CN107287224A

CN107287224A - 分泌trail的间充质干细胞及其治疗脑瘤的用途

Info

Publication number: CN107287224A
Application number: CN201710184390.6A
Authority: CN
Inventors: 胡祥; 潘伟生; 路钢; 徐明恺; 刘沐芸; 苏献伟
Original assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2017-10-24
Also published as: US20200318137A1

Abstract

分泌TRAIL的间充质干细胞及其治疗脑瘤的用途。本发明涉及基因重组和干细胞应用领域。具体的，本发明提供了一种用于表达分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的构建体，以及包含所述构建体的慢病毒表达载体。本发明还提供了在其基因组上整合了所述构建体的间充质干细胞，其可表达和分泌所述TRAIL蛋白片段。本发明还提供了所述构建体或载体或间充质干细胞在治疗脑瘤中的应用。

Description

分泌TRAIL的间充质干细胞及其治疗脑瘤的用途

技术领域

本发明涉及基因重组和干细胞应用领域。具体的，本发明提供了一种可表达分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的构建体，以及包含所述构建体的慢病毒表达载体，以及在其基因组上整合了所述构建体的干细胞，其可表达和分泌所述TRAIL蛋白片段。本发明还提供了所述构建体或载体或干细胞在治疗脑瘤或制备脑瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一员，主要通过与细胞表面的死亡受体(DR4和DR5)结合，启动外源性凋亡途径，从而诱导肿瘤细胞产生凋亡。并且，该凋亡诱导活性主要是针对肿瘤细胞，而对正常细胞不产生杀伤作用，因此具有一定肿瘤特异性。获得TRAIL蛋白最经济的方式是基因工程表达纯化，目前多用的表达系统包括大肠杆菌原核表达系统和细胞真核表达系统。由于TRAIL蛋白是哺乳动物起源，因此真核细胞表达系统具有更好的兼容性。

真核细胞表达TRAIL蛋白过程中有3个问题需要解决。1.TRAIL的可分泌性：一般的真核细胞表达载体缺乏有效的分泌型信号肽序列，不能将表达的目的蛋白输送到细胞外培养基当中去，而是累积在细胞内部，一方面影响了目的蛋白的积累，另一方面也为后续分离纯化过程增加了困难。2.TRAIL蛋白的可溶性：TRAIL蛋白分子的氨基端为疏水区跨膜结构，集中大量疏水氨基酸残基，导致TRAIL蛋白水溶性很差，在溶液中易集聚成团而失去活性。3.构建的基因工程细胞基因稳定性，普通真核细胞表达载体，将目的基因片段带入宿主细胞基因组中后，并不能稳定存在，目的基因随着宿主细胞传代分裂过程会逐渐丢失，因此需要不断的抗生素选择和单克隆细胞筛选。

本领域仍需要获得能够稳定和高效表达和分泌有活性的TRAIL蛋白或片段的构建体、载体和宿主细胞。本领域更需要能够用于治疗有关疾病和用于制备相关药物的能够稳定和高效表达和分泌有活性的TRAIL蛋白或片段的构建体、载体和宿主细胞。

发明内容

本发明针对以上问题，提供了在其基因组上整合了外源核酸的间充质干细胞，其可稳定和高效表达和分泌TRAIL蛋白片段。为此，本发明还构建了一种可表达分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的慢病毒表达载体，该载体可稳定的转染哺乳动物宿主细胞，并可将表达的TRAIL蛋白可溶性片段分泌到宿主细胞外的细胞培养液中，便于后续的收集，分离和纯化。本发明还提供了所述间充质干细胞在治疗TRAIL相关疾病或制备药物中的应用，这些疾病包括癌症或肿瘤，特别是脑瘤。

具体的，本发明提供了一种分离的构建体，其中，所述构建体包含(1)分泌信号肽编码区；(2)TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区；和(3)TRAIL蛋白片段编码区，

其中所述TRAIL蛋白片段具有与下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列：

(a)TRAIL的114～281氨基酸残基的；

(b)与(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且具有TRAIL蛋白活性。

真核生物的分泌信号肽存在于待分泌或将成为跨膜部分的蛋白质上，通常位于蛋白质的N-末端。本发明所指的信号肽可以是异源的信号肽，即为非天然地可操作地连接于蛋白质或多肽的信号肽。信号肽的使用可以令目标蛋白质或多肽可分泌到产生其的细胞外或分泌增加。常见的信号肽包括原纤蛋白分泌信号肽、生长因子信号肽、激素信号肽、细胞因子信号肽和免疫蛋白信号肽等。信号肽的例子包括GDF信号肽、IGF信号肽、BMP信号肽、神经营养因子信号肽、PDGF信号肽和EGF信号肽、激素信号肽(例如生产激素、胰岛素、ADH、LH、FSH、ACTH、MSH、TSH)、或白细胞介素信号肽。这些信号肽多来自哺乳动物来源的，例如人、小鼠、大鼠、猪、猴等，优选的，本发明使用的信号肽是小鼠或人来源的。所述信号肽还可经过修饰，以增强其帮助蛋白质分泌的能力。

