KR101127225B1 - 요로상피암 표지자 및 그를 이용한 요로상피암 진단방법 - Google Patents

요로상피암 표지자 및 그를 이용한 요로상피암 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 요로상피암 표지자 및 그를 이용한 요로상피암 진단방법, 치료, 및 예후판정에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 정상인, 비침윤성 및 침윤성 요로상피암의 표지자 및 그를 이용한 요로상피암 진단방법, 치료 및 예후판정 등에 관한 것이다.
본 발명의 요로상피암 표지자는 현재 임상에서 이용되고 있는 방광 요로상피암 표지자의 민감도와 특이도의 문제점을 보완한 것으로, 방광 요로상피암의 진단, 재발 및 근육 침윤성으로 진행의 추적관찰 등에 적용 가능하다.

Description

요로상피암 표지자 및 그를 이용한 요로상피암 진단방법{Biomarker of Urothelial Cancer and the Diagnostic Method of the Same}
본 발명은 요로상피암 표지자 및 그를 이용한 요로상피암 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 정상인, 비침윤성 및 침윤성 요로상피암의 표지자 및 그를 이용한 요로상피암 진단방법, 치료 및 예후판정 등에 관한 것이다.
방광 요로상피암은 미국에서만 해년마다 10만명의 새로운 환자가 발생하고 있으며, 우리나라에서도 비뇨기암 중 가장 흔한 종양으로 대부분이 비침윤성 방광암이다. 새롭게 발생하는 방광 요로상피암 중 근육 비침윤성 방광암이 약 70%, 근육 침윤성 방광암이 약 30%로 진단되고 있다. 특히 근육 비침윤성 방광암은 병리학적으로 70%는 병기 Ta, 20%는 병기 T1, 나머지 10%는 carcinoma in situ(CIS)이며 과거에 비하여 방광암의 발생률 증가와 이에 따른 그 수술 빈도 역시 증가하고 있다.
방광에 발생하는 요로상피암 중 대부분의 근육 비침윤성 방광암은 경요도 방광종양절제술로 치료할 수 있으나, 약 30~70%에 이르는 재발률과 약 10~30%에 이르는 방광 근육층을 침범하는 침윤성 방광암으로 진행하는 문제점이 있다. 이러한 문제점으로 비침윤성 방광암의 재발 및 진행의 경과 관찰을 위하여 방광경 및 요세포검사를 통한 정기적인 추적관찰이 반드시 필요하다.
요세포검사는 비침습적 검사이고, 분화도가 나쁜 방광 요로상피암의 발견에는 좋은 표지자 역할을 하며, 특이도가 90~95%로 매우 높은 장점이 있다. 그러나 전반적인 민감도가 35~40%정도로 낮고, 특히 저병기, 분화도가 좋은 방광암에서는 민감도가 상대적으로 더욱 낮다. 또한 검사 의뢰 후 검사가 시작될 때까지의 지연으로 인한 검체의 변질 가능성 및 정량적인 측정이 힘들다는 점과 검사결과가 판독이 주관적일 수 있어 병리학자에 따른 판독의 차이가 발생할 수 있고 그 정확도는 검사자의 숙련도에 따라 좌우될 수 있다는 단점이 있다.
방광 요로상피암의 추적관찰에 가장 유용한 방광경 검사는 현재까지의 검사 방법 중 가장 민감도가 높은 검사이나 연성 방광경의 사용, 요도의 국소마취, 시술전 진통제의 투여에도 환자들에게 통증과 불쾌감을 주는 침습적인 검사이며, 종물의 모양이 편평하거나 상피내암일 경우, 그리고 상부요로에 생긴 요로상피세포암을 진단하는 데 있어서는 한계점이 있다.
방광 요로상피암의 표지자는 요세포 검사보다 질병 민감도가 우수하다. 그러나 특이도에 있어 요세포 검사보다 낮은 성적을 보이고 있다. 최근 10여 년 사이에 새로운 방광암의 표지자가 많이 늘어나고 있으나 요 ThinPrepR 검사, BTA test, BAT Stat, BTA TRAK assay, NMP22(Nuclear matrix proteins) test, NMP 22 BladderChekTM, UBTTM test, Accu-Dx test(fibrin degradation products test) 등의 다양한 방광암의 표지자들은 방광 요로상피암에 대한 종양 특이 단백질이 아니며, 종양과 관련된 단백질로 비특이적이고, 다른 질환 및 정상에서도 양성반응을 보여 특이도가 낮다. 그러므로 방광 요로상피암의 진단, 추적관찰에 있어 큰 한계점을 가지고 있어 민감도가 낮은 요세포 검사를 대처하기는 힘든 실정이다.
