JP2023529836A

JP2023529836A - 生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス

Info

Publication number: JP2023529836A
Application number: JP2022574455A
Authority: JP
Inventors: ピーターコリンズ，; ウルスラバックホルツ，
Original assignee: ザユナイテッドステイツオブアメリカ，アズリプレゼンテッドバイザセクレタリー，デパートメントオブヘルスアンドヒューマンサービシーズ
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2023-07-12
Also published as: AU2021285997A1; WO2021248086A3; BR112022024539A2; CA3185143A1; EP4161567A2; CN116568323A; MX2022015398A; KR20230021115A; WO2021248086A2; US20230279362A1

Abstract

弱毒化表現型を有する新規組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を本明細書において報告する。本明細書に記載される組換えＲＳＶ株は、生弱毒化ＲＳＶワクチンとしての使用に好適である。記載されるウイルスをコードすることができるポリヌクレオチド配列、ならびにウイルスを産生するおよび使用するための方法も提供される。生弱毒化ＲＳＶワクチンとしての使用に好適である弱毒化表現型を有する新規組換えヒトＲＳＶの実施形態を本明細書において報告する。開示される組換えＲＳＶは、弱毒化表現型をもたらす１つまたは複数の遺伝的変異を含む。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年６月５日に出願された米国仮出願第６３／０３５，６１７号に対する優先権を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

分野
本明細書に開示される主題は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、およびワクチンとしての使用に好適なその弱毒化変異株に関する。

共同研究契約に対する当事者
本発明は、国立衛生研究所の国立アレルギー感染症研究所およびＳａｎｏｆｉＰａｓｔｅｕｒ，Ｉｎｃ．の間の公衆衛生局共同研究開発契約（ＰＨＳ－ＣＲＡＤＡ）番号２０１３－０８１０の下で行われた。

背景
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、年少期に世界中のほぼ全員に感染し、かなりの死亡率および罹患率の原因となる。米国単独では、ＲＳＶは、毎年７５，０００～１２５，０００人の入院の原因となり、控えめな見積もりは、ＲＳＶが世界中で毎年６４００万人の小児の感染および１６０，０００人またはそれよりも多くの小児の死亡の原因となっていることを示す。ＲＳＶの別の顕著な特性は、乳児期の重度の感染に、高頻度で、気道反応性に対する素因を含めて、長引く気道機能不全が続き、これは、一部の個体では、何年間にもわたって続き、青年期におよび青年期を超えて続き得る。ＲＳＶ感染は、喘息を悪化させ、喘息の発生に関与する場合がある。

ＲＳＶは、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーであり、そのため、細胞質において複製され、宿主細胞の細胞原形質膜において出芽することによって成熟するエンベロープウイルスである。ＲＳＶのゲノムは、１５．２キロベースのネガティブセンス一本鎖のＲＮＡであり、これはゲノムの３’末端の単一のウイルスプロモーターにおいて開始する逐次停止－開始メカニズムにより、ウイルスポリメラーゼによって１０のｍＲＮＡに転写される。それぞれのｍＲＮＡは、２つの重複するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するＭ２ｍＲＮＡが２つの別々のタンパク質Ｍ２－１およびＭ２－２をコードすることを例外として、単一の主要タンパク質をコードする。１１のＲＳＶタンパク質は、ＲＮＡ結合核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、大きなポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、結合糖タンパク質（Ｇ）、融合タンパク質（Ｆ）、小さな疎水性（ＳＨ）表面糖タンパク質、内部マトリックスタンパク質（Ｍ）、２つの非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２、ならびにＭ２－１およびＭ２－２タンパク質である。ＲＳＶ遺伝子の順序は、３’－ＮＳ１－ＮＳ２－Ｎ－Ｐ－Ｍ－ＳＨ－Ｇ－Ｆ－Ｍ２－Ｌである。それぞれの遺伝子は、それぞれの遺伝子の上流端に存在し、個々の遺伝子の転写開始に関与する遺伝子開始（ＧＳ）シグナル、およびそれぞれの遺伝子の下流端に存在し、ポリＡテイルの合成とそれに続くｍＲＮＡ放出の方向付けに関与する遺伝子終止（ＧＥ）シグナルと呼ばれる、短い保存された転写シグナルに挟まれている。転写は、３’末端において単一プロモーターにおいて開始し、順次進行する。

ＲＳＶワクチンの開発は、１９６０年代から進行中であるが、多くの要因によって複雑化している。例えば、不活化ＲＳＶによるＲＳＶ未感作乳児の免疫は、その後の自然ＲＳＶ感染の際に増強された疾患をプライムすることが示されており、実験動物における研究は、疾患増強が精製ＲＳＶサブユニットワクチンにも関連することを示す。

免疫防御の別の障害は、免疫防御の有効性が低減している呼吸気道内腔の表面細胞においてＲＳＶが複製し、疾患を引き起こすことである。そのため、ＲＳＶ感染の免疫制御は、非効率的であり、多くの場合不完全であり、可能な限り免疫原性であることがＲＳＶワクチンのために重要である。ＲＳＶワクチンに対する別の障害は、防御免疫応答の大きさが、ウイルス複製（および抗原産生）の程度におよそ比例することである。そのため、生ワクチンを作製するために必要なＲＳＶの弱毒化は、典型的には、複製および抗原合成の低減、ならびに相伴う免疫原性の低減を伴い、したがって、良好な耐容性を示すが、依然として満足のいく免疫原性である複製のレベルを特定することが有益である。

別の障害は、ＲＳＶが細胞培養中に中程度の力価までしか成長せず、多くの場合、精製することが困難な長いフィラメント中に存在することである。ＲＳＶは、取り扱いの間に、容易に感染性を失い得る。別の障害は、弱毒化変異を特定することおよび発生させることが困難であることである。適切な変異は、ｉｎｖｉｖｏで弱毒化をもたらすものでなければならないが、ｉｎｖｉｔｒｏでの複製に対する制限は最小限でなければならない。これが、効率的なワクチン製造のために好ましいからである。別の障害は、ＲＮＡウイルスの特徴である遺伝的不安定性であり、それにより、弱毒化変異は、野生型（ｗｔ）割り当てに、または弱毒化されていない表現型を付与する代替割り当てに戻り得る。不安定性および脱弱毒化は、点変異にとって特に問題である。

これらの要因を考え合わせると、ｉｎｖｉｔｒｏで効率的に複製し、最大限に免疫原性であり、満足のいくように弱毒化され、脱弱毒化に対して耐性である、生弱毒化ＲＳＶ株に対する必要性が存在する。

概要
生弱毒化ＲＳＶワクチンとしての使用に好適である弱毒化表現型を有する新規組換えヒトＲＳＶの実施形態を本明細書において報告する。開示される組換えＲＳＶは、弱毒化表現型をもたらす１つまたは複数の遺伝的変異を含む。

一部の実施形態では、組換えヒトＲＳＶは、それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＦ、Ｇ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、およびＬ遺伝子を含むゲノムであって、遺伝子位置１および２に位置するＦおよびＧ遺伝子が、それぞれ、ネイティブ遺伝子位置８および７から移動しており、ゲノムが、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含み、組換えＲＳＶが、感染性で、弱毒化され、自己複製性である、ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、組換えＲＳＶのＳＨ遺伝子は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０（両端を含む）の欠失、ならびに配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含む。

一部の実施形態では、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置９９～６２７（両端を含む）の欠失を含む。一部の実施形態では、Ｌ遺伝子は、ＴＣＡコドンによってコードされるＳ１３１３残基およびＡＡＡコドンによってコードされるＹ１３１４Ｋ置換を含むＬタンパク質をコードし、アミノ酸位置は、配列番号１３（Ｌタンパク質のアミノ酸配列）に示される参照Ｌタンパク質配列に対応する。

一部の実施形態では、Ｌ遺伝子は、Ｓ１３１３の欠失およびＩ１３１４Ｌ置換を含むＬタンパク質をコードし、アミノ酸位置は、配列番号１３に示される参照Ｌタンパク質配列に対応する。

一部の実施形態では、Ｆタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１４（ＦＷＴ）または配列番号１５（ＦＢＢ）を含む。一部の実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、任意の異種遺伝子を含まない。一部の実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、ＮＳ２遺伝子の欠失をさらに含む。

一部の実施形態では、ＲＳＶゲノムは、上記で考察された改変を含み、配列番号３（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１）、配列番号４（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１）、配列番号６（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）、配列番号７（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）、配列番号９（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）、または配列番号１０（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）と少なくとも９９％同一であるポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列を含む。例えば、ＲＳＶゲノムは、配列番号３（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１）、配列番号４（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１）、配列番号６（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）、配列番号７（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）、配列番号９（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）、または配列番号１０（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）によって表されるポジティブセンス配列に対応するヌクレオチド配列を含み得るか、またはそれからなり得る。

本明細書に開示される組換えＲＳＶの実施形態は、サブタイプＡＲＳＶまたはサブタイプＢＲＳＶであり得る。

開示されるウイルスの発現に関する方法および組成物も本明細書に提供される。例えば、記載されるウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子が提供される。組換えＲＳＶを産生する方法であって、開示される組換えＲＳＶのゲノムまたはアンチゲノムを含む核酸分子を含むベクターを許容細胞培養物にトランスフェクトすること、ウイルス複製を可能にするのに十分な時間、細胞培養物をインキュベートすること、および複製された組換えＲＳＶを精製することを含む、方法がさらに提供される。

組換えＲＳＶを含む医薬組成物も提供される。組成物は、アジュバントをさらに含むことができる。有効量の開示される組換えＲＳＶを対象に投与することによって、対象における免疫応答を誘発する方法も開示される。一部の実施形態では、対象は、ヒト対象、例えば、１～６か月齢、または１～１２か月齢、または１～１８か月齢、またはそれよりも上のヒト対象である。

本開示の前記のおよび他の特徴および利点は、添付の図面を参照して進めるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明から、より明らかになる。

Ｄ４６の、ＮＳ１の欠失（ΔＮＳ１）、ＮＳ１およびＮＳ２一緒の欠失（ΔＮＳ１＋２）、ならびにＳＨ遺伝子の部分の欠失および改変（ＬＩＤ変異）。（図１Ａ）ΔＮＳ１欠失の詳細。５２９－ｎｔ欠失（ヌクレオチド９９～６２７（両端を含む））は、ＮＳ１ＯＲＦのＡＴＧの最初のヌクレオチドであるヌクレオチド９９から開始し、かつそれを含み、ＮＳ２ＯＲＦのＡＴＧ（ヌクレオチド６２８～６３０）の直前のヌクレオチド６２７まで及び、かつそれを含む。この欠失は、ＮＳ１遺伝子の上流の非翻訳領域をＮＳ２ＯＲＦの翻訳開始コドンに接続する。コードされるアミノ酸ＭＤＴＴＨＮＤＮ（配列番号２１）を示す。（図１Ｂ）ΔＮＳ１＋２変異の詳細。１０４２－ｎｔ欠失（ヌクレオチド９９～１１４０（両端を含む））は、ＮＳ１ＯＲＦのＡＴＧの最初のヌクレオチドであるヌクレオチド９９から開始し、かつそれを含み、ＮＯＲＦのＡＴＧ（１１４１～１１４３）の直前のヌクレオチド１１４０まで及び、かつそれを含む。これは、ＮＳ１遺伝子の上流の非翻訳領域をＮＯＲＦの翻訳開始コドンに接続する。コードされるアミノ酸ＭＡＬＳＫＶＫＬ（配列番号２２）を示す。（図１Ｃ）ＬＩＤ変異の詳細。これは、最後の３つのコドンおよびＳＨＯＲＦの終結コドンにおける５つの翻訳的サイレント置換と一緒の、Ｄ４６のＳＨ遺伝子の下流の非翻訳領域のほとんどを包含する欠失の組合せからなる。１１２－ｎｔ欠失は、ＳＨＯＲＦのＴＡＧ終結コドンの直前のヌクレオチド４４９９から開始し、かつそれを含み、ＳＨ遺伝子－終止シグナルの７ヌクレオチド上流にあるヌクレオチド４６１０まで及び、かつそれを含む。この欠失は、同義ヌクレオチド置換Ｃ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ（太字および下線）と組み合わされる。コードされるアミノ酸ＡＲＶＮＴ（配列番号２３）を示す。ＲＳＶＬＩＤが、一般に、野生型ＲＳＶに似ており、野生型様対照として以下の実験の一部において使用されることに留意されたい。同上。それぞれ、ＦおよびＧに対する遺伝子位置１および２における（Ｆに先行するＧの天然の順番ではなく）Ｇに先行するＦに近接するプロモーターであり、それを有する、ＧおよびＦ遺伝子のそれらの天然のゲノム位置（それぞれ、遺伝子位置７および８）からの移動。（図２Ａ）。ヌクレオチド４６３０～７５５１（両端を含む）は、ＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡから欠失されて、ＦおよびＧ遺伝子が除去された。これは、ＳＨ遺伝子－終止シグナルをＦ／Ｍ２遺伝子間領域に融合する効果を有する。この変異は、ＬＩＤ変異（ＬＩＤ変異はＳＨ遺伝子の上または下の白三角で示される）を有するアンチゲノムＤ４６ｃＤＮＡにより示されるが、改変は、ＬＩＤ変異に依存しない。（図２Ｂ）。ＧおよびＦＯＲＦ（網掛けされた配列）を、それらの天然の順序の逆で（すなわち、Ｇ－Ｆの代わりにＦ－Ｇ）、遺伝子に再構築した。それぞれのＯＲＦは、短い非翻訳領域ならびに遺伝子開始シグナルおよび遺伝子終止シグナルに挟まれており、単一ヌクレオチドからなる短い遺伝子間領域によって分離された。ＸｈｏＩ部位を有するヌクレオチドアダプター（図２Ｂにおける囲み）を、ＦＯＲＦ（ＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣ、ＸｈｏＩ部位に下線、配列番号２８）の上流、およびＧＯＲＦが続く遺伝子－終止－遺伝子間－遺伝子－開始配列（ＡＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧＣＡＡＡＴＡＣＴＣＧＡＧ、ＸｈｏＩ部位に下線、配列番号２９）の下流に追加した。４つのヌクレオチド置換を使用して、ＸｈｏＩ部位を、下欄に示されるＬＩＤアンチゲノムｃＤＮＡ中のＮＳ１ＯＲＦに先行する非コード領域に導入し、これは、ＣＴＴＧ（大文字で示す）からｔｃｇａ（小文字で示す）までの上流の非翻訳ＮＳ１遺伝子領域を表す配列中のヌクレオチド８８～９１の変異を必要とした。コードされるアミノ酸ＭＥＬＬＩＬＫ（配列番号２４）、ＦＳＮ、ＭＳＫＮ（配列番号２５）、ＴＰＲＱ（配列番号２６）、およびＭＤＴＴ（配列番号２７）を示す。下欄でアンチゲノムとともに示されるように、Ｆ－Ｇ遺伝子カセット（網掛けの矩形）は、ＸｈｏＩ部位を使用して、ゲノムｃＤＮＡに挿入された。同上。ＬＩＤ変異（ＬＩＤ変異はＳＨ遺伝子の上の白三角で示される）；それらの天然位置からのＧおよびＦの欠失（ΔＧ＋Ｆ）、ならびにそれぞれ２番目および１番目の遺伝子位置への移動（Ｆ１Ｇ２、それらの天然の順序Ｇ－Ｆの逆でＦおよびＧを有する）；ＦＯＲＦがコドン最適化されているＦ１Ｇ２（Ｆ１ＢＢＧ２）；ＮＳ１遺伝子の欠失（ΔＮＳ１）；Ｌ割り当ての１３２１Ｋ（ＡＡＡ）および１３１３Ｓ（ＴＣＡ）からなる「安定化」１０３０ｓ変異の追加（すなわち、脱弱毒化に対して耐性）；Ｌにおける「安定化」Δ１３１３およびＩ１３１４Ｌ（ＣＴＧ）変異の追加（すなわち、脱弱毒化に対して耐性）；ならびにＮＳ１およびＮＳ２遺伝子両方の欠失（ΔＮＳ１＋２）を含む、さまざまな変異の組合せを有するＲＳＶ株のゲノムマップ。（図３Ａ）Ｆ１Ｇ２もしくはＦ１ＢＢＧ２改変のままであるか、またはそれを有する、ＲＳＶＬＩＤプラスΔＮＳ１欠失。（図３Ｂ）Ｆ１Ｇ２もしくはＦ１ＢＢＧ２改変のままであるか、またはそれを有する、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１プラス１０３０ｓ変異。（図３Ｃ）Ｆ１Ｇ２もしくはＦ１ＢＢＧ２改変のままであるか、またはそれを有する、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１プラスΔ１３１３およびＩ１３１４Ｌ変異。（図３Ｄ）Ｆ１Ｇ２もしくはＦ１ＢＢＧ２改変のままであるか、またはそれを有する、ＲＳＶＬＩＤプラスΔＮＳ１＋２欠失。同上。同上。同上。Ｖｅｒｏ細胞における示された組換えＲＳＶのマルチサイクル成長動態。これは、さまざまな組合せのＬＩＤ、ΔＮＳ１、Ｆ１Ｇ２、およびＦ１ＢＢＧ２変異を有するウイルスが、ワクチン製造のための細胞基材であるＶｅｒｏ細胞において妥当な力価まで複製することを示す。ヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞培養における示された組換えＲＳＶのマルチサイクル成長動態。ＨＡＥ培養物は、真正の気道上皮に非常に似ている、分化した、分極した、偽重層化した粘膜繊毛（mucocilliary）組織を形成する。これらの培養物における弱毒化複製は、非ヒト霊長類およびヒトにおける弱毒化複製の予測である。これらのデータは、ΔＮＳ１、Ｆ１Ｇ２、およびＦ１ＢＢＧ２改変を有するウイルスが、強く弱毒化されることを示す。さまざまな組合せでＬＩＤ、Ｆ１ＢＢＧ２、Ｆ１Ｇ２、およびΔＮＳ１変異を有する組換えＲＳＶは、Ｖｅｒｏ細胞において容易にプラークを形成する。Ｆ１Ｇ２およびＦ１ＢＢＧ２遺伝子移動を有する組換えＲＳＶは、Ｆタンパク質の発現の増加と一致して、マルチサイクル複製の間に、Ｖｅｒｏ細胞において大きな合胞体の形成を指示する。合胞体の例を矢印で示す。Ｆ１Ｇ２およびＦ１ＢＢＧ２改変を有する組換えＲＳＶに感染したＶｅｒｏ細胞におけるＲＳＶＦおよびＧタンパク質の発現の増加。Ｖｅｒｏ細胞を、３ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させ、細胞を、感染の２４時間後に回収し、変性および還元条件下でのゲル電気泳動、ならびに示された特異性の抗体を使用するウェスタンブロット解析によって解析した。１．０としてのＲＳＶＬＩＤと比べたＲＳＶＦ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、およびＭタンパク質の発現のレベルを右に示す。これは、ＲＳＶＧおよびＦの遺伝子移動が、他の遺伝子に対するわずかな効果を伴ってそれらの発現を増加させることを示す。ＮＳ１遺伝子を欠いている組換えＲＳＶに感染したヒト気道Ａ５４９細胞における１型（α、β）およびＩＩＩ型（λ）インターフェロンの発現の増加。Ａ５４９細胞を、３ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させ、組織培養培地上清を、感染の２４時間後に収集した。ＩＦＮ濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。これは、ＲＳＶＮＳ１遺伝子の欠失が、宿主細胞インターフェロンの発現の実質的な増加をもたらすことを示す。Ｆ１Ｇ２またはＦ１ＢＢＧ２またはΔＮＳ１改変の存在は、マウスの気道におけるＲＳＶ複製の低減をもたらす。６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、動物あたり１０^４または１０^６ＰＦＵの用量のそれぞれ示されたＲＳＶに感染させた。ウイルスおよび用量あたり５匹の動物を、感染の３日後（図１０Ａ）および５日後（図１０Ｂ）に屠殺し、鼻甲介および肺を回収し、ホモジネートし、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。同上。それらの制限された複製にもかかわらず、ΔＮＳ１、Ｆ１Ｇ２、およびＦ１ＢＢＧ２改変の示された組合せを有する組換えＲＳＶは、ＬＩＤウイルスと十分に比較されるＲＳＶ中和血清抗体の力価を誘導した。動物を、図１０に記載されるようにして感染させ、血清試料を、感染の２８日後に収集した。表１および２からのＡＧＭデータ。表３からのＡＧＭデータ。ハムスターにおける選択された免疫原のプライム－ブーストレジメンの評価。（図１４Ａ）研究設計。９６匹のハムスターを、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３血清陰性であることを確実にし、それぞれ１２匹の動物の８つの群に割り当てた。０日目に、群Ａ～Ｄに、０．１ｍｌのＬ１５培地中の１０^６ＰＦＵのＲＳＶＤ４６で一次ＩＮ感染を与え、群Ｅ～Ｈは、未感染のままにした。６週間後、血清を、ブースト前６０％ＲＳＶプラーク低減中和力価（ＲＳＶ－ＰＲＮＴ）の決定のために収集した。２日後、プライム群および非プライム群を対で、４つのウイルスのうちの１つ：（ｉ）空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（群ＡおよびＥ）；（ｉｉ）ＤＳ－Ｃａｖ１ベクター（群ＢおよびＦ）；（ｉｉｉ）ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター（群ＣおよびＧ）；および（ｉｖ）ＲＳＶＤ４６（群ＤおよびＨ）で、ＩＮブーストした（ベクターについて１０^５ＴＣＩＤ_５０およびＲＳＶについて１０^６ＰＦＵ）。ブースティングの５日後に、群あたり６匹のハムスターの鼻甲介（ＮＴ）および肺を、ウイルス力価のために収集した。群あたり他の６匹のハムスターから、血清を、ブースティングの２週間後に収集して、ＲＳＶ－ＰＲＮＴおよびＨＰＩＶ３－ＰＲＮＴを測定し、２日後に、動物を、１０^６ＰＦＵのＲＳＶＤ４６でＩＮチャレンジした。チャレンジの３日後、ＮＴおよび肺を、ＲＳＶ複製の滴定のために収集した。（図１４Ｂ、図１４Ｃ）ブースト５日後の（図１４Ｂ）ＮＴおよび（図１４Ｃ）肺の組織ホモジネートにおけるブースティングウイルスの力価。破線および点線は、それぞれ、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターおよびＲＳＶＤ４６についての検出限界（ＬＯＤ）を示す。（図１４Ｄ）補体なしでアッセイされたプライムハムスターおよび非プライムハムスターにおけるブースト２週間後の血清ＨＰＩＶ３－ＰＲＮＴ。（図１４Ｅ、図１４Ｆ）補体の添加あり（図１４Ｅ）およびなし（図１４Ｆ）でアッセイされた、ＲＳＶＤ４６でプライムされ、示されたウイルスでブーストされた群Ａ～Ｄからの動物におけるブースト前およびブースト後の血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ。示された比較間の差の有意性を、スチューデントのｔ検定によって決定した：ｎｓは有意性なしを示し（Ｐ＞０．０５）；^＊は０．０１＜Ｐ＜０．０５を示し；^＊＊は０．００１＜Ｐ＜０．０１を示し；^＊＊＊は０．０００１＜Ｐ＜０．００１を示す。同上。同上。ＡＧＭ実験番号１：プライミングおよびブースティングの間の間隔が約２か月（２か月マイナス９日）であった場合のＡＧＭにおけるウイルス複製および血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ。（図１５Ａ）研究設計。１２匹のＡＧＭを、ＩＮ／ＩＴ経路の組合せによって、３つのＲＳＶ（表８）のうちの１つによる一次感染を予め施行した。血清を、３７日目（ブースティングの２週間前）に収集し、ＲＳＶ－ＰＲＮＴを、補体の存在下で決定した。ＡＧＭを、３７日目のＲＳＶ－ＰＲＮＴ、プライミングウイルスの同一性、および性別比に関してバランスを取ったそれぞれ６匹の動物の２つの群に分けた（表８）。プライミング後５１日目（２か月マイナス９日）に、群を、ＩＮ／ＩＴ経路の組合せによって、ＲＳＶ２７６（ΔＭ２－２ウイルス；配列番号１２）またはＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターでブーストした。ウイルスの排出を、ＮＰおよびＴＬならびにウイルス滴定によって、ブースト後１～１０日目にモニタリングした。血清を、ブースティング後７、１４、２１、および２８日目に収集した。（図１５Ｂ、図１５Ｃ）ＳＥＭを示すブラケットとともに平均として示される（図１５Ｂ）ＮＰおよび（図１５Ｃ）ＴＬにおけるウイルス力価、ならびに破線（ベクター）および点線（ＲＳＶ）として示される検出限界。（図１５Ｄ）補体の存在下でアッセイされた、プライミング後３７日目、ならびにブースティング後０、７、１４、２１、および２８日目の血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ。（図１５Ｅ）補体なしでアッセイされた、ブースティング後０、７、１４、２１、および２８日目の血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ。ＤおよびＥは、ブースティングのときの組み合わされた２つの群についての平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ（黒色破線、平均算術値を示す）を示すためにアノテートされ、加えて、着色された破線は、示される算術値とともに、それぞれの群についての最高平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを示す。平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを、ＳＥＭを示すブラケットとともに示す。２つの群のピーク平均力価を、スチューデントのｔ検定によって比較した：^＊＊は０．００１＜Ｐ＜０．０１を示し；^＊＊＊は０．０００１＜Ｐ＜０．００１を示す。同上。ＡＧＭ実験番号２：プライミングおよびブースティングの間の間隔が約６か月（６か月プラス９日）であった場合のＡＧＭにおけるウイルス複製および血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ。（図１６Ａ）研究設計。２０匹のＡＧＭを、ＩＮ／ＩＴ経路の組合せによって、５つの弱毒化ＲＳＶ（表９）のうちの１つによる一次感染を予め施行した。血清を、２８および１５４日目（後者はブースティングの３５日前である）に収集し、ＲＳＶ－ＰＲＮＴを、補体の存在下で決定した。ＡＧＭを、１５４日目の血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ、プライミングウイルスの同一性、および性別比に関してバランスを取った３つの群（ｎ＝６、７、および７）に分けた（表９）。プライミング後１８９日目（６か月プラス９日）に、群を、３つのウイルスのうちの１つ：（ｉ）ＲＳＶ２７６（ｎ＝６）、（ｉｉ）ＤＳ－Ｃａｖ１ベクター（ｎ＝７）、または（ｉｉｉ）ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター（ｎ＝７）でブーストした。ウイルスの排出および血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを、図１５の凡例に記載されるように、モニタリングした。鼻粘膜内層液を、ブースティング後０、１４、２１、２８日目に、ＳＡＭストリップを使用して、ＩｇＡ分析のために収集した（詳細については方法および材料を参照されたい）。（図１６Ｂ、図１６Ｃ）（図１６Ｂ）ＮＰおよび（図１６Ｃ）ＴＬにおけるウイルス力価を決定し、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示すブラケットとともに平均として示し、検出限界を破線（ベクター）および点線（ＲＳＶ）として示した。（図１６Ｄ）補体ありでアッセイされた、プライミング後２８、１５４、および１８９日目、ならびにブースティング後７、１４、２１、および２８日目の血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ。（図１６Ｅ）ＳＥＭを示すブラケットとともに平均として示される、補体なしでアッセイされた、ブースティング後０、７、１４、２１、２８日目のＲＳＶ－ＰＲＮＴ。ＤおよびＥは、ブーストの時点の組み合わされた３つの群についての平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ（黒色破線、平均算術値を示す）を示すためにアノテートされ、加えて、着色された破線は、所与の算術値とともに、それぞれの群についての最高平均ＲＳＶ－ＰＲＮＴを示す。（図１６Ｆ、図１６Ｇ）ＡＧＭにおける血清および鼻粘膜のＩｇＡ応答。ＩｇＡ抗体力価を、（図１６Ｆ）ブースティング後０、７、１４、２１、および２８日目に収集された血清試料、ならびに（図１６Ｇ）ブースティング後０、１４、２１、および２８日目に収集された鼻粘膜内層液において決定した（ＤＳ－Ｃａｖ１／ＢＴＭＣＴ群において、２８日目のＳＡＭ検体の１つが、十分な体積を提供せず、そのため、ＤＳ－Ｃａｖ１／ＢＴＭＣＴベクターの２８日目の平均力価が６匹の動物のみについて算出されたことに留意されたい）。ＩｇＡ力価を、ＤＥＬＦＩＡＴＲＦアッセイにおいて、精製されたＲＳＶＤＳ－Ｃａｖ１Ｆタンパク質への結合によって測定した。抗体力価は、４００蛍光単位を生じる血清または粘膜検体のｌｏｇ_２希釈として与えられ、ＳＥＭを示すブラケットとともに平均として示される。ブーストの時点（０日目）の組み合わされた３つの群についての平均抗体力価を、より大きい黒色点線によって示し、０日目のすべてのＳＡＭ試料の力価は、検出レベル（５．３ｌｏｇ_２）を下回った。検出限界（ＬＯＤ）を、より小さい黒色点線によって示す。着色された破線は、それぞれの群についての最高平均抗体力価を示す。３つの群のピーク平均力価を、スチューデントのｔ検定によって対で比較した（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ）：^＊は０．０１＜Ｐ＜０．０５を示し；^＊＊は０．００１＜Ｐ＜０．０１を示し；^＊＊＊は０．０００１＜Ｐ＜０．００１を示し；ｎｓはＰ＞０．０５、有意性なしを示す。同上。同上。ＡＧＭ実験番号３：プライミングおよびブースティングの間の間隔が約１５か月（１５か月マイナス７日）であった場合のＡＧＭにおけるウイルス複製および血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ。（図１７Ａ）研究設計。４匹のＡＧＭを、生弱毒化ワクチン候補ＲＳＶ２７６による一次感染を予め施行した（表１０）。血清を、４２９日目（ブースティングの２週間前）に収集し、ＲＳＶ－ＰＲＮＴを、補体ありで決定した。ＡＧＭを、群が４２９日目の血清に基づいて類似の個体および平均ＲＳＶ－ＰＲＮＴを有するように、それぞれ２匹の動物の２つの群に配分した（表１０）。プライミング後４４３日目（１５か月マイナス７日）に、血清を収集し、２つの群を、部位あたり１０^６ＴＣＩＤ_５０（ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター）またはＰＦＵ（ＲＳＶ２７６）の用量で、ＩＮおよびＩＴ投与されるＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター（ｎ＝２）またはＲＳＶ２７６（ｎ＝２）でブーストした。ウイルス複製および血清学的応答を、図１５および１６の凡例に記載されるように、モニタリングした。（図１７Ｂ、図１７Ｃ）破線として示される検出限界とともに平均として示される（図１７Ｂ）ＮＰおよび（図１７Ｃ）ＴＬにおけるウイルス力価。記号は、個々の動物についての力価を示し、線は、平均値を示す。（図１７Ｄ）補体ありでアッセイされた、プライミング後４２９日目、ならびにブースティング後０、７、１４、２１、２８日目の血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ。（図１７Ｅ）補体なしでアッセイされた、ブースティング後０、７、１４、２１、および２８日目の血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ。Ｄは、ブースティングの時点の組み合わされた２つの群についての平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ（Ｄにおける黒色破線、平均算術値１：２６を示す）を示すためにアノテートされ、加えて、ＤおよびＥは、示される算術値とともに、それぞれの群についての最高平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを示す着色された破線でアノテートされる。同上。ＲＳＶ中和抗体の存在下または非存在下のｉｎｖｉｔｒｏでのｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのマルチサイクル複製。ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、細胞あたり０．０１ＴＣＩＤ_５０のＭＯＩで、空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（図１８Ａ）、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクター（図１８Ｂ）、またはＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター（図１８Ｃ）に感染させた。１時間の吸着後、細胞を、細胞培養培地で３回洗浄し、次いで、１０％の以下の血清の１つ（予め５６℃で３０分間加熱した）：免疫前のハムスター血清、または添加された補体の非存在下でＲＳＶＤ４６もしくは空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターに感染したハムスター由来のプールされた血清を含有する培養培地とともにインキュベートした。ハムスター血清は、図１４における実験からであった。異なる処置を、三連で行った。培地のアリコートを、感染後３連続日の間、毎日採取し、急速凍結し、ウイルス力価を決定した。免疫前血清およびＲＳＶ免疫血清の存在下での複製間の差の有意性を、スチューデントのｔ検定によって決定した：^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１。ＲＳＶ血清陰性ＡＧＭにおけるＲＳＶ２７６およびｗｔｒＲＳＶの複製。ＲＳＶ血清陰性ＡＧＭを、部位あたり１ｍＬの接種で、ＩＮ／ＩＴ経路の組合せによって、１０^６ＰＦＵのＲＳＶ２７６（ｎ＝８）またはｗｔｒＲＳＶ（ｎ＝４）に感染させた。ＮＰおよびＴＬを、それぞれ、１０日間、毎日および隔日に、プラス１２日目に、収集した。ウイルス力価を、免疫プラークアッセイによって決定し、それぞれの時点についての群平均として示す。ブラケットはＳＥＭを示し、検出限界を点線として示す。ＲＳＶ２７６に感染した８匹の動物は、ここで、その後にＡＧＭ実験番号１および番号３においてブーストされた、表８および１０に示される動物である。約６か月早く弱毒化ＲＳＶでプライムされたＡＧＭからの気管洗浄液（ＴＬ）におけるブースティングＲＳＶ２７６の複製。図１６における実験から、ブースティング後２、４、６、８および１０日目のＴＬにおけるＲＳＶ２７６の力価を、免疫プラークアッセイ（図２０Ａ）ならびにポジティブおよびネガティブセンスＲＳＶＭ遺伝子配列の両方に特異的なＲＴ－ｑＰＣＲ（図２０Ｂ）によって、定量した。それぞれの色は、個々のサルを表す。検出限界は、点線で示される。６か月早く生弱毒化ＲＳＶでプライムされたＡＧＭにおけるＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによって誘導された血清ＨＰＩＶ３－ＰＲＮＴ。図１６における実験から、ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによるブースティング２週間後に収集された血清を、補体なしのＨＰＩＶ３ＰＲＮＴアッセイによって分析した。点は、個々の動物を示し、群平均は、短い水平線で示される。点線は、検出限界を示す。２つの群の平均血清ＨＰＩＶ３－ＰＲＮＴを、スチューデントのｔ検定によって比較した：ｎｓはＰ＞０．０５、有意性なしを示す。