其中本发明的构建体中采用的所述分泌信号肽可选自人原纤维蛋白分泌信号肽，人生长激素分泌信号肽，人免疫球蛋白信号肽，人白细胞介素2信号肽等。

本发明优选使用的分泌信号肽为来源于人原纤维蛋白的分泌信号肽。人原纤维蛋白(human fibrillin-1)，或人原纤蛋白，由Sakai LY,Keene DR,Engvall E等在1986，J.Cell Biol.103，“Fibrillin,a new 350-kD glycoprotein,is a component ofextracellular microfibrils”进行了报道。人原纤维蛋白是一种可分泌的糖蛋白，由成纤维细胞分泌到细胞外基质。人原纤维蛋白分泌信号肽具有如下氨基酸序列：MRRGRLLEIALGFTVLLASYTSHGADA。可编码人原纤维蛋白分泌信号肽的核酸序列可用于本发明的构建体中。本发明的构建体中，优选的所述分泌信号肽编码区具有SEQ ID NO：2所示的序列。

在本发明的构建体中，其中所述TRAIL蛋白三聚体稳定结构用于帮助形成稳定的TRAIL蛋白或TRAIL片段的三聚体形式。TRAIL蛋白或TRAIL片段的三聚体形式相对于单体更稳定，活性更好。本发明可用的三聚体稳定结构序列包括异亮氨酸拉链结构，亮氨酸拉链结构等。

在本技术领域中已知的，在多种天然蛋白中发现有亮氨酸拉链结构域或异亮氨酸拉链结构存在。亮氨酸拉链(Leucine zippers)结构是指在反式因子的一段肽链中每隔7个氨基酸残基就有一个亮氨酸残基出现，这段肽链所形成的螺旋出现一个由亮氨酸残基构成的疏水面，而另一面则是由亲水性氨基酸残基所构成的亲水面。由亮氨酸残基组成的疏水面即为亮氨酸拉链条，两个具有亮氨酸拉链条的反式因子，就能借疏水作用形成二聚体或多聚体例如三聚体。亮氨酸拉链结构域或异亮氨酸拉链结构可以相互作用形成二聚体或者三聚体。本发明的构建体中包含的亮氨酸拉链结构域或异亮氨酸拉链结构可以促进融合蛋白的寡聚化因而能够增加稳定性。适合的人源亮氨酸拉链结构域例如人c-fos，c-jun，c-myc，max和mdx1蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。在本发明中，可选择优化并且经实验证明可使得表达的TRAIL蛋白片段形成三聚体的亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链结构序列。发明人通过设计和测试，得到了优化的编码异亮氨酸拉链结构序列的核酸序列。本发明的构建体中，优选的所述TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区具有SEQ ID NO：3所示的序列。

在本发明的构建体中，其中所述TRAIL蛋白片段为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第114-281个氨基酸的片段。

本领域已知人TRAIL是由281个氨基酸组成的II型跨膜蛋白。Wiley,S.R.等在Identification and Characterization of a New Member of the TNF Family thatInduces Apoptosis.Immunity 3,673-682(1995)进行了报道。TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明的构建体包含的TRAIL编码区编码的蛋白质可以是带有活性的TRAIL的片段，即具有TRAIL的281个氨基酸的氨基酸序列的一个连续部分，该部分具有TRAIL蛋白的活性。本发明优选的TRAIL片段包括，例如，SEQ ID NO：1所示的TRAIL的114～281氨基酸残基的片段。本领域已知，TRAIL的胞内N-末端无信号肽，活性部分位于胞外114～281氨基酸残基。人TRAIL的114～281氨基酸残基还可形成同源三聚体,在其顶部附近有锌结合位点,对维持TRAIL的及稳定性起重要作用。

本发明的构建体包含的TRAIL编码区编码的蛋白质也可以具有与TRAIL的114～281片段基本上相同的氨基酸序列。在本文，“基本上相同的氨基酸序列”是指氨基酸序列中一个到几个(例如2、3、4或5个)氨基酸被置换、缺失、添加或插入，其与该氨基酸序列相比具有相同或相似或更好的活性。