방광 요로상피암의 발생은 TP53, RB, P21, P27, P16등의 tumor suppressor genes 비활성화, RAS 등의 oncogene의 활성화, 그리고 EGF(ERBB1, ERBB2) receptor의 과발현이 중요한 역할을 하고 있다.
현재 임상에서 근육 비침윤성 방광암의 재발 및 근육 침윤성으로 진행을 예방하기 위하여 방광내 면역요법 및 항암요법이 적용되고 있다. 그러나 가장 효과가 우수한 면역요법의 경우 약 50%에서 재발 및 진행을 막지 못하는 것으로 보고되고 있다.
과거의 연구를 바탕으로 방광암의 발생시 작용하는 gene은 현재까지도 활발하게 연구되고 있으나, 근육 비침윤성 및 침윤성 방광 요로상피암에서 발현되는 단백질과 정상인의 방광조직 단백질 발현의 차이에 대한 연구는 전무한 실정이다.
즉, 현재 임상에서 적용되고 있는 방광 요로상피암 표지자들은 소변에서 배출되는 변화된 단백질을 선별을 위하여 개발되었기에 진단 및 추적관찰 도구로써 민감도는 높으나 특이도가 낮은 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 방광 요로상피암 진단 및 추적관찰 도구로써 민감도 및 특이도가 높은 표지자들을 찾고자 예의 노력을 기울인 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 목적은 요로상피암 표지자 및 그를 이용한 요로상피암 진단방법, 치료 및 예후판정 등을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코피린(Cofilin) 및 P-코피린(P-cofilin) 중 어느 하나 이상의 단백질을 포함하는 요로상피암 표지자를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 요로상피암은 비침윤성 또는 침윤성인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 진단 대상의 소변을 채취하는 단계; (b) 채취된 소변 내에, 코피린(Cofilin) 및 P-코피린(P-cofilin) 중 어느 하나 이상의 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 코피린(Cofilin) 및 P-코피린(P-cofilin) 중 어느 하나 이상의 단백질의 발현 정도를 정상인과 비교하는 단계를 포함하는 요로상피암의 진단방법 및 예후판정 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 요로상피암은 비침윤성 또는 침윤성인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 발현 정도를 측정하는 방법은 (1) 소변에서 단백질을 직접 측정하는 방법 또는 (2) 소변내의 축출된 요로상피세포에서 단백질 측정 및 면역 염색에 의한 단백질 발현을 검사하는 방법인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 immunoblotting, immunohistochemical assay, Boyden chamber assay, Real time polymerase chain reaction, MALDI TOF/TOF MS/MS, ELISA 등 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 코피린(Cofilin) 및 P-코피린(P-cofilin) 중 어느 하나의 단백질을 억제하는 것을 특징으로 하는 요로상피암의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법을 이용하여 요로상피암의 위험인자를 검사하는 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 단백체학을 통한 독창적으로 선별 및 확보한 요로상피암 표지자를 제공하는 효과가 있다.
본 발명의 요로상피암 표지자는 현재 임상에서 이용되고 있는 방광 요로상피암 표지자의 민감도와 특이도의 문제점을 보완한 것으로, 방광 요로상피암의 진단, 재발 및 근육 침윤성으로 진행의 추적관찰에 적용 가능하다.
도 1은 정상인, 비침윤성 및 침윤성 방광암 조직의 단백질 발현을 2-DE 겔 이미지로 나타낸 것으로, NMIBC는 비근육침윤성 방광암(Non-muscle invasive bladder cancer)을 MIBC는 근육침윤성 방광암(Muscle invasive bladder cancer)을 나타낸다.
도 2는 정상인, 비침윤성 및 침윤성 방광암 조직에서 상승 조절 또는 하강 조절 단백질의 발현 프로파일 및 정량 분석을 한 것으로, NMIBC는 비근육침윤성 방광암(Non-muscle invasive bladder cancer)을 MIBC는 근육침윤성 방광암(Muscle invasive bladder cancer)을 나타낸다.
도 3은 정상인, 비침윤성 및 침윤성 방광암 조직에서 코피린의 발현 및 인산화 정도를 나타낸 것으로, NMIBC는 비근육침윤성 방광암(Non-muscle invasive bladder cancer)을 MIBC는 근육침윤성 방광암(Muscle invasive bladder cancer)을 나타낸다.
