CN116568323A - 活减毒呼吸道合胞病毒 - Google Patents

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Abstract

本文报告具有减毒表型的新型重组呼吸道合胞病毒(RSV)。本文所述的重组RSV毒株适合于用作活减毒RSV疫苗。还提供能够编码所述病毒的多核苷酸序列，以及用于产生和使用所述病毒的方法。

Description

活减毒呼吸道合胞病毒
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月5日提交的美国临时申请号63/035,617的优先权，其通过引用以其整体并入。
技术领域
本文公开的主题涉及适合用作疫苗的呼吸道合胞病毒(RSV)及其减毒突变株。
联合研究协议各方
本发明是根据美国国立卫生研究院国家过敏症和传染病研究所与SanofiPasteur,Inc之间的公共卫生服务合作研究与开发协议(PHS-CRADA)第2013-0810号完成的。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(RSV)在生命早期感染几乎世界上的每个人并且导致高死亡率和患病率。仅在美国，RSV每年就导致75,000-125,000例住院，并且保守估计表明，RSV在世界范围内每年导致6400万例儿童感染和160,000或更多例儿童死亡。RSV的另一个值得注意的特征在于，婴儿期在严重感染后通常发生持续的气道功能障碍，包括对气道反应性的倾向，这在一些个体中持续数年并且可能延长至青春期和更久。RSV感染加重哮喘并且可能参与引发哮喘。
RSV是肺泡病毒科的成员，并且因此是在胞质中复制并通过在宿主细胞质膜处芽殖而成熟的囊膜病毒。RSV的基因组是15.2千碱基的单一负义链RNA，其被病毒聚合酶通过在基因组3'端的单一病毒启动子处起始的顺序启停机制(sequential stop-startmechanism)转录为10个mRNA。每个mRNA编码单一主要蛋白，但M2 mRNA例外，它具有两个重叠的开放阅读框(ORF)，编码两种单独蛋白M2-1和M2-2。这11种RSV蛋白是：RNA结合核蛋白(N)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)、附着糖蛋白(G)、融合蛋白(F)、小疏水(SH)表面糖蛋白、内部基质蛋白(M)、两种非结构蛋白NS1和NS2以及M2-1和M2-2蛋白。RSV基因顺序为：3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L。每个基因侧接有称为基因起始(GS)信号的短保守转录信号(存在于每个基因的上游端并参与起始相应基因的转录)和基因终止(GE)信号(存在于每个基因的下游端并参与引导多聚A尾的合成和之后mRNA的释放)。转录在3'端的单一启动子处开始并依序进行。
RSV疫苗的开发自二十世纪六十年代起已经在进行中，但是因多种因素而非常复杂。例如，已经显示用灭活RSV对初次感染RSV的婴儿进行免疫可针对随后自然RSV感染后增强的疾病进行初免，并且在实验动物中的研究表明，疾病增强也与纯化的RSV亚单位疫苗有关。
免疫保护的另一个障碍在于，RSV在呼吸气道管腔的表面细胞中复制并引起疾病，其中免疫保护的有效性降低。因此，对RSV感染的免疫控制是无效的且通常不完全，并且对于RSV疫苗重要的是尽可能地具有免疫原性。RSV疫苗的另一个障碍在于，保护性免疫应答的量值与病毒复制(以及抗原产生)的程度大致成比例。因此，制备活疫苗所需的RSV减毒通常伴随复制和抗原合成的减少，以及免疫原性的并行降低，因此鉴定耐受良好且免疫原性令人满意的复制水平是有益的。
另一个障碍在于，RSV在细胞培养中仅生长至中等滴度并且通常以难以纯化的长丝存在。RSV在操作期间可以容易地丧失感染性。另一个障碍是鉴定和开发减毒突变的困难。适当突变必须在体内是减毒的，但是应在体外对复制的限制性最低，因为这对于有效疫苗制造是优选的。另一个障碍是作为RNA病毒特征的遗传不稳定性，减毒突变可能借此回复至野生型(wt)分配或回复至赋予非减毒表型的替代性分配。不稳定性和去减毒对于点突变特别成问题。
综合考虑这些因素，存在对如下活减毒RSV毒株的需要，所述活减毒RSV毒株在体外有效复制，具有最大免疫原性，令人满意地减毒，并且难以去减毒。
发明内容
本文报告适合用作活减毒RSV疫苗的具有减毒表型的新型重组人RSV的实施方案。所公开的重组RSV包含导致所述减毒表型的一个或多个基因突变。
在一些实施方案中，所述重组人RSV包含如下基因组，所述基因组包含分别位于基因位置1-9的RSV F、G、NS2、N、P、M、SH、M2和L基因，其中位于基因位置1和2的F和G基因分别是从天然基因位置8和7转移的，并且其中所述基因组包含编码NS1蛋白的序列的缺失，并且其中所述重组RSV是感染性的、减毒的和自复制的。在几个实施方案中，所述重组RSV的SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610(包含端值)的缺失，以及对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。
在一些实施方案中，编码NS1蛋白的序列的所述缺失包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置99-627(包含端值)的缺失。在一些实施方案中，所述L基因编码L蛋白，所述L蛋白包含由TCA密码子编码的S1313残基和由AAA密码子编码的Y1314K取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO:13所示的参考L蛋白序列(所述L蛋白的氨基酸序列)。
在一些实施方案中，所述L基因编码L蛋白，所述L蛋白包含S1313的缺失和I1314L取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO:13所示的参考L蛋白序列。
在一些实施方案中，编码F蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:14(F WT)或SEQ IDNO:15(FBB)。在一些实施方案中，所述重组RSV的基因组不含任何异源基因。在一些实施方案中，所述重组RSV的基因组还包含所述NS2基因的缺失。
在一些实施方案中，所述RSV基因组包含如上文所讨论的修饰，并且包含对应于与SEQ ID NO:3(LID/F1G2/ΔNS1)、SEQ ID NO:4(LID/F1BBG2/ΔNS1)、SEQ ID NO:6(LID/F1G2/ΔNS1/1030s)、SEQ ID NO:7(LID/F1BBG2/ΔNS1/1030s)、SEQ ID NO:9(LID/F1G2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)或SEQ ID NO:10(LID/F1BBG2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)至少99％相同的正义序列的核苷酸序列。例如，所述RSV基因组可以包含对应于由SEQ ID NO:3(LID/F1G2/ΔNS1)、SEQ ID NO:4(LID/F1BBG2/ΔNS1)、SEQ ID NO:6(LID/F1G2/ΔNS1/1030s)、SEQ ID NO:7(LID/F1BBG2/ΔNS1/1030s)、SEQ ID NO:9(LID/F1G2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)或SEQ ID NO:10(LID/F1BBG2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)表示的正义序列的核苷酸序列或由其组成。
本文公开的重组RSV的实施方案可以是亚型A RSV或亚型B RSV。
本文还提供与所公开的病毒的表达相关的方法和组合物。例如，提供分离的多核苷酸分子，其包括编码所述病毒的基因组或反基因组的核酸序列。另外提供产生重组RSV的方法，所述方法包括用包含含有所公开的重组RSV的基因组或反基因组的核酸分子的载体转染允许细胞培养物，将所述细胞培养物孵育足够长时间段以允许病毒复制；以及纯化复制的重组RSV。
还提供包括所述重组RSV的药物组合物。所述组合物还可以包括佐剂。还公开通过将有效量的所公开的重组RSV施用至受试者来引发所述受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述受试者是人类受试者，例如，年龄在1月龄与6月龄之间，或1月龄与12月龄之间，或1月龄与18月龄之间或年龄更大的人类受试者。
本公开文本的前述和其他特征和优点将根据关于附图进行的几个实施方案的以下详细描述变得更清楚。
附图说明
图1A-图1C.NS1的缺失(ΔNS1)、NS1和NS2一起缺失(ΔNS1+2)以及D46的SH基因的部分的缺失和修饰(LID突变)。(图1A)ΔNS1缺失的详情。529-nt缺失(核苷酸99-627(包含端值))始于并包括核苷酸99(它是NS1 ORF的ATG的第一核苷酸)并且延伸至且包括核苷酸627(它紧接在NS2 ORF的ATG(核苷酸628-630)之前)。该缺失将NS1基因的上游非翻译区与NS2 ORF的翻译起始密码子接合。显示编码的氨基酸MDTTHNDN(SEQ ID NO:21)。(图1B)ΔNS1+2突变的详情。1042-nt缺失(核苷酸99-1140(包含端值))始于并包括核苷酸99(它是NS1 ORF的ATG的第一核苷酸)并且延伸至且包括核苷酸1140(它紧接在N ORF的ATG(1141-1143)之前)。该缺失将NS1基因的上游非翻译区与N ORF的翻译起始密码子接合。显示编码的氨基酸MALSKVKL(SEQ ID NO:22)。(图1C)LID突变的详情。该突变由以下的组合组成：涵盖D46的SH基因的大部分下游非翻译区的缺失，以及最后三个密码子中的五个翻译沉默取代和SH ORF的终止密码子。112-nt缺失始于并包括核苷酸4499(它紧接在SH ORF的TAG终止密码子之后)并且延伸至且包括核苷酸4610(它位于SH基因终止信号上游7个核苷酸处)。该缺失与同义核苷酸取代C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A(粗体且加下划线)组合。显示编码的氨基酸ARVNT(SEQ ID NO:23)。注意，RSV LID大体上类似于野生型RSV并且在一些以下实验中用作野生型样对照。
图2A和图2B.G和F基因从其天然基因组位置(分别为基因位置7和8)转移至启动子近端且F在G之前(而不是G在F之前的天然顺序)，F和G分别位于基因位置1和2。(图2A)。使核苷酸4630-7551(包含端值)从RSV反基因组cDNA缺失以去除F和G基因。这具有使SH基因终止信号与F/M2基因间区融合的作用。该突变用反基因组D46 cDNA来说明，所述反基因组D46cDNA带有LID突变(所述LID突变用SH基因上方或下方的空心三角形来指示)，但是所述修饰不依赖于所述LID突变。(图2B)。将G和F ORF(阴影序列)按其天然顺序的相反顺序(即，F-G代替G-F)重构为基因。每个ORF侧接有短非翻译区以及基因起始和基因终止信号，并且通过由单一核苷酸组成的短基因间区隔开。将具有Xho I位点(图2B中加框)的核苷酸衔接子添加于F ORF(CTCGAGTTCACC，XhoI位点加下划线，SEQ ID NO:28)的上游和基因终止-基因间-基因起始序列(AGTTAATAAAAAATGGGGCAAATACTCGAG，XhoI位点加下划线，SEQ ID NO:29)的下游在G ORF之后。使用四个核苷酸取代将Xho I位点引入在底部显示的LID反基因组cDNA中的NS1 ORF之前的非编码区中，并且需要所述序列中代表上游非翻译NS1基因区的核苷酸88-91从CTTG(以大写字母显示)至tcga(以小写字母显示)的突变。显示编码的氨基酸MELLILK(SEQ ID NO:24)、FSN、MSKN(SEQ ID NO:25)、TPRQ(SEQ ID NO:26)和MDTT(SEQ IDNO:27)。如以底部的反基因组所显示，使用Xho I位点将F-G基因盒(交叉影线矩形)插入基因组cDNA中。
图3A-图3D.带有不同突变组合的RSV毒株的基因组图谱，所述突变组合包括LID突变(所述LID突变用SH基因上的空心三角形来指示)；G和F从其天然位置缺失(ΔG+F)并分别转移至第2和第1基因位置(F1G2，其中F和G按其天然顺序G-F的相反顺序)；F1G2，其中F ORF已经进行密码子优化(F1BBG2)；NS1基因的缺失(ΔNS1)；“稳定的”1030s突变的添加(即，难以去减毒)，其由L分配1321K(AAA)和1313S(TCA)组成；L中“稳定的”Δ1313和I1314L(CTG)突变的添加(即，难以去减毒)；以及NS1和NS2基因二者的缺失(ΔNS1+2)。(图3A)RSV LID加ΔNS1缺失，呈原样或具有F1G2或F1BBG2修饰。(图3B)RSV LID/ΔNS1加1030s突变，呈原样或具有F1G2或F1BBG2修饰。(图3C)RSV LID/ΔNS1加Δ1313和I1314L突变，呈原样或具有F1G2或F1BBG2修饰。(图3D)RSV LID加ΔNS1+2缺失，呈原样或具有F1G2或F1BBG2修饰。
图4.指示的重组RSV在Vero细胞中的多周期生长动力学。该图显示，带有呈不同组合的LID、ΔNS1、F1G2和F1BBG2突变的病毒在Vero细胞(用于疫苗制造的细胞基质)中复制至合理滴度。
图5.指示的重组RSV在人气道上皮(HAE)细胞培养中的多周期生长动力学。HAE培养形成非常类似于真实气道上皮的分化的、极化的、假复层的黏液纤毛组织。这些培养中的减毒复制预示非人灵长类动物和人中的减毒复制。这些数据显示，带有ΔNS1、F1G2和F1BBG2修饰的病毒发生明显减毒。
图6.带有呈各种组合的LID、F1BBG2、F1G2和ΔNS1突变的重组RSV易于在Vero细胞上形成噬斑。
图7.带有F1G2和F1BBG2基因转移的重组RSV引导在多周期复制期间Vero细胞中大型合胞体的形成，与F蛋白的表达增加一致。合胞体的例子用箭头指示。
图8.在被带有F1G2和F1BBG2修饰的重组RSV感染的Vero细胞中，RSV F和G蛋白的表达增加。Vero细胞以3PFU/细胞的MOI被感染，并且在感染后24h收获细胞，且通过在变性和还原条件下的凝胶电泳以及使用具有所指示特异性的抗体的蛋白质印迹分析进行分析。RSV F、G、N、P和M蛋白相对于作为1.0的RSV LID的表达水平显示在右侧。该图显示，RSV G和F的基因转移增加其表达，且对其他基因的影响极小。
图9.在被缺少NS1基因的重组RSV感染的人气道A549细胞中，1型(α、β)和III型(λ)干扰素的表达增加。A549细胞以3PFU/细胞的MOI被感染，并且在感染后24h收集组织培养基上清液。通过ELISA确定IFN浓度。该图显示，RSV NS1基因的缺失导致宿主细胞干扰素的表达显著增加。
图10A和图10B.F1G2或F1BBG2或ΔNS1修饰的存在导致小鼠呼吸道中的RSV复制减少。用104或106PFU/动物的剂量的每种指示的RSV感染六周龄BALB/c小鼠。将每种病毒和剂量的五只动物在感染后3天(图10A)和5天(图10B)处死，并且收获鼻甲和肺，将其匀浆化，并通过噬斑测定来确定病毒滴度。
图11.尽管复制受限，但是带有ΔNS1、F1G2和F1BBG2修饰的指示组合的重组RSV诱导的RSV中和血清抗体的滴度与LID病毒不相上下。如图10中所述感染动物，并在感染后28天收集血清样品。
图12.来自表1和表2的AGM数据。
图13.来自表3的AGM数据。
图14A-图14F.在仓鼠中对所选免疫原的初免-加强方案的评价。(图14A)研究设计。确认96只仓鼠是RSV血清阴性和HPIV3血清阴性的并将其分配为八组，每组12只动物。在第0天，用0.1ml L15培养基中的106PFU的RSV D46给予组A-组D原发性IN感染，并使组E-H保持未被感染。六周后，收集血清用于确定加强前60％ RSV噬斑减少中和滴度(RSV-PRNT)。两天后，用以下四种病毒之一对成对的初免组和未初免组进行IN加强(对于载体，105TCID50；且对于RSV，106PFU)：(i)空rB/HPIV3载体(组A和组E)；(ii)DS-Cav1载体(组B和组F)；(iii)DS-Cav1/B3TMCT载体(组C和组G)；以及(iv)RSV D46(组D和组H)。在加强后五天，收集每组六只仓鼠的鼻甲(NT)和肺用于病毒滴定。在加强后两周，从每组另外六只仓鼠收集血清以测量RSV-PRNT和HPIV3-PRNT，并在两天后用106PFU RSV D46对所述动物进行IN激发。在激发后三天，收集NT和肺用于RSV复制的滴定。(图14B、图14C)加强后五天，(图14B)NT和(图14C)肺组织匀浆物中加强病毒的滴度。虚线和点线分别指示rB/HPIV3载体和RSV D46的检测限(LOD)。(图14D)加强后两周，初免仓鼠和未初免仓鼠中的血清HPIV3-PRNT，在没有补体的情况下测定。(图14E、图14F)组A-组D动物中的加强前和加强后血清RSV-PRNT，所述动物用RSV D46进行初免并用指示的病毒进行加强，在添加(图14E)和不添加(图14F)补体的情况下测定。所指示的比较之间的差异显著性通过Student's t检验来确定：ns指示不显著(P>0.05)；*指示0.01<P<0.05；**指示0.001<P<0.01；***指示0.0001<P<0.001。
图15A-图15E.AGM实验#1：在初免与加强之间的间隔为约2个月(两个月减九天)时，AGM中的病毒复制和血清RSV-PRNT。(图15A)研究设计。预先通过组合IN/IT途径用三种RSV之一(表8)向十二只AGM施用原发性感染。在第37天(加强前两周)收集血清，并且在存在补体的情况下确定RSV-PRNT。将所述AGM组织为两组，每组六只动物，将它们针对第37天RSV-PRNT、初免病毒的身份和性别比加以平衡(表8)。在初免后第51天(两个月减九天)，通过组合IN/IT途径用RSV 276(其为ΔM2-2病毒；SEQ ID NO:12)或DS-Cav1/B3TMCT载体对所述组进行加强。在加强后第1天-第10天通过NP和TL和病毒滴定监测病毒脱落。在加强后第7天、第14天、第21天和第28天收集血清。(图15B、图15C)(图15B)NP和(图15C)TL中的病毒滴度，显示为平均值，括号指示SEM，以及检测限，显示为虚线(载体)和点线(RSV)。(图15D)初免后第37天以及加强后第0天、第7天、第14天、第21天和第28天的血清RSV-PRNT，在存在补体的情况下测定。(图15E)加强后第0天、第7天、第14天、第21天和第28天的血清RSV-PRNT，在没有补体的情况下测定。图D和图E注释为显示在加强时组合的两个组的平均血清RSV-PRNT(黑色虚线，且显示算术平均值)；另外，有色虚线指示每组的最高平均血清RSV-PRNT，且显示算术值。显示平均血清RSV-PRNT，且括号指示SEM。通过Student's t检验比较两组的峰值平均滴度：**指示0.001<P<0.01；***指示0.0001<P<0.001。
图16A-图16G.AGM实验#2：在初免与加强之间的间隔为约6个月(六个月加九天)，AGM中的病毒复制和血清RSV-PRNT。(图16A)研究设计。通过组合IN/IT途径用五种减毒RSV之一(表9)向二十只AGM施用原发性感染。在第28天和第154天(后者是加强前35天)收集血清，并且在存在补体的情况下确定RSV-PRNT。将所述AGM组织为三组(n＝6、7和7)，将它们针对第154天血清RSV-PRNT、初免病毒的身份和性别比加以平衡(表9)。在初免后第189天(六个月加九天)，用以下三种病毒之一对所述组进行加强：(i)RSV 276(n＝6)、(ii)DS-Cav1载体(n＝7)或(iii)DS-Cav1/B3TMCT载体(n＝7)。如图15的图例中所述来监测病毒脱落和血清RSV-PRNT。在加强后第0天、第14天、第21天、第28天收集鼻黏膜衬液用于使用SAM条带进行IgA分析(详情参见方法和材料)。(图16B、图16C)确定(图16B)NP和(图16C)TL中的病毒滴度，显示为平均值，括号指示平均值的标准误差(SEM)，以及检测限，显示为虚线(载体)和点线(RSV)。(图16D)在初免后28、154和189天以及加强后7、14、21和28天的血清RSV-PRNT，用补体测定。(图16E)在加强后0、7、14、21、28天的RSV-PRNT，在没有补体的情况下测定，显示为平均值，括号指示SEM。图D和图E注释为显示在加强时组合的三个组的平均血清RSV-PRNT(黑色虚线，给出算术平均值)；另外，有色虚线指示每组的最高平均RSV-PRNT，给出算术值。(图16F、图16G)AGM中的血清和鼻黏膜IgA反应。在(图16F)加强后第0天、第7天、第14天、第21天和第28天收集的血清样品以及(图16G)加强后第0天、第14天、第21天和第28天收集的鼻黏膜衬液中确定IgA抗体滴度(注意，在DS-Cav1/BTMCT组中，第28天SAM试样中的一个没有提供足够体积；因此，仅针对6只动物来计算DS-Cav1/BTMCT载体的第28天平均滴度)。在DELFIA TRF测定中通过与纯化的RSV DS-Cav1 F蛋白结合来测量IgA滴度。抗体滴度作为产生400个荧光单位的血清或黏膜试样的log2稀释度给出，显示为平均值，括号指示SEM。在加强时(第0天)组合的三个组的平均抗体滴度由较大的黑色点线指示；在第0天所有SAM样品的滴度都低于检测水平(5.3log2)。所述检测限(LOD)由较小的黑色点线指示。有色虚线指示每组的最高平均抗体滴度。通过Student's t检验对三个组的峰值平均滴度进行成对比较(GraphPad Prism)：*指示0.01<P<0.05；**指示0.001<P<0.01；***指示0.0001<P<0.001；ns指示P>0.05，不显著。
图17A-图17E.AGM实验#3：在初免与加强之间的间隔为约15个月(15个月减七天)时，AGM中的病毒复制和血清RSV-PRNT。(图17A)研究设计。预先用候选活减毒疫苗RSV276向四只AGM施用原发性感染(表10)。在第429天(加强前两周)收集血清，并且用补体确定RSV-PRNT。将所述AGM分配为两组，每组两只动物，使得所述组基于第429天血清具有类似的单独和平均RSV-PRNT(表10)。在初免后第443天(15个月减七天)，收集血清并用以每个部位106TCID50(DS-Cav1/B3TMCT载体)或106PFU(RSV 276)的剂量IN和IT施用的DS-Cav1/B3TMCT载体(n＝2)或RSV 276(n＝2)对两组进行加强。如图15和图16的图例中所述来监测病毒复制和血清学反应。(图17B、图17C)(图17B)NP和(图17C)TL中的病毒滴度，显示为平均值，且检测限显示为虚线。符号指示单独动物的滴度，并且线指示平均值。(图17D)在初免后第429天和加强后第0天、第7天、第14天、第21天和第28天的血清RSV-PRNT，用补体测定。(图17E)在加强后第0天、第7天、第14天、第21天、第28天的血清RSV-PRNT，在没有补体的情况下测定。图D注释为显示在加强时组合的两个组的平均血清RSV-PRNT(图D中的黑色虚线，且以1:26显示算术平均值)；另外，图D和图E用有色虚线注释，其指示每组的最高平均血清RSV-PRNT，且显示算术值。
图18A-图18C.在存在或不存在RSV中和抗体的情况下，rB/HPIV3载体在体外的多周期复制。将LLC-MK2细胞用空rB/HPIV3载体(图18A)、DS-Cav1载体(图18B)或DS-Cav1/B3TMCT载体(图18C)以0.01TCID50/细胞的MOI感染。在吸附1h后，将细胞用细胞培养基洗涤三次，然后在不存在添加补体的情况下与含有10％的以下血清之一的培养基(先前已将其在56℃下加热30min)一起孵育：免疫前仓鼠血清，或者来自用RSV D46或用空rB/HPIV3载体感染的仓鼠的合并血清。所述仓鼠血清来自图14中的实验。以一式三份进行不同处理。在感染后连续三天每天取等份培养基，将其速冻，并确定病毒滴度。在存在免疫前血清与RSV免疫血清的情况下，复制之间的差异显著性通过student-t检验来确定：*，P<0.05；**，P<0.01。
图19.RSV 276和wt rRSV在RSV血清阴性AGM中的复制。通过组合IN/IT途径用每个部位1mL接种物中106PFU的RSV 276(n＝8)或wt rRSV(n＝4)感染RSV血清阴性AGM。分别每天和每隔一天收集NP和TL，持续10天，加上在第12天收集NP和TL。通过免疫噬斑测定来确定病毒滴度，并且显示为每个时间点的组平均值。括号指示SEM，并且检测限显示为点线。此处用RSV 276感染的八只动物是表8和表10中显示的动物，随后在AGM实验#1和#3中对其进行加强。
图20A-图20B.加强RSV 276在来自约6个月之前用减毒RSV初免的AGM的气管灌洗液(TL)中的复制。根据图16中的实验，通过免疫噬斑测定(图20A)和专用于正义和负义RSVM基因序列二者的RT-qPCR(图20B)对加强后第2天、第4天、第6天、第8天和第10天TL中的RSV276的滴度进行定量。每种颜色代表单独的猴子。检测限用点线来指示。
图21.在6个月之前用活减毒RSV初免的AGM中，通过DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体诱导的血清HPIV3-PRNT。根据图16中的实验，在没有补体的情况下通过HPIV3 PRNT测定来分析在通过DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体加强后2周收集的血清。点指示单独的动物；组平均值用短水平线来指示。点线指示检测限。通过Student's t检验来比较两个组的平均血清HPIV3-PRNT：ns指示P>0.05，不显著。
序列表
如37C.F.R.1.822所定义，使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列。每个核酸序列仅显示一条链，但应理解，只要提及所展示的链，即包括其互补链。序列表以ASCII文本文件的形式提交，文件名为“Sequence.txt”(约356kb)，其创建于2021年6月4日，通过引用并入本文。在所附的序列表中：
SEQ ID NO:1是RSV D46的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:2是RSV LID/ΔNS1的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:3是RSV LID/F1G2/ΔNS1的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:4是RSV LID/F1BBG2/ΔNS1的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:5是RSV LID/ΔNS1/1030s的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:6是RSV LID/F1G2/ΔNS1/1030s的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:7是RSV LID/F1BBG2/ΔNS1/1030s的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:8是RSV LID/ΔNS1/Δ1313/I1314L的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:9是RSV LID/F1G2/ΔNS1/Δ1313/I1314L的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:10是RSV LID/F1BBG2/ΔNS1/Δ1313/I1314L的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:11是RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:12是RSV 276基因组的反基因组核酸序列。
SEQ ID NO:13是来自D46的L蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是来自D46的RSV F蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是RSV FBB蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是B/HPIV3 DS-Cav1的反基因组序列。
SEQ ID NO:17是B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT的反基因组序列。
SEQ ID NO:18是RSV LID/ΔNS2/1030s的反基因组序列。
SEQ ID NO:19是RSV LID/ΔNS2/Δ1313/I1314L的反基因组序列。
SEQ ID NO:20-29是DNA和蛋白质序列的片段。
具体实施方式
开发针对RSV的儿童疫苗的重大挑战包括免疫系统在婴儿期期间不成熟、母体抗体所致的免疫阻抑、在呼吸道表面上皮处的无效免疫保护、病毒对宿主反应的阻抑(如NS1和NS2对宿主干扰素和细胞凋亡反应的阻抑)以及已经在初次感染病毒的接受者中使用灭活或亚单位RSV疫苗的研究中观察到的疫苗诱导的增强的疾病(Kim等人,Amer.J.Epidemiol.89:422-434,1969；Ottolini等人,Viral Immunol.13:231-236,2000；Schneider-Ohrum等人,J.Virol.91:e02180-16,2017)。因此，尽管付出了巨大的努力，但仍然需要诱导针对RSV的保护性免疫应答的有效免疫原。
本公开文本提供如下重组RSV，其为减毒的、感染性的且自复制的，并且满足上述需要。
I.术语概述
除非另有说明，技术术语根据常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可以参见Benjamin Lewin,Genes X,Jones&Bartlett Publishers出版,2009；以及Meyers等人(编辑),The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine,Wiley-VCH以16卷出版,2008；以及其他类似的参考文献。
如本文所用，术语“包含”意指“包括”。尽管可以使用与本文描述的那些相似或等同的许多方法和材料，但是本文描述了特别合适的方法和材料。在存在冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅为说明性，并不意图具有限制性。为了便于查阅各个实施方案，提供了以下术语解释：
约：从参考量加或减5％。例如，“约5”是指4.75至5.25。“约5:1”的比率是指4.75:1至5.25:1的比率。
佐剂：用于增强抗原性的媒介物。佐剂包括矿物质(铝、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液，其上吸附有抗原；或油包水乳液，例如，其中将抗原溶液在矿物油中乳化(弗氏不完全佐剂)，有时包含杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原的降解和/或导致巨噬细胞流入)。免疫刺激性寡核苷酸(如包括CpG基序的那些)也可以用作佐剂。佐剂包括生物分子(“生物佐剂”)，如共刺激分子。示例性佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL、免疫刺激复合物(ISCOM)基质和Toll样受体(TLR)激动剂，如TLR-9激动剂、多聚I:C或多聚ICLC。佐剂描述于例如Singh(编辑)Vaccine Adjuvants and Delivery Systems.Wiley-Interscience,2007中。
施用：通过所选途径将组合物引入受试者体内。施用可以是局部的或全身的。例如，如果所选途径是鼻内，通过将组合物(如包括所公开的减毒RSV的组合物)引入受试者的鼻道中来施用所述组合物。示例性施用途径包括但不限于口服、注射(例如皮下、肌内、真皮内、腹膜内和静脉内)、舌下、直肠、透皮(例如，局部)、鼻内、阴道和吸入途径。
氨基酸取代：用不同的氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。
减毒的：“减毒的”或具有“减毒表型”的病毒是指与在类似感染条件下的参考病毒相比，具有降低的毒力的病毒。减毒通常与如与在类似感染条件下参考野生型病毒的复制相比减少的病毒复制相关，因此，“减毒”和“受限的复制”通常作为同义词来使用。在一些宿主(通常非天然宿主，包括实验动物)中，在用所讨论的参考病毒感染期间疾病不明显，并且可以使用病毒复制的限制作为减毒的替代标记。在一些实施方案中，分别与相同感染条件下相同物种哺乳动物的上呼吸道或下呼吸道中非减毒的野生型病毒滴度相比，所公开的减毒RSV展现在哺乳动物的上呼吸道或下呼吸道中的病毒滴度的至少约10倍或更大降低，如至少约100倍或更大降低。哺乳动物的例子包括但不限于人、小鼠、兔子、大鼠、仓鼠(如例如黄金仓鼠(Mesocricetus auratus))以及非人灵长类动物(如例如非洲绿猴(Ceropithiecus aethiops)。减毒RSV可以展示不同表型，包括但不限于改变的生长、温度敏感性生长、宿主范围受限生长或噬斑大小改变。
对照：参考标准品。在一些实施方案中，对照是从健康患者获得的阴性对照样品。在其他实施方案中，对照是从被诊断患有RSV感染的患者获得的阳性对照样品。在仍其他实施方案中，对照是历史对照或标准参考值或值的范围(如先前测试的对照样品，如具有已知预后或结局的RSV患者组，或者代表基线或正常值的样品组)。
测试样品与对照之间的差异可以是增加或相反地是降低。所述差异可以是定性差异或定量差异，例如统计学上显著的差异。在一些例子中，差异是相对于对照的增加或降低，所述差异为至少约5％，如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约500％或大于500％。
有效量：药剂足以引发受试者的所需反应(如免疫应答)的量。应理解，为了获得针对目的病毒的保护性免疫应答，可能需要多次施用所公开的免疫原，和/或在初免加强方案中施用所公开的免疫原作为“初免”，其中加强免疫原可以与初免免疫原不同。因此，所公开的免疫原的有效量可以是所述免疫原足以引发受试者的初免免疫应答的量，随后可以用相同或不同免疫原对所述受试者进行加强以引发保护性免疫应答。
在一个例子中，所需反应是抑制或减少或预防RSV感染。所述方法不需要完全消除或减少或预防RSV感染才是有效的。例如，如与合适的对照相比，有效量的药剂的施用可以将RSV感染(例如，如通过细胞的感染或者通过RSV感染的受试者的数量或百分比所测量)减少所需的量，例如减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或者甚至至少100％(可检测RSV感染的消除或预防)。
基因：包含RNA(mRNA或其他RNA)转录所需的控制和编码序列的核酸序列。例如，基因可以包含启动子、一个或多个增强子或沉默子、编码RNA和/或多肽的核酸序列、下游调节序列以及可能地参与调节mRNA表达的其他核酸序列。
如本文所述的重组RSV的“基因”是指编码mRNA的重组RSV的一部分，并且通常在上游(3')末端以基因起始(GS)信号开始并且在下游(5')末端以基因终止(GE)信号结束。在这种情况下，术语基因还包括被称为“翻译开放阅读框”或ORF者，特别是在从另外的ORF而不是从唯一mRNA表达蛋白质的情形中。为了构建所公开的重组RSV，可以使一个或多个基因或基因组区段被完全或部分缺失、插入或取代。
异源的：源自不同的遗传来源。重组基因组中包括的异源基因是并非源自该基因组的基因。
宿主细胞：其中可以繁殖载体并表达其核酸的细胞。所述细胞可以是原核的或真核的。所述术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应理解，所有后代可能并非与亲代细胞相同，因为可能存在在复制期间发生的突变。然而，在使用术语“宿主细胞”时包括这样的后代。
感染性和自复制病毒：能够进入培养的细胞或者动物或人类宿主的细胞中并在其中复制以产生能够具有相同活性的后代病毒的病毒。
免疫应答：免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的应答。在一个实施方案中，所述应答对特定抗原具有特异性(“抗原特异性应答”)。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，如CD4+应答或CD8+应答。在另一个实施方案中，所述应答是B细胞应答，并且导致特异性抗体的产生。
免疫原性组合物：能够刺激免疫应答的免疫原性材料的制剂，其在一些例子中可以被施用用于感染性疾病或其他类型疾病的预防、改善或治疗。所述免疫原性材料可以包括减毒或杀死的微生物(如细菌或病毒)，或者源自它们的抗原性蛋白、肽或DNA。免疫原性组合物包含抗原(如病毒)，所述抗原诱导可测量的针对所述抗原的T细胞应答，或者诱导可测量的针对所述抗原的B细胞应答(如抗体产生)。在一个例子中，免疫原性组合物包含所公开的重组RSV，所述重组RSV在被施用至受试者时诱导针对RSV的可测量的CTL应答和/或可测量的B细胞应答(如抗体产生)。对于体内使用，免疫原性组合物通常将包括药学上可接受的载体中的重组病毒，并且还可以包括其他药剂，如佐剂。
分离的：“分离的”生物组分与其他生物组分(如所述组分天然存在于其中的其他生物组分，如其他染色体和染色体外DNA、RNA和蛋白质)基本上分离或纯化分开。已经“分离”的蛋白质、肽、核酸和病毒包括通过标准纯化方法纯化的那些。分离不需要绝对纯度，并且可以包括至少50％纯(如至少75％、80％、90％、95％、98％、99％或甚至99.9％纯)的蛋白质、肽、核酸或病毒分子。
核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA以及以上的合成形式和混合聚合物的有义链和反义链二者。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或者任一类型核苷酸的修饰形式。如本文所用术语“核酸分子”与“多核苷酸”是同义的。核酸分子的长度通常为至少10个碱基，除非另有规定。所述术语包括DNA的单-链和双-链形式。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非-天然存在的核苷酸连接而连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸中的一者或两者。
可操作地连接：在第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系中时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子与所述编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的核酸序列是连续的，并且在需要接合两个蛋白质编码区的情况下，位于同一阅读框中。
药学上可接受的载体：使用的药学上可接受的载体是常规的。Remington’sPharmaceutical Sciences,E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第19版,1995描述了适合于所公开免疫原的药学递送的组合物和配制品。
通常，所述载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外配制品通常包含注射液，所述注射液包括药学上和生理学上可接受的流体作为媒介物，如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。除了生物中性载体外，要施用的药物组合物可以含有少量无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。在特定实施方案中，适合于施用至受试者的载体可以是无菌的，和/或悬浮于或以其他方式含于单位剂型中，所述单位剂型含有一个或多个测量剂量的适于诱导所需免疫应答的组合物。它还可以伴随用于其用于治疗目的的用途的药物。所述单位剂型可以位于例如含有无菌内容物的密封小瓶或用于注射至受试者体内的注射器中，或者可以被冻干用于随后溶解和施用，或者呈固体或控释剂型。
多肽：任何氨基酸链，无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)如何。“多肽”应用于氨基酸聚合物，包括天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸(例如天然存在的氨基酸的相应人工化学模拟物)的氨基酸聚合物。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物掺入多肽中的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基末端(N末端)和羧基末端(C末端)。“多肽”可与肽或蛋白质互换使用，并且在本文中用于指代氨基酸残基的聚合物。
初免-加强免疫：包括向受试者施用第一免疫原性组合物(初免免疫)以及之后施用第二免疫原性组合物(加强免疫)以诱导所需免疫应答的免疫方案。初免与加强的施用之间合适的时间间隔以及这样的时间范围的例子公开于本文中。在一些实施方案中，初免、加强或者初免和加强二者另外包括佐剂。
重组的：重组核酸分子或蛋白质或病毒是通过重组DNA方法产生的，通常从一个或多个克隆的cDNA产生。一个或多个cDNA序列可以与一种或多种生物来源分子的序列相同，或者可以含有并非天然存在的一个或多个序列：例如，包括一个或多个核酸取代、缺失或插入，和/或具有通过将两个原本分开的序列区段人工组合而制备的序列。这种人工组合可以例如通过化学合成、天然存在的核酸分子或蛋白质的靶向突变或者分离的核酸区段的人工操作来实现，例如，通过基因工程化技术来实现。
呼吸道合胞病毒(RSV)：肺泡病毒科正肺病毒属(Orthopneumovirus)的囊膜非区段化负义单链RNA病毒。RSV基因组的长度为约15,000个核苷酸(对于KT 992094为15,223个碱基)，并且包括10个基因，编码11种蛋白质，包括糖蛋白SH、G和F。F蛋白介导融合，允许所述病毒进入细胞胞质中并且还促进合胞体的形成。已经描述人RSV毒株的两个抗原亚组，即A亚组和B亚组，主要基于G糖蛋白的抗原性差异。其他物种的RSV毒株也是已知的，包括牛RSV。人RSV和密切相关的动物对应RSV感染的几种动物模型是可获得的，包括被人RSV感染的模型生物体，以及被物种特异性RSV感染的模型生物体，如在牛中使用bRSV感染(参见例如，Bern等人,Am J,Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.,301:L148-L156,2011；以及Nam和Kun(编辑).Respiratory Syncytial Virus:Prevention,Diagnosis and Treatment.NovaBiomedical Nova Science Publisher,2011；以及Cane(编辑)Respiratory SyncytialVirus.Elsevier Science,2007)。
除非上下文另有指示，RSV核酸残基的定位是根据本文作为SEQ ID NO:1提供的参考RSV反基因组序列，所述序列为RSV毒株A2反基因组序列，还作为Genbank登录号KT992094.1(通过引用并入本文)来提供，并且描述于Collins等人,Proc Natl Acad SciUSA,92:11563-11567 1995中。该序列也被称为“D46”反基因组RSV序列。
序列同一性：在两个或更多个比较的核苷酸或氨基酸序列之间相同的核苷酸或氨基酸序列分配的百分比，允许空位以使同一性百分比最大化。所述百分比越高，两个序列越相似。在使用标准方法比对时，多肽的同源物、直系同源物或变体将具有相对高的序列同一性程度。
用于比较的序列比对方法是本领域中熟知的。各种程序和比对算法描述于以下文献中：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins和Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等人,Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988；Huang等人Computer Appls.In theBiosciences 8,155-65,1992；以及Pearson等人,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994。Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990呈现序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
多肽变体的特征通常在于具有在与目的氨基酸序列的全长比对中计数的至少约75％(例如，至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在通过该方法评估时，具有与参考序列的甚至更大相似性的蛋白质将显示增加的同一性百分比，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性。在比较小于整个序列的序列同一性时，同源物和变体通常将在10-20个氨基酸的短窗口中具有至少80％序列同一性，并且可以具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性，根据它们与参考序列的相似性而定。用于在这样的短窗口中确定序列同一性的方法可以在互联网上的NCBI网站获得。
如本文所用，在提及“至少90％同一性”(或类似用语)时是指与指定参考序列的“至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性”。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的类别。在例子中，受试者是人。在特定例子中，受试者是新生婴儿。在另外的例子中，选择需要抑制RSV感染的受试者。例如，受试者未被感染并且具有RSV感染的风险，或者被感染需要治疗。
在足以……的条件下：用于描述允许所需活性的任何环境的短语。
II.重组RSV
本文公开可用于产生人RSV的重组毒株的突变，所述重组毒株展现一系列减毒表型并且适合用作人用减毒活疫苗。如本文所报告，对wt RSV的特定突变组合导致引发更优免疫应答的活减毒病毒。
本文还公开与所公开的病毒的表达相关的方法和组合物。例如，公开分离的多核苷酸分子，其包括编码所述病毒的基因组或反基因组的核酸序列。
本文提供的重组RSV包含基因组或反基因组，所述基因组或反基因组相对于野生型RSV含有如本文所详述的使所述重组RSV减毒的修饰或突变。所述野生型RSV基因组或反基因组编码以下11种蛋白质：RNA结合核蛋白(N)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)、附着表面糖蛋白(G)、融合表面糖蛋白(F)、小疏水表面糖蛋白(SH)、内部基质蛋白(M)、两种非结构蛋白NS1和NS2以及M2-1和M2-2蛋白。RSV的基因组是约15.2kb的单链负义RNA，其包含编码10个mRNA的10个基因。每个mRNA编码单一蛋白质，但M2 mRNA例外，其编码两种单独蛋白质M2-1和M2-2。RSV基因顺序为：3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L，其中单一病毒启动子位于3'端。因此，在天然RSV基因组中，NS1位于位置1，NS2位于位置2，N位于位置3，P位于位置4，M位于位置5，SH位于位置6，G位于位置7，F位于位置8，M2位于位置9并且L位于位置10。该组织示意性地显示于图1C中。
在几个实施方案中，本文提供的重组RSV包含具有分别位于基因位置1-9的RSV F、G、NS2、N、P、M、SH、M2和L基因的基因组，其中位于基因位置1和2的F和G基因分别是从天然基因位置8和7转移的。所述重组RSV的基因组还包含缺失编码NS1蛋白的序列的修饰。在一些实施方案中，所述缺失包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置99-626的缺失(wt重组RSV毒株A2，Genbank KT 992094)。在几个实施方案中，本文提供的重组RSV的基因组还包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的对应于位置4499-4610(包含端值)的112个核苷酸的缺失，以及SEQ ID NO:1的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A。该缺失和所述五个核苷酸取代统称为“LID”突变或修饰。如下文例子中所讨论，对天然RSV基因组的这些修饰的新型组合导致引发更优免疫应答的重组RSV。
如本文所用，并且除非上下文另有指示，病毒名称是描述性的而非限制性的。不需要在名称中全部列出每种病毒中修饰或突变的全集。另外，除非上下文另有指示，修饰/突变和斜杠在病毒名称中出现的顺序可变：例如，“LID/F1G2/ΔNS1”与“LID/ΔNS1/F1G1”相同。
在几个实施方案中，本文提供的重组RSV包含如下基因组，所述基因组包含编码NS1蛋白的序列的缺失，其中所述缺失是对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置99-627的缺失，并且其中所述重组RSV是感染性的、减毒的和自复制的。在几个这样的实施方案中，本文提供的重组RSV的基因组还包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的对应于位置4499-4610(包含端值)的112个核苷酸的缺失，以及SEQ ID NO:1的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A。如下文例子中所讨论，对天然RSV基因组的这些修饰的新型组合导致引发更优免疫应答的重组RSV。
在一些实施方案中，所述重组RSV还包含L蛋白，所述L蛋白包含由TCA密码子编码的S1313残基和由AAA密码子编码的Y1314K取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ IDNO:13所示的参考L蛋白序列(所述L蛋白的氨基酸序列)。这对突变被称为“1030s”，并且通过反求遗传学开发和优化为非常难以去减毒(Luongo等人2012.J Virol86:10792-10804)。
在一些实施方案中，所述重组RSV还包含L蛋白，所述L蛋白包含S1313的缺失和I1314L取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO:13所示的参考L蛋白序列。这对突变被称为“Δ1313/I1314L”，并且通过反求遗传学开发和优化为非常难以去减毒(Luongo等人2013.J Virol 87:1985-1996)。
在一些实施方案中，所述重组RSV的F蛋白由野生型序列编码，如SEQ ID NO:14。在其他实施方案中，所述重组RSV可以包含F蛋白序列中的一个或多个变化。例如，在一些实施方案中，可以用涉及用于增加在所选宿主(特别是人)中的表达的密码子优化的序列替代编码RSV的蛋白质的天然或天然存在的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，所述重组RSV的F蛋白由密码子优化的序列FBB(“FBB”)(SEQ ID NO:15)编码。可以获得不同形式的密码子优化。
在几个实施方案中，所述重组RSV的基因组不含任何异源基因。
