ES2896056T3 - PD-ECGF como biomarcador de cáncer - Google Patents

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Valerio Gabriela Jimenez
De Olza María Ochoa
Perez Valentí Navarro
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Helena Verdaguer
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Abstract

Un método para el diagnóstico de cáncer en un sujeto que comprende (i) determinar los niveles de PD-ECGF en una muestra de dicho sujeto, en donde la muestra es una muestra de un fluido biológico y, (ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia, en donde - si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están elevados cuando se comparan con un valor de referencia, entonces al sujeto se le diagnostica cáncer, y - si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están reducidos cuando se comparan con un valor de referencia, entonces al sujeto no se le diagnostica cáncer y en donde el cáncer es carcinoma de células renales (CCR) o cáncer colorrectal, en donde el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.

Description

DESCRIPCIÓN
PD-ECGF como biomarcador de cáncer
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo del cáncer, particularmente a biomarcadores útiles en el diagnóstico y pronóstico del cáncer, en donde niveles modificados del biomarcador PD-ECGF en una muestra de un sujeto son útiles en el diagnóstico de cáncer en un sujeto o en el pronóstico de un sujeto que padece cáncer.
Antecedentes de la invención
La incidencia de carcinoma de células renales (CCR) ha aumentado ininterrumpidamente cada año. Que nosotros sepamos, se han descrito avances significativos de la biología de este cáncer. Gracias a estos avances, se han desarrollado nuevas estrategias terapéuticas en pacientes con enfermedad avanzada.
El documento US8029981B2 se refiere a métodos de diagnóstico de CCR que comprenden determinar los niveles de la proteína 2 inducible por hipoxia (HIG2). El documento US7611839B2 se refiere a un método de confirmación de un diagnóstico de CCR en un sujeto que comprende determinar los niveles del factor de elongación 1 alfa 2 (EEF1A2) y receptor 2 de tipo toll (TLR2).
No obstante, todavía no hay biomarcadores para el uso rutinario en la práctica clínica en relación con CCR. Particularmente en la última década, los métodos usados en el pronóstico de CCR no han cambiado. En general, la terapia se clasifica por la histología; y los pacientes continúan estando expuestos a terapias posiblemente tóxicas sin probabilidad de respuesta de la indicación. Por tanto, todavía existe la necesidad en la técnica de identificar posibles biomarcadores en el diagnóstico y/o pronóstico de CCR.
En el mundo, el cáncer de mama es el segundo tipo más común de cáncer (10,4%; después del cáncer de pulmón) y la quinta causa más común de muerte por cáncer (después del cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de hígado y cáncer de colon). Entre las mujeres en el mundo, el cáncer de mama es la causa más común de muerte por cáncer. El número de casos en el mundo ha aumentado significativamente desde la década de 1970, un fenómeno del que parcialmente se culpa a los modernos estilos de vida en el mundo occidental. Las mujeres norteamericanas tienen la incidencia más alta de cáncer de mama en el mundo.
Algunos marcadores moleculares de mama bien establecidos con valor pronóstico y/o terapéutico incluyen receptores de hormonas que incluyen receptor de estrógeno (ER) y receptor de progesterona (PR), oncogén HER-2, Ki-67 y p53. Dianas más recientemente identificadas en el cáncer de mama incluyen CXCR4, caveolina y FOXP3.
Con 655.000 muertes en el mundo al año, el cáncer colorrectal es la tercera forma más común de cáncer y la segunda causa más frecuente de muerte relacionada con el cáncer en el mundo occidental. Se cree que muchos cánceres colorrectales surgen de pólipos adenomatosos en el colon. Estos crecimientos en forma de hongos son normalmente benignos, pero algunos pueden convertirse en cáncer con el tiempo. La mayor parte del tiempo, el diagnóstico de cáncer de colon localizado es mediante colonoscopia.
La extirpación quirúrgica es la modalidad de tratamiento primario para el cáncer colorrectal de estadio temprano (estadio I a III), y la herramienta más poderosa para evaluar el pronóstico tras la cirugía potencialmente curativa es el análisis patológico del espécimen extirpado. Aunque los parámetros que determinan el estadio patológico son los factores pronósticos más fuertes del desenlace posoperatorio, otras características clínicas, moleculares e histológicas pueden influir en los pronósticos independientes del estadio. Entre pacientes con enfermedad de estadio IV, el pronóstico está más estrechamente ligado a la localización y el grado de enfermedad metastásica distante.
El nivel de antígeno carcinoembrionario (CEA) es el marcador tumoral con más frecuencia usado en cáncer colorrectal. Este nivel puede comprobarse antes de la cirugía para predecir el pronóstico, puede usarse durante la terapia para evaluar la respuesta al tratamiento, o después de completarse la terapia para seguir la recaída. CA 19-9 es un marcador en sangre que puede estar elevado en cáncer colorrectal. Puede usarse MSI (inestabilidad de microsatélite) para identificar el cáncer de colon de estadio temprano que puede requerir tratamiento más agresivo o para identificar pacientes que deben hacerse pruebas genéticas adicionales debido al riesgo de un síndrome familiar relacionado con varios tipos de cáncer. Recientemente, se ha propuesto miR-21 de suero como un biomarcador diagnóstico y pronóstico precoz en cáncer colorrectal (Toiyama et al. 2013 J. Natl. Cancer Inst. 105(12): 849-859).
Sin embargo, debido a la alta incidencia tanto de cáncer de mama como de cáncer colorrectal, existe una necesidad continua en la técnica para marcadores diagnósticos y/o predictivos de respuesta de dichos cánceres.
Volm et al. (2000 Anticancer Res. 20(5B):3449-58) describen factores predictivos celulares para la respuesta a fármacos de cáncer de pulmón. Mizutani et al. (2003 Cancer 15;98(4):730-6) describen la significación de la actividad timidina fosforilasa/factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas en carcinoma de células renales. Takayama et al. (2006 Japanese Journal of Clinical Oncology 36(9):564-569) describen altos niveles de timidina fosforilasa como un factor pronóstico independiente en carcinoma de células renales. Morita et al. (2003 Oncology 65(2):125-31) describen la significación clinicopatológica de timidina fosforilasa y dihidropirimidina deshidrogenasa en carcinoma de células renales. Padrik et al. (2010 Int Urol Nephrol. 42(2):295-8) describen la significación clinicopatológica de la expresión de timidina fosforilasa (TP) y su papel en carcinoma de células renales. Ruckhaberle et al. (2009 European journal of cancer 46(3):549-57) describen células inmunitarias que infiltran tumores como una fuente principal de expresión de timidina fosforilasa y su papel en el pronóstico de cáncer de mama. Tsuji et al. (2004 Eur J Surg Oncol. 30(3):296-302) describen la expresión del factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas como un factor pronóstico independiente en pacientes de cáncer colorrectal después de cirugía curativa. El documento US 5 798 213 A se refiere a anticuerpos monoclonales que reconocen timidina fosforilasa humana y los usos de los mismos en el diagnóstico y tratamiento de tumores. Brostjan et al. (2003 Cancer 15;98(10):2291-301) describen el seguimiento de factores angiogénicos circulantes en inmunoterapia contra el cáncer basada en células dendríticas.
Compendio de la invención
Los inventores han analizado niveles de expresión de la proteína PD-ECGF por inmunohistoquímica, ELISA e inmunotransferencia. No se detectó PD-ECGF en muestras de tejido no canceroso (0 en 12, 0%), pero se observó proteína PD-ECGF en 67 (>97%) de las muestras de tejido de 69 pacientes con CCR y en 10 (59%) de 17 en muestras de tejido de pacientes con cáncer de mama analizados por inmunohistoquímica. Así, la determinación de PD-ECGF de muestras de tejido podría usarse para la detección, diagnóstico o seguimiento de cáncer.
Además, los inventores han encontrado que la expresión de PD-ECGF es un factor pronóstico de la respuesta a terapias antiangiogénicas en pacientes con carcinoma de células renales, y cáncer colorrectal como se muestra correlacionando los niveles de PD-ECGF en los tumores antes del inicio de la terapia con el riesgo de evolución temprana (pruebas de Kaplan-Meier y de Gehan-Breslow-Wilcoxon, p<0,045). Por tanto, la expresión de PD-ECGF tiene valor potencial en predecir la evolución del cáncer a terapia como factor pronóstico de respuesta a terapias antiangiogénicas.
Además, los pacientes colorrectales con niveles en plasma más altos de PD-ECGF tuvieron un riesgo significativamente más alto de evolución temprana, como se representa por un análisis de la razón de riesgo significativo para PD-ECG y evolución tumoral (razón de riesgo, p<0,041). Por tanto, los niveles de proteína PD-ECGF en plasma tienen un potencial valor en predecir la respuesta del cáncer a terapia como factor pronóstico de respuesta a terapias antiangiogénicas.
Estos hallazgos confirman el uso de PD-ECGF como un novedoso biomarcador para la detección, el diagnóstico, el seguimiento de la enfermedad y la predicción de la respuesta en pacientes con CCR, cáncer de mama, cáncer colorrectal y otros tipos de cánceres.
Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de cáncer en un sujeto que comprende
(i) determinar los niveles de PD-ECGF en una muestra de dicho sujeto, en donde la muestra es una muestra de un fluido biológico y,
(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,
en donde
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están elevados cuando se comparan con un valor de referencia, entonces al sujeto se le diagnostica cáncer, y
- si los niveles de PD-ECGf en una muestra del sujeto están reducidos cuando se comparan con un valor de referencia, entonces al sujeto no se le diagnostica cáncer, y
en donde el cáncer es carcinoma de células renales (CCR) o cáncer colorrectal,
en donde el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método de predicción de la respuesta de un sujeto que padece cáncer a un tratamiento antiangiogénico, en donde dicho tratamiento antiangiogénico se selecciona del grupo que consiste en
- un anticuerpo monoclonal anti-VEGF, derivado o fragmento del mismo, preferiblemente Bevacizumab, anibizumab, ranibizumab o Fab IMC 1121 o F200 Fab,
- un inhibidor de tirosinas quinasas estimuladas por VEGF, preferiblemente lapatinib (Tykerb), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinib, vatalanib y pazopanib,
- un agente anti-FGF, preferiblemente suramina y sus derivados, pentosano polisulfato, cediranib, pazopanib o BIBF 1120,
- un agente anti-EGF, preferiblemente cetuximab, gefitinib o erlotinib,
- un agente anti-HGF, tal como ARQ197, JNJ-38877605, PF-04217903, SGX523, NK4, o AMG102, - un polipéptido antiangiogénico tal como angiostatina, endostatina, anti-trombina III antiangiogénica, sFRP-4 como se describe en el documento WO2007115376,
- pagaptanib,
- aflibercerpt (VEGF-Trap)
- un anticuerpo bloqueante de VEGFR2, preferiblemente Ramucirumab (IMC-1121B) y DC101 (también conocido como Acm anti-Flk-1),
- un compuesto seleccionado del grupo que consiste en Marimastat; AG3340; COL-3, BMS-275291, talidomida, SU5416, SU6668, EMD121974, 2-metoxioestradiol, carboxiamidotriazol, CMIOI (toxina GBS), pentosano polisulfato, angiopoyetina 2, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP470, paclitaxel, Accutin, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor de plaquetas 4 y minociclina,
dicho método comprende
(i) determinar los niveles de PD-ECGF en una muestra de dicho sujeto y,
(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,
en donde
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están elevados cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una mala respuesta al tratamiento antiangiogénico, y
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están reducidos cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una buena respuesta al tratamiento antiangiogénico.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de PD-ECGF en la determinación de la respuesta de un paciente con cáncer a un tratamiento antiangiogénico, en donde dicho tratamiento se selecciona del grupo que consiste en
- un anticuerpo monoclonal anti-VEGF, derivado o fragmento del mismo, preferiblemente Bevacizumab, anibizumab, ranibizumab o Fab IMC 1121 o F200 Fab,
- un inhibidor de tirosinas quinasas estimuladas por VEGF, preferiblemente lapatinib (Tykerb), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinib, vatalanib y pazopanib,
- un agente anti-FGF, preferiblemente suramina y sus derivados, pentosano polisulfato, cediranib, pazopanib o BIBF 1120,
- un agente anti-EGF, preferiblemente cetuximab, gefitinib o erlotinib,
- un agente anti-HGF, tal como ARQ197, JNJ-38877605, PF-04217903, SGX523, NK4, o AMG102,
- un polipéptido antiangiogénico tal como angiostatina, endostatina, anti-trombina III antiangiogénica, sFRP-4 como se describe en el documento WO2007115376,
- pagaptanib,
- aflibercerpt (VEGF-Trap)
- un anticuerpo bloqueante de VEGFR2, preferiblemente Ramucirumab (IMC-1121B) y DC101 (también conocido como Acm anti-Flk-1),
- un compuesto seleccionado del grupo que consiste en Marimastat; AG3340; COL-3, BMS-275291, talidomida, SU5416, SU6668, EMD121974, 2-metoxioestradiol, carboxiamidotriazol, CMIOI (toxina GBS), pentosano polisulfato, angiopoyetina 2, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteina, TNP470, paclitaxel, Accutin, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor de plaquetas 4 y minociclina.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de PD-ECGF en el diagnóstico de carcinoma de células renales (CCR) o cáncer colorrectal en un sujeto, en donde el uso comprende la determinación de los niveles de PD-ECGF en una muestra de un sujeto, en donde la muestra es una muestra de un fluido biológico, en donde el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.
Descripción de las figuras
Figura 1. Niveles de proteína PD-ECGF de muestras de tejido tumoral o no tumoral de pacientes o sujetos sanos medidos por inmunohistoquímica.
Figura 2. Niveles de proteína PD-ECGF de muestras de tejido tumoral de pacientes con cáncer CCR medidos por inmunohistoquímica.
Figura 3. Niveles de proteína PD-ECGF de muestras de tejido tumoral de pacientes con cáncer de mama medidos por inmunohistoquímica.
Figura 4. Gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier de la supervivencia sin evolución en pacientes con CCR relacionada con los niveles de expresión de PD-ECGF en tejido tumoral.
Figura 5. Niveles de proteína PD-ECGF medidos por ELISA de muestras de plasma de donantes sanos o pacientes con cáncer.
Figura 6. Niveles de proteína PD-ECGF medidos por ELISA de muestras de plasma de pacientes con cáncer CCR.
Figura 7. Niveles de proteína PD-ECGF medidos por ELISA de muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama.
Figura 8. Niveles de proteína PD-ECGF medidos por ELISA de muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal.
Figura 9. Asociación de la razón de riesgo de niveles de proteína PD-ECGF en plasma con la evolución del tumor en pacientes con cáncer colorrectal.
Figura 10. Gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier de supervivencia sin evolución en pacientes con CCR relacionada con los niveles en plasma de PD-ECGF.
Figura 11. Gráfico de la supervivencia sin enfermedad de Kaplan-Meier de pacientes con adenocarcinoma colorrectal en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (7 muestras). Referencia: Colorectal Adenocarcinoma (TCGA, Provisional).
Figura 12. Gráfico de supervivencia global de Kaplan-Meier de pacientes con glioblastoma en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (291 muestras). Referencia: Brennan CW et al., The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 10 Oct. 2013;155(2):462-77.
Figura 13. Gráfico de supervivencia global de Kaplan-Meier de pacientes con carcinoma renal de células claras de riñón en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (413 muestras). Referencia: Kidney Renal Clear Cell Carcinoma (TCGA, Provisional).
Figura 14. Gráfico de supervivencia sin enfermedad de Kaplan-Meier de pacientes con carcinoma renal de células claras de riñón en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (413 muestras). Referencia: Kidney Renal Clear Cell Carcinoma (TCGA, Provisional).
Figura 15. Gráfico de supervivencia global de Kaplan-Meier de pacientes con carcinoma renal de células claras de riñón en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (392 muestras). Referencia: Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma. Nature.
4 Jul 2013; 499(7456):43-9.
Figura 16. Gráfico de supervivencia sin enfermedad de Kaplan-Meier de pacientes con carcinoma renal de células papilares de riñón en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (161 muestras). Referencia: Kidney Renal Papillary Cell Carcinoma (TCGA, Provisional).
Figura 17. Gráfico de supervivencia global de Kaplan-Meier de pacientes con adenocarcinoma de pulmón en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (230 muestras). Referencia: Lung Adenocarcinoma (Tc Ga , Provisional).
Figura 18. Gráfico de supervivencia sin enfermedad de Kaplan-Meier de pacientes con adenocarcinoma de pulmón en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (230 muestras). Referencia: Lung Adenocarcinoma (TCGA, Provisional).
Figura 19. Gráfico de supervivencia sin enfermedad de Kaplan-Meier de pacientes con adenocarcinoma de próstata donde la expresión de p D-ECGF está alterada. Todos tumores completos (85 muestras). Referencia: Taylor BS et al., Integrative genomic profiling of human prostate cancer. Cancer Cell. 13 Jul 2010; 18(1):11-22.
Figura 20. Gráfico de supervivencia global de Kaplan-Meier de pacientes con cáncer de células germinales testiculares en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (149 muestras). Referencia: Testicular Germ Cell Cancer (TCGA, Provisional).
Figura 21. Gráfico de supervivencia global de Kaplan-Meier de pacientes con timoma en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (124 muestras). Referencia: Thymoma (TCGA, Provisional).
Figura 22. Gráfico de supervivencia sin enfermedad de Kaplan-Meier de pacientes con timoma en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (124 muestras). Referencia: Thymoma (TCGA, Provisional).
Figura 23. Gráfico de supervivencia global de Kaplan-Meier de pacientes con carcinoma tiroideo papilar en donde la expresión de PD-ECGF está alterada. Todos tumores completos (388 muestras). Referencia: Cáncer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic characterization of papiNary thyroid carcinoma. Cell. 23 Oct 2014;159(3):676-90.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
El término “tratamiento antiangiogénico” o “tratamiento de antiangiogénesis”, como se usa en el presente documento, se refiere a un tratamiento basado en al menos un agente de antiangiogénesis. El término “agente antiangiogénico”, o “agente de antiangiogénesis” o “inhibidor de la angiogénesis”, se refiere a un agente dirigido a la angiogénesis (por ejemplo, el proceso de formación de vasos sanguíneos) que incluye, pero no se limita a, angiogénesis tumoral. En este contexto, la inhibición puede referirse a bloquear la formación de vasos sanguíneos y detener o ralentizar el crecimiento de vasos sanguíneos.