本发明的构建体可通过使用常规DNA合成制备。所述构建体可通过常规基因工程方法插入表达载体；用得到的重组表达载体转化宿主细胞；培养得到的转化体；和从培养物中收集所述多肽。可参照例如以下文献中描述的方法进行：Molecular Cloning,T.Maniatis等人,CSH Laboratory(1983)。

本发明还提供了一种载体，其包含上述的构建体。本发明的载体可以是质粒、噬菌体和病毒等，在可表达蛋白的基因工程宿主中能够独立复制并具有选择标记。载体在进入宿主细胞中，得到扩增和表达。合适的基因工程宿主是本领域公知的，可以是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。优选的，本发明的所述载体为在动物细胞表达的载体，例如非病毒载体，杆状病毒表达载体，腺病毒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体。可用作本发明的载体优选为慢病毒载体，例如慢病毒载体pCDH，具体而言是具有前述本发明的构建体的pCDH。在本发明的其中一个例子本发明提供了如实施例制备得到的pCDH-seTRAIL。

本发明还提供了一种细胞，特别是哺乳动物细胞，例如人、小鼠、大鼠、猪、猴的细胞，其基因组上整合了上述本发明的构建体，并且可表达和分泌所述TRAIL蛋白片段。

上述本发明的哺乳动物细胞可以为干细胞、淋巴细胞，T细胞，B细胞，巨噬细胞，成纤维细胞，肿瘤细胞等。优选的，本发明提供了在其基因组上整合了前述本发明的构建体，并且可表达和分泌TRAIL蛋白片段的干细胞，例如间充质干细胞。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是成体干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。研究发现，间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。根据来源，间充质干细胞可分为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞等。

在本发明的其中一个方面，本发明提供的所述其基因组上整合了上述本发明的构建体，并且可表达和分泌所述TRAIL蛋白片段的哺乳动物细胞是通过下述方法制备的：

a.构建如前所述的本发明的构建体，所述构建体包含(1)分泌信号肽编码区；(2)TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区；和(3)TRAIL蛋白片段编码区，

(a)TRAIL的114～281氨基酸残基；

(b)与(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少99％同一性，并且具有TRAIL蛋白活性；

b.制备包含上述构建体的载体，优选的，所述载体为动物细胞表达载体，优选为慢病毒载体，例如pCDH；

c.用所述载体感染哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞优选为干细胞，例如间充质干细胞。

本发明还提供了用于生产TRAIL蛋白的方法，所述方法包括用上述的载体来转化哺乳动物细胞，在所述哺乳动物细胞中表达TRAIL蛋白，所述TRAIL蛋白可分泌到宿主细胞外的培养液中。

本发明提供了一种用于治疗与TRAIL有关的疾病的药物组合物，其含有上述本发明的任意一种构建体或载体或细胞。

本发明提供了上述本发明的任意一种构建体或载体或细胞或其药物组合物在治疗与TRAIL有关的疾病中的应用。本发明还提供了利用上述本发明的任意一种构建体或载体或细胞或其药物组合物在制备治疗与TRAIL有关的疾病的药物中的用途。

本领域已知TRAIL通过DR4和DR5两种受体来诱导凋亡反应。因此，本发明的任意一种构建体或载体或细胞或其药物组合物可用于治疗目标细胞上带有DR4或DR5受体的疾病。

本发明可治疗的疾病包括癌症和肿瘤，例如脑癌。本发明可治疗的脑瘤包括神经胶质瘤(glioma)和脑膜瘤(meningioma)等。神经胶质瘤包括成胶质细胞瘤(glioblastoma)、恶性星形细胞瘤(anaplastic astrocytoma)、神经胶质肉瘤(gliosarcoma)、退行性少突神经胶质瘤(anaplastic oligodendroglioma)、退行性神经节神经胶质瘤(anaplastic ganglioglioma)、成松果体细胞瘤(pineoblasoma)、成神经管细胞瘤(medullobastoma)等。

附图说明

图1经双酶切回收的分泌型TRAIL蛋白可溶性片段表达基因的琼脂糖凝胶电泳图。右侧为目的DNA条带，左侧为Invitrogen公司1Kb Plus DNA ladder分子量marker。目标核酸片段约为711bp。

图2经双酶切回收的慢病毒表达载体pCDH质粒DNA电泳图。左侧为目的DNA条带，右侧为使用的Invitrogen公司1Kb Plus DNA ladder分子量marker。目标核酸片段约为8,000bp。