도 4는 인간 방광 암 T24 세포의 EGF-유도 인산화를 나타낸 것이다.
도 5는 인간 방광 암 T24 세포의 증식 및 이동에 있어서의 EGF의 영향을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
현재 임상에서 적용되고 있는 방광 요로상피암 표지자들은 소변에서 배출되는 변화된 단백질 선별을 위하여 개발되었기에 진단 및 추적관찰 도구로써 민감도는 높으나 특이도가 낮은 문제점이 있으므로, 본 발명자들은 기존 표지자 검출 방법과 달리 방광 요로상피암 발생시 조직에서 변화되는 단백질의 발현을 바탕으로 정상조직, 근육 비침윤성 방광 요로상피암, 근육 침윤성 방광 요로상피암의 차이를 확인하였다. 즉, 요로상피암 발생시, 두드러진 차이를 보이는 단백질을 바탕으로 소변에서 차이를 확인하여 방광 요로상피암의 새로운 표지자를 발견한 것이다.
본 발명자들은 상기와 같은, 단백체학으로 정상인의 방광조직의 단백질 발현과 근육 비침윤성 및 침윤성 방광암에서 상이하게 발현되는 단백질인 코피린(cofilin)과 p-코피린(p-cofilin)을 확보하여 이용 가능성을 확인하였다.
Cofilin과 P-cofilin의 항체(antibody)를 이용한 면역화학염색에서 정상 방광조직, 근육 비침윤성 및 침윤성 방광 요로상피암 조직에서 단백체학을 바탕으로 한 단백질발현 결과와 동일한 결과를 보였다. 경요도 방광종양절제술 후 조직에서 면역화학염색을 통하여 근육 비침윤성 및 근육 침윤성 방광암의 진단에 유용하다. 또한 조직내에서 발현되는 Cofilin과 P-cofiln의 발현 비율 차이는 근육 비침윤성과 근육 침윤성 방광암의 구별에 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1. 실험준비
본 발명에 사용되는 재료의 출처는 다음과 같다:
a) 2-DE(2-Dimension Electrophoresis) 및 MS(mass spectrometry)를 위한 재료-BioRad(Hercules, CA, USA) 또는 Applied Biosystems(Foster City, CA, USA).
b) rhEGF(recombinant human epidermal growth factor)-R&D Systems(Minneapolis, MN, USA).
c) McCoy's 5 A medium-Welgene(Korea).
d) Fetal bovine serum(FBS), 페니실린, 스트렙토마이신 및 화학약품-Hyclone(Logan, UT, USA) 또는 Sigma(St. Louis, MO, USA).
e) Polyclonal anti-phosphorylatedser3 코피린 및 anti-nonphosphorylated 코피린 항체-Cell Signaling(Beverly, MA, USA).
f) Polyclonal GAPDH 항체-Sigma(St. Louis, MO, USA).
실험예 2. 실험방법
모든 실험은 건국대학교의 가이드라인에 따라서 수행하였다. 본 연구는 건국대 충주 병원의 IRB(임상시험심사위원회)에서 승인받은 것이다. 정상인 및 방광 암 환자(비침윤성 및 침윤성)의 요로상피는 방광 생체 검사 및 생리적 식염수(in mM; NaCl 136.9, KCl 5.4, CaCl2 1.5, MgCl2 1.0, NaHCO3 23.8, EDTA 0.01)에서의 경요도 절제술에 의해 제거되고, 조직병리학적으로 확인하였다. 확인된 샘플은 프로테오믹과 웨스턴 블럿 분석을 하기 위해, 액체 질소(N2)에서 순간 동결하였다. 면역조직화적 분석을 위한 샘플을 4% 파라포름알데히드 용액에 8시간 모두 담가뒀고, 파라핀에 묻어 뒀다.
실험예 3. 통계분석
본 발명의 데이터는 평균값±표준편차(SEM)로 표시했으며, 데이터의 통계적 평가는 그룹간 비교를 위해 Student's t-test를, 다양한 비교들을 위해서는 ANOVA를 이용하였다. p<0.05의 경우, 통계적으로 상당히 다른 값으로 여겼다.
실시예 1. 2차 전기영동 및 MALDI - TOF / TOF MS
정상인 및 암(침윤성, 비침윤성) 환자의 방광 조직 샘플들을 8M urea, 2M thiourea, 100mM DTT, 4% CHAPS(3[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-propanesulfonic acid) 및 1× complete protease inhibitor cocktail(Roche Applied Science, Germany)이 포함된, 2-DE 용해 완충액(lysis buffer)에서 균질화 시켰다.
