鉴定

1.PPV的DNA提取

取500μl的病毒悬液三冻三融，12000rpm离心5min，取437.5μl离心上清，加入50μl10％的SDS和12.5μl的蛋白酶K，55℃消化30min，参照酚氯仿法提取病毒DNA。

2.带有His和Flag标签的中间序列扩增

将PPV中间序列基因组分成两个部分(分别命名为F1和F2)。设计扩增F1片段和F2片段的PCR扩增引物。

上游引物F1(SEQ ID NO.1)：

5′-AAAAAAGAGGCGGGAAAAAAAGAGG-3′；

下游引物R1(SEQ ID NO.2)：

5′-ATCCATCCTACCTTAATGGTGATGGTGATGATGGCCACCGGTGGCTTCAAGGTTTGTTGTGGGTGC-3′；

上游引物F2(SEQ ID NO.3)：

5′-CACCATCACCATTAAGGTAGGATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGTGGCGCGCCTCCTGCAAAAA-3′；

下游引物R2(SEQ ID NO.4)：

5′-TGTTTTTTGGGGATAATTGGTATACAG-3′。

以上述步骤1中的DNA为模板，应用高保真酶分别以上游引物F1和下游引物F1扩增F1片段，以上游引物F2和下游引物F2扩增F2片段。使用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收F1和F2基因片段，以F1和F2为模板，以F1/R2引物扩增进行融合PCR，构建F1+F2融合片段F3，并将F3片段连接至pMD-18T载体进行测序，保存备用。

前述F3片段是PPV全长基因组中的非两末端发夹结构的中间序列。

3.带有His和Flag标签的全长感染性克隆构建

将pKQLL-T质粒经Stu I和SnaB I产生平末端切口的限制性内切酶线性化质粒，应用无缝连接试剂盒(TAKARA，中国)按照2：1的摩尔比将线性化pKQLL-T质粒、F3片段进行37℃连接30min，转化大肠杆菌stab3感受态中，涂布含卡那霉素浓度为50μg/ml的LB固体平板，静置过夜培养，次日提取单克隆进行PCR和酶切鉴定，将鉴定正确的阳性克隆送至公司进行测序。测序正确后命名pKQLL-PPV。

前述pKQLL-T质粒是由华大基因公司合成。pKQLL-T质粒是通过人工合成PPV基因组两末端的回文序列，在两末端序列之间通过Stu I和SnaB I平末端连接，再在5′末端和3′末端引入BamH I和Xba I酶切位点，然后连接至低拷贝质粒pKQLL(华大基因)上构建的。

实施例2带有His和Flag双标签的PPV全长感染性克隆质粒D-PPV病毒拯救

质粒大量提取试剂盒提取质粒(pKQLL-PPV)并测定质粒浓度。用限制性内切酶BamH I和Xba I双酶切重组质粒(pKQLL-PPV)，获得线性化PPV全长DNA片段(携带His、Flag双标签，全长5102bp)，核酸胶回收试剂盒回收酶切后的质粒。将PK-15细胞培养于含10％FBS的DMEM培养液中，转染前1d均匀铺于24孔板，每孔约5×10⁴个。铺板24h后，按照PEI转染试剂盒操作说明，将线性化PPV全长DNA片段转染PK-15细胞，具体转染方法如下：

(1)将DNA质粒(即线性化PPV全长DNA片段)溶于50μL无血清无抗生素的

Medium培养液中，轻轻混匀，并在室温下孵育5min；(2)将适量PEI转染试剂(主要功能成分为阳离子聚合物聚乙烯亚胺)溶于50μL无血清无抗生素的

Medium培养液中，混匀并在室温下孵育5min；(3)将步骤(1)、(2)所得两种混合物混合(总体积100μL，体积比1∶1)，轻轻混匀，在室温下孵育20min(不能出现雾状沉淀)；(4)上述操作同时，将待转染PK15细胞用PBS清洗两次，在每孔(24孔板)中加入100μL无血清无抗生素的

Medium培养液，待DNA质粒/PEI复合物混合20min后，立即加入待转染细胞对应孔中，并混匀，然后将细胞于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，约4h后更换为含2％FBS的DMEM细胞培养液，继续培养，并定期用显微镜观察细胞生长情况。

转染后2～3d收取细胞转入15mL离心管中，反复冻融3次裂解细胞，短暂离心后收集上清，将上清继续传代至正常(未转染)PK15细胞，如此反复盲传几代，并不断观察细胞病变效应，收集细胞上清进行鉴定。

由图1可以看出，与对照组(图1A)相比，拯救出的病毒(图1C)能诱导出与亲本毒株(YL，图1B)一致的PPV典型拉丝状细胞病变。

实施例3重组拯救病毒鉴定

1.PCR鉴定

鉴定引物：

上游引物F5(SEQ ID NO.5)：5′-CAACAATGGCTAGCTATATGCA-3′；

下游引物F6(SEQ ID NO.6)：5′-CTAGTGCGACCATTAAGCTTGC-3′。

以DNA质粒(即线性化PPV全长DNA片段)转染细胞后，连续传代，待细胞出现明显的细胞病变效应后收集细胞培养物。提取细胞DNA，以设计的鉴定引物扩增出大小约1500bp的片段(图2)。