图3HEK293细胞经慢病毒包装四质粒共转染48小时后的荧光显微照片。GFP为荧光下照片，Light为同一视野下白光照片，Merge为两个视野的整合照片。

图4慢病毒颗粒感染MSC细胞的荧光和白光显微照片。GFP为荧光下照片，Light为同一视野下白光照片，Merge为两个视野的整合照片。

图5检测TRAIL蛋白的ELISA标准曲线。横坐标为450nm处吸光值，纵坐标为TRAIL蛋白标准品浓度(pg/ml)。

图6MTS法检测感染了慢病毒的MSC细胞上清液条件培养基对U87肿瘤细胞的生长抑制作用。

图7感染慢病毒载体的MSC细胞分泌TRAIL蛋白的稳定性。

图8感染慢病毒载体的MSC细胞在小鼠中抑制U87实体肿瘤。

具体实施方式

实施例1编码分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的构建体的制备

(1)合成具有以下SEQ ID NO：4的核苷酸序列的双链DNA分子。

SEQ ID NO：4：

tctagagccatgggtcgtcgagggcgtctgctggagatcgccctgggatttaccgtgcttttagcgtcctacacgagccatggggcggacgcccgtatgaaacagatcgaagacaaaattgaggagatccttagcaagatttaccatatagaaaacgagatcgctcgtattaaaaagcttatcggtgaacgtgaattcgtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaaggatcc。

其中包括了XbaI位点tctaga，Kozak位点gccatgggt，以及

分泌信号肽编码区序列：

cgtcgagggcgtctgctggagatcgccctgggatttaccgtgcttttagcgtcctacacgagccatggggcggacgcc(SEQ ID NO：2)；

三聚体稳定结构编码区序列：

cgtatgaaacagatcgaagacaaaattgaggagatccttagcaagatttaccatatagaaaacgagatcgctcgtattaaaaagcttatcggtgaacgt(SEQ ID NO：3)；

编码TRAIL蛋白第114-281个氨基酸的核酸序列：

gtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggc(SEQ ID NO：1)；

以及BamHI位点ggatcc。

(2)双链DNA分子的双酶切和胶回收：

合成的双链DNA分子经限制性核酸内切酶Xba I和BamH I(NEB公司)充分消化，消化产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene公司的胶回收试剂盒纯化711bp的核酸片段(图1)。

实施例2分泌型TRAIL蛋白可溶性片段慢病毒表达载体pCDH-seTRAIL的构建

(1)pCDH载体的双酶切：将pCDH载体质粒(System Biosciences Catalog:CD513B-1)经限制性核酸内切酶Xba I和BamH I(NEB公司)充分消化，消化产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，以Qiagene公司的胶回收试剂盒纯化约8000bp片段(图2)。

(2)酶切产物的连接及转化：将经过实施例1得到的酶切回收的711bp片段编码DNA和与经同样酶切回收的8,000bp pCDH质粒DNA以5:1的摩尔比例混合，并以T4DNA连接酶(NEB公司)16℃连接过夜，构建成表达载体pCDH-seTRAIL。

连接产物转化大肠杆菌stbls感受态细胞(stbls感受态细胞购自Genecopoeia公司，转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley&Sons出版社1995年第三版P39-40)，以氨卞青霉素抗性筛选转化子。

(3)表达载体pCDH-seTRAIL的验证：将挑选的阳性转化子扩培，提取质粒DNA(质粒DNA提取方法按J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》美国纽约冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，并进行DNA测序证实连接正确。

实施例3表达分泌型TRAIL蛋白可溶性片段慢病毒颗粒的包装和转染

(1)表达质粒pCDH-seTRAIL和辅助质粒浓度和纯度的测定

采用第三代慢病毒包装系统，除表达质粒pCDH-seTRAIL外，还同时采用包装质粒pMDLg/pRRE(购自Addgene，Catalog：12251)；包装质粒pRSV-REV(购自Addgene，Catalog：12253)；外壳蛋白质粒pMD2G(购自Addgene，Catalog：12259)共同完成病毒颗粒的包装。

首先以NanoDrop分光光度计分析各质粒DNA的纯度和浓度。结果如表.1所示：

表1各质粒DNA的浓度和纯度分析结果

(2)质粒共转染HEK293细胞株

共转染质粒配方(每15cm培养皿)：

*TE buffer(10mM Tirs pH 8.0,1mM EDTA)

#HBS(280mM NaCl,50mM HEPES,1.5mM Na₂HPO₄.H₂O,10mM KCl,12mM Dextrose)