El término “cáncer” se refiere a una enfermedad caracterizada por la división celular incontrolada (o por un aumento de la supervivencia o resistencia a la apoptosis) y por la capacidad de dichas células para invadir otros tejidos vecinos (invasión) y extenderse a otras áreas del cuerpo donde las células no están normalmente localizadas (metástasis) a través de los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través del torrente sanguíneo, y entonces invadir tejidos normales en cualquier parte en el cuerpo. Dependiendo de si pueden extenderse o no por invasión y metástasis, los tumores se clasifican como que son o bien benignos o bien malignos: tumores benignos son tumores que no pueden extenderse por invasión o metástasis, es decir, solo crecen localmente; mientras que los tumores malignos son tumores que son capaces de extenderse por invasión y metástasis. Los procesos biológicos conocidos por estar relacionados con el cáncer incluyen angiogénesis, infiltración de células inmunitarias, migración celular y metástasis. El término cáncer incluye, sin limitación, cáncer de pulmón, sarcoma, melanoma maligno, mesotelioma pleural, carcinoma de vejiga, cáncer de próstata, carcinoma de páncreas, carcinoma gástrico, cáncer de ovario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de esófago, cáncer suprarrenal, cáncer de las glándulas parótidas, carcinoma de cabeza y cuello, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer de hígado, mesotelioma, mieloma múltiple, leucemia y linfoma. En una realización particular de la invención, el cáncer es carcinoma de células renales (CCR), cáncer de mama o cáncer colorrectal. El término “cáncer de mama” se refiere a cualquier trastorno proliferativo maligno de células de la mama, lo más comúnmente del revestimiento interno de los conductos galactóforos o los lóbulos que abastecen los conductos con leche. Los cánceres que se originan en conductos son conocidos como carcinomas ductales, mientras que los que se originan en lóbulos son conocidos como carcinomas lobulares. El término “cáncer colorrectal”, también conocido como “cáncer de colon”, “cáncer rectal” o “cáncer intestinal”, se refiere a un cáncer de crecimiento celular incontrolado en el colon o recto, o en el apéndice. El término “carcinoma de células renales”, también conocido como “cáncer de riñón” o “adenocarcinoma renal”, se refiere a cáncer en donde las células tumorales se encuentran en cualquiertejido del riñón que incluye carcinomas de células claras (mezcladas con células granulares o no), cánceres cromófilos, tumores rabdoides del riñón, cánceres cromofóbicos, cánceres oncocíticos, cánceres de los túbulos colectores, carcinomas de células transitorias y tumores sarcomatoides.
El término “diagnóstico”, como se usa en el presente documento, se refiere tanto al proceso de intentar determinar y/o identificar una posible enfermedad en un sujeto, es decir, el procedimiento de diagnóstico, como a la opinión alcanzada por este proceso, es decir, la opinión de diagnóstico. Como tal, también puede considerarse como un intento en la clasificación de un estado del individuo en categorías separadas y distintas que permiten que se tomen decisiones médicas sobre el tratamiento y el pronóstico. En particular, el término “diagnóstico de cáncer” se refiere a la capacidad para identificar o detectar la presencia de un tumor en un sujeto. Esta detección, como entiende un experto en la materia, no reivindica que sea correcta en el 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas se clasifique correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede establecerla un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas; ejemplos no limitantes ilustrativos de dichas herramientas estadísticas incluyen determinar los intervalos de confianza, determinar el valor de p, la prueba de la t de Student o funciones discriminantes de Fisher, etc. (véase, por ejemplo, Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983). Los intervalos de confianza son preferentemente al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. El valor de p es preferentemente inferior a 0,1, inferior a 0,05, inferior a 0,01, inferior a 0,005 o inferior a 0,0001. Las enseñanzas de la presente invención permiten preferentemente diagnosticar correctamente en al menos el 60 %, en al menos el 70%, en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un grupo determinado o población analizada.
El término “nivel de expresión”, como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad medible de producto génico producida por el gen en una muestra del sujeto, en donde el producto génico puede ser un producto transcripcional o un producto traduccional. Como entiende el experto en la materia, el nivel de expresión génica puede cuantificarse midiendo los niveles de ARN mensajero de dicho gen o de la proteína codificada por dicho gen. En el contexto de la presente invención, el nivel de expresión del gen que codifica PD-ECGF puede determinarse midiendo los niveles de ARNm codificado por dicho gen, o midiendo los niveles de la proteína codificada por dicho gen, es decir, la proteína PD-ECGF o de variantes de la misma. Las variantes de proteína PD-ECGF incluyen todas las formas de modificaciones químicas postraduccionales fisiológicamente relevantes de la proteína, por ejemplo, glucosilación, fosforilación, acetilación, etc., a condición de que la funcionalidad de la proteína se mantenga. Dicho término engloba la proteína PD-ECGF de cualquier especie de mamífero, que incluye, pero que no se limita a, animales domésticos y de granja (vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores), primates y seres humanos. Preferentemente, la proteína PD-ECGF es una proteína humana.
El término “factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas” o “PD-ECGF”, como se usa en el presente documento, también se conoce como “factor-1 de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas”, “ECGF-1” o “ECGF1”, “gliostatina”, “mitógeno de células endoteliales derivado de plaquetas”, “timidina fosforilasa” o “TP”, y se refiere a una proteína citoplásmica inicialmente aislada de plaquetas que muestra actividad mitogénica endotelial. Es una proteína no glucosilada ácida de 45 kDa, que se sintetiza como un precursor de 482 aminoácidos del que se deriva por procesamiento del extremo N. La proteína aislada de la placenta contiene cinco aminoácidos adicionales en el extremo N. PD-ECGF puede estar fosforilado in vivo en restos de serina, pero la significancia biológica de esta etapa de fosforilación es desconocida. El gen humano que codifica PD-ECGF está localizado en el cromosoma 22 y se le asigna Gene ID 1890 (NCBI GenBank, actualización de 1 de marzo de 2014). Se han descrito varias variantes de transcrito para PD-ECGF: variante 1 de transcrito (número de acceso NM_001113755.2 en NCBI GenBank), que codifica la misma isoforma 1 que las variantes 2, 3 y 4; variante 2 de transcrito (NM_001953.4), que usa un sitio de corte y empalme alternativo en la 5' UTR; variante 3 de transcrito (NM_001113756.2), que se diferencia en la 5' UTR en comparación con la variante 1; variante 4 de transcrito (NM_001257988.1), que usa un sitio de corte y empalme alternativo en la 5' UTR en comparación con la variante 1; y variante 5 de transcrito (NM_001257989.1), que usa sitios de corte y empalme alternativos en la 5' UTR y la región codificante 3' en comparación con la variante 1, y que codifica la isoforma 2, dicha isoforma 2 tiene un segmento adicional en la región C-terminal en comparación con la isoforma 1. La secuencia de aminoácidos de PD-ECGF humana está localizada en NCBI GenBank con el número de acceso AAB03344.2 (482 aminoácidos, versión de 3 de febrero de 2000) y en UniProtKB/Swiss-Prot número de acceso P19971.2 (versión de Uniprot 167 de 19 de febrero de 2014).
El término “predecir la respuesta a un tratamiento antiangiogénico”, como se usa en el presente documento, se refiere a la predicción de un desenlace médico tras una intervención terapéutica usando un tratamiento antiangiogénico. El desenlace después del tratamiento puede determinarse usando cualquier criterio de valoración común para la evolución del paciente, tal como, por ejemplo, un desenlace malo o bueno (por ejemplo, probabilidad de supervivencia a largo plazo, supervivencia global, supervivencia específica de enfermedad, supervivencia sin evolución o supervivencia sin enfermedad); recaída, evolución de la enfermedad, o mortalidad. Como entenderán los expertos en la materia, la predicción de la respuesta, aunque se prefiere, no necesita ser correcta para el 100% de los sujetos que van a diagnosticarse o evaluarse. El término, sin embargo, requiere que una porción estadísticamente significativa de sujetos pueda identificarse como que tiene una elevada probabilidad de tener un desenlace determinado en respuesta a la terapia. Si un sujeto es estadísticamente significativo, puede determinarse sin más preámbulos por el experto en la materia usando diversas herramientas de evaluación estadísticas muy conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Se encuentran detalles en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% al menos el 95%. Los valores de p son, preferentemente 0,05, 0,025, 0,001 o más bajos. Cualquier parámetro que sea ampliamente aceptado para determinar la respuesta de un paciente puede usarse en la presente invención, que incluye sin limitación de la evolución de la enfermedad.
El término “valor de referencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a un valor de laboratorio usado como referencia para valores/datos obtenidos por exámenes de laboratorio de sujetos o muestras recogidas de sujetos. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior o inferior, un intervalo de valores, un valor promedio, una mediana de valor, un valor medio, o un valor en comparación con un valor control o inicial particular. Un valor de referencia puede basarse en un valor de muestra individual, tal como, por ejemplo, un valor obtenido de una muestra del sujeto que se ensaya, pero en un momento anterior en el tiempo. El valor de referencia puede basarse en un gran número de muestras, tales como de la población de sujetos del mismo grupo de edad cronológica, o basarse en un conjunto de muestras que incluyen o excluyen la muestra que va a ensayarse. Valores de referencia adecuados se indican en el contexto de los métodos de la invención para determinar el diagnóstico de cáncer o predecir la respuesta de un sujeto con cáncer que está siendo tratado con terapias antiangiogénicas.
