CN107012170A - 一种番鸭细小病毒感染性克隆的构建及拯救方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)感染性克隆的构建和拯救方法。该方法是将MDPV的完整基因组克隆入载体质粒pBSKN，获得重组质粒；将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫番鸭胚，重组质粒在番鸭胚中得到拯救；所述pBSKN载体，是将商品化质粒pBluescript II(SK)多克隆位点原有的EcoRV酶切位点用NcoI位点替换而得到。产生的感染性病毒可致死番鸭胚，拯救病毒与亲本病毒对雏番鸭具有相近的致死率。该拯救方法操作简便高效，避免了转染原代细胞带来的繁琐和低效问题，在MDPV反向遗传学研究和疫苗创制上具有潜在应用价值。

Description

一种番鸭细小病毒感染性克隆的构建及拯救方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种MDPV感染性质粒克隆的构建以及转染番鸭胚拯救病毒的方法。

背景技术

番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)主要感染3周龄内雏番鸭，感染番鸭表现以腹泻、软脚和喘气为主要特征的临床症状，俗称番鸭“三周病”。发病率可达27％～62％，死亡率在22％～43％之间，病愈鸭大部分成为僵鸭。该病是番鸭养殖业上的重要疫病之一，国内雏番鸭细小病毒病的报道最早始于1985年，法国1990年报道该疫病的存在。

番鸭细小病毒属于细小病毒科依赖细小病毒属，其基因组为一条线性的单股DNA,以相等的极性存在病毒粒子中。两侧翼为457个碱基组成的末端倒置重复序列(ITR)，ITR与病毒基因组的复制、剪切、拯救等特性密切相关。基因组左侧阅读框编码病毒的非结构蛋白Rep，依据不同的剪接方式可生成为Rep1等4种不同的Rep蛋白，Rep蛋白通过与ITR结合参与基因组DNA的复制以及调控下游P41启动子。基因组右侧阅读框编码衣壳蛋白Cap，依据起始密码子不同和翻译后的蛋白裂解可分别生成VP1、VP2、VP3三个蛋白，三个蛋白氨基端不同、羧基端一致，以大约1:1:8的比例共同组成病毒的衣壳。

自上世纪80年代后期开始，由番鸭细小病毒引起的番鸭“三周病”开始在我国很多番鸭养殖区流行。到目前为止，有关MDPV的完整基因组序列仍很有限，目前报道序列多集中于内部编码蛋白。本实验室于2000年从浙江省的发病番鸭体内分离到一株MDPV,定名为YY株。在人工感染试验中，将含有YY株的新鲜尿囊液颈部皮下接种2日龄番鸭，番鸭死亡率可达62.5％。

反向遗传技术是开展病毒研究的一种有用平台，在阐明病毒致病机制和疫苗研制中能够发挥重要作用。同样，构建MDPV感染性分子克隆，以此为基础可以对MDPV的特定基因展开更为有效的研究，对MDPV弱毒疫苗株的研制也提供了一个有用平台。

病毒拯救是反向遗传操作上的重要一环，大多是将构建的质粒或RNA转录产物转染细胞的途径来实现拯救目的。对于细小病毒而言，细胞处于分裂期时才最适于病毒复制，因此转染时细胞所处状态对转染拯救结果影响很大，同时每次转染时制备原代细胞也颇费时间。因此，若能建立一种简便、高效的拯救方法，将极大的方便并推动MDPV相关基础研究的深入开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)感染性质粒的构建方法，以及简便高效的拯救方法。

本发明所述的MDPV感染性克隆质粒的拯救方法，是将MDPV完整基因组克隆入载体质粒pBSKN，获得重组质粒，将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫番鸭胚，重组质粒在番鸭胚中得到拯救；所述pBSKN载体，是将商品化质粒pBluescriptII(SK)多克隆位点上原有的EcoRV酶切位点用NcoI位点替换而得到。