在一些实施方案中，所述重组RSV的基因组包含如上文所讨论的一个或多个突变，以及与反基因组序列互补的核酸序列，所述反基因组序列与SEQ ID NO:1(D46序列)至少90％(如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同。在一些实施方案中，所述重组RSV的基因组是以如上文所讨论的一个或多个突变修饰的D46基因组。在几个实施方案中，所述重组RSV的基因组包含如本文所讨论的一个或多个突变，并且所述重组RSV的基因组与D46 RSV(SEQ ID NO:1)的基因组序列相比的任何其余序列差异在生物学上无足轻重(例如，所述其余序列差异不包括野生型基因组序列中修饰已知的顺式作用信号或改变氨基酸编码，或者显著影响所述病毒的体外复制或噬斑大小的变化)。
本文公开的重组RSV的实施方案可以是亚型A RSV或亚型B RSV。本文公开的重组RSV的实施方案是感染性的、减毒的和自复制的。
在一些实施方案中，所述重组RSV包含RSV基因组，所述RSV基因组包含分别位于基因位置1-9的RSV NS2、N、P、M、SH、G、F M2和L基因，其中所述基因组包含编码NS1蛋白的序列的缺失。在几个这样的实施方案中，所述重组RSV的SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与正义反基因组序列互补的核酸序列，所述正义反基因组序列与SEQ ID NO:2(RSV LID/ΔNS1)至少90％、至少95％、至少98％和/或至少99％相同。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与如SEQ ID NO:2(RSV LID/ΔNS1)所示的正义反基因组序列互补的核酸序列。
在一些实施方案中，所述重组RSV包含RSV基因组，所述RSV基因组包含分别位于基因位置1-9的RSV F、G、NS2、N、P、M、SH、M2和L基因，其中位于基因位置1和2的F和G基因分别是从天然基因位置8和7转移的，并且所述基因组包含编码NS1蛋白的序列的缺失。在几个这样的实施方案中，所述重组RSV的SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与正义反基因组序列互补的核酸序列，所述正义反基因组序列与SEQ ID NO:3(RSV LID/F1G2/ΔNS1)至少90％、至少95％、至少98％和/或至少99％相同。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与如SEQ ID NO:3(RSV LID/F1G2/ΔNS1)所示的正义反基因组序列互补的核酸序列。
在一些实施方案中，所述重组RSV包含RSV基因组，所述RSV基因组包含分别位于基因位置1-9的RSV F、G、NS2、N、P、M、SH、M2和L基因，其中位于基因位置1和2的F和G基因分别是从天然基因位置8和7转移的，并且所述L基因编码L蛋白，所述L蛋白包含由TCA密码子编码的S1313残基和由AAA密码子编码的Y1314K取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ IDNO:13所示的参考L蛋白序列。在几个这样的实施方案中，所述重组RSV的SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与正义反基因组序列互补的核酸序列，所述正义反基因组序列与SEQ ID NO:6(RSV LID/F1G2/ΔNS1/1030s)至少90％、至少95％、至少98％和/或至少99％相同。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与如SEQ ID NO:6(RSVLID/F1G2/ΔNS1/1030s)所示的正义反基因组序列互补的核酸序列。
在一些实施方案中，所述重组RSV包含RSV基因组，所述RSV基因组包含分别位于基因位置1-9的RSV F、G、NS2、N、P、M、SH、M2和L基因，其中位于基因位置1和2的F和G基因分别是从天然基因位置8和7转移的，所述基因组包含编码NS1蛋白的序列的缺失，并且所述L基因编码L蛋白，所述L蛋白包含S1313的缺失和I1314L取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO:13所示的参考L蛋白序列。在几个这样的实施方案中，所述重组RSV的SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与正义反基因组序列互补的核酸序列，所述正义反基因组序列与SEQ ID NO:9(RSV LID/F1G2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)至少90％、至少95％、至少98％和/或至少99％相同。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与如SEQ ID NO:9(RSV LID/F1G2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)所示的正义反基因组序列互补的核酸序列。
在一些实施方案中，所述重组RSV包含RSV基因组，所述RSV基因组包含分别位于基因位置1-9的RSV F、G、NS2、N、P、M、SH、M2和L基因，其中位于基因位置1和2的F和G基因分别是从天然基因位置8和7转移的，所述F蛋白油如SEQ ID NO:15(FBB)所示的序列编码，并且所述基因组包含编码NS1蛋白的序列的缺失。在几个这样的实施方案中，所述重组RSV的SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与正义反基因组序列互补的核酸序列，所述正义反基因组序列与SEQ ID NO:4(RSV LID/F1BBG2/ΔNS1)至少90％、至少95％、至少98％和/或至少99％相同。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与如SEQID NO:4(RSV LID/F1BBG2/ΔNS1)所示的正义反基因组序列互补的核酸序列。
在一些实施方案中，所述重组RSV包含RSV基因组，所述RSV基因组包含分别位于基因位置1-9的RSV F、G、NS2、N、P、M、SH、M2和L基因，其中位于基因位置1和2的F和G基因分别是从天然基因位置8和7转移的，所述F蛋白油如SEQ ID NO:15(FBB)所示的序列编码，所述基因组包含编码NS1蛋白的序列的缺失，并且所述L基因编码L蛋白，所述L蛋白包含由TCA密码子编码的S1313残基和由AAA密码子编码的Y1314K取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO:13所示的参考L蛋白序列。在几个这样的实施方案中，所述重组RSV的SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与正义反基因组序列互补的核酸序列，所述正义反基因组序列与SEQ ID NO:7(RSV LID/F1BBG2/ΔNS1/1030s)至少90％、至少95％、至少98％和/或至少99％相同。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与如SEQID NO:7(RSV LID/F1BBG2/ΔNS1/1030s)所示的正义反基因组序列互补的核酸序列。
在一些实施方案中，所述重组RSV包含RSV基因组，所述RSV基因组包含分别位于基因位置1-9的RSV F、G、NS2、N、P、M、SH、M2和L基因，其中位于基因位置1和2的F和G基因分别是从天然基因位置8和7转移的，并且其中所述基因组包含编码NS1蛋白的序列的缺失，并且其中所述L基因编码L蛋白，所述L蛋白包含S1313的缺失和I1314L取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO:13所示的参考L蛋白序列。在几个这样的实施方案中，所述重组RSV的SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与正义反基因组序列互补的核酸序列，所述正义反基因组序列与SEQ ID NO:10(RSV LID/F1BBG2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)至少90％、至少95％、至少98％和/或至少99％相同。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与如SEQ ID NO:10(RSV LID/F1BBG2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)所示的正义反基因组序列互补的核酸序列。
在一些实施方案中，除了上述修饰外，所述重组RSV还包含基因中、基因间区中以及尾部区中的非翻译序列的缺失。
在本文中病毒是通过列出其中存在的突变组合来命名，并且是描述性的而非限制性的。病毒名称中的符号“/”的使用(如在RSV LID/ΔNS1/1030s中，其表示RSV D46包含突变ΔNS1、LID和1030s)除了存在以使名称更易读以外没有任何意义，特别是当存在于文本中时。因此，RSV LID/ΔNS1/1030s与RSV LID/ΔNS1/1030s和RSV LID/ΔNS1/1030s相同。名称中并不总是使用RSV。反基因组cDNA及其编码的RSV的名称通常是可互换的。
除非上下文另有指示，否则本公开文本中使用的编号是基于本文作为SEQ ID NO:1提供的RSV A2毒株D46的序列，并且所述的病毒基因组序列是呈正义的。关于所述病毒的核苷酸和氨基酸序列位置的序列编号，使用惯例，其中给定病毒序列中的每个核苷酸或氨基酸残基保留其在作为SEQ ID NO:1提供的RSV D46毒株中具有的序列位置编号，不管任何修饰。因此，尽管多个基因组含有引起核苷酸长度和(在一些情形中)氨基酸长度的变化的缺失和/或插入，但是所述基因组和编码的蛋白质中所有其他残基(核苷酸或氨基酸)的编号保持不变。还应认识到，即使不使用此惯例的权宜之计，本领域技术人员可以通过以下的指导容易地鉴定长度可能不同的病毒基因组或蛋白质之间的相应序列位置：序列比对以及开放阅读框的位置、熟知的RNA特征如基因起始和基因终止信号，以及氨基酸序列特征。
实施例利用抗原亚组A的RSV毒株A2，其是使用最广泛的实验毒株并且还是已经在临床研究中评价的多种候选活减毒RSV疫苗的亲本。鉴于存在多种另外的RSV毒株(例如，RSV B1、RSV Long、RSV系19)，本领域技术人员将了解，某些RSV毒株可以具有改变给定残基的位置的核苷酸或氨基酸插入或缺失。例如，如果与毒株A2相比，另一种RSV毒株的蛋白质在所述蛋白质的上游末端中具有两个另外的氨基酸，这会使下游残基的氨基酸编号相对于毒株A2增加等于二的增量。然而，因为这些毒株共享很大的序列同一性程度，本领域技术人员将能够通过简单地比对A2参考毒株的核苷酸或氨基酸序列与所讨论毒株的核苷酸或氨基酸序列来确定相应序列的位置。因此，应理解，即使在本公开文本的上下文中明确列举，但是在已经发生序列位移时或者由于病毒毒株之间的序列变异，本文所述的氨基酸和核苷酸位置可以对应于其他位置。在两种或更多种相关病毒之间的蛋白质、或蛋白质区段、或基因、或基因组、或基因组区段的比较中，“相应”氨基酸或核苷酸残基是被认为在不同物种中在功能方面准确或大致等同的残基。
除了对重组RSV的上述修饰外，可以在RSV克隆中进行不同的或另外的修饰以有利于操作，如将独特的限制位点插入各个基因间区或其他地方中。可以去除非翻译基因序列以增加插入外来序列的容量。
将外来的限定突变引入感染性RSV克隆中可以通过多种熟知的方法来实现。“感染性克隆”意指cDNA或其产物(合成的或其他的)，其可以被转录为能够产生感染性病毒的基因组或反基因组RNA。术语“感染性的”是指病毒或病毒结构能够在培养的细胞或动物或人宿主中复制，以产生能够具有相同活性的后代病毒或病毒结构。因此，可以通过常规技术(例如，定点诱变)将限定突变引入基因组或反基因组的cDNA拷贝中。使用反基因组或基因组cDNA子片段组装完整反基因组或基因组cDNA是本领域技术人员熟知的，并且具有以下优点：每个区域可以单独操作(较小的cDNA比大的cDNA更易于操作)，然后容易地组装为完整cDNA。因此，完整反基因组或基因组cDNA或其任何子片段可以用作寡核苷酸定向诱变的模板。然后可以将突变的子片段组装为完整反基因组或基因组cDNA。突变可以从单一核苷酸改变到替代含有一个或多个基因或基因组区域的大cDNA片段变化。
在一些实施方案中，所公开的重组RSV可以使用称为反求遗传学的基于重组DNA的技术来产生(Collins等人1995.Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-11567)。该系统允许在限定条件下完全从合格的细胞底物中的cDNA从头恢复感染性病毒。反求遗传学提供将预定突变经由cDNA中间体引入RSV基因组中的手段。在临床前研究中表征特定减毒突变，并将其组合以实现所需的减毒水平。从cDNA衍生疫苗病毒可最大程度地减少外来因子(adventitious agent)污染的风险，并且有助于使传代史保持简短并有据可查。一旦恢复后，工程化的病毒毒株就以与生物学衍生病毒相同的方式繁殖。由于传代和扩增，疫苗病毒不含来自原始恢复的重组DNA。
重组RSV可以通过编码RSV基因组RNA的cDNA与生成转录性复制性核壳体所需的那些病毒蛋白一起在细胞内共表达而产生。编码其他RSV蛋白的质粒也可以与这些必需的蛋白质一起被包括。可替代地，RNA可以在体外转录反应中合成并被转染至培养的细胞中。
为了繁殖用于疫苗应用和其他目的的RSV病毒，可以使用允许RSV生长的多种细胞系。RSV在多种人和动物细胞中生长。用于繁殖用于疫苗应用的减毒RS病毒的优选细胞系包括DBSFRhL-2、MRC-5和Vero细胞。最高病毒产量通常用上皮细胞系如Vero细胞来实现。通常将细胞用病毒以范围为约0.001至1.0或更高的感染复数接种，并且在允许所述病毒复制的条件下培育，例如，在约30℃-37℃下培育约3-10天，或者使病毒达到足够滴度所需的时间。温度敏感的病毒通常使用32℃作为“允许温度”来生长。将病毒从细胞培养物取出并且与细胞组分分离，通常通过熟知的澄清程序(例如，离心)来进行，并且可以视需要使用本领域技术人员熟知的程序进一步纯化。
已经如本文所述减毒的RSV可以在多种熟知的且普遍接受的体外和体内模型中进行测试，以确认足够的减毒、对表型逆转的抗性以及用于疫苗应用的免疫原性。在体外测定中，针对病毒复制或“ts表型”的温度敏感性以及针对小噬斑表型来测试修饰的病毒(其可以是多重减毒的、生物来源的或重组的RSV)。还可以在体外人气道上皮(HAE)模型中评价修饰的病毒，所述模型似乎提供了一种按病毒在非人灵长类动物和人中的相对减毒的顺序对病毒进行排序的手段(Zhang等人2002J Virol 76:5654-5666；Schaap-Nutt等人2010Vaccine 28:2788-2798；Ilyushina等人2012J Virol 86:11725-11734)。在RSV感染的动物模型中进一步测试修饰的病毒。已经描述多种动物模型(例如，鼠、棉鼠和灵长类动物)并且它们是本领域技术人员已知的。
可以在细胞培养、啮齿动物和非人灵长类动物中评价重组病毒的感染性、复制动力学、产量、蛋白质表达效率和遗传稳定性。尽管这些半允许系统可能无法可靠地检测复制中的每个差异，但是特定地可以检测显著差异。也可以在成人、血清阳性儿童和血清阴性儿童中依次评价重组毒株。在一些情形中，在已经显示前一类似毒株在血清阴性儿童中耐受良好的情况下，可以在血清阴性儿童中直接评价新毒株。例如，可以在10名疫苗接受者和5名安慰剂接受者的组中进行评价，这是允许同时评价多个候选者的较小数量。可以在紧接在免疫后的时间段中评价候选者的疫苗病毒感染性、复制动力学、脱落、耐受性、免疫原性和遗传稳定性，并且可以在之后的RSV季节期间针对安全性、RSV疾病和RSV特异性血清抗体的变化使疫苗经历监督，如Karron等人2015,Science Transl Med2015 7(312):312ra175中所述，所述文献以其整体并入本文。因此，对所选代表性病毒的分析可以提供相对快速的分拣(triage)以缩小候选者的范围，以鉴定最佳候选者。
本文还提供分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码所述突变的病毒，构成所述基因组或反基因组，表达所述基因组或反基因组，或者编码可用于在体外制备重组RSV的各种蛋白质。还提供多种示例性多核苷酸的核酸序列。本文提供的实施方案内包括如下多核苷酸，所述多核苷酸包含由任何前述核酸序列组成或基本上由其组成的序列。还包括具有与任何前述序列或本文提供的SEQ ID NO的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％(或其之间的任何数字)或更高同一性的多核苷酸，以及与前述分子的补体杂交或者作为前述分子的补体的多核苷酸。
这些多核苷酸可以包括于载体内或由载体表达以产生重组RSV。因此，还包括用所述分离的多核苷酸或载体转染的细胞。
在另外的实施方案中，提供用于产生重组RSV的组合物(例如，掺入RSV编码cDNA的分离的多核苷酸和载体)和方法。还提供新型分离的多核苷酸分子和掺入这样的分子的载体，所述分子包含如本文所述进行修饰的RSV基因组或反基因组。还提供相同或不同的表达载体，其包含编码RSV蛋白的一种或多种分离的多核苷酸分子。这些蛋白质也可以从基因组或反基因组cDNA直接表达。一种或多种载体优选地在细胞或无细胞裂解物中表达或共表达，从而产生感染性突变体RSV颗粒或亚病毒颗粒。
还提供一种用于产生一种或多种纯化的RSV蛋白的方法，所述方法涉及在允许被感染细胞中的RSV繁殖的条件下用重组RSV毒株感染允许RSV感染的宿主细胞。在培养中的复制时间段后，裂解所述细胞并从其分离重组RSV。在分离病毒后纯化一种或多种所需RSV蛋白，产生一种或多种RSV蛋白用于疫苗、诊断和其他应用。
上文方法和组合物产生感染性病毒或亚病毒颗粒或其衍生物。感染性病毒与真实RSV病毒颗粒是可比较的，并且作为原样是感染性的。其可以直接感染新鲜细胞。感染性亚病毒颗粒通常是病毒颗粒的子组分，其可以在适当条件下引发感染。例如，含有基因组或反基因组RNA以及N、P、L和M2-1蛋白的核壳体是亚病毒颗粒的例子，其如果被引入细胞的胞质中可以引发感染。亚病毒颗粒包括如下病毒颗粒，所述病毒颗粒缺少并非感染性所必需的一种或多种蛋白质、一个或多个蛋白质区段或者其他一种或多种病毒组分。
在其他实施方案中，本发明提供一种细胞或无细胞裂解物，所述细胞或无细胞裂解物含有包含如上所述编码突变体RSV基因组或反基因组的分离的多核苷酸分子的表达载体，以及包含编码RSV的N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的一种或多种分离的多核苷酸分子的表达载体(相同或不同载体)。这些蛋白质中的一种或多种也可以从基因组或反基因组cDNA表达。在表达后，所述基因组或反基因组以及N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白组合以产生感染性RSV病毒或亚病毒颗粒。
III.免疫原性组合物
还提供包含所公开的重组RSV和药学上可接受的载体的免疫原性组合物。可以通过多种方式(例如，通过鼻内途径)将这样的组合物施用至受试者。用于制备可施用的免疫原性组合物的标准方法例如描述于诸如以下的出版物中：Remingtons PharmaceuticalSciences,第19版,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,1995。
潜在的载体包括但不限于生理平衡的培养基、磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(例如，油/水或水/油乳剂)、各种类型的润湿剂、防冻添加剂或稳定剂，如蛋白质、肽或水解产物(例如，白蛋白、明胶)、糖(例如，蔗糖、乳糖、山梨糖醇)、氨基酸(例如，谷氨酸钠)或其他保护剂。可以将所得水溶液包装以供原样使用或将其冻干。将冻干的制剂在施用前与无菌溶液组合以用于单次或多次给药。
所述免疫原性组合物可以含有抑菌剂以防止或最大限度减少在储存期间的降解，所述抑菌剂包括但不限于有效浓度(通常≦1％w/v)的苯甲醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。一些患者可能禁忌使用抑菌剂；因此，可以在含有或不含此组分的溶液中重构冻干配制品。
所述免疫原性组合物可以含有如接近生理条件所需的物质作为药学上可接受的媒介物，所述物质如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯和油酸三乙醇胺。
所述免疫原性组合物可以任选地包括佐剂以增强宿主的免疫应答。合适的佐剂是例如Toll样受体激动剂、明矾、AlPO4、铝胶、脂质A及其衍生物或变体、油乳剂、皂苷、中性脂质体、含有重组病毒的脂质体，以及细胞因子、非离子型嵌段聚合物和趋化因子。含有聚氧乙烯(POE)和聚氧丙烯(POP)的非离子型嵌段聚合物(如POE-POP-POE嵌段共聚物)、MPLTM(3-O-脱酰基单磷酰脂质A；Corixa，印第安纳州哈密尔顿)和IL-12(Genetics Institute，马萨诸塞州坎布里奇)，以及本领域熟知的许多其他合适的佐剂，可以用作佐剂(Newman等人,1998,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems15:89-142)。这些佐剂的优点在于，它们有助于以非特异性方式刺激免疫系统，从而增强针对药物产品的免疫应答。
在一些情况下，可以合意地组合包括所述重组RSV的免疫原性组合物与其他药物产品(例如，疫苗)，所述其他药物产品诱导针对其他病毒因子(特别是引起其他儿童疾病的那些)的保护性反应。例如，包括如本文所述的重组RSV的组合物还可以包括由免疫实践咨询委员会(ACIP；cdc.gov/vaccines/acip/index.html)推荐用于目标年龄组(例如，大约一至六个月龄的婴儿)的其他疫苗。这些另外的疫苗包括但不限于IN施用的疫苗。因此，如本文所述的重组RSV可以与针对例如乙型肝炎(HepB)、白喉、破伤风和百日咳(DTaP)、肺炎双球菌(PCV)、乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)、脊髓灰质炎、流感和轮状病毒的疫苗同时施用。
在一些实施方案中，所述免疫原性组合物可以以单位剂型提供，用于诱导受试者的免疫应答，例如，以预防受试者的RSV感染。单位剂型含有适合于施用至受试者的单一预选剂量，或者两个或更多个预选单位剂量的合适的标记或测量倍数，和/或用于施用单位剂量或其倍数的计量机制。
IV.引发免疫应答的方法
本文提供通过将含有所公开的重组RSV的免疫原性组合物施用至受试者来引发所述受试者的免疫应答的方法。在免疫后，所述受试者通过产生对RSV具有特异性的抗体来反应。另外，诱导先天的和细胞介导的免疫应答，这可以提供抗病毒效应子以及调节所述免疫应答。作为免疫的结果，宿主变得对RSV感染至少部分或完全免疫，或者对患上中度或重度RSV疾病(特别是下呼吸道的所述疾病)具有抗性。
在另外的实施方案中，一种通过向受试者施用含有重组RSV的免疫原性组合物来引发所述受试者的免疫应答的方法，所述重组RSV包含含有编码NS1蛋白的序列的缺失(如对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置99-627的缺失)的基因组，并且其中所述重组RSV是感染性的、减毒的和自复制的。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含SH基因，所述SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。在一些这样的实施方案中，所述重组RSV的基因组包含与如SEQ ID NO:2(LID/ΔNS1)所示的反基因组序列互补或与其至少99％相同的核酸序列。在免疫后，所述受试者通过产生对RSV具有特异性的抗体来反应。另外，诱导先天的和细胞介导的免疫应答，这可以提供抗病毒效应子以及调节所述免疫应答。作为免疫的结果，宿主变得对RSV感染至少部分或完全免疫，或者对患上中度或重度RSV疾病(特别是下呼吸道的所述疾病)具有抗性。
因为几乎所有人到5岁时都被RSV感染，所以包括整个出生同龄组作为用于免疫的相关群体。这可以例如通过在以下的任何时间开始免疫方案来进行：从出生至6个月龄，从6个月龄至5岁，在孕妇(或育龄妇女)中通过抗体的被动转移保护她们的婴儿、在新生婴儿或仍在子宫内的那些胎儿的家庭成员中，以及在年龄大于50岁的受试者中。本公开文本的范围意欲包括母体免疫。在几个实施方案中，所述受试者是对于RSV特异性抗体呈血清阴性的人类受试者。在另外的实施方案中，所述受试者不超过一岁，如不超过6个月龄、不超过3个月龄或不超过1个月龄。
有严重症状(例如需要住院)的RSV感染风险最高的受试者包括患有早产、支气管肺发育不良和先天性心脏病的儿童，这些受试者最容易患上严重疾病。在儿童期和成年期，疾病较轻，但可能伴随下呼吸道疾病，并且通常并发鼻窦炎。福利机构收容的老年人(例如，65岁以上的人)的疾病严重程度会增加。在患有严重的合并免疫缺陷疾病或在骨髓或肺移植后的人中也会发生严重疾病。在一些实施方案中，可以选择这些受试者以供施用所公开的重组RSV。
将含有重组RSV的免疫原性组合物以“有效量”施用至易患RSV感染或以其他方式具有RSV感染风险的受试者，所述有效量足以诱导或增强个体针对RSV的免疫应答能力。所述免疫原性组合物可以通过任何合适的方法来施用，包括但不限于通过注射、气雾剂递送、鼻喷雾剂、鼻滴剂、口服接种或局部应用。在一些实施方案中，疫苗可以鼻内或皮下或肌内施用。在一些实施方案中，可以将其施用至上呼吸道。这可以通过任何合适的方法来进行，所述方法包括但不限于通过喷雾剂、滴剂或气雾剂递送。通常，所述组合物将被施用至对针对RSV的抗体呈血清阴性或者具有经胎盘获得的针对RSV的母体抗体的个体。
在用有效量的所公开的重组RSV免疫后，所述受试者通过产生对RSV病毒蛋白(例如，F和G糖蛋白)具有特异性的抗体来反应。另外，诱导先天的和细胞介导的免疫应答，这可以提供抗病毒效应子以及调节所述免疫应答。作为免疫的结果，宿主变得对RSV感染至少部分或完全免疫，或者对患上中度或重度RSV疾病(特别是下呼吸道的所述疾病)具有抗性。
在优选实施方案中，根据已确立的人鼻内施用方案来施用减毒病毒(例如，如Karron等人JID 191:1093-104,2005中所讨论)。简言之，通过滴剂向成人或儿童鼻内接种有效量的重组RSV，所述重组RSV通常在体积为0.5ml的生理上可接受的稀释剂或载体中。与使用非复制病毒的肠胃外免疫相比，这具有简单且安全的优点。其还提供对局部呼吸道免疫的直接刺激，这在对RSV的抗性中起主要作用。此外，这种疫苗接种方式有效地绕过母体来源的RSV特异性血清抗体的免疫阻抑作用(通常在极幼小者中发现)。同样，尽管RSV抗原的肠胃外施用有时可能伴随免疫病理性并发症，但是这在使用活病毒时从未观察到过。
施用的免疫原的精确量以及施用的时机和重复次数将取决于多种因素，包括患者的健康状况和体重、施用方式、配制品的性质等。剂量范围通常将为每名患者约3.0log10至约6.0log10噬斑形成单位(“PFU”)或更多的病毒，更常见为每名患者约4.0log10至5.0log10PFU病毒。在一个实施方案中，可以在婴儿期(如1个月龄与6个月龄之间)期间施用每名患者约5.0log10至6.0log10 PFU，并且可以在2-6个月或更长时间后施用一次或多次另外的加强剂量。在另一个实施方案中，在大约2、4和6个月龄(这是多种其他儿童疫苗的推荐施用时间)，可以给予小婴儿每名患者约5.0log10至6.0log10 PFU的剂量。在又另一个实施方案中，可以在大约10-15个月龄施用另外的加强剂量。
将本文所述的重组RSV及其免疫原性组合物的实施方案以有效诱导或增强受试者针对所述重组RSV的RSV抗原的免疫应答的量施用至所述受试者。有效量将允许所述病毒一定程度的生长和增殖，以产生所需的免疫应答，但不会产生病毒相关的症状或疾病。基于本文提供的指导和本领域的知识，可以确定用于免疫的重组RSV的适当量。
可以通过多种方法表征所产生的免疫应答。这些方法包括采集鼻洗液或血清样品用于分析RSV特异性抗体，所述抗体可以通过测试进行检测，所述测试包括但不限于补体固定、噬斑中和、酶联免疫吸附测定、萤光素酶免疫沉淀测定和流式细胞术。此外，可以通过以下方法检测免疫应答：测定鼻洗液或血清中的细胞因子、任一来源的免疫细胞的ELISPOT、鼻洗液或血清样品的定量RT-PCR或微阵列分析、以及通过在体外再暴露于病毒抗原对来自鼻洗液或血清的免疫细胞的再刺激、以及通过流式细胞术分析细胞因子、表面标记或其他免疫相关量度的产生或展示、或者分析针对展示RSV抗原的指示靶标细胞的细胞毒性活性。在这方面，还监测个体的上呼吸道疾病的体征和症状。
所需免疫应答是抑制随后的RSV感染。所述方法不需要完全抑制RSV感染才是有效的。例如，如与合适的对照相比，有效量的所公开的重组RSV的施用可以将随后的RSV感染(例如，如通过细胞感染或通过被RSV感染的受试者的数量或百分比所测量)减少所需的量，例如减少至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或者甚至至少100％(预防可检测的RSV感染)。
有效剂量的确定通常基于通过人类临床试验跟踪的动物模型研究，并且按照如下施用方案来指导，所述施用方案显著减少受试者中所靶向疾病症状或病症的发生率或严重程度，或者在受试者中诱导所需反应(如中和免疫应答)。在这方面，合适的模型包括例如鼠科动物、大鼠、仓鼠、棉鼠、牛、绵羊、猪、猫、雪貂、非人灵长类动物以及本领域已知的其他接受的动物模型受试者。可替代地，可以使用体外模型(例如，免疫学和组织病理学测定)确定有效剂量。使用这样的模型，仅需常规计算和调整即可确定用于施用有效量(例如，有效引发所需免疫应答或缓解所靶向疾病的一种或多种症状的量)的组合物的适当浓度和剂量。
将重组RSV施用至受试者可以引发免疫应答的产生，所述免疫应答在受试者随后被野生型RSV感染或再感染时针对严重下呼吸道疾病(如肺炎和细支气管炎或哮吼)提供保护。尽管自然循环的病毒仍然能够引起感染，特别是在上呼吸道中，但由于免疫和可能的抗性加强，由于随后被野生型病毒感染而患上鼻炎的可能性降低。在免疫后，存在可检测水平的宿主产生的血清和分泌抗体，所述抗体能够在体外和体内中和同源(同一亚组的)野生型病毒。在许多情况下，宿主抗体还会中和不同的非疫苗亚组的野生型病毒。
包括所公开的重组RSV病毒中的一种或多种的免疫原性组合物可以用于协调(或初免-加强)免疫方案或组合配制品中。考虑可能进行几次加强，并且每次加强可以是不同的所公开的免疫原。在一些例子中还考虑，加强可以是与另一加强或初免相同的免疫原。在某些实施方案中，新型组合免疫原性组合物和协调免疫方案采用单独的免疫原或配制品，每种免疫原或配制品旨在引发抗肿瘤免疫应答，如针对RSV蛋白的免疫应答。可以将引发抗肿瘤免疫应答的单独免疫原性组合物组合于在单一免疫步骤中施用至受试者的多价免疫原性组合物中，或者它们可以按协调(或初免-加强)免疫方案分开施用(呈单价免疫原性组合物)。
在一些实施方案中，所公开的重组RSV(如以下中的任一种：RSV LID/ΔNS1(SEQID NO:2)、RSV LID/F1G2/ΔNS1(SEQ ID NO:3)、RSV LID/F1BBG2/ΔNS1(SEQ ID NO:4)、RSV LID/F1G2/ΔNS1/1030s(SEQ ID NO:6)、RSV LID/F1BBG2/ΔNS1/1030s(SEQ ID NO:7)、RSV LID/F1G2/ΔNS1/Δ1313/I1314L(SEQ ID NO:9)或RSV LID/F1BBG2/ΔNS1/Δ1313/I1314L(SEQ ID NO:10))用于初免免疫，并且加强包括用RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)、B/HPIV3 DS-Cav1病毒(SEQ ID NO:16)或B/HPIV3DS-Cav1/B3TMCT病毒(SEQ ID NO:17)进行免疫。
在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS2/Δ1313/I1314L病毒(SEQ IDNO:19)、RSV LID/F1BBG2/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:4)、RSV LID/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:2)、RSV LID/ΔNS2/1030s病毒(SEQ ID NO:18)或RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII病毒(SEQID NO:11)，并且加强包括施用RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS2/Δ1313/I1314L病毒(SEQ IDNO:19)、RSV LID/F1BBG2/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:4)、RSV LID/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:2)、RSV LID/ΔNS2/1030s病毒(SEQ ID NO:18)、RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII病毒(SEQ IDNO:11)或RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)，并且加强包括施用B/HPIV3DS-Cav1/B3TMCT病毒(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS2/Δ1313/I1314L病毒(SEQ IDNO:19)、RSV LID/F1BBG2/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:4)、RSV LID/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:2)、RSV LID/ΔNS2/1030s病毒(SEQ ID NO:18)、RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII病毒(SEQ IDNO:11)或RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1病毒(SEQ IDNO:16)。
在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS2/Δ1313/I1314L病毒(SEQ IDNO:19)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1病毒(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS2/Δ1313/I1314L病毒(SEQ ID NO:19)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS2/Δ1313/I1314L病毒(SEQ ID NO:19)，并且加强包括施用RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS2/1030s病毒(SEQ ID NO:18)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1病毒(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS2/1030s病毒(SEQ ID NO:18)，并且加强包括施用B/HPIV3DS-Cav1/B3TMCT病毒(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS2/1030s病毒(SEQ IDNO:18)，并且加强包括施用RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，初免包括施用RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1病毒(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/F1BBG2/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:4)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1病毒(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/F1BBG2/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:4)，并且加强包括施用B/HPIV3DS-Cav1/B3TMCT病毒(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/F1BBG2/ΔNS1病毒(SEQ IDNO:4)，并且加强包括施用RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:2)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1病毒(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，初免包括施用RSVLID/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:2)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒(SEQ IDNO:17)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV LID/ΔNS1病毒(SEQ ID NO:2)，并且加强包括施用RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，初免包括施用RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII病毒(SEQ IDNO:11)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1病毒(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII病毒(SEQ ID NO:11)，并且加强包括施用B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，初免包括施用RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII病毒(SEQ ID NO:11)，并且加强包括施用RSV 276病毒(SEQ ID NO:12)。
在任何本文提供的初免-加强免疫方法中，可以以约5.0log10 PFU至约6.0log10PFU的剂量将初免和加强鼻内施用至受试者。在任何本文提供的初免-加强免疫方法中，可以选择合适的受试者用于免疫，如五岁或更年幼的人类受试者。在本文提供的初免-加强免疫方法中，通过合适的方法(如鼻内施用)将病毒施用至受试者。
在一些实施方案中，以3.0log10至7.0log10 PFU的剂量(例如，约5.0log10至约6.0log10PFU的剂量，如约6.0log10 PFU的剂量)将如本文所公开的重组RSV鼻内施用至5岁或更年幼(如约2岁或更年幼)的人类受试者。
在一些实施方案中，以3.0log10至7.0log10 PFU的剂量(如约6.0log10 PFU的剂量)将如本文所公开的重组RSV鼻内施用至5岁或更年幼(如约2岁或更年幼)的RSV血清阳性人类受试者，并且其中在施用后最初2周期间所取鼻洗液中重组RSV的滴度为3.0log10PFU/ml鼻洗液或更低，并且施用至所述受试者的重组RSV是减毒的，使得在鼻内施用至受试者之后第一个月内，所述受试者展现在种类和严重程度方面与未接受所述病毒的可比较的受试者可比较的无或轻度(1级)呼吸/发热疾病。
在一些实施方案中，以3.0log10至7.0log10 PFU的剂量(如约6.0log10 PFU的剂量)将如本文所公开的重组RSV鼻内施用至5岁或更年幼(如约2岁或更年幼)的RSV血清阳性人类受试者，并且其中在施用后最初2周期间所取鼻洗液中重组RSV的滴度为3.0log10PFU/ml鼻洗液或更低。
在一些实施方案中，以3.0log10至7.0log10 PFU的剂量(如约6.0log10 PFU的剂量)将如本文所公开的重组RSV鼻内施用至5岁或更年幼(如约2岁或更年幼)的RSV血清阳性人类受试者，并且其中所述重组RSV的施用在≥75％的接受者中引发血清RSV特异性抗体的增加。
可以通过多种方法表征所产生的免疫应答。这些方法包括采集鼻洗液或血清样品用于分析RSV特异性抗体，所述抗体可以通过测试进行检测，所述测试包括但不限于补体固定、噬斑中和、酶联免疫吸附测定、萤光素酶免疫沉淀测定和流式细胞术。此外，可以通过以下方法检测免疫应答：测定鼻洗液或血清中的细胞因子、任一来源的免疫细胞的ELISPOT、鼻洗液或血清样品的定量RT-PCR或微阵列分析、以及通过在体外再暴露于病毒抗原对来自鼻洗液或血清的免疫细胞的再刺激、以及通过流式细胞术分析细胞因子、表面标记或其他免疫相关量度的产生或展示、或者分析针对展示RSV抗原的指示靶标细胞的细胞毒性活性。在这方面，还监测个体的上呼吸道疾病的体征和症状。
实施例
本公开文本中描述的材料、信息和方法提供具有分级的减毒表型的减毒毒株的阵列，并且提供基于临床基准选择合适的候选疫苗毒株的指导。提供以下实施例以说明某些实施方案的特定特征，但是各权利要求的范围不应限于所例示的那些特征。
实施例1
带有NS1缺失以及F和G基因转移的重组呼吸道合胞病毒
此实施例描述重组减毒RSV，其包括与一个或多个另外的突变组合的NS1基因的缺失。
NS1和NS2蛋白独立地(且在一定程度上协同地)介导对宿主先天免疫应答和细胞凋亡的强阻抑，并且还已经发现其阻抑并改变适应性免疫应答。NS1似乎在许多这些活性中发挥的作用更大。NS1和NS2借以阻抑和改变宿主反应的机制多种多样，并且被不完全地鉴定和不完全地表征。两种蛋白质(尤其是NS1)抑制I型和III型干扰素(IFN)以及促炎性细胞因子的诱导。该抑制涉及多种机制。例如，NS1和NS2抑制细胞内信号传导途径，如通过与RIG-I和MAVS结合以阻断其相互作用，以及通过促进RIG-I、TRAF3、TBK1和IKKε的降解(Boyapalle等人2012.PLoS One 7:e29386；Sweden等人2009.J Virol83:9682-9693)。NS1可以阻断IRF3激活、其核易位以及其与IFN-β启动子上的转录共激活因子的相互作用(Spann等人2005.J Virol 79:5353-5362；Ren等人2011.J Gen Virol92:2153-2159)。已经报道两种蛋白质均抑制来自I型IFN受体(IFNAR)的信号传导，其原本放大INF应答并诱导数十种有助于抗病毒状态的蛋白质。例如，已经描述两种蛋白质(尤其是NS2)促进STAT2的降解(Lo等人2005,J Virol 79:9315-9319；Xu等人2014.Intervirology 57:65-73)。也已经显示NS1直接干扰IFN诱导的抗病毒状态的组分，即原本抑制RSV复制的2'-5'-寡腺苷酸合成酶样(OASL)蛋白(Dhar等人2015.J Virol89:10115-10119)。两种蛋白质(尤其是NS1)阻抑细胞响应于RSV感染的细胞凋亡的诱导，具有延长被感染细胞的存活和增加后代RSV的产生的作用(Bitko等人2007.J Virol81:1786-1795)。两种蛋白质(尤其是NS1)通过阻抑树突细胞(DC)的成熟、通过偏移T细胞子集的激活(部分通过拮抗IFN应答)以及通过改变调节T细胞的应答，来阻抑适应性免疫的发展(Munir等人2008.J Virol 82:8780-8796；Munir等人2011.PLoS Pathogen 7:e1001336；Yang等人2015.Virology 485:223-232)。也已经显示NS1蛋白可通过修改特定miRNA的表达来促进RSV感染(Bakre等人2015.J Gen Virol 96:3179-3191；Zhang等人2016.Biochem Biophys Res Comm 478:1436-1441)。也已经显示NS1蛋白(和NS2蛋白以较低程度)在微型基因组系统中下调RNA合成，表明它们对仍有待确定的病毒基因表达和/或基因组复制具有直接影响(Atreya等人1998.J Virol 72:1452-1461)。归因于NS1和NS2的活性和机制的该列表并非完整的或完全表征的。
任一种或两种基因的缺失或沉默在体内减弱RSV复制，其中在血清阴性黑猩猩中NS1的缺失具有比NS2更大的减毒作用(Whitehead等人1999.J Virol 73:3438-3442；Teng等人2000.J Virol 74:9317-9321)，黑猩猩被认为是初次感染RSV的人的最有预测性的替代。假定在不存在NS1和/或NS2蛋白的情况下增加的IFN和细胞凋亡应答是该减毒中的主要因素。然而，许多NS1介导的和NS2介导的的活性对其天然人类宿主中的RSV复制的意义和影响，以及对人体中候选活减毒RSV疫苗的减毒和免疫原性的意义和影响仍在研究中，并且尚未被完全理解。已经在人体中评价带有与多个点突变组合的NS2的缺失的几种实验疫苗。这些疫苗病毒之一rA2cpΔNS2(其组合ΔNS2缺失与来自冷传代(cp)RSV毒株的N、F和L蛋白中的五个点突变)在血清阳性儿童中减毒不足(Wright等人2006.J Infect Dis 193:573-581)。两种其他疫苗病毒rA2cp248/404ΔNS2和rA2cp530/1009ΔNS2(其各自进一步添加不同的减毒温度敏感性(ts)突变对(248/404或530/1009))在血清阴性儿童中减毒过度(Wright等人2006.J Infect Dis 193:573-581)。这些研究确认，NS2的缺失在人类宿主中是减毒的，但是认为对于作为儿童疫苗的进一步评价，所述病毒都没有被合适地减毒。先前，从未在人体中评价带有NS1基因的缺失的RSV；在本公开文本中，呈现来自在12-59个月龄的RSV血清阳性儿童和6-24个月龄的RSV血清阴性儿童中进行的I期临床试验的数据。
具有ΔNS1和另外的突变的重组RSV的设计
用于构建重组RSV的RSV反基因组是称为D46的野生型RSV毒株A2反基因组cDNA。该反基因组cDNA在文献中有时也被称为D53。D46是目前的反求遗传学系统的基础(Collins等人1995.Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-11567)，并且其完整序列显示于美国专利6,790,449和GenBank KT992094中，在本文中作为SEQ ID NO:1来提供。
图1A说明NS1基因的缺失。529-nt缺失(核苷酸99-627(包含端值))始于并包括核苷酸99(它是NS1 ORF的ATG的第一核苷酸)并且延伸至且包括核苷酸627(它紧接在NS2ORF的ATG(核苷酸628-630)之前)。该缺失将NS1基因的上游非翻译区与NS2 ORF的翻译起始密码子接合。
图1B说明NS1和NS2 ORF连同其大部分侧接基因序列从其在基因组中的天然位置1和2的缺失。1042-nt缺失(核苷酸99-1140(包含端值))始于并包括核苷酸99(它是NS1 ORF的ATG的第一核苷酸)并且延伸至且包括核苷酸1140(它紧接在N ORF的ATG(1141-1143)之前)。该缺失将NS1基因的上游非翻译区与N ORF的翻译起始密码子接合。
图1C说明“LID”突变，其包括D46的SH基因的下游非翻译区的112个核苷酸缺失以及5个核苷酸取代(C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A)，这涉及SH ORF的最后三个密码子和终止密码子并且不改变氨基酸编码(Bukreyev等人2001.J Virol75:12128-12140)。注意，在临床前研究中，带有LID突变的RSV通常似乎具有野生型样表型(Bukreyev等人2001.J Virol 75:12128-12140)，但是这并不排除可能的微小差异，如在细胞培养中适度增加的复制。
图2说明G和F基因从其天然基因组位置转移以位于启动子近端并且使F在G之前(而不是G在F之前的天然顺序)。图2A说明从RSV LID缺失F和G基因。使核苷酸4630-7551(包含端值)从RSV反基因组cDNA缺失以去除F和G基因。这具有使SH基因终止信号与F/M2基因间区融合的作用。该突变用反基因组cDNA来说明，所述反基因组cDNA带有LID突变(用SH基因上方或下方的空心三角形来指示)，但是所述修饰不依赖于所述LID突变。图2B说明将F和G基因分别插入重组RSV反基因组的基因位置1和2中。将G和F ORF(阴影序列)按其天然顺序的相反顺序(即，F-G代替G-F)重构为基因。每个ORF的设计使得在最终构建体(反基因组cDNA)中，其侧接有短非翻译区以及基因起始和基因终止信号，且F和G基因通过由单一核苷酸组成的短基因间区隔开。将具有Xho I位点的核苷酸衔接子添加于F和G ORF的上游和下游：在LID反基因组cDNA中，上游Xho I位点的产生需要所述序列中代表上游非翻译NS1基因区的核苷酸88-91从CTTG(以大写字母显示)至tcga(以小写字母显示)的突变。如以底部的反基因组所显示，使用Xho I位点将F-G基因盒(交叉影线矩形)插入基因组cDNA中。
图3提供带有不同突变组合的RSV毒株的基因组图谱，所述突变组合包括LID突变(所述LID突变用SH基因上的空心三角形来指示)；G和F从其天然位置缺失(ΔG+F)及其分别转移至第2和第1基因位置(F1G2，其中F和G按其天然顺序G-F的相反顺序)；F1G2，其中F ORF已经进行密码子优化(F1BBG2)；NS1基因的缺失(ΔNS1)；1030s突变的添加，其由L分配1321K(AAA)和1313S(TCA)组成；L中Δ1313和I1314L(CTG)突变的添加；以及NS1和NS2基因二者的缺失(ΔNS1+2)。所示LID/F1BBG2/ΔNS1、LID/F1BBG2/ΔNS1/1030s、LID/F1BBG2/ΔNS1/Δ1313/I1314L和LID/ΔNS1+2/F1BBG2构建体含有密码子优化的F1BB2 ORF：称为LID/F1G2/ΔNS1、LID/F1G2/ΔNS1/1030s、LID/F1G2/ΔNS1/Δ1313/I1314L和LID/F1G2/ΔNS1+2的平行构建体含有未优化的野生型形式(未显示)。
通过反求遗传学恢复重组RSV(参见Collins等人1995.Proc Natl Acad Sci U SA92:11563-7)。使RSV在32℃下在Vero细胞中生长。通过未克隆的RT-PCR产物的自动化Sanger测序分析来确认所有病毒的完整基因组序列不含高于背景的可检测外来突变。
重组RSV的体外评估
在非洲绿猴Vero细胞中评估各种重组RSV的多周期复制的动力学和产量(图4)，所述细胞无法响应于病毒感染而产生I型干扰素。该图显示，带有呈不同组合的LID、ΔNS1、F1G2和F1BBG2突变的病毒在Vero细胞(用于疫苗制造的细胞基质)中复制至合理滴度。注意，RSV LID病毒是野生型样病毒，因此在此实验和随后的实验中用作野生型样对照。
还在人气道上皮(HAE)细胞培养中评估各种重组RSV的多周期生长动力学(图5)。HAE培养形成非常类似于真实气道上皮的分化的、极化的、假复层的黏液纤毛组织。这些培养中的减毒复制预示非人灵长类动物和人中的减毒复制。这些数据显示，与RSV LID亲本相比，带有单独的或与F1G2和F1BBG2修饰组合的ΔNS1修饰的病毒发生显著减毒。