转染：

A.转染前一日，将HEK293细胞(购自Clontech公司,Cat.No 632180)接种于15cm细胞培养皿中，控制使接种日细胞密度达到80％左右；

B.各质粒组分，CaCl₂溶液，TE buffer充分混合在一个50ml的离心管中，并将以上混合物缓慢的加入另一个已经放置了HBS溶液的离心管中；

C.中速震荡混匀，并加入各细胞培养皿中，置于细胞培养箱培养；

D.转染后16小时，小心吸走培养基，并换液以含10％FBS的DMEM培养基；

E.继续培养48小时，以荧光显微镜观察细胞的荧光信号。

图3为被四质粒共转染的HEK293细胞株的荧光显微照片。结果如图3所示。GFP为荧光下照片，Light为同一视野下白光照片，Merge为两个视野的整合照片。

(3)病毒颗粒收集

A.收集上述细胞培养上清液；

B.在4℃下，以800g离心10min，收集上清液；

C.上清液过0.45μm的微孔滤膜，保留滤过液；

D.每四倍体积的滤过液，加入一倍体积预冷的PEG-it Virus PrecipitationSolution(System Biosciences Catalog:LV810A-1)，充分混匀，在4℃静置过夜下，以1,500g离心30min，获得病毒颗粒沉淀；

E.病毒颗粒以适量TBS溶液(800mg NaCl,20mg KCl,300mg Tris碱，溶于100ml去离子水中，PH 8.0)重悬成病毒颗粒储液，分装并保存于-80℃。

实施例4表达可分泌型TRAIL慢病毒滴度的测定

1.HEK293细胞接种于96孔板内，接种密度为4,000个细胞每孔，置于细胞培养箱培养过夜；

2.以含8μg/ml的polybrene的DMEM培养基(含10％FBS)，十倍梯度稀释制备的病毒储液

3.小心吸走96孔板中的培养基，并以以上含有梯度稀释病毒颗粒的培养基，加入各孔，每个浓度处理组三个孔重复。

4.继续培养48小时，在荧光显微镜下观察具有绿色荧光信号的HEK293细胞，记录有荧光信号出现的最低稀释度(表2)，并以如下公式计算病毒颗粒储液的滴度：

滴度(TU/μl)＝1/10X 10^(n-1)

n为梯度稀释系数

表2滴度测定荧光信号检测结果(√表示有荧光，x表示无荧光)

由表2结果和上述公式计算

pCDH-seTRAIL慢病毒滴度为1×10⁶TU/μl

pCDH(空载体对照)慢病毒滴度为1×10⁶TU/μl

实施例5表达可分泌型TRAIL慢病毒对人间充质干细胞的感染

1、脐带来源的人间充质干细胞细胞的制备

胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中2-8℃恒温保存。

用0.9％氯化钠注射液冲洗获得的脐带，重复2～3次，去除血渍。75％乙醇浸没整根脐带消毒灭菌。氯化钠注射液重复洗涤去除残留乙醇。用无菌手术剪将脐带剪成约2～5cm数段，清除脐带小段血管中淤血和凝块。位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华通氏胶，用有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中，加入适量0.9％氯化钠注射液，洗涤胶体。用无菌组织剪将称重后的华通氏胶体剪切成1～4mm³的组织匀浆块，加入0.9％氯化钠注射液，离心800～900g,5min。收集末次洗涤液送检无菌。根据胶体重量，加入适量培养基，定容组织匀浆浓度约为04～0.7g/ml，移液器吹打组织匀浆块均匀后，将组织匀浆块接种于T75培养瓶中，加入培养基混合培养。

平置培养瓶使组织匀浆块尽量均匀分布于整个底面，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2％。

第一次换液：组织块培养至第5～7天进行全量换液。将培养瓶中的未贴壁的组织块和旧的培养基一起合并转移到离心管，800～900g，离心5min，去掉上清液，将离心后的残余组织块，加入适量新鲜培养基，移液管吹打均匀，等量均分到原来的培养瓶，然后加培养基。平置培养瓶使组织块尽量均匀分布于整个底面，放置CO₂恒温恒湿培养箱继续培养。

第二次换液：培养第10～13天换液。稍稍倾斜培养瓶，移液管轻轻吸掉半量旧的培养基，加入等量新鲜培养基。放置CO₂培养箱继续培养。

组织块培养的第14～18天，细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，消化收获。去除培养基上清液，0.9％氯化钠注射液洗涤细胞。培养瓶中加入适量消化酶，直至浸润培养瓶底面。静置1min后，取培养瓶，倒置显微镜下观察，细胞呈圆形，大部分贴壁组织块和细胞脱落，终止消化(消化时间不超过5min)。细胞悬液移入离心管中，少量0.9％氯化钠注射液冲洗瓶壁，洗涤液转入离心管中，移液管吹打悬浮后静置30秒，100μm无菌滤网过滤，滤液离心，300g，10min。弃去洗涤上清液，0.9％氯化钠注射液重悬细胞。