具体地：将重组质粒与转染试剂Lipofectamine 2000按照一定比例1:2.5(μg/μl)混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种11日龄非免疫番鸭胚。番鸭胚在接种后7～11天死亡，胚体具有典型的MDPV感染特征，表现为胚体出血、绒毛尿囊膜水肿的典型特征。拯救出的病毒具有与亲本病毒YY株相近的致病性。

进一步地，为了排除转染拯救过程中亲本MDPV毒株污染的可能，可通过overlapPCR方法，在重组质粒的克隆基因组内部引入1个同义碱基突变作为遗传标记，得到的带有遗传标记的重组质粒再施以转染及拯救过程。更具体地，可以是在重组质粒的VP1基因中引入1个突变碱基作为遗传标记。

本发明中，所述的重组质粒是插入MDPVYY株完整基因组pYY质粒，或者是插入MDPVYY株完整基因组并引入遗传标记的pYYΔ质粒。但是，本发明的拯救方法适用于但不仅限于插入MDPV YY株完整基因组的pYY质粒或pYYΔ质粒。对其它MDPV分离株，以本发明内容公开的相同构建方法克隆其全基因组，获得重组质粒，重组质粒的拯救方法同pYY质粒或pYYΔ质粒。

本发明所述的质粒pYY，它的构建方法在于：超速离心浓缩MDPVYY株病毒，提取病毒基因组单链DNA，体外退火后生成双股DNA。用NcoI酶切基因组DNA生成两个亚基因组片段，分别克隆入自行改造的pBSKN载体的相应酶切位点，在Sure株大肠杆菌感受态细胞中增殖。再通过酶切-连接的常规分子操作，拼接获得含有完整基因组的质粒pYY。

进一步地，通过overlap PCR方法，在pYY质粒的VP1基因中引入1个同义突变碱基作为遗传标记，获得质粒pYYΔ。

本发明中所述相近的致病性是指在雏番鸭感染试验中，拯救病毒具有与亲本病毒相近的死亡率。

本发明公开了YY株的完整基因组序列。YY株基因组由5075个核苷酸组成(SEQ IBNO.7)。YY株ITR由428个核苷酸组成，5′ITR和3′ITR具有一致的序列。该回文结构的茎部由342个核苷酸组成，通过碱基互补形成171个碱基对，45个核苷酸组成Bubble区。ITR内侧为D或D′区，由41个核苷酸组成。

作为一个具体的操作，本发明公开了一种MDPV全基因组克隆的构建方法，该方法对其它MDPV毒株同样适用，它包括如下步骤：

(1)MDPV核酸的提取

MDPV YY株在番鸭胚中增殖，收集的尿囊液分别经差速和超速离心浓缩到原有体积的1/60。采用SDS-蛋白酶K消化法提取病毒核酸。经95℃变性10min，缓慢冷却至65℃退火，使单股DNA形成双股DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，可观察到约5.1kb基因组DNA。

(2)全基因组克隆的构建

将体外退火的MDPVYY株基因组双股DNA用限制性内切酶NcoI酶切，产生两个亚基因组片段。将0.7kb基因组左片段插入质粒载体pBSKN的HincII-NcoI之间，产生质粒pBSKN-L。4.4kb基因组右片段插入质粒载体pBSKN的NcoI-SmaI之间，产生质粒pBSKN-R。pBSKNB-L质粒和pBSKN-R质粒分别用XhoI和NcoI进行双酶切，分别回收0.7kb和7.3kb片段，体外进行连接，连接产物转化Sure感受态细胞(Agilent,Santa Clara,USA)，最终产生包含YY株全基因组的克隆质粒pYY。

本发明还公开了pYY质粒中遗传标记引入的方法，以便于将拯救病毒与亲本病毒YY株区分开(见附图7)。

在pYY质粒的VP1基因中引入1个突变碱基作为遗传标记，不改变氨基酸组成，获得质粒pYYΔ。利用YY株基因组内部在拟突变位点两侧分别存在单一BglII和KpnI位点，设计了一组overlap PCR引物，引物代号和序列分别为：

MP1:5′GTCCGGAGCCTGAGAG 3′(SEQ IB NO.1)

