CN111701017B - 一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物疫苗领域，具体地说，涉及一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法。该疫苗由PBD‑b‑PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白组成；所述的PBD‑b‑PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白的质量比为100：1‑200：1。本发明提供的猪流行性腹泻病毒疫苗能够有效地将抗原递送至抗原呈递细胞，并诱导抗体产生和细胞介导的反应；对怀孕母猪饲喂本发明的猪流行性腹泻病毒疫苗后，可显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并长时间维持在一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，使得所产仔猪在断奶后就能产生抗体，并在断奶后长时间维持在一个较高的血清抗体水平。

Description

一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于动物疫苗领域，具体地说，涉及一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染引起的一种急性、高度接触性的猪肠道传染病。PEDV可感染各年龄的猪，导致动物出现呕吐、水样腹泻及脱水等临床症状，以仔猪的感染最为严重，病死率可达80%-100%，给养猪业造成了巨大的经济损失。
目前市场上预防猪流行性腹泻的疫苗多数为传统的肌肉注射疫苗，由于新生仔猪免疫系统发育不完善，注射疫苗不能及时产生保护力，导致免疫屡屡失败。通过给母猪免疫，在初乳中产生的母源抗体使新生仔猪获得被动型乳源性免疫力是目前预防新生仔猪肠道传染病理想的策略。
如中国专利ZL201611000980.0公开了一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，含有灭活的猪流行性腹泻病毒和佐剂，其中佐剂是由以重量百分含量计5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温80、92%0.005M柠檬酸钠缓冲溶液和1%的β-葡聚糖组成，所述猪流行性腹泻病毒是由猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株经灭活制备得到，其微生物保藏编号为CGMCC No.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。与现有的商品化疫苗毒株相比，本发明所筛选的猪流行性腹泻病毒PEDV-KB2013-4株具有免疫原性好，在产前42天前进行灭活疫苗的免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。然而在研究中发现，该疫苗在产前42天前对怀孕母猪进行注射后，虽然能够很快产生抗体，但在免疫后第2周抗体水平就呈明显的下降趋势，仔猪断奶后母源抗体水平逐渐消退，致使仔猪的抵抗力下降，不利于断奶后仔猪的保护。另外，该疫苗采用以角鲨烷、油酸和吐温80等制成的佐剂组分种类繁多，成分复杂，也给猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备带来了一定的难度。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法，其制备工艺简单，无需种类繁多的佐剂，且饲喂本发明的猪流行性腹泻病毒疫苗后，可以显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并长时间维持在一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，使得所产仔猪在断奶后就能产生抗体，并在断奶后长时间维持在一个较高的血清抗体水平。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪流行性腹泻病毒疫苗，其中，所述的猪流行性腹泻病毒疫苗由PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白组成；所述PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白的质量比为100：1~200：1。
蛋白是PEDV编码蛋白中的一种结构蛋白，它能把病毒粒子吸附在宿主细胞受体上，通过膜融合渗进细胞中。能诱导产生中和抗体，具有PEDV抗原的作用。
本发明中，所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白可以为猪流行性腹泻病毒广东1株S蛋白，其基因序列记载在Genbank上（登录号为：KP698751）。
本发明中，PBD-b-PEO/DOTAP形成一种结构、性质和尺寸均与正常细胞膜非常接近的双层脂质膜结构，它们是直径约为100nm的中空囊泡，且其壁是由双层的共聚物所形成的，能够在其壁中或中空结构内部掺入抗原，有效地将抗原递送至抗原呈递细胞，并诱导抗体产生和细胞介导的反应，增强诱导产生抗体水平。
经试验表明，通过给母猪饲喂本发明的由PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白组成的猪流行性腹泻病毒疫苗，可以显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并且母猪乳汁中的特异性SIgA水平能长时间维持一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，使得所产仔猪在断奶后就能产生抗体，中和抗体水平逐渐增加，直到断奶后35天，仍保持较高的血清抗体水平，且较现有的疫苗相比抗体效价差异显著，从而给仔猪提供了更好的免疫保护。