配列表
添付の配列表に列挙される核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるヌクレオチド塩基についての標準的な文字略号およびアミノ酸についての３文字コードを使用して示される。それぞれの核酸配列の１つの鎖のみが示されるが、相補鎖は、提示された鎖に対する任意の参照によって含まれるものとして理解される。配列表は、２０２１年６月４日に作成された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」（約３５６ｋｂ）という名称のファイルの形式でＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、これは、参照により、本明細書に組み込まれる。添付の配列表では、以下の通りである。
配列番号１は、ＲＳＶＤ４６のアンチゲノム核酸配列である。
配列番号２は、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１のアンチゲノム核酸配列である。
配列番号３は、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１のアンチゲノム核酸配列である。
配列番号４は、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１のアンチゲノム核酸配列である。
配列番号５は、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１／１０３０ｓのアンチゲノム核酸配列である。
配列番号６は、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓのアンチゲノム核酸配列である。
配列番号７は、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓのアンチゲノム核酸配列である。
配列番号８は、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌのアンチゲノム核酸配列である。
配列番号９は、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌのアンチゲノム核酸配列である。
配列番号１０は、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌのアンチゲノム核酸配列である。
配列番号１１は、ＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩのアンチゲノム核酸配列である。
配列番号１２は、ＲＳＶ２７６ゲノムのアンチゲノム核酸配列である。
配列番号１３は、Ｄ４６由来のＬタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、Ｄ４６由来のＲＳＶＦタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ＲＳＶＦＢＢタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１のアンチゲノム配列である。
配列番号１７は、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴのアンチゲノム配列である。
配列番号１８は、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓのアンチゲノム配列である。
配列番号１９は、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌのアンチゲノム配列である。
配列番号２０～２９は、ＤＮＡおよびタンパク質の配列の断片である。

詳細な説明
ＲＳＶに対する小児ワクチンを開発することに対する主要な挑戦には、乳児期の間の免疫系の未熟さ、母親由来抗体による免疫抑制、気道の表層上皮での非効率的な免疫防御、宿主インターフェロンの抑制ならびにＮＳ１およびＮＳ２によるアポトーシス応答などの宿主応答のウイルス抑制、ならびにウイルス未感作レシピエントにおける不活化またはサブユニットＲＳＶワクチンによる研究において観察されているワクチン誘発性の疾患の増強が含まれる（Kim et al., Amer. J. Epidemiol. 89:422-434, 1969；Ottolini et al., Viral Immunol. 13:231-236, 2000；Schneider-Ohrum et al., J. Virol. 91:e02180-16, 2017）。そのため、相当の努力にもかかわらず、ＲＳＶに対する防御免疫応答を誘導する有効な免疫原についての必要性が残されている。

本開示は、弱毒化され、感染性で、自己複製性であり、かつ上記で考察された必要性を満たす組換えＲＳＶを提供する。

Ｉ．用語の概要
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishers, 2009；およびMeyers et al. (eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine, published by Wiley-VCH in 16 volumes, 2008；ならびに他の類似の参考文献に見出され得る。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書に記載されるものと類似または等価な多くの方法および材料を使用することができるが、特に好適な方法および材料が本明細書に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。さまざまな実施形態のレビューを容易にするために、以下の用語の説明が提供される。

約：指示対象の量からプラスまたはマイナス５％。例えば、「約５」は、４．７５～５．２５を指す。「約５：１」の比は、４．７５：１～５．２５：１の比を指す。

アジュバント：抗原性を増強するために使用される媒体。アジュバントとしては、抗原が吸着される鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液；または油中水型エマルジョン、例えば、抗原溶液が鉱油に乳化されている油中水型エマルジョン（フロイント不完全アジュバント）、時には、抗原性をさらに増強する（抗原の分解を阻害し、および／またはマクロファージの流入を引き起こす）ために、殺滅マイコバクテリウムを含むもの（フロイント完全アジュバント）が挙げられる。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むものなど）も、アジュバントとして使用することができる。アジュバントとしては、生物学的分子（「生物学的アジュバント」）、例えば、共刺激分子が挙げられる。例示的なアジュバントとしては、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）マトリックス、およびトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えば、ＴＬＲ－９アゴニスト、ポリＩ：Ｃ、またはポリＩＣＬＣが挙げられる。アジュバントは、例えば、Singh (ed.) Vaccine Adjuvants and Delivery Systems. Wiley-Interscience, 2007に記載されている。

投与：選ばれた経路による組成物の対象への導入。投与は、局所的または全身的であり得る。例えば、選ばれた経路が、鼻腔内である場合、組成物（開示される弱毒化ＲＳＶを含む組成物など）は、組成物を対象の鼻道へ導入することによって投与される。例示的な投与の経路としては、限定されるものではないが、経口、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、および静脈内など）、舌下、直腸、経皮（例えば、局部的）、鼻腔内、膣、ならびに吸入の経路が挙げられる。

アミノ酸置換：ポリペプチド中のあるアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換え。

弱毒化された：「弱毒化」されたまたは「弱毒化表現型」を有するウイルスは、類似の感染の条件下で、参照ウイルスと比較して病原性の減少を有するウイルスを指す。弱毒化は、通常、類似の感染の条件下で、参照野生型ウイルスの複製と比較して、ウイルス複製の減少に関連し、そのため、「弱毒化」および「制限された複製」は、多くの場合、同義的に使用される。一部の宿主（典型的には、実験動物を含む非天然宿主）では、疾患は、問題の参照ウイルスによる感染の間に明白でなく、ウイルス複製の制限を、弱毒化の代替マーカーとして使用することができる。一部の実施形態では、開示される弱毒化ＲＳＶは、同じ感染の条件下で、同じ種の哺乳動物の、それぞれ、上気道または下気道における非弱毒化野生型ウイルスの力価と比較して、哺乳動物の上気道または下気道におけるウイルス力価において少なくとも約１０分の１またはそれ未満への減少、例えば少なくとも、約１００分の１またはそれ未満への減少を示す。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、例えば、Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓａｕｒａｔｕｓなどのハムスター、および例えば、Ｃｅｒｏｐｉｔｈｉｅｃｕｓａｅｔｈｉｏｐｓなどの非ヒト霊長類が挙げられる。弱毒化ＲＳＶは、限定されないが、変更された成長、温度感受性の成長、宿主域が制限された成長、またはプラークサイズの変更を含む、異なる表現型を提示し得る。

対照：参照標準。一部の実施形態では、対照は、健康な患者から得られた陰性対照試料である。他の実施形態では、対照は、ＲＳＶ感染と診断された患者から得られた陽性対照試料である。また他の実施形態では、対照は、ヒストリカルコントロール、または標準の参照値もしくは値の範囲である（例えば、予め試験された対照試料、例えば、公知の予後もしくは転帰を有するＲＳＶ患者の群、またはベースラインもしくは正常値を表す試料の群）。

試験試料および対照の間の差は、増加、または逆に減少であり得る。差は、質的な差または量的な差、例えば、統計学的有意差であり得る。一部の例では、差は、対照と比べた、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、または５００％よりも大きい、増加または減少である。

有効量：所望の応答、例えば、対象における免疫応答を誘発するのに十分である薬剤の量。目的のウイルスに対する防御免疫応答を得るためには、開示される免疫原の複数回投与、および／またはプライムブーストプロトコールにおける「プライム」としての開示される免疫原の投与が必要であり得ることが理解され、ここで、ブースト免疫原は、プライム免疫原とは異なり得る。したがって、開示される免疫原の有効量は、防御免疫応答を誘発するために同じまたは異なる免疫原でその後にブーストされ得る対象において免疫応答のプライミングを誘発するのに十分な免疫原の量であり得る。

一例では、所望の応答は、ＲＳＶ感染を阻害または低減または予防することである。ＲＳＶ感染は、方法が有効であるために、完全に排除または低減または予防される必要はない。例えば、有効量の薬剤の投与は、所望の量により、好適な対照と比較して、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも１００％（検出可能なＲＳＶ感染の排除または予防）まで、ＲＳＶ感染を減少させることができる（例えば、細胞の感染、またはＲＳＶに感染した対象の数もしくはパーセンテージによって測定される）。

遺伝子：ｍＲＮＡであるかまたは他の種類であるかに関わらず、ＲＮＡの転写のために必要な制御配列およびコード配列を含む核酸配列。例えば、遺伝子は、プロモーター、１つまたは複数のエンハンサーまたはサイレンサー、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドをコードする核酸配列、下流調節配列、ならびに場合により、ｍＲＮＡの発現の調節に関与する他の核酸配列を含んでいてもよい。

本明細書に記載される組換えＲＳＶの「遺伝子」は、ｍＲＮＡをコードする組換えＲＳＶの一部分を指し、典型的には、遺伝子開始（ＧＳ）シグナルによって上流（３’）末端において開始し、遺伝子終止（ＧＥ）シグナルによって下流（５’）末端で終わる。この文脈では、特に、タンパク質が、固有のｍＲＮＡではなく追加のＯＲＦから発現される場合に、遺伝子という用語は、「翻訳オープンリーディングフレーム」またはＯＲＦと称されるものも包含する。開示される組換えＲＳＶを構築するために、１つまたは複数の遺伝子またはゲノムセグメントは、全体的にまたは部分的に、欠失、挿入、または置換されていてもよい。

異種：異なる遺伝子起源に由来すること。組換えゲノムに含まれる異種遺伝子は、そのゲノムに由来しない遺伝子である。

宿主細胞：ベクターが増殖され得、かつその核酸が発現され得る細胞。細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。この用語は、対象の宿主細胞の任意の子孫も含む。複製の間に起こる変異が存在し得るので、すべての子孫が親細胞と同一でなくてもよいことが理解される。しかしながら、「宿主細胞」という用語が使用される場合、そのような子孫が含まれる。

感染性および自己複製性ウイルス：培養細胞または動物もしくはヒト宿主の細胞に侵入および複製して、同じ活性の能力がある子孫ウイルスを産生することができるウイルス。

免疫応答：刺激に対する免疫系の細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球の応答。一実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答である。別の実施形態では、応答は、Ｂ細胞応答であり、特異的抗体の産生をもたらす。

免疫原性組成物：一部の例では、感染性疾患または他の種類の疾患の予防、軽快、または処置のために投与され得る、免疫応答を刺激することができる免疫原性材料の調製物。免疫原性材料としては、弱毒化もしくは殺滅微生物（細菌またはウイルスなど）、またはそれらに由来する抗原性のタンパク質、ペプチドもしくはＤＮＡが挙げられ得る。免疫原性組成物は、抗原に対する測定可能なＴ細胞応答を誘導するか、または抗原に対する測定可能なＢ細胞応答（抗体の産生など）を誘導する抗原（ウイルスなど）を含む。一例では、免疫原性組成物は、対象に投与された場合に、ＲＳＶに対する測定可能なＣＴＬ応答および／または測定可能なＢ細胞応答（抗体の産生など）を誘導する開示される組換えＲＳＶを含む。ｉｎｖｉｖｏでの使用のために、免疫原性組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体中に組換えウイルスを含み、他の作用物質、例えば、アジュバントも含んでいてもよい。

単離された：「単離された」生物学的構成要素は、他の生物学的構成要素、例えば、天然に存在する構成要素中の他の生物学的構成要素、例えば、他の染色体および染色体外のＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質から、実質的に分離されているか、または精製されている。「単離された」タンパク質、ペプチド、核酸、およびウイルスは、標準的な精製方法によって精製されたものを含む。単離されたとは、絶対純度を必要とせず、少なくとも５０％純粋、例えば、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはさらに９９．９％純粋である、タンパク質、ペプチド、核酸、またはウイルス分子を含むことができる。

核酸分子：ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み得るヌクレオチドのポリマー形態、ならびに上記の合成形態および混合ポリマー。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態を指す。「核酸分子」という用語は、本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、他に規定されない限り、通常、少なくとも１０塩基長である。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を含む。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチドおよび／または天然に存在しないヌクレオチドの連結によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび改変ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。

作動可能に連結された：第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結された核酸配列は、連続しており、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合には、同じリーディングフレームにある。

薬学的に許容される担体：使用される薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995は、開示される免疫原の薬学的送達のために好適な組成物および製剤を記載している。

一般に、担体の特質は、用いられる特定の投与の様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを媒体として含む、注射可能な流体を含む。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の非毒性の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。特定の実施形態では、対象への投与のために好適な担体は、無菌であってもよく、および／または所望の免疫応答を誘導するのに好適な組成物の１つもしくは複数の測定された用量を含有する単位剤形に懸濁されていてもよく、もしくは代わりにそれに含有されていてもよい。それはまた、処置目的のためのその使用のための薬物治療を伴っていてもよい。単位剤形は、例えば、無菌の内容物を含有する密封されたバイアル、もしくは対象への注射のための注射器中にあってもよく、またはその後の可溶化および投与のために凍結乾燥されていてもよく、または固体もしくは放出制御投与量中にあってもよい。

ポリペプチド：長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）に関わらず、アミノ酸の任意の鎖。「ポリペプチド」は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーを含むアミノ酸ポリマー、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基が、非天然のアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物であるものに適用する。「残基」は、アミド結合またはアミド結合模倣物によってポリペプチドに組み込まれたアミノ酸またはアミノ酸模倣物を指す。ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有する。「ポリペプチド」は、ペプチドまたはタンパク質と互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で使用される。

プライム－ブースト免疫：所望の免疫応答を誘導するための対象への第１の免疫原性組成物の投与（プライム免疫）とそれに続く第２の免疫原性組成物の投与（ブースト免疫）を含む免疫プロトコール。プライムおよびブーストの投与の間の好適な時間間隔およびそのようなタイムフレームの例を本明細書に開示する。一部の実施形態では、プライム、ブースト、またはプライムおよびブーストの両方は、アジュバントをさらに含む。

組換え：組換え核酸分子またはタンパク質またはウイルスは、典型的にはクローニングされたｃＤＮＡから、組換えＤＮＡ法によって産生されたものである。ｃＤＮＡ配列は、生物学的に由来する分子の配列と同一であってもよく、または天然に存在しない配列：例えば、１つもしくは複数の核酸の置換、欠失、もしくは挿入を含み、および／または代わりに分離されている２つの配列のセグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有する配列を含有していてもよい。この人工的な組合せは、例えば、化学合成、天然に存在する核酸分子もしくはタンパク質の標的化変異、または単離された核酸のセグメントの人工操作、例えば、遺伝子工学技術によって、達成され得る。

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）：Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｏｒｔｈｏｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属のエンベロープを有する非分節型ネガティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルス。ＲＳＶゲノムは、約１５，０００ヌクレオチド長（ＫＴ９９２０９４について１５，２２３）であり、糖タンパク質ＳＨ、Ｇ、およびＦを含む１１のタンパク質をコードする１０の遺伝子を含む。Ｆタンパク質は、融合を媒介し、細胞質へのウイルスの侵入を可能にし、合胞体の形成も促進する。主にＧ糖タンパク質の抗原性の差に基づいて、ヒトＲＳＶ株の２つの抗原性のサブグループであるＡサブグループおよびＢサブグループが記載されている。ウシＲＳＶを含む他の種についてのＲＳＶ株も公知である。ヒトＲＳＶに感染したモデル生物、およびウシにおけるｂＲＳＶ感染の使用などの種特異的ＲＳＶに感染したモデル生物を含む、ヒトＲＳＶおよび近縁関係にある動物対応物による感染のいくつかの動物モデルが利用可能である（例えば、Bern et al., Am J, Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 301: L148-L156, 2011；およびNam and Kun (Eds.). Respiratory Syncytial Virus: Prevention, Diagnosis and Treatment. Nova Biomedical Nova Science Publisher, 2011；およびCane (Ed.) Respiratory Syncytial Virus. Elsevier Science, 2007を参照されたい）。

文脈が他を指示しない限り、ＲＳＶ核酸残基の位置決めは、配列番号１として本明細書に提供される参照ＲＳＶアンチゲノム配列に従い、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＴ９９２０９４．１（参照により本明細書に組み込まれる）としても提供されるＲＳＶ株Ａ２アンチゲノム配列であり、Collins, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 92:11563-11567 1995に記載されている。この配列は、「Ｄ４６」アンチゲノムＲＳＶ配列としても公知である。

配列同一性：同一性パーセントを最大化するために許容されるギャップを伴って２つまたはそれよりも多くの比較されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸配列割り当てのパーセンテージ。パーセンテージが高いほど、２つの配列はより類似している。ポリペプチドのホモログ、オルソログ、またはバリアントは、標準的な方法を使用して整列された場合に、比較的高度の配列同一性を有する。

比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。さまざまなプログラムおよびアライメントアルゴリズムは、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970；Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988；Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988；Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989；Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988；Huang et al. Computer Appls. In the Biosciences 8, 155-65, 1992；およびPearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990は、配列アライメント法および相同性の算出の詳細な考察を提示している。