MP2：5′GCAGGTAGATATTCTGTTCTGCCA 3′(SEQ IB NO.2)

MP3:5′TGGCAGAACAGAATATCTACCTGC 3′(SEQ IB NO.3)

MP4:5′ATACCTAATCAGCCTATC 3′(SEQ IB NO.4)

酶切位点用单下划线标示，单个突变碱基用双下划线标示，碱基由T突变为C，突变后产生1个新的EcoRV位点，但不改变氨基酸组成。

MP1引物和MP4引物内部分别含有BglII和KpnI位点。通过overlap PCR,结合酶切连接操作，能够将1个突变碱基引入pYY质粒，获得质粒pYYΔ。

本发明还公开了pYYΔ质粒通过绒毛尿囊膜转染番鸭胚拯救病毒的具体方法：

采用Lipofectamine 2000作为转染试剂。质粒和转染试剂的比例按照1：2.5(μg：μl)进行。吸取16μg pYYΔ质粒溶液至1个灭菌的1.5ml离心管中，用Opti-DMEM培养液(Invitrogen，美国)稀释至1ml；另一个离心管内加入40μl Lipofectamine 2000转染试剂，加入960μl Opti-DMEM培养液混匀。将稀释后的质粒和转染试剂静置5min后，轻柔混匀，室温静置20min后即可进行转染。每只番鸭胚接种0.25ml质粒-转染试剂混合物于绒毛尿囊膜上,其中包含了2.0μg质粒。番鸭胚在接种后第6天开始出现死亡，至转染后第9天，死亡率达到83％。拯救病毒在番鸭胚上能够成功传代。

本发明对拯救病毒的致病性进行了测定。结果表明：以拯救病毒的新鲜尿囊液颈部皮下接种2日龄雏番鸭，死亡率达到56％，不死雏番鸭生长明显慢于对照组，表明拯救病毒具有与亲本病毒YY株相当的致病力。本发明建立的拯救方法操作简便高效，避免了转染原代细胞带来的繁琐和低效问题，在MDPV反向遗传学研究和疫苗创制上具有潜在应用价值。

附图说明

图1.MDPV YY株基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳分析。M.1kb DNA分子量markers；1.基因组DNA退火后形成的5.1kb双股DNA分子。

图2.MDPV YY株感染性克隆pYY的构建策略

图3.pYY质粒示意图

图4.pYY质粒的酶切鉴定.M:1kb DNA markers；1:NcoI酶切产生单一的8.0-kbDNA条带.2:XhoI和BamHI双酶切产生3.0kb载体分子和 5.0kb MDPV基因组分子。

图5.pYYΔ转染11日龄番鸭胚，胚胎在第6天开始出现死亡，至转染后第10天死亡率达到83％，而转染pBSKN质粒的对照鹅胚全部存活。

图6.pYYΔ转染番鸭胚后胚胎死亡的病理变化，表现为胚体、头部、肢端出血(A),而转染pBSKN对照质粒的番鸭胚发育正常(B)。

图7.pYY-2Δ质粒转染拯救病毒与亲本病毒的区分。拯救病毒的1.4kb扩增片段能够为EcoRV酶切成0.4kb和1.0kb两条带，而亲本病毒的1.4kb扩增产物不能为EcoRV所切开。

图8.拯救病毒与亲本病毒序列的比较。拯救病毒与亲本病毒株YY具有一致的序列，除了在拯救病毒中引入的作为遗传标记的唯一碱基突变(T→C).