本发明中，PBD-b-PEO和阳离子脂质体DOTAP可从市场上购置得到，如PBD-b-PEO可购置于ACM Biolabs公司或加拿大Polymer Source公司；阳离子脂质体DOTAP可购置于ACMBiolabs公司（纯度大于99%）或加拿大TRC公司（纯度大于98%）。
进一步的，所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白的浓度为5~100μg/ml。
本发明还提供所述的猪流行性腹泻病毒疫苗的制备方法，其中，所述的制备方法包括如下步骤：
1）将PBD-b-PEO和DOTAP溶于四氢呋喃溶液中，得到PBD-b-PEO/DOTAP溶液；
2）将猪流行性腹泻病毒S蛋白用缓冲液稀释，调节pH值至6.0~9.0，得到猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液；
3）向猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液中加入步骤1）制得的PBD-b-PEO/DOTAP溶液，搅拌，混合均匀，然后进行均化、除菌、包装，得到所述的猪流行性腹泻病毒疫苗。
本发明制备工艺简单，无需种类繁多的佐剂；经对怀孕母猪饲喂本发明的猪流行性腹泻病毒疫苗后，可以显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并长时间维持在一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，使得所产仔猪在断奶后就能产生抗体，并在断奶后长时间维持在一个较高的血清抗体水平。
进一步的，步骤1）中，PBD-b-PEO与DOTAP的质量比为10：1~20：1。
进一步的，步骤2）中，所述的稀释为稀释至猪流行性腹泻病毒S蛋白浓度为5µg/ml~100µg/ml。
进一步的，步骤3）中，PBD-b-PEO/DOTAP溶液与猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液的体积比为1：25~1：50。
进一步的，所述的PBD-b-PEO/DOTAP溶液的加入速率为8~12µl/分钟。
进一步的，步骤3）中，所述搅拌的搅拌速度为600~800转/分。
本发明中，所述的缓冲液由如下组分配制而成：
磷酸二氢钠 12g
蔗糖 80g
氢氧化钠 适量
盐酸 适量
甘氨酸 0.7507g
氯化钠 0.2922g
水 加至1000ml
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明提供的猪流行性腹泻病毒疫苗能够有效地将抗原递送至抗原呈递细胞，并诱导强抗体和细胞介导的反应；
（2）饲喂本发明的猪流行性腹泻病毒疫苗，可以显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并且能使母猪乳汁中的特异性SIgA水平长时间维持在一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，从而使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，提高仔猪的存活率、降低养殖损失；
（3）饲喂本发明的猪流行性腹泻病毒疫苗的母猪所产仔猪在断奶后就能产生抗体，中和抗体水平逐渐增加，直到断奶后35天，仍保持较高的血清抗体水平，且较现有的疫苗相比抗体效价差异显著。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为各组母猪乳汁中特异性SIgA水平图；
图2为各组母猪所产仔猪的抗体水平检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
（1）将10mgPBD-b-PEO和1mgDOTAP溶于10ml四氢呋喃溶液中，待DOTAP脂质溶解后得到PBD-b-PEO/DOTAP溶液，存放于冰箱中，备用；
（2）将猪流行性腹泻病毒S蛋白用缓冲液稀释至浓度为50µg/ml，再用适量的氢氧化钠和/或盐酸调节pH值至9.0，得到猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液；其中，所述的缓冲液由如下组分配制而成：
磷酸二氢钠 12g
蔗糖 80g
氢氧化钠 适量
盐酸 适量
甘氨酸 0.7507g
氯化钠 0.2922g
水 加至1000ml
（3）取250ml步骤（2）制得的猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液，以10µl/分钟的速率加入10ml步骤1）制得的备用的PBD-b-PEO/DOTAP溶液，以700转/分的搅拌速度搅拌，混合均匀；然后将所得溶液置于均化器中进行均化处理，均化后通过截留分子量为300kDa的切向超滤器去除游离抗原，再进行除菌处理、包装，得到猪流行性腹泻病毒疫苗。
实施例2
（1）将20mgPBD-b-PEO和1mgDOTAP溶于10ml四氢呋喃溶液中，待DOTAP脂质溶解后得到PBD-b-PEO/DOTAP溶液，存放于冰箱中，备用；
（2）将猪流行性腹泻病毒S蛋白用缓冲液稀释至浓度为5µg/ml，再用适量的氢氧化钠和/或盐酸调节pH值至6.0，得到猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液；其中，所述的缓冲液同实施例1；
（3）取500ml步骤（2）制得的猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液，以8µl/分钟的速率加入10ml步骤1）制得的备用的PBD-b-PEO/DOTAP溶液，以600转/分的搅拌速度搅拌，混合均匀；然后将所得溶液置于均化器中进行均化处理，均化处理分两个阶段进行，第一阶段维持压力50±5Bar，第二阶段维持压力700±20Bar，重复5次；均化结束后，通过截留分子量为300kDa的切向超滤器去除游离抗原，再进行除菌处理、包装，得到猪流行性腹泻病毒疫苗。
实施例3
（1）将15mgPBD-b-PEO和1mgDOTAP溶于10ml四氢呋喃溶液中，待DOTAP脂质溶解后得到PBD-b-PEO/DOTAP溶液，存放于冰箱中，备用；