El término “muestra” o “muestra biológica”, como se usa en el presente documento, se refiere a material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica contiene cualquier material biológico adecuado para detectar niveles de ARN o de proteína. En una realización particular, la muestra comprende material genético, por ejemplo, ADN, ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc), ARN, ARN heterogéneo nuclear (ARNhn), ARNm, etc., del sujeto en estudio. La muestra puede aislarse de cualquier tejido o fluido biológico adecuado tal como, por ejemplo, sangre, saliva, plasma, suero, orina, líquido cefalorraquídeo (LCR), heces, un espécimen quirúrgico, un espécimen obtenido de una biopsia y una muestra de tejido incluida en parafina. Los expertos en la materia conocen métodos de aislamiento de muestras. En particular, los métodos de obtención de una muestra de una biopsia incluyen la división macroscópica de una masa, o microdisección u otros métodos de separación de células conocidos en la técnica. Con el fin de simplificar la conservación y la manipulación de las muestras, estas pueden fijarse en formalina e incluirse en parafina o primero congelarse y luego incorporarse en un medio criosolidificable, tal como OCT-Compound, mediante inmersión en un medio altamente criogénico que permite la rápida congelación. En una realización particular, la muestra del sujeto según los métodos de la presente invención es una muestra de fluido biológico. En una realización particular, la muestra del sujeto según los métodos de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, y una muestra de tejido; más preferentemente del grupo que consiste en plasma y una muestra de tejido.
El término “sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mamífero”, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates y seres humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, o roedores. Preferentemente, el sujeto es un ser humano masculino o femenino de cualquier edad, sexo o raza.
El término “tratamiento”, como se usa en el presente documento, comprende cualquier tipo de terapia, que tiene como objetivo terminar, prevenir, mejorar y/o reducir la susceptibilidad a un estado clínico como se describe en el presente documento. El término tratamiento se refiere a tratamiento profiláctico (es decir, una terapia para reducir la susceptibilidad de un estado clínico, un trastorno o afección como se define en el presente documento). Así, “tratamiento”, “tratar” y similares, como se usa en el presente documento, se refiere a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, cubre cualquier tratamiento de una afección patológica o trastorno en un mamífero, que incluye un ser humano. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente un trastorno o síntoma del mismo y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de un trastorno y/o efecto adverso atribuible al trastorno. Es decir, “tratamiento” incluye (1) prevenir que el trastorno se produzca o repita en un sujeto, (2) inhibir el trastorno, tal como detener su desarrollo, (3) parar o terminar el trastorno o al menos síntomas asociados al mismo, de manera que el hospedador ya no padezca el trastorno o sus síntomas, tal como causar la regresión del trastorno o su síntomas, por ejemplo, restaurando o reparando una función perdida, ausente o defectuosa, o estimulando un proceso ineficaz, o (4) atenuar, aliviar, o mejorar el trastorno, o síntomas asociados al mismo, donde mejorar se usa en un sentido amplio para referirse a al menos una reducción en la magnitud de un parámetro, tal como inflamación, dolor y/o inmunodeficiencia.
Método de diagnóstico de cáncer de la invención
Los autores de la presente invención han encontrado que la expresión de PD-ECGF no se detecta en muestras de tejido no canceroso (0 en 12, 0%), mientras que la expresión de proteínas PD-ECGF se detecta en 67 (>97%) muestras de tejido de 69 pacientes con CCR y en 9 (56%) de 16 en muestras de tejido de pacientes con cáncer de mama cuando las muestras de tejido se analizaron por inmunohistoquímica (véase el Ejemplo 1). Similarmente, la expresión de PD-ECGF se observó en 14 (>87%) muestras de plasma de 16 pacientes con CCR, en 11 (69%) de 16 en muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama y en 52 (90%) de 58 en muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal analizadas por ELISA (véase el Ejemplo 2).
Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico de cáncer en un sujeto que comprende
(i) determinar los niveles de PD-ECGF en una muestra de dicho sujeto, en donde la muestra es una muestra de un fluido biológico y,
(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,
en donde
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están elevados cuando se comparan con un valor de referencia, entonces al sujeto se le diagnostica cáncer, y
- si los niveles de PD-ECGf en una muestra del sujeto están reducidos cuando se comparan con un valor de referencia, entonces al sujeto no se le diagnostica cáncer, y
en donde el cáncer es carcinoma de células renales (CCR) o cáncer colorrectal,
en donde el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.
Así, en una primera etapa del método diagnóstico de la invención, los niveles de expresión de PD-ECGF se determinan en una muestra del sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse. También se divulga una muestra que contiene células del posible tumor es posible tejido tumoral o una porción del mismo. En una realización más particular, dicha posible muestra de tejido tumoral es una muestra de tejido de riñón de un paciente cuyo diagnóstico de cáncer de riñón va a determinarse, o una muestra de tejido de mama de un paciente cuyo diagnóstico de cáncer de mama va a determinarse, o una muestra de tejido colorrectal de un paciente cuyo diagnóstico de cáncer colorrectal va a determinarse. Dicha muestra puede obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, biopsia, extirpación quirúrgica o aspiración, usando métodos muy conocidos para los expertos en las técnicas médicas relacionadas. Los métodos de obtención de la muestra de la biopsia incluyen la división macroscópica de una masa, o microdissección u otros métodos de separación de células conocidos en la técnica que incluyen nefrectomía y tumorectomía parcial. Las células tumorales pueden obtenerse adicionalmente de citología por aspiración con aguja fina. Con el fin de simplificar la conservación y manipulación de las muestras, estas pueden ser fijadas en formalina e incluidas en parafina o primero congelarse y luego incluirse en un medio criosolidificable, tal como OCT-Compound, mediante inmersión en un medio altamente criogénico que permite la rápida congelación.
La muestra en la que el nivel de expresión de PD-ECGF se determina es un biofluido del paciente cuyo diagnóstico va a determinarse se selecciona de sangre, particularmente sangre periférica, plasma o suero. La muestra de sangre normalmente se extrae por medio de punción de una arteria o vena, normalmente una vena de la parte interna del codo o del reverso de la mano, la muestra de sangre se recoge en un vial o jeringa hermético al aire. Puede realizarse una punción capilar normalmente en el talón o en las falanges distales de los dedos para análisis por medio de un micrométodo. Puede obtenerse suero de la muestra de sangre completa y en ausencia de anticoagulante dejando que la muestra sedimente durante 10 minutos de manera que coagule y posteriormente centrifugándola a 1.500 rpm durante 10 minutos con el fin de separar las células (precipitado) del suero (sobrenadante). A su vez, para obtener la muestra de plasma, la sangre completa se pone en contacto con un anticoagulante y se centrifuga a 3.000 rpm durante 20 minutos. El precipitado de dicha centrifugación se corresponde con los elementos formados, y el sobrenadante se corresponde con el plasma. El suero o el plasma obtenidos pueden transferirse a un tubo de almacenamiento para el análisis de muestras por medio del método de la invención.
En una realización particular del método diagnóstico de la invención, la muestra en donde los niveles de expresión de PD-ECGF se determinan es una muestra de plasma. En una realización particular, los niveles de expresión de PD-ECGF se determinan en una muestra de plasma o en una muestra de tejido de mama cuando va a determinarse el diagnóstico de cáncer de mama. En una realización alternativa particular, los niveles de expresión de PD-ECGF se determinan en una muestra de plasma o en una muestra de tejido de riñón cuando va a determinarse el diagnóstico de carcinoma de células renales (CCR). En otra realización alternativa particular, los niveles de expresión de PD-ECGF se determinan en una muestra de plasma o en una muestra de tejido colorrectal cuando va a determinarse el diagnóstico de cáncer colorrectal.
Como se describe previamente, pueden cuantificarse los niveles de expresión génica midiendo los niveles de ARN mensajero del gen o de la proteína codificada por dicho gen o de la proteína codificada por dicho gen, es decir, proteína PD-ECGF o de variantes de la misma. Las variantes de la proteína PD-ECGF incluyen todas las formas de modificaciones químicas postraduccionales fisiológicamente relevantes de la proteína, por ejemplo, glucosilación, fosforilación, acetilación, etc., a condición de que se mantenga la funcionalidad de la proteína. Dicho término engloba la proteína PD-ECGF de cualquier especie de mamífero, que incluye, pero que no se limita a, animales domésticos y de granja (vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores), primates y seres humanos. Preferentemente, la proteína PD-ECGF es una proteína humana.
Con el fin de medir los niveles de ARNm de un gen, la muestra biológica puede tratarse para alterar física, mecánica o químicamente la estructura del tejido o célula, para liberar componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica para preparar ácidos nucleicos para el posterior análisis. Los ácidos nucleicos se extraen de la muestra mediante procedimientos conocidos para el experto y comercialmente disponibles. Después se extrae ARN de muestras congeladas o recientes por cualquiera de los métodos típicos en la materia, por ejemplo, Sambrook, J., et al., 2001. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3. Preferentemente, se tiene cuidado para evitar la degradación del ARN durante el proceso de extracción.