ポリペプチドのバリアントは、典型的には、目的のアミノ酸配列との全長アライメントに対してカウントされる、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性の保有によって特徴付けられる。参照配列とのさらに大きな類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価された場合に、増加する同一性パーセンテージ、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示す。全体よりも少ない配列が配列同一性について比較されている場合、ホモログおよびバリアントは、典型的には、１０～２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列とのそれらの類似性に応じて、少なくとも８５％、または少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有していてもよい。そのような短いウィンドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。

本明細書で使用される場合、「少なくとも９０％の同一性」（または類似する語）への言及は、指定された参照配列との「少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらに１００％の同一性」を指す。

対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーである生きている多細胞脊椎生物。ある例では、対象は、ヒトである。特定の例では、対象は、新生児である。追加例では、ＲＳＶ感染を阻害することを必要とする対象が選択される。例えば、処置を必要とする対象は、感染しておらず、かつＲＳＶ感染のリスクがあるか、または感染しているかのいずれかである。

のために十分な条件下：所望の活性を許容する任意の環境を記載するために使用される語句。

ＩＩ．組換えＲＳＶ
ある範囲の弱毒化表現型を示し、ヒトにおける弱毒化生ワクチンとしての使用に好適であるヒトＲＳＶの組換え株を産生するのに有用である変異が本明細書に開示される。本明細書に報告されるように、ｗｔＲＳＶに対する変異の特定の組合せは、優れた免疫応答を誘発する生弱毒化ウイルスをもたらす。

開示されるウイルスの発現に関する方法および組成物が本明細書にさらに開示される。例えば、記載されるウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子が開示される。

本明細書に提供される組換えＲＳＶは、組換えＲＳＶを弱毒化する、野生型ＲＳＶと比べた本明細書に詳細に記載される改変または変異を含有するゲノムまたはアンチゲノムを含む。野生型ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、以下の１１のタンパク質：ＲＮＡ結合核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、大きなポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、結合表面糖タンパク質（Ｇ）、融合表面糖タンパク質（Ｆ）、小さな疎水性表面糖タンパク質（ＳＨ）、内部マトリックスタンパク質（Ｍ）、２つの非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２、ならびにＭ２－１およびＭ２－２タンパク質をコードする。ＲＳＶのゲノムは、１０のｍＲＮＡをコードする１０の遺伝子を含む約１５．２ｋｂのネガティブセンスＲＮＡの一本鎖である。それぞれのｍＲＮＡは、２つの別々のタンパク質Ｍ２－１およびＭ２－２をコードするＭ２ｍＲＮＡを除いて、単一のタンパク質をコードする。ＲＳＶ遺伝子の順序は、３’末端に位置する単一のウイルスプロモーターを伴って、３’－ＮＳ１－ＮＳ２－Ｎ－Ｐ－Ｍ－ＳＨ－Ｇ－Ｆ－Ｍ２－Ｌである。そのため、ネイティブＲＳＶゲノムでは、ＮＳ１は位置１にあり、ＮＳ２は位置２にあり、Ｎは位置３にあり、Ｐは位置４にあり、Ｍは位置５にあり、ＳＨは位置６にあり、Ｇは位置７にあり、Ｆは位置８にあり、Ｍ２は位置９にあり、Ｌは位置１０にある。この組織は、図１Ｃに概略的に示される。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組換えＲＳＶは、それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＦ、Ｇ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、およびＬ遺伝子を有するゲノムを含み、ここで、遺伝子位置１および２に位置するＦおよびＧ遺伝子は、それぞれ、ネイティブ遺伝子位置８および７から移動している。組換えＲＳＶのゲノムは、ＮＳ１タンパク質をコードする配列を欠失する改変をさらに含む。一部の実施形態では、欠失は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列（ｗｔ組換えＲＳＶ株Ａ２、ＧｅｎｂａｎｋＫＴ９９２０９４）に対応する位置９９～６２６の欠失を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０（両端を含む）に対応する１１２ヌクレオチドの欠失、ならびに配列番号１のＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａをさらに含む。この欠失および５ヌクレオチドの置換は、まとめて「ＬＩＤ」変異または改変と呼ばれる。下記の実施例において考察されるように、ネイティブＲＳＶゲノムに対するこれらの改変の新規組合せは、優れた免疫応答を誘発する組換えＲＳＶをもたらす。

本明細書で使用される場合、文脈（contect）が他を指示しない限り、ウイルスの名称は、限定的ではなく説明的である。それぞれのウイルスにおける改変または変異の完全なセットは、必ずしもその名称で完全にリストされない。加えて、文脈が他を指示しない限り、ウイルスの名称における改変／変異の出現の順序およびフォワードスラッシュは、変わり得、例えば、「ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１」は、「ＬＩＤ／ΔＮＳ１／Ｆ１Ｇ１」と同じである。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組換えＲＳＶは、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含むゲノムであって、欠失が、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置９９～６２７の（of of）欠失であり、組換えＲＳＶが、感染性で、弱毒化され、自己複製性である、ゲノムを含む。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に提供される組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０（両端を含む）に対応する１１２ヌクレオチドの欠失、ならびに配列番号１のＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａをさらに含む。下記の実施例において考察されるように、ネイティブＲＳＶゲノムに対するこれらの改変の新規組合せは、優れた免疫応答を誘発する組換えＲＳＶをもたらす。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、ＴＣＡコドンによってコードされるＳ１３１３残基およびＡＡＡコドンによってコードされるＹ１３１４Ｋ置換を含むＬタンパク質をさらに含み、アミノ酸位置は、配列番号１３（Ｌタンパク質のアミノ酸配列）に示される参照Ｌタンパク質配列に対応する。この変異の対は、「１０３０ｓ」と呼ばれ、脱弱毒化に対して非常に耐性であるように逆遺伝学によって開発および最適化された（Luongo, et al. 2012. J Virol 86:10792-10804）。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、Ｓ１３１３の欠失およびＩ１３１４Ｌ置換を含むＬタンパク質をさらに含み、アミノ酸位置は、配列番号１３に示される参照Ｌタンパク質配列に対応する。この変異の対は、「Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ」と呼ばれ、脱弱毒化に対して非常に耐性であるように逆遺伝学によって開発および最適化された（Luongo, et al. 2013. J Virol 87:1985-1996）。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶのＦタンパク質は、野生型配列、例えば、配列番号１４によってコードされる。他の実施形態では、組換えＲＳＶは、Ｆタンパク質配列中に１つまたは複数の変化を含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態では、ＲＳＶのタンパク質をコードするネイティブのまたは天然に存在するヌクレオチド配列は、選択された宿主、特に、ヒトにおいて発現の増加のために設計されたコドン最適化配列で置き換えられていてもよい。例えば、一部の実施形態では、組換えＲＳＶのＦタンパク質は、コドン最適化配列ＦＢＢ（「ＦＢＢ」）（配列番号１５）によってコードされる。異なるバージョンのコドン最適化を得ることができる。

いくつかの実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、任意の異種遺伝子を含まない。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、上記で考察された１つまたは複数の変異、および配列番号１（Ｄ４６配列）と少なくとも９０％（少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％など）同一であるアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。一部の実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、上記で考察された１つまたは複数の変異で改変されたＤ４６ゲノムである。いくつかの実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、本明細書で考察される１つまたは複数の変異を含み、Ｄ４６ＲＳＶ（配列番号１）のゲノム配列と比較した組換えＲＳＶのゲノムの任意の残りの配列の差は、生物学的に重要ではない（例えば、残りの配列の差は、公知のシス作用性シグナルを改変するか、またはアミノ酸コーディングを変更するか、またはウイルスのｉｎｖｉｔｒｏ複製またはプラークサイズに測定可能な影響を及ぼす、野生型ゲノム配列に対する変化を含まない）。

本明細書に開示される組換えＲＳＶの実施形態は、サブタイプＡＲＳＶまたはサブタイプＢＲＳＶであり得る。本明細書に開示される組換えＲＳＶの実施形態は、感染性で、弱毒化され、自己複製性である。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、ＦＭ２、およびＬ遺伝子を含むＲＳＶゲノムであって、ゲノムが、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含む、ＲＳＶゲノムを含む。いくつかのそのような実施形態では、組換えＲＳＶのＳＨ遺伝子は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号２（ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および／または少なくとも９９％同一のポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号２（ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１）に示されるポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＦ、Ｇ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、およびＬ遺伝子を含むＲＳＶゲノムであって、遺伝子位置１および２に位置するＦおよびＧ遺伝子が、それぞれ、ネイティブ遺伝子位置８および７から移動しており、ゲノムが、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含む、ＲＳＶゲノムを含む。いくつかのそのような実施形態では、組換えＲＳＶのＳＨ遺伝子は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号３（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および／または少なくとも９９％同一のポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号３（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１）に示されるポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＦ、Ｇ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、およびＬ遺伝子を含むＲＳＶゲノムであって、遺伝子位置１および２に位置するＦおよびＧ遺伝子が、それぞれ、ネイティブ遺伝子位置８および７から移動しており、Ｌ遺伝子が、ＴＣＡコドンによってコードされるＳ１３１３残基およびＡＡＡコドンによってコードされるＹ１３１４Ｋ置換を含むＬタンパク質をコードし、アミノ酸位置が、配列番号１３に示される参照Ｌタンパク質配列に対応する、ＲＳＶゲノムを含む。いくつかのそのような実施形態では、組換えＲＳＶのＳＨ遺伝子は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号６（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および／または少なくとも９９％同一のポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号６（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）に示されるポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＦ、Ｇ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、およびＬ遺伝子を含むＲＳＶゲノムであって、遺伝子位置１および２に位置するＦおよびＧ遺伝子が、それぞれ、ネイティブ遺伝子位置８および７から移動しており、ゲノムが、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含み、Ｌ遺伝子が、Ｓ１３１３の欠失およびＩ１３１４Ｌ置換を含むＬタンパク質をコードし、アミノ酸位置が、配列番号１３に示される参照Ｌタンパク質配列に対応する、ＲＳＶゲノムを含む。いくつかのそのような実施形態では、組換えＲＳＶのＳＨ遺伝子は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号９（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および／または少なくとも９９％同一のポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号９（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）に示されるポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＦ、Ｇ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、およびＬ遺伝子を含むＲＳＶゲノムであって、遺伝子位置１および２に位置するＦおよびＧ遺伝子が、それぞれ、ネイティブ遺伝子位置８および７から移動しており、Ｆタンパク質が、配列番号１５（ＦＢＢ）に示される配列によってコードされ、ゲノムが、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含む、ＲＳＶゲノムを含む。いくつかのそのような実施形態では、組換えＲＳＶのＳＨ遺伝子は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号４（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および／または少なくとも９９％同一のポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号４（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１）に示されるポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＦ、Ｇ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、およびＬ遺伝子を含むＲＳＶゲノムであって、遺伝子位置１および２に位置するＦおよびＧ遺伝子が、それぞれ、ネイティブ遺伝子位置８および７から移動しており、Ｆタンパク質が、配列番号１５（ＦＢＢ）に示される配列によってコードされ、ゲノムが、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含み、Ｌ遺伝子が、ＴＣＡコドンによってコードされるＳ１３１３残基およびＡＡＡコドンによってコードされるＹ１３１４Ｋ置換を含むＬタンパク質をコードし、アミノ酸位置が、配列番号１３に示される参照Ｌタンパク質配列に対応する、ＲＳＶゲノムを含む。いくつかのそのような実施形態では、組換えＲＳＶのＳＨ遺伝子は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号７（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および／または少なくとも９９％同一のポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号７（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）に示されるポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＦ、Ｇ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、およびＬ遺伝子を含むＲＳＶゲノムであって、遺伝子位置１および２に位置するＦおよびＧ遺伝子が、それぞれ、ネイティブ遺伝子位置８および７から移動しており、ゲノムが、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含み、Ｌ遺伝子が、Ｓ１３１３の欠失およびＩ１３１４Ｌ置換を含むＬタンパク質をコードし、アミノ酸位置が、配列番号１３に示される参照Ｌタンパク質配列に対応する、ＲＳＶゲノムを含む。いくつかのそのような実施形態では、組換えＲＳＶのＳＨ遺伝子は、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号１０（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および／または少なくとも９９％同一のポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号１０（ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）に示されるポジティブセンスアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。

一部の実施形態では、組換えＲＳＶは、上記で述べた改変に加えて、遺伝子中の、遺伝子間領域中の、およびトレーラー領域中の非翻訳配列の欠失を含む。

ウイルスは、本明細書では、それらに存在する変異の組合せをリストすることによって命名され、限定的ではなく説明的である。（変異ΔＮＳ１、ＬＩＤ、および１０３０ｓを含むＲＳＶＤ４６を表すＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１／１０３０ｓにおけるような）ウイルスの名称における記号「／」の使用は、特に本文中に存在する場合、その名称をより読みやすくするために存在することは別にして、重要ではない。そのため、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１／１０３０ｓは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１／１０３０ｓおよびＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１／１０３０ｓと同じである。ＲＳＶは、常に名称で使用されるわけではない。アンチゲノムｃＤＮＡおよびそれらのコードされるＲＳＶの名称は、典型的には、互換可能である。

文脈が他を指示しない限り、本開示で使用される番号付けは、配列番号１および記載されるウイルスゲノム配列がポジティブセンスにあるとして本明細書に提供される、ＲＳＶＡ２株Ｄ４６の配列に基づく。記載されるウイルスについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列位置の配列の番号付けに関して、慣習が使用され、それによって、所与のウイルス配列中のそれぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、任意の改変を問わず、配列番号１として提供されるＲＳＶＤ４６株における配列位置番号を保持した。そのため、多くのゲノムは、ヌクレオチド長、および一部の場合ではアミノ酸長の変化を引き起こす欠失および／または挿入を含有するが、ゲノムおよびコードされるタンパク質中のすべての他の残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の番号付けは、未変化のままである。好都合のこの慣習がなくても、当業者は、配列アライメントだけでなく、オープンリーディングフレームの位置、周知のＲＮＡ特性、例えば、遺伝子開始シグナルおよび遺伝子終止シグナル、ならびにアミノ酸配列特性によって導かれる、長さが異なる可能性があるウイルスゲノムまたはタンパク質間の対応する配列位置を容易に同定することができるということも認識される。

例は、抗原性サブグループＡのＲＳＶ株Ａ２を利用し、これは、最も広く使用されている実験株であり、臨床研究において評価されている多数の生弱毒化ＲＳＶワクチン候補の親でもある。各種のさらなるＲＳＶ株が存在することを考えると（例えば、ＲＳＶＢ１、ＲＳＶＬｏｎｇ、ＲＳＶＬｉｎｅ１９）、当業者は、ある特定のＲＳＶの株が、所与の残基の位置を変更するヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入または欠失を有していてもよいことを認識する。例えば、別のＲＳＶ株のタンパク質が、株Ａ２との比較において、タンパク質の上流末端に２つの追加のアミノ酸を有する場合、これは、株Ａ２と比べて下流の残基のアミノ酸番号付けを、２増分ずつ増加させるであろう。しかしながら、これらの株は、高い度合いの配列同一性を共有するので、当業者は、Ａ２参照株のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を問題の株のものと単純に整列させることによって対応する配列の位置を決定することが可能であろう。したがって、本明細書に記載されるアミノ酸およびヌクレオチド位置は、本開示の文脈において具体的に列挙されているが、配列移動が、起こったか、またはウイルス株間の配列の変動に起因する場合に、他の位置に対応し得ることが理解されるべきである。２つまたはそれよりも多くの関連するウイルス間のタンパク質、またはタンパク質セグメント、または遺伝子、またはゲノム、またはゲノムセグメントの比較では、「対応する」アミノ酸またはヌクレオチド残基は、異なる種において機能が正確にまたはおよそ等しいと思われるものである。

組換えＲＳＶに対する上記に記載される改変に加えて、ＲＳＶクローンにおける異なるまたは追加の改変を行って、操作、例えば、さまざまな遺伝子間領域または他の場所での固有の制限部位の挿入を容易にすることができる。非翻訳遺伝子配列を除去して、外来配列を挿入するための能力を増加させることができる。

前記の定義された変異の感染性ＲＳＶクローンへの導入は、各種の周知の方法によって達成することができる。「感染性クローン」とは、感染性ウイルスを産生することができるゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡに転写され得る、合成のまたはその他のｃＤＮＡもしくはその産物を意味する。「感染性」という用語は、培養細胞、または動物もしくはヒト宿主において複製して、同じ活動が可能な子孫ウイルスまたはウイルス構造を産生することができるウイルスまたはウイルス構造を指す。そのため、定義された変異は、ゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡコピーに、従来技術（例えば、部位特異的変異誘発）によって導入することができる。アンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡのサブフラグメントを使用して完全なアンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡをアセンブルすることは、当業者に周知であり、それぞれの領域を別々に操作し（より小さなｃＤＮＡは大きなものよりも操作するのが容易である）、次いで、完全なｃＤＮＡに容易にアセンブルすることができるという利点を有する。そのため、完全なアンチゲノムもしくはゲノムｃＤＮＡ、またはその任意のサブフラグメントは、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発のための鋳型として使用することができる。次いで、変異したサブフラグメントは、完全なアンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡにアセンブルすることができる。変異は、単一のヌクレオチド変化から、１つまたは複数の遺伝子またはゲノム領域を含有する大きなｃＤＮＡピースの置き換えまで、変わり得る。

一部の実施形態では、開示される組換えＲＳＶは、逆遺伝学と呼ばれる組換えＤＮＡに基づく技法を使用して産生することができる（Collins, et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-11567）。この系は、定義された条件下で、適格な細胞基材において、すべてｃＤＮＡから感染性ウイルスをデノボ回収することを可能にする。逆遺伝学は、ｃＤＮＡ中間体を経てＲＳＶゲノムに所定の変異を導入する手段を提供する。特定の弱毒化変異は、前臨床研究において特徴付けられ、組み合わせて、所望のレベルの弱毒化を達成した。ｃＤＮＡからのワクチンウイルスの誘導は、外因性因子による汚染のリスクを最小化し、継代履歴を簡潔で十分に記録されている状態に保つのを助ける。回収されたら、操作されたウイルス株は、生物学的に誘導されたウイルスと同じ様式で増殖する。継代および増幅の結果として、ワクチンウイルスは、元の回収由来の組換えＤＮＡを含有しない。

組換えＲＳＶは、ＲＳＶのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを、転写し、複製するヌクレオカプシドを生じるのに必要なウイルスタンパク質と一緒に、細胞内共発現させることによって産生されてもよい。他のＲＳＶタンパク質をコードするプラスミドも、これらの必須タンパク質とともに含まれていてもよい。あるいは、ＲＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応で合成し、培養細胞にトランスフェクトされてもよい。

ワクチン使用および他の目的のためのＲＳＶウイルスを増殖させるために、ＲＳＶ成長を可能にする多くの細胞系が使用され得る。ＲＳＶは、各種のヒトおよび動物の細胞において成長する。ワクチン使用のための弱毒化ＲＳウイルスを増殖させるための好ましい細胞系としては、ＤＢＳＦＲｈＬ－２、ＭＲＣ－５、およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。最も高いウイルス収量は、通常、Ｖｅｒｏ細胞などの上皮細胞系を用いて達成される。細胞に、典型的には、約０．００１～１．０またはそれよりも高い範囲の感染多重度でウイルスを接種し、細胞を、ウイルスの複製を許容する条件下で、例えば、約３０～３７℃で約３～１０日間、またはウイルスが適当な力価に達するのに必要な間、培養する。温度感受性ウイルスは、多くの場合、「許容温度」として３２℃を使用して成長させる。ウイルスを、細胞培養物から取り出し、典型的には、周知の清澄化手順、例えば、遠心分離によって細胞構成要素から分離し、所望により、当業者に周知の手順を使用して、さらに精製してもよい。

本明細書に記載されるようにして弱毒化されたＲＳＶは、ワクチン使用のために適当な弱毒化、表現型復帰に対する抵抗性、および免疫原性を確認するために、各種の周知の一般的に許容されるｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏモデルにおいて試験することができる。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイでは、多重弱毒化され得るか、生物学的に誘導され得るか、または組換えＲＳＶであり得る改変ウイルスは、ウイルス複製の温度感受性、または「ｔｓ表現型」について、および小さなプラークの表現型について試験される。改変ウイルスはまた、ｉｎｖｉｔｒｏヒト気道上皮（ＨＡＥ）モデルにおいて評価されてもよく、これは、非ヒト霊長類およびヒトにおけるそれらの相対的弱毒化の順序にウイルスをランク付けする手段を提供するようである（Zhang et al 2002 J Virol 76:5654-5666；Schaap-Nutt et al 2010 Vaccine 28:2788-2798；Ilyushina et al 2012 J Virol 86:11725-11734）。改変ウイルスは、ＲＳＶ感染の動物モデルにおいてさらに試験される。各種の動物モデル（例えば、ネズミ、コットンラット、および霊長類）が記載されており、当業者に公知である。

組換えウイルスは、細胞培養、げっ歯類および非ヒト霊長類において、感染力、複製動態、収量、タンパク質発現の効率、および遺伝的安定性について、評価されてもよい。これらの半許容系は、複製のあらゆる差を確実に検出できない場合があるが、実質的な差が、特に、検出され得る。また、組換え株は、引き続いて、成人、血清陽性小児、および血清陰性小児において評価されてもよい。一部の場合では、以前に類似の株が血清陰性小児において十分な耐容性を示すことがすでに示されている場合に、新しい株が、血清陰性小児において直接評価されてもよい。評価は、複数の候補の同時評価を可能にする小数の、例えば、１０人のワクチンレシピエントおよび５人のプラセボレシピエントの群で行ってもよい。候補は、ワクチンウイルスの感染力、複製動態、排出、耐容性、免疫原性、および遺伝的安定性について、免疫直後の期間に評価されてもよく、ワクチンは、その全体が本明細書に組み込まれるKarron, et al. 2015, Science Transl Med 2015 7(312):312ra175に記載されるように、安全性、ＲＳＶ疾患、およびＲＳＶ特異的血清抗体の変化について、次のＲＳＶシーズンの間に調査に供されてもよい。このようにして、選択された代表的なウイルスの分析は、候補を絞り込んで、最も適切なものを特定するための比較的迅速なトリアージを提供し得る。

記載される変異したウイルスをコードするか、記載されるゲノムもしくはアンチゲノムを作り上げるか、記載されるゲノムもしくはアンチゲノムを発現するか、またはｉｎｖｉｔｒｏで組換えＲＳＶを作製するために有用なさまざまなタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドも本明細書に提供される。いくつかの例示的なポリヌクレオチドの核酸配列も提供される。前記の核酸配列のいずれかからなるか、またはそれから本質的になる配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書に提供される実施形態内に含まれる。さらに、本明細書に提供される前記の配列または配列番号のいずれかと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントもしくはそれよりも高い同一性、またはその間の任意の数値の同一性を有するポリヌクレオチド、および前記の分子にハイブリダイズするか、またはその相補体であるポリヌクレオチドが含まれる。

これらのポリヌクレオチドは、組換えＲＳＶを産生するために、ベクター内に含まれ得るか、またはベクターによって発現され得る。したがって、単離されたポリヌクレオチドまたはベクターをトランスフェクトされた細胞も含まれる。

追加の実施形態では、組換えＲＳＶを産生するための組成物（例えば、ＲＳＶコードｃＤＮＡを組み込んだ単離されたポリヌクレオチドおよびベクター）および方法が提供される。本明細書に記載されるようにして改変されたＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムを含む新規の単離されたポリヌクレオチド分子、およびそのような分子を組み込んだベクターも提供される。ＲＳＶタンパク質をコードする１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含む同じまたは異なる発現ベクターも提供される。これらのタンパク質は、ゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡから直接発現させることもできる。ベクター（複数可）は、好ましくは、細胞または無細胞溶解物中で発現または共発現され、それによって、感染性の変異ＲＳＶ粒子またはサブウイルス粒子を産生する。

感染細胞におけるＲＳＶ増殖を可能にする条件下で、ＲＳＶ感染を許容する宿主細胞に組換えＲＳＶ株を感染させることを含む、１つまたは複数の精製されたＲＳＶタンパク質を産生するための方法も提供される。培養における複製期間の後、細胞は溶解され、組換えＲＳＶはそれらから分離される。１つまたは複数の所望のＲＳＶタンパク質は、ウイルスの単離後、精製され、ワクチン、診断および他の使用のための１つまたは複数のＲＳＶタンパク質が得られる。

上記の方法および組成物は、感染性ウイルスもしくはサブウイルス粒子、またはそれらの誘導体をもたらす。感染性ウイルスは、真正のＲＳＶウイルス粒子と同等であり、そのままで感染性である。これは、新鮮な細胞に直接感染することができる。感染性サブウイルス粒子は、典型的には、適切な条件下で感染を開始することができるウイルス粒子のサブコンポーネントである。例えば、ゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡならびにＮ、Ｐ、ＬおよびＭ２－１タンパク質を含有するヌクレオカプシドは、細胞の細胞質に導入された場合に、感染を開始することができるサブウイルス粒子の例である。サブウイルス粒子は、感染力に必須ではない１つまたは複数のタンパク質、タンパク質セグメント、または他のウイルス構成要素を欠くウイルス粒子を含む。