具体实施方式

为更好地理解本发明，以下结合具体生物材料及参数对本发明进一步说明，不是对本发明的进一步限定。

实施例

1.MDPV全基因组克隆pYY的构建

1.1.病毒扩增

将保存的MDPVYY株(Archives of Virology,2016,161:2589-2594)种毒用灭菌生理盐水做1:10稀释，加入青、链霉素至终浓度各2000μg或2000IU/ml，置37℃培养箱中孵育30min后接种12日龄非免疫番鸭胚，每只0.2ml。石蜡封口后放入37℃孵化箱中，每隔8h照蛋1次，剔除48h前死亡的鹅胚。收集48小时后死亡番鸭胚，置于4℃冰箱放置4～6h后无菌收取尿囊液，储存在-40℃冰箱，备用。

1.2.病毒纯化

将收集到的300ml病毒尿囊液按11,000g离心20min，取上清后加入1/3体积的氯仿，剧烈震荡，以同样的离心力转速再次离心20min，收集上层水相再经150,000g离心力超速离心3h(SW32Ti转子,Beckman)。弃去上清，病毒沉淀用5ml TE缓冲液(50mM Tris，20mMEDTA，pH 8.0)溶解，-70℃保存待用。

1.3病毒DNA提取

取500μl浓缩病毒液，分别加入10％SDS和蛋白酶K至终浓度为1％和400μg/ml。45℃水浴2小时。用苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)和氯仿-异戊醇(24:1)各抽提1次。上清液加入2.5倍体积的无水乙醇和十分之一体积的醋酸钠(pH 5.2)，-70℃沉淀过夜。次日15,000rpm/min，离心20min，去上清，核酸沉淀用70％酒精洗涤，再次15,000rpm/min，离心8min，去上清，沉淀凉干后，用30μL STE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，100mM NaCL，pH 8.0)溶解。将提取的核酸置于95℃水浴10min，使单股DNA发生热变性，然后缓慢冷却到65℃，此时单股DNA可退火形成双链。取10μL经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析DNA，见附图1。

1.4基因组克隆

为了便于克隆，我们对pBluescriptII(SK)质粒(Agilent公司，美国)的酶切位点进行了改造，将质粒上原有的EcoRV酶切位点用NcoI位点替换，改造后的质粒命名为pBSKN。该质粒的蓝白斑筛选特性保持不变。

MDPV在724位碱基处存在单一的NcoI位点。MDPV的dsDNA用NcoI酶切，酶切产物电泳分离后，切胶回收目的胶块，用胶回收试剂盒纯化目的片段。将0.7kb基因组左片段插入质粒载体pBSKN的HincII-NcoI之间，产生质粒pBSKN-L。4.4kb右片段插入质粒载体pBSKN的NcoI-SmaI之间，产生质粒pBSKN-R,构建策略见附图2。pBSKNB-L质粒和pBSKN-R质粒分别用XhoI和NcoI进行双酶切，分别回收0.7kb和7.3kb片段，体外进行连接，连接产物转化Sure感受态细胞(Agilent,Santa Clara,USA)，最终产生包含YY株全基因组的克隆质粒pYY，见附图3。

pYY质粒的酶切鉴定。NcoI酶切产生单一的8.0-kb DNA条带，用XhoI和BamHI双酶切产生3.0kb载体分子和5.0kb MDPV基因组分子，见附图4。

1.5基因组序列分析

将构建的pBSKN-L和pBSKN-R阳性克隆送商业化公司(苏州金唯智)进行测序。由于ITR形成的高级结构会干扰测序反应，利用ITR loop区天然存在的SphI位点，对pBSKN-L和pBSKN-R质粒，分别用SphI+BamHI或者SphI+XhoI进行双酶切，生成的亚片段将包含半个ITR。将含有一半ITR序列的亚片段克隆进pUC19或者pBSK质粒的相应位点，对重组克隆进行测序后将获得一致的ITR序列。

利用DNASTAR软件包中的SeqMan II程序对所测序列进行拼接，获得完整的基因组序列，并提交GenBank。(登录号KX000918)。

序列分析结果表明，YY株基因组由5075个核苷酸组成。YY株ITR由428个核苷酸组成，5′ITR和3′ITR具有一致的序列。该回文结构的茎部由342个核苷酸组成，通过碱基互补形成171个碱基对，45个核苷酸组成bubble区。ITR内侧为D或D′区，由41个核苷酸组成。