También se divulga que el nivel de expresión puede determinarse usando ARNm obtenidos de una muestra de tejido fijada en formalina, inluida en parafina. El ARNm puede aislarse de una muestra patológica de archivo o muestra de biopsia que primero se desparafina. Un método de desparafinación a modo de ejemplo implica lavar la muestra parafinada con un disolvente orgánico, tal como xileno. Las muestras desparafinadas pueden ser rehidratadas con una disolución acuosa de un alcohol inferior. Los alcoholes inferiores adecuados, por ejemplo, incluyen metanol, etanol, propanoles y butanoles. Las muestras desparafinadas pueden ser rehidratadas con lavados sucesivos con soluciones de alcoholes inferiores de concentración decreciente, por ejemplo. Alternativamente, la muestra se desparafina y se rehidrata simultáneamente. La muestra se lisa entonces y se extrae ARN de la muestra. También pueden obtenerse muestras de tejido tumoral reciente, tales como un tumor extirpado. En una realización particular, las muestras pueden obtenerse de tejido tumoral fresco o de tejido congelado incluido en OCT. Las muestras pueden obtenerse por colonoscopia y entonces incluirse en parafina.
Con el fin de normalizar los valores de expresión de ARNm entre las diferentes muestras, es posible comparar los niveles de expresión del ARNm de interés en las muestras de prueba con la expresión de un ARN control. Un “ARN control”, como se usa en el presente documento, se refiere a ARN cuyos niveles de expresión no cambian o cambian solo en cantidades limitadas en células tumorales con respecto a células no tumorigénicas. Preferentemente, el ARN control es ARNm derivado de genes de mantenimiento y que codifican proteínas que se expresan constitutivamente y que llevan a cabo funciones celulares esenciales. Genes de mantenimiento preferidos para su uso en la presente invención incluyen p-2-microglobulina, ubiquitina, proteína ribosómica 18-S, ciclofilina, IPO8, HPRT, GAPDH, PSMB4, tubulina y p-actina. En una realización preferida, el ARN control es GAPDH, IPO8, HPRT, p-actina, proteína ribosómica 18-S o ARNm de PSMB4.
En una realización, la cuantificación de la expresión génica relativa se calcula según el método del ciclo umbral (Ct) comparativo usando GAPDH, IPO8, HPRT, p-actina o PSMB4 como control endógeno y controles de ARN comercial como calibradores. Los resultados finales se determinan según la fórmula 2-(ACt muestra-ACt calibrador), donde los valores de ACT del calibrador y muestra se determinan restando el valor de Ct del gen diana del valor del gen control.
Los métodos adecuados para determinar los niveles de expresión génica al nivel de ARNm incluyen, sin limitación, ensayos estándar para determinar los niveles de expresión de ARNm tales como qPCR, RT-PCR, análisis de protección de ARN, transferencia Northern, transferencia en mancha de ARN, hibridación in situ, tecnología de micromatrices, métodos basados en etiquetas tales como análisis en serie de la expresión génica (SAGE) que incluyen variantes tales como LongSAGE y SuperSAGE, micromatrices, hibridación de fluorescencia in situ (FISH), que incluye variantes tales como Flow-FISH, qFiSH y FISH de fusión doble (D-FISH), y similares.
Los métodos adecuados para determinar los niveles de expresión génica a nivel de proteínas incluyen, sin limitación, métodos convencionales para determinar los niveles de expresión de proteína, tal como usar anticuerpos con una capacidad para unirse específicamente a las proteínas codificadas por dichos genes (o a fragmentos de las mismas que contienen determinantes antigénicos) y posterior cuantificación de los complejos anticuerpo-antígeno resultantes. En una realización particular, los niveles de proteína PD-ECGF pueden cuantificarse usando ensayos estándar para determinar los niveles de expresión de proteína tales como inmunotransferencia o transferencia Western, ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sándwich de anticuerpo doble), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips o micromatrices de proteína que incluyen anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como tiras reactivas.
Los anticuerpos que van a emplearse en estos ensayos pueden ser, por ejemplo, sueros policlonales, sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, ScFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados. Al mismo tiempo, los anticuerpos pueden marcarse o no. Ejemplos ilustrativos, pero no exclusivos, de marcadores que pueden usarse incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc. Hay una amplia variedad de ensayos muy conocidos que pueden usarse en la presente invención, que usan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios); entre estas técnicas están incluidas inmunotransferencia o transferencia Western, ELISA, RIA, EIA competitivo, DAS-ELISA, técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips o micromatrices de proteína que incluyen anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal en formatos tales como tiras reactivas. Otras formas de detección y cuantificación de los niveles de la proteína de interés incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de ligando de unión, etc.
Por otra parte, la determinación de los niveles de la proteína PD-ECGF puede llevarse a cabo construyendo una micromatriz de tejido (TMA) que contiene las muestras del sujeto ensambladas, y determinando los niveles de expresión de la proteína correspondiente por técnicas inmunohistoquímicas. La intensidad de inmunotinción puede ser evaluada por dos o más patólogos diferentes y puntuarse usando criterios de corte uniformes y claros, con el fin de mantener la reproducibilidad del método. Pueden resolverse las discrepancias por re-evaluación simultánea. Brevemente, el resultado de la inmunotinción puede registrarse como expresión negativa (0) frente a expresión positiva, y expresión baja (1+) frente a expresión moderada (2+) y alta (3+), teniendo en cuenta la expresión en células tumorales y el valor de corte específico para cada marcador. Como un criterio general, los valores de cortes se seleccionan con el fin de facilitar la reproducibilidad, y cuando sea posible, traducir eventos biológicos. Alternativamente, la intensidad de inmunotinción puede evaluarse usando técnicas de obtención de imágenes y métodos automatizados tales como los divulgados en Rojo, M.G. et al. (Folia Histochem. Cytobiol. 2009; 47: 349-54) o Mulrane, L. et al. (Expert Rev. Mol. Diagn. 2008; 8: 707-25).
Alternativamente, en otra realización particular, los niveles de la proteína PD-ECGF se determinan por inmunotransferencia. La inmunotransferencia se basa en la detección de proteínas previamente resueltas por electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes e inmovilizadas sobre una membrana, generalmente nitrocelulosa, por la incubación con un anticuerpo específico y un sistema de revelado (por ejemplo, quimioluminiscente).
En una realización particular, los niveles de expresión de PD-ECGF que van a determinarse en el método diagnóstico de la invención se determinan como niveles de proteína PD-ECGF. En una realización más particular, los niveles de proteína PD-ECGF se determinan por ELISA, inmunotransferencia o por inmunohistoquímica.
El término “nivel de actividad” de una proteína, más particularmente de una enzima, como se usa en el presente documento, se refiere a una medida de la actividad enzimática, particularmente medida como moles de sustrato convertidos por unidad de tiempo.
Los ensayos para determinar el nivel de actividad de una enzima son conocidos por el experto e incluyen, sin limitación, ensayos de velocidad inicial, ensayos de curvas de progreso, ensayos cinéticos transitorios y ensayos de relajación. Los ensayos continuos de actividad enzimática incluyen, sin limitación, ensayos espectrofotométricos, fluorométricos, calorimétricos, quimioluminiscentes, de dispersión de la luz y de termoforesis a microescala. Los ensayos discontinuos de actividad enzimática incluyen, sin limitación, ensayos radiométricos y cromatográficos. Como entiende el experto, los factores que pueden influir en la actividad enzimática comprenden concentración de sales, temperatura, pH y concentración de sustrato.
En una segunda etapa del método diagnóstico de la invención, los niveles de expresión de PD-ECGF en la muestra de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse se comparan con un valor de referencia.
En el contexto del método de la invención, para el diagnóstico de cáncer en un sujeto, el valor de referencia es el nivel de expresión de PD-ECGF determinado en una muestra de un sujeto sano, es decir, un sujeto no diagnosticado con cáncer, o en una muestra de tejido no tumoral de un sujeto diagnosticado con cáncer, preferentemente el valor de referencia es el nivel de expresión de PD-ECGF determinado en una muestra de un sujeto sano, o en un sujeto no diagnosticado con cáncer.
Una vez se establece este valor de referencia, el nivel de PD-ECGF expresado en la muestra puede compararse con dicho valor de referencia, y así se asigna un nivel de expresión “elevado” o “reducido”. Por ejemplo, un aumento en los niveles de expresión por encima del valor de referencia de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más en comparación con el valor de referencia se considera nivel de expresión “elevado”. Por otra parte, una disminución en los niveles de expresión por debajo del valor de referencia de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, 0,1 veces, 0,05 veces, 0,025 veces, 0,02 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menos en comparación con el valor de referencia se considera nivel de expresión “reducido”.
De este modo, si se observa un nivel de expresión de PD-ECGF elevado en la muestra de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse cuando se compara con un valor de referencia, entonces al sujeto se le diagnostica cáncer. Alternativamente, si se observa un nivel de expresión de PD-ECGF reducido en la muestra de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse cuando se compara con el valor de referencia, entonces al sujeto no se le diagnostica cáncer.
Método de predicción de la respuesta a un tratamiento antiangiogénico según la invención
Los autores de la presente invención han encontrado que los niveles de PD-ECGF determinados en pacientes con cáncer muestran una correlación estadísticamente significativa con el riesgo de que los pacientes muestren evolución temprana después del tratamiento con una terapia antiangiogénica. Así, en un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método de predicción de la respuesta al tratamiento en un sujeto que padece cáncer y que se somete a un tratamiento antitumoral que comprende
(i) determinar los niveles de PD-ECGF en una muestra de dicho sujeto y,
(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,
en donde
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están elevados cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una mala respuesta del paciente con cáncer al tratamiento, y
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están reducidos cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una buena respuesta del paciente con cáncer al tratamiento.