他の実施形態では、本発明は、上記に記載される変異ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、ならびにＲＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＲＮＡポリメラーゼ伸長因子タンパク質をコードする１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター（同じまたは異なるベクター）を含む細胞または無細胞溶解物を提供する。これらのタンパク質の１つまたは複数は、ゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡから発現させることもできる。発現の際に、ゲノムまたはアンチゲノムならびにＮ、Ｐ、ＬおよびＲＮＡポリメラーゼ伸長因子タンパク質は組み合わされて、感染性ＲＳＶウイルスまたはサブウイルス粒子を産生する。

ＩＩＩ．免疫原性組成物
開示される組換えＲＳＶおよび薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物も提供される。そのような組成物は、各種の様式によって、例えば、鼻腔内経路によって、対象に投与され得る。投与可能な免疫原性組成物を調製するための標準的な方法は、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995などの刊行物に記載されている。

潜在的な担体としては、限定されるものではないが、生理学的平衡培養培地、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン（例えば、油／水型もしくは水／油型のエマルジョン）、さまざまな種類の湿潤剤、凍結保護添加剤もしくは安定剤、例えば、タンパク質、ペプチドもしくは加水分解物（例えば、アルブミン、ゼラチン）、糖（例えば、スクロース、ラクトース、ソルビトール）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸ナトリウム）、または他の保護剤が挙げられる。得られる水性溶液は、そのままで使用のために包装されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。凍結乾燥調製物は、単回または複数回の投与のいずれかのために、投与の前に無菌溶液と組み合わされる。

免疫原性組成物は、限定されるものではないが、有効濃度（通常、≦１％ｗ／ｖ）のベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、および／またはプロピルパラベンを含む、貯蔵の間の分解を防止または最小化する静菌剤を含有することができる。静菌剤は、一部の患者に禁忌である場合があり、したがって、凍結乾燥製剤は、そのような構成要素を含有しているまたは含有していない溶液中で復元されてもよい。

免疫原性組成物は、薬学的に許容される媒体として、生理学的条件に近づけるために必要な物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、およびトリエタノールアミンオレエートを含有することができる。

免疫原性組成物は、必要に応じて、宿主の免疫応答を増強するアジュバントを含んでいてもよい。好適なアジュバントは、例えば、トール様受容体アゴニスト、ミョウバン、ＡｌＰＯ４、アルハイドロゲル、リピドＡおよびその誘導体またはバリアント、油エマルジョン、サポニン、中性リポソーム、組換えウイルスを含有するリポソーム、ならびにサイトカイン、非イオン性ブロックコポリマー、ならびにケモカインである。当技術分野において周知の多くの他の好適なアジュバントの中でも、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）およびポリオキシプロピレン（polyxylpropylene）（ＰＯＰ）を含有する非イオン性ブロックポリマー、例えば、ＰＯＥ－ＰＯＰ－ＰＯＥブロックコポリマー、ＭＰＬ（商標）（３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＩＮ）、ならびにＩＬ－１２（ＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）をアジュバントとして使用してもよい（Newman et al., 1998, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15:89-142）。これらのアジュバントは、免疫系を非特異的な方法で刺激するのを助け、このようにして、医薬生成物に対する免疫応答を増強するという利点を有する。

一部の例では、組換えＲＳＶを含む免疫原性組成物を、他のウイルス性病原体、特に、他の小児疾病を引き起こすものに対する防御応答を誘導する他の医薬生成物（例えば、ワクチン）と組み合わせることが望ましい場合がある。例えば、本明細書に記載される組換えＲＳＶを含む組成物は、目的の年齢群（例えば、およそ１～６か月齢の乳児）のためのＡｄｖｉｓｏｒｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＰｒａｃｔｉｃｅｓ（ＡＣＩＰ；ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ａｃｉｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって推奨される他のワクチンを含むこともできる。これらの追加のワクチンとしては、限定されるものではないが、ＩＮ投与されるワクチンが挙げられる。そのため、本明細書に記載される組換えＲＳＶは、例えば、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）、ジフテリア、破傷風および百日咳（ＤＴａＰ）、肺炎球菌（ＰＣＶ）、ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈｉｂ）、ポリオ、インフルエンザ、およびロタウイルスに対するワクチンと同時に投与されてもよい。

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、対象における免疫応答を誘導するための、例えば、対象におけるＲＳＶ感染を予防するための使用のために、単位剤形で提供され得る。単位剤形は、対象への投与のための好適な単一の予め選択された投与量、または２もしくはそれよりも多くの予め選択された単位投与量の好適なマークまたは測定された倍数、および／あるいは単位用量もしくはその倍数を投与するための計量メカニズムを含有する。

ＩＶ．免疫応答を誘発する方法
開示される組換えＲＳＶを含有する免疫原性組成物を対象へ投与することによって、対象における免疫応答を誘発する方法が本明細書に提供される。免疫の際に、対象は、ＲＳＶに特異的な抗体を産生することによって応答する。加えて、抗ウイルス性エフェクターを提供することができるだけでなく、免疫応答を調節する、自然免疫応答および細胞媒介性免疫応答が誘導される。免疫の結果として、宿主は、少なくとも部分的にもしくは完全にＲＳＶ感染に対して免疫を有するようになるか、または中等度もしくは重度のＲＳＶ疾患、特に、下気道のＲＳＶ疾患の発生に対して抵抗性になる。

追加の実施形態では、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失（配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置９９～６２７の欠失など）を含むゲノムを含む組換えＲＳＶを含有する免疫原性組成物を対象に投与することによって、対象における免疫応答を誘発する方法であって、組換えＲＳＶは、感染性で、弱毒化され、自己複製性である。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含むＳＨ遺伝子を含む。一部のそのような実施形態では、組換えＲＳＶのゲノムは、配列番号２（ＬＩＤ／ΔＮＳ１）に示されるか、またはそれらと少なくとも９９％同一のアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む。免疫の際に、対象は、ＲＳＶに特異的な抗体を産生することによって応答する。加えて、抗ウイルス性エフェクターを提供することができるだけでなく、免疫応答を調節する、自然免疫応答および細胞媒介性免疫応答が誘導される。免疫の結果として、宿主は、少なくとも部分的にもしくは完全にＲＳＶ感染に対して免疫を有するようになるか、または中等度もしくは重度のＲＳＶ疾患、特に、下気道のＲＳＶ疾患の発生に対して抵抗性になる。

ほぼすべてのヒトが、５歳までにＲＳＶに感染するので、出生コホート全体が、免疫のための関連する集団として含まれる。これは、例えば、免疫レジメンを、出生～６か月齢、６か月齢～５歳のいつでも、抗体の受身伝達によって自身の乳児を防御するために妊娠した女性（または子供を有する年齢の女性）、新生児または胎児の家族、５０歳より上の対象において開始することによって行われ得る。本開示の範囲は、母体免疫を含むことを意味する。いくつかの実施形態では、対象は、ＲＳＶ特異的抗体に関して血清陰性であるヒト対象である。追加の実施形態では、対象は、１歳以下、例えば、６か月齢以下、３か月齢以下、または１か月齢以下である。

重度の症状を有する（例えば、入院を必要とする）ＲＳＶ感染の最大のリスクがある対象としては、重度の疾患に対して最も感受性である、早産、気管支肺異形成症、および先天性心疾患の小児が挙げられる。小児期および成年期の間、疾患は、より軽症であるが、下気道疾患に関連し得、一般に、副鼻腔炎を合併する。疾患の重症度は、施設収容された高齢者（例えば、６５歳を超えるヒト）において増加する。重度の疾患は、重度の複合免疫不全症を有する人、または骨髄もしくは肺の移植後の人においても起こる。一部の実施形態では、これらの対象が、開示される組換えＲＳＶの投与のために選択され得る。

組換えＲＳＶを含有する免疫原性組成物は、個体のＲＳＶに対する免疫応答能力を誘導または増強するのに十分である「有効量」で、ＲＳＶ感染に感受性であるか、または代わりにそのリスクがある対象に投与される。免疫原性組成物は、限定されるものではないが、注射、エアロゾル送達、鼻スプレー、点鼻薬、経口接種、または局所的適用を介する方法を含む任意の好適な方法によって投与されてもよい。一部の実施形態では、ワクチンは、鼻腔内または皮下または筋肉内投与されてもよい。一部の実施形態では、これは、上気道に投与されてもよい。これは、限定されるものではないが、スプレー、液滴、またはエアロゾル送達によるのを含む任意の好適な方法によって行われてもよい。多くの場合、組成物は、ＲＳＶに対する抗体に関して血清陰性であるか、またはＲＳＶに対する経胎盤的に獲得された母親由来抗体を有する個体に投与される。

有効量の開示される組換えＲＳＶによる免疫の際に、対象は、ＲＳＶウイルスタンパク質、例えば、ＦおよびＧ糖タンパク質に特異的な抗体を産生することによって応答する。加えて、抗ウイルス性エフェクターを提供することができるだけでなく、免疫応答を調節する自然免疫応答および細胞媒介性免疫応答が誘導される。免疫の結果として、宿主は、少なくとも部分的にもしくは完全にＲＳＶ感染に対して免疫を有するようになるか、または中等度もしくは重度のＲＳＶ疾患、特に、下気道のＲＳＶ疾患の発生に対して抵抗性になる。

好ましい実施形態では、弱毒化されたウイルスは、確立されたヒト鼻腔内投与プロトコールに従って投与される（例えば、Karron et al. JID 191:1093-104, 2005において考察される通り）。簡潔には、成人または小児は、典型的には、０．５ｍｌの体積の生理学的に許容される希釈剤または担体中の有効量の組換えＲＳＶを有する液滴を介して鼻腔内接種される。これは、非複製性ウイルスによる非経口免疫と比較して、簡単および安全性の利点を有する。それは、ＲＳＶに対する抵抗性において主要な役割を果たす局所的な気道免疫の直接刺激も提供する。さらに、このワクチン接種の様式は、非常に若い者において典型的に見出されるＲＳＶ特異的な母性由来の血清抗体の免疫抑制効果を効率的に迂回する。また、ＲＳＶ抗原の非経口投与は、免疫病理学的合併症に関連している場合があり得るが、これは、生ウイルスで観察されていない。

投与される免疫原の正確な量ならびに投与のタイミングおよび反復は、患者の健康状態および体重、投与の様式、製剤の特質などを含むさまざまな要因によって決定される。投与量は、一般に、患者あたり約３．０ｌｏｇ_１０～約６．０ｌｏｇ_１０プラーク形成単位（「ＰＦＵ」）またはそれよりも多くのウイルス、より一般には、患者あたり約４．０ｌｏｇ_１０～５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵのウイルスの範囲である。一実施形態では、患者あたり約５．０ｌｏｇ_１０～６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵが、乳児期に、例えば、１～６か月齢で投与されてもよく、１回または複数回の追加のブースター用量が、２～６か月またはそれよりも後に与えられ得る。別の実施形態では、低年齢乳児は、他の多くの小児ワクチンの推奨される投与の時期である、およそ２、４、および６か月齢で、患者あたり約５．０ｌｏｇ_１０～６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量を与えられ得る。さらに別の実施形態では、追加のブースター用量が、およそ１０～１５か月齢で投与され得る。

本明細書に記載される組換えＲＳＶおよびその免疫原性組成物の実施形態は、対象における組換えＲＳＶ中のＲＳＶ抗原に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量で対象に投与される。有効量は、所望の免疫応答を生じさせるために、ウイルスのある程度の成長および増殖を可能にするが、ウイルスに関連する症状または疾病は生じさせない。本明細書に提供される指針および当技術分野における知識に基づいて、免疫のために使用するための組換えＲＳＶの適正量を決定することができる（cane determined）。

得られる免疫応答は、各種の方法によって特徴付けられ得る。これらには、限定されるものではないが、補体固定、プラーク中和、酵素結合免疫吸着検定法、ルシフェラーゼ免疫沈降アッセイ、およびフローサイトメトリーを含む試験によって検出され得る、ＲＳＶ特異的抗体の分析のための鼻洗浄液または血清の試料を採取することを含む。加えて、免疫応答は、鼻洗浄液または血清におけるサイトカインのアッセイ、いずれかの供給源由来の免疫細胞のＥＬＩＳＰＯＴ、鼻洗浄液または血清試料の定量的ＲＴ－ＰＣＲまたはマイクロアレイ分析、およびｉｎｖｉｔｒｏでのウイルス抗原への再曝露による鼻洗浄液または血清由来の免疫細胞の再刺激、ならびにフローサイトメトリーによって測定されるサイトカイン、表面マーカー、もしくは他の免疫相関物の産生もしくは提示についての、またはＲＳＶ抗原を提示する指標標的細胞に対する細胞傷害活性についての分析によって検出することができる。これに関して、個体も、上気道疾病の兆候および症状についてモニタリングされる。

所望の免疫応答は、ＲＳＶによるその後の感染を阻害することである。ＲＳＶ感染は、有効である方法のために、完全に阻害される必要はない。例えば、有効量の開示される組換えＲＳＶの投与は、所望の量により、好適な対照と比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも１００％（検出可能なＲＳＶ感染の予防）まで、その後のＲＳＶ感染を減少させることができる（例えば、細胞の感染またはＲＳＶに感染した対象の数もしくはパーセンテージによって測定される）。

有効投与量の決定は、典型的には、動物モデル研究、それに続くヒト臨床試験に基づき、かつ対象における標的の疾患の症状もしくは状態の出現もしくは重症度を有意に低減するか、または対象における所望の応答（免疫応答の中和など）を誘導する投与プロトコールによって導かれる。これに関する好適なモデルとしては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、コットンラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、フェレット、非ヒト霊長類、および当技術分野において公知の他の許容される動物モデル対象が挙げられる。あるいは、有効投与量は、ｉｎｖｉｔｒｏモデル（例えば、免疫学的および組織病理学的なアッセイ）を使用して決定することができる。そのようなモデルを使用して、組成物の有効量（例えば、所望の免疫応答を誘発するか、または標的の疾患の１つもしくは複数の症状を軽減するのに有効である量）を投与するための適切な濃度および用量を決定するために、通常の算出および調整のみが必要とされる。

組換えＲＳＶの対象への投与は、対象がその後に野生型ＲＳＶに感染または再感染した場合に、重篤な下気道疾患、例えば、肺炎および細気管支炎、またはクループに対して防御的な免疫応答の生成を誘発することができる。天然に循環しているウイルスは、特に、上気道において、依然として感染を引き起こすことが可能であるが、免疫、およびおそらく野生型ウイルスによるその後の感染による抵抗性のブースティングの結果として、鼻炎の可能性が低減する。免疫後、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで同種の（同じサブグループの）野生型ウイルスを中和することができる、検出可能なレベルの宿主が生み出した血清および分泌抗体が存在する。多くの例では、宿主抗体は、異なる非ワクチンサブグループの野生型ウイルスも中和する。

１つまたは複数の開示される組換えＲＳＶのウイルスを含む免疫原性組成物は、コーディネート（またはプライム－ブースト）免疫プロトコールまたは組み合わせ製剤（combinatorial formulation）を使用することができる。数回のブーストを行うことができ、それぞれのブーストは、異なる開示される免疫原であり得ることが企図される。一部の例では、ブーストは、別のブーストまたはプライムと同じ免疫原であってもよいことも企図される。ある特定の実施形態では、新規の組み合わせ免疫原性組成物およびコーディネート免疫プロトコールは、抗ウイルス免疫応答、例えば、ＲＳＶタンパク質に対する免疫応答の誘発の方にそれぞれ向かわせる別々の免疫原または製剤を用いる。抗ウイルス免疫応答を誘発する別々の免疫原性組成物は、単一の免疫ステップにおいて対象に投与される多価免疫原性組成物において組み合わせることができ、またはそれらは、コーディネート（もしくはプライム－ブースト）免疫プロトコールにおいて別々に（１価免疫原性組成物で）投与することができる。

一部の実施形態では、開示される組換えＲＳＶ（ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１（配列番号２）、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１（配列番号３）、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１（配列番号４）、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ（配列番号６）、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ（配列番号７）、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ（配列番号９）、またはＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ（配列番号１０）のいずれか１つなど）は、プライム免疫のために使用され、ブーストは、ＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス（配列番号１６）、またはＢ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルス（配列番号１７）による免疫を含む。

一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルス（配列番号１９）、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号４）、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号２）、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルス（配列番号１８）、またはＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩウイルス（配列番号１１）の投与を含み、ブーストは、ＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含む。

一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルス（配列番号１９）、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号４）、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号２）、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルス（配列番号１８）、ＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩウイルス（配列番号１１）、またはＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルス（配列番号１７）の投与を含む。

一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルス（配列番号１９）、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号４）、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号２）、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルス（配列番号１８）、ＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩウイルス（配列番号１１）、またはＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス（配列番号１６）の投与を含む。

一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルス（配列番号１９）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス（配列番号１６）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルス（配列番号１９）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルス（配列番号１７）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルス（配列番号１９）の投与を含み、ブーストは、ＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含む。

一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルス（配列番号１８）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス（配列番号１６）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルス（配列番号１８）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルス（配列番号１７）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルス（配列番号１８）の投与を含み、ブーストは、ＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含む。

一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス（配列番号１６）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルス（配列番号１７）の投与を含む。

一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号４）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス（配列番号１６）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号４）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルス（配列番号１７）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号４）の投与を含み、ブーストは、ＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含む。

一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号２）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス（配列番号１６）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号２）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルス（配列番号１７）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルス（配列番号２）の投与を含み、ブーストは、ＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含む。

一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩウイルス（配列番号１１）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス（配列番号１６）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩウイルス（配列番号１１）の投与を含み、ブーストは、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルス（配列番号１７）の投与を含む。一部の実施形態では、プライムは、ＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩウイルス（配列番号１１）の投与を含み、ブーストは、ＲＳＶ２７６ウイルス（配列番号１２）の投与を含む。

本明細書に提供されるプライム－ブースト免疫方法のいずれかでは、プライムおよびブーストは、約５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ～約６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量で対象に鼻腔内投与されてもよい。本明細書に提供されるプライム－ブースト免疫方法のいずれかでは、好適な対象、例えば、５歳またはそれよりも若いヒト対象が、免疫のために選択されてもよい。本明細書に提供されるプライム－ブースト免疫方法では、ウイルスは、好適な方法、例えば、鼻腔内投与によって、対象に投与される。

一部の実施形態（embodiemnt）では、本明細書に開示される組換えＲＳＶは、３．０ｌｏｇ_１０～７．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量、例えば、約５．０ｌｏｇ_１０～約６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量（例えば、約６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量）で、５歳またはそれよりも若い（例えば、約２歳またはそれよりも若い）ヒト対象に鼻腔内投与される。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組換えＲＳＶは、３．０ｌｏｇ_１０～７．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量（例えば、約６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量）で、５歳またはそれよりも若い（例えば、約２歳またはそれよりも若い）ＲＳＶ血清陽性ヒト対象に鼻腔内投与され、ここで、投与後最初の２週間の間に採取された鼻洗浄液における組換えＲＳＶの力価は、３．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｍｌ鼻洗浄液またはそれ未満であり、対象に投与される組換えＲＳＶは、弱毒化され、その結果、対象への鼻腔内投与後最初の１か月以内に、対象は、呼吸器／熱性疾病を示さないか、またはウイルスを受けていなかった同等の対象のものと同等の種類および重症度の、軽度（グレード１）の呼吸器／熱性疾病を示す。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組換えＲＳＶは、３．０ｌｏｇ_１０～７．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量（例えば、約６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量）で、５歳またはそれよりも若い（例えば、約２歳またはそれよりも若い）ＲＳＶ血清陽性ヒト対象に鼻腔内投与され、ここで、投与後最初の２週間の間に採取された鼻洗浄液における組換えＲＳＶの力価は、３．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｍｌ鼻洗浄液またはそれ未満である。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組換えＲＳＶは、３．０ｌｏｇ_１０～７．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量（例えば、約６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量）で、５歳またはそれよりも若い（例えば、約２歳またはそれよりも若い）ＲＳＶ血清陽性ヒト対象に鼻腔内投与され、ここで、組換えＲＳＶの投与は、≧７５％のレシピエントにおいて血清ＲＳＶ特異的抗体の増加を誘発する。

得られる免疫応答は、各種の方法によって特徴付けられ得る。これらには、限定されるものではないが、補体固定、プラーク中和、酵素結合免疫吸着検定法、ルシフェラーゼ免疫沈降アッセイ、およびフローサイトメトリーを含む試験によって検出され得る、ＲＳＶ特異的抗体の分析のための鼻洗浄液または血清の試料を採取することを含む。加えて、免疫応答は、鼻洗浄液または血清におけるサイトカインのアッセイ、いずれかの供給源由来の免疫細胞のＥＬＩＳＰＯＴ、鼻洗浄液または血清試料の定量的ＲＴ－ＰＣＲまたはマイクロアレイ分析、およびｉｎｖｉｔｒｏでのウイルス抗原への再曝露による鼻洗浄液または血清由来の免疫細胞の再刺激、ならびにフローサイトメトリーによるサイトカイン、表面マーカー、もしくは他の免疫相関物の尺度の生成もしくは提示についての、またはＲＳＶ抗原を提示する指標標的細胞に対する細胞傷害活性についての分析によって検出することができる。これに関して、個体も、上気道疾病の兆候および症状についてモニタリングされる。

本開示に記載される材料、情報、および方法は、等級分けされた弱毒化表現型を有する一連の弱毒化株を提供し、臨床ベンチマークに基づいて好適なワクチン候補株を選択する際に指針を提供する。以下の実施例は、ある特定の実施形態の特定の特性を示すために提供されるが、特許請求の範囲の範囲は、例証されたそれらの特性に限定されるべきではない。

（実施例１）
ＮＳ１欠失ならびにＦおよびＧ遺伝子移動を有する組換え呼吸器合胞体ウイルス
この実施例は、ＮＳ１遺伝子の欠失を１つまたは複数の追加の変異と組み合わせて含む組換え弱毒化ＲＳＶを記載する。

ＮＳ１およびＮＳ２タンパク質は、独立して、かつある程度協調的に、宿主の自然免疫応答およびアポトーシスの強い抑制を媒介し、適応免疫応答を抑制および変更することも見出されている。ＮＳ１は、多くのこれらの活性においてより多くの役割を果たすようである。ＮＳ１およびＮＳ２が宿主の応答を抑制および変更するメカニズムは、多数あり、不完全に特定され、不完全に特徴付けられている。両タンパク質、特にＮＳ１は、Ｉ型およびＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）ならびに炎症促進性サイトカインの誘導を阻害する。この阻害は、複数のメカニズムを含む。例えば、ＮＳ１およびＮＳ２は、例えば、ＲＩＧ－ＩおよびＭＡＶＳに結合して、それらの相互作用を遮断することによって、ならびにＲＩＧ－Ｉ、ＴＲＡＦ３、ＴＢＫ１、およびＩＫＫεの分解を促進することによって細胞内シグナル伝達経路を阻害する（Boyapalle, et al. 2012. PLoS One 7:e29386；Sweden, et al. 2009. J Virol 83:9682-9693）。ＮＳ１は、ＩＲＦ３活性化、その核移行、およびＩＦＮ－βプロモーターにおける転写物コアクチベーターとのその相互作用を遮断することができる（Spann, et al. 2005. J Virol 79:5353-5362；Ren, et al. 2011. J Gen Virol 92:2153-2159）。両タンパク質は、Ｉ型ＩＦＮ受容体（ＩＦＮＡＲ）からのシグナル伝達を阻害することが報告されており、これは、他の方法でＩＮＦ応答を増幅し、抗ウイルス状態に寄与する数十のタンパク質を誘導する。例えば、両タンパク質、特にＮＳ２は、ＳＴＡＴ２の分解を促進することが記載されている（Lo, et al. 2005, J Virol 79:9315-9319；Xu, et al. 2014. Intervirology 57:65-73）。ＮＳ１はまた、ＩＦＮ誘導抗ウイルス状態の構成要素、すなわち、ＮＳ１によって妨げられなければＲＳＶ複製を阻害する２’－５’－オリゴアデニル酸シンテターゼ様（ＯＡＳＬ）タンパク質を直接妨げることが示されている（Dhar, et al. 2015. J Virol 89:10115-10119）。両タンパク質、特にＮＳ１は、感染細胞の生存を延長し、子孫ＲＳＶの産生を増加させる効果を伴って、ＲＳＶ感染に応答して細胞アポトーシスの誘導を抑制する（Bitko, et al. 2007. J Virol 81:1786-1795）。両タンパク質、特にＮＳ１は、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を抑制することによって、部分的にＩＦＮ応答をアンタゴナイズすることによりＴ細胞サブセットの活性化をゆがめることによって、および調節性Ｔ細胞の応答を変更することによって、適応免疫の発生を抑制する（Munir, et al. 2008. J Virol 82:8780-8796；Munir, et al. 2011. PLoS Pathogen 7:e1001336；Yang, et al. 2015. Virology 485:223-232）。ＮＳ１タンパク質は、特異的ｍｉＲＮＡの発現を改変することによって、ＲＳＶ感染を容易にすることも示されている（Bakre, et al. 2015. J Gen Virol 96:3179-3191；Zhang, et al. 2016. Biochem Biophys Res Comm 478:1436-1441）。ＮＳ１タンパク質、およびより低い程度でＮＳ２タンパク質は、ミニゲノム系においてＲＮＡ合成を下方調節することも示されており、それらが、まだ明らかになっていない、ウイルスの遺伝子発現および／またはゲノム複製に対する直接効果を有することを示唆している（Atreya, et al. 1998. J Virol 72:1452-1461）。ＮＳ１およびＮＳ２に起因する活性およびメカニズムのこのリストは、決して、完全にまたはすべて特徴付けられていない。