在Vero细胞上评估重组RSV的噬斑和合胞体形成特性(图6和图7)。带有呈各种组合的LID、F1BBG2、F1G2和ΔNS1突变的重组RSV在Vero细胞上容易地形成噬斑，并且带有F1G2和F1BBG2基因转移的重组RSV在多周期复制期间在Vero细胞中引导大合胞体的形成，这与F蛋白的表达增加一致。
另外，被带有F1G2和F1BBG2修饰的重组RSV感染的Vero细胞显示在Vero细胞中增加的RSV F和G蛋白的表达(图8)，如通过在变性和还原条件下的凝胶电泳和使用具有所指示特异性的抗体的蛋白质印迹分析所确定，且RSV F、G、N、P和M蛋白相对于作为1.0的RSVLID的表达水平显示于右侧。
还在人气道A549细胞中评估重组RSV，所述细胞能够进行针对病毒感染的干扰素应答。被缺少NS1基因的重组RSV感染的细胞显示增加的1型(α、β)和III型(λ)干扰素的表达(图9)。A549细胞以3PFU/细胞的MOI被感染，并且在感染后24h收集组织培养基上清液。通过ELISA确定培养基上清液中的IFN浓度。这显示，NS1基因的缺失导致I型和III型干扰素的表达显著增加，从而可以刺激免疫应答并减弱病毒复制。
在实验动物中对重组RSV的评估
在小鼠中评估重组RSV(图10)。与作为野生型样病毒的RSV LID病毒相比，在存在或不存在NS1缺失和LID突变的情况下，F1G2或F1BBG2修饰的存在导致小鼠上呼吸道和下呼吸道中的RSV复制减少。对于这些测定，用104或106PFU/动物的剂量的每种指示的RSV感染六周龄BALB/c小鼠。将每种病毒和剂量的五只动物在感染后3天和5天处死，并且收获鼻甲和肺，将其匀浆化，并通过噬斑测定来确定病毒滴度。
尽管在上呼吸道和下呼吸道中的复制受限，但是带有LID、ΔNS1、F1G2和F1BBG2修饰的指示组合的重组RSV诱导的RSV中和血清抗体的滴度与作为野生型样病毒的LID病毒不相上下(图11)。对于这些测定，用104或106PFU/动物的剂量的每种指示的RSV感染六周龄BALB/c小鼠，并且在感染后28天收集血清样品。
使用非洲绿猴(AGM)评估RSV LID/ΔNS1和LID/F1BBG2/ΔNS1，与带有ΔNS2的RSVΔNS2/Δ1313/I1314L、带有ΔM2-2的RSV 276和野生型病毒相比较。对于每种病毒感染四只动物，并且从来自每只动物的鼻咽和气管灌洗样品确定病毒滴度(表1和表2；图12)。还从每只动物获得血清样品，并确定血清PRNT60滴度(表3；图13)。结果显示，LID/F1BBG2/ΔNS1具有有前景的减毒表型并引发更优的免疫应答。
表1.与ΔNS2和ΔM2-2突变体和重组wt RSV rA2相比，来自用RSVΔNS1突变体接种的AGM的鼻咽拭子样品的病毒滴度。
a将猴子用每个部位1mL接种物中106PFU的指示的病毒i.n.和i.t.接种(总剂量＝2x106 PFU/AGM)。b对Vero细胞进行病毒滴定。检测下限为1.0log10 PFU/mL。没有可检测病毒的样品表示为“-”。每只动物的峰值滴度加下划线。的平均峰值滴度c使用每日滴度之和作为脱落量值(曲线下面积)的估计值。对于没有可检测病毒的样品，使用0.35的值。dΔM2-2病毒。
表2.与ΔNS2和ΔM2-2突变体和重组wt RSV rA2相比，来自用RSVΔNS1突变体接种的AGM的气管灌洗样品的病毒滴度。
a将猴子用每个部位1mL接种物中106PFU的指示的病毒i.n.和i.t.接种(总剂量＝2x106 PFU/AGM)。b对Vero细胞进行病毒滴定。检测下限为1.0log10 PFU/mL。没有可检测病毒的样品表示为“-”。加下划线的值指示每只动物的最大滴度。c使用每日滴度之和作为脱落量值(曲线下面积)的估计值。对于没有可检测病毒的样品，使用0.7的值。dΔM2-2病毒。
表3：与ΔNS2和ΔM2-2突变体和重组wt RSV rA2相比，用RSVΔNS1突变体接种的AGM中的血清PRNT60滴度。
a60％噬斑减少测定的检测下限为3.3(稀释度倒数的Log2)。将低于检测下限的样品记录为“-”。bΔM2-2病毒。
实施例2
在人类受试者中对重组RSV的评估
来自实验动物中的研究的信息通常对于预测在人体中且特别是在婴儿和幼儿中减毒、耐受性和免疫原性的量值并非完全准确，所述人大多具有RSV感染的风险并且是疫苗开发的主要目标。此外，与婴儿和幼儿的不成熟且不太有效的免疫系统相比，实验动物通常是具有成熟的免疫系统的成年动物。关于呼吸道病毒，与人相比，实验动物的上呼吸道和下呼吸道的大小、结构和组成可能具有差异。另外，无法假定缺失RSV辅助蛋白(如本公开文本中所述的NS1和NS2蛋白)的效应在实验动物和人中是相同的，因为这些病毒蛋白已经进化为与人宿主细胞蛋白相互作用，并且可能与实验动物中的相应蛋白质不具有相同的相互作用和效应。因此，在婴儿和幼儿中的临床试验对于评价候选儿童RSV疫苗是重要的。
值得注意，发现基于实验动物中包括的临床前研究表现为作为候选儿童疫苗有前景并且进展至I期临床研究的大多数活减毒RSV毒株没有有前景到足以进展至进一步的临床研究。Karron等人最近综述了在超过25年中评价的作为候选儿童疫苗的19种活减毒RSV毒株的临床研究(Karron等人2013In Challenges and Opportunities for RespiratorySyncytial Virus Vaccines,Current Topics in Microbiology and Immunology 372，第259-284页)。在该综述中的十种生物来源的活减毒RSV毒株中，发现都不适合进行进一步研究。在该综述中的另外九种重组产生的活减毒候选者中，仅一种，即RSV Medi/ΔM2-2(Karron等人Sci Transl Med 312:ra175；ClinicalTrials.gov标识符：NCT01459198)表现为可能适合于进一步的临床研究但并未进展。随后，已经在I期临床研究中评价另外五种重组产生的活减毒RSV毒株，关于其获得足够数据来确定它们用于进一步临床评价的合适性。这些另外的毒株是：(i)RSV LID/ΔM2-2(McFarland等人2018.Live-attenuatedrespiratory syncytial virus vaccine candidate with deletion of RSV synthesisregulatory protein M2-2 is immunogenic in children.J.Infect.Dis.217:1347-55；ClinicalTrials.gov标识符：NCT02040831和NCT02237209)；(ii)RSV D46/cp/M2-2(ClinicalTrials.gov标识符NCT02601612)；(iii)RSV LID/cp/ΔM2-2(Cunningham等人2019.Live-attenuated respiratory syncytial virus vaccine with deletion of RNAsynthesis regulatory protein M2-2 and cold-passage mutations is over-attenuated.Open Forum Infect Dis.2019年5月6日；6(6):ofz212.doi:10.1093/ofid/ofz212.eCollection 2019年6月；ClinicalTrials.gov标识符：NCT02890381和NCT02948127)；(iv)RSV LID/ΔM2-2/1030s(McFarland等人2020.Live respiratorysyncytial attenuated by M2-2 deletion and stabilized temperature sensitivitymutation 1030s is a promising vaccine candidate in children.J.Infect.Dis.221:534-43；ClinicalTrials.gov标识符：NCT02952339和NCT02794870)；以及(v)RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII(McFarland等人2020.Live-attenuated respiratory syncytialvirus vaccine with M2-2 deletion and with SH non-coding region is highlyimmunogenic in children.J.Infect.Dis.2020年2月1日.pii:jiaa049.doi:10.1093/infdis/jiaa049.[Epub优先出版]；ClinicalTrials.gov标识符：NCT03102034)。在这五种另外的病毒中，只有RSV LID/ΔM2-2/1030s表现为适合于进展至进一步临床研究。因此，在超过25年中评价的在临床前研究中看起来有前景并进展至儿童临床研究的总计24种活减毒RSV毒株中，仅两种(Medi/ΔM2-2和LID/ΔM2-2/1030s)被认为是进一步临床研究的候选者。因此，在婴儿和幼儿中对候选活减毒RSV疫苗的临床评价是不可预测的并且在历史上成功率一直不高。
本公开文本中的两种病毒作为候选活减毒儿童RSV疫苗进展至儿童中的I期临床研究，即RSV LID/ΔNS1和RSV LID/F1G2/ΔNS1(基因组图谱参见图3A)。该研究提供对活RSV毒株中的两个独立修饰/突变的首次临床评价：(i)NS1基因的缺失，以及(ii)F和G基因分别从其常见位置8和7分别转移至位置1和2。为了制备可接受用于人使用的CTM，每种突变体的种子病毒通过反求遗传学从cDNA从头生成，所述cDNA被电穿孔至从世界卫生组织Vero细胞生成的cGMP认证的Vero细胞中。每种突变体的cGMP认证的CTM是在Charles RiverLaboratories在相同细胞基质中从种子病毒制备的。使用RT-PCR扩增的全基因组序列分析确认，种子病毒的两种制剂和CTM的两种制剂不含可检测的外来突变。临床前安全性测试确认，CTM的两种制剂适合于人施用。
在依序、随机化、双盲、安慰剂对照的研究中，在年龄为12-59个月的RSV血清阳性儿童中以6.0log10 PFU(LID/ΔNS1)或5.8log10 PFU(LID/F1G2/ΔNS1)的剂量以及在年龄为6-24个月的RSV血清阴性儿童中以5.0log10 PFU的剂量，与安慰剂接受者并行评价LID/ΔNS1和LID/F1G2/ΔNS1的单一剂量。将儿童以2:2:1随机化以分别接受作为鼻滴剂(每名受试者0.5ml，每个鼻孔给予大约0.25ml)施用的LID/ΔNS1、LID/F1G2/ΔNS1或安慰剂。临床方案、同意书和研究者手册由CIR和NIAID研究者开发；研究性新药物应用、FDA审查、知情同意、机构审查委员会审查、随机化、设盲、揭盲、研究实施以及NIAID数据安全性监督委员会审查基本上如先前所述来进行(Karron等人2015.A gene deletion that up-regulatesviral gene expression yields an attenuated RSV vaccine with improved antibodyresponses in children.Sci Transl Med7:312ra175.)。
每年在RSV季节之外在4月1日与10月31日之间招募儿童。进行临床评估并在疫苗施用后的以下天数获得鼻洗液(NW)样品：RSV血清阳性儿童，研究第0天、第3天-第7天和第10天；RSV血清阴性儿童，研究第0天、第3天、第5天、第7天、第10天、第12天、第14天、第17天、第28天±1天，在每个时间点。对于RSV血清阳性和RSV血清阴性儿童，收集不良事件至第28天；对于RSV血清阴性儿童，收集严重不良事件和LRI至第56天，在LRI的事件中进行另外的身体检查并获得NW样品。发烧、上呼吸道疾病(URI；包括鼻漏、咽炎和声嘶)、咳嗽、LRI和中耳炎如其他地方所述来定义(Karron等人1997.Evaluation of two live,cold-passaged,temperature-sensitive respiratory syncytial virus vaccines in chimpanzees andin adult humans.J Infect Dis 176:1428-36)。在发生疾病时，借助实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测试NW样品中的其他病毒和支原体(呼吸道病原体21试剂盒；Fast TrackDiagnostics，卢森堡)。通过免疫噬斑测定使用3种针对RSV F的单克隆抗体(mAb)(mAb1129、1243和1269，通过定量RT-PCR(RT-qPCR)(Karron2015，同上))的混合物对NW流体中的疫苗病毒进行定量。在接种前和在RSV血清阳性参与者接种之后大约1个月以及在RSV血清阴性参与者接种之后2个月，获得血清样品。使用补体增强的60％ RSV噬斑减少中和测定测试血清样品的RSV中和抗体，并且使用酶联免疫吸附测定测试血清样品的针对RSV F糖蛋白的免疫球蛋白G(IgG)抗体(Karron等人2015，同上)。噬斑减少中和滴度(PRNT)和RSV F IgG滴度表示为倒数log2值。将抗体反应定义为与疫苗接种前滴度相比，滴度的≥4倍增加。将用疫苗感染定义为通过培养或RT-qPCR检测到疫苗病毒，和/或血清RSV PRNT或RSV F IgG≥4倍升高。仅计算感染的疫苗的疫苗病毒脱落的平均峰值滴度(log10 PFU/mL)。将PRNT和RSV F IgG滴度转换为log2值用于计算平均值，并且使用Student t检验来比较组间的平均值。计算所有受试者的血清抗体滴度：向那些滴度低于检测限的受试者分配2.3log2(PRNT)和4.6log2(ELISA)的值。使用双尾Fisher精确性检验比较患病率和抗体反应。
首先在12-59个月龄的RSV血清阳性儿童评价候选RSV LID/ΔNS1疫苗和候选LID/F1G2/ΔNS1疫苗以确认，它们被充分减毒以在RSV血清阴性儿童中进行评价(表4和表5)。在2018年和2019年招募RSV血清阳性儿童。将每种疫苗各自施用至10名受试者，并将安慰剂(由L-15组织培养基组成)施用至5名受试者。分别在30％、50％和40％的接受RSV LID/ΔNS1、LID/F1G2/ΔNS1和安慰剂的参与者中观察到在研究第0天与第28天之间发生的轻度呼吸道或发热疾病(表4)。在此时间段期间未观察到下呼吸道疾病(LRI)的情况。在疫苗接受者中，轻度呼吸/发热疾病的这些偶然事件中的每一个与外来呼吸病原体的检测是同时期的(数据未显示)。任何组中的受试者都没有脱落可检测的疫苗病毒，指示减毒(表4)。单一疫苗接受者(LID/F1G2/ΔNS1组)具有血清RSV中和抗体和RSV-F结合抗体的≥4倍升高，但是未检测到疫苗病毒脱落或外来RSV(表4和表5)。这种低免疫原性水平也指示减毒。因此，这两种新候选疫苗都被充分减毒以进展至在RSV血清阴性的更幼小儿童中进行评价。
因此，在6-24个月龄的RSV血清阴性儿童中评价候选RSV LID/ΔNS1疫苗和候选LID/F1G2/ΔNS1疫苗，所述年龄组可能将是儿童RSV疫苗的主要目标(表5和表6)。招募在2019年开始并且仍在进行中。可获得每个疫苗组中4名受试者和2名安慰剂接受者的数据(完整招募将为每个疫苗组14-20名受试者和7-10名安慰剂接受者，总计35-50名受试者)。分别在50％、75％和50％的接受RSV LID/ΔNS1、LID/F1G2/ΔNS1和安慰剂的参与者中观察到在研究第0天与第28天之间的轻度呼吸道或发热疾病(表6)。这些偶然事件似乎都与疫苗病毒脱落无关(数据未显示)。不存在LRI的偶然事件。LID/ΔNS1组中的两名疫苗接受者脱落疫苗病毒，其平均峰值滴度为2.1log 10PFU(培养)和5.4log10拷贝数(RT-PCR)。在LID/F1G2/ΔNS1组中，所有四名疫苗接受者都脱落通过培养和/或RT-PCR可检测的疫苗病毒，其平均峰值滴度为1.3log 10PFU(培养)和3.9log10拷贝数(RT-PCR)(表6)。对于RSV LID/ΔNS1病毒的任何接受者未观察到血清RSV中和和/或RSV-F结合抗体的≥4倍升高，但是对于75％的RSV LID/F1G2/ΔNS1病毒的接受者检测到所述升高，其平均滴度为5.5log2(PRNT)和10.8log2(ELISA)(表7)。
基于这些初始数据，两种新病毒(LID/ΔNS1和LID/F1G2/ΔNS1)似乎是高度减毒的且耐受良好的(减毒的)。在RSV血清阳性和RSV血清阴性两种受试者中，轻度呼吸/发热疾病的频率与安慰剂接受者大致相同，并且通常似乎与外来因子是同时期的。
两种病毒似乎都高度受限。在RSV血清阳性受试者中，未观察到任一病毒的脱落，不论是通过培养还是通过RT-PCR来测定，并且仅一名疫苗接受者具有血清RSV特异性抗体反应。在RSV血清阴性受试者中，50％的LID/ΔNS1的接受者脱落通过培养和RT-PCR检测的病毒，但仅以低滴度脱落。在RSV血清阴性受试者中，50％和100％的LID/F1G2/ΔNS1的接受者分别脱落通过培养和RT-PCR检测的病毒，并且仅以低滴度脱落。
在RSV血清阴性接受者中，LID/ΔNS1病毒未诱导血清RSV-PRNT和ELISA抗体反应的≥4倍增加，而LID/F1G2/ΔNS1病毒在75％的接受者中诱导血清RSV-PRNT和ELISA抗体的≥4倍增加。
总之，该研究提供对候选活减毒RSV疫苗的两个修饰在人体中的首次评价：(i)NS1基因的缺失，以及(ii)F和G基因的位置分别从8和7转移至1和2。NS1基因的缺失得到如下病毒，所述病毒是高度减毒的、耐受良好的、高度受限的且在LID/F1G2/ΔNS1的情形中具有中度免疫原性。F1G2基因转移似乎增加免疫原性，从而将具有≥4倍血清抗体反应的接受者的百分比从0％(LID/ΔNS1)增加至75％(LID/F1G2/ΔNS1)。该研究仍在进行中并且将招募另外的6-24个月龄的RSV血清阴性受试者。
可用数据提高这些病毒在5.0log10 PFU的剂量下可能减毒过度的可能性，因为通常认为优选地通过培养检测的感染性频率为大约85％或更大，并且通过培养检测的脱落病毒的平均峰值滴度为3.0至4.0log10 PFU/ml，以具有足够抗原负荷。当然，来自正在进行的临床研究的其他数据应已经澄清这些病毒的特性。如果认为任一种或两种病毒减毒过度，这可能可以通过将剂量从5.0log10 PFU增加至6.0log10 PFU来补偿，如先前用下文描述的另一种候选活减毒RSV所进行的。
先前在RSV血清阳性和RSV血清阴性儿童中评价称为RSVΔNS2/Δ1313/I1314L的病毒(具有NS2基因的缺失且存在L中的Δ1313密码子缺失和L中的稳定I1314L突变)(Karron2019.Safety and Immunogenicity of the Respiratory Syncytial VirusVaccine RSV/ΔNS2/Δ1313/I1314L in RSV-Seronegative Children.J InfectDis.pii:jiz408.doi:10.1093/infdis/jiz408.[Epub优先出版]；ClinicalTrials.gov标识符：NCT01893554)。在以5.0log10 PFU的剂量施用至RSV血清阴性儿童时，RSVΔNS2/Δ1313/I1314L病毒耐受良好。通过培养，在15名接受者中的1名中脱落是可检测的(峰值滴度1.4log10 PFU/ml)，且通过RT-PCR，在15名接受者中的11名中脱落是可检测的(平均峰值滴度3.0log10拷贝/ml)。在以6.0log10 PFU的高10倍的剂量施用时，感染性显著改善，通过培养在20名接受者中的16名中检测到脱落(平均峰值滴度为1.8log10 PFU/ml)，且通过RT-PCR在20名接受者中的18名中检测到脱落(平均峰值滴度为3.5log10拷贝/ml)。重要的是，具有血清PRNT的≥4倍升高的接受者的百分比从53％增加至80％。剂量的增加对耐受性无影响：在5.0和6.0log10剂量下轻度呼吸/发热疾病的发病率分别为73％和55％，与之相比，每个相应安慰剂接受者组分别为14％和70％。
总之，在6-24个月龄的RSV血清阴性儿童中的I期临床研究显示，在5.0log10 PFU的剂量下，RSV LID/ΔNS1和LID/F1G2/ΔNS1是高度减毒的、高度受限的、耐受良好的，并且LID/F1G2/ΔNS1具有中度免疫原性。将F和G基因转移至位置1和2与免疫原性增加相关。
表4：12至59个月龄的RSV血清阳性儿童对106PFU的重组活减毒呼吸道合胞病毒疫苗RSV LID/ΔNS1、或105.8PFU的RSV LID/F1G2/ΔNS1、或安慰剂的临床和病毒学反应。
表5：12至59个月龄的RSV血清阳性儿童对106PFU的重组活减毒呼吸道合胞病毒疫苗RSV LID/ΔNS1、或105.8PFU的RSV LID/F1G2/ΔNS1、或安慰剂的免疫应答。
/>
表6：6至24个月龄的RSV血清阴性儿童对105PFU的重组活减毒呼吸道合胞病毒疫苗RSV LID/ΔNS1、或RSV LID/F1G2/ΔNS1、或安慰剂的临床和病毒学反应。
/>
表7：6至24个月龄的RSV血清阴性儿童对105PFU的重组活减毒呼吸道合胞病毒疫苗RSV LID/ΔNS1、或RSV LID/F1G2/ΔNS1、或安慰剂的免疫应答。
实施例3
使用活减毒RSV疫苗的初免-加强免疫
在本发明研究中，与RSV相比来评价具有或不具有B3TMCT突变的表达DS-Cav1稳定的RSV pre-F蛋白的rB/HPIV3载体的加强作用。在先前具有原发性RSV感染的仓鼠和非洲绿猴(AGM)中评价加强。另外，在AGM中评价初免与加强之间的不同时间间隔(约2个月、约6个月和约15个月)的作用。结果显示，在任一实验动物中以及对于任何时间间隔，与通过RSV进行的加强相比，通过工程化用于增强免疫原性的表达RSV F的rB/HPIV3载体进行的加强诱导显著更高的血清RSV中和抗体滴度，特别是能够在不添加补体的情况下在体外中和RSV且因此特别有效的抗体。
RSV F和G蛋白是两种RSV中和抗原和主要保护性抗原。F通常被认为是比G更有效的中和和保护性抗原，并且其氨基酸序列在RSV毒株之间显著更保守。RSV F以融合前(pre-F)构象产生，所述融合前构象是亚稳定的并且可能易于被触发而经历主要可逆构象重排，所述构象重排驱动膜融合并使F呈高度稳定的融合后(post-F)构象(参见McLellan等人2010.Structure of a major antigenic site on the respiratory syncytial virusfusion glycoprotein in complex with neutralizing antibody 101F.J Virol 84:12236-44；Swanson等人2011.Structural basis for immunization with postfusionrespiratory syncytial virus fusion F glycoprotein(RSV F)to elicit highneutralizing antibody titers.Proc Natl Acad Sci U S A108:9619-24；McLellan等人2013.Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to aprefusion-specificneutralizing antibody.Science 340:1113-7)。pre-F和post-F共享一些中和表位，但是恢复期人血清中的大部分中和活性识别对pre-F具有特异性的表位(Graham.2017.Vaccinedevelopment for respiratory syncytial virus.Curr Opin Virol 23:107-112)。可以通过基于结构的工程化，如通过引入称为“DS”的二硫键和两个称为“Cav1”的疏水腔填充氨基酸取代，使RSV F在pre-F构象中基本上稳定(McLellan等人2013.Structure-baseddesign of a fusion glycoprotein vaccine for respiratory syncytialvirus.Science342:592-8)。DS-Cav1稳定的pre-F在啮齿动物和非人灵长类动物中的免疫原性比作为亚单位疫苗或由副流行性感冒病毒(PIV)载体表达的post-F显著更强(Liang等人2015.Enhanced Neutralizing Antibody Response Induced by RespiratorySyncytial Virus Prefusion F Protein Expressed by a Vaccine Candidate.J Virol89:9499-510)。
已经开发RSV毒株A2的多种减毒衍生物作为候选活减毒IN RSV疫苗(参见Karron等人2013.Live-attenuated respiratory syncytial virus vaccines.Curr TopMicrobiol Immunol372:259-84)。已经显示这些减毒病毒中的一些在婴儿和幼儿中的I期研究中耐受良好且具有免疫原性。
另外，已经寻求用于从添加的基因表达RSV抗原(主要是F蛋白)的PIV载体策略。HPIV血清型1、2和3是重要的儿童呼吸道病毒，并且HPIV3作为儿童呼吸道感染的主要病因仅次于RSV。PIV是囊膜非区段化负义RNA病毒，其与RSV相关并且属于单负病毒目(Mononegavirales)副黏液病毒科(Paramyxoviridae)。rB/HPIV3由牛PIV3(BPIV3)基因组(其通过宿主范围限制在人和非人灵长类动物中赋予减毒)组成，其中BPIV3 F和血凝素神经氨酸酶(HN)糖蛋白基因(编码两种PIV3中和和主要保护性抗原)被其来自人PIV3(HPIV3)的对应基因替代。
结果
在预先用RSV感染的仓鼠中使用RSV与rB/HPIV3-RSV-pre-F载体的加强免疫的比较。先前描述两种rB/HPIV3载体(Liang等人2017.Improved Prefusion Stability,Optimized Codon Usage,and Augmented Virion Packaging Enhance theImmunogenicity of Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein in a Vectored-Vaccine Candidate.J Virol 91)：rB/HPIV3/DS-Cav1(缩写为DS-Cav1载体)，其表达通过DS-Cav1突变在pre-F构象中具有显著增加的稳定性的RSV F；以及rB/HPIV3/DS-Cav1/B3TMCT(缩写为DS-Cav1/B3TMCT载体)，其表达具有相同DS-Cav1突变加上其TMCT结构域被BPIV3 F蛋白的那些TMCT结构域替代以实现有效掺入载体病毒粒子中的RSV F。针对感染仓鼠并诱导仓鼠中的血清RSV中和抗体的二次或加强反应的能力，将这两种载体与RSV D46相比较，所述仓鼠预先已经接受使用RSV D46的单一原发性IN感染(图14A)。使用RSV D46进行感染，因为减毒RSV毒株在仓鼠中由于强宿主范围限制而感染性弱。
确认四十八只仓鼠对于RSV和HPIV3是血清阴性的，将其分为四组(组A-组D，每组n＝12)，并通过IN接种用106PFU RSV D46/动物进行初免(图14A)。使分四组(组E-组H，每组n＝12)的另外四十八只RSV血清阴性和HPIV3血清阴性的仓鼠保持未初免以供比较。初免后六周，收集血清以测量RSV-PRNT和HPIV3-PRNT。两天后，用以下对成对的初免组和未初免组进行IN加强：(i)空rB/HPIV3载体(组A和组E)；(ii)DS-Cav1载体(组B和组F)；(iii)DS-Cav1/B3TMCT载体(组C和组G)；或者(iv)RSV D46(组D和组H)。以105TCID50/动物的剂量给予载体，并且以106PFU的剂量给予RSV D46。在加强后五天，将每组六只仓鼠处死并收获鼻甲(NT)和肺，并且通过免疫噬斑测定(RSV)或有限稀释测定(rB/HPIV3载体)进行测定以测量感染性病毒滴度。对于每组的其他六只仓鼠，在加强后两周收集血清以测量RSV-PRNT和HPIV3-PRNT。两天后，用如下文所述的RSV D46对动物进行IN激发。
在加强后五天对未初免动物中的病毒滴度的分析显示，DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体在NT和肺中复制的滴度低于空载体(图14B和图14C，分别为泳道3和泳道5与泳道1)，表明由于RSV F插入物的存在而减毒。DS-Cav1/B3TMCT载体的减毒程度略高于DS-Cav1载体并且与如下看法一致：将RSV F掺入载体囊膜中可能干扰载体复制。
RSV初免的动物与未初免动物的比较(图14B和图14C：偶数泳道与奇数泳道)显示，初免免疫完全限制RSV D46加强的复制(图14B、图14C，泳道8与泳道7)，但是对空rB/HPIV3载体的复制无影响(泳道2与泳道1)，与如下预期一致：RSV特异性免疫将限制RSV而非rB/HPIV3的复制。使用RSV的初免导致DS-Cav1载体的复制的适度限制(在NT中为2倍，在肺中为4倍)(图14B、图14C，泳道4与泳道3)，以及DS-Cav1/B3TMCT载体的略高限制(在NT中为32倍，在肺中为10倍；图14B和图14C，泳道6与泳道5)，但是初免组与未初免组之间的差异仅对于NT中的DS-Cav1/B3TMCT载体是统计学上显著的(图14B，泳道6与泳道5)。这些观察表明，rB/HPIV3的RSV F表达赋予对RSV特异性免疫所致限制的低敏感性水平，所述限制在将RSV F包装至载体病毒粒子中时略微增加。
对在加强后两周从未初免动物收集的血清中的HPIV3中和抗体滴度的分析显示，任一种RSV插入物在rB/HPIV3载体中的存在与相比于空载体HPIV3中和抗体的减少相关(图14D，泳道3和泳道5与泳道1)，与涉及如上所述的插入物的复制减少一致。DS-Cav1插入物的存在没有可检测地降低初免动物中相比于未初免动物的HPIV3免疫原性(图14D，泳道4与泳道3)，但是DS-Cav1/B3TMCT插入物导致初免动物中的HPIV3免疫原性相比于未初免动物显著降低(图14D，泳道6与泳道5)，与其如上所述的限制一致。
通过在添加或不添加豚鼠补体的情况下进行测定，来确定通过初免和加强诱导的血清RSV-PRNT(图14E和图14F)。补体的添加可以赋予抗体位阻和病毒裂解活性，从而导致可能原本具有弱中和活性的RSV特异性抗体的增强的检测。在不存在添加补体的情况下，中和测定对于直接中和RSV的“优质”抗体是更严格的测定(参见Liang等人2016.Packagingand Prefusion Stabilization Separately and Additively Increase the Quantityand Quality of Respiratory Syncytial Virus(RSV)-Neutralizing AntibodiesInduced by an RSV Fusion Protein Expressed by a Parainfluenza Virus Vector.JVirol 90:10022-10038；Liang等人2017.Improved Prefusion Stability,OptimizedCodon Usage,and Augmented Virion Packaging Enhance the Immunogenicity ofRespiratory Syncytial Virus Fusion Protein in a Vectored-Vaccine Candidate.JVirol 91)。
使用RSV D46的初始初免感染诱导在存在补体的情况下测量的高血清RSV-PRNT，并且诱导在不存在补体的情况下测量的较低RSV-PRNT。具体而言，在初免后六周从组A-组D收集的血清的平均血清RSV-PRNT使用补体确定在10.6log2(1:1,552)至11.2log2(1:2,353)范围内(图14E)，并且不使用补体确定在4.5log2(1:23)至5.2log2(1:37)范围内(图14F)。
使用RSV D46的加强将使用补体测量的平均血清RSV-PRNT(图14E，泳道7与泳道8)增加3倍，增加至12.3log2(1:5,043)的加强后平均滴度，并且将不使用补体测量的平均血清RSV-PRNT(图14F，泳道7与泳道8)也增加3倍，增加至6.6log2 PRNT(1:97)的加强后平均滴度。
使用DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体的加强将使用补体测量的平均血清RSV-PRNT分别增加8倍和6倍，增加至13.8log2(1:14,263)和13.7log2(1:13,308)的显著更高的加强后平均滴度(图14E，对于DS-Cav1为泳道3与泳道4，并且对于DS-Cav1/B3TMCT为泳道5与泳道6)。将不使用补体测量的加强前和加强后平均血清RSV-PRNT分别增加9倍和18倍，增加至8.3log2(1:315)和9.3log2(1:630)的加强后平均滴度(图14F，对于DS-Cav1载体为泳道3与泳道4，并且对于DS-Cav1/B3TMCT载体为泳道5与泳道6)。
还在血清收集后两天通过用106PFU的RSV D46/动物进行IN感染对用于加强后血清型的每组六只动物进行激发，并且在激发后3天收集NT和肺，并且通过免疫噬斑测定来确定激发RSV滴度。未用RSV初免并且用空rB/HPIV3载体加强，且因此没有RSV特异性免疫的动物在NT和肺中具有大约5.0log10 PFU/g组织的激发RSV。已经用RSV D46和/或表达RSV F的rB/HPIV3进行初免和/或加强的其他组中的所有仓鼠在NT和肺中没有可检测的感染性激发RSV(数据未显示)。因此，初免和/或加强的所有组合在RSV复制的该半允许模型中具有高保护性，并且无法基于保护性功效加以区分。
总之，在使用rB/HPIV3载体进行加强免疫时，存在大量载体复制和血清RSV-PRNT的稳健增加，从而导致极高滴度。相比之下，在使用RSV D46作为加强时，其复制高度受限，并且RSV-PRNT的增加显著更低。此外，由rB/HPIV3载体诱导的血清RSV-PRNT的增加倍数对于不使用补体测量的优质RSV中和血清抗体而言更大。
AGM中的加强免疫的比较。还在预先用单一RSV感染通过组合IN/IT途径(106PFU/部位)初免的AGM中评价加强免疫。在这些初次免疫中使用的病毒是RSV毒株A2的各种减毒衍生物，或者wt毒株rRSV A/Maryland/001/11(其像毒株A2一样来自亚组A)。初免RSV列于表8-表10中且描述于下文中。注意，关于初免将所有这些病毒处理为等同的，但是将接受各种病毒的动物在加强组之间均匀分配。
在三项单独实验(AGM实验#1-#3)中，通过组合IN/IT途径用减毒RSV(106PFU/部位)或DS-Cav1/B3TMCT载体(106TCID50/部位)给予预先初免的AGM单一加强感染。在实验#2中，另外的RSV初免的AGM接受DS-Cav1载体(106TCID50/部位)。在所有情形中，加强RSV是称为RSV 276的候选活减毒疫苗，其为通过缺失大部分M2-2 ORF减毒的RSV毒株A2形式。
对于12只动物(AGM实验#1，图15和表8)，初免与加强之间的时间间隔为约2个月(具体而言51天，等于两个月减九天)。对于20只其他动物(AGM实验#2，图16和表9)，初免与加强之间的时间间隔为约6个月(具体而言189天，等于六个月加九天)。对于其余四只动物(AGM实验#3，图17和表10)，所述时间间隔为约15个月(具体而言443天，等于15个月减七天)。
为了监测加强后的病毒脱落，分别每天和每隔一天收集NP和TL，持续连续十天，并且通过免疫噬斑测定(RSV)或有限稀释(B/HPIV3载体)来确定病毒滴度。在加强当天之前的一天或多天、在加强当天以及在之后连续四周中每七天收集血清，并且确定PRNT。
AGM实验#1：在用RSV初免后约2个月(两个月减九天)对AGM进行的加强免疫。可获得十二只预先接受使用以下三种不同RSV之一的单一初免免疫的AGM(表8)：(i)RSV LID/ΔNS1，一种NS1基因缺失突变体；(ii)RSV LID/F1G2/ΔNS1，前述病毒的一种衍生物，其中将RSV F和G基因移动至第1和第2基因组位置以增加其表达；以及(iii)亚组A wt毒株rRSV A/Maryland/001/11。在初免后第37天(加强前两周)，收集血清并在存在补体的情况下分析以确定RSV-PRNT，并且确认HPIV3血清阴性。将所述12只AGM再分配为两组，每组六只动物的组织使得所述两组具有类似数量的具有高、中或低第37天血清RSV-PRNT的动物，具有基本上相同的组平均RSV-PRNT，并且关于初免病毒的身份和性别比加以平衡(表8)。
表8.在初免后约2个月进行加强的AGM的组分配(实验#1)。
a在加强前两周收集血清，并且在添加补体的情况下用RSV PRN测定进行分析。值是单独动物的值。
b在加强后两周收集血清，并且在添加补体的情况下用RSV PRN测定进行分析。值是单独动物的值。
在第51天，用RSV 276对一组进行加强，并用DS-Cav1/B3TMCT载体对另一组进行加强。收集NP、TL和血清试样以评价病毒脱落和免疫原性(图15B-图15E)。在NP中在一天仅以痕量检测到RSV 276的脱落，并且在TL中未检测到RSV 276的脱落。很明显，RSV 276的极低脱落是由于RSV初免的动物中RSV特异性免疫的限制所致，因为在前一实验中，用RSV 276感染四只RSV血清阴性AGM在10天时间段中导致显著病毒脱落，其中在NP和TL中最高峰值平均滴度接近3.0log10 PFU/ml(图19)。相比之下，在NP和TL二者中在10天中DS-Cav1/B3TMCT载体的脱落是显著的，其峰值平均滴度在NP中为大约5.0log10TCID50/ml，且在TL中为3.4log10TCID50/ml(图15B和图15C)。
用补体测量的所有12只动物的平均加强前血清RSV-PRNT为1:256(图15D)。相对于加强前滴度，用RSV 276和DS-Cav1/B3TMCT载体进行加强将用补体测量的血清RSV-PRNT分别增加22倍和91倍，分别增加至1:5,793和1:23,170的峰值平均滴度(在加强后第14天出现)，它们是显著不同的(图15D)。所述载体的峰值平均加强后血清RSV-PRNT比RSV 276大4倍。
在不存在补体的情况下测量，所有12只动物的平均加强前血清RSV-PRNT为1:12(图15E)。用RSV 276和DS-Cav1/B3TMCT载体进行加强将所述滴度分别增加25倍和366倍，分别增加至1:294和1:4,390的峰值平均滴度(在加强后第14天出现；图15E)，它们是显著不同的。所述载体的峰值平均加强后血清RSV-PRNT比RSV 276大15倍。因此，所述载体的加强作用强于RSV 276，特别是对于不使用补体检测到的“优质”中和抗体。
AGM实验#2：在用RSV初免后约6个月(6个月加九天)对AGM的加强免疫。可获得二十只预先接受使用以下五种RSV之一的单一初免免疫的其他AGM(表9)：(i)RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII，一种M2-2缺失突变体；(ii)RSV LID/ΔNS2/1030s，一种NS2缺失突变体，具有在L聚合酶中的遗传稳定的温度敏感性(ts)突变；(iii)RSV LID/ΔNS1，一种NS1缺失突变体，其也是实验#1中的初免病毒之一，但是在不同的AGM中；(iv)RSV LID/F1BBG2/ΔNS1/，前述LID/ΔNS1突变体的一种形式，其中F基因进行密码子优化用于增加翻译，并且将F和G基因分别移动至第1和第2基因组位置，用于增加表达；以及(v)RSV 276(上文所述)，其也是所述加强中使用的减毒ΔM2-2 RSV，如前所述。
表9在初免后约6个月进行加强的AGM的组分配(实验#2)。
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a在添加补体的情况下用RSV PRN测定分析在加强之前35天收集的血清。值是单独动物的值。b在添加补体的情况下用RSV PRN测定分析在加强后两周收集的血清。值是单独动物的值。
在初次免疫后，在第28天和第154天收集血清并在存在补体的情况下分析以测量RSV-PRNT，以及确认HPIV3血清阴性(发现一只动物，即#AG 8960[表9]，是HPIV3血清阳性的，因此被分配为通过RSV而非rB/HPIV3载体来加强)。将所述20只AGM再分配为三组(n＝6、7和7)，进行组织以平衡第154天血清RSV-PRNT、初免病毒的身份和性别比(表9)。在初免后第189天(6个月加九天)，用RSV 276、DS-Cav1载体或DS-Cav1/B3TMCT载体对所述三组进行加强。收集NP、TL和血清试样以评价病毒脱落和免疫原性(图16)。
RSV 276的脱落在NP中通过免疫噬斑测定是无法检测的(图16B)，而在TL中存在RSV276的低散在性检测(图16C)。通过RT-qPCR(其检测正义和负义RSV M RNA二者)对多个动物的TL试样的评价更灵敏，产生更大数量的对RSV RNA呈阳性的样品，且滴度高达450-5,500RNA分子/ml(图20)。相比之下，通过有限稀释测定在NP和TL中在8至10天的时间段中大量检测到DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体的脱落，其峰值平均滴度类似，在NP中为大约5.5log10 TCID50/ml且在TL中为5.0log10 TCID50/ml。DS-Cav1/B3TMCT载体的复制似乎略慢于DS-Cav1载体，但是此差异在TL中仅在第2天和第4天是显著的(图16C)。所述两种载体最终达到类似的峰值NP和TL滴度(图16B和图16C)。
在通过中和测定用补体测量时(图16D)，在20只AGM中通过用减毒RSV初次免疫诱导的平均血清RSV-PRNT在第28天接近10Log2(1:1,024)(图16D)，然后在第189天在给予所述加强时降低至1:64。用RSV 276、DS-Cav1载体和DS-Cav1/B3TMCT载体进行加强将用补体测量的峰值平均血清RSV-PRNT分别增加78倍、260倍和776倍，分别增加至1:4,973、1:16,615和1:49,667的峰值平均滴度(在加强后14天出现；图16D)，它们对于每种载体相比于RSV276是显著不同的。DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体的峰值平均加强后血清RSV-PRNT分别比RSV 276高3倍和10倍。DS-Cav1/B3TMCT载体的免疫原性似乎略高于DS-Cav1，但如上所述其复制略慢，这可能是由于B3TMCT修饰所致，但是所述差异在统计学上不显著(图16D)。
在通过PRN测定不使用补体测量时(图16E)，所述20只AGM中的平均加强前血清RSV-PRNT为1:8。使用RSV 276、DS-Cav1载体和DS-Cav1/B3TMCT载体进行的加强将峰值平均血清RSV-PRNT分别增加37倍、315倍和446倍，分别增加至1:294、1:2,521和1:3,565的滴度(在加强后14天出现)，它们对于每种载体相比于RSV 276是显著不同的。DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体的峰值平均加强后血清RSV-PRNT比RSV 276高9倍和12倍。
在不添加补体的情况下使用HPIV3中和测定来比较使用DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体进行的加强诱导血清HPIV3中和抗体的能力(图21)。注意，所述动物在所述加强前对于HPIV3是血清阴性的，因此这些接种关于HPIV3是初次免疫。所述两种载体诱导非常相似的峰值平均血清HPIV3-PRNT(分别为1:724和1:776，在接种后第14天出现)，表明它们对HPIV3的免疫原性基本上等同。这与如下观察一致：所述两种载体在AGM中复制至相似的峰值滴度(图16B和图16C)。
还评估相比于RSV 276，使用DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体进行的加强诱导结合RSV DS-Cav1 F蛋白的血清和黏膜IgA抗体的能力(图16F和图16G)。使用高灵敏度DELFIATRF免疫测定来检测猴IgA与作为抗原的纯化的重组RSV DS-Cav1 F蛋白的结合。在DELFIATRF测定中，IgA滴度表示为产生400个荧光单位的log2稀释度。使用所述两种载体进行的加强诱导强血清IgA反应：使用所述两种载体进行加强后的峰值平均滴度是相同的(19.5log2)并且比通过使用RSV 276进行的加强诱导的那些(15.6log2)高约16倍。在加强后14天检测到峰值血清IgA反应，与峰值血清RSV中和抗体反应一致。因为呼吸道黏膜抗体反应被认为在限制RSV感染中特别有效，还评价对所述加强的鼻黏膜IgA反应。使用吸收性膜(SAM条带)来收集鼻黏膜衬液。该方法提供相对浓的黏膜样品，适合于检测IgA(图16G)。在所有组中，黏膜IgA反应的峰值出现在所述加强后第14天(图16G)，与血清IgA(图16F)和血清RSV中和抗体(图16D和图16E)的峰值一致。同样，DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体诱导类似地强的反应(峰值平均滴度分别为12.1和12.8log2)，而对RSV 276的反应低约8倍(峰值平均滴度为9.2log2)。因此，DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体在其加强对RSV pre-F蛋白的血清和黏膜IgA抗体反应的能力方面明显超过RSV 276。
AGM实验#3：在用RSV初免后约15个月(15个月减七天)对AGM的加强免疫。可获得四只预先已经接受使用RSV 276的单一初次免疫的其他AGM(表10)。在原发性感染后第429天(以及加强前两周)，收集血清并在存在补体的情况下分析以确定RSV-PRNT，并且确认HPIV3血清阴性。将所述AGM分配为两组(每组n＝2)，将其关于血清RSV-PRNT和性别比加以平衡(表10)。在原发性感染后第443天(15个月减七天)，用RSV 276或DS-Cav1/B3TMCT载体对所述两组进行加强，并且如上所述监测病毒复制和血清学反应。
表10.在初免后约15个月进行加强的AGM的组分配(实验#3)。
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a在加强前两周收集血清，并且在添加补体的情况下用RSV PRN测定进行分析。值是单独动物的值。
b在加强后两周收集血清，并且在添加补体的情况下用RSV PRN测定进行分析。值是单独动物的值。
在约15个月的间隔后RSV 276的复制高度受限，通过对NP和TL的免疫噬斑测定没有检测到病毒，而DS-Cav1/B3TMCT载体的复制是稳健的(图17B和图17C)。
用补体测量的四只动物的平均加强前血清RSV-PRNT为1:33(图17D)。用RSV 276和DS-Cav1/B3TMCT载体进行的加强将在存在补体的情况下测量的峰值平均血清RSV-PRNT分别增加216倍和926倍，分别增加至1:7,132和1:30,574的滴度(在第14天出现，图17D)。所述载体的峰值平均加强后血清RSV-PRNT比RSV 276高4倍。
不使用补体测量的四只动物的平均加强前血清RSV-PRNT为1:6(图17D)。用RSV276和DS-Cav1/B3TMCT载体进行的加强将峰值平均血清RSV-PRNT分别增加171倍和1,274倍，分别增加至1:1,024和1:7,643的滴度(在第14天出现，图17E)。所述载体的峰值平均加强后血清RSV-PRNT比RSV 276高7倍。
RSV血清抗体在体外阻抑DS-Cav1/B3TMCT载体复制。因为仓鼠中DS-Cav1/B3TMCT载体的复制在NT中由于来自原发性感染的RSV特异性免疫而显著减少(图14B-图14D)，所以研究该载体的复制在体外是否会被RSV中和抗体抑制。将LLC-MK2细胞用空rB/HPIV3载体或者用DS-Cav1或DS-Cav1/B3TMCT载体以0.01的MOI感染，然后在不存在添加补体的情况下将其与含有10％热灭活(56℃持续30min)血清的培养基一起孵育，所述血清来自未感染的仓鼠或者来自被RSV D46或rB/HPIV3感染的仓鼠(来自图14中的实验)(图18)。通过连续三天每天取小等份培养基上清液用于病毒滴定来监测在存在添加仓鼠血清的情况下载体的复制。
如所预期，rB/HPIV3免疫血清完全抑制所有三种载体构建体的复制(图18A-图18C，黑色曲线)，而在初次免疫之前收集的免疫前血清对任何构建体的复制没有影响(图18A-图18C)。RSV免疫血清对空rB/HPIV3载体(图18A)或DS-Cav1载体(图18B)的复制没有影响，但是它到第2天和第3天显著减少DS-Cav1/B3TMCT载体的复制，到第3天减少100倍(图18C)。这些结果表明，RSV特异性血清抗体抑制DS-Cav1/B3TMCT载体的复制，但是不抑制DS-Cav1载体的复制。
讨论
用于开发儿童RSV疫苗的非限制性方法包括(i)RSV的减毒衍生物，以及(ii)从添加的基因表达RSV F蛋白的rB/HPIV3。两种方法都提供目前在针对初次免疫的评价下有前景的候选者，但是它们对于加强免疫的有用性还不太清楚。在先前的儿童临床研究中，在几个月中以连续剂量施用的加强免疫中，作为候选疫苗的活减毒RSV是无效的(至少关于诱导RSV特异性血清抗体的增加)。例如，在将称为MEDI-559的活减毒RSV以三个连续剂量以2个月间隔给予婴儿和幼儿时，在已经“服用”前一剂量的那些受试者中，第二和第三剂量通常感染性弱且在加强血清抗体反应中是无效的(参见Malkin等人2013.Safety andimmunogenicity of a live attenuated RSV vaccine in healthy RSV-seronegativechildren 5to 24months of age.PLoS One 8:e77104)。在将活减毒RSV cpts248/404以两个连续剂量以4-6周的间隔给予婴儿和幼儿时，也有类似的发现(参见Wright等人2000.Evaluation of a live,cold-passaged,temperature-sensitive,respiratorysyncytial virus vaccine candidate in infancy.J Infect Dis 182:1331-42)。对于以连续剂量以长达6个月的间隔给予的PIV3的减毒形式，也有类似的发现。因此，在“同源”初免-加强(即，同一疫苗病毒的连续剂量)中，至少在6个月或更短的时间间隔内，减毒RSV(或PIV3)通常仅对于首次“服用”具有感染性和对于血清病毒中和抗体的显著免疫原性。偶然地，在用RSV D46而非减毒RSV进行继发性感染时，情况是不同的。具体而言，在受试者在夏季期间接受减毒RSV并在随后的冬季期间自然暴露于社区RSV D46的疫苗试验中，存在血清RSV-PRNT的20至40倍加强(参见Karron等人2015.A gene deletion that up-regulatesviral gene expression yields an attenuated RSV vaccine with improved antibodyresponses in children.Sci Transl Med 7:312ra175)。因此，重复剂量的减毒RSV的弱免疫原性似乎主要由于其减毒所致。
