CN116847881A

CN116847881A - 经改良的冠状病毒疫苗

Info

Publication number: CN116847881A
Application number: CN202280005924.3A
Authority: CN
Inventors: 翁启惠; 马彻; 黄菡颐
Original assignee: Zhou Meiyin
Current assignee: Zhou Meiyin
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2022-04-12
Publication date: 2023-10-03

Abstract

本发明提供一种经糖工程改造的SARS‑CoV‑2刺突蛋白，其相对于SARS‑CoV‑2及其变异体的天然刺突蛋白，能够引发增强的免疫应答。所述经糖工程改造的刺突蛋白暴露糖基化位点且同时保持所述刺突蛋白的三级结构。因此，本发明提供用于更好地预防及治疗新出现的冠状病毒感染的经改良的免疫原、疫苗及方法。

Description

经改良的冠状病毒疫苗

技术领域

背景技术

自报导第一个病例以来，Covid-19的爆发已在全世界引起超过三百万例死亡。当前若干针对SARS-CoV-2感染的COVID-19疫苗正在开发中，处于临床试验阶段，且已授权一些疫苗供人类使用。尽管许多经批准的疫苗展现出高功效，但SARS-CoV-2的基因变异体已出现且在整个COVID-19大流行中在全世界传播。

因此，迫切需要经改良的COVID-19疫苗以更好地预防新出现的冠状病毒感染及/或降低危及生命的冠状病毒感染的严重程度。

发明内容

SARS-CoV-2的刺突蛋白广泛糖基化。本发明基于如下认识：与SARS-CoV-2或其变异体的天然刺突蛋白相比，用经修饰的缺乏聚糖遮蔽或较少地被聚糖遮蔽的SARS-CoV-2刺突蛋白进行免疫接种诱发增强的针对SARS-CoV-2及其引发关切的病毒变体(例如Alpha、Gamma、Delta及Omicron)的免疫应答。依据全球共享流感数据倡议组织(GISAID)的超过六百万个S蛋白序列的比对，可鉴别位于受体结合域(receptor-binding domain,RBD)及包括七肽重复2域(heptad repeat 2,HR2)的S蛋白质第二次单元(S2)中的12个高度保守抗原表位(SEQ ID:1-12)。藉由N-聚糖修整来移除聚糖遮蔽以更好地暴露此等高度保守抗原表位提供一种研发针对SARS-CoV-2及变异体的广效保护性疫苗的有效方法。刺突蛋白的N-聚糖修整可藉由活体外糖工程改造来实现。藉此，经糖工程改造的刺突蛋白暴露经聚糖覆盖的高度保守抗原表位，且同时保持刺突蛋白的三级结构。因此，本发明提供用于更好地预防及治疗新出现的冠状病毒(例如SARS-CoV-2)感染的经改良的免疫原、疫苗及方法。

因此，本发明提供一种免疫原，其包含经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白，所述经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白包含复数个截短N-聚糖及未经修饰的O-聚糖(例如O连接的寡糖)。在一些实施例中，复数个截短N-聚糖位于受体结合域(RBD)中，藉此暴露具有以下胺基酸序列的复数个高度保守抗原表位：TESIVRFPNITNL(SEQ ID NO.:41)、NITNLCPFGEVFNATR(SEQ ID NO:42)、LYNSASFSTFK(SEQ ID NO:43)、LDSKVGGNYN(SEQ IDNO:44)、KSNLKPFERDIST(SEQ ID NO:45)、KPFERDISTEIYQAG(SEQ ID NO:46)及/或GPKKSTNLVKNKC(SEQ ID NO:47)。在一些实施例中，复数个截短N-聚糖位于七肽重复2(HR2)域中，藉此暴露具有以下胺基酸序列的复数个高度保守抗原表位：NCDVVIGIVNNTVY(SEQ IDNO:48)、PELDSFKEELDKYFKNHTS(SEQ ID NO:49)、VNIQKEIDRLNEVA(SEQ ID NO:50)、NLNESLIDLQ(SEQ ID NO:51)及/或LGKYEQYIKWP(SEQ ID NO:52)。