いずれかまたは両方の遺伝子の欠失またはサイレンシングはｉｎｖｉｖｏでのＲＳＶ複製を弱毒化し、ＮＳ１の欠失は、血清陰性チンパンジーにおいて、ＮＳ２よりも高い弱毒化効果を有する（Whitehead, et al. 1999. J Virol 73:3438-3442；Teng, et al. 2000. J Virol 74:9317-9321）。これは、ＲＳＶ未感作ヒトに対する、最も予測的な代替と考えられる。ＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質の非存在下でのＩＦＮおよびアポトーシス応答の増加が、この弱毒化における主要な要因であると推定される。しかしながら、その未感作ヒト宿主におけるＲＳＶ複製に対する、ならびにヒトにおける生弱毒化ＲＳＶワクチン候補の弱毒化および免疫原性に対する、多くのＮＳ１媒介およびＮＳ２媒介活性の意味および影響は、調査中のままであり、理解は不完全である。ＮＳ２の欠失をさまざまな点変異と組み合わせて有するいくつかの実験ワクチンがヒトにおいて評価されている。ΔＮＳ２欠失を低温継代（ｃｐ）ＲＳＶ株由来のＮ、Ｆ、およびＬタンパク質における５つの点変異と組み合わせたこれらのワクチンウイルスの１つであるｒＡ２ｃｐΔＮＳ２は、血清陽性小児において弱毒化された（Wright, et al. 2006. J Infect Dis 193:573-581）。弱毒化されている温度感受性（ｔｓ）変異（２４８／４０４または５３０／１００９）の異なる対のさらなる追加をそれぞれ有する２つの他のワクチンウイルスであるｒＡ２ｃｐ２４８／４０４ΔＮＳ２およびｒＡ２ｃｐ５３０／１００９ΔＮＳ２は、血清陰性小児において過剰に弱毒化された（Wright, et al. 2006. J Infect Dis 193:573-581）。これらの研究は、ＮＳ２の欠失が、ヒト宿主において弱毒化していることは確認したが、ウイルスが、小児ワクチンとしてのさらなる評価のために好適に弱毒化されたとは考えられなかった。以前に、ＮＳ１遺伝子の欠失を有するＲＳＶは、ヒトにおいて評価されておらず、本開示では、本発明者らは、１２～５９か月齢のＲＳＶ血清陽性小児、および６～２４か月齢のＲＳＶ血清陰性小児におけるフェーズＩ臨床試験からのデータを提示する。

ΔＮＳ１および追加の変異を有する組換えＲＳＶの設計
組換えＲＳＶを構築するために使用されたＲＳＶアンチゲノムは、Ｄ４６と呼ばれる野生型ＲＳＶ株Ａ２アンチゲノムｃＤＮＡであった。このアンチゲノムｃＤＮＡは、文献でＤ５３と称される場合もある。Ｄ４６は、本逆遺伝学系のための土台であり（Collins, et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA 92:11563-11567）、その完全な配列は、米国特許第６，７９０，４４９号およびＧｅｎＢａｎｋＫＴ９９２０９４において示され、本明細書では配列番号１として提供される。

図１Ａは、ＮＳ１遺伝子の欠失を示す。５２９－ｎｔ欠失（ヌクレオチド９９～６２７（両端を含む））は、ＮＳ１ＯＲＦのＡＴＧの最初のヌクレオチドであるヌクレオチド９９から開始し、かつそれを含み、ＮＳ２ＯＲＦのＡＴＧ（ヌクレオチド６２８～６３０）の直前のヌクレオチド６２７まで及び、かつそれを含む。この欠失は、ＮＳ１遺伝子の上流の非翻訳領域をＮＳ２ＯＲＦの翻訳開始コドンに接続する。

図１Ｂは、ゲノム中のそれらのネイティブ位置１および２からのそれらの隣接遺伝子配列のほとんどと併せたＮＳ１およびＮＳ２ＯＲＦの欠失を示す。１０４２－ｎｔ欠失（ヌクレオチド９９～１１４０（両端を含む））は、ＮＳ１ＯＲＦのＡＴＧの最初のヌクレオチドであるヌクレオチド９９から開始し、かつそれを含み、ＮＯＲＦのＡＴＧ（１１４１～１１４３）の直前のヌクレオチド１１４０まで及び、かつそれを含む。これは、ＮＳ１遺伝子の上流の非翻訳領域をＮＯＲＦの翻訳開始コドンに接続する。

図１Ｃは、「ＬＩＤ」変異を示し、これは、５つのヌクレオチド置換（Ｃ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ）と一緒にＤ４６のＳＨ遺伝子の下流の非翻訳領域の１１２のヌクレオチドの欠失を含み、これは、ＳＨＯＲＦの最後の３つのコドンおよび停止コドンを含み、アミノ酸コーディングを変更しない（Bukreyev, et al. 2001. J Virol 75:12128-12140）。ＬＩＤ変異を有するＲＳＶが、一般に、前臨床研究において野生型様表現型を有するようであるが（Bukreyev, et al. 2001. J Virol 75:12128-12140）、これは、細胞培養において中程度の複製の増加などの可能性のある微妙な差を妨げないことに留意されたい。

図２は、プロモーターが近接し、かつ（Ｆに先行するＧの天然の順番ではなく）Ｇに先行するＦを有するような、それらの天然ゲノム位置からＧおよびＦ遺伝子の移動を示す。図２Ａは、ＲＳＶＬＩＤからのＦおよびＧ遺伝子の欠失を示す。ヌクレオチド４６３０～７５５１（両端を含む）は、ＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡから欠失されて、ＦおよびＧ遺伝子が除去された。これは、ＳＨ遺伝子－終止シグナルをＦ／Ｍ２遺伝子間領域に融合する効果を有する。この変異は、ＬＩＤ変異（ＳＨ遺伝子の上または下の白三角で示される）を有するアンチゲノムｃＤＮＡにより示されるが、改変は、ＬＩＤ変異に依存しない。図２Ｂは、組換えＲＳＶアンチゲノムの、それぞれ遺伝子位置１および２におけるＦおよびＧ遺伝子の挿入を示す。ＧおよびＦＯＲＦ（網掛けされた配列）を、それらの天然の順序の逆で（すなわち、Ｇ－Ｆの代わりにＦ－Ｇ）遺伝子に再構築した。それぞれのＯＲＦを、最終構築物（アンチゲノムｃＤＮＡ）において、それが、単一ヌクレオチドからなる短い遺伝子間領域によって分離されたＦおよびＧ遺伝子を伴って、短い非翻訳領域ならびに遺伝子開始シグナルおよび遺伝子終止シグナルに挟まれるように設計した。ＸｈｏＩ部位を有するヌクレオチドアダプターを、ＦおよびＧＯＲＦの上流および下流に追加し、上流のＸｈｏＩ部位の作出は、ＬＩＤアンチゲノムｃＤＮＡにおいて、ＣＴＴＧ（大文字で示す）からｔｃｇａ（小文字で示す）までの上流の非翻訳ＮＳ１遺伝子領域を表す配列中のヌクレオチド８８～９１の変異を必要とした。下欄でアンチゲノムとともに示されるように、Ｆ－Ｇ遺伝子カセット（網掛けの矩形）は、ＸｈｏＩ部位を使用して、ゲノムｃＤＮＡに挿入された。

図３は、ＬＩＤ変異（ＬＩＤ変異はＳＨ遺伝子の上の白三角で示される）；それらの天然位置からのＧおよびＦの欠失（ΔＧ＋Ｆ）、ならびにそれぞれ２番目および１番目の遺伝子位置へのそれらの移動（Ｆ１Ｇ２、それらの天然の順序Ｇ－Ｆの逆でＦおよびＧを有する）；ＦＯＲＦがコドン最適化されているＦ１Ｇ２（Ｆ１ＢＢＧ２）；ＮＳ１遺伝子の欠失（ΔＮＳ１）；Ｌ割り当ての１３２１Ｋ（ＡＡＡ）および１３１３Ｓ（ＴＣＡ）からなる１０３０ｓ変異の追加；ＬにおけるΔ１３１３およびＩ１３１４Ｌ（ＣＴＧ）変異の追加；ならびにＮＳ１およびＮＳ２遺伝子両方の欠失（ΔＮＳ１＋２）を含む、さまざまな変異の組合せを有するＲＳＶ株のゲノムマップを提供する。示されるＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１、ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ、ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ、およびＬＩＤ／ΔＮＳ１＋２／Ｆ１ＢＢＧ２構築物は、コドン最適化Ｆ１ＢＢ２ＯＲＦを含有し、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ、およびＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１＋２と呼ばれる並列構築物は、非最適化野生型バージョンを含有していた（示さない）。

組換えＲＳＶを、逆遺伝学によって回収した（Collins et al. 1995. Proc Natl Acad Sci U S A 92:11563-7を参照されたい）。ＲＳＶを、Ｖｅｒｏ細胞において、３２℃で成長させた。すべてのウイルスの完全なゲノム配列を、バックグラウンドを上回って検出可能な外因性変異を含まないことをクローニングされていないＲＴ－ＰＣＲ産物の自動サンガーシークエンシング解析によって確認した。

ｉｎｖｉｔｒｏでの組換えＲＳＶの評価
さまざまな組換えＲＳＶのマルチサイクル複製の動態および収量を、ウイルス感染に応答してＩ型インターフェロンを産生し得ないアフリカミドリザルＶｅｒｏ細胞において評価した（図４）。これは、ＬＩＤ、ΔＮＳ１、Ｆ１Ｇ２、およびＦ１ＢＢＧ２変異をさまざまな組合せで有するウイルスが、ワクチン製造のための細胞基材であるＶｅｒｏ細胞において妥当な力価まで複製することを示す。ＲＳＶＬＩＤウイルスが野生型様ウイルスであり、そのため、この実験およびその後の実験において野生型様対照としての役割を果たすことに留意されたい。

さまざまな組換えＲＳＶのマルチサイクル成長動態も、ヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞培養において評価した（図５）。ＨＡＥ培養物は、真正の気道上皮に非常に似ている、分化した、分極した、偽重層化した粘膜繊毛組織を形成する。これらの培養物における弱毒化複製は、非ヒト霊長類およびヒトにおける弱毒化複製の予測である。これらのデータは、ΔＮＳ１改変を単独またはＦ１Ｇ２およびＦ１ＢＢＧ２改変との組合せで有するウイルスが、ＲＳＶＬＩＤ親と比較して、強く弱毒化されたことを示す。

組換えＲＳＶのプラークおよび合胞体形成性を、Ｖｅｒｏ細胞において評価した（図６および７）。ＬＩＤ、Ｆ１ＢＢＧ２、Ｆ１Ｇ２、およびΔＮＳ１変異をさまざまな組合せで有する組換えＲＳＶは、Ｖｅｒｏ細胞において容易にプラークを形成し、Ｆ１Ｇ２およびＦ１ＢＢＧ２遺伝子シフトを有する組換えＲＳＶは、Ｆタンパク質の発現の増加と一致して、マルチサイクル複製の間に、Ｖｅｒｏ細胞において大きな合胞体の形成を指示する。

加えて、Ｆ１Ｇ２およびＦ１ＢＢＧ２改変を有する組換えＲＳＶに感染したＶｅｒｏ細胞は、変性および還元条件下でのゲル電気泳動ならびに示された特異性の抗体を使用するウェスタンブロット解析によって決定されるように、Ｖｅｒｏ細胞において、ＲＳＶＦおよびＧタンパク質の発現の増加を示し（図８）、ＲＳＶＦ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、およびＭタンパク質発現のレベルは、１．０としてのＲＳＶＬＩＤと比べて右に示した。

組換えＲＳＶは、ウイルス感染に対するインターフェロン応答にうってつけであるヒト気道Ａ５４９細胞においても評価した。ＮＳ１遺伝子を欠いている組換えＲＳＶに感染した細胞は、１型（α、β）およびＩＩＩ型（λ）インターフェロンの発現の増加を示した（図９）。Ａ５４９細胞を、３ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させ、組織培養培地上清を、感染の２４時間後に収集した。培地上清におけるＩＦＮ濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。これは、ＮＳ１遺伝子の欠失が、免疫応答を刺激し、ウイルス複製を弱毒化し得る、Ｉ型およびＩＩＩ型インターフェロンの発現の実質的な増加をもたらしたことを示した。

実験動物における組換えＲＳＶの評価
組換えＲＳＶを、マウスにおいて評価した（図１０）。ＮＳ１の欠失およびＬＩＤ変異の有りまたは無しでのＦ１Ｇ２またはＦ１ＢＢＧ２改変の存在は、野生型様ウイルスであるＲＳＶＬＩＤウイルスと比較して、マウスの上気道および下気道におけるＲＳＶ複製の低減をもたらした。これらのアッセイのために、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、動物あたり１０^４または１０^６ＰＦＵの用量のそれぞれ示されたＲＳＶに感染させた。ウイルスおよび用量あたり５匹の動物を、感染の３日後および５日後に屠殺し、鼻甲介および肺を回収し、ホモジネートし、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。

上気道および下気道におけるそれらの制限された複製にもかかわらず、ＬＩＤ、ΔＮＳ１、Ｆ１Ｇ２、およびＦ１ＢＢＧ２改変の示された組合せを有する組換えＲＳＶは、野生型様ウイルスであるＬＩＤウイルスと十分に比較されるＲＳＶ中和血清抗体の力価を誘導した（図１１）。これらのアッセイのために、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、動物あたり１０^４または１０^６ＰＦＵの用量のそれぞれ示されたＲＳＶに感染させ、血清試料を、感染２８日後に収集した。

アフリカミドリザル（ＡＧＭ）を使用して、ΔＮＳ２を有するＲＳＶ ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ、ΔＭ２－２を有するＲＳＶ２７６、および野生型ウイルスとの比較において、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１およびＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１を評価した。４匹の動物を、それぞれのウイルスに感染させ、ウイルス力価を、それぞれの動物からの鼻咽頭拭い液試料および気管洗浄試料から決定した（表１および２；図１２）。血清試料もそれぞれの動物から得、血清ＰＲＮＴ_６０力価を決定した（表３；図１３）。結果は、ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１が有望な弱毒化表現型を有し、優れた免疫応答を誘発することを示す。

（実施例２）
ヒト対象における組換えＲＳＶの評価
実験動物における研究からの情報は、多くの場合、ヒトにおける、特に、ＲＳＶ感染の最も高いリスクがあり、ワクチン開発の主要な目標である乳児および低年齢小児における、弱毒化、耐容性、および免疫原性の大きさの予測については完全に正確ではない。さらに、実験動物は、典型的には、乳児および若年齢小児の未成熟で有効性が低い免疫系と比較して、成熟した免疫系を有する成体動物である。呼吸器系ウイルスに関して、実験動物の上気道および下気道のサイズ、構造、および組成は、ヒトと比較して、差を有し得る。加えて、ＲＳＶの付属タンパク質、例えば、本開示に記載されるＮＳ１およびＮＳ２タンパク質を欠失する効果は、これらのウイルスタンパク質が、進化して、ヒト宿主細胞タンパク質と相互作用し、実験動物における対応するタンパク質と同じ相互作用および効果を有していない場合があるので、実験動物およびヒトにおいて同一であると仮定することができない。そのため、乳児および低年齢小児における臨床試験は、候補の小児ＲＳＶワクチンの評価のために重要である。

とりわけ、実験動物を含む前臨床研究に基づく小児ワクチン候補として有望であるようであり、フェーズＩ臨床研究に進んだほとんどの生弱毒化ＲＳＶ株は、さらなる臨床研究に進むには十分に有望ではないことが見出された。Karron et alは、最近、２５年よりも長くにわたって評価された小児ワクチン候補として１９の生弱毒化ＲＳＶ株の臨床研究をレビューした（Karron et al 2013 In Challenges and Opportunities for Respiratory Syncytial Virus Vaccines, Current Topics in Microbiology and Immunology 372, pp 259-284）。そのレビューにおいて１０の生物学的に誘導された生弱毒化ＲＳＶ株のうち、さらなる研究のために好適なものは見出されなかった。そのレビューにおいて９の追加の組換え的に誘導された生弱毒化候補のうち、唯一ＲＳＶＭｅｄｉ／ΔＭ２－２（Karron et al Sci Transl Med 312:ra175；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０１４５９１９８）が、さらなる臨床研究のためにおそらく好適であるようであるが、進まなかった。その後、５の追加の組換え的に誘導された生弱毒化ＲＳＶ株が、十分なデータを得て、さらなる臨床評価に対するそれらの好適さを決定するためのフェーズＩ臨床研究において評価された。これらの追加の株は、（ｉ）ＲＳＶＬＩＤ／ΔＭ２－２（McFarland et al. 2018. Live-attenuated respiratory syncytial virus vaccine candidate with deletion of RSV synthesis regulatory protein M2-2 is immunogenic in children. J. Infect. Dis. 217:1347-55；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２０４０８３１およびＮＣＴ０２２３７２０９）；（ｉｉ）ＲＳＶＤ４６／ｃｐ／Ｍ２－２（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０２６０１６１２）；（ｉｉｉ）ＲＳＶＬＩＤ／ｃｐ／ΔＭ２－２（Cunningham et al. 2019. Live-attenuated respiratory syncytial virus vaccine with deletion of RNA synthesis regulatory protein M2-2 and cold-passage mutations is over-attenuated. Open Forum Infect Dis. 2019 May 6;6(6):ofz212. doi: 10.1093/ofid/ofz212. eCollection 2019 Jun；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２８９０３８１およびＮＣＴ０２９４８１２７）；（ｉｖ）ＲＳＶＬＩＤ／ΔＭ２－２／１０３０ｓ（McFarland et al. 2020. Live respiratory syncytial attenuated by M2-2 deletion and stabilized temperature sensitivity mutation 1030s is a promising vaccine candidate in children. J. Infect. Dis. 221:534-43；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２９５２３３９およびＮＣＴ０２７９４８７０）、および（ｖ）ＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩ（McFarland et al. 2020. Live-attenuated respiratory syncytial virus vaccine with M2-2 deletion and with SH non-coding region is highly immunogenic in children. J. Infect. Dis. 2020 Feb 1. pii: jiaa049. doi: 10.1093/infdis/jiaa049.［印刷前に電子公開］；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３１０２０３４）である。これらの追加の５つのウイルスのうち、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＭ２－２／１０３０ｓのみが、さらなる臨床研究に進むことが好適であるようである。したがって、前臨床研究において有望さを調べ、小児臨床研究に進んだ、２５年よりも長くにわたって評価された合計で２４の生弱毒化ＲＳＶ株のうち、２つのみ（Ｍｅｄｉ／ΔＭ２－２およびＬＩＤ／ΔＭ２－２／１０３０ｓ）が、さらなる臨床研究のための候補と考えられた。このように、乳児および低年齢小児における生弱毒化ＲＳＶワクチン候補の臨床評価は、予測不可能であり、歴史的に、高い成功率を有していなかった。

本開示における２つのウイルスが、候補の生弱毒化小児ＲＳＶワクチン、すなわち、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１およびＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１として、小児におけるフェーズＩ臨床研究に進んだ（ゲノムマップについて図３Ａを参照されたい）。この研究は、生ＲＳＶ株における２つの独立した改変／変異：（ｉ）ＮＳ１遺伝子の欠失、ならびに（ｉｉ）ＦおよびＧ遺伝子の、それぞれそれらの通常の位置８および７から、それぞれ位置１および２への移動の最初の臨床評価を提供する。ヒト使用のために許容されるＣＴＭを調製するために、それぞれの変異体の種ウイルスを、世界保健機関Ｖｅｒｏ細胞から作製されたｃＧＭＰ適格Ｖｅｒｏ細胞にエレクトロポレーションされたｃＤＮＡから逆遺伝学によってデノボで作製した。それぞれの変異体についてのｃＧＭＰ適格ＣＴＭを、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで、同じ細胞基材において種ウイルスから調製した。ＲＴ－ＰＣＲ増幅を使用する全ゲノム配列解析は、２つの種ウイルスの調製物および２つのＣＴＭの調製物が、検出可能な外因性変異を含んでいなかったことを確認した。前臨床安全性試験は、２つのＣＴＭの調製物がヒト投与のために好適であったことを確認した。

単一用量のＬＩＤ／ΔＮＳ１およびＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１を、６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ（ＬＩＤ／ΔＮＳ１）または５．８ｌｏｇ_１０ＰＦＵ（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１）の用量で１２～５９か月齢のＲＳＶ血清陽性小児および５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量で６～２４か月齢のＲＳＶ血清陰性小児における、逐次、無作為化、二重盲検、プラセボ対照研究において、プラセボレシピエントと並べて評価した。小児を、ＬＩＤ／ΔＮＳ１、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１、またはプラセボを受けるように、２：２：１に無作為化し、点鼻薬（対象あたり０．５ｍｌ、鼻孔あたりおよそ０．２５ｍｌとして与える）として、それぞれ投与した。臨床プロトコール、同意書、および治験薬概要書は、ＣＩＲおよびＮＩＡＩＤの調査官によって開発され、新薬臨床試験開始届、ＦＤＡレビュー、インフォームドコンセント、施設内審査委員会レビュー、無作為化、盲検化、非盲検化、試験実施、ならびにＮＩＡＩＤデータ安全性モニタリング委員会によるレビューは、本質的に、以前に記載されたようにして行った（Karron et al. 2015. A gene deletion that up-regulates viral gene expression yields an attenuated RSV vaccine with improved antibody responses in children. Sci Transl Med7:312ra175）。

小児は、ＲＳＶシーズン外の毎年４月１日～１０月３１日に登録した。小児の評価を行い、鼻洗浄液（ＮＷ）試料を、以下のワクチン投与の翌日に得た：ＲＳＶ血清陽性小児、研究の０、３～７および１０日目；ＲＳＶ血清陰性小児、それぞれの時点において研究の０、３、５、７、１０、１２、１４、１７、２８日目±１日。有害事象をＲＳＶ血清陽性およびＲＳＶ血清陰性小児について２８日目まで収集し、重篤な有害事象およびＬＲＩをＲＳＶ血清陰性小児について５６日目まで収集し、追加の健康診断を行い、ＮＷ試料をＬＲＩの事象において得た。発熱、上気道疾病（ＵＲＩ；鼻漏、咽頭炎、および嗄声を含む）、咳、ＬＲＩ、および中耳炎を、他の場所に記載される通りに定義した（Karron et al. 1997. Evaluation of two live, cold-passaged, temperature-sensitive respiratory syncytial virus vaccines in chimpanzees and in adult humans. J Infect Dis 176:1428-36）。疾病が起こったら、ＮＷ試料を、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）（ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＰａｔｈｏｇｅｎｓ２１キット；ＦａｓｔＴｒａｃｋＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ）によって、他のウイルスおよびマイコプラズマについて試験した。ＮＷ液中のワクチンウイルスを、ＲＳＶＦに対する３つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の混合物を使用する免疫プラークアッセイによって定量した（ｍＡｂ１１２９、１２４３、および１２６９、ならびに定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって）（Karron 2015、同書）。血清試料を、ＲＳＶ血清陽性参加者の接種前、および接種のおよそ１か月後、ならびにＲＳＶ血清陰性参加者の接種の２か月後に得た。血清試料を、補体増強６０％ＲＳＶプラーク低減中和アッセイを使用してＲＳＶ中和抗体について、および酵素結合免疫吸着検定法を使用してＲＳＶＦ糖タンパク質に対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体について、試験した（Karron et al. 2015、同書）。プラーク低減中和力価（ＰＲＮＴ）およびＲＳＶＦＩｇＧ力価を、逆ｌｏｇ_２値として表す。抗体応答を、ワクチン前力価と比較した、力価の≧４倍の増加として定義した。ワクチンによる感染を、培養もしくはＲＴ－ｑＰＣＲによるワクチンウイルスの検出、および／または血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴもしくはＲＳＶＦＩｇＧにおける≧４倍の上昇として定義した。ワクチンウイルスの排出の平均ピーク力価（ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｍＬ）を、感染ワクチンのみについて算出した。ＰＲＮＴおよびＲＳＶＦＩｇＧ力価を、平均の算出のためにｌｏｇ_２値に変換し、スチューデントのｔ検定を使用して、群間の平均を比較した。血清抗体力価を、すべての対象について算出し、検出限界を下回る力価を有するものに、２．３ｌｏｇ_２（ＰＲＮＴ）および４．６ｌｏｇ_２（ＥＬＩＳＡ）の値を割り当てた。疾病率および抗体応答を、両側フィッシャーの正確確率検定を使用して比較した。

ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１およびＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１ワクチン候補を、それらがＲＳＶ血清陰性小児において評価するために十分に弱毒化されたことを確認するために、１２～５９か月齢のＲＳＶ血清陽性小児において最初に評価した（表４および５）。ＲＳＶ血清陽性小児は、２０１８年および２０１９年に登録した。それぞれのワクチンを、それぞれ１０人の対象に投与し、プラセボ（Ｌ－１５組織培養培地を含有する）を、５人の対象に投与した。研究の０～２８日目に起こる軽度の呼吸器または熱性疾病が、それぞれ、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１、およびプラセボを受けた３０％、５０％、および４０％の参加者において観察された（表４）。下気道疾病（ＬＲＩ）の例は、この期間の間に観察されなかった。ワクチンレシピエントでは、これらの軽度の呼吸器／熱性疾病のインシデントのそれぞれは、外因性呼吸器病原体の検出と同時期に起こった（データは示さない）。どの群における対象も、検出可能なワクチンウイルスを排出せず、弱毒化を示した（表４）。単一ワクチンレシピエント（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１群）は、血清ＲＳＶ中和抗体およびＲＳＶ－Ｆ結合抗体の≧４倍の上昇を有していたが、ワクチンウイルスの排出または外因性ＲＳＶは検出されなかった（表４および５）。この低レベルの免疫原性も弱毒化を示した。このように、これらの新たなワクチン候補は両方とも、ＲＳＶ血清陰性のより低年齢の小児における評価に進むために十分に弱毒化されていた。