本发明研究研究“异源”初免-加强策略。在此策略中，使用RSV的初次免疫通过使用从添加的基因表达RSV F蛋白的rB/HPIV3的二次免疫而被加强。RSV F蛋白通过DS-Cav1突变在pre-F构象中基本上稳定，并且在每个实验中使用的DS-Cav1/B3TMCT载体的情形中含有B3TMCT修饰，所述B3TMCT修饰介导将RSV F有效包装至载体病毒粒子中。尽管rB/HPIV3载体本身在抗原性上与RSV不同，但是它确实表达RSV抗原(在此情形中为F蛋白)。这可能被RSV特异性免疫靶向，所述RSV特异性免疫包括RSV特异性血清抗体，如在本发明研究中所测量，以及历史上未充分表征的其他效应子，包括RSV特异性黏膜抗体和细胞免疫。关于RSV特异性抗体，与通过所述载体表达的RSV F的结合大概不会直接阻断载体感染和扩散，因为在此项研究中，RSV F对于融合由于DS-Cav1突变而在很大程度上是无功能的，因此可能对载体复制和扩散的贡献极小或无贡献。然而，载体感染的细胞中RSV F的表达可能靶向那些细胞以供通过细胞毒性T细胞或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性加以破坏。另外，如所述，在本发明研究的所有实验中使用的DS-Cav1/B3TMCT载体表达有效包装于载体病毒粒子中的RSV F蛋白的B3TMCT形式，并且这可能靶向所述载体病毒粒子以供如通过调理作用加以破坏。抗体与包装的RSV F的结合可能也产生位阻，从而在附着和进入期间干扰载体HN和F蛋白。也有可能的是，针对RSV F的抗体反应可能被预先存在的F特异性抗体阻抑。
在仓鼠中评估同源和异源加强。在给予仓鼠使用RSV D46的原发性感染和约6周后使用RSV D46的同源加强感染时，在收获的NT和肺组织中没有可检测的感染性RSV，与RSV特异性免疫会严重限制RSV加强的复制的预期一致。然而，在添加或不添加补体的情况下测量的血清RSV-PRNT有显著的约3倍增加，表明发生了一些感染和抗原表达。在用空rB/HPIV3载体加强的仓鼠中，在RSV初免的动物与未初免动物之间NT和肺中的病毒滴度没有差异，显示RSV特异性免疫确实没有限制rB/HPIV3主链。相比之下，DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体的复制在RSV初免的动物与未初免动物中展现适度的限制，但是所述差异仅在NT中的DS-Cav1/B3TMCT载体的情形中是显著的。这表明，RSV F蛋白的未包装形式的表达导致RSV特异性免疫对载体的边缘性限制，并且RSV F蛋白的包装形式的表达导致略微更大的限制。这与RSV初免的仓鼠与未初免仓鼠中DS-Cav1/B3TMCT载体(但并非DS-Cav1载体)对血清HPIV3中和抗体的诱导的显著降低相关，从而提供减少的DS-Cav1/B3TMCT载体复制的另一指示。在RSV初免的仓鼠中，DS-Cav1和DS-Cav1/B3TMCT载体诱导用补体测定的血清RSV-PRNT的8倍和6倍增加，与之相比RSV D46为3倍；在不用补体测定时，所述增加分别为9倍和18倍相比于3倍。所述载体的用和不用补体测定的所得峰值平均加强后血清RSV-PRNT显著大于RSVD46。因此，仓鼠中的这些结果显示，(i)使用RSV D46的同源加强高度受限且具有适度免疫原性；(ii)空rB/HPIV3载体不受RSV特异性免疫限制；(iii)rB/HPIV3的RSV F表达赋予对RSV特异性免疫所致限制的低敏感性水平，所述限制在将RSV F包装至载体病毒粒子中时变得显著，并且(iv)使用所述载体的加强的免疫原性显著高于使用RSV D46。
还在预先进行原发性RSV感染的AGM中评价加强。评价在所述原发性RSV感染与所述加强之间的三个不同的时间间隔：约2个月、约6个月和约15个月。预期加强前宿主免疫可能随着间隔时间延长而减小，这可能影响所述加强的效率。实际上，平均加强前血清RSV-PRNT在约2个月组、约6个月组和约15个月组中逐渐减小，其用补体测量的相应滴度为1:256、1:64和1:33，并且不用补体测量的相应滴度为1:12、1:8和1:6。合理地推定，通过原发性RSV感染诱导的其他免疫效应子(如黏膜抗体和细胞免疫)也随时间而减少。
RSV 276加强的复制在每个时间间隔后高度且几乎同等受限，仅有脱落的感染性病毒的散在性痕迹。因此，在高度限制该减毒RSV的能力方面，在所述时间间隔之间不存在差异。尽管感染性RSV的脱落高度受限，可能存在一些病毒感染和抗原表达，导致观察到的二次免疫应答。这受到了在检测病毒核酸的脱落的实验#2中进行的RT-qPCR的支持，其中可能已经包括被分泌型抗体中和且未通过感染性测定检测到的后代病毒。
与RSV相反，DS-Cav1/B3TMCT载体稳健地复制。NP和TL中载体的峰值平均滴度对于实验#2和实验#3非常相似，范围为4.8至5.4log10 TCID50/ml。DS-Cav1/B3TMCT载体的脱落的该水平与先前在RSV血清阴性和HPIV3血清阴性的恒河猴中观察到的类似(参见Liang等人2017.Improved Prefusion Stability,Optimized Codon Usage,and AugmentedVirion Packaging Enhance the Immunogenicity of Respiratory Syncytial VirusFusion Protein in a Vectored-Vaccine Candidate.J Virol 91)，表明在约6个月和约15个月时间间隔后，预先存在的针对RSV的免疫对所述载体几乎没有限制。相比之下，对于实验#1(约2个月时间间隔)，脱落的DS-Cav1/B3TMCT载体的滴度在NP中低大约0.5log10TCID50/ml，并且在TL中低1.4至1.8log10 TCID50/ml(表11)。这可能表明，在最短间隔后，此载体的RSV F表达以及将RSV F包装至载体病毒粒子中赋予对RSV特异性免疫的限制的适度敏感性，所述限制与RSV初免的仓鼠与未初免仓鼠中对DS-Cav1/B3TMCT载体的限制类似。因为由原发性感染诱导的细胞免疫可能仅持续几个月，如上文针对仓鼠模型所述，这可能有助于在约2个月而非在约6个月和约15个月观察到的对DS-Cav1/B3TMCT载体的限制。然而，无论如何，在约2个月间隔后的限制较小且在统计学上不显著。
表11.在2个月、6个月和15个月研究同龄组中，用DS-Cav1/B3TMCT加强的AGM中的加强前血清RSV中和滴度以及加强后复制和RSV中和抗体的峰值平均滴度
a在加强前两周(约2个月和约15个月研究)或35天(约6个月研究)收集血清，并在添加补体的情况下通过RSV PRN测定加以分析且表示为平均log2,PRNT。b在加强后分别每天和每隔一天收集NP和TL，持续10天，并通过有限稀释进行滴定。滴度表示为TCID50/ml。计算每天的平均值，并显示每种病毒的峰值平均滴度。c在加强后两周收集血清，并使用或不使用补体通过RSV PRN测定加以分析，如所指示，且滴度表示为平均log2PRNT。
为了研究AGM中与将RSV F蛋白包装至载体病毒粒子中相关的可能限制，在AGM实验#2(在初免后约6个月间隔)中将DS-Cav1/B3TMCT载体(其有效包装RSV F)的加强后复制与DS-Cav1载体(其对于包装非常低效)的加强后复制进行比较。与DS-Cav1载体相比，DS-Cav1/B3TMCT载体的复制可能假设地由于以下原因而有所减少：(i)由于将RSV F蛋白包装至载体病毒粒子中而干扰载体复制，和/或(ii)由于RSV特异性免疫被靶向至包装的RSV F蛋白所致的限制，如上文所述。DS-Cav1/B3TMCT载体复制的动力学略微慢于DS-Cav1载体，但是所述差异不大并且仅在TL中对于第2天和第4天是显著的，并且两种载体的峰值滴度是类似的。我们确实发现，在细胞培养中(在不存在补体的情况下)，RSV特异性仓鼠抗血清抑制DS-Cav1/B3TMCT载体的复制，但不抑制DS-Cav1或空载体的抑制。在该体外环境中，所述抑制可能是由于抗体与包装在载体病毒粒子中的RSV F的结合所致，并且可能并未完全概括可能在体内运转的一种或多种机制。
在约2个月、约6个月和约15个月的间隔后使用RSV 276进行的加强导致使用补体测量的峰值平均血清RSV-PRNT分别增加22倍、78倍和216倍，从而导致峰值平均滴度为1:5,793、1:4,973和1:7,132。在不使用补体测量时，峰值平均血清RSV-PRNT的相应增加为25倍、37倍和171倍，并且导致峰值平均滴度为1:294、1:294和1:1,024。因此，在不同的时间间隔之间加强后血清RSV-PRNT通常是类似的，但是与其他间隔相比，在约15个月间隔后的滴度略微更高(使用补体测量为1倍，并且不使用补体测量为3.5倍)。
对于DS-Cav1/B3TMCT载体，在约2个月、约6个月和约15个月间隔后的加强导致用补体测量的峰值平均血清RSV-PRNT分别增加91倍、776倍和926倍，导致峰值平均加强后血清RSV-PRNT为1:23,170、1:49,667和1:30,574。在不用补体测量时，所属相应增加为366倍、446倍和1,274倍，导致峰值平均加强后血清RSV-PRNT为1:4,390、1:3,565和1:7,643。因此，在不同的时间间隔之间加强后滴度通常是类似的，其差异不大于2倍且对于任何间隔是不一致的。
当在AGM实验#2中比较时，与DS-Cav1载体相比，用DS-Cav1/B3TMCT载体进行的加强诱导大3倍的用补体测量的血清RSV-PRNT，以及大1.4倍的不用补体测量的滴度。在仓鼠研究中，与DS-Cav1载体相比，用DS-Cav1/B3TMCT载体进行的加强仅对于不用补体测量的血清RSV-PRNT而言更大，且仅大2倍。
在AGM实验中，所述载体的峰值平均加强后血清RSV-PRNT特别高：使用和不使用补体测定，分别高达1:49,667和1:7,643。这提高了如下可能性：一些使用所述载体的更大加强的情况由于对免疫应答的量值的限制而可能被钝化。在使用补体测定时，所述载体的滴度高于RSV 276(3倍至10倍)，并且所述差异在不使用补体测定时甚至更大(7倍至15倍)。与RSV 276相比，两种载体还诱导显著更大的血清和黏膜IgA的反应，在所述两种载体之间几乎没有差异。通过所述载体进行的加强与RSV相比更大的免疫原性可能反映其二者更高的复制水平(和所得更大的抗原表达)以及对RSV F蛋白的DS-Cav1和B3TMCT修饰。
因为对RSV的免疫应答在婴儿期期间有所减小，可能重要的是在用儿童RSV疫苗进行初次免疫后加强RSV特异性免疫。在该研究中，使用具有DS-Cav1和B3TMCT修饰的表达RSVF的减毒PIV载体进行的加强的免疫原性显著高于使用减毒RSV进行的加强，特别是对于在不添加补体的情况下在体外中和的“优质”RSV中和抗体。不论初免与加强之间的间隔是约2个月、约6个月还是约15个月，结果是类似的。这表明，PIV载体可以在同一疫苗接种季节期间或者可替代地在下一年期间有效进行加强。另外，以PIV为载体的RSV疫苗可能非常适合于小婴儿的初次免疫，所述小婴儿具有来自母体转移(包括在母体免疫后)或来自被动抗体免疫预防(包括使用工程化以延长半衰期的抗体)的被动血清RSV中和抗体。这些被动抗体可能限制减毒RSV，但不限制以PIV为载体的RSV疫苗。减毒PIV3载体的使用还提供针对HPIV3的免疫，HPIV3作为重度急性儿童呼吸道疾病的因子仅次于RSV。
材料和方法
病毒。此实施例中的RSV是使用反求遗传学制备的亚组A毒株A2(GenbankKT992094)的重组(r)野生型(wt)或减毒形式(Collins等人1995.Production ofinfectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms anessential role for the transcription elongation factor from the 5'proximalopen reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides acapability for vaccine development.Proc Natl Acad Sci U S A92:11563-7)。减毒RSV描述于结果章节中。一种另外的RSV是rRSV A/Maryland/001/11，其为从在2011年从患有急性呼吸道疾病的成人收集的鼻洗液分离的wt亚组A毒株RSV A/Maryland/001/11的重组形式。Maryland/001/11毒株的F和G蛋白具有与毒株A2的97％和86％的氨基酸序列同一性。rB/HPIV3构建体先前已有描述(Liang等人2017.Improved Prefusion Stability,Optimized Codon Usage,and Augmented Virion Packaging Enhance theImmunogenicity of Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein in a Vectored-Vaccine Candidate.J Virol 91)，并且从第二基因位置中添加的基因表达RSV毒株A2(Genbank KT992094)的F蛋白的修饰形式。所述载体构建体为：(i)rB/HPIV3，其为空载体；(ii)rB/HPIV3/DS-Cav1(缩写为DS-Cav1载体)，其表达在pre-F构象中的稳定性由于DS和Cav1突变而增加的RSV F蛋白(McLellan等人2013.Structure-based design of a fusionglycoprotein vaccine for respiratory syncytial virus.Science 342:592-8)；以及(iii)rB/HPIV3/DS-Cav1/B3TMCT(缩写为DS-Cav1/B3TMCT载体)，其表达具有DS-Cav1突变且其TM和CT结构域被BPIV3 F的那些TM和CT结构域替代的RSV F。另外，如先前所述，所述载体构建体中使用的RSV F ORF已经通过密码子优化来修饰(GenScript，皮斯卡塔韦，新泽西州)，并且通过称为HEK的两个氨基酸取代(K66E和Q101P)进一步修饰，所述氨基酸取代使F在氨基酸水平上与RSV毒株A2的早期传代相同。
使RSV和rB/HPIV3载体在32℃下分别在Vero和LLC-MK2细胞中生长。通过未克隆的RT-PCR产物的自动化Sanger测序分析确认所有病毒的完整基因组序列不含高于背景的可检测的外来突变(除了分别位于3'端和5'端的约30个和约120个核苷酸外，其包括引物结合位点并且不进行测序)。
感染性病毒和血清抗体的滴定。使用三种F特异性单克隆抗体的混合物用免疫染色在Vero细胞中通过噬斑测定来确定RSV制剂的滴度，如先前所述(Luongo等人2013.Respiratory syncytial virus modified by deletions of the NS2 gene andamino acid S1313 of the L polymerase protein is a temperature-sensitive,live-attenuated vaccine candidate that is phenotypically stable at physiologicaltemperature.J Virol 87:1985-96)；滴度报告为log10噬斑形成单位(PFU)/ml或g。在LLC-MK2细胞中通过有限稀释来确定rB/HPIV3载体的滴度，并且用豚鼠红细胞通过血细胞吸附来检测病毒阳性孔，如先前所述(Durbin等人1999.Mutations in the C,D,and V openreading frames ofhuman parainfluenza virus type 3attenuate replication inrodents and primates.Virology 261:319-30)；滴度报告为log10 50％组织培养感染性剂量(TCID50)/ml或g。
使用表达绿色荧光蛋白(GFP)的RSV或HPIV3通过对Vero细胞的60％噬斑减少中和(PRN)测定来确定血清RSV或HPIV3中和抗体滴度(Liang等人2014.Chimeric bovine/humanparainfluenza virus type 3expressing respiratory syncytial virus(RSV)Fglycoprotein:effect of insert position on expression,replication,immunogenicity,stability,and protection against RSV infection.J Virol 88:4237-50)。所述测定是如所述在存在(RSV)或不存在(RSV、HPIV3)5％添加的豚鼠补体(Cedarlane，伯灵顿，北卡罗来纳州)的情况下进行。60％噬斑减少中和滴度(PRNT)报告为log2和/或算术值。在原发性感染之前，分别通过使用补体的PRN测定或使用豚鼠红细胞的血细胞凝集抑制测定来确认动物是RSV或HPIV3血清阴性的(Coates等人1966.Anantigenic analysis of respiratory syncytial virus isolates by a plaquereduction neutralization test.Am J Epidemiol 83:299-313；van Wyke Coelingh等人1988.Attenuation of bovine parainfluenza virus type 3in nonhuman primates andits ability to confer immunity to human parainfluenza virus type 3challenge.JInfect Dis157:655-62)。
动物研究。动物研究是根据国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南(Guidefor Care and Use of Laboratory Animals)来进行，并且由NIAID动物护理和使用委员会批准。
在叙利亚黄金仓鼠中进行单一初免-加强实验，如图14的图例和所附结果章节中所述。
在非洲绿猴中进行三项初免-加强实验(分别为AGM实验#1-#3，表8-表10，以及图15-图17)。使用RSV的原发性AGM感染是使用多种不同的RSV来进行，所述RSV大多是RSV毒株A2的减毒衍生物并且描述于结果章节和表8-表10中。在那些研究中，RSV是通过组合的IN/气管内(IT)途径以1ml L-15培养基中的106PFU的每部位剂量来施用。在本发明研究中使用RSV或DS-Cav1/B3TMCT或DS-Cav1载体在AGM中进行的加强感染是以相同方式，通过组合IN/IT途径，以1ml L-15培养基中的106PFU(RSV)或106TCID50(载体)的每部位剂量来施用。在接种后，分别每天和每隔一天收集鼻咽拭子(NP)和气管灌洗液(TL)，持续10天，并且将其在干冰上速冻且储存于-80℃直至滴定。在加强当天在接种前以及在之后连续四周中每七天收集血清。
在AGM实验#2中，在加强当天以及在加强后第14天、第21天和第28天，使用合成吸附基质(SAM)条带(Nasosorption FXi，Hunt Developments，英国)对鼻黏膜衬液进行取样。将SAM条带缓慢地置于一个鼻孔的下鼻甲的鼻黏膜上，保持就位30秒，并将其置入预填充300μl含有3％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％ Tween 20的磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)的微型管中。将样品在干冰上速冻并保持在-80℃直至使用。通过如下所述的解离增强的镧系元素荧光免疫测定(DELFIA)来确定黏膜和血清IgA滴度。
通过专用于正义和负义RSV M基因序列的逆转录定量PCR测定(RT-qPCR)对AGM TL样品中的RSV RNA拷贝数进行定量。将冷冻的AGM TL样品在37℃水浴中短暂解冻并立即保持在冰上。在通过在4℃下以800g离心5min来澄清后，使用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(Qiagen)提取TL样品中的总RNA。使用Applied Biosystem RT试剂盒(ThermoFisherScientific)以随机六聚体引物通过逆转录生成cDNA，并通过M特异性qPCR加以分析。对于比较，使用编码wt RSV A2毒株(LID)的全长基因组的DNA质粒生成标准曲线，通过相同qPCR测定加以分析。从所述标准曲线内插TL样品中逆转录的RSV RNA的拷贝数。使用GraphPadPrism 8版(GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)进行统计学分析。
使用解离增强的镧系元素荧光免疫测定(DELFIA)对IgA抗体的检测。通过DELFIA免疫测定来检测血清和黏膜IgA。简言之，在HEK293细胞中表达重组RSV DS-Cav1 F蛋白并且如先前所述来纯化(McLellan等人2013.Structure-based design of a fusionglycoprotein vaccine for respiratory syncytial virus.Science 342:592-8)。将96孔DELFIA黄色板(Perkin Elmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)用稀释于100μl碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(Millipore Sigma，圣路易斯，密苏里州)中的100ng/孔的纯化的RSV DS-Cav1 F蛋白涂布，并在4℃下孵育过夜。所述测定中的所有洗涤都是用200μl/孔的洗涤缓冲液(1XDELFIA浓缩洗涤液，Perkin Elmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)进行一次。在过夜抗原涂布后，将板洗涤并与100μl/孔的阻断溶液(含有0.1％ Tween-20和3％ BSA的PBS)在37℃下一起孵育1h。洗涤板并添加100μl在阻断溶液中4倍连续稀释的血清样品，并在4℃下孵育过夜。在洗涤后，添加100μl/孔的以1:5000稀释于阻断溶液中的抗猴IgA生物素缀合物(AlphaDiagnostic，圣安东尼奥，得克萨斯州)并在37℃下孵育1h。洗涤板并添加100μl/孔的以1:2000稀释于DELFIA测定缓冲液(Perkin Elmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中的铕(Eu)缀合的链霉亲和素。在37℃下孵育1h后，洗涤板并与100μl/孔的DELFIA增强溶液(Perkin Elmer)在室温和温和振荡下一起孵育20分钟。使用Eu特异性时间分辨荧光(TRF)程序(340nm激发，615nm发射)在Synergy Neo 2读板器(BioTek，威努斯基，佛蒙特州)中测量荧光。使用阻断溶液生成空白值，并使用24个空白值的平均值加3个标准差作为截止值(对应于400个荧光单位)。使用GraphPad Prism 8版(GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)从S形标准曲线内插对应于400个荧光单位的测试样品稀释度并表示为log2值。
将明显的是，可以在不背离所述实施方案的精神的情况下改变或修改所述方法或组合物的精确细节。我们要求所有这样的修改或改变落入以下权利要求书的范围和精神内。
序列表
<110> 美利坚合众国- 由健康及人类服务部部长代表
<120> 活减毒呼吸道合胞病毒
<130> 9668-100351-02
<150> US63/035,617
<151> 2020-06-05
<160> 29
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 15223
<212> DNA
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 1
acgggaaaaa atgcgtacaa caaacttgca taaaccaaaa aaatggggca aataagaatt 60
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atggaacaag ttgttgaggt ttatgaatat gcccaaaaat tgggtggtga agcaggattc 2040
taccatatat tgaacaaccc aaaagcatca ttattatctt tgactcaatt tcctcacttc 2100
tccagtgtag tattaggcaa tgctgctggc ctaggcataa tgggagagta cagaggtaca 2160
ccgaggaatc aagatctata tgatgcagca aaggcatatg ctgaacaact caaagaaaat 2220
ggtgtgatta actacagtgt actagacttg acagcagaag aactagaggc tatcaaacat 2280
cagcttaatc caaaagataa tgatgtagag ctttgagtta ataaaaaatg gggcaaataa 2340
atcatcatgg aaaagtttgc tcctgaattc catggagaag atgcaaacaa cagggctact 2400
aaattcctag aatcaataaa gggcaaattc acatcaccca aagatcccaa gaaaaaagat 2460
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aattcaacta ttatcaaccc aacaaatgag acagatgata ctgcagggaa caagcccaat 2580
tatcaaagaa aacctctagt aagtttcaaa gaagacccta caccaagtga taatcccttt 2640
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cctacatctg ctcgggatgg tataagagat gccatggttg gtttaagaga agaaatgata 2880
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cattcttcac ttcaccatca caatcacaaa cactctgtgg ttcaaccaat caaacaaaac 4140
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tatccatctg ttaaaaagat tgccagcaga cgtattgaag aaaaccatca aaaacacatt 8100
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cctctcaaga attgattgac acaattcaaa attttctaca acatctaggt attattgagg 8400
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tacattatta attcaaacaa ttcaagttgt gggacaaaat ggatcccatt attaatggaa 8520
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tcaaatacat tcttagccaa gatgcaagtt tacatagagt aaaaggatgt catagcttca 13320
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aactaaatta cgagatatta gtttttgaca ctttttttct cgt 15223
<210> 2
<211> 14582
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 2
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tgttacggtg gggagtctta gcaaaatcag ttaaaaatat tatgttagga catgctagtg 1440
tgcaagcaga aatggaacaa gttgttgagg tttatgaata tgcccaaaaa ttgggtggtg 1500
aagcaggatt ctaccatata ttgaacaacc caaaagcatc attattatct ttgactcaat 1560
ttcctcactt ctccagtgta gtattaggca atgctgctgg cctaggcata atgggagagt 1620
acagaggtac accgaggaat caagatctat atgatgcagc aaaggcatat gctgaacaac 1680
tcaaagaaaa tggtgtgatt aactacagtg tactagactt gacagcagaa gaactagagg 1740
ctatcaaaca tcagcttaat ccaaaagata atgatgtaga gctttgagtt aataaaaaat 1800
ggggcaaata aatcatcatg gaaaagtttg ctcctgaatt ccatggagaa gatgcaaaca 1860
acagggctac taaattccta gaatcaataa agggcaaatt cacatcaccc aaagatccca 1920
agaaaaaaga tagtatcata tctgtcaact caatagatat agaagtaacc aaagaaagcc 1980
ctataacatc aaattcaact attatcaacc caacaaatga gacagatgat actgcaggga 2040
acaagcccaa ttatcaaaga aaacctctag taagtttcaa agaagaccct acaccaagtg 2100
ataatccctt ttctaaacta tacaaagaaa ccatagaaac atttgataac aatgaagaag 2160
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tagataggat tgatgaaaaa ttaagtgaaa tactaggaat gcttcacaca ttagtagtgg 2280
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ctctcaatcc aacatcagag aaattgaaca acctattgga agggaatgat agtgacaatg 2520
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agaagaccaa caaactaacc aacccaatca tccaaccaaa catccatccg ccaatcagcc 2640
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tatgcgctaa tgtgtccttg gatgaaagaa gcaaactagc atatgatgta accacaccct 3060
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tagaaaaaga aagtatatat tatgttacca caaattggaa gcacacagct acacgatttg 3480
caatcaaacc catggaagat taaccttttt cctctacatc agtgtgttaa ttcatacaaa 3540
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ctcaaataag ttaataaaaa atatacacat ggggcaaata atcattggag gaaatccaac 3720
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aacaataaca ttggggcaaa tgcaaacatg tccaaaaaca aggaccaacg caccgctaag 4080
acattagaaa ggacctggga cactctcaat catttattat tcatatcatc gtgcttatat 4140
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acaactgcaa tcatacaaga tgcaacaagc cagatcaaga acacaacccc aacatacctc 4320
acccagaatc ctcagcttgg aatcagtccc tctaatccgt ctgaaattac atcacaaatc 4380
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caaaacaaac caccaagcaa acccaataat gattttcact ttgaagtgtt caactttgta 4560
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aaaaaaccag gaaagaaaac cactaccaag cccacaaaaa aaccaaccct caagacaacc 4680
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ccacccaaca caccacgcca gtagttactt aaaaacatat tatcacaaaa ggccttgacc 4980
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taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa caagaattag ataaatataa 5280
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tatcatgtcc ataataaaag aggaagtctt agcatatgta gtacaattac cactatatgg 5940
tgttatagat acaccctgtt ggaaactaca cacatcccct ctatgtacaa ccaacacaaa 6000
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catctaggta ttattgagga tatatataca atatatatat tagtgtcata acactcaatt 7800
ctaacactca ccacatcgtt acattattaa ttcaaacaat tcaagttgtg ggacaaaatg 7860
gatcccatta ttaatggaaa ttctgctaat gtttatctaa ccgatagtta tttaaaaggt 7920
gttatctctt tctcagagtg taatgcttta ggaagttaca tattcaatgg tccttatctc 7980
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gaagaaccta cttattttca gtcattactt atgacataca agagtatgac ctcgtcagaa 8160
cagattgcta ccactaattt acttaaaaag ataataagaa gagctataga aataagtgat 8220
gtcaaagtct atgctatatt gaataaacta gggcttaaag aaaaggacaa gattaaatcc 8280
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tcagctgtta aagataatca atctcatctt aaagcagaca aaaatcactc tacaaaacaa 8400
aaagacacaa tcaaaacaac actcttgaag aaattgatgt gttcaatgca acatcctcca 8460
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gacatagtat tccaaaactg tataagcttt ggccttagtt taatgtcagt agtagaacaa 12060
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attggtttat atgtgtatta actaaattac gagatattag tttttgacac tttttttctc 14580
gt 14582
<210> 3
<211> 14348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 3
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acacaatgaa cagtttaaca ttaccaagtg aagtaaatct ctgcaatgtt gacatattca 1260
accccaaata tgattgtaaa attatgactt caaaaacaga tgtaagcagc tccgttatca 1320
catctctagg agccattgtg tcatgctatg gcaaaactaa atgtacagca tccaataaaa 1380
atcgtggaat cataaagaca ttttctaacg ggtgcgatta tgtatcaaat aaaggggtgg 1440
acactgtgtc tgtaggtaac acattatatt atgtaaataa gcaagaaggt aaaagtctct 1500
atgtaaaagg tgaaccaata ataaatttct atgacccatt agtattcccc tctgatgaat 1560
ttgatgcatc aatatctcaa gtcaacgaga agattaacca gagcctagca tttattcgta 1620
aatccgatga attattacat aatgtaaatg ctggtaaatc caccacaaat atcatgataa 1680
ctactataat tatagtgatt atagtaatat tgttatcatt aattgctgtt ggactgctct 1740
tatactgtaa ggccagaagc acaccagtca cactaagcaa agatcaactg agtggtataa 1800
ataatattgc atttagtaac taaagtagtt aattaaaaat ggggcaaata caaccatgtc 1860
caaaaacaag gaccaacgca ccgctaagac attagaaagg acctgggaca ctctcaatca 1920
tttattattc atatcatcgt gcttatataa gttaaatctt aaatctgtag cacaaatcac 1980
attatccatt ctggcaatga taatctcaac ttcacttata attgcagcca tcatattcat 2040
agcctcggca aaccacaaag tcacaccaac aactgcaatc atacaagatg caacaagcca 2100
gatcaagaac acaaccccaa catacctcac ccagaatcct cagcttggaa tcagtccctc 2160
taatccgtct gaaattacat cacaaatcac caccatacta gcttcaacaa caccaggagt 2220
caagtcaacc ctgcaatcca caacagtcaa gaccaaaaac acaacaacaa ctcaaacaca 2280
acccagcaag cccaccacaa aacaacgcca aaacaaacca ccaagcaaac ccaataatga 2340
ttttcacttt gaagtgttca actttgtacc ctgcagcata tgcagcaaca atccaacctg 2400
ctgggctatc tgcaaaagaa taccaaacaa aaaaccagga aagaaaacca ctaccaagcc 2460
cacaaaaaaa ccaaccctca agacaaccaa aaaagatccc aaacctcaaa ccactaaatc 2520
aaaggaagta cccaccacca agcccacaga agagccaacc atcaacacca ccaaaacaaa 2580
catcataact acactactca cctccaacac cacaggaaat ccagaactca caagtcaaat 2640
ggaaaccttc cactcaactt cctccgaagg caatccaagc ccttctcaag tctctacaac 2700
atccgagtac ccatcacaac cttcatctcc acccaacaca ccacgccagt agttaataaa 2760
aaatggggca aatactcgag ttagagatgg acacaaccca caatgataat acaccacaaa 2820
gactgatgat cacagacatg agaccgttgt cacttgagac cataataaca tcactaacca 2880
gagacatcat aacacacaaa tttatatact tgataaatca tgaatgcata gtgagaaaac 2940
ttgatgaaag acaggccaca tttacattcc tggtcaacta tgaaatgaaa ctattacaca 3000
aagtaggaag cactaaatat aaaaaatata ctgaatacaa cacaaaatat ggcactttcc 3060
ctatgccaat attcatcaat catgatgggt tcttagaatg cattggcatt aagcctacaa 3120
agcatactcc cataatatac aagtatgatc tcaatccata aatttcaaca caatattcac 3180
acaatctaaa acaacaactc tatgcataac tatactccat agtccagatg gagcctgaaa 3240
attatagtaa tttaaaactt aaggagagat ataagataga agatggggca aatacaacca 3300
tggctcttag caaagtcaag ttgaatgata cactcaacaa agatcaactt ctgtcatcca 3360
gcaaatacac catccaacgg agcacaggag atagtattga tactcctaat tatgatgtgc 3420
agaaacacat caataagtta tgtggcatgt tattaatcac agaagatgct aatcataaat 3480
tcactgggtt aataggtatg ttatatgcga tgtctaggtt aggaagagaa gacaccataa 3540
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gtcaagacat taatggaaaa gaaatgaaat ttgaagtgtt aacattggca agcttaacaa 3660
ctgaaattca aatcaacatt gagatagaat ctagaaaatc ctacaaaaaa atgctaaaag 3720
aaatgggaga ggtagctcca gaatacaggc atgactctcc tgattgtggg atgataatat 3780
tatgtatagc agcattagta ataactaaat tagcagcagg ggacagatct ggtcttacag 3840
ccgtgattag gagagctaat aatgtcctaa aaaatgaaat gaaacgttac aaaggcttac 3900
tacccaagga catagccaac agcttctatg aagtgtttga aaaacatccc cactttatag 3960
atgtttttgt tcattttggt atagcacaat cttctaccag aggtggcagt agagttgaag 4020
ggatttttgc aggattgttt atgaatgcct atggtgcagg gcaagtgatg ttacggtggg 4080
gagtcttagc aaaatcggtt aaaaatatta tgttaggaca tgctagtgtg caagcagaaa 4140
tggaacaagt tgttgaggtt tatgaatatg cccaaaaatt gggtggtgaa gcaggattct 4200
accatatatt gaacaaccca aaagcatcat tattatcttt gactcaattt cctcacttct 4260
ccagtgtagt attaggcaat gctgctggcc taggcataat gggagagtac agaggtacac 4320
cgaggaatca agatctatat gatgcagcaa aggcatatgc tgaacaactc aaagaaaatg 4380
gtgtgattaa ctacagtgta ctagacttga cagcagaaga actagaggct atcaaacatc 4440
agcttaatcc aaaagataat gatgtagagc tttgagttaa taaaaaatgg ggcaaataaa 4500
tcatcatgga aaagtttgct cctgaattcc atggagaaga tgcaaacaac agggctacta 4560
aattcctaga atcaataaag ggcaaattca catcacccaa agatcccaag aaaaaagata 4620
gtatcatatc tgtcaactca atagatatag aagtaaccaa agaaagccct ataacatcaa 4680
attcaactat tatcaaccca acaaatgaga cagatgatac tgcagggaac aagcccaatt 4740
atcaaagaaa acctctagta agtttcaaag aagaccctac accaagtgat aatccctttt 4800
ctaaactata caaagaaacc atagaaacat ttgataacaa tgaagaagaa tccagctatt 4860
catacgaaga aataaatgat cagacaaacg ataatataac agcaagatta gataggattg 4920
atgaaaaatt aagtgaaata ctaggaatgc ttcacacatt agtagtggca agtgcaggac 4980
ctacatctgc tcgggatggt ataagagatg ccatggttgg tttaagagaa gaaatgatag 5040
aaaaaatcag aactgaagca ttaatgacca atgacagatt agaagctatg gcaagactca 5100
ggaatgagga aagtgaaaag atggcaaaag acacatcaga tgaagtgtct ctcaatccaa 5160
catcagagaa attgaacaac ctattggaag ggaatgatag tgacaatgat ctatcacttg 5220
aagatttctg attagttacc aatcttcaca tcaacacaca ataccaacag aagaccaaca 5280
aactaaccaa cccaatcatc caaccaaaca tccatccgcc aatcagccaa acagccaaca 5340
aaacaaccag ccaatccaaa actaaccacc cggaaaaaat ctataatata gttacaaaaa 5400
aaggaaaggg tggggcaaat atggaaacat acgtgaacaa gcttcacgaa ggctccacat 5460
acacagctgc tgttcaatac aatgtcttag aaaaagacga tgaccctgca tcacttacaa 5520
tatgggtgcc catgttccaa tcatctatgc cagcagattt acttataaaa gaactagcta 5580
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catgtagtct aacatgccta aaatcaaaaa atatgttgac tacagttaaa gatctcacta 5820
tgaagacact caaccctaca catgatatta ttgctttatg tgaatttgaa aacatagtaa 5880
catcaaaaaa agtcataata ccaacatacc taagatccat cagtgtcaga aataaagatc 5940
tgaacacact tgaaaatata acaaccactg aattcaaaaa tgctatcaca aatgcaaaaa 6000
tcatccctta ctcaggatta ctattagtca tcacagtgac tgacaacaaa ggagcattca 6060
aatacataaa gccacaaagt caattcatag tagatcttgg agcttaccta gaaaaagaaa 6120
gtatatatta tgttaccaca aattggaagc acacagctac acgatttgca atcaaaccca 6180
tggaagatta acctttttcc tctacatcag tgtgttaatt catacaaact ttctacctac 6240
attcttcact tcaccatcac aatcacaaac actctgtggt tcaaccaatc aaacaaaact 6300
tatctgaagt cccagatcat cccaagtcat tgtttatcag atctagtact caaataagtt 6360
aataaaaaat atacacatgg ggcaaataat cattggagga aatccaacta atcacaatat 6420
ctgttaacat agacaagtcc acacaccata cagaatcaac caatggaaaa tacatccata 6480
acaatagaat tctcaagcaa attctggcct tactttacac taatacacat gatcacaaca 6540
ataatctctt tgctaatcat aatctccatc atgattgcaa tactaaacaa actttgtgaa 6600
tataacgtat tccataacaa aacctttgag ttaccaagag ctcgagttaa tacttgataa 6660
agtagttaat taaaaacaca attgcatgcc agattaactt accatctgta aaaatgaaaa 6720
ctggggcaaa tatgtcacga aggaatcctt gcaaatttga aattcgaggt cattgcttaa 6780
atggtaagag gtgtcatttt agtcataatt attttgaatg gccaccccat gcactgcttg 6840
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tatcagaaat aagtggagct gcagagttgg acagaacaga agagtatgct cttggtgtag 6960