1.6pYY质粒的转染拯救

1.6.1pYY质粒纯化

挑取pYY克隆单个菌落，接种于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃震荡培养16～24h。采用高纯度质粒纯化试剂盒提取质粒，具体操作按照其说明书进行，质粒用超纯水溶解。采用Nanodrop 2000核酸测定仪，检测质粒浓度和纯度，确保OD260/280在1.8-2.0之间。

1.6.2质粒-转染试剂混合物的配制

转染混合物的配制参照Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen,Carlsbad,USA)说明书进行。质粒和转染试剂的比例按照1:2.5(μg:μL)进行。取16μg纯化的质粒溶液至1个灭菌的指形管中，用Opti-DMEM培养液(Invitrogen)稀释至1mL；另一个离心管内加入40μl Lipofectamine 2000转染试剂，加入960μL opti-DMEM培养液混匀。将稀释后的质粒和转染试剂静置5min后，轻柔混匀，室温静置20min后即可进行转染

1.6.3转染番鸭胚

上述配制好的转染试剂，分别经绒毛尿囊膜途径接种11日龄番鸭，每只番鸭胚接种0.25mL,其中包含2.0μg质粒。同时将质粒载体pBSKN转染番鸭胚作为对照。石蜡封口后放入孵化箱内继续孵育，每隔8h照胚1次，弃去48小时内死亡番鸭胚。收集转染48小时后死亡番鸭胚的尿囊液，-70冻存。

结果表明，pYY质粒转染11日龄番鸭胚，转染后第7天胚体开始死亡，至13天死亡率达到100％。收集尿囊液-70℃冻存。检查胚体病变，可见胚体、头部、肢端出血，绒毛尿囊膜水肿等特征性病变。

1.6.4拯救病毒的传代

将第1代的拯救病毒用灭菌生理盐水做1:50稀释，接种12日龄番鸭胚，收集死亡番鸭胚尿囊液，观察胚体病变。如此传至第4代，-70℃保存备用。

1.7拯救病毒中遗传标记的引入

为了排除拯救病毒可能来自于转染或传代过程中亲本病毒或MDPV野毒株污染的可能，采用overlap PCR方法在pYY质粒内部VP1基因上游引入一个碱基突变(T→C)，突变后产生1个新的EcoRV位点，但不改变氨基酸的组成。

1.7.1overlap PCR引物设计

为了实现鉴别的目的，设计了一组重叠PCR引物，引物由大连宝生物有限公司合成，引物代号和序列分别为：

MP1:5′GTCCGGAGCCTGAGAG 3′(SEQ IB NO.1)

MP2：5′GCAGGTAGATATTCTGTTCTGCCA 3′(SEQ IB NO.2)

MP3:5′TGGCAGAACAGAATATCTACCTGC 3′(SEQ IB NO.3)

MP4:5′ATACCTAATCAGCCTATC 3′(SEQ IB NO.4)

MP1和MP4内部分别含有BglII和KpnI位点，用斜体标示，突变碱基用双下划线标示。1.7.2overlap PCR扩增

以pYY质粒为模板，以MP1引物和MP2引物扩增2109bp的A片段。反应体系为：PrimeSTAR Max Premix 25μL，上下游引物各1μL，模板1μL，超纯水补至50μL体系。反应程序设定为：95℃,1min预变性；然后执行94℃，15s；55℃，退火25s，72℃,延伸23s，共25个循环；72℃，延伸10min结束。

以MP3引物和MP4引物扩增375bp的B片段。反应体系为：PrimeSTAR Max Premix 25μL，上下游引物各1μL，模板1μL，超纯水补至50μL体系。反应程序设定为：95℃,1min预变性；然后执行94℃，15s；55℃退火25s，72℃延伸23s，共25个循环；72℃，10min结束。

A、B扩增片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，分别采用凝胶回收试剂盒(天根生物科技有限公司)切胶回收目的片段。

回收的A、B产物各取1μl混合后作为第二步PCR扩增反应的模板。以MP1和MP4为上下游引物。反应体系为：PrimeSTAR Max Premix 25μL，模板1μL，超纯水补至48μL体系。反应程序设定为：95℃,1min变性；然后执行94℃，15s；54℃，25s，72℃,35s延伸，共5个循环。