したがって、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１およびＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１ワクチン候補を、小児ＲＳＶワクチンのための主要な目標になる可能性がある年齢群の６～２４か月齢のＲＳＶ血清陰性小児において評価した（表５および６）。登録を２０１９年に開始し、依然として進行中である。データは、それぞれのワクチン群において４人の対象、２人のプラセボレシピエントについて利用可能である（完全な登録は、合計で３５～５０人の対象について、ワクチン群あたり１４～２０人の対象、およびプラセボレシピエントについて７～１０人になろう）。研究の０～２８日目に起こる軽度の呼吸器または熱性疾病が、それぞれ、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１、およびプラセボを受けた５０％、７５％、および５０％の参加者において観察された（表６）。これらのインシデントは、ワクチンウイルスの排出に関連するようではなかった（データは示さない）。ＬＲＩのインシデントはなかった。ＬＩＤ／ΔＮＳ１群におけるワクチンレシピエントの２人が、２．１ｌｏｇ_１０ＰＦＵ（培養）および５．４ｌｏｇ_１０コピー数（ＲＴ－ＰＣＲ）の平均ピーク力価で、ワクチンウイルスを排出した。ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１群では、ワクチンレシピエントの４人全員が、１．３ｌｏｇ_１０ＰＦＵ（培養）および３．９ｌｏｇ_１０コピー数（ＲＴ－ＰＣＲ）の平均ピーク力価で、培養および／またはＲＴ－ＰＣＲによって検出可能なワクチンウイルスを排出した（表６）。血清ＲＳＶ中和抗体および／またはＲＳＶ－Ｆ－結合抗体の≧４倍の上昇は、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルスのどのレシピエントについても観察されなかったが、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１ウイルスのレシピエントの７５％について、５．５ｌｏｇ_２（ＰＲＮＴ）および１０．８ｌｏｇ_２（ＥＬＩＳＡ）の平均力価で検出された（表７）。

これらの初期データに基づいて、２つの新たなウイルス（ＬＩＤ／ΔＮＳ１およびＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１）は、非常に弱毒化され、十分な耐容性を示す（弱毒化された）ようであった。ＲＳＶ血清陽性およびＲＳＶ血清陰性の対象の両方で、軽度の呼吸器／熱性疾患の頻度は、プラセボレシピエントについてとほぼ同じであり、通常、外因性病原体と同時期に起こるようであった。

両ウイルスは、非常に制限的であるようであった。ＲＳＶ血清陽性対象では、培養またはＲＴ－ＰＣＲによってアッセイされたかにかかわらず、いずれのウイルスの排出も観察されず、ワクチンレシピエントの１人だけが、血清ＲＳＶ特異的抗体応答を有していた。ＲＳＶ血清陰性の対象では、ＬＩＤ／ΔＮＳ１のレシピエントの５０％が、低力価でのみであるが、培養およびＲＴ－ＰＣＲによって検出されるウイルスを排出した。ＲＳＶ血清陰性の対象では、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１のレシピエントの５０％および１００％が、低力価でのみ、それぞれ、培養およびＲＴ－ＰＣＲによって検出されるウイルスを排出した。

ＲＳＶ血清陰性レシピエントでは、ＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルスは、血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴおよびＥＬＩＳＡ抗体応答において≧４倍の増加を誘導しなかったが、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１ウイルスは、レシピエントの７５％で、血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴおよびＥＬＩＳＡ抗体において≧４倍の増加を誘導した。

要約すると、この研究は、生弱毒化ＲＳＶワクチン候補に対する２つの改変：（ｉ）ＮＳ１遺伝子の欠失、ならびに（ｉｉ）ＦおよびＧ遺伝子の位置のそれぞれ８および７から１および２への移動のヒトにおける最初の評価を提供した。ＮＳ１遺伝子の欠失は、非常に弱毒化され、十分に耐容性を示して非常に制限的であり、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１の場合に、中程度の免疫原性であったウイルスをもたらした。Ｆ１Ｇ２遺伝子移動は、免疫原性を増加させるようであり、≧４倍の血清抗体応答を有するレシピエントのパーセンテージを０％（ＬＩＤ／ΔＮＳ１）から７５％（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１）まで増加させた。この研究は、進行中のままであり、追加の６～２４か月齢のＲＳＶ血清陰性対象を登録することになる。

本発明者らは、一般に、十分な抗原負荷を有するためには、およそ８５％またはそれよりも高い、培養によって検出される感染性の頻度を有し、かつ３．０～４．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｍｌの、培養によって検出される排出ウイルスの平均ピーク力価を有することが好ましいと考えるので、利用可能なデータは、これらのウイルスが５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量で過剰に弱毒化され得る可能性を高めた。当然ながら、進行中の臨床研究からのさらなるデータは、これらのウイルスの性質を明確にするはずである。いずれかまたは両方のウイルスが過剰に弱毒化されると見なされる場合、これは、おそらく、下記に記載される別の生弱毒化ＲＳＶ候補を用いて予め行われたように、５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵから６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵまで用量を増加させることによって補償され得る。

本発明者らは、以前にＲＳＶ ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌと呼ばれるウイルス（ＮＳ２遺伝子の欠失、ならびにＬにおけるΔ１３１３コドン欠失の存在、ならびにＬにおけるＩ１３１４Ｌ変異の安定化を有する）を、ＲＳＶ血清陽性およびＲＳＶ血清陰性小児において評価した（Karron 2019. Safety and Immunogenicity of the Respiratory Syncytial Virus Vaccine RSV/ΔNS2/Δ1313/I1314L in RSV-Seronegative Children. J Infect Dis. pii: jiz408. doi: 10.1093/infdis/jiz408.［印刷前に電子公開］；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０１８９３５５４）。５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量でＲＳＶ血清陰性小児に投与された場合、ＲＳＶ ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルスは、十分な耐容性を示した。排出は、培養により１５人のレシピエントのうちの１人（ピーク力価１．４ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｍｌ）、およびＲＴ－ＰＣＲより１５人のレシピエントのうちの１１人（平均ピーク力価３．０ｌｏｇ_１０コピー／ｍｌ）で検出可能であった。６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの１０倍高い用量で投与された場合、感染性は、実質的に改善され、排出が、培養により２０人のレシピエントのうちの１６人（平均ピーク力価１．８ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｍｌ）、およびＲＴ－ＰＣＲより２０人のレシピエントのうちの１８人（平均ピーク力価３．５ｌｏｇ_１０コピー／ｍｌ）で検出された。重要なことには、血清ＰＲＮＴの≧４倍の上昇を有するレシピエントのパーセンテージが、５３％から８０％まで増加した。用量の増加は、耐容性に対する効果を有さず、５．０および６．０ｌｏｇ_１０用量での軽度の呼吸器／熱性疾病の発生は、それぞれの個々のプラセボレシピエント群についての１４％および７０％と比較して、それぞれ７３％および５５％であった。

結論として、６～２４か月齢のＲＳＶ血清陰性小児におけるフェーズＩ臨床研究は、５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量で、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１およびＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１が、非常に弱毒化され、非常に制限的で、十分な耐容性を示し、ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１が、中程度の免疫原性であることを示した。ＦおよびＧ遺伝子の位置１および２への移動は、免疫原性の増加に関連した。

（実施例３）
生弱毒化ＲＳＶワクチンによるプライム－ブースト免疫
本研究では、Ｂ３ＴＭＣＴ変異の有りまたは無しでのＤＳ－Ｃａｖ１安定化ＲＳＶプレＦタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターのブースティング効果を、ＲＳＶとの比較において評価した。ブースティングを、一次ＲＳＶ感染を予め有していたハムスターおよびアフリカミドリザル（ＡＧＭ）において評価した。加えて、プライムおよびブーストの間の異なる時間間隔（約２、約６、および約１５か月）の効果を、ＡＧＭにおいて評価した。結果は、いずれかの実験動物においても、かつ時間間隔のいずれについても、免疫原性の増強のために操作されたＲＳＶＦを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによるブーストが、ＲＳＶによるブーストと比較して、有意に高い力価の血清ＲＳＶ中和抗体、特に、補体の添加なしでｉｎｖｉｔｒｏでＲＳＶを中和することができる、したがって特に強力である抗体を誘導したことを示す。

ＲＳＶＦおよびＧタンパク質は、２つのＲＳＶ中和抗原および主要な保護抗原である。Ｆは、一般に、Ｇよりも、より強力な中和抗原および保護抗原であると考えられ、そのアミノ酸配列は、ＲＳＶ株の中で、非常に高く保存されている。ＲＳＶＦは、準安定性である融合前（プレＦ）コンフォメーションで産生され、膜融合を駆動し、非常に安定な融合後（ポストＦ）コンフォメーションでＦを離す主要な不可逆的コンフォメーション再編成を受けるように容易に引き金が引かれ得る（McLellan et al. 2010. Structure of a major antigenic site on the respiratory syncytial virus fusion glycoprotein in complex with neutralizing antibody 101F. J Virol 84:12236-44；Swanson et al. 2011. Structural basis for immunization with postfusion respiratory syncytial virus fusion F glycoprotein (RSV F) to elicit high neutralizing antibody titers. Proc Natl Acad Sci U S A 108:9619-24；McLellan et al. 2013. Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a prefusion-specific neutralizing antibody. Science 340:1113-7を参照されたい）。プレＦおよびポストＦは、一部の中和エピトープを共有するが、回復期のヒト血清における中和活性のほとんどは、プレＦに特異的なエピトープを認識する（Graham. 2017. Vaccine development for respiratory syncytial virus. Curr Opin Virol 23:107-112）。ＲＳＶＦは、構造に基づく操作によって、例えば、「ＤＳ」と呼ばれるジスルフィド結合および「Ｃａｖ１」と呼ばれる２つの疎水性の空洞充填アミノ酸置換の導入によって、プレＦのコンフォメーションで実質的に安定化され得る（McLellan et al. 2013. Structure-based design of a fusion glycoprotein vaccine for respiratory syncytial virus. Science 342:592-8）。ＤＳ－Ｃａｖ１安定化プレＦは、サブユニットワクチンとしてまたはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）ベクターによって発現されるいずれかのポストＦよりも、げっ歯類および非ヒト霊長類において実質的により高い免疫原性である（Liang et al. 2015. Enhanced Neutralizing Antibody Response Induced by Respiratory Syncytial Virus Prefusion F Protein Expressed by a Vaccine Candidate. J Virol 89:9499-510）。

ＲＳＶ株Ａ２のいくつかの弱毒化誘導体が、候補生弱毒化ＩＮＲＳＶワクチンとして開発されている（Karron et al. 2013. Live-attenuated respiratory syncytial virus vaccines. Curr Top Microbiol Immunol 372:259-84を参照されたい）。これらの弱毒化ウイルスの一部は、乳児および低年齢小児におけるフェーズＩ研究において、十分な耐容性を示し、免疫原性であることを示した。

加えて、追加された遺伝子から、ＲＳＶ抗原、主にＦタンパク質を発現するＰＩＶベクター戦略は、探求されている。ＨＰＩＶ血清型１、２、および３は、重要な小児呼吸器系ウイルスであり、ＨＰＩＶ３は、重度の小児呼吸器感染症の主要な原因としてＲＳＶに次ぐ。ＰＩＶは、ＲＳＶに関連するエンベロープを有する非分節型ネガティブセンスＲＮＡウイルスであり、Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ目のＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科に属する。ｒＢ／ＨＰＩＶ３は、ウシＰＩＶ３（ＢＰＩＶ３）ゲノムからなり（宿主域制限により、ヒトおよび非ヒト霊長類において弱毒化を付与する）、ここで、ＢＰＩＶ３Ｆおよび赤血球凝集素－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質遺伝子（２つのＰＩＶ３中和抗原および主要保護抗原をコードする）は、ヒトＰＩＶ３（ＨＰＩＶ３）由来のそれらの対応物によって置き換えられた。

結果
ＲＳＶに予め感染したハムスターにおけるＲＳＶ対ｒＢ／ＨＰＩＶ３－ＲＳＶ－プレＦベクターによるブースター免疫の比較。２つのｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターが以前に記載されている（Liang et al. 2017. Improved Prefusion Stability, Optimized Codon Usage, and Augmented Virion Packaging Enhance the Immunogenicity of Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein in a Vectored-Vaccine Candidate. J Virol 91）：ＤＳ－Ｃａｖ１変異によりプレＦコンフォメーションの安定性が大きく増加したＲＳＶＦを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３／ＤＳ－Ｃａｖ１（ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターと略される）；および同じＤＳ－Ｃａｖ１変異と、ベクタービリオンへの効率的な組み込みを達成するためのそのＴＭＣＴドメインのＢＰＩＶ３Ｆタンパク質のものとの置き換えを有するＲＳＶＦを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターと略される）。これらの２つのベクターを、ＲＳＶＤ４６による単一一次ＩＮ感染を予め受けたハムスターにおいて、感染する能力および血清ＲＳＶ中和抗体の二次またはブースター応答を誘導する能力について、ＲＳＶＤ４６と比較した（図１４Ａ）。弱毒化ＲＳＶ株が、強い宿主域制限に起因してハムスターにおいて不十分な感染性であるので、ＲＳＶＤ４６を、感染のために使用した。

４８匹のハムスターを、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３に関して血清陰性であることを確認し、４つの群にし（群Ａ～Ｄ、それぞれｎ＝１２）、動物あたり１０^６ＰＦＵのＲＳＶＤ４６によるＩＮ接種によってプライムした（図１４Ａ）。４つの群における４８匹の追加のＲＳＶおよびＨＰＩＶ３血清陰性ハムスター（群Ｅ～Ｈ、それぞれｎ＝１２）を、比較のためにプライムしないままにした。プライミングの６週間後、血清を収集して、ＲＳＶ－ＰＲＮＴおよびＨＰＩＶ３－ＰＲＮＴを測定した。２日後、プライム群および非プライム群の対を、（ｉ）空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（群ＡおよびＥ）；（ｉｉ）ＤＳ－Ｃａｖ１ベクター（群ＢおよびＦ）；（ｉｉｉ）ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター（群ＣおよびＧ）；または（ｉｖ）ＲＳＶＤ４６（群ＤおよびＨ）で、ＩＮでブーストした。ベクターは、動物あたり１０^５ＴＣＩＤ_５０の用量で、ＲＳＶＤ４６は、１０^６ＰＦＵの用量で与えた。ブースティングの５日後、群あたり６匹のハムスターを屠殺し、鼻甲介（ＮＴ）および肺を回収し、免疫プラークアッセイ（ＲＳＶ）または限界希釈アッセイ（ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター）によってアッセイして、感染性ウイルス力価を測定した。群あたり他の６匹のハムスターについて、血清を、ブーストの２週間後に収集して、ＲＳＶ－ＰＲＮＴおよびＨＰＩＶ３－ＰＲＮＴを測定した。２日後、動物を、下記に記載されるようにして、ＲＳＶＤ４６により、ＩＮチャレンジした。

ブーストの５日後の非プライム動物におけるウイルス力価の分析は、ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターが、ＮＴおよび肺において、空ベクターよりも低い力価に複製されたことを示し（それぞれ、図１４Ｂおよび１４Ｃ、レーン３および５対１）、ＲＳＶＦ挿入物の存在に起因する弱毒化を示した。ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターは、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターよりもいくらか弱毒化され、ＲＳＶＦのベクターエンベロープへの組み込みがベクター複製を妨げる可能性があるという見解と一致した。

ＲＳＶプライム動物対非プライム動物の比較（図１４Ｂおよび１４Ｃ：偶数レーン対奇数レーン）は、プライミング免疫が、ＲＳＶＤ４６ブーストの複製を完全に制限したが（図１４Ｂ、１４Ｃ、レーン８対７）、空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの複製に対する効果を有さず（レーン２対１）、ＲＳＶ特異的免疫が、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ではなくＲＳＶの複製を制限するという予想と一致したことを示した。ＲＳＶによるプライミングは、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターの複製の中程度の制限（ＮＴにおいて２倍、肺において４倍）（図１４Ｂ、１４Ｃ、レーン４対３）、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターにおけるいくらか大きな制限（ＮＴにおいて３２倍、肺において１０倍；図１４Ｂおよび１４Ｃ、レーン６対５）をもたらしたが、プライム群および非プライム群の間の差は、ＮＴにおけるＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターについてのみ統計学的に有意であった（図１４Ｂ、レーン６対５）。これらの観察は、ｒＢ／ＨＰＩＶ３によるＲＳＶＦの発現が、ＲＳＶＦがベクタービリオンにパッケージングされた場合にいくらか増加したＲＳＶ特異的免疫による制限に対する低レベルの感受性を付与したことを示唆した。

ブースト２週間後の非プライム動物から収集された血清におけるＨＰＩＶ３中和抗体の力価の分析は、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターにおけるいずれかのＲＳＶ挿入物の存在が、空ベクターと比較したＨＰＩＶ３中和抗体の減少に関連し（図１４Ｄ、レーン３および５対１）、上記の挿入物に関連する複製の減少と一致したことを示した。ＤＳ－Ｃａｖ１挿入物の存在は、プライム動物対非プライム動物においてＨＰＩＶ３免疫原性を検出可能に低減しなかったが（図１４Ｄ、レーン４対３）、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ挿入物は、プライム動物対非プライム動物においてＨＰＩＶ３免疫原性の有意な減少をもたらし（図１４Ｄ、レーン６対５）、上記の制限と一致した。

プライミングおよびブースティングによって誘導された血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを、モルモット補体の添加ありまたはなしのアッセイによって決定した（図１４Ｅおよび１４Ｆ）。補体の添加は、立体障害および抗体に対するウイルス溶解活性を付与することができ、他の方法では劣った中和活性を有する可能性があるＲＳＶ特異的抗体の検出の増強をもたらす。添加された補体の非存在下での中和アッセイは、ＲＳＶを直接中和する「高品質」抗体についてのより厳格なアッセイである（Liang et al. 2016 Packaging and Prefusion Stabilization Separately and Additively Increase the Quantity and Quality of Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Neutralizing Antibodies Induced by an RSV Fusion Protein Expressed by a Parainfluenza Virus Vector. J Virol 90:10022-10038；Liang et al. 2017 Improved Prefusion Stability, Optimized Codon Usage, and Augmented Virion Packaging Enhance the Immunogenicity of Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein in a Vectored-Vaccine Candidate. J Virol 91を参照されたい）。

ＲＳＶＤ４６による初回プライミング感染は、補体の存在下で測定される高い血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ、および補体の非存在下で測定されるより低いＲＳＶ－ＰＲＮＴを誘導した。具体的には、プライミング６週間後に群Ａ～Ｄから収集された血清は、補体ありで決定された１０．６ｌｏｇ_２（１：１，５５２）～１１．２ｌｏｇ_２（１：２，３５３）（図１４Ｅ）、および補体なしで決定された４．５ｌｏｇ_２（１：２３）～５．２ｌｏｇ_２（１：３７）（図１４Ｆ）の範囲内の平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを有していた。

ＲＳＶＤ４６によるブースティングは、１２．３ｌｏｇ_２（１：５，０４３）のブースト後平均力価まで３倍、補体ありで測定された平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを増加させ（図１４Ｅ、レーン７対８）、また、６．６ｌｏｇ_２ＰＲＮＴ（１：９７）のブースト後平均力価まで３倍、補体なしで測定された平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを増加させた（図１４Ｆ、レーン７対８）。

ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによるブースティングは、１３．８ｌｏｇ_２（１：１４，２６３）および１３．７ｌｏｇ_２（１：１３，３０８）の顕著に高いブースト後平均力価まで、それぞれ、８倍および６倍、補体ありで測定された平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを増加させた（図１４Ｅ、ＤＳ－Ｃａｖ１についてレーン３対４、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴについてレーン５対６）。補体なしで測定されたブースト前および後の平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、８．３ｌｏｇ_２（１：３１５）および９．３ｌｏｇ_２（１：６３０）のブースト後平均力価まで、それぞれ、９倍および１８倍に増加した（図１４Ｆ、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターについてレーン３対４、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターについて５対６）。

ブースト後血清学のために使用される群あたり６匹の動物を、動物あたり１０^６ＰＦＵのＲＳＶＤ４６によるＩＮ感染によって、血清収集の２日後にもチャレンジし、ＮＴおよび肺を、チャレンジの３日後に収集し、チャレンジＲＳＶ力価を、免疫プラークアッセイによって決定した。ＲＳＶでプライムされず、空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターでブーストされた、したがって、ＲＳＶ特異的免疫を有していない動物は、ＮＴおよび肺におけるチャレンジＲＳＶのおよそ５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｇ組織を有していた。ＲＳＶＦを発現するＲＳＶＤ４６および／またはｒＢ／ＨＰＩＶ３でプライムおよび／またはブーストされた他の群におけるハムスターはすべて、ＮＴおよび肺における検出可能な感染性チャレンジＲＳＶを有していなかった（データは示さない）。このように、プライミングおよび／またはブースティングの組合せはすべて、ＲＳＶ複製についてのこの半許容モデルにおいて非常に保護的であり、保護有効性に基づいて識別できなかった。

要約すると、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターがブースター免疫のために使用された場合、実質的なベクター複製および血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴにおけるロバストな増加があり、非常に高い力価をもたらした。対照的に、ＲＳＶＤ４６がブーストとして使用された場合、その複製は、非常に制限され、ＲＳＶ－ＰＲＮＴの増加は、有意に低かった。さらにまた、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターによって誘導された血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴの増加倍数は、補体なしで測定された高品質ＲＳＶ中和血清抗体についてより高かった。

ＡＧＭにおけるブースター免疫の比較。ブースター免疫も、ＩＮ／ＩＴ経路の組合せによって（部位あたり１０^６ＰＦＵ）、単回ＲＳＶ感染により予めプライムされたＡＧＭにおいて評価した。これらの一次免疫において使用されたウイルスは、ＲＳＶ株Ａ２、またはｗｔ株ｒＲＳＶＡ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／００１／１１（これは、株Ａ２のように、サブグループＡ由来である）のさまざまな弱毒化誘導体であった。プライミングＲＳＶを、表８～１０にリストし、下記に記載する。本発明者らは、プライミングに関して等しくなるようにすべてのこれらのウイルスを処理したが、本発明者らが、ブースティング群の間で均等に、さまざまなウイルスを受ける動物を配分したことに留意されたい。３つの別々の実験（ＡＧＭ実験番号１～番号３）では、予めプライムされたＡＧＭは、ＩＮ／ＩＴ経路の組合せによって、弱毒化ＲＳＶ（部位あたり１０^６ＰＦＵ）またはＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター（部位当たり１０^６ＴＣＩＤ_５０）で、単回ブースター感染を受けた。実験番号２では、追加のＲＳＶプライムＡＧＭは、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクター（部位当たり１０^６ＴＣＩＤ_５０）を受けた。すべての場合に、ブースターＲＳＶは、ほとんどのＭ２－２ＯＲＦの欠失により弱毒化されたＲＳＶ株Ａ２のバージョンであるＲＳＶ２７６と呼ばれる生弱毒化ワクチン候補であった。

１２匹の動物について（ＡＧＭ実験番号１、図１５および表８）、プライムおよびブーストの間の時間間隔は、約２か月（具体的には５１日、２か月マイナス９日に等しい）であった。２０匹の他の動物について（ＡＧＭ実験番号２、図１６および表９）、プライムおよびブーストの間の時間間隔は、約６か月（具体的には１８９日、６か月プラス９日に等しい）であった。残りの４匹の動物について（ＡＧＭ実験番号３、図１７および表１０）、時間間隔は、約１５か月（具体的には４４３日、１５か月マイナス７日に等しい）であった。

ブースト後のウイルス排出をモニタリングするために、ＮＰおよびＴＬを、１０連続日の間、それぞれ、毎日および１日おきに収集し、ウイルス力価を、免疫プラークアッセイ（ＲＳＶ）または限界希釈（Ｂ／ＨＰＩＶ３ベクター）によって決定した。血清を、ブーストの日の１日前またはそれよりも前、ブーストの日、およびその後、４連続週の間、７日ごとに収集し、ＰＲＮＴを決定した。

ＡＧＭ実験番号１：ＲＳＶによるプライミングの約２か月後（２か月マイナス９日）のＡＧＭのブースター免疫。３つの異なるＲＳＶのうちの１つ（表８）：（ｉ）ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１、ＮＳ１遺伝子欠失変異体；（ｉｉ）ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１、ＲＳＶＦおよびＧ遺伝子が、それらの発現を増加させるために、１番目および２番目のゲノム位置に移動された先行するウイルスの誘導体；ならびに（ｉｉｉ）サブグループＡｗｔ株ｒＲＳＶＡ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／００１／１１による単一プライミング免疫を予め受けた１２匹のＡＧＭが利用可能であった。プライミング後３７日目（ブースティング２週間前）に、血清を収集し、分析して、補体の存在下でＲＳＶ－ＰＲＮＴを決定し、ＨＰＩＶ３血清陰性を確認した。２つの群が、類似する数の３７日目の血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴが高い、中程度または低い動物を有し、本質的に同一の群平均ＲＳＶ－ＰＲＮＴを有し、プライミングウイルスの同一性、および性別比に関してバランスが取られるように（表８）、１２匹のＡＧＭを、それぞれ分けられた６匹の動物の２つの群に再配分した。

