CN112430265A

CN112430265A - 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61及其应用

Info

Publication number: CN112430265A
Application number: CN202011322743.2A
Authority: CN
Inventors: 梁米芳; 孙丽娜; 曲圆圆; 殷强玲; 李德新; 王世文; 李川; 芜为; 李建东; 李阿茜; 黄晓霞
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: WUHAN INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2040-11-23
Also published as: CN112430265B

Abstract

本发明公开了人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV‑61及其应用。本发明利用噬菌体抗体库技术，成功获得一条特异性针对新型冠状病毒表面抗原的人源中和性抗体nCoV‑61，其在体外具有阻止新型冠状病毒感染敏感细胞的中和功能，对抗原亲和力高，有望制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎的特异性抗体药物。

Description

人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61及其应用。

背景技术

新型冠状病毒SARS-CoV-2是在2019年发现的一种新病毒，可导致人类病毒性肺炎或肺部感染。冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中刺突蛋白(Spike)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基S1和S2，其中S1主要包含受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体。新冠病毒刺突蛋白与人血管紧张素转化酶2(ACE2)互作来感染人的呼吸道上皮细胞。

尽管瑞德西韦、羟氯喹、洛匹那韦与干扰素β1a等多种药物在体外被证明对抗新冠有效，但据WHO最新研究表明这些药物都不能显著降低新冠病毒的死亡率，也没有改善患者的治疗过程。因此开发具有中和活性的单克隆抗体以及多种单抗联合治疗的方法显得尤为重要。抗体鸡尾酒疗法是指将两种以非竞争方式与新冠病毒刺突蛋白的关键受体结合的中和性单克隆抗体的组合联用的治疗方式，可以削弱变异病毒的逃逸，从而更有效地阻断新冠病毒感染。因此开发针对抗原不同结合位点的中和性抗体，以及建立更有效的抗体鸡尾酒疗法成为当务之急。

发明内容

本发明的目的是提供人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61，其轻链及重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下：

抗体nCoV-61的轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

第二方面，本发明提供编码抗体nCoV-61的核酸分子。其中，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。

第三方面，本发明提供含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第四方面，本发明提供抗体nCoV-61经改造得到的单链抗体或全抗。

第五方面，本发明提供用于预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物，其有效成分为抗体nCoV-61或抗体nCoV-61经改造得到的单链抗体或全抗。

第六方面，本发明提供一种新冠病毒检测试剂，其包含抗体nCoV-61或抗体nCoV-61经改造得到的单链抗体或全抗。

在本发明的一个具体实施方式中，全抗体IgG的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示，编码轻链和重链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示。

第七方面，本发明提供抗体nCoV-61或抗体nCoV-61经改造得到的单链抗体或全抗的以下任一应用：

1)用于制备预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物；

2)用于制备新冠病毒检测试剂或试剂盒；

3)用于预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病；

4)用于检测新冠病毒。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明利用噬菌体抗体库技术，成功获得一条特异性针对新型冠状病毒表面抗原的人源中和性抗体nCoV-61，其在体外具有阻止新型冠状病毒感染敏感细胞的中和功能，对抗原亲和力高。利用上述方法获得的人源中和性抗新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和新型冠状病毒感染的抗体产物，可制成临床上用于预防和治疗新型冠状病毒肺炎的特异性抗体药物。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中12株单克隆细菌裂解液中Fab抗体滴度。

图2为本发明较佳实施例中人源中和性抗体nCoV-61的SDS-PAGE纯化胶图。

图3为本发明较佳实施例中抗体nCoV-61中和新型冠状病毒(活病毒)分析结果。

图4为本发明较佳实施例中抗体nCoV-61与新冠病毒表面抗原结合活性ELISA检测结果。

图5为本发明较佳实施例中抗体nCoV-61与新冠病毒表面抗原结合活性IFA检测结果。

图6为本发明较佳实施例中抗体nCoV-61与新冠病毒S蛋白结合活性流式细胞术检测结果。

图7为本发明较佳实施例中抗体nCoV-61亲和力测定曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61的制备及功能