상기 균질화된 현탁액을 40분 배양한 후, 12,000×g, 10℃의 조건으로 10분 동안 원심분리한 다음, 상등액을, 7M Urea, 2M thiourea, 100mM DTT, 2% CHAPS 0.5% ampolyte(Bio-Rad) 및 0.01% bromophenol blue를 포함하는, 재수화 완충액(rehydration buffer)로 희석시키고, 2-DE 분석에 샘플로 사용하였다.
2-DE 분석은 이 등(Lee CK et al ., Proteomics . 9:4851, 2009; Lee CK et al ., Proteomics . 6:6455, 2006; Lee CK, et al , Biochim Biophys Acta . 1774:848, 2007)의 방법에 따라 염색시킨 겔(gel)을 광도계(Versa Doc Imagin System 1000TM)를 사용하여 확인하였다(도 1 참조).
도 1은 정상인, 비침윤성 및 침윤성 방광암 조직의 단백질 발현을 2-DE 겔 이미지를 나타낸 것이다. 도 1에 제시된 숫자들은 감지된 단백질의 spot의 수를 의미하며, 화살표는 정상인과 암 환자의 조직에서 다르게 발현되는 단백질들을 나타낸다.
또한, 상기 겔을 PDQuest 소프트웨어(Version 7.1.1, Bio-Rad)를 사용하여, 평준화, 통계분석 하였다(도 2 참조).
즉, 변경된 단백질 spot의 In-gel digestion 및 단백질 동정(protein identification)은 기존의 방법과 동일하게 이루어졌다(Lee CK et al ., Proteomics. 9:4851, 2009; Lee CK et al ., Proteomics . 6:6455, 2006; Lee CK, et al, Biochim Biophys Acta . 1774:848, 2007).
간략히 말하자면, 상기 단백질 spot은 트립신에 의해 분해되고, ZipTip C18(Millipore)에 의해 탈염되었다.
상기 단백질 샘플을 CHCA 기질 용액과 혼합하였고, 그 후, reflector mode의 MALDI-TOF/TOF(AB4700, Applied Biosystems)을 이용하여, 분석하였다. 스펙트럼은 Global Protein Server Explorer 3.0 software(Applied Biosystems)로 처리되었고 분석되었다. 내부의 MASCORT program(Matrix Science, UK)은 데이터베이스 정보와 MS 및 MS/MS 데이터를 매칭시키는데 이용되었다. 상기 결과 데이터는 NCBI와 스위스 Prot/TrEMBL 홈페이지에서 다운로드 한, 마우스, 인간 데이터베이스를 대비한 survey이다(도 2 및 도 3 참조).
도 2는 정상인, 비침윤성 및 침윤성 방광암 조직에서 상승 조절 또는 하강 조절 단백질의 발현 프로파일 및 정량 분석을 한 것이다. 2-DE 겔에 있는 화살표는 정상일 및 암 환자 사이에 차이가 있는 spot을 나타낸다. PDQuest software(Version 7.1.1, Bio-Rad)을 이용하여, 4번의 독립적인 실험을 수행한 2-DE 겔로부터의 통계 데이터를 얻었다. 도면상, * 표시는 정상인, 비침윤성 및 침윤성 암 환자 간에 상당한 차이(p<0.05)가 있는 것을 나타낸다. 그래프 상, 흰색 막대는 정상인의 방광 조직을, 줄무늬 막대는 비침윤성 암환자의 방광 조직을, 검정 막대는 침윤성 환자의 방광 조직 결과를 나타낸다.
도 3A는 정상인, 비침윤성 및 침윤영 암환자의 방광 조직의 2-DE 겔에 있는 코피린 spot을 확대한 것이다(n=4). 화살표는 코피린을 나타낸다.
실시예 2. Immunoblotting
Immunoblotting을 위해, 차가운 용해 완충액으로 방광조직 및 세포로부터, 단백질을 추출했다. 단백질의 농도는 단백질 정량 시약(protein assay reagents)(Bio-Rad, Hercules, CAN, USA)을 이용하여 결정했다.
상기 단백질 샘플을 SDS 샘플 완충액과 1:1(v/v)로 섞어 희석시킨 다음, 5분간 가열하여 변형시켰다. 상기 샘플(20-30㎍/lane)은 14% SDS-PAGE로 분리되었고, PVD 멤브레인(polyvinylidene fluoride membrane)(Millipore, Bedford, MA, USA)에 전기적으로 이동시켰다.