En un aspecto particular, la invención se refiere a un método de predicción de la respuesta de un sujeto que padece cáncer a un tratamiento antiangiogénico, en donde el tratamiento antiangiogénico se selecciona del grupo que consiste en
- un anticuerpo monoclonal anti-VEGF, derivado o fragmento del mismo, preferiblemente Bevacizumab, anibizumab, ranibizumab o Fab IMC 1121 o F200 Fab,
- un inhibidor de tirosinas quinasas estimuladas por VEGF, preferiblemente lapatinib (Tykerb), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinib, vatalanib y pazopanib,
- un agente anti-FGF, preferiblemente suramina y sus derivados, pentosano polisulfato, cediranib, pazopanib o BIBF 1120,
- un agente anti-EGF, preferiblemente cetuximab, gefitinib o erlotinib,
- un agente anti-HGF, tal como ARQ197, JNJ-38877605, PF-04217903, SGX523, NK4, o AMG102,
- un polipéptido antiangiogénico tal como angiostatina, endostatina, anti-trombina III antiangiogénica, sFRP-4 como se describe en el documento WO2007115376,
- pagaptanib,
- aflibercerpt (VEGF-Trap)
- un anticuerpo bloqueante de VEGFR2, preferiblemente Ramucirumab (IMC-1121B) y DC101 (también conocido como Acm anti-Flk-1),
- un compuesto seleccionado del grupo que consiste en Marimastat; AG3340; COL-3, BMS-275291, talidomida, SU5416, SU6668, EMD121974, 2-metoxioestradiol, carboxiamidotriazol, CMIOI (toxina GBS), pentosano polisulfato, angiopoyetina 2, herbimicina A, PNU145156E, 16K fragmento de prolactina, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteina, TNP470, paclitaxel, Accutin, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor de plaquetas 4 y minociclina,
dicho método comprende
(i) determinar los niveles de PD-ECGF en una muestra de dicho sujeto y,
(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,
en donde
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están elevados cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una mala respuesta al tratamiento antiangiogénico, y
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están reducidos cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una buena respuesta al tratamiento antiangiogénico.
En una realización más particular, la invención se refiere a un método de predicción de la respuesta de un sujeto que padece cáncer a un tratamiento antiangiogénico, en el que dicho tratamiento antiangiogénico no es terapia con doxorrubicina o interferón, que comprende
(i) determinar los niveles de PD-ECGF en una muestra de dicho sujeto y,
(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,
en donde
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están elevados cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una mala respuesta al tratamiento antiangiogénico, y
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están reducidos cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una buena respuesta al tratamiento antiangiogénico.
En una primera etapa del método de la invención para predecir la respuesta a un tratamiento antiangiogénico, los niveles de expresión de PD-ECGF se determinan en una muestra de un sujeto que padece cáncer cuya respuesta al tratamiento va a predecirse.
La muestra en la que el nivel de expresión de PD-ECGF se determina puede ser cualquier muestra que contenga células del tumor. En una realización particular, la muestra que contiene células del posible tumor es una muestra de fluido biológico. En una realización particular, la muestra que contiene células del tumor es tejido tumoral o una porción del mismo. En una realización más particular, dicha muestra de tejido de tumor es una muestra de tejido de tumor de riñón de un paciente cuya respuesta al tratamiento antiangiogénico de cáncer de riñón va a predecirse, o una muestra de tejido de tumor de mama de un paciente cuya respuesta al tratamiento antiangiogénico de cáncer de mama va a predecirse, o una muestra de tejido de tumor colorrectal de un paciente cuya respuesta al tratamiento antiangiogénico de cáncer colorrectal va a predecirse. Dicha muestra puede obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, biopsia, extirpación quirúrgica o aspiración, usando métodos muy conocidos para los expertos en las técnicas médicas relacionadas y previamente descritos en el contexto del método diagnóstico de la invención. En una realización, la muestra que contiene células tumorales es una muestra del tumor primario. En otra realización, el tumor es un tumor metastásico y la muestra en la que los niveles de PD-ECGF se determinan es una muestra de la metástasis.
En otra realización, la muestra en donde el nivel de expresión de PD-ECGF se determina es un biofluido del paciente que padece cáncer cuya respuesta al tratamiento va a predecirse. En una realización preferida, el biofluido se selecciona de sangre, particularmente sangre periférica, plasma o suero. El experto en la materia conoce métodos para la obtención de muestras de sangre, suero y plasma y se han descrito previamente en el contexto del método diagnóstico de la invención.
En una realización particular del método de la invención para predecir la respuesta a un tratamiento antiangiogénico, la muestra en la que se determinan los niveles de expresión de PD-ECGF es una muestra de plasma o una muestra de tejido. En una realización particular, se determinan los niveles de expresión de PD-ECGF en una muestra de plasma o en una muestra de tejido de tumor de mama cuando va a predecirse la respuesta al tratamiento antiangiogénico de cáncer de mama. En una realización alternativa particular, se determinan niveles de expresión de PD-ECGF en una muestra de plasma o en una muestra de tejido de tumor de riñón cuando va a predecirse la respuesta al tratamiento antiangiogénico de carcinoma de células renales (CCR). En otra realización alternativa particular, se determinan niveles de expresión de PD-ECFG en una muestra de plasma o en una muestra de tejido de tumor colorrectal cuando va a predecirse respuesta al tratamiento antiangiogénico de cáncer colorrectal.
Como se describe previamente, pueden cuantificarse niveles de expresión génica midiendo los niveles de ARN mensajero del gen o de la proteína codificados por dicho gen o de la proteína codificada por dicho gen, es decir, proteína PD-ECGF o de variantes de la misma. Se han descrito anteriormente variantes de la proteína PD-ECGF y se incorporan en el presente documento.
Se han descrito previamente métodos de determinación de los niveles de expresión basados en niveles de ARNm y niveles de proteína, particularmente niveles de ARNm de PD-ECGF y niveles de proteína PD-ECGF, en el contexto del método diagnóstico de la invención y se incorporan en el presente documento.
En una realización particular, los niveles de expresión de PD-ECGF que van a determinarse en la predicción de respuesta al tratamiento antiangiogénico por el método de la invención se determinan como niveles de proteína PD-ECGF. En una realización más particular, los niveles de proteína PD-ECGF se determinan por ELISA, inmunotransferencia o por inmunohistoquímica.
En una realización particular, el sujeto que padece cáncer cuya predicción de respuesta al tratamiento va a determinarse por el método de la invención se somete a un tratamiento antiangiogénico, en donde dicho tratamiento antiangiogénico de cáncer se basa en al menos un agente antiangiogénesis.
Los agentes y tratamientos antiangiogénicos según la invención se seleccionan del grupo que consiste en agentes anti-VEGF, que incluyen anticuerpos monoclonales tales como bevacizumab (Avastin, un anticuerpo IgG1 monoclonal humanizado recombinante que se une a e inhibe la actividad biológica de VEGFA humano en sistemas de ensayo in vitro e in vivo), derivados de anticuerpo tales como ranibizumab (Lucentis), o fragmentos de anticuerpos tales como Fab IMC 1121 o Fab F200 o moléculas pequeñas disponibles por vía oral que inhiben las tirosinas quinasas estimuladas por VEGF tales como lapatinib (Tykerb), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinib y pazopanib; agentes anti-factor de crecimiento de fibroblastos (anti-FGF), tales como suramina y sus derivados, pentosano polisulfato, cediranib, pazopanib o BIBF 1120); agentes anti-EGF, tales como cetuximab, gefitinib o erlotinib y agentes anti-HGF, tales como ARQ197, JNJ-38877605, PF-04217903, SGX523, NK4 o AMG102; y polipéptidos antiangiogénicos tales como angiostatina, endostatina, antitrombina III antiangiogénica o sFRP- 4, marimastat; AG3340; COL-3, BMS-275291, talidomida, endostatina, SU5416, SU6668, EMD121974, 2-metoxioestradiol, carboxiamidotriazol, CMIOI (toxina GBS), pentosano polisulfato, angiopoyetina 2 (Regeneron), herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP470, endostatina, paclitaxel, Accutin, angiostatina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor 4 de plaquetas o minociclina, polipéptidos antiangiogénicos, que indican polipéptidos capaces de inhibir la angiogénesis y que incluyen, sin limitación, angiostatina, endostatina, antitrombina III antiangiogénica, sFRP-4 como se describe en el documento WO2007115376, un anticuerpo anti-VEGF tal como ranibizumab, bevacizumab (avastin), Fab IMC 1121 y Fab F200, pegaptanib, sunitinib, pazopanib, sorafenib, vatalanib y aflibercept (VEGF-Trap), anticuerpos bloqueantes de VEGFR2, tales como ramucirumab (IMC-1121B) y DC101 (también conocidos como Acm anti-Flk-1), sunitinib, bevacizumab y DC101.
En una realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento que comprenda un antibiótico de antraciclina. En otra realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento que comprenda doxorrubicina. En otra realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento que comprenda un interferón. En otra realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento que comprenda un interferón de tipo I y/o un interferón de tipo II. En otra realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento que comprenda IFN-a, IFN-p, IFN-£, IFN-k e IFN-u>. En otra realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento que comprenda IFN-y. En otra realización, el tratamiento antiangiogénico es un tratamiento adyuvante, es decir, después de la extirpación quirúrgica del tumor. En una realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento adyuvante que comprenda interferón. En otra realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento adyuvante que comprenda un interferón de tipo I y/o un interferón de tipo II. En otra realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento adyuvante que comprenda IFN-a, IFN-p, IFN-£, IFN-k e IFN-ui. En otra realización, el tratamiento antiangiogénico no es un tratamiento adyuvante que comprenda IFN-y.