一、材料

1.样本、载体：新冠病毒抗体阳性血清及淋巴细胞：由武汉疾控、山东疾控提供。菌株XLI-Blue购自美国Stratagene公司，抗体库构建载体pComb3H(40kb)由美国Scripps研究所惠赠。

2.抗原：新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白由华兰生物工程股份有限公司提供，新型冠状病毒S蛋白三聚体由江苏东抗生物医药科技有限公司提供，RBD蛋白表达质粒、S蛋白全长表达质粒(参见Chi X,Yan R,Zhang J,Zhang G,Zhang Y,Hao M,Zhang Z,Fan P,DongY,Yang Y,Chen Z,Guo Y,Zhang J,Li Y,Song X,Chen Y,Xia L,Fu L,Hou L,Xu J,Yu C,Li J,Zhou Q,Chen W.A neutralizing human antibody binds to the N-terminaldomain of the Spike protein of SARS-CoV-2.Science.2020Aug7；369(6504):650-655.doi:10.1126/science.abc6952.Epub 2020Jun 22.PMID:32571838；PMCID:PMC7319273)由清华大学史宣玲教授惠赠。

3.新冠病毒：实验使用的新冠病毒19nCoV-CDC-Tan-Strain(HB02)由中国疾病预防控制中心病毒病所分离并保存。

二、方法

1.人源抗新冠病毒表面抗原抗体库的构建与筛选

1.1噬菌体抗体库的构建

用淋巴细胞分离液(美国Sigma)从新型冠状病毒患者恢复期外周血液中分离淋巴细胞，用RNeasy Mini Kit(德国QIAGEN)提取总细胞RNA，用Oligo-dT引物将提取的RNA采用Invitrogen公司的第一链合成试剂盒(SuperScriptTMⅢFirst-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR.Cat No.18080-051)逆转录成cDNA，用一组扩增人源抗体IgG1重链Fd及轻链Kappa和Lambda引物，对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94℃1min，52℃1min，72℃1min，35个循环。建库方法基本按文献进行(Barbas,C.FⅢ.,Kang,A.S.,andlarner,R.A.Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface:thegeneⅢsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18):7978-7982)。

1.2噬菌体抗体库的富集筛选及Fab段抗体的诱导表达

筛选抗原为纯化新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白。用0.1M NaHCO₃(pH8.6)溶液稀释抗原，包被96孔板免疫孔，每孔150μl；用2％脱脂奶-PBST，37℃封闭2h后，加入上述噬菌体抗体库，每孔150μl，37℃孵育2h，用5％Tween-20-PBST反复洗10遍；最后每孔用150μlpH2.2的甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱，用pH9.6的Tris液中和；洗脱后的噬菌体继续感染20ml新鲜的OD₆₀₀＝0.5左右的XL1-Blu菌，经辅助噬菌体VCSM13(美国Stratagene)感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选3次。具体富集筛选方法及Fab段的诱导表达基本按文献进行(Barbas,C.FⅢ.,Kang,A.S.,and larner,R.A.Assembly of combinatorial antibodylibraries on phage surface:the geneⅢsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18):7978-7982)。

2.新冠病毒表面抗原基因工程Fab抗体的检测

2.1Fab抗体表达的检测

用0.1m/L NaHCO₃(pH9.6)溶液包被抗人Fab抗体(美国Sigma，1:2000稀释使用)于酶标板，4℃过夜；5％脱脂奶封闭，37℃1h，加入表达的Fab抗体，37℃1h；加入酶标抗人Fab二抗(美国Sigma，1:2000稀释使用)，37℃1h；显色液显色，2M H₂SO₄终止反应，酶标仪检测吸光度A值。

2.2间接ELISA检测Fab抗体与新型冠状病毒表面抗原的结合活性

用纯化的新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白作为包被抗原，后续步骤同上。

3.人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析：

用Qiagen Miniprep Kit(德国QIAGEN)制备质粒DNA进行核酸序列分析。轻、重链的测序引物分别为5＇-ATTGAATTCAGGAGGAA-3＇和5＇-TGAAATACCTATTGCCTA-3＇。测序结果与Internet V-Base基因库(http://www.vbase2.org/)中IgG基因序列比较。