2.以60％的细胞密度接种于细胞培养皿中，置于细胞培养箱培养过夜；

3.小心吸走细胞培养皿中的培养基，以含8μg/ml的α-MEM培养基(含10％FBS)，小心加入培养皿。

4.每细胞培养皿中分别加入pCDH-seTRAIL和pCDH(空载体对照)慢病毒储液，使MOI(病毒TU与靶细胞的数量的比值)约为10，置于细胞培养箱继续培养24小时；

5.小心吸走细胞培养皿中的培养基，以含10％FBS的α-MEM培养基小心加入各细胞培养皿，继续培养48小时；

6.以荧光显微镜观察具有绿色荧光信号的MSC细胞，并收集细胞培养上清。如图4所示，GFP为荧光下照片，Light为同一视野下白光照片，Merge为两个视野的整合照片。

实施例6感染慢病毒载体的MSC细胞表达和分泌TRAIL蛋白的活性

收集的细胞培养基上清液，以Abcam公司的TRAIL Human ELISA Kit试剂盒(Catalog:ab46074)分析上清液中的TRAIL蛋白含量，精确按照试剂盒说明书操作，以试剂盒中提供的重组human TRAIL做标准曲线。

测定结果如图5所示：

感染慢病毒pCDH-seTRAIL的MSC培养基上清中，TRAIL蛋白浓度约为634.93pg/ml。

感染对照空载体慢病毒pCDH的MSC培养基上清中，TRAIL蛋白浓度约为32.96pg/ml。这个数额为测试试剂和仪器读数本底误差范围。

实施例7分泌TRAIL蛋白的MSC细胞对人胶质瘤细胞系U87细胞的抑制

1.收集的培养了感染有病毒颗粒的MSC的细胞培养上清液，1,000rpm离心10分钟，除去残存细胞，吸取上清液，做为条件培养基；

2.以含10％FBS的α-MEM培养基以2倍浓度梯度逐次稀释该条件培养基，设置1，0.5,0.25，和0.125浓度；

3.以含10％FBS的α-MEM培养基培养的人胶质瘤细胞系U87细胞(购自ATCC，货号HTB-14)，以3,000细胞每孔的密度接种于96孔板中，置于细胞培养箱培养过夜；

4.小心干净的吸走每孔中的培养基上清液；

5.每孔中分别加入200ul梯度稀释的各浓度条件培养基，同时设置空白对照孔(加入含10％FBS的α-MEM培养基)，继续培养72小时；

6.每孔加入预置的MTS溶液(promega)20ul，继续培养3小时

7.以Thermo Scientific Mulitiskan微孔板读板仪，在490nm测量波长，690nm参比波长下，测量各孔吸光度值；

8.以如下公式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(空白孔吸光值-条件培养基处理孔吸光值)/空白孔吸光值X 100

结果如图6所示，本发明构建的可表达分泌型TRAIL蛋白的慢病毒载体感染MSC细胞后，MSC可表达分泌大量具有生物活性的TRAIL蛋白到细胞培养基中，并且对U87细胞具有显著生长抑制作用。

实施例8感染慢病毒载体的MSC细胞分泌TRAIL蛋白的稳定性

1.以实施例6得到的感染慢病毒pCDH-seTRAIL的MSC条件培养基上清为分析对象(上清中TRAIL蛋白浓度经检测为：634.93pg/ml)；

已感染对照空载体慢病毒pCDH的MSC条件培养基上清为第一对照培养基；

已新鲜培养基上清为第二对照培养基(上清中TRAIL蛋白浓度经检测约为0)；

以市售的商品化重组人rhTRAIL蛋白(Pepro tech公司，货号：310-04)为研究参照。将市售的商品化重组人rhTRAIL蛋白分别溶解于第一对照培养基和第二对照培养基中，终浓度为650pg/ml。

将感染慢病毒pCDH-seTRAIL的MSC条件培养基上清，溶解rhTRAIL的第一对照培养基上清，和溶解rhTRAIL的第二对照培养基上清，同时置于37摄氏度温浴中，每隔不同时间(0，3，6，12，24，48h)吸取少量上清，迅速置于-70摄氏度冰箱保存。