在一些实施例中，复数个截短N-聚糖位于受体结合域(RBD)及七肽重复2(HR2)域中，藉此暴露具有以下胺基酸序列的复数个高度保守抗原表位：TESIVRFPNITNL(SEQ IDNO.:41)、NITNLCPFGEVFNATR(SEQ ID NO:42)、LYNSASFSTFK(SEQ ID NO:43)、LDSKVGGNYN(SEQ ID NO:44)、KSNLKPFERDIST(SEQ ID NO:45)、KPFERDISTEIYQAG(SEQ ID NO:46)、GPKKSTNLVKNKC(SEQ ID NO:47)、NCDVVIGIVNNTVY(SEQ ID NO:48)、PELDSFKEELDKYFKNHTS(SEQ ID NO:49)、VNIQKEIDRLNEVA(SEQ ID NO:50)、NLNESLIDLQ(SEQ ID NO:51)及/或LGKYEQYIKWP(SEQ ID NO:52)。

本文所述的经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白包含SEQ ID NO:1的胺基酸序列或与SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少90％序列一致性的其变异体或所述胺基酸序列或所述变异体的免疫活性片段组成。

在一些实施例中，经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白包含由SEQ ID NO:1的胺基酸序列组成的多肽，其中所述多肽由22个截短N-聚糖组成，各截短N-聚糖具有GlcNAc部分。

在一些实施例中，经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白包含由SEQ ID NO:2的胺基酸序列组成的多肽，其中所述多肽由21个截短N-聚糖组成，各截短N-聚糖具有GlcNAc部分。

在一些实施例中，截短N-聚糖为单糖、双糖或三糖。在一些实施例中，截短N-聚糖为单糖。在较佳实施例中，单糖为N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。

在较佳实施例中，本文所述的截短N-聚糖实质上为均质的。术语“均质”意指由一种期望的聚糖物种表示的糖基化模式。本文所用的术语“实质上均质”意指组合物中存在至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的糖蛋白由一种预期的糖形(例如经GlcNAc修饰)表示，并伴随存在痕量的非预期的糖形。“痕量”意指糖蛋白组合物中存在的任何既定非预期糖形以小于总糖蛋白的5％、较佳小于4％、小于3％、小于2％、小于1％及甚至小于0.5％或甚至小于0.1％的量存在。

如本文所述，术语“刺突蛋白”及“刺突糖蛋白”及“冠状病毒刺突蛋白”可互换使用。本文所述的经糖工程改造的刺突蛋白可自天然冠状病毒刺突蛋白藉由糖工程改造(例如：活体外或活体内的糖工程改造)而产生。在一些实施例中，经糖工程改造的刺突蛋白是使用一或多种化学或酵素方法产生。在一些实施例中，经糖工程改造的刺突蛋白是使用内切糖苷酶H(Endo H)产生。

在一些实施例中，本文所述的天然冠状病毒刺突蛋白为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SAR-CoV-2)或其变异体的刺突蛋白。本文所述的SARS-CoV-2的变异体包括但不限于D614G、Alpha(B.1.1.7及Q谱系)、Beta(B.1.351及后代谱系)、Gamma(P.1及后代谱系)、Epsilon(B.1.427及B.1.429)、Eta(B.1.525)、Iota(B.1.526)、Kappa(B.1.617.1)、1.617.3、Mu(B.1.621、B.1.621.1)、Zeta(P.2)、Delta(B.1.617.2及AY谱系)及Omicron(B.1.1.529及BA谱系)。在一些实施例中，天然冠状病毒刺突蛋白为蝙蝠冠状病毒RaTG13或其变异体的刺突蛋白。

如本文所述，术语“天然冠状病毒刺突蛋白”、“天然冠状病毒刺突糖蛋白”、“天然刺突糖蛋白”及“天然刺突蛋白”是可互换的。

在一些实施例中，本文所述的经糖工程改造的刺突蛋白呈三聚体(例如溶液中的三聚体)形式存在。本文所述的经糖工程改造的刺突蛋白可保留与其天然冠状病毒刺突蛋白相同的三级结构。

如本文所述，经糖工程改造的刺突蛋白能够引发相对于其天然冠状病毒刺突蛋白增强的免疫应答。增强的免疫应答为增加的IgG效价、增加的IgM效价、增加的CD4 T细胞反应、增加的CD8 T细胞反应、增加的中和效价或其组合。