4.全抗体重组表达质粒的构建与表达纯化

4.1全抗体重组表达质粒的构建

参照V-base数据库中抗体序列，设计引物扩增出Fab抗体轻重链可变区基因片段，在κ链5’和3’端引入Age1/BsiW1酶切位点，λ链5’和3’端引入Age1/Xho1酶切位点，重链5’和3’端引入Age1/Sal1酶切位点，分别将轻重链克隆到全抗体表达载体-米歇尔系列载体(该载体由清华大学史宣玲教授惠赠，参见Chi X,Yan R,Zhang J,Zhang G,Zhang Y,Hao M,Zhang Z,Fan P,Dong Y,Yang Y,Chen Z,Guo Y,Zhang J,Li Y,Song X,Chen Y,Xia L,FuL,Hou L,Xu J,Yu C,Li J,Zhou Q,Chen W.A neutralizing human antibody binds tothe N-terminal domain of the Spike protein of SARS-CoV-2.Science.2020Aug 7；369(6504):650-655.doi:10.1126/science.abc6952.Epub 2020Jun 22.PMID:32571838；PMCID:PMC7319273.)中，构建成全抗体表达载体。

4.2全抗体表达及纯化

取构建好表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液按1:5(w/v)混合后，瞬时转染密度为2×10⁶的Expi293F细胞，37℃孵育120rpm摇床培养4天后，采用GE公司的Protein-G亲和层析柱分别纯化收集上清。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析抗体纯度，利用BCATM protein assay kit(Thermo，美国)检测抗体浓度。

5.新冠病毒表面抗原基因工程抗体的功能检测

5.1BIAcore法测定抗体亲和力

表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种光学物理现象。当一束偏振光在一定的角度范围内入射到棱镜端面，在棱镜与金属薄膜的界面将产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。运用SPR技术，可以免标记实时得到分子间互相作用。分析时，先将偶联物偶联到芯片上，然后将分析物流过芯片表面，若偶联物与分析物有结合活性，则会引起金属膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，并以Biacore的响应信号值RU来呈现。通过检测SPR角度变化，获得动力学常数(结合速率常数ka、解离速率常数kd、亲和力常数KD)和特异性等信息。

数据结果处理使用Biacore Insight Evaluation程序软件输出原始数据，并进行1:1Binding结合模式进行动力学拟合分析。根据拟合结果得到结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)以及亲和力常数(KD)。

5.2抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体中和活性

Vero细胞由中国生物技术股份有限公司提供，病毒使用19nCoV-CDC-Tan-Strain(HB02，P5)。纯化单抗进行2倍梯度稀释，取50ul稀释抗体与等体积2000TCID₅₀/ml病毒混合，37℃孵育2h；使用上述混合物感染vero细胞，37℃，5％CO₂培养箱培养，96h观察细胞病变效应(CPE)，记录细胞完全保护的样本最高稀释度。

5.3ELISA检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与抗原结合活性

用纯化新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白、S蛋白作为包被抗原，分别检测纯化单抗与上述抗原的结合活性，后续步骤同2.1。

5.4间接免疫荧光(IFA)检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与抗原结合活性

5.4.1与新冠病毒的结合活性

将经过新冠病毒(19nCoV-CDC-Tan-Strain(HB02)感染的vero细胞培养4天后制成抗原片，95％酒精，固定30分钟；加入抗体表达上清37℃孵育30分钟，洗净，吹干；加入按照1:40的比例用1:30000稀释的伊文思蓝染色液稀释的抗人Fc荧光抗体(Sgma)，37℃孵育30min，洗净，吹干。荧光显微镜检测拍照。

5.4.2与新冠病毒RBD蛋白的结合活性

取RBD蛋白表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液按1:5(w/v)比例混合后，瞬时转染汇合度达80％的Expi293F细胞，置于37℃CO₂孵箱，培养48h制成抗原片，后续步骤同5.4.1。