上述反应结束后，再加入上下游引物各1μL执行以下反应程序：95℃,1min变性；然后执行94℃，15s；54℃，25s，72℃,35s延伸，共20个循环；72℃，10min补平结束反应。预期扩增片段为2.5kb。反应结束后，将50μL PCR反应产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的片段。目的片段用KpnI和BglII双酶切，酒精沉淀酶切片段后，用20μL超纯水溶解。

1.7.3突变位点导入pYY质粒

将pYY用KpnI和BglII双酶切，电泳分离线性化片段，然后切胶回收5.5kb片段。将前述回收的2.5kb PCR扩增片段与5.5kb片段连接，连接产物转入Sure感受态细胞，涂布LB平板。采用EcoRV酶切消化质粒的方法来鉴定阳性的突变插入克隆，并进一步用自带引物送商业化公司进行测序，确保在突变位点正确引入的同时，其它位点未发生改变。阳性克隆命名为pYYΔ。

1.7.4遗传标记病毒的拯救

将pYYΔ质粒转染番鸭胚。pYYΔ转染11日龄番鸭胚，胚胎在第6天开始出现死亡，至转染后第10天死亡率达到83％，而转染pBSKN质粒的对照鹅胚全部存活。实验方法同2.5，见附图5。pYYΔ转染番鸭胚后胚胎死亡的病理变化，表现为胚体、头部、肢端出血(A),而转染pBSKN对照质粒的番鸭胚发育正常(B)，见附图6。

拯救病毒在番鸭胚上传代4次。从尿囊液中提取病毒核酸，用M7和M8引物扩增含有突变位点的1.4kb DNA片段，并用EcoRV酶切鉴定。

M7：5′-GGAACAAACCCAGACTCAAA-3′(SEQ IB NO.5)

M8：5′-CCAATCAGCCTATCTTCTACAT-3′(SEQ IB NO.6)

结果表明，pYY-2Δ质粒转染拯救病毒的1.4kb扩增片段用EcoRV酶切，产生0.4kb和1.0kb的两个片段，而亲本病毒的1.4kb扩增片段无法用EcoRV酶切，见附图7。

1.8遗传标记拯救病毒的雏番鸭感染试验

将32只2日龄易感雏番鸭随机分成2组。一组为感染组，颈部皮下注射0.4mL的新鲜的拯救病毒尿囊液原液；另一组16只雏番鸭感染仅注射生理盐水作为对照。雏番鸭分别在单独的房间隔离饲养18天，记录死亡个数和死亡时间，所有死亡雏番鸭均剖解观察病理变化并做病毒分离和PCR测序鉴定。

结果表明，2日龄雏番鸭接种后第6天开始出现死亡，至第13天死亡率达到56％，不死雏番鸭生长明显慢于对照组，表明拯救病毒具有与亲本病毒YY株相当的致病力。剖解病死番鸭，可见肝脏、脑淤血、出血，肾脏肿大，有尿酸盐沉积，肠道充出血，肠上皮粘膜脱落，某些病例可见胸腔有胶冻样渗出液。

从肠道、肝脏采集的病料经无菌处理后接种番鸭胚，能够使番鸭胚致死。取尿囊液检测，能够扩增出包含标记位点在内的MDPV特异片段。PCR产物直接测序，除了引入的突变碱基，其余序列与YY株完全一致，表明死亡雏番鸭确实死于拯救病毒感染所致，可以排除野毒感染的可能，见附图8。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种番鸭细小病毒感染性克隆的构建及拯救方法

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtccggagag atctcctgag ag 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaggtagat atctctgttc tgcca 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggcagaaca gagatatcta cctgc 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

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<400> 4

atacctggta ccaatcagcc tatc 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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ggaacaaacc cagactcaaa 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaatcagcc tatcttctac at 22