2.其它方法鉴定

进一步应用His和Flag标签抗体进行间接免疫荧光(图3，图4)以及Western-blot检测均能检测到阳性信号(图5，图6)，同时应用PPV衣壳蛋白3C9抗体同样能检测到特异性目的条带(图7)，上述结果表明成功构建出含His和Flag标签的PPV全长感染性克隆。

实施例4带有His和Flag标签的PPV全长感染性克隆的生物学特性检测

在六孔细胞培养板的各孔中分别接种3×10⁵/孔PK-15细胞过夜培养，待细胞密度长至80％左右，换做无血清无双抗的DMEM培养基，按照1MOI的细胞感染量接种亲本毒株PPV和带双标签的拯救病毒，在接种后12h，24h和36h收集细胞，检测病毒感染不同时间点细胞培养液中PPV的DNA拷贝数。结果显示在病毒感染不同时间点产生具有相似的DNA拷贝数和TCID₅₀(图8)，实验结果初步表明拯救病毒和亲本毒株具有相似的生物学特性。

实施例5一种带有His和Flag标签的PPV全长感染性克隆在制备抗病毒药物筛选中的应用

1.LiCl对PK-15细胞的毒性分析：在96孔细胞培养板中接种1×10⁴/孔PK-15细胞过夜培养，待细胞密度达到80％-90％，吸弃孔中的细胞培养基，换做含不同浓度LiCl(0，10，20，30，40，50mM)的2％的DMEM维持培养基，培养48h后，按照10μl/孔加入MTT试剂继续培养孵育4h，然后加入Formazan溶解液，继续培养4h，在570nm下测定吸光值，计算LiCl对PK-15细胞的最大药物安全浓度。实验结果表明：当LiCl浓度不超过40mM时，为LiCl对PK-15细胞的最大药物安全浓度(图9)。因此后续试验中，LiCl的使用浓度为0，10，20，30，40mM。

2.LiCl对带有His和Flag标签的PPV的抑制作用：在96孔细胞培养板中接种1×10⁴/孔PK-15细胞过夜培养，待细胞密度达到80％-90％，吸弃孔中的细胞培养基，换成无血清无双抗的DMEM，按照1MOI的量接种带有His和Flag标签的PPV，37℃吸附1h；吸附完毕后将各个孔病毒液弃去，分别加入含不同浓度LiCl的2％血清的DMEM(已经报道(Chen Y，Yan H，Zheng H，Shi Y，Sun L，Wang C，Sun J：Antiviral effect of lithium chloride oninfection of cells by porcine parvovirus.Archives of virology 2015，160(4)：1015-1020.)对PPV复制有抑制作用)100μl，于37℃5％CO₂条件下培养24h，收集不同药物浓度组的细胞培养液，提取细胞DNA，应用实时荧光定量PCR检测PPV的DNA拷贝数。研究结果发现随着LiCl浓度的逐渐增加，其抑制PPV复制的能力逐渐增强，表明LiCl与PPV抑制关系呈浓度依赖性(图10)。本实验结果表明：本发明所构建的D-PPV能够用于抗PPV药物筛选研究。

综上，本发明的方法能够成功产生带有双标签的高滴度猪细小病毒，易于纯化和检测，便于用作抗猪细小病毒药物的筛选。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北农林科技大学

<120> 带有双标签猪细小病毒全长感染性克隆制备方法及应用

<130> GYKH1408-2019P017629CC

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

aaaaaagagg cgggaaaaaa agagg 25

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atccatccta ccttaatggt gatggtgatg atggccaccg gtggcttcaa ggtttgttgt 60

gggtgc 66

<210> 3

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

caccatcacc attaaggtag gatggattac aaggatgacg acgataaggg tggcgcgcct 60

cctgcaaaaa 70

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

tgttttttgg ggataattgg tatacag 27

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

caacaatggc tagctatatg ca 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ctagtgcgac cattaagctt gc 22

Claims

1.一种带有His和Flag双标签的猪细小病毒全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)将pKQLL-T质粒经StuI和SnaBI产生平末端切口的限制性内切酶线性化质粒，再将F3片段与其连接，得重组质粒；限制性内切酶线性化质粒与F3片段的摩尔比是2∶1；

3)使用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切重组质粒，回收带有His和Flag双标签的猪细小病毒全长片段；

步骤2)所述的pKQLL-T质粒是通过如下方法制备：合成猪细小病毒基因组两末端的回文序列，在两末端序列之间通过StuI和SnaBI平末端连接，并在5′末端和3′末端引入BamHI和XbaI酶切位点，然后连接至低拷贝质粒pKQLL上构建得到。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)的转染方法是PEI法。

3.权利要求1或2所述方法制备得到的带有His和Flag双标签的猪细小病毒全长感染性克隆。

4.权利要求3所述带有His和Flag双标签的猪细小病毒全长感染性克隆在抗病毒药物筛选中的用途。