待全部时间点都取样完毕后，以如实施例6中的ELISA方法测定各样品的TRAIL蛋白含量。

以各处理组的0h时的蛋白含量为百分百，按照以下公式计算各处理组各时间点的TRAIL蛋白残留率：

残留率＝(各时间点TRAIL浓度/0h时间点TRAIL浓度)x 100％

结果如图7所示。结果证明，本发明的感染带有可分泌TRAIL蛋白插入体的慢病毒载体的MSC细胞制备和分泌的TRAIL蛋白片段的稳定性高于市售的商品化重组人rhTRAIL蛋白。

实施例9动物模型中分泌TRAIL蛋白的MSC细胞在裸鼠体内对人胶质瘤细胞的抑制

实验动物为4-6周的雄性裸鼠(香港中文大学实验动物中心，BALB/C裸鼠)。在标准实验条件下饲养：12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。

感染慢病毒pCDH-seTRAIL的MSCs，感染对照空载体慢病毒pCDH的MSCs，和人胶质瘤细胞系U87细胞，都分别在含10％FBS的α-MEM培养基中，37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养。待动物适应培养环境4天后，将U87细胞注射到裸鼠皮下，每只动物接种两个位置，分别为裸鼠背部的左侧和与之对称的右侧，每个位点的U87细胞的接种量为2x10⁶细胞，注射体积为100ul。整个操作过程在超净工作台中完成。完成接种后对小鼠的健康状况和肿瘤的生长情况进行监测。待全部小鼠长出明显肿瘤实体之后，根据动物的肿瘤体积选出左右两侧瘤块大小均匀相同(游标卡尺测量直径大约5mm)的8只小鼠，左侧瘤块位置注射2x106个感染对照空载体慢病毒pCDH的MSCs，右侧瘤块位置注射2x106个感染慢病毒pCDH-seTRAIL的MSCs，注射体积均为100ul。每隔4天以游标卡尺测量肿瘤大小，并按照以下公式计算出肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝1/2ab²，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。

数据分析组间比较用ANOVA统计学方法进行统计分析，P＜0.05被认为有显著性区别。

图8为实验过程中两组平均肿瘤体积测量结果(体积单位mm³)

注射慢病毒感染的MSCs后，两组肿瘤体积开始出现分化，注射感染慢病毒pCDH-seTRAIL的MSCs的治疗组肿瘤体积逐渐低于注射感染对照空载体慢病毒pCDH的MSCs的对照组肿瘤体积。且在第12天和第16天时表现出显著差异(P＜0.05)。实验结果证明本发明的感染带有可分泌TRAIL蛋白插入体的慢病毒载体的MSC细胞在动物体内对人胶质瘤具有显著的治疗效果。

本发明的发明人出乎意料地发现用本发明的方法制备的脐带间质干细胞在动物体内能够有效地抑制脑瘤，特别是神经胶质瘤。这个出乎意料的发现的其中一个原因是基于本发明构建的分泌型TRAIL蛋白可溶性片段构建体以及含有该构建体的慢病毒表达载体。

本发明的TRAIL蛋白可溶性片段编码区中添加了可促形成三聚体结构的氨基酸序列，有助于提高表达的TRAIL蛋白可溶性片段分子的稳定性和活性。，在哺乳动物细胞中表达分泌型TRAIL蛋白可溶性片段分子。另外，本发明构建的分泌型TRAIL蛋白可溶性片段表达载体，在启动子下游区，紧邻TRAIL蛋白可溶性片段编码基因的上游区，添加了高效的分泌信号肽序列，可使克隆于下游的TRAIL蛋白可溶性片段编码基因表达的TRAIL蛋白可溶性片段分子分泌到细胞外培养基中，显著提高蛋白表达效率，而且产生的TRAIL蛋白可溶性片段稳定性出乎意料地提高。特别是在利用慢病毒载体的情况下，可以将编码分泌型TRAIL蛋白可溶性片段的编码基因稳定的整合到宿主细胞的基因组中，不易丢失，而且插入性肿瘤生成的风险大大降低，更加安全可靠。

除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。

序列表

<110> 深圳市北科生物科技有限公司

<120> 分泌TRAIL的干细胞及其治疗疾病的用途

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgagagaaa gaggtcctca gagagtagca gctcacataa ctgggaccag aggaagaagc 60

aacacattgt cttctccaaa ctccaagaat gaaaaggctc tgggccgcaa aataaactcc 120

tgggaatcat caaggagtgg gcattcattc ctgagcaact tgcacttgag gaatggtgaa 180

ctggtcatcc atgaaaaagg gttttactac atctattccc aaacatactt tcgatttcag 240

gaggaaataa aagaaaacac aaagaacgac aaacaaatgg tccaatatat ttacaaatac 300

acaagttatc ctgaccctat attgttgatg aaaagtgcta gaaatagttg ttggtctaaa 360

gatgcagaat atggactcta ttccatctat caagggggaa tatttgagct taaggaaaat 420

gacagaattt ttgtttctgt aacaaatgag cacttgatag acatggacca tgaagccagt 480

tttttcgggg cctttttagt tggc 504

<210> 2

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtcgagggc gtctgctgga gatcgccctg ggatttaccg tgcttttagc gtcctacacg 60