<210> 7

<211> 5075

<212> DNA

<213> 番鸭细小病毒YY株

<400> 7

tcattggagg gttcgttcgt tcgaaccagc caatcagggg aggggggaag tgacgtaagt 60

tccggtcacg tgcttccggt catgtgactt ccggtcacgt gacttccggt gacgtgtttc 120

ctgtcacgtg acttccggtg acgcacttcc tttgatgacg tatttccggt tgtcaaggct 180

gatcgggcgc atgcgcccga tctgccatga aaattaaacc ggaaatacgt catcaaagga 240

agtgcgtcac cggaagtcac gtgacaggaa acacgtcacc ggaagtcacg tgaccggaag 300

tcacatgacc ggaagcacgt gaccggaact tacgtcactt cccccctccc ctgattggct 360

ggttcgaacg aacgaaccct ccaatgagac tcaaggacag caggactttt tgcgcgccag 420

gaagtggtgc aatctaggag agtgtataag gagagctttt tccggttgca ttcattcgtt 480

gctctgctct cacagagaac ggacctcagg tcaggaaaat ggcattttct aggcctcttc 540

agatttcttc tgacaaattc tatgaagtta tcatcaggct accctcggat attgatcaag 600

atgtgcctgg tttgtctctt aactttgtag aatggctttc tacgggggtc tgggagccca 660

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atctggttga ttggctcatt gagatgggta tcacctctga aaaacagtgg ctaactgaaa 1260

ataaagagag ctaccggagc tttcaggcta catcttcaaa caacagacaa gtaaaagcag 1320

cacttgaaaa tgcccgagca gaaatgctac taacaaaaac tgccacagac tatttgattg 1380

gaaaagaccc agttctggac attactaaaa atcggatcta tcaaattctg aagttgaata 1440

actataaccc tcaatatgta gggagcatcc tatgcggatg ggtgaaaaga gaattcaaca 1500

aaagaaatgc catatggctc tacggacctg cgaccaccgg aaagaccaac atagccgagg 1560

ctattgccca tgctgtaccc ttctatggct gtgttaactg gactaatgag aacttcccat 1620

ttaatgactg cgttgataaa atgcttatat ggtgggagga gggaaaaatg accaataaag 1680

tagtggaatc cgcaaaagcg atactggggg ggtctgctgt acgagttgat caaaagtgta 1740

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tgattgtgga tggaaattct actacaatgg aacacagaat tcctttggag gaaagaatgt 1860

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tccctacgaa tgaacaaacc aaacttactg agcccgttcc tgaacgagcg aatgagcctt 2040

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aatctcagtc tgtgtctaca gacagaaaac cccaacgaaa agacaataat aggggctttg 2580

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ataaagcgga cagcgtcgcg cttgagcacg ataaagcgta cgaccagcag ctcaaggcag 2700

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cagtcattac caagactaca agaacctggg tcttgccaag ctacaacaac cacatctaca 3180

aagccatcac aagcggaaca aacccagact caaataccca atatgctgga tacagcaccc 3240

cctgggggta ctttgatttc aacagattcc actgccattt ctctccaaga gactggcaga 3300

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ctacaatcca gatattcacg gataatgaac accagctgcc ctatgttctg ggctcggcca 3480

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gcacaatgca caccaaccag agtggagcta gattcaatga cagaagtgcc ttctattgct 3600