５１日目に、１つの群をＲＳＶ２７６で、および他の群をＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターでブーストした。ＮＰ、ＴＬ、および血清検体を収集して、ウイルス排出および免疫原性を評価した（図１５Ｂ～１５Ｅ）。ＲＳＶ２７６の排出は、ＮＰにおいて微量でのみ１日、検出され、ＴＬにおいて検出されなかった。以前の実験では、ＲＳＶ２７６による４匹のＲＳＶ血清陰性ＡＧＭの感染が、ＮＰおよびＴＬにおいて３．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｍｌに達する最高ピーク平均力価で、１０日の期間にわたって実質的なウイルス排出をもたらしたので、ＲＳＶ２７６の非常に低い排出が、ＲＳＶプライム動物におけるＲＳＶ特異的免疫による制限に起因したことが証拠付けられた（図１９）。対照的に、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの排出は、およそＮＰにおいて５．０ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍｌおよびＴＬにおいて３．４ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍｌのピーク平均力価で、ＮＰおよびＴＬの両方において、１０日にわたってかなりのものであった（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。

補体ありで測定された１２匹の動物すべてについての平均ブースト前血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、１：２５６であった（図１５Ｄ）。ＲＳＶ２７６およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによるブースティングは、それぞれ、１：５，７９３および１：２３，１７０のピーク平均力価まで、ブースト前力価に対して２２倍および９１倍、補体ありで測定された血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを増加させ（ブースト後１４日目に起こる）、これは、有意に異なった（図１５Ｄ）。ベクターについてのピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、ＲＳＶ２７６についてよりも４倍大きかった。

補体の非存在下で測定されたら、１２匹の動物すべてについての平均ブースト前血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、１：１２であった（図１５Ｅ）。ＲＳＶ２７６およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによるブースティングは、それぞれ、１：２９４および１：４，３９０のピーク平均力価まで、２５倍および３６６倍、力価を増加させ（ブースト後１４日目に起こる；図１５Ｅ）、これは、有意に異なった。ベクターについてのピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、ＲＳＶ２７６についてよりも１５倍大きかった。このように、ベクターは、特に、補体なしで検出される「高品質」中和抗体について、ＲＳＶ２７６よりも強いブースティング効果を有していた。

ＡＧＭ実験番号２：ＲＳＶによるプライミングの約６か月後（６か月プラス９日）のＡＧＭのブースター免疫。５つの異なるＲＳＶのうちの１つ（表９）：（ｉ）ＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍ２－２欠失変異体；（ｉｉ）ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓ、Ｌポリメラーゼにおける遺伝学的に安定化された温度感受性（ｔｓ）変異を有するＮＳ２欠失変異体；（ｉｉｉ）ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１、異なるＡＧＭにおいてであるが、実験番号１におけるプライミングウイルスの１つでもあったＮＳ１欠失変異体；（ｉｖ）ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／、Ｆ遺伝子が、翻訳の増加のためにコドン最適化され、かつＦおよびＧ遺伝子が、発現の増加のために、それぞれ、１番目および２番目のゲノム位置に移動された先行するＬＩＤ／ΔＮＳ１変異体のバージョン；ならびに（ｖ）すでに記載したようにブーストにおいて使用された弱毒化ΔＭ２－２ＲＳＶでもあるＲＳＶ２７６（上記に記載）による単一プライミング免疫を予め受けた２０匹の他のＡＧＭが利用可能であった。

一次免疫後、血清を、２８および１５４日目に収集し、分析して、補体の存在下でのＲＳＶ－ＰＲＮＴを測定し、ＨＰＩＶ３血清陰性を確認した（１匹の動物、番号ＡＧ８９６０［表９］は、ＨＰＩＶ３血清陽性であることが見出され、したがって、ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターではなくＲＳＶによってブーストされるように割り当てられた）。２０匹のＡＧＭを、１５４日目の血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ、プライミングウイルスの同一性、および性別比をバランスを取って分けた３つの群（ｎ＝６、７、および７）に再配分した（表９）。プライミング後１８９日目（６か月プラス９日）に、３つの群を、ＲＳＶ２７６、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクター、またはＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターでブーストした。ＮＰ、ＴＬ、および血清検体を収集して、ウイルス排出および免疫原性を評価した（図１６）。

ＲＳＶ２７６の排出は、免疫プラークアッセイによってＮＰにおいて検出不能であったが（図１６Ｂ）、ＴＬにおけるＲＳＶ２７６の検出は低く散在性であった（図１６Ｃ）。ＲＴ－ｑＰＣＲによる多くの動物についてのＴＬ検体の評価（ポジティブおよびネガティブセンスＲＳＶＭＲＮＡの両方を検出した）は、より感受性が高く、最高で４５０～５，５００ＲＮＡ分子／ｍｌの力価で、ＲＳＶＲＮＡについて陽性の多数の試料を与えた（図２０）。対照的に、ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの排出は、およそＮＰにおいて５．５ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍｌおよびＴＬにおいて５．０ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの類似のピーク平均力価で、８～１０日の期間にわたって、ＮＰおよびＴＬにおける限界希釈アッセイによって豊富に検出された。ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターは、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターよりもわずかに遅く複製するようであるが、この差は、ＴＬにおいて、２および４日目においてのみ有意であった（図１６Ｃ）。２つのベクターは、最終的に、類似のピークＮＰおよびＴＬ力価に達した（図１６Ｂおよび１６Ｃ）。

補体ありの中和アッセイによって測定された場合（図１６Ｄ）、弱毒化ＲＳＶによる一次免疫によって誘導された２０匹のＡＧＭにおける平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、２８日目に１０Ｌｏｇ_２（１：１，０２４）に近づき（図１６Ｄ）、次いで、ブーストが与えられた１８９日目において、１：６４まで減少した。ＲＳＶ２７６、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクター、およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによるブースティングは、１：４，９７３、１：１６，６１５、および１：４９，６６７のピーク平均力価まで、それぞれ、７８倍、２６０倍、および７７６倍、補体ありで測定されたピーク平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを増加させ（ブースト後１４日目に起こる；図１６Ｄ）、これは、それぞれのベクター対ＲＳＶ２７６について、有意に異なった。ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターについてのピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、ＲＳＶ２７６についてよりも、それぞれ、３倍および１０倍高かった。ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターは、上記のそのわずかに遅い複製にもかかわらず、ＤＳ－Ｃａｖ１よりもわずかに免疫原性が高いと思われ、これは、Ｂ３ＴＭＣＴ改変に起因する可能性があるが、差は統計的に有意でなかった（図１６Ｄ）。

補体なしのＰＲＮアッセイによって測定された場合（図１６Ｅ）、２０匹のＡＧＭにおける平均ブースト前血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、１：８であった。ＲＳＶ２７６、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクター、およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによるブースティングは、１：２９４、１：２，５２１、および１：３，５６５の力価まで、それぞれ、３７倍、３１５倍、および４４６倍、ピーク平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを増加させ（ブースト後１４日目に起こる）、これは、それぞれのベクター対ＲＳＶ２７６について、有意に異なった。ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターについてのピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、ＲＳＶ２７６についてよりも、９倍および１２倍高かった。

ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによるブーストの血清ＨＰＩＶ３中和抗体を誘導する能力を、補体添加なしのＨＰＩＶ３中和アッセイを使用して比較した（図２１）。動物が、ブースト前にＨＰＩＶ３に関して血清陰性であり、したがって、これらの接種が、ＨＰＩＶ３に関して一次免疫であったことに留意されたい。２つのベクターは、非常に類似のピーク平均血清ＨＰＩＶ３－ＰＲＮＴ（それぞれ、１：７２４および１：７７６、接種後１４日目に起こる）を誘導し、それらが、ＨＰＩＶ３に対して本質的に等しい免疫原性であったことを示した。これは、２つのベクターがＡＧＭにおいて類似のピーク力価まで複製されたという観察と一致する（図１６Ｂおよび１６Ｃ）。

ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター対ＲＳＶ２７６によるブーストの、ＲＳＶＤＳ－Ｃａｖ１Ｆタンパク質に結合する血清および粘膜ＩｇＡ抗体を誘導する能力も評価した（図１６Ｆおよび１６Ｇ）。感度が高いＤＥＬＦＩＡＴＲＦイムノアッセイを使用して、抗原として精製された組換えＲＳＶＤＳ－Ｃａｖ１Ｆタンパク質に結合するサルＩｇＡを検出した。ＩｇＡ力価を、ＤＥＬＦＩＡＴＲＦアッセイにおいて４００蛍光単位を与えるｌｏｇ_２希釈として表す。２つのベクターによるブースティングは、強い血清ＩｇＡ応答を誘導し、２つのベクターによるブースト後のピーク平均力価は、同一であり（１９．５ｌｏｇ_２）、ＲＳＶ２７６によるブースティングによって誘導されたもの（１５．６ｌｏｇ_２）よりも約１６倍高かった。ブースト１４日後に、ピーク血清ＲＳＶ中和抗体応答と一致するピーク血清ＩｇＡ応答を検出した。呼吸器粘膜抗体応答は、ＲＳＶ感染を制限するのに特に有効であると考えられるので、本発明者らは、ブーストに対する鼻粘膜ＩｇＡ応答も評価した。鼻粘膜内層液を、吸収性膜（ＳＡＭストリップ）を使用して収集した。この方法は、ＩｇＡを検出するのに好適な相対的に高濃度の粘膜試料を提供する（図１６Ｇ）。すべての群において、血清ＩｇＡ（図１６Ｆ）および血清ＲＳＶ中和抗体（図１６Ｄおよび１６Ｅ）のピークと一致する粘膜ＩｇＡ応答のピークは、ブースト後１４日目であった（図１６Ｇ）。再び、ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターは、類似の強い応答（それぞれ、１２．１および１２．８ｌｏｇ_２のピーク平均力価）を誘導したが、ＲＳＶ２７６に対する応答は、約８分の１であった（９．２ｌｏｇ_２のピーク平均力価）。そのため、ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターは、ＲＳＶプレＦタンパク質に対する血清および粘膜ＩｇＡ抗体応答をブーストするそれらの能力において、ＲＳＶ２７６を有意に超えた。

ＡＧＭ実験番号３：ＲＳＶによるプライミングの約１５か月後（１５か月マイナス７日）のＡＧＭのブースター免疫。ＲＳＶ２７６による単一一次免疫を予め受けた４匹の他のＡＧＭが利用可能であった（表１０）。一次感染後４２９日目（およびブースティングの２週間前）に、血清を収集し、分析して、補体の存在下でＲＳＶ－ＰＲＮＴを決定し、ＨＰＩＶ３血清陰性を確認した。ＡＧＭを、血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ、および性別比に関してバランスを取った２つの群（それぞれｎ＝２）に配分した（表１０）。一次感染後４４３日目（１５か月マイナス７日）に、２つの群を、ＲＳＶ２７６またはＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターでブーストし、ウイルス複製および血清学的応答を、上記に記載されるようにしてモニタリングした。

約１５か月間隔後のＲＳＶ２７６の複製は、非常に制限され、ウイルスは、ＮＰおよびＴＬの免疫プラークアッセイによって検出されなかったが、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製は、ロバストであった（図１７Ｂおよび１７Ｃ）。

補体ありで測定された４匹の動物についての平均ブースト前血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、１：３３であった（図１７Ｄ）。ＲＳＶ２７６およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによるブースティングは、１：７，１３２および１：３０，５７４の力価まで、それぞれ、２１６倍および９２６倍、補体の存在下で測定されたピーク平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを増加させた（１４日目に起こる；図１７Ｄ）。ベクターについてのピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、ＲＳＶ２７６についてよりも４倍高かった。

補体なしで測定された４匹の動物についての平均ブースト前血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、１：６であった（図１７Ｄ）。ＲＳＶ２７６およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターによるブースティングは、１：１，０２４および１：７，６４３の力価まで、それぞれ、１７１倍および１，２７４倍、ピーク平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴを増加させた（１４日目に起こる；図１７Ｅ）。ベクターについてのピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、ＲＳＶ２７６についてよりも７倍高かった。

ＲＳＶ血清抗体は、ｉｎｖｉｔｒｏでＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製を抑制した。ハムスターにおけるＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製が、一次感染からのＲＳＶ特異的免疫によってＮＴにおいて有意に低減されたので（図１４Ｂ～１４Ｄ）、ｉｎｖｉｔｒｏでのこのベクターの複製がＲＳＶ中和抗体によって阻害され得るかどうかを調べた。ＬＬＣ－ＭＫ２細胞を、空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターまたはＤＳ－Ｃａｖ１もしくはＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターに０．０１のＭＯＩで感染させ、次いで、添加された補体の非存在下で、未感染ハムスター由来またはＲＳＶＤ４６もしくはｒＢ／ＨＰＩＶ３に感染したハムスター由来（図１４における実験から）の、１０％の熱失活された（５６℃で３０分間）血清を含有する培地とともにインキュベートした（図１８）。添加されたハムスター血清の存在下でのベクターの複製を、ウイルス力価について、３連続日の間、毎日、培養培地上清の小アリコートを採取することによってモニタリングした。

予想通り、ｒＢ／ＨＰＩＶ３免疫血清は、３つのベクター構築物すべての複製を完全に阻害したが（図１８Ａ～１８Ｃ、黒色曲線）、一次免疫前に収集された免疫前血清は、どの構築物の複製にも影響を及ぼさなかった（図１８Ａ～１８Ｃ）。ＲＳＶ免疫血清は、空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクター（図１８Ａ）またはＤＳ－Ｃａｖ１ベクター（図１８Ｂ）の複製に対する効果を有していなかったが、これはＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製を、２および３日目までに有意に低減し、後者では１００分の１まで低減した（図１８Ｃ）。これらの結果は、ＲＳＶ特異的血清抗体が、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製を阻害したが、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターはそうではなかったことを示した。

考察
小児ＲＳＶワクチンを開発するための非限定的なアプローチは、（ｉ）ＲＳＶの弱毒化誘導体、および（ｉｉ）追加された遺伝子由来のＲＳＶＦタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３を含む。両アプローチは、一次免疫のための評価の下で現在有望な候補を提供したが、ブースター免疫のためのそれらの有用性は、あまり明確ではなかった。以前の小児臨床研究では、ワクチン候補としての生弱毒化ＲＳＶは、数か月にわたる連続用量で投与されるブースター免疫において効率的ではなかった（少なくとも、ＲＳＶ特異的血清抗体の増加を誘導することに関して）。例えば、ＭＥＤＩ－５５９と呼ばれる生弱毒化ＲＳＶが、２か月の間隔で３回の連続用量で乳児および低年齢小児に与えられた場合、２回目および３回目の用量は、一般に、感染性が劣り、以前の用量による「摂取」があったこれらの対象における血清抗体応答のブースティングにおいて効率的ではなかった（Malkin et al. 2013. Safety and immunogenicity of a live attenuated RSV vaccine in healthy RSV-seronegative children 5 to 24 months of age. PLoS One 8:e77104を参照されたい）。類似の知見は、生弱毒化ＲＳＶｃｐｔｓ２４８／４０４が、４～６週間の間隔で２回の連続用量で乳児および低年齢小児に与えられた場合に得られた（Wright et al. 2000. Evaluation of a live, cold-passaged, temperature-sensitive, respiratory syncytial virus vaccine candidate in infancy. J Infect Dis 182:1331-42を参照されたい）。類似の知見はまた、最長で６か月の間隔で連続用量で与えられるＰＩＶ３の弱毒化バージョンにより得られた。このように、「同種」プライム－ブースト（すなわち、同じワクチンウイルスの連続用量）では、弱毒化ＲＳＶ（またはＰＩＶ３）は、通常、感染性であり、少なくとも６か月またはそれ未満の時間間隔内で、最初の「摂取」だけが血清ウイルス中和抗体に対して実質的に免疫原性である。ところで、二次感染が、弱毒化ＲＳＶではなくＲＳＶＤ４６による場合、状況は異なる。具体的には、対象が、夏の間に弱毒化ＲＳＶを受け、その後の冬の間にコミュニティーのＲＳＶＤ４６に自然曝露されたワクチン治験では、血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴの２０～４０倍のブーストがあった（Karron et al. 2015. A gene deletion that up-regulates viral gene expression yields an attenuated RSV vaccine with improved antibody responses in children. Sci Transl Med 7:312ra175を参照されたい）。このため、弱毒化ＲＳＶの反復用量の劣った免疫原性は、大部分は、それらの弱毒化に起因するようである。

本研究は、「異種」プライム－ブースト戦略を調べた。この戦略では、ＲＳＶによる一次免疫は、追加された遺伝子からＲＳＶＦタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３による二次免疫によってブーストされた。ＲＳＶＦタンパク質は、ＤＳ－Ｃａｖ１変異によってプレＦコンフォメーションが実質的に安定化され、それぞれの実験において使用されるＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの場合では、ベクタービリオンへのＲＳＶＦの効率的なパッケージングを媒介するＢ３ＴＭＣＴ改変を含有した。ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターそれ自身は、ＲＳＶと抗原的に異なるが、これは、ＲＳＶ抗原、この場合ではＦタンパク質を発現する。これは、本研究において測定されるようなＲＳＶ特異的血清抗体を含むＲＳＶ特異的免疫だけでなく、ＲＳＶ特異的粘膜抗体および細胞免疫を含む歴史的にあまり十分に特徴付けられていない他のエフェクターによって標的にされる可能性がある。ＲＳＶ特異的抗体に関して、この研究におけるＲＳＶＦが、ＤＳ－Ｃａｖ１変異に起因して融合に対して大部分は非機能的であり、したがって、推定上、ベクターの複製および伝播を最小化するか、またはそれに寄与しないであろうという理由で、ベクターによって発現されたＲＳＶＦへの結合は、おそらく、ベクターの感染および伝播を直接遮断しないであろう。しかしながら、ベクター感染細胞におけるＲＳＶＦの発現は、細胞傷害性Ｔ細胞または抗体依存性細胞媒介性傷害による破壊のために、これらの細胞を標的にする可能性がある。加えて、記載したように、本研究におけるすべての実験で使用されるＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターは、ベクタービリオンに効率的にパッケージングされたＲＳＶＦタンパク質のＢ３ＴＭＣＴバージョンを発現し、これは、例えばオプソニン化によって、破壊のために、ベクタービリオンを標的にする可能性がある。パッケージングされたＲＳＶＦへの抗体の結合は、結合および侵入の間にベクターのＨＮおよびＦタンパク質を妨害する立体障害を作り出す可能性もある。ＲＳＶＦに対する抗体応答が、既存のＦ特異的抗体によって抑制される可能性があることもあり得た。

同種および異種ブースティングを、ハムスターにおいて評価した。ハムスターに、ＲＳＶＤ４６による一次感染、および約６週間後のＲＳＶＤ４６による同種ブースター感染を与えた場合、回収されたＮＴおよび肺組織において検出可能な感染性ＲＳＶは存在せず、ＲＳＶ特異的免疫が、ＲＳＶブーストの複製を激しく制限するであろうという予想と一致した。しかしながら、補体の添加の有りまたは無しでの、測定された血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴにおける有意な約３倍の増加があり、いくらかの感染および抗原発現が起こったことを示唆した。空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターでブーストされたハムスターでは、ＲＳＶプライム動物対非プライム動物の間で、ＮＴおよび肺におけるウイルス力価の差はなく、ＲＳＶ特異的免疫が、実際に、ｒＢ／ＨＰＩＶ３骨格を制限しなかったことを示した。対照的に、ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製は、ＲＳＶプライム動物対非プライム動物における中程度の制限の量を示したが、差は、ＮＴにおけるＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの場合にのみ有意であった。これは、ＲＳＶＦタンパク質のパッケージングされていないバージョンの発現が、ＲＳＶ特異的免疫によるベクターのわずかな制限をもたらし、ＲＳＶＦタンパク質のパッケージングされたバージョンの発現が、いくらか大きな制限をもたらしたことを示唆する。これは、ＲＳＶプライムハムスター対非プライムハムスターにおいて、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター（ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターではないが）による血清ＨＰＩＶ３中和抗体の誘導の有意な減少に関連し、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製の低減の別の指標を提供した。ＲＳＶプライムハムスターでは、ＤＳ－Ｃａｖ１およびＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターは、ＲＳＶＤ４６について、８および６倍対３倍の補体ありでアッセイされた血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴの増加を誘導し、補体なしでアッセイされた場合、増加は、それぞれ、９および１８倍対３倍であった。補体の有りまたは無しでのアッセイされた得られるピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、ＲＳＶＤ４６についてよりもベクターについて有意に大きかった。このように、ハムスターにおけるこれらの結果は、（ｉ）ＲＳＶＤ４６による同種ブーストは、非常に制限され、中程度の免疫原性であった；（ｉｉ）空ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターは、ＲＳＶ特異的免疫によって制限されなかった；（ｉｉｉ）ｒＢ／ＨＰＩＶ３によるＲＳＶＦの発現は、ＲＳＶＦがベクタービリオンにパッケージングされた場合に有意になるＲＳＶ特異的免疫による制限に対して低い感受性のレベルを付与した；および（ｉｖ）ベクターによるブーストは、ＲＳＶＤ４６によるよりも有意に免疫原性であったことを示した。

ブースティングを、一次ＲＳＶ感染を予め有していたＡＧＭにおいても評価した。一次ＲＳＶ感染およびブーストの間の３つの異なる時間間隔を評価した：約２、約６、および約１５か月。ブースト前宿主免疫が、時間間隔の増加とともに減少する可能性があり、これが、ブーストの有効性に影響を及ぼす可能性があることが予期された。実際に、平均ブースト前血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、補体ありで測定された１：２５６、１：６４、および１：３３、ならびに補体なしで測定された１：１２、１：８、および１：６のそれぞれの力価で、約２、約６、および約１５か月の群において漸進的に減少した。他の免疫エフェクターが、一次ＲＳＶ感染、例えば、粘膜抗体および細胞免疫によって誘導され、また、時間とともに減少したと仮定することが妥当である。

ＲＳＶ２７６ブーストの複製は、感染性ウイルスの排出の散発的な痕跡のみを伴って、それぞれの時間間隔後に非常にほぼ等しく制限された。そのため、この弱毒化ＲＳＶを強く制限する能力において時間間隔の間の差はなかった。感染性ＲＳＶの排出は非常に制限されたが、推定上、観察された二次免疫応答をもたらすいくらかのウイルス感染および抗原発現があった。これは、ウイルス核酸の排出を検出した実験番号２において行われたＲＴ－ｑＰＣＲによってサポートされ、これは、分泌抗体によって中和され、感染力アッセイによって検出されなかった子孫ウイルスが含まれていてもよい。

ＲＳＶとは対照的に、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターは、ロバストに複製された。ＮＰおよびＴＬにおけるベクターのピーク平均力価は、実験番号２および３について、４．８～５．４ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの範囲で、非常に類似していた。ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの排出のこのレベルは、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３血清陰性アカゲザルにおいて以前に観察されたものと類似しており（Liang et al. 2017. Improved Prefusion Stability, Optimized Codon Usage, and Augmented Virion Packaging Enhance the Immunogenicity of Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein in a Vectored-Vaccine Candidate. J Virol 91を参照されたい）、約６か月および約１５か月の時間間隔後に、ＲＳＶに対する既存の免疫によってベクターのわずかな制限があったか、または制限がなかったことを示唆した。対照的に、実験番号１について（約２か月の時間間隔）、排出されたＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの力価は、およそＮＰにおいて０．５ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍｌまで、およびＴＬにおいて１．４～１．８ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０／ｍｌまで低下した（表１１）。これは、このベクターによるＲＳＶＦの発現、およびベクタービリオンへのＲＳＶＦのパッケージングが、ＲＳＶプライムハムスター対非プライムハムスターにおいて、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの制限と類似する、最も短い間隔後のＲＳＶ特異的免疫による制限に対する中程度の量の感受性を付与したことを示す可能性がある。一次感染によって誘導された細胞免疫が数か月間の間だけ持続し得るので、ハムスターモデルについて上記のように、これは、約６および約１５か月ではなく約２か月で観察されたＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの制限に寄与した可能性がある。しかしながら、任意の事象では、約２か月の間隔後の制限は、小さく、統計学的に有意ではなかった。

ベクタービリオンへのＲＳＶＦタンパク質のパッケージングに関連するＡＧＭにおける可能性のある制限を調べるために、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター（効率的にＲＳＶＦをパッケージングする）のブースト後複製を、ＡＧＭ実験番号２（プライミング後約６か月の間隔）において、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクター（パッケージングについて非常に非効率的である）のものと比較した。ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製は、仮定では、すでに記載したように、（ｉ）ベクタービリオンへのＲＳＶＦタンパク質のパッケージングに起因するベクター複製における妨害、および／または（ｉｉ）パッケージングされたＲＳＶＦタンパク質を標的にするＲＳＶ特異的免疫に起因する制限によって、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターと比較して、低減された可能性がある。ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製の動態は、ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターについてよりもわずかに遅かったが、差は、中程度であり、ＴＬにおいて２および４日目にのみ有意であり、２つのベクターについてのピーク力価は類似していた。本発明者らは、ＲＳＶ特異的ハムスター抗血清が、細胞培養において（補体の非存在下）、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターの複製を阻害したが、ＤＳ－Ｃａｖ１または空ベクターではそうではなかったことを見出した。このｉｎｖｉｔｒｏの状況では、阻害は、推定上、ベクタービリオンにパッケージングされたＲＳＶＦへの抗体の結合に起因し、ｉｎｖｉｖｏで作動する可能性があるメカニズム（複数可）を完全に繰り返さなくてもよい。