agccatgggg cggacgcc 78

<210> 3

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtatgaaac agatcgaaga caaaattgag gagatcctta gcaagattta ccatatagaa 60

aacgagatcg ctcgtattaa aaagcttatc ggtgaacgt 99

<210> 4

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctagagcca tgggtcgtcg agggcgtctg ctggagatcg ccctgggatt taccgtgctt 60

ttagcgtcct acacgagcca tggggcggac gcccgtatga aacagatcga agacaaaatt 120

gaggagatcc ttagcaagat ttaccatata gaaaacgaga tcgctcgtat taaaaagctt 180

atcggtgaac gtgaattcgt gagagaaaga ggtcctcaga gagtagcagc tcacataact 240

gggaccagag gaagaagcaa cacattgtct tctccaaact ccaagaatga aaaggctctg 300

ggccgcaaaa taaactcctg ggaatcatca aggagtgggc attcattcct gagcaacttg 360

cacttgagga atggtgaact ggtcatccat gaaaaagggt tttactacat ctattcccaa 420

acatactttc gatttcagga ggaaataaaa gaaaacacaa agaacgacaa acaaatggtc 480

caatatattt acaaatacac aagttatcct gaccctatat tgttgatgaa aagtgctaga 540

aatagttgtt ggtctaaaga tgcagaatat ggactctatt ccatctatca agggggaata 600

tttgagctta aggaaaatga cagaattttt gtttctgtaa caaatgagca cttgatagac 660

atggaccatg aagccagttt tttcggggcc tttttagttg gctaaggatc c 711

<210> 5

<211> 281

<212> PRT

<213> 人

<400> 5

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

Claims

1.一种分离的构建体，其中，所述构建体包含(1)分泌信号肽编码区；(2)TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区；和(3)TRAIL蛋白片段编码区，

(a)TRAIL的114～281氨基酸残基；

(b)与(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少99％同一性，并且具有TRAIL蛋白活性。

2.权利要求1的构建体，其中所述分泌信号肽是人原纤维蛋白分泌信号肽，人生长激素分泌信号肽，人免疫球蛋白信号肽，人白细胞介素2信号肽，优选为人原纤维蛋白分泌信号肽，例如所述分泌信号肽编码区具有SEQ ID NO：2所示的序列。

3.权利要求1或2的构建体，其中所述TRAIL蛋白三聚体稳定结构序列是异亮氨酸拉链结构，亮氨酸拉链结构，例如所述TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区具有SEQ ID NO：3所示的序列。

4.权利要求1-3中任一项的构建体，其中所述TRAIL蛋白片段编码区具有SEQ ID NO：1所示的序列。

5.权利要求1-4中任一项的构建体，其具有SEQ ID NO：4所示的序列。

6.一种载体，其包含权利要求1-5中任一项的构建体，优选的，所述载体为动物细胞表达载体，优选为慢病毒载体，例如pCDH。

7.一种哺乳动物细胞，其基因组上整合了权利要求1-5中任一项的构建体，并且可表达和分泌所述TRAIL蛋白或其片段，所述哺乳动物细胞优选为人、小鼠、大鼠、猪或猴的干细胞。

8.权利要求7的哺乳动物细胞，其为间充质干细胞，例如脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。

9.权利要求7或8的哺乳动物细胞，其是通过下述方法制备的：

a.构建如权利要求1-5中任一项的构建体，所述构建体包含(1)分泌信号肽编码区；(2)TRAIL蛋白三聚体稳定结构编码区；和(3)TRAIL蛋白片段编码区，

(a)TRAIL的114～281氨基酸残基；

10.一种用于治疗脑瘤，例如神经胶质瘤，的药物组合物，其含有权利要求1-5中任一项的构建体或权利要求6的载体或权利要求7的细胞。

11.权利要求1-5中任一项的构建体或权利要求6的载体或权利要求7-9中任一项的细胞或权利要求10的药物组合物在治疗脑瘤，例如神经胶质瘤，中的应用。

12.权利要求1-5中任一项的构建体或权利要求6的载体或权利要求7-9中任一项的细胞或权利要求10的药物组合物在制备治疗脑瘤，例如神经胶质瘤，的药物中的应用。