ttggagtgct agagagttat ataggatcaa taaacaatat aactaaacaa tcagcatgtg 7020
ttgccatgag caaactcctc actgaactca atagtgatga tatcaaaaag ctgagggaca 7080
atgaagagct aaattcaccc aagataagag tgtacaatac tgtcatatca tatattgaaa 7140
gcaacaggaa aaacaataaa caaactatcc atctgttaaa aagattgcca gcagacgtat 7200
tgaagaaaac catcaaaaac acattggata tccataagag cataaccatc aacaacccaa 7260
aagaatcaac tgttagtgat acaaatgacc atgccaaaaa taatgatact acctgacaaa 7320
tatccttgta gtataacttc catactaata acaagtagat gtagagttac tatgtataat 7380
caaaagaaca cactatattt caatcaaaac aacccaaata accatatgta ctcaccgaat 7440
caaacattca atgaaatcca ttggacctct caagaattga ttgacacaat tcaaaatttt 7500
ctacaacatc taggtattat tgaggatata tatacaatat atatattagt gtcataacac 7560
tcaattctaa cactcaccac atcgttacat tattaattca aacaattcaa gttgtgggac 7620
aaaatggatc ccattattaa tggaaattct gctaatgttt atctaaccga tagttattta 7680
aaaggtgtta tctctttctc agagtgtaat gctttaggaa gttacatatt caatggtcct 7740
tatctcaaaa atgattatac caacttaatt agtagacaaa atccattaat agaacacatg 7800
aatctaaaga aactaaatat aacacagtcc ttaatatcta agtatcataa aggtgaaata 7860
aaattagaag aacctactta ttttcagtca ttacttatga catacaagag tatgacctcg 7920
tcagaacaga ttgctaccac taatttactt aaaaagataa taagaagagc tatagaaata 7980
agtgatgtca aagtctatgc tatattgaat aaactagggc ttaaagaaaa ggacaagatt 8040
aaatccaaca atggacaaga tgaagacaac tcagttatta cgaccataat caaagatgat 8100
atactttcag ctgttaaaga taatcaatct catcttaaag cagacaaaaa tcactctaca 8160
aaacaaaaag acacaatcaa aacaacactc ttgaagaaat tgatgtgttc aatgcaacat 8220
cctccatcat ggttaataca ttggtttaac ttatacacaa aattaaacaa catattaaca 8280
cagtatcgat caaatgaggt aaaaaaccat gggtttacat tgatagataa tcaaactctt 8340
agtggatttc aatttatttt gaaccaatat ggttgtatag tttatcataa ggaactcaaa 8400
agaattactg tgacaaccta taatcaattc ttgacatgga aagatattag ccttagtaga 8460
ttaaatgttt gtttaattac atggattagt aactgcttga acacattaaa taaaagctta 8520
ggcttaagat gcggattcaa taatgttatc ttgacacaac tattccttta tggagattgt 8580
atactaaagc tatttcacaa tgaggggttc tacataataa aagaggtaga gggatttatt 8640
atgtctctaa ttttaaatat aacagaagaa gatcaattca gaaaacgatt ttataatagt 8700
atgctcaaca acatcacaga tgctgctaat aaagctcaga aaaatctgct atcaagagta 8760
tgtcatacat tattagataa gacagtgtcc gataatataa taaatggcag atggataatt 8820
ctattaagta agttccttaa attaattaag cttgcaggtg acaataacct taacaatctg 8880
agtgaactat attttttgtt cagaatattt ggacacccaa tggtagatga aagacaagcc 8940
atggatgctg ttaaaattaa ttgcaatgag accaaatttt acttgttaag cagtctgagt 9000
atgttaagag gtgcctttat atatagaatt ataaaagggt ttgtaaataa ttacaacaga 9060
tggcctactt taagaaatgc tattgtttta cccttaagat ggttaactta ctataaacta 9120
aacacttatc cttctttgtt ggaacttaca gaaagagatt tgattgtgtt atcaggacta 9180
cgtttctatc gtgagtttcg gttgcctaaa aaagtggatc ttgaaatgat tataaatgat 9240
aaagctatat cacctcctaa aaatttgata tggactagtt tccctagaaa ttacatgcca 9300
tcacacatac aaaactatat agaacatgaa aaattaaaat tttccgagag tgataaatca 9360
agaagagtat tagagtatta tttaagagat aacaaattca atgaatgtga tttatacaac 9420
tgtgtagtta atcaaagtta tctcaacaac cctaatcatg tggtatcatt gacaggcaaa 9480
gaaagagaac tcagtgtagg tagaatgttt gcaatgcaac cgggaatgtt cagacaggtt 9540
caaatattgg cagagaaaat gatagctgaa aacattttac aattctttcc tgaaagtctt 9600
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aaatcaaatc gctacaatga taattacaac aattacatta gtaagtgctc tatcatcaca 9720
gatctcagca aattcaatca agcatttcga tatgaaacgt catgtatttg tagtgatgtg 9780
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gggaaattct caattactgc tttaattaat ggtgacaatc aatcaataga tataagcaaa 10080
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gaaagtctat tatgcagttt aatatttaga aatgtatggt tatataatca gattgctcta 10440
caattaaaaa atcatgcatt atgtaacaat aaactatatt tggacatatt aaaggttctg 10500
aaacacttaa aaaccttttt taatcttgat aatattgata cagcattaac attgtatatg 10560
aatttaccca tgttatttgg tggtggtgat cccaacttgt tatatcgaag tttctataga 10620
agaactcctg acttcctcac agaggctata gttcactctg tgttcatact tagttattat 10680
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ttaacatgca taatcacgtt tgacaaaaac cctaatgctg aattcgtaac attgatgaga 10800
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catgggctaa gagttgttta tgaaagttta cccttttata aagcagagaa aatagtaaat 11040
cttatatcag gtacaaaatc tataactaac atactggaaa aaacttctgc catagactta 11100
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ggcataatta tagagaaata taatgttaac agtttaacac gtggtgagag aggacccact 11400
aaaccatggg ttggttcatc tacacaagag aaaaaaacaa tgccagttta taatagacaa 11460
gtcttaacca aaaaacagag agatcaaata gatctattag caaaattgga ttgggtgtat 11520
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cttacagtca gtagtagacc atgtgaattc cctgcatcaa taccagctta tagaacaaca 11700
aattatcact ttgacactag ccctattaat cgcatattaa cagaaaagta tggtgatgaa 11760
gatattgaca tagtattcca aaactgtata agctttggcc ttagtttaat gtcagtagta 11820
gaacaattta ctaatgtatg tcctaacaga attattctca tacctaagct taatgagata 11880
catttgatga aacctcccat attcacaggt gatgttgata ttcacaagtt aaaacaagtg 11940
atacaaaaac agcatatgtt tttaccagac aaaataagtt tgactcaata tgtggaatta 12000
ttcttaagta ataaaacact caaatctgga tctcatgtta attctaattt aatattggca 12060
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gaactaaact ataaccattt atatatggta gaatctacat atccttacct aagtgaattg 14040
ttaaacagct tgacaaccaa tgaacttaaa aaactgatta aaatcacagg tagtctgtta 14100
tacaactttc ataatgaata atgaataaag atcttataat aaaaattccc atagctatac 14160
actaacactg tattcaatta tagttattaa aaattaaaaa tcatataatt ttttaaataa 14220
cttttagtga actaatccta aagttatcat tttaatcttg gaggaataaa tttaaaccct 14280
aatctaattg gtttatatgt gtattaacta aattacgaga tattagtttt tgacactttt 14340
tttctcgt 14348
<210> 4
<211> 14348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 4
acgggaaaaa atgcgtacaa caaacttgca taaaccaaaa aaatggggca aataagaatt 60
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tgaggacagg gtggtacaca tccgtgatta ccattgagct gagtaatatc aagaagaaca 300
agtgcaacgg cactgatgcc aaagtgaagc tcattaaaca ggaactcgat aagtacaaga 360
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tcatgtccat tattaaggag gaggtcctgg cttacgtcgt gcagctgcct ctttatgggg 1020
tgatcgacac cccttgctgg aagctccata catcccctct gtgcactacc aacaccaagg 1080
aggggtccaa catctgcttg acaagaaccg atcgcggctg gtactgcgat aacgcaggca 1140
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acaccatgaa cagcctgacc cttcccagcg aggtgaacct ttgtaacgtg gacatcttca 1260
acccaaagta tgattgtaag attatgacta gcaaaaccga tgtcagcagc agcgtgatca 1320
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acagaggcat catcaagacc ttcagtaatg gatgtgacta cgtgtccaac aaaggggtgg 1440
atacagtgag cgtgggaaac acattgtact acgtgaacaa acaggagggg aagtccttgt 1500
acgtgaaggg tgagcccatt atcaacttct acgaccctct cgtgttccca tcagacgagt 1560
ttgacgcctc catctcccag gtgaacgaga agatcaatca gtcactggcc tttattagga 1620
aatccgacga gctgctgcac aacgtcaacg ccggaaagtc taccactaac atcatgatca 1680
ccacaatcat cattgtgatc atcgtcatcc tcctgagctt gatcgctgtc gggttgctgt 1740
tgtactgcaa ggcccggtcc acacccgtga ctctgagcaa ggaccagctg tctggcatta 1800
acaacatcgc ctttagcaac taaagtagtt aattaaaaat ggggcaaata caaccatgtc 1860
caaaaacaag gaccaacgca ccgctaagac attagaaagg acctgggaca ctctcaatca 1920
tttattattc atatcatcgt gcttatataa gttaaatctt aaatctgtag cacaaatcac 1980
attatccatt ctggcaatga taatctcaac ttcacttata attgcagcca tcatattcat 2040
agcctcggca aaccacaaag tcacaccaac aactgcaatc atacaagatg caacaagcca 2100
gatcaagaac acaaccccaa catacctcac ccagaatcct cagcttggaa tcagtccctc 2160
taatccgtct gaaattacat cacaaatcac caccatacta gcttcaacaa caccaggagt 2220
caagtcaacc ctgcaatcca caacagtcaa gaccaaaaac acaacaacaa ctcaaacaca 2280
acccagcaag cccaccacaa aacaacgcca aaacaaacca ccaagcaaac ccaataatga 2340
ttttcacttt gaagtgttca actttgtacc ctgcagcata tgcagcaaca atccaacctg 2400
ctgggctatc tgcaaaagaa taccaaacaa aaaaccagga aagaaaacca ctaccaagcc 2460
cacaaaaaaa ccaaccctca agacaaccaa aaaagatccc aaacctcaaa ccactaaatc 2520
aaaggaagta cccaccacca agcccacaga agagccaacc atcaacacca ccaaaacaaa 2580
catcataact acactactca cctccaacac cacaggaaat ccagaactca caagtcaaat 2640
ggaaaccttc cactcaactt cctccgaagg caatccaagc ccttctcaag tctctacaac 2700
atccgagtac ccatcacaac cttcatctcc acccaacaca ccacgccagt agttaataaa 2760
aaatggggca aatactcgag ttagagatgg acacaaccca caatgataat acaccacaaa 2820
gactgatgat cacagacatg agaccgttgt cacttgagac cataataaca tcactaacca 2880
gagacatcat aacacacaaa tttatatact tgataaatca tgaatgcata gtgagaaaac 2940
ttgatgaaag acaggccaca tttacattcc tggtcaacta tgaaatgaaa ctattacaca 3000
aagtaggaag cactaaatat aaaaaatata ctgaatacaa cacaaaatat ggcactttcc 3060
ctatgccaat attcatcaat catgatgggt tcttagaatg cattggcatt aagcctacaa 3120
agcatactcc cataatatac aagtatgatc tcaatccata aatttcaaca caatattcac 3180
acaatctaaa acaacaactc tatgcataac tatactccat agtccagatg gagcctgaaa 3240
attatagtaa tttaaaactt aaggagagat ataagataga agatggggca aatacaacca 3300
tggctcttag caaagtcaag ttgaatgata cactcaacaa agatcaactt ctgtcatcca 3360
gcaaatacac catccaacgg agcacaggag atagtattga tactcctaat tatgatgtgc 3420
agaaacacat caataagtta tgtggcatgt tattaatcac agaagatgct aatcataaat 3480
tcactgggtt aataggtatg ttatatgcga tgtctaggtt aggaagagaa gacaccataa 3540
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gtcaagacat taatggaaaa gaaatgaaat ttgaagtgtt aacattggca agcttaacaa 3660
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aaatgggaga ggtagctcca gaatacaggc atgactctcc tgattgtggg atgataatat 3780
tatgtatagc agcattagta ataactaaat tagcagcagg ggacagatct ggtcttacag 3840
ccgtgattag gagagctaat aatgtcctaa aaaatgaaat gaaacgttac aaaggcttac 3900
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atgtttttgt tcattttggt atagcacaat cttctaccag aggtggcagt agagttgaag 4020
ggatttttgc aggattgttt atgaatgcct atggtgcagg gcaagtgatg ttacggtggg 4080
gagtcttagc aaaatcggtt aaaaatatta tgttaggaca tgctagtgtg caagcagaaa 4140
tggaacaagt tgttgaggtt tatgaatatg cccaaaaatt gggtggtgaa gcaggattct 4200
accatatatt gaacaaccca aaagcatcat tattatcttt gactcaattt cctcacttct 4260
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cgaggaatca agatctatat gatgcagcaa aggcatatgc tgaacaactc aaagaaaatg 4380
gtgtgattaa ctacagtgta ctagacttga cagcagaaga actagaggct atcaaacatc 4440
agcttaatcc aaaagataat gatgtagagc tttgagttaa taaaaaatgg ggcaaataaa 4500
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aattcctaga atcaataaag ggcaaattca catcacccaa agatcccaag aaaaaagata 4620
gtatcatatc tgtcaactca atagatatag aagtaaccaa agaaagccct ataacatcaa 4680
attcaactat tatcaaccca acaaatgaga cagatgatac tgcagggaac aagcccaatt 4740
atcaaagaaa acctctagta agtttcaaag aagaccctac accaagtgat aatccctttt 4800
ctaaactata caaagaaacc atagaaacat ttgataacaa tgaagaagaa tccagctatt 4860
catacgaaga aataaatgat cagacaaacg ataatataac agcaagatta gataggattg 4920
atgaaaaatt aagtgaaata ctaggaatgc ttcacacatt agtagtggca agtgcaggac 4980
ctacatctgc tcgggatggt ataagagatg ccatggttgg tttaagagaa gaaatgatag 5040
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catcagagaa attgaacaac ctattggaag ggaatgatag tgacaatgat ctatcacttg 5220
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aactaaccaa cccaatcatc caaccaaaca tccatccgcc aatcagccaa acagccaaca 5340
aaacaaccag ccaatccaaa actaaccacc cggaaaaaat ctataatata gttacaaaaa 5400
aaggaaaggg tggggcaaat atggaaacat acgtgaacaa gcttcacgaa ggctccacat 5460
acacagctgc tgttcaatac aatgtcttag aaaaagacga tgaccctgca tcacttacaa 5520
tatgggtgcc catgttccaa tcatctatgc cagcagattt acttataaaa gaactagcta 5580
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tgaagacact caaccctaca catgatatta ttgctttatg tgaatttgaa aacatagtaa 5880
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tcatccctta ctcaggatta ctattagtca tcacagtgac tgacaacaaa ggagcattca 6060
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attcttcact tcaccatcac aatcacaaac actctgtggt tcaaccaatc aaacaaaact 6300
tatctgaagt cccagatcat cccaagtcat tgtttatcag atctagtact caaataagtt 6360
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agtagttaat taaaaacaca attgcatgcc agattaactt accatctgta aaaatgaaaa 6720
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ttggagtgct agagagttat ataggatcaa taaacaatat aactaaacaa tcagcatgtg 7020
ttgccatgag caaactcctc actgaactca atagtgatga tatcaaaaag ctgagggaca 7080
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tcaattctaa cactcaccac atcgttacat tattaattca aacaattcaa gttgtgggac 7620
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aatctaaaga aactaaatat aacacagtcc ttaatatcta agtatcataa aggtgaaata 7860
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tcagaacaga ttgctaccac taatttactt aaaaagataa taagaagagc tatagaaata 7980
agtgatgtca aagtctatgc tatattgaat aaactagggc ttaaagaaaa ggacaagatt 8040
aaatccaaca atggacaaga tgaagacaac tcagttatta cgaccataat caaagatgat 8100
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cctccatcat ggttaataca ttggtttaac ttatacacaa aattaaacaa catattaaca 8280
cagtatcgat caaatgaggt aaaaaaccat gggtttacat tgatagataa tcaaactctt 8340
agtggatttc aatttatttt gaaccaatat ggttgtatag tttatcataa ggaactcaaa 8400
agaattactg tgacaaccta taatcaattc ttgacatgga aagatattag ccttagtaga 8460
ttaaatgttt gtttaattac atggattagt aactgcttga acacattaaa taaaagctta 8520
ggcttaagat gcggattcaa taatgttatc ttgacacaac tattccttta tggagattgt 8580
atactaaagc tatttcacaa tgaggggttc tacataataa aagaggtaga gggatttatt 8640
atgtctctaa ttttaaatat aacagaagaa gatcaattca gaaaacgatt ttataatagt 8700
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tgtcatacat tattagataa gacagtgtcc gataatataa taaatggcag atggataatt 8820
ctattaagta agttccttaa attaattaag cttgcaggtg acaataacct taacaatctg 8880
agtgaactat attttttgtt cagaatattt ggacacccaa tggtagatga aagacaagcc 8940
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atgttaagag gtgcctttat atatagaatt ataaaagggt ttgtaaataa ttacaacaga 9060
tggcctactt taagaaatgc tattgtttta cccttaagat ggttaactta ctataaacta 9120
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tcacacatac aaaactatat agaacatgaa aaattaaaat tttccgagag tgataaatca 9360
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gaacaattta ctaatgtatg tcctaacaga attattctca tacctaagct taatgagata 11880
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ttaaacagct tgacaaccaa tgaacttaaa aaactgatta aaatcacagg tagtctgtta 14100
tacaactttc ataatgaata atgaataaag atcttataat aaaaattccc atagctatac 14160
actaacactg tattcaatta tagttattaa aaattaaaaa tcatataatt ttttaaataa 14220
cttttagtga actaatccta aagttatcat tttaatcttg gaggaataaa tttaaaccct 14280
aatctaattg gtttatatgt gtattaacta aattacgaga tattagtttt tgacactttt 14340
tttctcgt 14348
<210> 5
<211> 14582
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 5
acgggaaaaa atgcgtacaa caaacttgca taaaccaaaa aaatggggca aataagaatt 60
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tggagcctga aaattatagt aatttaaaac ttaaggagag atataagata gaagatgggg 600
caaatacaac catggctctt agcaaagtca agttgaatga tacactcaac aaagatcaac 660
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ctatcaaaca tcagcttaat ccaaaagata atgatgtaga gctttgagtt aataaaaaat 1800
ggggcaaata aatcatcatg gaaaagtttg ctcctgaatt ccatggagaa gatgcaaaca 1860
acagggctac taaattccta gaatcaataa agggcaaatt cacatcaccc aaagatccca 1920
agaaaaaaga tagtatcata tctgtcaact caatagatat agaagtaacc aaagaaagcc 1980
ctataacatc aaattcaact attatcaacc caacaaatga gacagatgat actgcaggga 2040
acaagcccaa ttatcaaaga aaacctctag taagtttcaa agaagaccct acaccaagtg 2100
ataatccctt ttctaaacta tacaaagaaa ccatagaaac atttgataac aatgaagaag 2160
aatccagcta ttcatacgaa gaaataaatg atcagacaaa cgataatata acagcaagat 2220
tagataggat tgatgaaaaa ttaagtgaaa tactaggaat gcttcacaca ttagtagtgg 2280
caagtgcagg acctacatct gctcgggatg gtataagaga tgccatggtt ggtttaagag 2340
aagaaatgat agaaaaaatc agaactgaag cattaatgac caatgacaga ttagaagcta 2400
tggcaagact caggaatgag gaaagtgaaa agatggcaaa agacacatca gatgaagtgt 2460
ctctcaatcc aacatcagag aaattgaaca acctattgga agggaatgat agtgacaatg 2520
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agaagaccaa caaactaacc aacccaatca tccaaccaaa catccatccg ccaatcagcc 2640
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tagttacaaa aaaaggaaag ggtggggcaa atatggaaac atacgtgaac aagcttcacg 2760
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tatgcgctaa tgtgtccttg gatgaaagaa gcaaactagc atatgatgta accacaccct 3060
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gaaataaaga tctgaacaca cttgaaaata taacaaccac tgaattcaaa aatgctatca 3300
caaatgcaaa aatcatccct tactcaggat tactattagt catcacagtg actgacaaca 3360
aaggagcatt caaatacata aagccacaaa gtcaattcat agtagatctt ggagcttacc 3420
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caatcaaacc catggaagat taaccttttt cctctacatc agtgtgttaa ttcatacaaa 3540
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ctcaaataag ttaataaaaa atatacacat ggggcaaata atcattggag gaaatccaac 3720
taatcacaat atctgttaac atagacaagt ccacacacca tacagaatca accaatggaa 3780
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aacaataaca ttggggcaaa tgcaaacatg tccaaaaaca aggaccaacg caccgctaag 4080
acattagaaa ggacctggga cactctcaat catttattat tcatatcatc gtgcttatat 4140
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acaactgcaa tcatacaaga tgcaacaagc cagatcaaga acacaacccc aacatacctc 4320
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ccacccaaca caccacgcca gtagttactt aaaaacatat tatcacaaaa ggccttgacc 4980
aacttaaaca gaatcaaaat aaactctggg gcaaataaca atggagttgc taatcctcaa 5040
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taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa caagaattag ataaatataa 5280
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caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat gcaggcgtaa ctacacctgt 5760
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tatcatgtcc ataataaaag aggaagtctt agcatatgta gtacaattac cactatatgg 5940
tgttatagat acaccctgtt ggaaactaca cacatcccct ctatgtacaa ccaacacaaa 6000
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ttcaatgaaa tccattggac ctctcaagaa ttgattgaca caattcaaaa ttttctacaa 7740
catctaggta ttattgagga tatatataca atatatatat tagtgtcata acactcaatt 7800
ctaacactca ccacatcgtt acattattaa ttcaaacaat tcaagttgtg ggacaaaatg 7860
gatcccatta ttaatggaaa ttctgctaat gtttatctaa ccgatagtta tttaaaaggt 7920
gttatctctt tctcagagtg taatgcttta ggaagttaca tattcaatgg tccttatctc 7980
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aagaaactaa atataacaca gtccttaata tctaagtatc ataaaggtga aataaaatta 8100
gaagaaccta cttattttca gtcattactt atgacataca agagtatgac ctcgtcagaa 8160
cagattgcta ccactaattt acttaaaaag ataataagaa gagctataga aataagtgat 8220
gtcaaagtct atgctatatt gaataaacta gggcttaaag aaaaggacaa gattaaatcc 8280
aacaatggac aagatgaaga caactcagtt attacgacca taatcaaaga tgatatactt 8340
tcagctgtta aagataatca atctcatctt aaagcagaca aaaatcactc tacaaaacaa 8400
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gaactcagtg taggtagaat gtttgcaatg caaccgggaa tgttcagaca ggttcaaata 9780
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cactttgaca ctagccctat taatcgcata ttaacagaaa agtatggtga tgaagatatt 12000
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gt 14582
<210> 6
<211> 14348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 6
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ctactataat tatagtgatt atagtaatat tgttatcatt aattgctgtt ggactgctct 1740
tatactgtaa ggccagaagc acaccagtca cactaagcaa agatcaactg agtggtataa 1800
ataatattgc atttagtaac taaagtagtt aattaaaaat ggggcaaata caaccatgtc 1860
caaaaacaag gaccaacgca ccgctaagac attagaaagg acctgggaca ctctcaatca 1920
tttattattc atatcatcgt gcttatataa gttaaatctt aaatctgtag cacaaatcac 1980
attatccatt ctggcaatga taatctcaac ttcacttata attgcagcca tcatattcat 2040
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gatcaagaac acaaccccaa catacctcac ccagaatcct cagcttggaa tcagtccctc 2160
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ctattaagta agttccttaa attaattaag cttgcaggtg acaataacct taacaatctg 8880
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tcacacatac aaaactatat agaacatgaa aaattaaaat tttccgagag tgataaatca 9360
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tttctcgt 14348
<210> 7
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<212> DNA
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<220>
<223> 重组RSV序列
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caaaaacaag gaccaacgca ccgctaagac attagaaagg acctgggaca ctctcaatca 1920
tttattattc atatcatcgt gcttatataa gttaaatctt aaatctgtag cacaaatcac 1980
attatccatt ctggcaatga taatctcaac ttcacttata attgcagcca tcatattcat 2040
agcctcggca aaccacaaag tcacaccaac aactgcaatc atacaagatg caacaagcca 2100
gatcaagaac acaaccccaa catacctcac ccagaatcct cagcttggaa tcagtccctc 2160
taatccgtct gaaattacat cacaaatcac caccatacta gcttcaacaa caccaggagt 2220
caagtcaacc ctgcaatcca caacagtcaa gaccaaaaac acaacaacaa ctcaaacaca 2280
acccagcaag cccaccacaa aacaacgcca aaacaaacca ccaagcaaac ccaataatga 2340
ttttcacttt gaagtgttca actttgtacc ctgcagcata tgcagcaaca atccaacctg 2400
ctgggctatc tgcaaaagaa taccaaacaa aaaaccagga aagaaaacca ctaccaagcc 2460
cacaaaaaaa ccaaccctca agacaaccaa aaaagatccc aaacctcaaa ccactaaatc 2520
aaaggaagta cccaccacca agcccacaga agagccaacc atcaacacca ccaaaacaaa 2580
catcataact acactactca cctccaacac cacaggaaat ccagaactca caagtcaaat 2640
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gactgatgat cacagacatg agaccgttgt cacttgagac cataataaca tcactaacca 2880
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ttgatgaaag acaggccaca tttacattcc tggtcaacta tgaaatgaaa ctattacaca 3000
aagtaggaag cactaaatat aaaaaatata ctgaatacaa cacaaaatat ggcactttcc 3060
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attatagtaa tttaaaactt aaggagagat ataagataga agatggggca aatacaacca 3300
tggctcttag caaagtcaag ttgaatgata cactcaacaa agatcaactt ctgtcatcca 3360
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accatatatt gaacaaccca aaagcatcat tattatcttt gactcaattt cctcacttct 4260
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atgaaaaatt aagtgaaata ctaggaatgc ttcacacatt agtagtggca agtgcaggac 4980
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aactaaccaa cccaatcatc caaccaaaca tccatccgcc aatcagccaa acagccaaca 5340
aaacaaccag ccaatccaaa actaaccacc cggaaaaaat ctataatata gttacaaaaa 5400
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acacagctgc tgttcaatac aatgtcttag aaaaagacga tgaccctgca tcacttacaa 5520
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tcatccctta ctcaggatta ctattagtca tcacagtgac tgacaacaaa ggagcattca 6060
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attcttcact tcaccatcac aatcacaaac actctgtggt tcaaccaatc aaacaaaact 6300
tatctgaagt cccagatcat cccaagtcat tgtttatcag atctagtact caaataagtt 6360
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aaaggtgtta tctctttctc agagtgtaat gctttaggaa gttacatatt caatggtcct 7740
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tcagaacaga ttgctaccac taatttactt aaaaagataa taagaagagc tatagaaata 7980
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ctattaagta agttccttaa attaattaag cttgcaggtg acaataacct taacaatctg 8880
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cgtttctatc gtgagtttcg gttgcctaaa aaagtggatc ttgaaatgat tataaatgat 9240
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tcacacatac aaaactatat agaacatgaa aaattaaaat tttccgagag tgataaatca 9360
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gaacaattta ctaatgtatg tcctaacaga attattctca tacctaagct taatgagata 11880