約２、約６、および約１５か月の間隔後のＲＳＶ２７６によるブースティングは、それぞれ、２２倍、７８倍、および２１６倍の補体ありで測定されたピーク平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴの増加をもたらし、１：５，７９３、１：４，９７３、および１：７，１３２のピーク平均力価をもたらした。補体なしで測定された場合、ピーク平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴのそれぞれの増加は、２５倍、３７倍、および１７１倍であり、１：２９４、１：２９４、および１：１，０２４のピーク平均力価をもたらした。このため、ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、一般に、約１５か月の間隔後の力価が、他の間隔と比較してわずかに高かった（補体ありで１倍、および補体なしで３．５倍）ことを除いて、異なる時間間隔の間で類似していた。

ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターについて、約２、約６、および約１５か月の間隔後のブースティングは、それぞれ、９１倍、７７６倍、および９２６倍の補体ありで測定されたピーク平均血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴの増加をもたらし、１：２３，１７０、１：４９，６６７、および１：３０，５７４のピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴをもたらした。補体なしで測定された場合、それぞれの増加は、３６６倍、４４６倍、および１，２７４倍であり、１：４，３９０、１：３，５６５、および１：７，６４３のピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴをもたらした。このように、ブースト後力価は、一般に、異なる時間間隔の間で類似しており、差は、２倍以下であり、どの間隔についても一致しなかった。

ＡＧＭ実験番号２において比較した場合、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター対ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターによるブースティングは、補体ありで測定された３倍大きい血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴ、および補体なしで測定された１．４倍大きい力価を誘導した。ハムスター研究では、ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクター対ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターによるブースティングは、補体なしで測定された血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴについてのみ大きく、わずか２倍であった。

ＡＧＭ実験では、ベクターについてのピーク平均ブースト後血清ＲＳＶ－ＰＲＮＴは、例外的に高く、それぞれ補体の有りまたは無しでのアッセイされて、最高で１：４９，６６７および１：７，６４３であった。これは、ベクターによるブースティングのより大きな例の一部が、免疫応答の大きさにおける限定に起因して鈍化し得る可能性を高める。ベクターについての力価は、補体ありでアッセイされた場合、ＲＳＶ２７６についてよりも高く（３～１０倍）、差は、補体なしでアッセイされた場合、さらに大きかった（７～１５倍）。両ベクターはまた、ＲＳＶ２７６と比較して、血清および粘膜ＩｇＡの有意に大きな応答を誘導し、２つのベクターの間の差はわずかであった。ＲＳＶと比較したベクターによるブーストのより大きな免疫原性は、それらのより高い複製のレベル（および得られるより大きな抗原発現）およびＲＳＶＦタンパク質へのＤＳ－Ｃａｖ１およびＢ３ＴＭＣＴ改変の両方を反映する可能性がある。

ＲＳＶに対する免疫応答は乳児期に低減するので、小児ＲＳＶワクチンによる一次免疫後にＲＳＶ特異的免疫をブーストすることは重要であり得る。この研究では、ＤＳ－Ｃａｖ１およびＢ３ＴＭＣＴ改変を有するＲＳＶＦを発現する弱毒化ＰＩＶベクターによるブースティングは、特に、補体の添加なしでｉｎｖｉｔｒｏで中和する「高品質」ＲＳＶ中和抗体について、弱毒化ＲＳＶによるブースティングよりも実質的により免疫原性であった。結果は、プライミングおよびブースティングの間の間隔が約２、約６、または約１５か月であったかにかかわらず、類似していた。これは、ＰＩＶベクターが、同じワクチン接種シーズン、または代わりに翌年の間に、ブースティングが有効であり得ることを示唆する。加えて、ＰＩＶベクター化ＲＳＶワクチンは、母体免疫後を含む母体移入からの、または半減期の増加のために操作された抗体の使用を含む受動抗体免疫予防からの受動血清ＲＳＶ中和抗体を有する低年齢乳児の一次免疫に十分に適し得る。これらの受動抗体は、弱毒化ＲＳＶを制限するが、ＰＩＶベクター化ＲＳＶワクチンを制限しない可能性がある。弱毒化ＰＩＶ３ベクターの使用は、重度の急性小児呼吸器疾患の病原体としてＲＳＶに次ぐＨＰＩＶ３に対する免疫も提供する。

材料および方法
ウイルス。この実施例におけるＲＳＶは、逆遺伝学を使用して調製されたサブグループＡ株Ａ２（ＧｅｎｂａｎｋＫＴ９９２０９４）の組換え（ｒ）野生型（ｗｔ）または弱毒化バージョンであった（Collins et al. 1995. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proc Natl Acad Sci U S A 92:11563-7）。弱毒化ＲＳＶを結果において記載する。１つの追加のＲＳＶは、急性呼吸器疾病の成人から２０１１年に収集された鼻洗浄液から単離されたｗｔサブグループＡ株ＲＳＶＡ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／００１／１１の組換えバージョンであるｒＲＳＶＡ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／００１／１１であった。Ｍａｒｙｌａｎｄ／００１／１１株のＦおよびＧタンパク質は、株Ａ２と９７％および８６％のアミノ酸配列同一性を有する。ｒＢ／ＨＰＩＶ３構築物は、以前に記載されており（Liang et al. 2017. Improved Prefusion Stability, Optimized Codon Usage, and Augmented Virion Packaging Enhance the Immunogenicity of Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein in a Vectored-Vaccine Candidate. J Virol 91）、２番目の遺伝子位置における遺伝子の追加に由来するＲＳＶ株Ａ２（ＧｅｎｂａｎｋＫＴ９９２０９４）のＦタンパク質の改変バージョンを発現する。ベクター構築物は、（ｉ）空ベクターであるｒＢ／ＨＰＩＶ３；（ｉｉ）ＤＳおよびＣａｖ１変異に起因するプレＦコンフォメーションの安定性の増加を有するＲＳＶＦタンパク質を発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３／ＤＳ－Ｃａｖ１（ＤＳ－Ｃａｖ１ベクターと略される）（McLellan et al. 2013 Structure-based design of a fusion glycoprotein vaccine for respiratory syncytial virus. Science 342:592-8）；ならびに（ｉｉｉ）ＤＳ－Ｃａｖ１変異およびＢＰＩＶ３Ｆのものによって置き換えられたそのＴＭおよびＣＴドメインを有するＲＳＶＦを発現するｒＢ／ＨＰＩＶ３／ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴ（ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴベクターと略される）であった。加えて、以前に記載されたように、ベクター構築物において使用されたＲＳＶＦＯＲＦは、コドン最適化によって改変され（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＲＳＶ株Ａ２の初期継代とアミノ酸レベルで同一のＦを作製するＨＥＫと呼ばれる２つのアミノ酸置換（Ｋ６６ＥおよびＱ１０１Ｐ）によってさらに改変されている。

ＲＳＶおよびｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターを、それぞれ、Ｖｅｒｏ細胞およびＬＬＣ－ＭＫ２細胞において、３２℃で成長させた。すべてのウイルスの完全ゲノム配列を、バックグラウンドを上回って検出可能な外因性変異を含まないことをクローニングされていないＲＴ－ＰＣＲ産物の自動サンガーシークエンシング解析によって確認した（それぞれ、３’および５’末端の約３０および約１２０ヌクレオチドを除き、これは、プライマー結合部位を含み、配列決定されていなかった）。

感染性ウイルスおよび血清抗体の滴定。ＲＳＶ調製物の力価を、以前に記載されたようにして、３つのＦ特異的モノクローナル抗体の混合物を使用する免疫染色によるＶｅｒｏ細胞におけるプラークアッセイによって決定し（Luongo et al. 2013. Respiratory syncytial virus modified by deletions of the NS2 gene and amino acid S1313 of the L polymerase protein is a temperature-sensitive, live-attenuated vaccine candidate that is phenotypically stable at physiological temperature. J Virol 87:1985-96）、力価を、１ｍｌまたは１ｇあたりのｌｏｇ_１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）として報告する。ｒＢ／ＨＰＩＶ３ベクターの力価を、以前に記載されたようにして、モルモット赤血球を用いる血球吸着によって検出されたウイルス陽性ウェルによるＬＬＣ－ＭＫ２細胞における限界希釈によって決定し（Durbin et al. 1999. Mutations in the C, D, and V open reading frames of human parainfluenza virus type 3 attenuate replication in rodents and primates. Virology 261:319-30）、力価を、１ｍｌまたは１ｇあたりのｌｏｇ_１０５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ_５０）として報告する。

血清ＲＳＶまたはＨＰＩＶ３中和抗体の力価を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＲＳＶまたはＨＰＩＶ３を使用するＶｅｒｏ細胞における６０％プラーク低減中和（ＰＲＮ）アッセイによって決定した（Liang et al. 2014. Chimeric bovine/human parainfluenza virus type 3 expressing respiratory syncytial virus (RSV) F glycoprotein: effect of insert position on expression, replication, immunogenicity, stability, and protection against RSV infection. J Virol 88:4237-50）。アッセイを、記載したようにして、５％の添加されたモルモット補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）の存在下（ＲＳＶ）または非存在下（ＲＳＶ、ＨＰＩＶ３）で行った。６０％プラーク低減中和力価（ＰＲＮＴ）は、ｌｏｇ_２および／または算術値で報告する。一次感染の前に、動物を、それぞれ、ＲＳＶまたはＨＰＩＶ３血清陰性であることを、補体ありのＰＲＮアッセイまたはモルモット赤血球を使用する赤血球凝集阻害アッセイによって確認した（Coates et al. 1966. An antigenic analysis of respiratory syncytial virus isolates by a plaque reduction neutralization test. Am J Epidemiol 83:299-313；van Wyke Coelingh et al. 1988. Attenuation of bovine parainfluenza virus type 3 in nonhuman primates and its ability to confer immunity to human parainfluenza virus type 3 challenge. J Infect Dis 157:655-62）。

動物研究。動物研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従って行い、ＮＩＡＩＤ動物管理使用委員会によって承認された。

単一プライム－ブースト実験を、図１４の凡例および添付の結果セクションに記載されるようにして、シリアンゴールデンハムスターにおいて行った。

３つのプライム－ブースト実験を、アフリカミドリザルにおいて行った（それぞれ、ＡＧＭ実験番号１～番号３、表８～１０、および図１５～１７）。ＲＳＶによる一次ＡＧＭ感染を、ほとんどがＲＳＶ株Ａ２の弱毒化誘導体であった多くの異なるＲＳＶを使用して行い、結果および表８～１０に記載する。これらの研究では、ＲＳＶは、１ｍｌのＬ－１５培地中の１０^６ＰＦＵの部位当たりの用量で、ＩＮ／気管内（ＩＴ）経路の組合せによって投与した。本研究において、ＡＧＭにおけるＲＳＶまたはＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴもしくはＤＳ－Ｃａｖ１ベクターによるブースター感染を、１ｍｌのＬ－１５培地中の１０^６ＰＦＵ（ＲＳＶ）または１０^６ＴＣＩＤ_５０（ベクター）の部位当たりの用量で、ＩＮ／ＩＴ経路の組合せによって、同じ方法で投与した。接種後、鼻咽頭スワブ（ＮＰ）および気管洗浄液（ＴＬ）を、１０日間、それぞれ、毎日および１日おきに収集し、ドライアイス上で急速凍結し、滴定まで－８０℃で貯蔵した。血清を、ブーストの日の接種前、およびその後の４連続週の間、７日ごとに収集した。

ＡＧＭ実験番号２では、鼻粘膜内層液を、ブースティングの日、およびブースティング後１４、２１、および２８日目に、合成吸着マトリックス（ＳＡＭ）ストリップ（ＮａｓｏｓｏｒｐｔｉｏｎＦＸｉ、ＨｕｎｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して、試料採取した。ＳＡＭストリップを、１つの鼻孔の鼻甲介下部の鼻粘膜に静かに置き、３０秒間保持し、３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する３００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で事前に満たしたマイクロ管に入れた。試料を、ドライアイス上で急速凍結し、使用まで－８０℃で保った。粘膜および血清ＩｇＡ力価を、下記に記載される解離－増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）によって決定した。

ＡＧＭＴＬ試料におけるＲＳＶＲＮＡコピー数を、ポジティブおよびネガティブセンスＲＳＶＭ遺伝子配列の両方に特異的であった逆転写－定量的ＰＣＲアッセイ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって定量した。凍結ＡＧＭＴＬ試料を、簡単に、３７℃の水浴中で解凍し、直ぐに氷上で保った。８００ｇ、４℃で５分間の遠心分離による清澄化後、ＴＬ試料中の総ＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ｃＤＮＡを、ランダム六量体プライマーを用いるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍＲＴキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する逆転写によって作製し、Ｍ特異的ｑＰＣＲによって分析した。比較のために、標準曲線を、同じｑＰＣＲアッセイによって分析されたｗｔＲＳＶＡ２株（ＬＩＤ）の全長ゲノムをコードするＤＮＡプラスミドを使用して作製した。ＴＬ試料における逆転写されたＲＳＶＲＮＡのコピー数を、標準曲線から内挿した。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン８、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡを使用して行った。

解離－増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）を使用するＩｇＡ抗体の検出。血清および粘膜ＩｇＡを、ＤＥＬＦＩＡイムノアッセイによって検出した。簡潔には、組換えＲＳＶＤＳ－Ｃａｖ１Ｆタンパク質を、以前に記載されたようにして、ＨＥＫ２９３細胞において発現させ、精製した（McLellan et al. 2013. Structure-based design of a fusion glycoprotein vaccine for respiratory syncytial virus. Science 342:592-8）。９６ウェルＤＥＬＦＩＡ黄色プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）を、１００ｎｇ／ウェルの１００μｌの炭酸塩－重炭酸塩緩衝液（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭＯ）に希釈された精製ＲＳＶＤＳ－Ｃａｖ１Ｆタンパク質でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。アッセイにおけるすべての洗浄は、２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１×ＤＥＬＦＩＡ洗浄濃縮液、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）で１回行った。終夜の抗原コーティング後、プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（０．１％のＴｗｅｅｎ－２０および３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ブロッキング溶液での４倍希釈系列の血清試料１００μｌを添加し、４℃で終夜インキュベートした。洗浄後、ブロッキング溶液に１：５０００希釈された１００μｌ／ウェルの抗サルＩｇＡビオチンコンジュゲート（ＡｌｐｈａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ、ＳａｎＡｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に１：２０００希釈された１００μｌ／ウェルのユーロピウム（Ｅｕ）コンジュゲートストレプトアビジンを添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ強化溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）とともに、穏やかに振とうしながら、室温で２０分間インキュベートした。蛍光を、ＳｙｎｅｒｇｙＮｅｏ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）においてＥｕ特異的時間分解蛍光（ＴＲＦ）プログラム（３４０ｎｍ励起、６１５ｎｍ放射）を使用して測定した。ブロッキング溶液を使用して、ブランク値を生成し、２４のブランク値の平均プラス３標準偏差を、カットオフとして使用した（４００蛍光単位に対応する）。４００蛍光単位に対応する試験試料希釈物を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡ）を使用してシグモイド標準曲線から内挿し、ｌｏｇ_２値として表した。

記載される方法または組成物の正確な詳細は、記載される実施形態の精神から逸脱することなく変更または改変されてもよいことは明らかである。本発明者らは、下記の特許請求の範囲の範囲および精神内にあるすべてそのような改変および変形形態を主張する。

Claims

対象におけるＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、有効量のプライム－ブースト免疫を前記対象に投与することを含み、
前記プライムが、ＲＳＶ ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルス、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルス、またはＲＳＶ２７６ウイルスの鼻腔内投与を含み、
前記ブーストが、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルス、またはＢ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルスの鼻腔内投与を含む、
方法。
前記対象が、５歳またはそれよりも若く、前記プライムおよびブーストが、約５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ～約６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量で前記対象に鼻腔内投与される、請求項１に記載の方法。
組換えヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であって、
（Ａ）それぞれ、遺伝子位置１～９に位置するＲＳＶＦ、Ｇ、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２、およびＬ遺伝子を含むゲノムであって、遺伝子位置１および２に位置する前記ＦおよびＧ遺伝子が、それぞれ、ネイティブ遺伝子位置８および７から移動しており、前記ゲノムが、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含み、前記組換えＲＳＶが、感染性で、弱毒化され、自己複製性である、ゲノム、または
（Ｂ）ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含むゲノムであって、前記欠失が、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置９９～６２７の欠失であり、前記組換えＲＳＶが、感染性で、弱毒化され、自己複製性である、ゲノム
を含む、組換えヒト呼吸器合胞体ウイルス。
（Ａ）前記ＳＨ遺伝子が、配列番号１に示される前記参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される前記参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含み、または
（Ｂ）前記組換えＲＳＶの前記ゲノムが、配列番号１に示される前記参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、および配列番号１に示される前記参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含むＳＨ遺伝子を含む、
請求項３に記載の組換えＲＳＶ。
（Ａ）ＮＳ１タンパク質をコードする配列の前記欠失が、配列番号１に示される前記参照ＲＳＶ配列に対応する位置９９～６２７の欠失を含む、
請求項３または請求項４に記載の組換えＲＳＶ。
前記Ｌ遺伝子が、ＴＣＡコドンによってコードされるＳ１３１３残基およびＡＡＡコドンによってコードされるＹ１３１４Ｋ置換を含むＬタンパク質をコードし、前記アミノ酸位置が、配列番号１３に示される参照Ｌタンパク質配列に対応する、請求項３～５のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ。
前記Ｌ遺伝子が、Ｓ１３１３の欠失およびＩ１３１４Ｌ置換を含むＬタンパク質をコードし、前記アミノ酸位置が、配列番号１３に示される前記参照Ｌタンパク質配列に対応する、請求項３～５のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ。
前記Ｆタンパク質をコードする核酸配列が、配列番号１４（ＦＷＴ）または配列番号１５（ＦＢＢ）を含む、請求項３～７のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ。
前記ゲノムが、任意の異種遺伝子を含まない、請求項３～８のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ。
前記ＮＳ１遺伝子の欠失の有りまたは無しでの、前記ＮＳ２遺伝子の欠失をさらに含む、請求項３～９のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ。
前記ゲノムが、配列番号２（ＬＩＤ／ΔＮＳ１）、配列番号３（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１）、配列番号４（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１）、配列番号６（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）、配列番号７（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）、配列番号９（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）、または配列番号１０（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）と少なくとも９９％同一であるアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む、請求項３に記載の組換えＲＳＶ。
前記ゲノムが、配列番号２（ＬＩＤ／ΔＮＳ１）、配列番号３（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１）、配列番号４（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１）、配列番号６（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）、配列番号７（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／１０３０ｓ）、配列番号９（ＬＩＤ／Ｆ１Ｇ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）、または配列番号１０（ＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌ）に示されるアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む、請求項１１に記載の組換えＲＳＶ。
請求項３～１２のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶのゲノムのヌクレオチド配列、または前記ＲＳＶゲノムのアンチゲノムｃＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を含む核酸分子。
請求項１３に記載の核酸分子を含むベクター。
請求項１３または請求項１４に記載の核酸分子またはベクターを含む細胞。
組換えＲＳＶを産生する方法であって、
請求項１４に記載のベクターを許容細胞培養物にトランスフェクトすること、
ウイルス複製を可能にするのに十分な時間、前記細胞培養物をインキュベートすること、および
複製された組換えＲＳＶを精製すること
を含む、方法。
請求項１６に記載の方法によって産生された組換えＲＳＶ。
請求項３～１２または１７のいずれかに記載の組換えＲＳＶを含む免疫原性組成物。
対象におけるＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、有効量の請求項３～１２または１７のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶを前記対象に投与することを含む、方法。
前記有効量が、プライム－ブースト投与を含み、
前記プライムが、前記組換えＲＳＶの投与を含み、
前記ブーストが、ＲＳＶ２７６ウイルス、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス、またはＢ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルスの異種ウイルスの投与を含む、
請求項１９に記載の方法。
前記ＲＳＶ２７６ウイルスが、配列番号１２に示されるアンチゲノム配列を含み、
前記Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルスが、配列番号１６に示されるアンチゲノム配列を含み、
前記Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルスが、配列番号１７に示されるアンチゲノム配列を含む、
請求項２０に記載の方法。
対象におけるＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、有効量の免疫原を前記対象に投与することを含み、前記有効量を投与することが、プライム－ブースト投与を含み、
前記プライムが、ＲＳＶ ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルス、ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１ウイルス、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルス、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルス、ＲＳＶＤ４６／ＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩウイルス、またはＲＳＶ２７６ウイルスの生弱毒化ＲＳＶウイルスの投与を含み；
前記ブーストが、ＲＳＶ２７６ウイルス、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルス、またはＢ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルスの投与を含み、
前記プライムおよび前記ブーストの投与が、両方ともＲＳＶ２７６ウイルスではない、
方法。
前記プライムが、ＲＳＶ ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルス、ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルス、またはＲＳＶ２７６ウイルスの鼻腔内投与を含み、
前記ブーストが、Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルスまたはＢ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルスの鼻腔内投与を含む、
請求項２２に記載の方法。
前記ＲＳＶ２７６ウイルスが、配列番号１２に示されるアンチゲノム配列を含み、
前記Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１／Ｂ３ＴＭＣＴウイルスが、配列番号１７に示されるアンチゲノム配列を含み、
前記Ｂ／ＨＰＩＶ３ＤＳ－Ｃａｖ１ウイルスが、配列番号１６に示されるアンチゲノム配列を含み、
前記ＲＳＶＬＩＤ／Ｆ１ＢＢＧ２／ΔＮＳ１ウイルスが、配列番号４に示されるアンチゲノム配列を含み、
前記ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ１ウイルスが、配列番号２に示されるアンチゲノム配列を含み、
前記ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／１０３０ｓウイルスが、配列番号１８に示されるアンチゲノム配列を含み、
ＲＳＶＬＩＤ／ΔＮＳ２／Δ１３１３／Ｉ１３１４Ｌウイルスが、配列番号１９に示されるアンチゲノム配列を含み、
ＲＳＶＤ４６／ΔＮＳ２／Ｎ／ΔＭ２－２－ＨｉｎｄＩＩＩウイルスが、配列番号１１に示されるアンチゲノム配列を含む、
請求項２２または請求項２３に記載の方法。
前記対象が、ヒトである、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
ヒト対象におけるＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の欠失を含むゲノムを含む有効量の組換えヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を投与することを含み、前記組換えＲＳＶが、感染性で、弱毒化され、自己複製性である、方法。
前記組換えＲＳＶの前記ゲノムが、配列番号１に示される参照ＲＳＶ配列に対応する位置４４９９～４６１０の欠失、ならびに配列番号１に示される前記参照ＲＳＶ配列に対応するＣ４４８９Ｔ、Ｃ４４９２Ｔ、Ａ４４９５Ｔ、Ａ４４９７Ｇ、およびＧ４４９８Ａ置換を含むＳＨ遺伝子を含む、請求項２６に記載の方法。
ＮＳ１タンパク質をコードする配列の前記欠失が、配列番号１に示される前記参照ＲＳＶ配列に対応する位置９９～６２７の欠失である、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
前記組換えＲＳＶの前記ゲノムが、配列番号２（ＬＩＤ／ΔＮＳ１）と少なくとも９９％同一であるアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えＲＳＶの前記ゲノムが、配列番号２（ＬＩＤ／ΔＮＳ１）に示されるアンチゲノム配列に相補的な核酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
前記組換えＲＳＶが、鼻腔内投与される、請求項１９～３０のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えＲＳＶが、注射、エアロゾル送達、鼻スプレー、または点鼻薬を介して投与される、請求項１９～３１のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、５歳またはそれよりも若い、請求項１９～３２のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、２歳またはそれよりも若い、請求項３３に記載の方法。
前記対象が、１～６か月齢である、請求項３４に記載の方法。
前記対象が、ＲＳＶに関して血清陰性である、請求項１９～３５のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、ＲＳＶに関して血清陽性である、請求項１９～３５のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えＲＳＶが、３．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ～７．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量で前記対象に鼻腔内投与される、請求項１９～３７のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えＲＳＶが、約５．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ～約６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量で前記対象に鼻腔内投与される、請求項３８に記載の方法。
前記組換えＲＳＶが、約６．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量で前記対象に鼻腔内投与される、請求項３９に記載の方法。
前記組換えＲＳＶが、３．０ｌｏｇ_１０～７．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵの用量で５歳またはそれよりも若いＲＳＶ血清陽性ヒト対象に鼻腔内投与される、請求項３８に記載の方法。
前記対象が、２歳またはそれよりも若いＲＳＶ血清陽性ヒト対象である、請求項４１に記載の方法。
前記免疫応答が、防御免疫応答である、請求項１９～４２のいずれか一項に記載の方法。
投与後最初の１か月以内に、前記対象が、呼吸器／熱性疾病を示さないか、または前記ウイルスを受けていなかった同等の対象のものと同等の種類および重症度の、軽度（グレード１）の呼吸器／熱性疾病を示す、請求項１９～４３のいずれか一項に記載の方法。
投与後最初の２週間の間に採取された鼻洗浄液における前記組換えＲＳＶの力価が、３．０ｌｏｇ_１０ＰＦＵ／ｍｌ鼻洗浄液またはそれ未満である、請求項１９～４４のいずれか一項に記載の方法。
前記組換えＲＳＶの投与が、レシピエントの≧７５％において血清ＲＳＶ特異的抗体の増加を誘発する、請求項１９～４５のいずれか一項に記載の方法。
対象におけるＲＳＶに対する免疫応答を誘発するための、請求項３～１２または１７のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶの使用。