Se describen ensayos para determinar la actividad antiangiogénica de un agente particular, sin limitación, en el documento WO 2003086299.
En una segunda etapa del método de predicción de respuesta de la invención, los niveles de expresión de PD-ECGF en la muestra de un sujeto que padece cáncer cuya predicción al tratamiento antiangiogénico va a determinarse se comparan con un valor de referencia.
En el contexto del método de la invención para la predicción de respuesta de cáncer en un sujeto al tratamiento con terapia antiangiogénica, un valor de referencia adecuado puede ser el nivel de expresión de PD-ECGF determinado en una muestra de un sujeto que tiene cáncer o que ha tenido cáncer que ha mostrado una buena respuesta al tratamiento con terapia antiangiogénica, habiendo sido determinados dichos niveles de expresión en el momento en el que el paciente estaba siendo tratado. En otra realización, el valor de referencia es los niveles de PD-ECGF en un paciente sano, es decir, un paciente que no ha sido diagnosticado con el tipo de cáncer para el que se desea una predicción de la respuesta a terapia.
Una vez se establece este valor de referencia, el nivel de PD-ECGF expresado en la muestra puede compararse con dicho valor de referencia, y así se asigna un nivel de expresión “elevado” o “reducido”. Por ejemplo, un aumento en los niveles de expresión por encima del valor de referencia de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más en comparación con el valor de referencia se considera nivel de expresión “elevado”. Por otra parte, una disminución en los niveles de expresión por debajo del valor de referencia de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, 0,1 veces, 0,05 veces, 0,025 veces, 0,02 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menos en comparación con el valor de referencia se considera nivel de expresión “reducido”.
Así, si se observa un nivel de expresión de PD-ECGF elevado en la muestra de un sujeto que padece cáncer cuya predicción de respuesta al tratamiento va a determinarse cuando se compara con un valor de referencia, es indicativo de una mala respuesta al tratamiento. Alternativamente, si un nivel de expresión de PD-ECGF reducido en la muestra de un sujeto que padece cáncer cuya predicción de respuesta al tratamiento va a determinarse cuando se compara con el valor de referencia, es indicativo de una buena respuesta al tratamiento.
Usos de la invención
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de PD-ECGF en la determinación de la respuesta de un paciente con cáncer a un tratamiento antiangiogénico, en donde dicho tratamiento antiangiogénico se selecciona del grupo que consiste en
- un anticuerpo monoclonal anti-VEGF, derivado o fragmento del mismo, preferiblemente Bevacizumab, anibizumab, ranibizumab o Fab IMC 1121 o F200 Fab,
- un inhibidor de tirosinas quinasas estimuladas por VEGF, preferiblemente lapatinib (Tykerb), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinib, vatalanib y pazopanib,
- un agente anti-FGF, preferiblemente suramina y sus derivados, pentosano polisulfato, cediranib, pazopanib o BIBF 1120,
- un agente anti-EGF, preferiblemente cetuximab, gefitinib o erlotinib,
- un agente anti-HGF, tal como ARQ197, JNJ-38877605, PF-04217903, SGX523, NK4, o AMG102,
- un polipéptido antiangiogénico tal como angiostatina, endostatina, anti-trombina III antiangiogénica, sFRP-4 como se describe en el documento WO2007115376,
- pagaptanib,
- aflibercerpt (VEGF-Trap)
- un anticuerpo bloqueante de VEGFR2, preferiblemente Ramucirumab (IMC-1121B) y DC101 (también conocido como Acm anti-Flk-1),
- un compuesto seleccionado del grupo que consiste en Marimastat; AG3340; COL-3, BMS-275291, talidomida, SU5416, SU6668, EMD121974, 2-metoxioestradiol, carboxiamidotriazol, CMIOI (toxina GBS), pentosano polisulfato, angiopoyetina 2, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteina, TNP470, paclitaxel, Accutin, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor de plaquetas 4 y minociclina.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de PD-ECGF en el diagnóstico de carcinoma de células renales (CCR) o cáncer colorrectal en un sujeto, en donde el uso comprende la determinación de los niveles de PD-ECGF en una muestra de un sujeto, en donde la muestra es una muestra de un fluido biológico, en donde el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.
Los términos “diagnóstico de cáncer” y “predicción de la respuesta de un paciente con cáncer a un tratamiento antiangiogénico” se han definido anteriormente y son igualmente aplicables a los usos según la presente invención. En una realización preferida, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de células renales (CCR), cáncer de mama y cáncer colorrectal. En una realización preferida, el uso según la invención comprende el uso del polipéptido PD-ECGF. En una realización, el polipéptido PD-ECGF se usa determinando los niveles usando un reactivo que es capaz de unirse específicamente a PD-ECGF, tal como un anticuerpo o un aptámero. En una realización preferida, el uso según la invención comprende el uso del polinucleótido que codifica el polipéptido PD-ECGF. En una realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido PD-ECGF se usa determinando los niveles usando un reactivo que es capaz de unirse específicamente al polinucleótido que codifica PD-ECGF, tal como un conjunto de cebadores específicos o una sonda.
A continuación, la invención se describe mediante los siguientes ejemplos, que deben considerarse como simplemente ilustrativos y en ningún caso limitantes del ámbito de la presente invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Identificación de los niveles de PD-ECGF en tejido como un marcador de cáncer para la detección, el diagnóstico y el seguimiento de cáncer en pacientes. Determinación de los niveles de proteína p D-ECGF en muestras de tejido no cancerosas o tumorales por inmunohistoquímica.
La expresión de PD-ECGF se analizó en tumores de pacientes por inmunodetección. Se usó un anticuerpo monoclonal de ratón anti-timidina fosforilasa [P-GF, 44C] (Abcam, ab 3151).
Los resultados mostraron que:
- En 12 tejidos no cancerosos, no se detectó PD-ECGF; por tanto, hay una diferencia significativa entre los niveles de PD-ECGF de tejido no canceroso y masa tumoral en pacientes con cáncer (prueba de Mann-Whitney, p<0,0001) (Figura 1).
- Se observó expresión de proteína de PD-ECGF en 67 (>97%) muestras de tejido de 69 pacientes con CCR y en 9 (56%) de 16 en muestras de tejidos de pacientes con cáncer de mama analizados por inmunohistoquímica. - PD-ECGF tiene diferentes localizaciones (membrana, citoplasma y núcleo), lo que permite evaluar los diferentes grados de expresión según la localización, y
- PD-ECGF muestra diferentes niveles de expresión dependiendo de las características intrínsecas de cada tumor.
Cuando se analizaron los niveles de expresión basal de PD-ECGF (pre-tratamiento), se observó que los tumores mostraron diferentes niveles de expresión basal (Figura 2 y 3), probablemente dependiendo de las características intrínsecas de cada tumor.
Ejemplo 2. Identificación de los niveles de PD-ECGF en plasma como marcador de cáncer para la detección, el diagnóstico y el seguimeinto de cáncer en pacientes. Determinación de los niveles de proteína p D-ECGF en muestras de plasma por ELISA.
Se analizó la expresión de PD-ECGF en plasma de sujetos sanos y pacientes con cáncer por ELISA. Se usó un kit de ELISA de timidina fosforilasa humana, t P [CSB-E10814h].
Los resultados mostraron que:
- Los niveles de PD-ECGF en plasma no eran detectables en sujetos sanos en comparación con pacientes con cáncer. Cuantitativamente, hay una diferencia estadísticamente significativa entre los niveles de PD-ECGF de sujetos sanos y los niveles en plasma de PD-ECGF en pacientes con cáncer (prueba de Mann-Whitney, p= 0,0013) (Figura 5).
- Se observó expresión de proteína de PD-ECGF en 14 (>87%) muestras de plasma de 16 pacientes con CCR, en 11 (69%) de 16 en muestras de plasma de pacientes con cáncer de mama y en 52 (90%) de 58 en muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal analizadas por ELISA.
- PD-ECGF muestra diferentes niveles de expresión dependiendo de las características de cada paciente.
- Cuando se analizaron los niveles de expresión basales de PD-ECGF, se observó que los pacientes mostraron diferentes niveles de expresión basales (Figura 6, 7 y 8), probablemente dependiendo de las características intrínsecas de cada paciente.
Ejemplo 3. Identificación de PD-ECGF como factor pronóstico de respuesta a tratamiento antiangiogénico por inmunohistoquímica y ELISA.
Se analizó la expresión de PD-ECGF en tumores de pacientes por inmunodetección. Se usó un anticuerpo monoclonal de ratón anti-timidina fosforilasa [P-GF, 44C] (Abcam, ab 3151).
Los resultados mostraron que:
- Se evaluó PD-ECGF en muestras de tejido de CCR de 63 pacientes; hay una asociación significativa entre niveles de PD-ECGF en tejido más altos y riesgo más alto de evolución temprana en pacientes con CCR (prueba de Kaplan-Meier y de Gehan-Breslow-Wilcoxon, p=0,045) (Figura 4).
Por otra parte, la expresión de PD-ECGF se analizó en plasma de pacientes por ELISA. Se usó un kit de ELISA de timidina fosforilasa humana, TP [CSB-E10814h].