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tacaactttc ataatgaata atgaataaag atcttataat aaaaattccc atagctatac 14160
actaacactg tattcaatta tagttattaa aaattaaaaa tcatataatt ttttaaataa 14220
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tttctcgt 14348
<210> 8
<211> 14579
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 8
acgggaaaaa atgcgtacaa caaacttgca taaaccaaaa aaatggggca aataagaatt 60
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aactattaca caaagtagga agcactaaat ataaaaaata tactgaatac aacacaaaat 360
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ttaagcctac aaagcatact cccataatat acaagtatga tctcaatcca taaatttcaa 480
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tggagcctga aaattatagt aatttaaaac ttaaggagag atataagata gaagatgggg 600
caaatacaac catggctctt agcaaagtca agttgaatga tacactcaac aaagatcaac 660
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ataatccctt ttctaaacta tacaaagaaa ccatagaaac atttgataac aatgaagaag 2160
aatccagcta ttcatacgaa gaaataaatg atcagacaaa cgataatata acagcaagat 2220
tagataggat tgatgaaaaa ttaagtgaaa tactaggaat gcttcacaca ttagtagtgg 2280
caagtgcagg acctacatct gctcgggatg gtataagaga tgccatggtt ggtttaagag 2340
aagaaatgat agaaaaaatc agaactgaag cattaatgac caatgacaga ttagaagcta 2400
tggcaagact caggaatgag gaaagtgaaa agatggcaaa agacacatca gatgaagtgt 2460
ctctcaatcc aacatcagag aaattgaaca acctattgga agggaatgat agtgacaatg 2520
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agaagaccaa caaactaacc aacccaatca tccaaccaaa catccatccg ccaatcagcc 2640
aaacagccaa caaaacaacc agccaatcca aaactaacca cccggaaaaa atctataata 2700
tagttacaaa aaaaggaaag ggtggggcaa atatggaaac atacgtgaac aagcttcacg 2760
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catcacttac aatatgggtg cccatgttcc aatcatctat gccagcagat ttacttataa 2880
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tatgcgctaa tgtgtccttg gatgaaagaa gcaaactagc atatgatgta accacaccct 3060
gtgaaatcaa ggcatgtagt ctaacatgcc taaaatcaaa aaatatgttg actacagtta 3120
aagatctcac tatgaagaca ctcaacccta cacatgatat tattgcttta tgtgaatttg 3180
aaaacatagt aacatcaaaa aaagtcataa taccaacata cctaagatcc atcagtgtca 3240
gaaataaaga tctgaacaca cttgaaaata taacaaccac tgaattcaaa aatgctatca 3300
caaatgcaaa aatcatccct tactcaggat tactattagt catcacagtg actgacaaca 3360
aaggagcatt caaatacata aagccacaaa gtcaattcat agtagatctt ggagcttacc 3420
tagaaaaaga aagtatatat tatgttacca caaattggaa gcacacagct acacgatttg 3480
caatcaaacc catggaagat taaccttttt cctctacatc agtgtgttaa ttcatacaaa 3540
ctttctacct acattcttca cttcaccatc acaatcacaa acactctgtg gttcaaccaa 3600
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ctcaaataag ttaataaaaa atatacacat ggggcaaata atcattggag gaaatccaac 3720
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acattagaaa ggacctggga cactctcaat catttattat tcatatcatc gtgcttatat 4140
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acaactgcaa tcatacaaga tgcaacaagc cagatcaaga acacaacccc aacatacctc 4320
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ggcaatccaa gcccttctca agtctctaca acatccgagt acccatcaca accttcatct 4920
ccacccaaca caccacgcca gtagttactt aaaaacatat tatcacaaaa ggccttgacc 4980
aacttaaaca gaatcaaaat aaactctggg gcaaataaca atggagttgc taatcctcaa 5040
agcaaatgca attaccacaa tcctcactgc agtcacattt tgttttgctt ctggtcaaaa 5100
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tctgagaact ggttggtata ccagtgttat aactatagaa ttaagtaata tcaagaaaaa 5220
taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa caagaattag ataaatataa 5280
aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca caagcaacaa acaatcgagc 5340
cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac aatgccaaaa aaaccaatgt 5400
aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggtttt ttgttaggtg ttggatctgc 5460
aatcgccagt ggcgttgctg tatctaaggt cctgcaccta gaaggggaag tgaacaagat 5520
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caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat gcaggcgtaa ctacacctgt 5760
aagcacttac atgttaacta atagtgaatt attgtcatta atcaatgata tgcctataac 5820
aaatgatcag aaaaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata gttagacagc aaagttactc 5880
tatcatgtcc ataataaaag aggaagtctt agcatatgta gtacaattac cactatatgg 5940
tgttatagat acaccctgtt ggaaactaca cacatcccct ctatgtacaa ccaacacaaa 6000
agaagggtcc aacatctgtt taacaagaac tgacagagga tggtactgtg acaatgcagg 6060
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tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaagtaaat ctctgcaatg ttgacatatt 6180
caaccccaaa tatgattgta aaattatgac ttcaaaaaca gatgtaagca gctccgttat 6240
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aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgcgat tatgtatcaa ataaaggggt 6360
ggacactgtg tctgtaggta acacattata ttatgtaaat aagcaagaag gtaaaagtct 6420
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catctaggta ttattgagga tatatataca atatatatat tagtgtcata acactcaatt 7800
ctaacactca ccacatcgtt acattattaa ttcaaacaat tcaagttgtg ggacaaaatg 7860
gatcccatta ttaatggaaa ttctgctaat gtttatctaa ccgatagtta tttaaaaggt 7920
gttatctctt tctcagagtg taatgcttta ggaagttaca tattcaatgg tccttatctc 7980
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aagaaactaa atataacaca gtccttaata tctaagtatc ataaaggtga aataaaatta 8100
gaagaaccta cttattttca gtcattactt atgacataca agagtatgac ctcgtcagaa 8160
cagattgcta ccactaattt acttaaaaag ataataagaa gagctataga aataagtgat 8220
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tcagctgtta aagataatca atctcatctt aaagcagaca aaaatcactc tacaaaacaa 8400
aaagacacaa tcaaaacaac actcttgaag aaattgatgt gttcaatgca acatcctcca 8460
tcatggttaa tacattggtt taacttatac acaaaattaa acaacatatt aacacagtat 8520
cgatcaaatg aggtaaaaaa ccatgggttt acattgatag ataatcaaac tcttagtgga 8580
tttcaattta ttttgaacca atatggttgt atagtttatc ataaggaact caaaagaatt 8640
actgtgacaa cctataatca attcttgaca tggaaagata ttagccttag tagattaaat 8700
gtttgtttaa ttacatggat tagtaactgc ttgaacacat taaataaaag cttaggctta 8760
agatgcggat tcaataatgt tatcttgaca caactattcc tttatggaga ttgtatacta 8820
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ctaattttaa atataacaga agaagatcaa ttcagaaaac gattttataa tagtatgctc 8940
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agtaagttcc ttaaattaat taagcttgca ggtgacaata accttaacaa tctgagtgaa 9120
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gctgttaaaa ttaattgcaa tgagaccaaa ttttacttgt taagcagtct gagtatgtta 9240
agaggtgcct ttatatatag aattataaaa gggtttgtaa ataattacaa cagatggcct 9300
actttaagaa atgctattgt tttaccctta agatggttaa cttactataa actaaacact 9360
tatccttctt tgttggaact tacagaaaga gatttgattg tgttatcagg actacgtttc 9420
tatcgtgagt ttcggttgcc taaaaaagtg gatcttgaaa tgattataaa tgataaagct 9480
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atacaaaact atatagaaca tgaaaaatta aaattttccg agagtgataa atcaagaaga 9600
gtattagagt attatttaag agataacaaa ttcaatgaat gtgatttata caactgtgta 9660
gttaatcaaa gttatctcaa caaccctaat catgtggtat cattgacagg caaagaaaga 9720
gaactcagtg taggtagaat gtttgcaatg caaccgggaa tgttcagaca ggttcaaata 9780
ttggcagaga aaatgatagc tgaaaacatt ttacaattct ttcctgaaag tcttacaaga 9840
tatggtgatc tagaactaca aaaaatatta gaactgaaag caggaataag taacaaatca 9900
aatcgctaca atgataatta caacaattac attagtaagt gctctatcat cacagatctc 9960
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ataatatgca catataggca tgcacccccc tatataggag atcatattgt agatcttaac 10140
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actacagaga tagatctaaa tgatattatg caaaatatag aacctacata tcctcatggg 11220
ctaagagttg tttatgaaag tttacccttt tataaagcag agaaaatagt aaatcttata 11280
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atagtattcc aaaactgtat aagctttggc cttagtttaa tgtcagtagt agaacaattt 12060
actaatgtat gtcctaacag aattattctc atacctaagc ttaatgagat acatttgatg 12120
aaacctccca tattcacagg tgatgttgat attcacaagt taaaacaagt gatacaaaaa 12180
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attatacaac ttatgaaaga ttctaaaggt atttttgaaa aagattgggg agagggatat 12420
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ttgtgttttc ataaaggtta tggcaaagca aagctggagt gtgatatgaa cacttcagat 12540
cttctatgtg tattggaatt aatagacagt agttattgga agtctatgtc taaggtattt 12600
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ggatgtcata gcttcaaatt atggtttctt aaacgtctta atgtagcaga attcacagtt 12720
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ctatcatatt ctatagctgg acgtaatgaa gttttcagca ataaacttat aaatcataag 14160
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tataaccatt tatatatggt agaatctaca tatccttacc taagtgaatt gttaaacagc 14280
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cataatgaat aatgaataaa gatcttataa taaaaattcc catagctata cactaacact 14400
gtattcaatt atagttatta aaaattaaaa atcatataat tttttaaata acttttagtg 14460
aactaatcct aaagttatca ttttaatctt ggaggaataa atttaaaccc taatctaatt 14520
ggtttatatg tgtattaact aaattacgag atattagttt ttgacacttt ttttctcgt 14579
<210> 9
<211> 14345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 9
acgggaaaaa atgcgtacaa caaacttgca taaaccaaaa aaatggggca aataagaatt 60
tgataagtac cacttaaatt taactcctcg agttcaccat ggagttgcta atcctcaaag 120
caaatgcaat taccacaatc ctcactgcag tcacattttg ttttgcttct ggtcaaaaca 180
tcactgaaga attttatcaa tcaacatgca gtgcagttag caaaggctat cttagtgctc 240
tgagaactgg ttggtatacc agtgttataa ctatagaatt aagtaatatc aagaaaaata 300
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acagactact agagattacc agggaattta gtgttaatgc aggcgtaact acacctgtaa 840
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tcatgtccat aataaaagag gaagtcttag catatgtagt acaattacca ctatatggtg 1020
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gatcaagaac acaaccccaa catacctcac ccagaatcct cagcttggaa tcagtccctc 2160
taatccgtct gaaattacat cacaaatcac caccatacta gcttcaacaa caccaggagt 2220
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acccagcaag cccaccacaa aacaacgcca aaacaaacca ccaagcaaac ccaataatga 2340
ttttcacttt gaagtgttca actttgtacc ctgcagcata tgcagcaaca atccaacctg 2400
ctgggctatc tgcaaaagaa taccaaacaa aaaaccagga aagaaaacca ctaccaagcc 2460
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<210> 10
<211> 14345
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<220>
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<400> 10
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acccagcaag cccaccacaa aacaacgcca aaacaaacca ccaagcaaac ccaataatga 2340
ttttcacttt gaagtgttca actttgtacc ctgcagcata tgcagcaaca atccaacctg 2400
ctgggctatc tgcaaaagaa taccaaacaa aaaaccagga aagaaaacca ctaccaagcc 2460
cacaaaaaaa ccaaccctca agacaaccaa aaaagatccc aaacctcaaa ccactaaatc 2520
aaaggaagta cccaccacca agcccacaga agagccaacc atcaacacca ccaaaacaaa 2580
catcataact acactactca cctccaacac cacaggaaat ccagaactca caagtcaaat 2640
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tggctcttag caaagtcaag ttgaatgata cactcaacaa agatcaactt ctgtcatcca 3360
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ctcgt 14345
<210> 11
<211> 14989
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 11
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aattcaacta ttatcaaccc aacaaatgag acagatgata ctgcagggaa caagcccaat 2580
tatcaaagaa aacctctagt aagtttcaaa gaagacccta caccaagtga taatcccttt 2640
tctaaactat acaaagaaac catagaaaca tttgataaca atgaagaaga atccagctat 2700
tcatacgaag aaataaatga tcagacaaac gataatataa cagcaagatt agataggatt 2760
gatgaaaaat taagtgaaat actaggaatg cttcacacat tagtagtggc aagtgcagga 2820
cctacatctg ctcgggatgg tataagagat gccatggttg gtttaagaga agaaatgata 2880
gaaaaaatca gaactgaagc attaatgacc aatgacagat tagaagctat ggcaagactc 2940
aggaatgagg aaagtgaaaa gatggcaaaa gacacatcag atgaagtgtc tctcaatcca 3000
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gaagatttct gattagttac caatcttcac atcaacacac aataccaaca gaagaccaac 3120
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taacacagtc cttaatatct aagtatcata aaggtgaaat aaaattagaa gaacctactt 8520
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taaaaaacca tgggtttaca ttgatagata atcaaactct tagtggattt caatttattt 9000
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catggattag taactgcttg aacacattaa ataaaagctt aggcttaaga tgcggattca 9180
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agacagtgtc cgataatata ataaatggca gatggataat tctattaagt aagttcctta 9480
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tatatagaat tataaaaggg tttgtaaata attacaacag atggcctact ttaagaaatg 9720
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tgtattaact aaattacgag atattagttt ttgacacttt ttttctcgt 14989
<210> 12
<211> 14988
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 12
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tggaacaagt tgttgaggtt tatgaatatg cccaaaaatt gggtggtgaa gcaggattct 2040
accatatatt gaacaaccca aaagcatcat tattatcttt gactcaattt cctcacttct 2100
ccagtgtagt attaggcaat gctgctggcc taggcataat gggagagtac agaggtacac 2160
cgaggaatca agatctatat gatgcagcaa aggcatatgc tgaacaactc aaagaaaatg 2220
gtgtgattaa ctacagtgta ctagacttga cagcagaaga actagaggct atcaaacatc 2280
agcttaatcc aaaagataat gatgtagagc tttgagttaa taaaaaatgg ggcaaataaa 2340
tcatcatgga aaagtttgct cctgaattcc atggagaaga tgcaaacaac agggctacta 2400
aattcctaga atcaataaag ggcaaattca catcacccaa agatcccaag aaaaaagata 2460
gtatcatatc tgtcaactca atagatatag aagtaaccaa agaaagccct ataacatcaa 2520
attcaactat tatcaaccca acaaatgaga cagatgatac tgcagggaac aagcccaatt 2580
atcaaagaaa acctctagta agtttcaaag aagaccctac accaagtgat aatccctttt 2640
ctaaactata caaagaaacc atagaaacat ttgataacaa tgaagaagaa tccagctatt 2700
catacgaaga aataaatgat cagacaaacg ataatataac agcaagatta gataggattg 2760
atgaaaaatt aagtgaaata ctaggaatgc ttcacacatt agtagtggca agtgcaggac 2820
ctacatctgc tcgggatggt ataagagatg ccatggttgg tttaagagaa gaaatgatag 2880
aaaaaatcag aactgaagca ttaatgacca atgacagatt agaagctatg gcaagactca 2940
ggaatgagga aagtgaaaag atggcaaaag acacatcaga tgaagtgtct ctcaatccaa 3000
catcagagaa attgaacaac ctattggaag ggaatgatag tgacaatgat ctatcacttg 3060
aagatttctg attagttacc aatcttcaca tcaacacaca ataccaacag aagaccaaca 3120
aactaaccaa cccaatcatc caaccaaaca tccatccgcc aatcagccaa acagccaaca 3180
aaacaaccag ccaatccaaa actaaccacc cggaaaaaat ctataatata gttacaaaaa 3240
aaggaaaggg tggggcaaat atggaaacat acgtgaacaa gcttcacgaa ggctccacat 3300
acacagctgc tgttcaatac aatgtcttag aaaaagacga tgaccctgca tcacttacaa 3360
tatgggtgcc catgttccaa tcatctatgc cagcagattt acttataaaa gaactagcta 3420
atgtcaacat actagtgaaa caaatatcca cacccaaggg accttcacta agagtcatga 3480
taaactcaag aagtgcagtg ctagcacaaa tgcccagcaa atttaccata tgcgctaatg 3540
tgtccttgga tgaaagaagc aaactagcat atgatgtaac cacaccctgt gaaatcaagg 3600
catgtagtct aacatgccta aaatcaaaaa atatgttgac tacagttaaa gatctcacta 3660
tgaagacact caaccctaca catgatatta ttgctttatg tgaatttgaa aacatagtaa 3720
catcaaaaaa agtcataata ccaacatacc taagatccat cagtgtcaga aataaagatc 3780
tgaacacact tgaaaatata acaaccactg aattcaaaaa tgctatcaca aatgcaaaaa 3840
tcatccctta ctcaggatta ctattagtca tcacagtgac tgacaacaaa ggagcattca 3900
aatacataaa gccacaaagt caattcatag tagatcttgg agcttaccta gaaaaagaaa 3960
gtatatatta tgttaccaca aattggaagc acacagctac acgatttgca atcaaaccca 4020
tggaagatta acctttttcc tctacatcag tgtgttaatt catacaaact ttctacctac 4080
attcttcact tcaccatcac aatcacaaac actctgtggt tcaaccaatc aaacaaaact 4140
tatctgaagt cccagatcat cccaagtcat tgtttatcag atctagtact caaataagtt 4200
aataaaaaat atacacatgg ggcaaataat cattggagga aatccaacta atcacaatat 4260
ctgttaacat agacaagtcc acacaccata cagaatcaac caatggaaaa tacatccata 4320
acaatagaat tctcaagcaa attctggcct tactttacac taatacacat gatcacaaca 4380
ataatctctt tgctaatcat aatctccatc atgattgcaa tactaaacaa actttgtgaa 4440
tataacgtat tccataacaa aacctttgag ttaccaagag ctcgagtcaa cacatagcat 4500
tcatcaatcc aacagcccaa aacagtaacc ttgcatttaa aaatgaacaa cccctacctc 4560
tttacaacac ctcattaaca tcccaccatg caaaccacta tccatactat aaagtagtta 4620
attaaaaata gtcataacaa tgaactagga tatcaagact aacaataaca ttggggcaaa 4680
tgcaaacatg tccaaaaaca aggaccaacg caccgctaag acattagaaa ggacctggga 4740
cactctcaat catttattat tcatatcatc gtgcttatat aagttaaatc ttaaatctgt 4800
agcacaaatc acattatcca ttctggcaat gataatctca acttcactta taattgcagc 4860
catcatattc atagcctcgg caaaccacaa agtcacacca acaactgcaa tcatacaaga 4920
tgcaacaagc cagatcaaga acacaacccc aacatacctc acccagaatc ctcagcttgg 4980
aatcagtccc tctaatccgt ctgaaattac atcacaaatc accaccatac tagcttcaac 5040
aacaccagga gtcaagtcaa ccctgcaatc cacaacagtc aagaccaaaa acacaacaac 5100
aactcaaaca caacccagca agcccaccac aaaacaacgc caaaacaaac caccaagcaa 5160
acccaataat gattttcact ttgaagtgtt caactttgta ccctgcagca tatgcagcaa 5220
caatccaacc tgctgggcta tctgcaaaag aataccaaac aaaaaaccag gaaagaaaac 5280
cactaccaag cccacaaaaa aaccaaccct caagacaacc aaaaaagatc ccaaacctca 5340
aaccactaaa tcaaaggaag tacccaccac caagcccaca gaagagccaa ccatcaacac 5400
caccaaaaca aacatcataa ctacactact cacctccaac accacaggaa atccagaact 5460
cacaagtcaa atggaaacct tccactcaac ttcctccgaa ggcaatccaa gcccttctca 5520
agtctctaca acatccgagt acccatcaca accttcatct ccacccaaca caccacgcca 5580
gtagttactt aaaaacatat tatcacaaaa agccatgacc aacttaaaca gaatcaaagt 5640
aaactctggg gcaaataaca atggagttgc taatcctcaa agcaaatgca attaccacaa 5700
tcctcactgc agtcacattt tgttttgctt ctggtcaaaa catcactgaa gaattttatc 5760
aatcaacatg cagtgcagtt agcaaaggct atcttagtgc tctgagaact ggttggtata 5820
ccagtgttat aactatagaa ttaagtaata tcaagaaaaa taagtgtaat ggaacagatg 5880
ctaaggtaaa attgataaaa caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc 5940
agttgctcat gcaaagcaca caagcaacaa acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt 6000
ttatgaatta tacactcaac aatgccaaaa aaaccaatgt aacattaagc aagaaaagga 6060
aaagaagatt tcttggtttt ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcgttgctg 6120
tatctaaggt cctgcaccta gaaggggaag tgaacaagat caaaagtgct ctactatcca 6180
caaacaaggc tgtagtcagc ttatcaaatg gagtcagtgt cttaaccagc aaagtgttag 6240
acctcaaaaa ctatatagat aaacaattgt tacctattgt gaacaagcaa agctgcagca 6300
tatcaaatat agaaactgtg atagagttcc aacaaaagaa caacagacta ctagagatta 6360
ccagggaatt tagtgttaat gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttac atgttaacta 6420
atagtgaatt attgtcatta atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaagttaa 6480
tgtccaacaa tgttcaaata gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaaag 6540
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ggaaactaca cacatcccct ctatgtacaa ccaacacaaa agaagggtcc aacatctgtt 6660
taacaagaac tgacagagga tggtactgtg acaatgcagg atcagtatct ttcttcccac 6720
aagctgaaac atgtaaagtt caatcaaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa 6780
cattaccaag tgaagtaaat ctctgcaatg ttgacatatt caaccccaaa tatgattgta 6840
aaattatgac ttcaaaaaca gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg 6900
tgtcatgcta tggcaaaact aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga 6960
cattttctaa cgggtgcgat tatgtatcaa ataaaggggt ggacactgtg tctgtaggta 7020
acacattata ttatgtaaat aagcaagaag gtaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa 7080
taataaattt ctatgaccca ttagtattcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc 7140
aagtcaacga gaagattaac cagagcctag catttattcg taaatccgat gaattattac 7200
ataatgtaaa tgccggtaaa tccaccacaa atatcatgat aactactata attatagtga 7260
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gcacaccagt cacactaagc aaagatcaac tgagtggtat aaataatatt gcatttagta 7380
actaaataaa aatagcacct aatcatgttc ttacaatggt ttactatctg ctcatagaca 7440
acccatctgt cattggattt tcttaaaatc tgaacttcat tgaaactctc atctataaac 7500
catctcactt acactattta agtagattcc tagtttatag ttatataaaa cacaattgaa 7560
tgccagatta acttaccatc tgtaaaaatg aaaactgggg caaatatgtc acgaaggaat 7620
ccttgcaaat ttgaaattcg aggtcattgc ttaaatggta agaggtgtca ttttagtcat 7680
aattattttg aatggccacc gcatgcactg cttgtaagac aaaactttat gttaaacaga 7740
atacttaagt ctatggataa aagtatagat accttatcag aaataagtgg agctgcagag 7800
ttggacagaa cagaagagta tgctcttggt gtagttggag tgctagagag ttatatagga 7860
tcaataaaca atataactaa acaatcagca tgtgttgcca tgagcaaact cctcactgaa 7920
ctcaatagtg atgatatcaa aaagctgagg gacaatgaag agctaaattc acccaagata 7980
agagtgtaca atactgtcat atcatatatt gaaagcaaca ggaaaaacaa taaacaaact 8040
atccatctgt taaaaagatt gccagcagac gtattgaaga aaaccatcaa aaacacattg 8100
gatatccata agagcataac catcaacaac ccaaaagaat caactgttag tgatacaaat 8160
gaccatgcca aaaataatga tactacctga caaataacgt tcaattctaa cactcaccac 8220
atcgttacat tattaattca aacaattcaa gttgtgggac aaaatggatc ccattattaa 8280
tggaaattct gctaatgttt atctaaccga tagttattta aaaggtgtta tctctttctc 8340
agagtgtaat gctttaggaa gttacatatt caatggtcct tatctcaaaa atgattatac 8400
caacttaatt agtagacaaa atccattaat agaacacatg aatctaaaga aactaaatat 8460
aacacagtcc ttaatatcta agtatcataa aggtgaaata aaattagaag aacctactta 8520
ttttcagtca ttacttatga catacaagag tatgacctcg tcagaacaga ttgctaccac 8580
taatttactt aaaaagataa taagaagagc tatagaaata agtgatgtca aagtctatgc 8640
tatattgaat aaactagggc ttaaagaaaa ggacaagatt aaatccaaca atggacaaga 8700
tgaagacaac tcagttatta cgaccataat caaagatgat atactttcag ctgttaaaga 8760
taatcaatct catcttaaag cagacaaaaa tcactctaca aaacaaaaag acacaatcaa 8820
aacaacactc ttgaagaaat tgatgtgttc aatgcaacat cctccatcat ggttaataca 8880
ttggtttaac ttatacacaa aattaaacaa catattaaca cagtatcgat caaatgaggt 8940
aaaaaaccat gggtttacat tgatagataa tcaaactctt agtggatttc aatttatttt 9000
gaaccaatat ggttgtatag tttatcataa ggaactcaaa agaattactg tgacaaccta 9060
taatcaattc ttgacatgga aagatattag ccttagtaga ttaaatgttt gtttaattac 9120
atggattagt aactgcttga acacattaaa taaaagctta ggcttaagat gcggattcaa 9180
taatgttatc ttgacacaac tattccttta tggagattgt atactaaagc tatttcacaa 9240
tgaggggttc tacataataa aagaggtaga gggatttatt atgtctctaa ttttaaatat 9300
aacagaagaa gatcaattca gaaaacgatt ttataatagt atgctcaaca acatcacaga 9360
tgctgctaat aaagctcaga aaaatctgct atcaagagta tgtcatacat tattagataa 9420
gacagtgtcc gataatataa taaatggcag atggataatt ctattaagta agttccttaa 9480
attaattaag cttgcaggtg acaataacct taacaatctg agtgaactat attttttgtt 9540
cagaatattt ggacacccaa tggtagatga aagacaagcc atggatgctg ttaaaattaa 9600
ttgcaatgag accaaatttt acttgttaag cagtctgagt atgttaagag gtgcctttat 9660
atatagaatt ataaaagggt ttgtaaataa ttacaacaga tggcctactt taagaaatgc 9720
tattgtttta cccttaagat ggttaactta ctataaacta aacacttatc cttctttgtt 9780
ggaacttaca gaaagagatt tgattgtgtt atcaggacta cgtttctatc gtgagtttcg 9840
gttgcctaaa aaagtggatc ttgaaatgat tataaatgat aaagctatat cacctcctaa 9900
aaatttgata tggactagtt tccctagaaa ttacatgcca tcacacatac aaaactatat 9960
agaacatgaa aaattaaaat tttccgagag tgataaatca agaagagtat tagagtatta 10020
tttaagagat aacaaattca atgaatgtga tttatacaac tgtgtagtta atcaaagtta 10080
tctcaacaac cctaatcatg tggtatcatt gacaggcaaa gaaagagaac tcagtgtagg 10140
tagaatgttt gcaatgcaac cgggaatgtt cagacaggtt caaatattgg cagagaaaat 10200
gatagctgaa aacattttac aattctttcc tgaaagtctt acaagatatg gtgatctaga 10260
actacaaaaa atattagaat tgaaagcagg aataagtaac aaatcaaatc gctacaatga 10320
taattacaac aattacatta gtaagtgctc tatcatcaca gatctcagca aattcaatca 10380
agcatttcga tatgaaacgt catgtatttg tagtgatgtg ctggatgaac tgcatggtgt 10440
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aagtggatta tatagatatc acatgggtgg catcgaaggg tggtgtcaaa aactatggac 10620
catagaagct atatcactat tggatctaat atctctcaaa gggaaattct caattactgc 10680