（2）将猪流行性腹泻病毒S蛋白用缓冲液稀释至浓度为100µg/ml，再用适量的氢氧化钠和/或盐酸调节pH值至7.0，得到猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液；其中，所述的缓冲液同实施例1；
（3）取350ml步骤（2）制得的猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液，以12µl/分钟的速率加入10ml步骤1）制得的备用的PBD-b-PEO/DOTAP溶液，以800转/分的搅拌速度搅拌，混合均匀；然后将所得溶液置于均化器中进行均化处理，均化处理分两个阶段进行，第一阶段维持压力50±5Bar，第二阶段维持压力700±20Bar，重复8次；均化结束后，通过截留分子量为300kDa的切向超滤器去除游离抗原，再进行除菌处理、包装，得到猪流行性腹泻病毒疫苗。
实施例4
（1）将12mgPBD-b-PEO和1mgDOTAP溶于10ml四氢呋喃溶液中，待DOTAP脂质溶解后得到PBD-b-PEO/DOTAP溶液，存放于冰箱中，备用；
（2）将重组猪流行性腹泻病毒S蛋白用缓冲液稀释至浓度为80µg/ml，再用适量的氢氧化钠和/或盐酸调节pH值至7.5，得到重组猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液；其中，所述的缓冲液同实施例1；
（3）取400ml步骤（2）制得的重组猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液，以10µl/分钟的速率加入10ml步骤1）制得的备用的PBD-b-PEO/DOTAP溶液，以700转/分的搅拌速度搅拌，混合均匀；然后将所得溶液置于均化器中进行均化处理，均化处理分两个阶段进行，第一阶段维持压力50±5Bar，第二阶段维持压力700±20Bar，重复10次；均化结束后，通过截留分子量为300kDa的切向超滤器去除游离抗原，再进行除菌处理、包装，得到猪流行性腹泻病毒疫苗。
试验例1
1、试验设计
从猪场中挑选了30头健康的怀孕母猪（PEDV阴性），分为3组，每组10头。第1组（口服组）在产前42d经口饲喂100μg本发明实施例1制得的猪流行性腹泻病毒疫苗；第2组（肌注组）在产前42d肌肉注射2mL灭活的PEDV疫苗，10d后再肌肉注射1次，剂量相同；第3组（对照组）既不注射灭活疫苗也不饲喂本发明的猪流行性腹泻病毒疫苗。
、样品采集和处理
30头猪分娩后分别于第0d、7天、14天、21天、28天和35天采集乳汁。乳汁处理：取20mL乳汁置于冰上，用210μm孔径的尼龙网过滤一次，4℃1600-1700r∙min-1离心15min，收集上清液，用于检测特异性SigA水平。
、乳汁中特异性SIgA水平的检测
取1μg mL-1纯化的PEDV S蛋白包被酶标板，每孔100μL，4℃孵育过夜；PBST洗涤5次（每次5min），甩干后每孔加400μL30g L-1牛血清白蛋白，37℃孵育2h；洗涤后每孔加100μL乳汁（1：40稀释液和原液），37℃孵育1.5h；将待检样品洗涤后每孔加100μLHRP标记的羊抗猪IgA（1：4000和1：2000），37℃孵育1h；洗涤后每孔加100μL底物显色液TMB液，37℃避光作用5min；加50μL终止液终止显色；酶标仪读D450值。
、结果
各组母猪乳汁中特异性SIgA水平结果如图1所示。
从图1可以看出，口服本发明制得的猪流行性腹泻病毒疫苗的母猪乳汁中的特异性SIgA水平较肌注组和对照组显著增加。
试验例2
从试验例1的口服组、肌注组和对照组各母猪所产仔猪中各随机选取6头，分置三个独立房间进行饲养，均于母乳喂养35d后断奶，分别于断奶第0天、7天、14天、21天、28天和35天收集血清样品，以7天为间隔进行血清中和实验。
血清中和实验采用固定病毒稀释血清法，对用于中和试验的血清进行加热灭活处理：60℃，30min。用细胞生长液配比稀释血清：1：2、1：4、1：8、1：16......1：256，每个稀释度做4个重复。试验组每孔加血清样品50μL及50μL病毒液（病毒液滴度为200TCID50），封盖，37℃温箱放置，病毒和血清制作1h后，每孔加100μLVero悬液，37℃、5%CO2细胞培养箱培养48h后逐日观察结果。
试验结果如图2所示。
从图2可以看出，口服本发明制得的猪流行性腹泻病毒疫苗的母猪所产仔猪断奶后就能产生抗体，中和抗体水平逐渐增加，直到断奶后35天，仍保持较高的血清抗体水平，且较肌注组和对照组相比抗体效价差异显著。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种猪流行性腹泻病毒疫苗，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒疫苗的制备方法包括如下步骤：
（1）将10mgPBD-b-PEO和1mgDOTAP溶于10ml四氢呋喃溶液中，待DOTAP脂质溶解后得到PBD-b-PEO/DOTAP溶液，存放于冰箱中，备用；
（2）将猪流行性腹泻病毒S蛋白用缓冲液稀释至浓度为50µg/ml，再用适量的氢氧化钠和/或盐酸调节pH值至9.0，得到猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液；其中，所述的缓冲液由如下组分配制而成：
磷酸二氢钠12g
蔗糖80g
氢氧化钠适量
盐酸适量
甘氨酸0.7507g
氯化钠0.2922g
水加至1000ml；
（3）取250ml步骤（2）制得的猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液，以10µl/分钟的速率加入10ml步骤（1）制得的备用的PBD-b-PEO/DOTAP溶液，以700转/分的搅拌速度搅拌，混合均匀；然后将所得溶液置于均化器中进行均化处理，均化后通过截留分子量为300kDa的切向超滤器去除游离抗原，再进行除菌处理、包装，得到猪流行性腹泻病毒疫苗。
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