5.4.3与新冠病毒S蛋白的结合活性

取S蛋白全长表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液按1:5(w/v)比例混合后，瞬时转染汇合度达80％的Expi293F细胞，置于37℃CO₂孵箱，培养48h制成抗原片，后续步骤同5.4.1。

5.5流式细胞术检测检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与新型冠状病毒S蛋白结合活性

取S蛋白全长表达质粒与1mg/mL聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)溶液按1:5(w/v)比例混合后，瞬时转染汇合度达80％的Expi293F细胞，置于37℃CO₂孵箱，培养36h。将细胞消化下来用PBS洗3次，以20ug/ml的浓度将待测抗体加入至5.5×10⁵个细胞中，室温孵育30min。用PBS洗3次，以1:40的浓度将抗人Fc-FITC抗体(sigma)加入至细胞中，室温孵育30min。用PBS洗3次后用200ul的PBS将细胞重悬，随后上机检测(BD FACSAria^TMⅡ)。

三、结果

1.人源抗新冠病毒表面抗原抗体库的构建与筛选

1.1人源抗新冠病毒表面抗原抗体库的构建

成功构建4个Kappa库和1个Lambda库，库容量在1×10⁷以上，轻重链插入率在90％以上。分别对Kappa子库和Lambda子库进行包装，再按1:1比例混合，用纯化新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白、S2蛋白经过三轮筛选洗脱库容逐渐增加挑取600个克隆，ELISA检测并测序共发现12株序列不同的抗体克隆，如表1所示。

表1抗体库包装和富集筛选产出量

1.2人源抗新冠病毒Fab抗体对新冠表面抗原的特异性结合

12株克隆Fab诱导裂解液抗人Fab和新冠RBD抗原、S1抗原、S2抗原的ELISA检测结果显示(图1)，其中nCoV-61号抗体抗人Fab、新冠RBD抗原、S1抗原滴度均较高，因此选择该株构建IgG全抗体。

2.人源抗新冠病毒表面抗原抗体的序列分析

用DNAstar Lasergene软件分析，并与Internet V-Base基因库中IgG序列进行比较，筛选出的12株序列不同的Fab抗体。共计6条重链，12条轻链。其中一株重链可变区的分类在VH3，轻链可变区的分类在VL1，命名为nCoV-61。其轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。

3.全抗体重组表达质粒的构建与表达纯化

将nCoV-61抗体的轻链和重链可变区基因分别克隆入全抗体表达载体后瞬时转染Expi293F细胞，利用该哺乳动物细胞系统实现全抗体IgG的分泌表达。采用GE公司的Protein-G亲和层析柱直接纯化表达上清，用SDS-PAGE检测全抗体IgG的表达及纯化情况，结果证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻链和重链分别位于约28kD、55kD处(图2)。全抗体IgG的轻链和重链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示，编码轻链和重链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示。

4.新冠病毒表面抗原基因工程IgG抗体的功能检测

4.1亲和力测定

利用生物传感器BIAcoreTM 8000测定人源单抗的亲和力，生物传感器工作的原理和基本过程是利用表面等离子共振(surface plasmon resonance)现象监测传感片表面介质的折射率变化所引发的共振角改变，而这一改变与传感片表面结台的生物大分子的量成正比，溶液中游离的分子不影响共振角的大小，因此非常特异、敏感。用生物传感器检测任何生物大分子间的相互作用都要经过以下几个步骤：结合、解离及再生。本发明使用纯化的新冠S1蛋白作为抗原偶联至生物传感芯片来测定人源单抗的亲和力，亲和常数用BiacoreInsight Evaluation计算，如表2所示。nCoV-61针对新冠病毒S蛋白的亲和力为KD＝3.327×10^-12M(图7)。

表2表面等离子共振技术测定抗体亲和力

4.2中和实验

活病毒中和实验结果表明nCoV-61号抗体具有中和活性，IC₅₀值为0.46μg/ml，中和活性较好。同时nCoV-61与nCoV-121联用后可显著降低IC₅₀值(0.12μg/ml)(图3)。