tttaattaat ggtgacaatc aatcaataga tataagcaaa ccaatcagac tcatggaagg 10740
tcaaactcat gctcaagcag attatttgct agcattaaat agccttaaat tactgtataa 10800
agagtatgca ggcataggcc acaaattaaa aggaactgag acttatatat cacgagatat 10860
gcaatttatg agtaaaacaa ttcaacataa cggtgtatat tacccagcta gtataaagaa 10920
agtcctaaga gtgggaccgt ggataaacac tatacttgat gatttcaaag tgagtctaga 10980
atctataggt agtttgacac aagaattaga atatagaggt gaaagtctat tatgcagttt 11040
aatatttaga aatgtatggt tatataatca gattgctcta caattaaaaa atcatgcatt 11100
atgtaacaat aaactatatt tggacatatt aaaggttctg aaacacttaa aaaccttttt 11160
taatcttgat aatattgata cagcattaac attgtatatg aatttaccca tgttatttgg 11220
tggtggtgat cccaacttgt tatatcgaag tttctataga agaactcctg acttcctcac 11280
agaggctata gttcactctg tgttcatact tagttattat acaaaccatg acttaaaaga 11340
taaacttcaa gatctgtcag atgatagatt gaataagttc ttaacatgca taatcacgtt 11400
tgacaaaaac cctaatgctg aattcgtaac attgatgaga gatcctcaag ctttagggtc 11460
tgagagacaa gctaaaatta ctagcgaaat caatagactg gcagttacag aggttttgag 11520
tacagctcca aacaaaatat tctccaaaag tgcacaacat tatactacta cagagataga 11580
tctaaatgat attatgcaaa atatagaacc tacatatcct catgggctaa gagttgttta 11640
tgaaagttta cccttttata aagcagagaa aatagtaaat cttatatcag gtacaaaatc 11700
tataactaac atactggaaa aaacttctgc catagactta acagatattg atagagccac 11760
tgagatgatg aggaaaaaca taactttgct tataaggata cttccattgg attgtaacag 11820
agataaaaga gagatattga gtatggaaaa cctaagtatt actgaattaa gcaaatatgt 11880
tagggaaaga tcttggtctt tatccaatat agttggtgtt acatcaccca gtatcatgta 11940
tacaatggac atcaaatata ctacaagcac tatatctagt ggcataatta tagagaaata 12000
taatgttaac agtttaacac gtggtgagag aggacccact aaaccatggg ttggttcatc 12060
tacacaagag aaaaaaacaa tgccagttta taatagacaa gtcttaacca aaaaacagag 12120
agatcaaata gatctattag caaaattgga ttgggtgtat gcatctatag ataacaagga 12180
tgaattcatg gaagaactca gcataggaac ccttgggtta acatatgaaa aggccaagaa 12240
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ccctattaat cgcatattaa cagaaaagta tggtgatgaa gatattgaca tagtattcca 12420
aaactgtata agctttggcc ttagtttaat gtcagtagta gaacaattta ctaatgtatg 12480
tcctaacaga attattctca tacctaagct taatgagata catttgatga aacctcccat 12540
attcacaggt gatgttgata ttcacaagtt aaaacaagtg atacaaaaac agcatatgtt 12600
tttaccagac aaaataagtt tgactcaata tgtggaatta ttcttaagta ataaaacact 12660
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tcataatact tacattttaa gtactaattt agctggacat tggattctga ttatacaact 12780
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agttatcaaa tacattctta gccaagatgc aagtttacat agagtaaaag gatgtcatag 13080
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tataactata ttaaaaactt atgtatgctt aggcagtaag ttaaagggat cggaggttta 14280
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atgaataaag atcttataat aaaaattccc atagctatac actaacactg tattcaatta 14820
tagttattaa aaattaaaaa tcatataatt ttttaaataa cttttagtga actaatccta 14880
aagttatcat tttaatcttg gaggaataaa tttaaaccct aatctaattg gtttatatgt 14940
gtattaacta aattacgaga tattagtttt tgacactttt tttctcgt 14988
<210> 13
<211> 2165
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 13
Met Asp Pro Ile Ile Asn Gly Asn Ser Ala Asn Val Tyr Leu Thr Asp
1 5 10 15
Ser Tyr Leu Lys Gly Val Ile Ser Phe Ser Glu Cys Asn Ala Leu Gly
20 25 30
Ser Tyr Ile Phe Asn Gly Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Tyr Thr Asn Leu
35 40 45
Ile Ser Arg Gln Asn Pro Leu Ile Glu His Met Asn Leu Lys Lys Leu
50 55 60
Asn Ile Thr Gln Ser Leu Ile Ser Lys Tyr His Lys Gly Glu Ile Lys
65 70 75 80
Leu Glu Glu Pro Thr Tyr Phe Gln Ser Leu Leu Met Thr Tyr Lys Ser
85 90 95
Met Thr Ser Ser Glu Gln Ile Ala Thr Thr Asn Leu Leu Lys Lys Ile
100 105 110
Ile Arg Arg Ala Ile Glu Ile Ser Asp Val Lys Val Tyr Ala Ile Leu
115 120 125
Asn Lys Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asp Lys Ile Lys Ser Asn Asn Gly
130 135 140
Gln Asp Glu Asp Asn Ser Val Ile Thr Thr Ile Ile Lys Asp Asp Ile
145 150 155 160
Leu Ser Ala Val Lys Asp Asn Gln Ser His Leu Lys Ala Asp Lys Asn
165 170 175
His Ser Thr Lys Gln Lys Asp Thr Ile Lys Thr Thr Leu Leu Lys Lys
180 185 190
Leu Met Cys Ser Met Gln His Pro Pro Ser Trp Leu Ile His Trp Phe
195 200 205
Asn Leu Tyr Thr Lys Leu Asn Asn Ile Leu Thr Gln Tyr Arg Ser Asn
210 215 220
Glu Val Lys Asn His Gly Phe Thr Leu Ile Asp Asn Gln Thr Leu Ser
225 230 235 240
Gly Phe Gln Phe Ile Leu Asn Gln Tyr Gly Cys Ile Val Tyr His Lys
245 250 255
Glu Leu Lys Arg Ile Thr Val Thr Thr Tyr Asn Gln Phe Leu Thr Trp
260 265 270
Lys Asp Ile Ser Leu Ser Arg Leu Asn Val Cys Leu Ile Thr Trp Ile
275 280 285
Ser Asn Cys Leu Asn Thr Leu Asn Lys Ser Leu Gly Leu Arg Cys Gly
290 295 300
Phe Asn Asn Val Ile Leu Thr Gln Leu Phe Leu Tyr Gly Asp Cys Ile
305 310 315 320
Leu Lys Leu Phe His Asn Glu Gly Phe Tyr Ile Ile Lys Glu Val Glu
325 330 335
Gly Phe Ile Met Ser Leu Ile Leu Asn Ile Thr Glu Glu Asp Gln Phe
340 345 350
Arg Lys Arg Phe Tyr Asn Ser Met Leu Asn Asn Ile Thr Asp Ala Ala
355 360 365
Asn Lys Ala Gln Lys Asn Leu Leu Ser Arg Val Cys His Thr Leu Leu
370 375 380
Asp Lys Thr Val Ser Asp Asn Ile Ile Asn Gly Arg Trp Ile Ile Leu
385 390 395 400
Leu Ser Lys Phe Leu Lys Leu Ile Lys Leu Ala Gly Asp Asn Asn Leu
405 410 415
Asn Asn Leu Ser Glu Leu Tyr Phe Leu Phe Arg Ile Phe Gly His Pro
420 425 430
Met Val Asp Glu Arg Gln Ala Met Asp Ala Val Lys Ile Asn Cys Asn
435 440 445
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305 310 315 320
Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys
325 330 335
Ala Gly Gly Thr Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala
340 345 350
Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala
355 360 365
Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala
370 375 380
Thr Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala
385 390 395 400
Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Thr Thr Cys Thr Thr Gly Cys Thr Ala Gly Gly Thr Gly Thr Gly
420 425 430
Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys Thr Thr
435 440 445
Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys
450 455 460
Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly
465 470 475 480
Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ala Thr Ala
485 490 495
Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ala Gly Thr Cys Cys Gly Cys Ala Cys Thr
500 505 510
Gly Cys Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Thr Ala Ala Gly
515 520 525
Gly Cys Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr
530 535 540
Cys Thr Ala Ala Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ala Gly Thr Gly Thr
545 550 555 560
Gly Cys Thr Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys
565 570 575
Cys Thr Cys Gly Ala Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr
580 585 590
Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Thr Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr
595 600 605
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Ala Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala
625 630 635 640
Thr Thr Ala Gly Thr Ala Ala Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala Cys
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Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys
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Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly
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Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Gly
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Gly Cys Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Ala Cys Ala Cys Cys Cys
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1700 1705 1710
Thr Thr Thr Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala Ala
1715 1720 1725
<210> 16
<211> 17214
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 16
accaaacaag agaagagact ggtttgggaa tattaattca aataaaaatt aacttaggat 60
taaagaactt taccgaaagg taaggggaaa gaaatcctaa gagcttagcc atgttgagtc 120
tattcgacac attcagtgcg cgtaggcagg agaacataac gaaatcagct ggtggggctg 180
ttattcccgg gcaaaaaaac actgtgtcta tatttgctct tggaccatca ataacagatg 240
acaatgataa aatgacattg gctcttctct ttttgtctca ttctttagac aatgaaaagc 300
agcatgcgca aagagctgga tttttagttt ctctgttatc aatggcttat gccaacccag 360
aattatattt aacatcaaat ggtagtaatg cagatgttaa atatgttatc tacatgatag 420
agaaagaccc aggaagacag aaatatggtg ggtttgtcgt caagactaga gagatggttt 480
atgaaaagac aactgattgg atgttcggga gtgatcttga gtatgatcaa gacaatatgt 540
tgcaaaatgg tagaagcact tctacaatcg aggatcttgt tcatactttt ggatatccat 600
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ttaaatccag tctagtgttg agcggtgatg cagtagaaca aattggatca attatgaggt 780
cccaacagag cttggtaaca ctcatggttg aaacactgat aacaatgaac acaggcagga 840
atgatctgac aacaatagaa aagaatatac agattgtagg aaactacatc agagatgcag 900
gtcttgcttc atttttcaac acaatcagat atggcattga gactagaatg gcagctctaa 960
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caaaggggcc acgtgctcct tttatatgca ttttgagaga tcccgtgcat ggtgagtttg 1080
caccaggcaa ctatcctgcc ctctggagtt atgcgatggg tgtagcagtt gtacaaaaca 1140
aggccatgca acagtatgta acaggaaggt cttatctgga tattgaaatg ttccaacttg 1200
gtcaagcagt ggcacgtgat gccgagtcgc agatgagttc aatattagag gatgaactgg 1260
gggtcacaca agaagccaag caaagcttga agaaacacat gaagaacatc agcagttcag 1320
atacaacctt tcataagcct acagggggat cagccataga aatggcgata gatgaagaag 1380
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ttccttatgc atgggcagac gaaaccggga atgacaatca aactgaatca actacagaaa 1500
ttgacagcat caaaactgaa caaagaaaca tcagagacag gctgaacaaa agactcaacg 1560
agaaaaggaa acagagtgac ccgagatcaa ctgacatcac aaacaacaca aatcaaactg 1620
aaatagatga tttgttcagt gcattcggaa gcaactagtc acaaagagat gaccaggcgc 1680
gccaagtaag aaaaacttag gattaatgga cctgcaggat ggaactgctg atcctgaaag 1740
ccaacgctat tactactatc ctgaccgccg tgacattttg cttcgcatct ggacagaaca 1800
ttactgagga attctaccag tcaacatgca gcgccgtgtc caaaggatac ctgagcgccc 1860
tgcggaccgg ctggtataca tcagtgatta ctatcgagct gtccaacatc aaggaaaaca 1920
aatgtaatgg gaccgacgca aaggtgaaac tgatcaagca ggagctggat aagtacaaaa 1980
atgccgtgac agaactgcag ctgctgatgc agtccacacc agcaactaac aatcgcgccc 2040
ggagagagct gccccggttc atgaactata ccctgaacaa tgctaagaaa accaatgtga 2100
cactgtccaa gaaacgcaag aggcgcttcc tgggatttct gctgggcgtg gggtctgcca 2160
tcgctagtgg agtggccgtc tgcaaagtcc tgcacctgga gggcgaagtg aacaagatca 2220
aaagcgccct gctgtccact aacaaggcag tggtcagtct gtcaaatggc gtgtccgtcc 2280
tgaccttcaa ggtgctggac ctgaaaaatt atattgataa gcagctgctg cctatcctga 2340
acaaacagag ctgctccatt tctaatatcg agacagtgat cgaattccag cagaagaaca 2400
atagactgct ggagattacc agagagttca gcgtgaacgc cggcgtcacc acacccgtgt 2460
ccacctacat gctgacaaat agtgagctgc tgtcactgat taacgacatg cctatcacca 2520
atgatcagaa gaaactgatg tccaacaatg tgcagatcgt cagacagcag agttactcaa 2580
tcatgtgcat cattaaggag gaagtcctgg cctacgtggt ccagctgcca ctgtatggcg 2640
tgatcgacac cccctgctgg aaactgcata catctcctct gtgcactacc aacacaaagg 2700
aaggaagtaa tatctgcctg actcgaaccg accggggatg gtactgtgat aacgcaggca 2760
gcgtgtcctt ctttccacag gccgagacct gcaaggtcca gagcaacagg gtgttctgtg 2820
acactatgaa tagcctgacc ctgccttccg aagtcaacct gtgcaatgtg gacatcttta 2880
atccaaagta cgattgtaag atcatgacta gcaagaccga tgtcagctcc tctgtgatta 2940
cttctctggg ggccatcgtg agttgctacg gaaagacaaa atgtactgcc agcaacaaaa 3000
atcgcggcat cattaagacc ttctccaacg ggtgcgacta tgtctctaac aagggcgtgg 3060
atacagtgag tgtcgggaac actctgtact atgtcaataa gcaggaggga aaaagcctgt 3120
acgtgaaggg cgaacccatc attaacttct atgaccccct ggtgttccct tccgacgagt 3180
ttgatgcatc tattagtcag gtgaacgaaa aaatcaatca gagtctggcc tttattcgga 3240
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ccacaatcat catcgtgatt atcgtcattc tgctgtcact gatcgctgtg gggctgctgc 3360
tgtactgtaa ggcaagaagc accccagtca ctctgtcaaa agaccagctg tcagggatta 3420
acaacattgc cttcagtaac tgatagctag cggcgcgcca gcaacaagta agaaaaactt 3480
aggattaatg gaaattatcc aatccagaga cggaaggaca aatccagaat ccaaccacaa 3540
ctcaatcaac caaagattca tggaagacaa tgttcaaaac aatcaaatca tggattcttg 3600
ggaagaggga tcaggagata aatcatctga catctcatcg gccctcgaca tcattgaatt 3660
catactcagc accgactccc aagagaacac ggcagacagc aatgaaatca acacaggaac 3720
cacaagactt agcacgacaa tctaccaacc tgaatccaaa acaacagaaa caagcaagga 3780
aaatagtgga ccagctaaca aaaatcgaca gtttggggca tcacacgaac gtgccacaga 3840
gacaaaagat agaaatgtta atcaggagac tgtacaggga ggatatagga gaggaagcag 3900
cccagatagt agaactgaga ctatggtcac tcgaagaatc tccagaagca gcccagatcc 3960
taacaatgga acccaaatcc aggaagatat tgattacaat gaagttggag agatggataa 4020
ggactctact aagagggaaa tgcgacaatt taaagatgtt ccagtcaagg tatcaggaag 4080
tgatgccatt cctccaacaa aacaagatgg agacggtgat gatggaagag gcctggaatc 4140
tatcagtaca tttgattcag gatataccag tatagtgact gccgcaacac tagatgacga 4200
agaagaactc cttatgaaga acaacaggcc aagaaagtat caatcaacac cccagaacag 4260
tgacaaggga attaaaaaag gggttggaag gccaaaagac acagacaaac aatcatcaat 4320
attggactac gaactcaact tcaaaggatc gaagaagagc cagaaaatcc tcaaagccag 4380
cacgaataca ggagaaccaa caagaccaca gaatggatcc caggggaaga gaatcacatc 4440
ctggaacatc ctcaacagcg agagcggcaa tcgaacagaa tcaacaaacc aaacccatca 4500
gacatcaacc tcgggacaga accacacaat gggaccaagc agaacaacct ccgaaccaag 4560
gatcaagaca caaaagacgg atggaaagga aagagaggac acagaagaga gcactcgatt 4620
tacagaaagg gcgattacat tattacagaa tcttggtgta atccaatctg cagcaaaatt 4680
agacctatac caagacaaga gagttgtgtg tgtggcgaat gtcctaaaca atgcagatac 4740
tgcatcaaag atagacttcc tagcaggttt gatgatagga gtgtcaatgg atcatgatac 4800
caaattaaat cagattcaga acgagatatt aagtttgaaa actgatctta aaaagatgga 4860
tgaatcacat agaagactaa ttgagaatca aaaagaacaa ttatcactga tcacatcatt 4920
aatctcaaat cttaaaatta tgacagagag aggagggaag aaggaccaac cagaacctag 4980
cgggaggaca tccatgatca agacaaaagc aaaagaagag aaaataaaga aagtcaggtt 5040
tgaccctctt atggaaacac agggcatcga gaaaaacatc cctgacctct atagatcaat 5100
agagaaaaca ccagaaaacg acacacagat caaatcagaa ataaacagat tgaatgatga 5160
atccaatgcc actagattag tacctagaag aataagcagt acaatgagat cattaataat 5220
aatcattaac aacagcaatt tatcatcaaa agcaaagcaa tcatacatca acgaactcaa 5280
gctctgcaag agtgacgagg aagtgtctga gttgatggac atgttcaatg aggatgtcag 5340
ctcccagtaa accgccaacc aagggtcaac accaagaaaa ccaatagcac aaaacagcca 5400
atcagagacc accccaatac accaaaccaa tcaacacata acaaagatcg cggccgcata 5460
gatgattaag aaaaacttag gatgaaagga ctaatcaatc ctccgaaaca atgagcatca 5520
ccaactccac aatctacaca ttcccagaat cctctttctc cgagaatggc aacatagagc 5580
cgttaccact caaggtcaat gaacagagaa aggccatacc tcatattagg gttgtcaaga 5640
taggagatcc gcccaaacat ggatccagat atctggatgt ctttttactg ggcttctttg 5700
agatggaaag gtcaaaagac aggtatggga gcataagtga tctagatgat gatccaagtt 5760
acaaggtttg tggctctgga tcattgccac ttgggttggc tagatacacc ggaaatgatc 5820
aggaactcct acaggctgca accaagctcg atatagaagt aagaagaact gtaaaggcta 5880
cggagatgat agtttacact gtacaaaaca tcaaacctga actatatcca tggtccagta 5940
gattaagaaa agggatgtta tttgacgcta ataaggttgc acttgctcct caatgtcttc 6000
cactagatag agggataaaa ttcagggtga tatttgtgaa ctgcacagca attggatcaa 6060
taactctatt caaaatccct aagtccatgg cattgttatc attgcctaat acaatatcaa 6120
taaatctaca agtacatatc aaaacaggag ttcagacaga ttccaaagga gtagttcaga 6180
ttctagatga aaaaggtgaa aaatcactaa atttcatggt tcatctcggg ttgatcaaaa 6240
ggaagatggg cagaatgtac tcagttgaat attgtaagca gaagatcgag aagatgagat 6300
tattattctc attgggatta gttggaggga tcagcttcca cgtcaacgca actggctcta 6360
tatcaaagac attagcaagt caattagcat tcaaaagaga aatctgctat cccctaatgg 6420
atctgaatcc acacttaaat tcagttatat gggcatcatc agttgaaatt acaagggtag 6480
atgcagttct ccagccttca ttacctggcg aattcagata ctacccaaac atcatagcaa 6540
aaggggtcgg gaaaatcaga cagtaaaatc aacaaccctg atatccaccg gtgtattaag 6600
ccgaagcaaa taaaggataa tcaaaaactt aggacaaaag aggtcaatac caacaactat 6660
tagcagtcac actcgcaaga ataagagaga agggaccaaa aaagtcaaat aggagaaatc 6720
aaaacaaaag gtacagaaca ccagaacaac aaaatcaaaa catccaactc actcaaaaca 6780
aaaattccaa aagagaccgg caacacaaca agcactgaac acaatgccaa cttcaatact 6840
gctaattatt acaaccatga tcatggcatc tttctgccaa atagatatca caaaactaca 6900
gcacgtaggt gtattggtca acagtcccaa agggatgaag atatcacaaa actttgaaac 6960
aagatatcta attttgagcc tcataccaaa aatagaagac tctaactctt gtggtgacca 7020
acagatcaag caatacaaga agttattgga tagactgatc atccctttat atgatggatt 7080
aagattacag aaagatgtga tagtaaccaa tcaagaatcc aatgaaaaca ctgatcccag 7140
aacaaaacga ttctttggag gggtaattgg aaccattgct ctgggagtag caacctcagc 7200
acaaattaca gcggcagttg ctctggttga agccaagcag gcaagatcag acatcgaaaa 7260
actcaaagaa gcaattaggg acacaaacaa agcagtgcag tcagttcaga gctccatagg 7320
aaatttaata gtagcaatta aatcagtcca ggattatgtt aacaaagaaa tcgtgccatc 7380
gattgcgagg ctaggttgtg aagcagcagg acttcaatta ggaattgcat taacacagca 7440
ttactcagaa ttaacaaaca tatttggtga taacatagga tcgttacaag aaaaaggaat 7500
aaaattacaa ggtatagcat cattataccg cacaaatatc acagaaatat tcacaacatc 7560
aacagttgat aaatatgata tctatgatct gttatttaca gaatcaataa aggtgagagt 7620
tatagatgtt gacttgaatg attactcaat caccctccaa gtcagactcc ctttattaac 7680
taggctgctg aacactcaga tctacaaagt agattccata tcatataaca tccaaaacag 7740
agaatggtat atccctcttc ccagccatat catgacgaaa ggggcatttc taggtggagc 7800
agacgtcaaa gaatgtatag aagcattcag cagctatata tgcccttctg atccaggatt 7860
tgtattaaac catgaaatag agagctgctt atcaggaaac atatcccaat gtccaagaac 7920
aacggtcaca tcagacattg ttccaagata tgcatttgtc aatggaggag tggttgcaaa 7980
ctgtataaca accacctgta catgcaacgg aattggtaat agaatcaatc aaccacctga 8040
tcaaggagta aaaattataa cacataaaga atgtagtaca ataggtatca acggaatgct 8100
gttcaataca aataaagaag gaactcttgc attctataca ccaaatgata taacactaaa 8160
caattctgtt gcacttgatc caattgacat atcaatcgag ctcaacaagg ccaaatcaga 8220
tctagaagaa tcaaaagaat ggataagaag gtcaaatcaa aaactagatt ctattggaaa 8280
ttggcatcaa tctagcacta caatcataat tattttgata atgatcatta tattgtttat 8340
aattaatata acgataatta caattgcaat taagtattac agaattcaaa agagaaatcg 8400
agtggatcaa aatgacaagc catatgtact aacaaacaaa taacatatct acagatcatt 8460
agatattaaa attataaaaa acttaggagt aaagttacgc aatccaactc tactcatata 8520
attgaggaag gacccaatag acaaatccaa attcgagatg gaatactgga agcataccaa 8580
tcacggaaag gatgctggta atgagctgga gacgtctatg gctactcatg gcaacaagct 8640
cactaataag ataatataca tattatggac aataatcctg gtgttattat caatagtctt 8700
catcatagtg ctaattaatt ccatcaaaag tgaaaaggcc cacgaatcat tgctgcaaga 8760
cataaataat gagtttatgg aaattacaga aaagatccaa atggcatcgg ataataccaa 8820
tgatctaata cagtcaggag tgaatacaag gcttcttaca attcagagtc atgtccagaa 8880
ttacatacca atatcattga cacaacagat gtcagatctt aggaaattca ttagtgaaat 8940
tacaattaga aatgataatc aagaagtgct gccacaaaga ataacacatg atgtaggtat 9000
aaaaccttta aatccagatg atttttggag atgcacgtct ggtcttccat ctttaatgaa 9060
aactccaaaa ataaggttaa tgccagggcc gggattatta gctatgccaa cgactgttga 9120
tggctgtgtt agaactccgt ctttagttat aaatgatctg atttatgctt atacctcaaa 9180
tctaattact cgaggttgtc aggatatagg aaaatcatat caagtcttac agatagggat 9240
aataactgta aactcagact tggtacctga cttaaatcct aggatctctc atacctttaa 9300
cataaatgac aataggaagt catgttctct agcactccta aatacagatg tatatcaact 9360
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tgtacttgat attgtcaatt atgatggttc aatctcaaca acaagattta agaataataa 9480
cataagcttt gatcaaccat atgctgcact atacccatct gttggaccag ggatatacta 9540
caaaggcaaa ataatatttc tcgggtatgg aggtcttgaa catccaataa atgagaatgt 9600
aatctgcaac acaactgggt gccccgggaa aacacagaga gactgtaatc aagcatctca 9660
tagtccatgg ttttcagata ggaggatggt caactccatc attgttgttg acaaaggctt 9720
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agagtaatga atttatatat gataaggacc ctttaaagga tatagatcta tcaaaattaa 14640
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aaagggatta tgggataatg aggccatatc atacagcact gcaaattttt ggattccaaa 16560
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acataaaaac aaaaaataaa acacctattc ctcacccatt cacttccaac aaaatgaaaa 17160
gtaagaaaaa catgtaatat atatatacca aacagagttt ttctcttgtt tggt 17214
<210> 17
<211> 17220
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 17
accaaacaag agaagagact ggtttgggaa tattaattca aataaaaatt aacttaggat 60
taaagaactt taccgaaagg taaggggaaa gaaatcctaa gagcttagcc atgttgagtc 120
tattcgacac attcagtgcg cgtaggcagg agaacataac gaaatcagct ggtggggctg 180
ttattcccgg gcaaaaaaac actgtgtcta tatttgctct tggaccatca ataacagatg 240
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cgtgtcttgg agcccttata atccaagttt ggataatact tgttaaggct ataaccagta 660
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ttaaatccag tctagtgttg agcggtgatg cagtagaaca aattggatca attatgaggt 780
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ccagtagatt aagaaaaggg atgttatttg acgctaataa ggttgcactt gctcctcaat 6000
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<210> 18
<211> 14589
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 18
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gctatcacaa atgcaaaaat catcccttac tcaggattac tattagtcat cacagtgact 3360
gacaacaaag gagcattcaa atacataaag ccacaaagtc aattcatagt agatcttgga 3420
gcttacctag aaaaagaaag tatatattat gttaccacaa attggaagca cacagctaca 3480
cgatttgcaa tcaaacccat ggaagattaa cctttttcct ctacatcagt gtgttaattc 3540
atacaaactt tctacctaca ttcttcactt caccatcaca atcacaaaca ctctgtggtt 3600
caaccaatca aacaaaactt atctgaagtc ccagatcatc ccaagtcatt gtttatcaga 3660
tctagtactc aaataagtta ataaaaaata tacacatggg gcaaataatc attggaggaa 3720
atccaactaa tcacaatatc tgttaacata gacaagtcca cacaccatac agaatcaacc 3780
aatggaaaat acatccataa caatagaatt ctcaagcaaa ttctggcctt actttacact 3840
aatacacatg atcacaacaa taatctcttt gctaatcata atctccatca tgattgcaat 3900
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tcgagttaat acttgataaa gtagttaatt aaaaatagtc ataacaatga actaggatat 4020
caagactaac aataacattg gggcaaatgc aaacatgtcc aaaaacaagg accaacgcac 4080
cgctaagaca ttagaaagga cctgggacac tctcaatcat ttattattca tatcatcgtg 4140
cttatataag ttaaatctta aatctgtagc acaaatcaca ttatccattc tggcaatgat 4200
aatctcaact tcacttataa ttgcagccat catattcata gcctcggcaa accacaaagt 4260
cacaccaaca actgcaatca tacaagatgc aacaagccag atcaagaaca caaccccaac 4320
atacctcacc cagaatcctc agcttggaat cagtccctct aatccgtctg aaattacatc 4380
acaaatcacc accatactag cttcaacaac accaggagtc aagtcaaccc tgcaatccac 4440
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acaacgccaa aacaaaccac caagcaaacc caataatgat tttcactttg aagtgttcaa 4560
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gacaaccaaa aaagatccca aacctcaaac cactaaatca aaggaagtac ccaccaccaa 4740
gcccacagaa gagccaacca tcaacaccac caaaacaaac atcataacta cactactcac 4800
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ctccgaaggc aatccaagcc cttctcaagt ctctacaaca tccgagtacc catcacaacc 4920
ttcatctcca cccaacacac cacgccagta gttacttaaa aacatattat cacaaaaggc 4980
cttgaccaac ttaaacagaa tcaaaataaa ctctggggca aataacaatg gagttgctaa 5040
tcctcaaagc aaatgcaatt accacaatcc tcactgcagt cacattttgt tttgcttctg 5100
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ttagtgctct gagaactggt tggtatacca gtgttataac tatagaatta agtaatatca 5220
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aatataaaaa tgctgtaaca gaattgcagt tgctcatgca aagcacacaa gcaacaaaca 5340
atcgagccag aagagaacta ccaaggttta tgaattatac actcaacaat gccaaaaaaa 5400
ccaatgtaac attaagcaag aaaaggaaaa gaagatttct tggttttttg ttaggtgttg 5460
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ttagtgtttt aaccagcaaa gtgttagacc tcaaaaacta tatagataaa caattgttac 5640
ctattgtgaa caagcaaagc tgcagcatat caaatataga aactgtgata gagttccaac 5700