그 후, 상기 멤브레인을 실온에서, 2시간 동안, 0.05% Tween 20 및 5% 탈지분유(fat-free dried milk)를 포함하는 PBS(phosphate buffered saline)에 담가, 블로킹시킨 다음, 상기 멤브레인에 1:1,000-5,000으로 희석된 항체를 처리해 4℃에서 하루저녁(overnight) 동안 반응시켰다.
상기 면역 복합체를 horseradish peroxidase-conjugated 항체(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA)와 상온에서, 1시간 동안 반응시킨 다음, ECL(enhanced chemiluminescence) 시약(Amersham Pharmacia)을 반응시켜, 식별가능하게 했다(도 3 참조). 도 3B는 정상인, 비침윤성 및 침윤성 암환자의 방광 조직의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 단백질 샘플은 12% SDS-PAGE에서 분리되었고, 코피린 및 p-코피린 항체 그리고, 화학 발광 물질에 의해, 식별가능 하였다. 통계 분석을 위해 Quantitation 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하였다
실시예 3. 면역조직학 분석( Immunohistochemical assay )
정상인과 암 환자의 방광조직이 들어있는 파라핀을 4-㎛ 절편으로 자른 다음, 상기 절편을 탈타라핀화 및 재수화(rehydrate)시키고, 3% 과산화수소를 포함하는 메탄올로 차단(block)시킨 후, 1:100으로 희석된 Polyclonal anti-phosphorylatedser3 및 anti-nonphosphorylated 코피린 항체를 준비해서, 실온에서 60분간 배양했다.
상기 절편을 세척한 다음, HRP(horseradish peroxidase) conjugated dextran polymer reagent kit와 함께 실온에서 30분간 배양했다. 페록시다아제 활성(Peroxidase activity)은 3, 3'-diaminobenzidine tetrachloride를 이용하여 관찰할 수 있었다. 상기 절편의 대조염색은 실온에서 헤마토실린을 이용하여 수행했고, 음성 대조군은 일차 항체가 없는 조건에서 시행했다(도 3 참조). 도 3C는 정상인, 비침윤성 및 침윤성 암환자의 방광 조직의 코피린 및 p-코피린의 면역염색(immunostaining) 한 것을 나타낸다. 정상인, 비침윤성 및 침윤성 암환자의 방광 조직이 들어있는 파라핀은 polyclonal 코피린 및 p-코피린 항체에 의해 확인 가능했다.
실시예 4. 인간 방광 암세포주 T24 및 siRNA - 코피린으로 형질감염
인간 방광 암 T24 세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)는 10% FBS, 100U/㎖ 페니실린, 100g/㎖ 스트렙토마이신 및 200mM 글루타민을 포함하는 McCoy's 5 A medium에서 배양했다.
상기 배양된 세포(8×104)는 FBS-free McCoy's 5 A medium으로 대체했고, 그 후 상기 세포는 형질감염 시약(Welfect-QTM Gold; Welgene, Korea)을 사용하여, siRNA 또는 nonsilencing control RNA을 형질감염해, 최종 1,000pM의 농도가 되도록 형질감염했다. 상기 상대적인 코피린의 발현 수준은 항체를 이용하여 immunoblotting 분석으로 알 수 있었다.
코피린 siRNA는 하기 서열번호 1의 서열을 타겟으로 디자인 되었다.
서열번호 1: 5'-CCCAAACUGCUUUUGAUCU-3'(Accession number: NM_005507; Bioneer, Korea).
실시예 5. 인간 방광 암 T24 세포의 EGF -유도 인산화
EGF의 양과, 반응시간에 따른 코피린의 인산화 정도를 알아보기 위하여, 인간 방광 암 T24 세포의 EGF-유도 인산화 작용을 알아보았다(도 4 참조).
도 4는 인간 방광 암 T24 세포의 EGF-유도 인산화를 나타낸 것이다. 인간 방광 암 T24 세포는 EGF(0-100ng/㎖)(A, C) 및 표시시간 동안의 EGF(50ng/㎖)(B, D)에 의해 활성화되었다. 상기 세포 lysate는 anti-phosphorylatedser3 및 non-phosphorylated 코피린 항체에 의해 immunoblot 되었다. (C) 및 (D)의 통계 결과는 (A)와 (B)로부터 정량화된 것이고, 코피린 인산화 기준 레벨은 100%로 표기하였다(n=3). * 표시는 인산화의 기준 레벨과 상당한 차이(p<0.05)를 보이는 것을 나타낸다.