4.3ELISA检测抗体与新冠病毒表面抗原结合活性

nCoV-61号抗体与新型冠状病毒RBD蛋白、S1蛋白、S蛋白均可结合，并与上述蛋白均有良好的结合活性(图4)。

4.4免疫荧光检测基因工程抗体与新型冠状病毒、新型冠状病毒RBD蛋白及S蛋白结合活性

nCoV-61号抗体与新型冠状病毒、在细胞中表达的新型冠状病毒RBD蛋白及S蛋白间接免疫荧光检测均为阳性，表明nCoV-61号抗体可结合上述抗原(图5)。

4.5流式细胞术检测检测抗人新型冠状病毒表面抗原基因工程抗体与新型冠状病毒S蛋白结合活性

抗体nCoV-61与新冠病毒S蛋白结合活性流式细胞术检测结果如图6所示。图中横坐标为FITC荧光强度，当抗体结合于细胞表面时，可检测到FITC荧光信号。与未转染S蛋白的对照组相比，转染S蛋白的实验组可见明显的细胞分群，同型对照抗体未见分群。这表明nCoV-61号抗体可与在细胞表面中表达的新型冠状病毒S蛋白结合。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61及其应用

<130> KHP201117134.0

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Glu Ile Ile Val Asn Arg Asn

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ile Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Tyr Gly Asp Phe Tyr Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60

tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240

actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

<210> 4

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgaag cctctgaaat catcgtcaat aggaattaca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaatt atatatcccg gtggtagcac attctacgca 180

gactccgtga agggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gatgtatctt 240

caaatgaaca gcctgagagc cgaagacacg gctgtgtatt actgtgcgag atcctacggt 300

gacttctacg ttgacttctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

<210> 5

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala

20 25 30

Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile

35 40 45

Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr

85 90 95

Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp

100 105 110

Ser Ser Leu Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

115 120 125

Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser

145 150 155 160

Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser

165 170 175

Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn

180 185 190

Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp

195 200 205

Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr

210 215 220

Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 6

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Glu Ile Ile Val

35 40 45

Asn Arg Asn Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Ile Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

85 90 95

Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Asp Phe Tyr Val Asp Phe Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 7

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggttc ttgggcccag 60

tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120

tgctctggaa gcagctccaa cattgggaat aattatgtat cctggtacca gcagctccca 180

ggaacagccc ccaaactcct catttatgac aataataagc gaccctcagg gattcctgac 240

cgattctctg gctccaagtc tggcacgtca gccaccctgg gcatcaccgg actccagact 300

ggggacgagg ccgattatta ctgcggaaca tgggatagca gcctgagtgc ttgggtgttc 360

ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 420

ttcccgccct cgagtgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480

gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540

ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 600

ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 660

gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttcatag 708

<210> 8

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattccgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgaagcct ctgaaatcat cgtcaatagg aattacatga actgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtgggt ctcaattata tatcccggtg gtagcacatt ctacgcagac 240

tccgtgaagg gcagattcac catctccaga gacaattcca agaacacgat gtatcttcaa 300

atgaacagcc tgagagccga agacacggct gtgtattact gtgcgagatc ctacggtgac 360

ttctacgttg acttctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc gtcgaccaag 420

ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacctgtga cggtctcgtg gaactcaggc 540

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 720

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380

tccctgtccc cgggtaaatg a 1401

Claims

1.人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61，其特征在于，其轻链及重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下：

2.根据权利要求1所述的中和性抗体，其特征在于，其轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。

3.编码权利要求1或2所述中和性抗体的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。

5.含有权利要求3或4所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

6.权利要求1或2所述中和性抗体经改造得到的单链抗体或全抗。

7.用于预防或治疗由新冠病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物，其特征在于，有效成分为权利要求1或2所述中和性抗体或权利要求6所述单链抗体或全抗。

8.新冠病毒检测试剂，其特征在于，其包含权利要求1或2所述中和性抗体或权利要求6所述单链抗体或全抗。

9.权利要求1或2所述中和性抗体或权利要求6所述单链抗体或全抗的以下任一应用：

2)用于制备新冠病毒检测试剂或试剂盒。