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cacctgtaag cacttacatg ttaactaata gtgaattatt gtcattaatc aatgatatgc 5820
ctataacaaa tgatcagaaa aagttaatgt ccaacaatgt tcaaatagtt agacagcaaa 5880
gttactctat catgtccata ataaaagagg aagtcttagc atatgtagta caattaccac 5940
tatatggtgt tatagataca ccctgttgga aactacacac atcccctcta tgtacaacca 6000
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ccgttatcac atctctagga gccattgtgt catgctatgg caaaactaaa tgtacagcat 6300
ccaataaaaa tcgtggaatc ataaagacat tttctaacgg gtgcgattat gtatcaaata 6360
aaggggtgga cactgtgtct gtaggtaaca cattatatta tgtaaataag caagaaggta 6420
aaagtctcta tgtaaaaggt gaaccaataa taaatttcta tgacccatta gtattcccct 6480
ctgatgaatt tgatgcatca atatctcaag tcaacgagaa gattaaccag agcctagcat 6540
ttattcgtaa atccgatgaa ttattacata atgtaaatgc tggtaaatcc accacaaata 6600
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gtggtataaa taatattgca tttagtaact aaataaaaat agcacctaat catgttctta 6780
caatggttta ctatctgctc atagacaacc catctgtcat tggattttct taaaatctga 6840
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tttatagtta tataaaacac aattgcatgc cagattaact taccatctgt aaaaatgaaa 6960
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caaaatggat cccattatta atggaaattc tgctaatgtt tatctaaccg atagttattt 7920
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tatactttca gctgttaaag ataatcaatc tcatcttaaa gcagacaaaa atcactctac 8400
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tatgctcaac aacatcacag atgctgctaa taaagctcag aaaaatctgc tatcaagagt 9000
atgtcataca ttattagata agacagtgtc cgataatata ataaatggca gatggataat 9060
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tatgttaaga ggtgccttta tatatagaat tataaaaggg tttgtaaata attacaacag 9300
atggcctact ttaagaaatg ctattgtttt acccttaaga tggttaactt actataaact 9360
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agaaagagaa ctcagtgtag gtagaatgtt tgcaatgcaa ccgggaatgt tcagacaggt 9780
tcaaatattg gcagagaaaa tgatagctga aaacatttta caattctttc ctgaaagtct 9840
tacaagatat ggtgatctag aactacaaaa aatattagaa ctgaaagcag gaataagtaa 9900
caaatcaaat cgctacaatg ataattacaa caattacatt agtaagtgct ctatcatcac 9960
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cactaacact gtattcaatt atagttatta aaaattaaaa atcatataat tttttaaata 14460
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ttttctcgt 14589
<210> 19
<211> 14586
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 19
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gaatttgaaa acatagtaac atcaaaaaaa gtcataatac caacatacct aagatccatc 3240
agtgtcagaa ataaagatct gaacacactt gaaaatataa caaccactga attcaaaaat 3300
gctatcacaa atgcaaaaat catcccttac tcaggattac tattagtcat cacagtgact 3360
gacaacaaag gagcattcaa atacataaag ccacaaagtc aattcatagt agatcttgga 3420
gcttacctag aaaaagaaag tatatattat gttaccacaa attggaagca cacagctaca 3480
cgatttgcaa tcaaacccat ggaagattaa cctttttcct ctacatcagt gtgttaattc 3540
atacaaactt tctacctaca ttcttcactt caccatcaca atcacaaaca ctctgtggtt 3600
caaccaatca aacaaaactt atctgaagtc ccagatcatc ccaagtcatt gtttatcaga 3660
tctagtactc aaataagtta ataaaaaata tacacatggg gcaaataatc attggaggaa 3720
atccaactaa tcacaatatc tgttaacata gacaagtcca cacaccatac agaatcaacc 3780
aatggaaaat acatccataa caatagaatt ctcaagcaaa ttctggcctt actttacact 3840
aatacacatg atcacaacaa taatctcttt gctaatcata atctccatca tgattgcaat 3900
actaaacaaa ctttgtgaat ataacgtatt ccataacaaa acctttgagt taccaagagc 3960
tcgagttaat acttgataaa gtagttaatt aaaaatagtc ataacaatga actaggatat 4020
caagactaac aataacattg gggcaaatgc aaacatgtcc aaaaacaagg accaacgcac 4080
cgctaagaca ttagaaagga cctgggacac tctcaatcat ttattattca tatcatcgtg 4140
cttatataag ttaaatctta aatctgtagc acaaatcaca ttatccattc tggcaatgat 4200
aatctcaact tcacttataa ttgcagccat catattcata gcctcggcaa accacaaagt 4260
cacaccaaca actgcaatca tacaagatgc aacaagccag atcaagaaca caaccccaac 4320
atacctcacc cagaatcctc agcttggaat cagtccctct aatccgtctg aaattacatc 4380
acaaatcacc accatactag cttcaacaac accaggagtc aagtcaaccc tgcaatccac 4440
aacagtcaag accaaaaaca caacaacaac tcaaacacaa cccagcaagc ccaccacaaa 4500
acaacgccaa aacaaaccac caagcaaacc caataatgat tttcactttg aagtgttcaa 4560
ctttgtaccc tgcagcatat gcagcaacaa tccaacctgc tgggctatct gcaaaagaat 4620
accaaacaaa aaaccaggaa agaaaaccac taccaagccc acaaaaaaac caaccctcaa 4680
gacaaccaaa aaagatccca aacctcaaac cactaaatca aaggaagtac ccaccaccaa 4740
gcccacagaa gagccaacca tcaacaccac caaaacaaac atcataacta cactactcac 4800
ctccaacacc acaggaaatc cagaactcac aagtcaaatg gaaaccttcc actcaacttc 4860
ctccgaaggc aatccaagcc cttctcaagt ctctacaaca tccgagtacc catcacaacc 4920
ttcatctcca cccaacacac cacgccagta gttacttaaa aacatattat cacaaaaggc 4980
cttgaccaac ttaaacagaa tcaaaataaa ctctggggca aataacaatg gagttgctaa 5040
tcctcaaagc aaatgcaatt accacaatcc tcactgcagt cacattttgt tttgcttctg 5100
gtcaaaacat cactgaagaa ttttatcaat caacatgcag tgcagttagc aaaggctatc 5160
ttagtgctct gagaactggt tggtatacca gtgttataac tatagaatta agtaatatca 5220
agaaaaataa gtgtaatgga acagatgcta aggtaaaatt gataaaacaa gaattagata 5280
aatataaaaa tgctgtaaca gaattgcagt tgctcatgca aagcacacaa gcaacaaaca 5340
atcgagccag aagagaacta ccaaggttta tgaattatac actcaacaat gccaaaaaaa 5400
ccaatgtaac attaagcaag aaaaggaaaa gaagatttct tggttttttg ttaggtgttg 5460
gatctgcaat cgccagtggc gttgctgtat ctaaggtcct gcacctagaa ggggaagtga 5520
acaagatcaa aagtgctcta ctatccacaa acaaggctgt agtcagctta tcaaatggag 5580
ttagtgtttt aaccagcaaa gtgttagacc tcaaaaacta tatagataaa caattgttac 5640
ctattgtgaa caagcaaagc tgcagcatat caaatataga aactgtgata gagttccaac 5700
aaaagaacaa cagactacta gagattacca gggaatttag tgttaatgca ggcgtaacta 5760
cacctgtaag cacttacatg ttaactaata gtgaattatt gtcattaatc aatgatatgc 5820
ctataacaaa tgatcagaaa aagttaatgt ccaacaatgt tcaaatagtt agacagcaaa 5880
gttactctat catgtccata ataaaagagg aagtcttagc atatgtagta caattaccac 5940
tatatggtgt tatagataca ccctgttgga aactacacac atcccctcta tgtacaacca 6000
acacaaaaga agggtccaac atctgtttaa caagaactga cagaggatgg tactgtgaca 6060
atgcaggatc agtatctttc ttcccacaag ctgaaacatg taaagttcaa tcaaatcgag 6120
tattttgtga cacaatgaac agtttaacat taccaagtga agtaaatctc tgcaatgttg 6180
acatattcaa ccccaaatat gattgtaaaa ttatgacttc aaaaacagat gtaagcagct 6240
ccgttatcac atctctagga gccattgtgt catgctatgg caaaactaaa tgtacagcat 6300
ccaataaaaa tcgtggaatc ataaagacat tttctaacgg gtgcgattat gtatcaaata 6360
aaggggtgga cactgtgtct gtaggtaaca cattatatta tgtaaataag caagaaggta 6420
aaagtctcta tgtaaaaggt gaaccaataa taaatttcta tgacccatta gtattcccct 6480
ctgatgaatt tgatgcatca atatctcaag tcaacgagaa gattaaccag agcctagcat 6540
ttattcgtaa atccgatgaa ttattacata atgtaaatgc tggtaaatcc accacaaata 6600
tcatgataac tactataatt atagtgatta tagtaatatt gttatcatta attgctgttg 6660
gactgctctt atactgtaag gccagaagca caccagtcac actaagcaaa gatcaactga 6720
gtggtataaa taatattgca tttagtaact aaataaaaat agcacctaat catgttctta 6780
caatggttta ctatctgctc atagacaacc catctgtcat tggattttct taaaatctga 6840
acttcatcga aactctcatc tataaaccat ctcacttaca ctatttaagt agattcctag 6900
tttatagtta tataaaacac aattgcatgc cagattaact taccatctgt aaaaatgaaa 6960
actggggcaa atatgtcacg aaggaatcct tgcaaatttg aaattcgagg tcattgctta 7020
aatggtaaga ggtgtcattt tagtcataat tattttgaat ggccacccca tgcactgctt 7080
gtaagacaaa actttatgtt aaacagaata cttaagtcta tggataaaag tatagatacc 7140
ttatcagaaa taagtggagc tgcagagttg gacagaacag aagagtatgc tcttggtgta 7200
gttggagtgc tagagagtta tataggatca ataaacaata taactaaaca atcagcatgt 7260
gttgccatga gcaaactcct cactgaactc aatagtgatg atatcaaaaa gctgagggac 7320
aatgaagagc taaattcacc caagataaga gtgtacaata ctgtcatatc atatattgaa 7380
agcaacagga aaaacaataa acaaactatc catctgttaa aaagattgcc agcagacgta 7440
ttgaagaaaa ccatcaaaaa cacattggat atccataaga gcataaccat caacaaccca 7500
aaagaatcaa ctgttagtga tacaaatgac catgccaaaa ataatgatac tacctgacaa 7560
atatccttgt agtataactt ccatactaat aacaagtaga tgtagagtta ctatgtataa 7620
tcaaaagaac acactatatt tcaatcaaaa caacccaaat aaccatatgt actcaccgaa 7680
tcaaacattc aatgaaatcc attggacctc tcaagaattg attgacacaa ttcaaaattt 7740
tctacaacat ctaggtatta ttgaggatat atatacaata tatatattag tgtcataaca 7800
ctcaattcta acactcacca catcgttaca ttattaattc aaacaattca agttgtggga 7860
caaaatggat cccattatta atggaaattc tgctaatgtt tatctaaccg atagttattt 7920
aaaaggtgtt atctctttct cagagtgtaa tgctttagga agttacatat tcaatggtcc 7980
ttatctcaaa aatgattata ccaacttaat tagtagacaa aatccattaa tagaacacat 8040
gaatctaaag aaactaaata taacacagtc cttaatatct aagtatcata aaggtgaaat 8100
aaaattagaa gaacctactt attttcagtc attacttatg acatacaaga gtatgacctc 8160
gtcagaacag attgctacca ctaatttact taaaaagata ataagaagag ctatagaaat 8220
aagtgatgtc aaagtctatg ctatattgaa taaactaggg cttaaagaaa aggacaagat 8280
taaatccaac aatggacaag atgaagacaa ctcagttatt acgaccataa tcaaagatga 8340
tatactttca gctgttaaag ataatcaatc tcatcttaaa gcagacaaaa atcactctac 8400
aaaacaaaaa gacacaatca aaacaacact cttgaagaaa ttgatgtgtt caatgcaaca 8460
tcctccatca tggttaatac attggtttaa cttatacaca aaattaaaca acatattaac 8520
acagtatcga tcaaatgagg taaaaaacca tgggtttaca ttgatagata atcaaactct 8580
tagtggattt caatttattt tgaaccaata tggttgtata gtttatcata aggaactcaa 8640
aagaattact gtgacaacct ataatcaatt cttgacatgg aaagatatta gccttagtag 8700
attaaatgtt tgtttaatta catggattag taactgcttg aacacattaa ataaaagctt 8760
aggcttaaga tgcggattca ataatgttat cttgacacaa ctattccttt atggagattg 8820
tatactaaag ctatttcaca atgaggggtt ctacataata aaagaggtag agggatttat 8880
tatgtctcta attttaaata taacagaaga agatcaattc agaaaacgat tttataatag 8940
tatgctcaac aacatcacag atgctgctaa taaagctcag aaaaatctgc tatcaagagt 9000
atgtcataca ttattagata agacagtgtc cgataatata ataaatggca gatggataat 9060
tctattaagt aagttcctta aattaattaa gcttgcaggt gacaataacc ttaacaatct 9120
gagtgaacta tattttttgt tcagaatatt tggacaccca atggtagatg aaagacaagc 9180
catggatgct gttaaaatta attgcaatga gaccaaattt tacttgttaa gcagtctgag 9240
tatgttaaga ggtgccttta tatatagaat tataaaaggg tttgtaaata attacaacag 9300
atggcctact ttaagaaatg ctattgtttt acccttaaga tggttaactt actataaact 9360
aaacacttat ccttctttgt tggaacttac agaaagagat ttgattgtgt tatcaggact 9420
acgtttctat cgtgagtttc ggttgcctaa aaaagtggat cttgaaatga ttataaatga 9480
taaagctata tcacctccta aaaatttgat atggactagt ttccctagaa attacatgcc 9540
atcacacata caaaactata tagaacatga aaaattaaaa ttttccgaga gtgataaatc 9600
aagaagagta ttagagtatt atttaagaga taacaaattc aatgaatgtg atttatacaa 9660
ctgtgtagtt aatcaaagtt atctcaacaa ccctaatcat gtggtatcat tgacaggcaa 9720
agaaagagaa ctcagtgtag gtagaatgtt tgcaatgcaa ccgggaatgt tcagacaggt 9780
tcaaatattg gcagagaaaa tgatagctga aaacatttta caattctttc ctgaaagtct 9840
tacaagatat ggtgatctag aactacaaaa aatattagaa ctgaaagcag gaataagtaa 9900
caaatcaaat cgctacaatg ataattacaa caattacatt agtaagtgct ctatcatcac 9960
agatctcagc aaattcaatc aagcatttcg atatgaaacg tcatgtattt gtagtgatgt 10020
gctggatgaa ctgcatggtg tacaatctct attttcctgg ttacatttaa ctattcctca 10080
tgtcacaata atatgcacat ataggcatgc acccccctat ataggagatc atattgtaga 10140
tcttaacaat gtagatgaac aaagtggatt atatagatat cacatgggtg gcatcgaagg 10200
gtggtgtcaa aaactatgga ccatagaagc tatatcacta ttggatctaa tatctctcaa 10260
agggaaattc tcaattactg ctttaattaa tggtgacaat caatcaatag atataagcaa 10320
accaatcaga ctcatggaag gtcaaactca tgctcaagca gattatttgc tagcattaaa 10380
tagccttaaa ttactgtata aagagtatgc aggcataggc cacaaattaa aaggaactga 10440
gacttatata tcacgagata tgcaatttat gagtaaaaca attcaacata acggtgtata 10500
ttacccagct agtataaaga aagtcctaag agtgggaccg tggataaaca ctatacttga 10560
tgatttcaaa gtgagtctag aatctatagg tagtttgaca caagaattag aatatagagg 10620
tgaaagtcta ttatgcagtt taatatttag aaatgtatgg ttatataatc agattgctct 10680
acaattaaaa aatcatgcat tatgtaacaa taaactatat ttggacatat taaaggttct 10740
gaaacactta aaaacctttt ttaatcttga taatattgat acagcattaa cattgtatat 10800
gaatttaccc atgttatttg gtggtggtga tcccaacttg ttatatcgaa gtttctatag 10860
aagaactcct gacttcctca cagaggctat agttcactct gtgttcatac ttagttatta 10920
tacaaaccat gacttaaaag ataaacttca agatctgtca gatgatagat tgaataagtt 10980
cttaacatgc ataatcacgt ttgacaaaaa ccctaatgct gaattcgtaa cattgatgag 11040
agatcctcaa gctttagggt ctgagagaca agctaaaatt actagcgaaa tcaatagact 11100
ggcagttaca gaggttttga gtacagctcc aaacaaaata ttctccaaaa gtgcacaaca 11160
ttatactact acagagatag atctaaatga tattatgcaa aatatagaac ctacatatcc 11220
tcatgggcta agagttgttt atgaaagttt acccttttat aaagcagaga aaatagtaaa 11280
tcttatatca ggtacaaaat ctataactaa catactggaa aaaacttctg ccatagactt 11340
aacagatatt gatagagcca ctgagatgat gaggaaaaac ataactttgc ttataaggat 11400
acttccattg gattgtaaca gagataaaag agagatattg agtatggaaa acctaagtat 11460
tactgaatta agcaaatatg ttagggaaag atcttggtct ttatccaata tagttggtgt 11520
tacatcaccc agtatcatgt atacaatgga catcaaatat actacaagca ctatatctag 11580
tggcataatt atagagaaat ataatgttaa cagtttaaca cgtggtgaga gaggacccac 11640
taaaccatgg gttggttcat ctacacaaga gaaaaaaaca atgccagttt ataatagaca 11700
agtcttaacc aaaaaacaga gagatcaaat agatctatta gcaaaattgg attgggtgta 11760
tgcatctata gataacaagg atgaattcat ggaagaactc ctgggaaccc ttgggttaac 11820
atatgaaaag gccaagaaat tatttccaca atatttaagt gtcaattatt tgcatcgcct 11880
tacagtcagt agtagaccat gtgaattccc tgcatcaata ccagcttata gaacaacaaa 11940
ttatcacttt gacactagcc ctattaatcg catattaaca gaaaagtatg gtgatgaaga 12000
tattgacata gtattccaaa actgtataag ctttggcctt agtttaatgt cagtagtaga 12060
acaatttact aatgtatgtc ctaacagaat tattctcata cctaagctta atgagataca 12120
tttgatgaaa cctcccatat tcacaggtga tgttgatatt cacaagttaa aacaagtgat 12180
acaaaaacag catatgtttt taccagacaa aataagtttg actcaatatg tggaattatt 12240
cttaagtaat aaaacactca aatctggatc tcatgttaat tctaatttaa tattggcaca 12300
taaaatatct gactattttc ataatactta cattttaagt actaatttag ctggacattg 12360
gattctgatt atacaactta tgaaagattc taaaggtatt tttgaaaaag attggggaga 12420
gggatatata actgatcata tgtttattaa tttgaaagtt ttcttcaatg cttataagac 12480
ctatctcttg tgttttcata aaggttatgg caaagcaaag ctggagtgtg atatgaacac 12540
ttcagatctt ctatgtgtat tggaattaat agacagtagt tattggaagt ctatgtctaa 12600
ggtattttta gaacaaaaag ttatcaaata cattcttagc caagatgcaa gtttacatag 12660
agtaaaagga tgtcatagct tcaaattatg gtttcttaaa cgtcttaatg tagcagaatt 12720
cacagtttgc ccttgggttg ttaacataga ttatcatcca acacatatga aagcaatatt 12780
aacttatata gatcttgtta gaatgggatt gataaatata gatagaatac acattaaaaa 12840
taaacacaaa ttcaatgatg aattttatac ttctaatctc ttctacatta attataactt 12900
ctcagataat actcatctat taactaaaca tataaggatt gctaattctg aattagaaaa 12960
taattacaac aaattatatc atcctacacc agaaacccta gagaatatac tagccaatcc 13020
gattaaaagt aatgacaaaa agacactgaa tgactattgt ataggtaaaa atgttgactc 13080
aataatgtta ccattgttat ctaataagaa gcttattaaa tcgtctgcaa tgattagaac 13140
caattacagc aaacaagatt tgtataattt attccctatg gttgtgattg atagaattat 13200
agatcattca ggcaatacag ccaaatccaa ccaactttac actactactt cccaccaaat 13260
atccttagtg cacaatagca catcacttta ctgcatgctt ccttggcatc atattaatag 13320
attcaatttt gtatttagtt ctacaggttg taaaattagt atagagtata ttttaaaaga 13380
tcttaaaatt aaagatccca attgtatagc attcataggt gaaggagcag ggaatttatt 13440
attgcgtaca gtagtggaac ttcatcctga cataagatat atttacagaa gtctgaaaga 13500
ttgcaatgat catagtttac ctattgagtt tttaaggctg tacaatggac atatcaacat 13560
tgattatggt gaaaatttga ccattcctgc tacagatgca accaacaaca ttcattggtc 13620
ttatttacat ataaagtttg ctgaacctat cagtcttttt gtctgtgatg ccgaattgtc 13680
tgtaacagtc aactggagta aaattataat agaatggagc aagcatgtaa gaaagtgcaa 13740
gtactgttcc tcagttaata aatgtatgtt aatagtaaaa tatcatgctc aagatgatat 13800
tgatttcaaa ttagacaata taactatatt aaaaacttat gtatgcttag gcagtaagtt 13860
aaagggatcg gaggtttact tagtccttac aataggtcct gcgaatatat tcccagtatt 13920
taatgtagta caaaatgcta aattgatact atcaagaacc aaaaatttca tcatgcctaa 13980
gaaagctgat aaagagtcta ttgatgcaaa tattaaaagt ttgataccct ttctttgtta 14040
ccctataaca aaaaaaggaa ttaatactgc attgtcaaaa ctaaagagtg ttgttagtgg 14100
agatatacta tcatattcta tagctggacg taatgaagtt ttcagcaata aacttataaa 14160
tcataagcat atgaacatct taaaatggtt caatcatgtt ttaaatttca gatcaacaga 14220
actaaactat aaccatttat atatggtaga atctacatat ccttacctaa gtgaattgtt 14280
aaacagcttg acaaccaatg aacttaaaaa actgattaaa atcacaggta gtctgttata 14340
caactttcat aatgaataat gaataaagat cttataataa aaattcccat agctatacac 14400
taacactgta ttcaattata gttattaaaa attaaaaatc atataatttt ttaaataact 14460
tttagtgaac taatcctaaa gttatcattt taatcttgga ggaataaatt taaaccctaa 14520
tctaattggt ttatatgtgt attaactaaa ttacgagata ttagtttttg acactttttt 14580
tctcgt 14586
<210> 20
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 20
ggggcaaata agaatttgat aagtaccact taaatttaac tcccttggtt agagatggct 60
cttagcaaag tcaagttg 78
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 21
Met Asp Thr Thr His Asn Asp Asn
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 22
Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 23
Ala Arg Val Asn Thr
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 24
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys
1 5
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 25
Met Ser Lys Asn
1
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 26
Thr Pro Arg Gln
1
<210> 27
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 27
Met Asp Thr Thr
1
<210> 28
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 28
ctcgagttca cc 12
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组RSV序列
<400> 29
agttaataaa aaatggggca aatactcgag 30

Claims (47)

1.一种引发受试者的针对RSV的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的初免-加强免疫施用至所述受试者，其中：
所述初免包括RSVΔNS2/Δ1313/I1314L病毒、RSV LID/ΔNS2/1030s病毒或RSV 276病毒的鼻内施用；并且
所述加强包括B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒或B/HPIV3 DS-Cav1病毒的鼻内施用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为五岁或更年幼，并且所述初免和加强是以约5.0log10 PFU至约6.0log10 PFU的剂量鼻内施用至所述受试者。
3.一种重组人呼吸道合胞病毒(RSV)，所述重组人呼吸道合胞病毒包含：
(A)包含分别位于基因位置1-9的RSV F、G、NS2、N、P、M、SH、M2和L基因的基因组，其中位于基因位置1和2的F和G基因分别是从天然基因位置8和7转移的，并且所述基因组包含编码NS1蛋白的序列的缺失，并且其中所述重组RSV是感染性的、减毒的和自复制的；或者
(B)包含编码NS1蛋白的序列的缺失的基因组，其中所述缺失是对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置99-627的缺失，并且其中所述重组RSV是感染性的、减毒的和自复制的。
4.根据权利要求3所述的重组RSV，其中：
(A)所述SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代；或者
(B)所述重组RSV的基因组包含SH基因，所述SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的重组RSV，其中：
(A)编码NS1蛋白的序列的所述缺失包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置99-627的缺失。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的重组RSV，其中所述L基因编码L蛋白，所述L蛋白包含由TCA密码子编码的S1313残基和由AAA密码子编码的Y1314K取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO:13所示的参考L蛋白序列。
7.根据权利要求3-5中任一项所述的重组RSV，其中所述L基因编码L蛋白，所述L蛋白包含S1313的缺失和I1314L取代，其中所述氨基酸位置对应于如SEQ ID NO:13所示的参考L蛋白序列。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的重组RSV，其中编码所述F蛋白的核酸序列包含SEQID NO:14(F WT)或SEQ ID NO:15(FBB)。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的重组RSV，其中所述基因组不含任何异源基因。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的重组RSV，所述重组RSV还包含所述NS2基因的缺失，伴随或不伴随所述NS1基因的缺失。
11.根据权利要求3所述的重组RSV，其中所述基因组包含与反基因组序列互补的核酸序列，所述反基因组序列与SEQ ID NO:2(LID/ΔNS1)、SEQ ID NO:3(LID/F1G2/ΔNS1)、SEQID NO:4(LID/F1BBG2/ΔNS1)、SEQ ID NO:6(LID/F1G2/ΔNS1/1030s)、SEQ IDNO:7(LID/F1BBG2/ΔNS1/1030s)、SEQ ID NO:9(LID/F1G2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)或SEQ ID NO:10(LID/F1BBG2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)至少99％相同。
12.根据权利要求11所述的重组RSV，其中所述基因组包含与如以下所示的反基因组序列互补的核酸序列：SEQ ID NO:2(LID/ΔNS1)、SEQ ID NO:3(LID/F1G2/ΔNS1)、SEQ IDNO:4(LID/F1BBG2/ΔNS1)、SEQ ID NO:6(LID/F1G2/ΔNS1/1030s)、SEQ IDNO:7(LID/F1BBG2/ΔNS1/1030s)、SEQ ID NO:9(LID/F1G2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)或SEQ ID NO:10(LID/F1BBG2/ΔNS1/Δ1313/I1314L)。
13.一种核酸分子，所述核酸分子包含根据权利要求3-12中任一项所述的重组RSV的基因组的所述核苷酸序列，或者所述RSV基因组的反基因组cDNA或RNA序列。
14.一种载体，所述载体包含根据权利要求13所述的核酸分子。
15.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求13或权利要求14所述的核酸分子或载体。
16.一种产生重组RSV的方法，所述方法包括：
用根据权利要求14所述的载体转染允许细胞培养物；
将所述细胞培养物孵育足够长时间段以允许病毒复制；以及
纯化复制的重组RSV。
17.一种通过根据权利要求16所述的方法产生的重组RSV。
18.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含根据权利要求3-12或17中任一项所述的重组RSV。
19.一种引发受试者的针对RSV的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求3-12或17中任一项所述的重组RSV施用至所述受试者。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述有效量包括初免-加强施用，并且其中：
所述初免包括所述重组RSV的施用；并且
所述加强包括RSV 276病毒、B/HPIV3 DS-Cav1病毒或B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒的异源病毒的施用。
21.根据权利要求20所述的方法，其中：
所述RSV 276病毒包含如SEQ ID NO:12所示的反基因组序列，
所述B/HPIV3 DS-Cav1病毒包含如SEQ ID NO:16所示的反基因组序列，并且
所述B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒包含如SEQ ID NO:17所示的反基因组序列。
22.一种引发受试者的针对RSV的免疫应答的方法，所述方法包括将有效量的免疫原施用至所述受试者，其中施用所述有效量包括初免-加强施用，并且其中：
所述初免包括施用RSVΔNS2/Δ1313/I1314L病毒、RSV LID/F1BBG2/ΔNS1病毒、RSVLID/ΔNS1病毒、RSV LID/ΔNS2/1030s病毒、RSV D46/NS2/N/ΔM2-2-HindIII病毒或RSV276病毒活减毒RSV病毒；
所述加强包括施用RSV 276病毒、B/HPIV3 DS-Cav1病毒或B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒；并且
其中所述初免和所述加强施用并非都是RSV 276病毒。
23.根据权利要求22所述的方法，其中
所述初免包括RSVΔNS2/Δ1313/I1314L病毒、RSV LID/ΔNS2/1030s病毒或RSV 276病毒的鼻内施用；并且
所述加强包括B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒或B/HPIV3 DS-Cav1病毒的鼻内施用。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中：
所述RSV 276病毒包含如SEQ ID NO:12所示的反基因组序列，
所述B/HPIV3 DS-Cav1/B3TMCT病毒包含如SEQ ID NO:17所示的反基因组序列，所述B/HPIV3 DS-Cav1病毒包含如SEQ ID NO:16所示的反基因组序列，
所述RSV LID/F1BBG2/ΔNS1病毒包含如SEQ ID NO:4所示的反基因组序列，所述RSVLID/ΔNS1病毒包含如SEQ ID NO:2所示的反基因组序列，
所述RSV LID/ΔNS2/1030s病毒包含如SEQ ID NO:18所示的反基因组序列；
所述RSV LID/ΔNS2/Δ1313/I1314L病毒包含如SEQ ID NO:19所示的反基因组序列，并且
所述RSV D46/ΔNS2/N/ΔM2-2-HindIII病毒包含如SEQ ID NO:11所示的反基因组序列。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
26.一种引发人类受试者的针对RSV的免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的重组人呼吸道合胞病毒(RSV)，所述重组人呼吸道合胞病毒包含含有编码NS1蛋白的序列的缺失的基因组，其中所述重组RSV是感染性的、减毒的和自复制的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述重组RSV的基因组包含SH基因，所述SH基因包含对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置4499-4610的缺失，以及对应于如SEQID NO:1所示的参考RSV序列的C4489T、C4492T、A4495T、A4497G和G4498A取代。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中编码NS1蛋白的序列的所述缺失是对应于如SEQ ID NO:1所示的参考RSV序列的位置99-627的缺失。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述重组RSV的基因组包含与反基因组序列互补的核酸序列，所述反基因组序列与SEQ ID NO:2(LID/ΔNS1)至少99％相同。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述重组RSV的基因组包含与如SEQ ID NO:2(LID/ΔNS1)所示的反基因组序列互补的核酸序列。
31.根据权利要求19-30中任一项所述的方法，其中所述重组RSV是鼻内施用的。
32.根据权利要求19-31中任一项所述的方法，其中所述重组RSV是通过注射、气雾剂递送、鼻喷雾剂或鼻滴剂施用的。
33.根据权利要求19-32中任一项所述的方法，其中所述受试者为5岁或更年幼。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者为2岁或更年幼。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述受试者的年龄在1个月与6个月之间。
36.根据权利要求19-35中任一项所述的方法，其中所述受试者对于RSV是血清阴性的。
37.根据权利要求19-35中任一项所述的方法，其中所述受试者对于RSV是血清阳性的。
38.根据权利要求19-37中任一项所述的方法，其中所述重组RSV是以3.0log10 PFU至7.0log10 PFU的剂量鼻内施用至所述受试者。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述重组RSV是以约5.0log10 PFU至约6.0log10PFU的剂量鼻内施用至所述受试者。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述重组RSV是以约6.0log10 PFU的剂量鼻内施用至所述受试者。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述重组RSV是以3.0log10至7.0log10 PFU的剂量鼻内施用至5岁或更年幼的RSV血清阳性人类受试者。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述受试者是2岁或更年幼的RSV血清阳性人类受试者。
43.根据权利要求19-42中任一项所述的方法，其中所述免疫应答是保护性免疫应答。
44.根据权利要求19-43中任一项所述的方法，并且其中在施用后的第一个月内，所述受试者展现在种类和严重程度方面与未接受所述病毒的可比较的受试者可比较的无或轻度(1级)呼吸/发热疾病。
45.根据权利要求19-44中任一项所述的方法，其中在施用后最初2周期间所取鼻洗液中所述重组RSV的滴度为3.0log10 PFU/ml鼻洗液或更低。
46.根据权利要求19-45中任一项所述的方法，其中所述重组RSV的施用在≥75％的接受者中引发血清RSV特异性抗体的增加。
47.根据权利要求3-12或17中任一项所述的重组RSV用于引发受试者的针对RSV的免疫应答的用途。
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