실시예 6. Proliferation assay
T24 세포의 증식은 WelCountTM cell viability kit(Welgene)를 이용한 XTT 분석에 의해 수행하였다. T24 세포는 96-well 플레이트에 1.5×104 cells/well의 밀도로 도포하고, EGF 포함 또는 미포함의 McCoy's 5 A medium에서 48시간 배양한 다음, 상기 세포를 XTT 염료(a tetrazolium salt)로 처리한 다음, 37℃의 조건 4시간 배양했다. formazan crystal의 형성의 양은 450㎚에서, ELIAS(enzyme-linked immunosorbent assay reader)로 정량했다. 코피린이 넉다운된(knock-downed) 세포에서의 증식 분석은 48시간동안, siRNA-코피린과 배양한 다음, 동일한 방법에 의해 수행했다(도 5 참조). 도 5의 A는 인간 방광 암 T24 세포의 증식에 있어서의 EGF의 영향을 나타낸 것이다. 정지 상태(quiescent state)에서의 증식(n=5)은 100%로 표시하였다. * 표시는 정지 상태에서의 반응이 상당한 차이(p<0.05)를 보이는 것을 나타낸다.
실시예 7. Boyden chamber assay
이동 분석(migration assay)은 42-well microchemotaxis Boyden chamber(Neuro Probe, Cabin John, Md., USA)에서 수행했다. 폴리카보네이트 멤브레인(8-m pores, Neuro Probe)을 type I collagen(BD Bioscience) 0.1-㎎/㎖로 코팅한 다음, 60분 동안 건조시켰다. 세포는 trypsin-EDTA(Life Technologies, Paisley, UK)를 이용하여 채취하였으며, EGF 포함 또는 미포함의 0.1% BSA를 포함한 McCoy's 5 A medium에서 재현탁하였다. 그 후, 챔버 바닥에 3×10 4 세포를 로딩하고, 상기 미세 챔버를 80분간, 37℃에서 배양하였다.
상기 멤브레인을 Diff-Quik(Baxter Healthcare, Miami, Fla., USA)를 이용하여 고정하고 염색하였다. 상기 멤브레인을 통해 이동하는 세포의 수는 현미경(×400)에서 랜덤하게 선택된 4개의 지점을 카운팅함으로써 정해졌다(도 5 참조).
도 5의 B는 인간 방광 암 T24 세포의 이동에 있어서의 EGF의 영향을 나타낸 것이다. EGF(1-100ng/㎖)를 80분간 처리한 세포를 Boyden chamber assay로 정량화 하였다. 정지 상태(quiescent state)에서의 이동(n=6)은 100%로 표시하였다. * 표시는 정지 상태에서의 반응이 상당한 차이(p<0.05)를 보이는 것을 나타낸다.
이동 분석은 siRNA-코피린이 전이된 세포에서 수행하였다. 본 실험에 사용된 모든 샘플에는 0.1% DMSO가 포함되어 있으나, DMSO의 존재는 T24 세포 이동에 영향을 미치지 않았다.
상기 실시예에서 살펴본 바와 같이, Cofilin과 인산화형 cofilin (P-cofilin)을 조사하여 방광의 근육 비침윤성 요로상피암이 근육 침윤성 요로상피암으로 진행하는 것을 예측할 수 있고, Cofilin과 P-cofilin의 억제를 유도하는 새로운 약제의 주입으로 방광 요로상피암의 재발 및 진행을 감소시키고, 근육 침윤성 요로상피암으로의 진행을 예방할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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  8. (a) 진단 대상의 소변을 채취하는 단계;
    (b) 채취된 소변 내에, 코피린(Cofilin) 및 P-코피린(P-cofilin)의 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 코피린(Cofilin) 및 P-코피린(P-cofilin)의 단백질의 발현 정도를 정상인과 비교하는 단계;를 포함하여 비침윤성 또는 침윤성 방광 요로상피암의 위험인자를 검사하는 진단 키트.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 정도를 측정하는 방법은 (1) 소변에서 단백질을 직접 측정하는 방법 또는 (2) 소변내의 축출된 요로상피세포에서 단백질 측정 및 면역 염색에 의한 단백질 발현을 검사하는 방법인 것을 특징으로 하는 비침윤성 또는 침윤성 방광 요로상피암의 위험인자를 검사하는 진단 키트.
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