tagagtactt ccccagtcag atgctgagaa cagggaataa ttttgaattc agttttgagt 3660

ttgaagaagt tcccttccat agcatgttcg ctcattcaca ggatttagac aggctaatga 3720

atcctctcct agatcagtac ctgtggaatt tctctgaggt taatggtggc aggaatgcac 3780

agttcaaaaa agctgtgaaa ggagcatttg gtgcaatggg gagaaattgg cttccaggac 3840

ccaaacttct agaccaaagg gtaagagcat acagtggagg aacagataac tatgcgaatt 3900

ggtcaatctg gagtaaagga aacaaagttt ttcttaaaga cagagagtat ctactgcaac 3960

caggtccagt agctactgca catacagaag atcaggcttc cagtataccg gctcaaaaca 4020

caataggaat tgcaaaagac ccctacaggt caggcagtag tctggcagga atttcagaca 4080

ttatggtaac agatgagcaa gaaatagcac caactaatgg tgtagggtgg agaccttatg 4140

gattgaccgt aaccaatgaa caaaacacaa caacagctcc tacaaatgct gagctagaag 4200

tactgggagc gctacctggc atggtctggc agaacagaga tatttacctg cagggtccta 4260

tatgggctaa aatacccaaa acagatggga aatttcatcc ttctccaaac ctgggaggtt 4320

ttggtctcca taatccacct ccccaggtct ttataaaaaa tactcctgtt cctgcagatc 4380

ctccagtaga gtatgtaaat cagaagtgga attcttacat tacacagtat tcaacagggc 4440

agtgtactat agaaatggtc tgggaactca gaaaagaaaa ctccaagaga tggaaccctg 4500

agatccagtt taccagtaac tttggaaata gaacaagtac tatgtttgct ccaaatgaga 4560

ctggaggcta tgtagaagat aggctgattg gtaccaggta tttgactcag aatctgtaaa 4620

tttctgtatt cttttgattt taaataaacc acttcctggc gcgcaaaaag tcctgctgtc 4680

cttgagtctc attggagggt tcgttcgttc gaaccagcca atcaggggag gggggaagtg 4740

acgtaagttc cggtcacgtg cttccggtca tgtgacttcc ggtcacgtga cttccggtga 4800

cgtgtttcct gtcacgtgac ttccggtgac gcacttcctt tgatgacgta tttccggttg 4860

tcaaggctga tcgggcgcat gcgcccgatc tgccatgaaa attaaaccgg aaatacgtca 4920

tcaaaggaag tgcgtcaccg gaagtcacgt gacaggaaac acgtcaccgg aagtcacgtg 4980

accggaagtc acatgaccgg aagcacgtga ccggaactta cgtcacttcc cccctcccct 5040

gattggctgg ttcgaacgaa cgaaccctcc aatga 5075

Claims (6)

1.一种番鸭细小病毒(MDPV)感染性克隆质粒的构建及拯救方法，其特征在于，是将MDPV的完整基因组克隆入载体质粒pBSKN，获得重组质粒；将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫番鸭胚，重组质粒在番鸭胚中得到拯救；所述pBSKN载体，是将商品化质粒pBluescript II(SK)多克隆位点原有的EcoRV酶切位点用NcoI位点替换而得到。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将重组质粒与转染试剂Lipofectamine 2000按照1:2.5(μg/μl)比例混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种11日龄非免疫番鸭胚；番鸭胚在接种后7-11天之间死亡，胚体具有典型的MDPV感染特征，表现为胚体出血、绒毛尿囊膜水肿的典型特征；拯救出的病毒具有与亲本病毒相近的致病性。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组质粒是pYY，它的构建方法为：超速离心浓缩MDPVYY株病毒，提取病毒的基因组单链DNA，体外退火后生成双股DNA；选用NcoI酶切基因组DNA生成亚基因组片段，分别克隆入pBSKN载体的相应酶切位点，再通过酶切-连接的分子操作，拼接获得含有完整基因组的质粒pYY。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的重组质粒的克隆基因组内部引入1个同义碱基突变作为遗传标记，带有遗传标记的重组质粒再与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种11日龄非免疫番鸭胚，带有遗传标记的重组质粒在番鸭胚中得到拯救。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述带有遗传标记的重组质粒是pYYΔ，它的构建方法为：超速离心浓缩MDPVYY株病毒，提取病毒的基因组单链DNA，体外退火后生成双股DNA；用NcoI酶切基因组DNA生成两个亚基因组片段，分别克隆入pBSKN载体的相应酶切位点，再通过酶切-连接的分子操作，拼接获得含有完整基因组的质粒pYY；进一步通过overlap PCR方法，在pYY质粒的VP1基因中引入1个突变碱基作为遗传标记，获得质粒pYYΔ。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述相近致病性是指在雏番鸭感染试验中，拯救病毒具有与亲本病毒相近的致死率。