Los resultados mostraron que:
- Se evaluó PD-ECGF en muestras de plasma de cáncer colorrectal de 52 pacientes; hay una asociación significativa entre niveles en plasma de PD-ECGF y el riesgo de evolución temprana representada por una razón de riesgo significativa para niveles de PD-ECGF en evolución de la enfermedad en pacientes con cáncer colorrectal (se usó la probabilidad posterior de la razón de riesgo para evaluar los datos, y la probabilidad posterior de que la razón de riesgo fuera superior a 1 fue igual a 0,041, lo que muestra la asociación entre evolución tumoral y niveles de PD-ECGF) (Figura 9).
- Se evaluó PD-ECGF en muestras de plasma de CCR de 14 pacientes; hay una asociación significativa entre niveles más altos en plasma de PD-ECGF y riesgo más alto de evolución temprana en pacientes con CCR (pruebas de Kaplan-Meier y del rango logarítmico (Mantel-Cox), p<0,07). (Figura 10).
Así, la expresión de PD-ECGF tiene un posible valor en predecir la evolución de cáncer en pacientes tratados. Estos hallazgos apoyan el uso de PD-ECGF como un novedoso biomarcador con valor predictivo de respuesta al tratamiento para CCR, cáncer de mama, cáncer colorrectal y otros tipos de cáncer.
Ejemplo 4. Niveles de expresión de PD-ECGF y pronóstico de cáncer
Para analizar la relación entre los niveles de expresión de PD-ECGF y el pronóstico de cáncer, los inventores generaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier basadas en pacientes con cáncer con expresión alta o baja de PD-ECGF usando cBioPortal for Cancer Genomics (www.cbioportal.org) (Fig. A-M).
Se siguió el siguiente protocolo para generar las Figuras 11-23: seleccionar “Query” en la página de inicio del sitio web www.cbioportal.org, seleccionar “Studies in cancer patients (*)” de Select Cancer Study. En “Select Genomic Profiles”, seleccionar solo “mRNA Expression z-Scores (RNA Seq V2 RSEM). “Enter Gene set”, introducir “TYMP”, y entonces hacer clic en “Submit”. Oncoprint da el porcentaje de alteración (véase la Tabla 1 y la Tabla 2 a continuación) y hacer clic en la pestaña “Survival”, aparecerá la estimación de supervivencia global de Kaplan-Meier.
Tabla 1. Porcentaje de alteración de PD-ECGF en líneas de células cancerosas
Figure imgf000016_0002
Tabla 2. Porcentaje de alteración de PD-ECGF en pacientes con cáncer
Figure imgf000016_0001
Los resultados mostraron lo siguiente:
- los casos de adenocarcinoma colorrectal con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia sin enfermedad que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 11),
- los casos de glioblastoma con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia global que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 12),
- los casos de carcinoma renal de células claras de riñón con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia global que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 13),
- los casos de carcinoma renal de células claras de riñón con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia sin enfermedad que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 14),
- los casos de carcinoma renal de células claras de riñón con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia global que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 15),
- los casos de carcinoma renal de células papilares de riñón con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia sin enfermedad que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 16),
- los casos de adenocarcinoma de pulmón con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia global que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 17),
- los casos de adenocarcinoma de pulmón con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia sin enfermedad que los casos sin alteración de p D-ECGF (Figura 18),
- los casos de adenocarcinoma de próstata con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia sin enfermedad que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 19),
- los casos de cáncer de células germinales testiculares con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia global que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 20),
- los casos de timoma con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia global que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 21),
- los casos de timoma con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia sin enfermedad que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 22), y
los casos de carcinoma tiroideo papilar con alteración de PD-ECGF tienen peor supervivencia global que los casos sin alteración de PD-ECGF (Figura 23).

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para el diagnóstico de cáncer en un sujeto que comprende
(i) determinar los niveles de PD-ECGF en una muestra de dicho sujeto, en donde la muestra es una muestra de un fluido biológico y,
(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,
en donde
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están elevados cuando se comparan con un valor de referencia, entonces al sujeto se le diagnostica cáncer, y
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están reducidos cuando se comparan con un valor de referencia, entonces al sujeto no se le diagnostica cáncer y
en donde el cáncer es carcinoma de células renales (CCR) o cáncer colorrectal,
en donde el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.
2. El método según la reivindicación 1, en donde la muestra de fluido biológico es una muestra de plasma.
3. Un método para predecir la respuesta de un sujeto que padece cáncer a un tratamiento antiangiogénico, en donde dicho tratamiento antiangiogénico se selecciona del grupo que consiste en
un anticuerpo monoclonal anti-VEGF, derivado o fragmento del mismo, preferiblemente Bevacizumab, anibizumab, ranibizumab o Fab IMC 1121 o F200 Fab,
un inhibidor de tirosinas quinasas estimuladas por VEGF, preferiblemente lapatinib (Tykerb), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinib, vatalanib y pazopanib,
un agente anti-FGF, preferiblemente suramina y sus derivados, pentosano polisulfato, cediranib, pazopanib o BIBF 1120,
un agente anti-EGF, preferiblemente cetuximab, gefitinib o erlotinib,
un agente anti-HGF, tal como ARQ197, JNJ-38877605, PF-04217903, SGX523, NK4, o AMG102, un polipéptido antiangiogénico tal como angiostatina, endostatina, anti-trombina III antiangiogénica, sFRP-4 como se describe en el documento WO2007115376,
pagaptanib,
aflibercerpt (VEGF-Trap)
un anticuerpo bloqueante de VEGFR2, preferiblemente Ramucirumab (IMC-1121B) y DC101 (también conocido como Acm anti-Flk-1),
un compuesto seleccionado del grupo que consiste en Marimastat; AG3340; COL-3, BMS-275291, talidomida, SU5416, SU6668, EMD121974, 2-metoxioestradiol, carboxiamidotriazol, CMIOI (toxina GBS), pentosano polisulfato, angiopoyetina 2, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteina, TNP470, paclitaxel, Accutin, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor de plaquetas 4 y minociclina,
dicho método comprende
(i) determinar los niveles de PD-ECGF en una muestra de dicho sujeto y,
(ii) comparar los niveles obtenidos en (i) con un valor de referencia,
en donde
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están elevados cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una mala respuesta al tratamiento antiangiogénico, y
- si los niveles de PD-ECGF en una muestra del sujeto están reducidos cuando se comparan con un valor de referencia, es indicativo de una buena respuesta al tratamiento antiangiogénico.
4. Un método según la reivindicación 3, en donde la respuesta se mide como evolución temprana de cáncer.
5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en donde el tratamiento antiangiogénico se inicia después de la determinación de los niveles de PD-ECGF.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde la muestra es una muestra de tejido o una muestra de fluido biológico.
7. El método según la reivindicación 6, en donde la muestra de tejido es una muestra del tumor.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el tumor es el tumor primario o una metástasis.
9. El método según la reivindicación 6, en donde la muestra de fluido biológico es una muestra de plasma.
10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el valor de referencia se determina en la muestra de un sujeto sano o en una muestra de un sujeto no diagnosticado con cáncer.
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde los niveles de PD-ECGF determinados son niveles de proteína PD-ECGF.
12. El método según la reivindicación 11, en donde los niveles de proteína PD-ECGF se determinan por inmunohistoquímica, por ELISA, o por inmunotransferencia.
13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de células renales (CCR), cáncer de mama y cáncer colorrectal.
14. Uso de PD-ECGF en la determinación de la respuesta de un paciente con cáncer a un tratamiento antiangiogénico, en donde dicho tratamiento antiangiogénico se selecciona del grupo que consiste en
- un anticuerpo monoclonal anti-VEGF, derivado o fragmento del mismo, preferiblemente Bevacizumab, anibizumab, ranibizumab o Fab IMC 1121 o F200 Fab,
- un inhibidor de tirosinas quinasas estimuladas por VEGF, preferiblemente lapatinib (Tykerb), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar), axitinib, vatalanib y pazopanib,
- un agente anti-FGF, preferiblemente suramina y sus derivados, pentosano polisulfato, cediranib, pazopanib o BIBF 1120,
- un agente anti-EGF, preferiblemente cetuximab, gefitinib o erlotinib,
- un agente anti-HGF, tal como ARQ197, JNJ-38877605, PF-04217903, SGX523, NK4, o AMG102, - un polipéptido antiangiogénico tal como angiostatina, endostatina, anti-trombina III antiangiogénica, sFRP-4 como se describe en el documento WO2007115376,
- pagaptanib,
- aflibercerpt (VEGF-Trap)
- un anticuerpo bloqueante de VEGFR2, preferiblemente Ramucirumab (IMC-1121B) y DC101 (también conocido como Acm anti-Flk-1),
- un compuesto seleccionado del grupo que consiste en Marimastat; AG3340; COL-3, BMS-275291, talidomida, SU5416, SU6668, EMD121974, 2-metoxioestradiol, carboxiamidotriazol, CMIOI (toxina GBS), pentosano polisulfato, angiopoyetina 2, herbimicina A, PNU145156E, 16K fragmento de prolactina, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteina, TNP470, paclitaxel, Accutin, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor de plaquetas 4 y minociclina.
15. Uso según la reivindicación 14, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de células renales (CCR), cáncer de mama y cáncer colorrectal.
16. Uso de PD-ECGF en el diagnóstico de carcinoma de células renales (CCR) o cáncer colorrectal en un sujeto en donde el uso comprende la determinación de los niveles de PD-ECGF en una muestra de un sujeto, en donde la muestra es una muestra de un fluido biológico, en donde el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.
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