在另一态样中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：(a)本发明的免疫原，及(b)视情况选用的佐剂。

如本文所述，佐剂可包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant，IFA)、角鲨烯、明矾、铝胶、MF59、QS-21、CpG 1018、AS03、AS37、Matrix-M或其组合。

本文所述的冠状病毒可包括SARS-CoV-2及其变异体，且可包括蝙蝠冠状病毒RaTG13或其变异体。在较佳实施例中，冠状病毒感染由SARS-CoV-2及其变异体引起。

如本文所述，相对于使用其天然SAR-CoV-2刺突蛋白的疫苗，免疫原性组合物能够引发增强的免疫应答，藉此用作针对由SAR-CoV-2或其变异体引起的冠状病毒感染的经改良的COVID-19疫苗。

在另一态样中，本发明提供一种用于在有需要的个体中引发针对SARS-CoV-2或变异体的免疫应答的方法，其包含向所述个体投与有效量的本发明的免疫原性组合物。

在另一态样中，本发明提供一种用于保护有需要的个体避免感染SARS-CoV-2或变异体的方法，其包含向所述个体投与有效量的本发明的免疫原性组合物。

在另一态样中，本发明提供一种用于预防有需要的个体感染COVID-19疾病的方法，所述方法包含向所述个体投与有效量的本发明的免疫原性组合物。

在另一态样中，本发明提供本发明的免疫原性组合物的用途，其用于在有需要的个体中引发针对SARS-CoV-2的免疫应答。

在另一态样中，本发明提供本发明的免疫原性组合物的用途，其用于保护有需要的个体避免感染SARS-CoV-2。

在另一态样中，本发明提供本发明的免疫原性组合物的用途，其用于预防有需要的个体感染COVID-19疾病。

此等及其他态样由以下较佳实施例的描述结合以下附图而将变得显而易见，但其中可进行变化及修改而不背离本发明的新颖构思的精神及范畴。。

本发明详细描述于以下部分中。本发明的其他特征、目的及优点可轻易在本发明的详细描述及申请专利范围中发现。

附图说明

以下图式形成本说明书的一部分且包括在内以进一步展示本发明的某些态样，其中可藉由参考此等图式中的一或多者且结合本文中呈现的特定实施例的详细描述更好地理解本发明。

图1(a)至(f).经糖工程改造的刺突蛋白与单GlcNAc装饰(S_MG)的蛋白疫苗的设计及表征。(a)重组SARS-CoV-2刺突糖蛋白构筑体的示意图。蛋白结构域图示为N端域(NTD)、受体结合域(RBD)、融合肽(FP)、七肽重复1(HR1)、七肽重复2(HR2)、中心螺旋(CH)及连接域(CD)。可溶性刺突蛋白的C端与折迭子序列及His标签(His6)连接。弗林蛋白酶切割位点经GSAG残基取代且两个脯胺酸突变(K986P及V987P)将刺突蛋白固定在融合前状态。N连接的糖基化序列子(N-X-S/T，其中X≠P)的位置展示为分支(N，Asn；X，任何残基；S，Ser；T，Thr；P，Pro)。井号位点(#)表示凝血酶切割位点。(b)单GlcNAc装饰的刺突蛋白疫苗产生的示意性概述。S_HM，具有高甘露糖类型N-聚糖的刺突蛋白；S_MG，在其N-糖基化位点处具有GlcNAc的刺突蛋白。(c)经纯化的S_MG的尺寸排阻色谱法(size-exclusion chromatography)。黑色曲线表示S_MG且灰色曲线展示蛋白质分子量标记物。(d)S_FG(具有典型复合型N-聚糖的刺突蛋白)、S_HM及S_MG的SDS-PAGE分析。(e)S_MG的结构模型。藉由使用Wincootm添加聚糖，利用蛋白质数据库(PDB)ID代码7CN9建立模型，且用程序ChimeraX显示。(f)S_FG及S_MG的N-聚糖组合物的质谱分析。

图2(A)至(S).S_MG疫苗接种增强活体内对SARS-CoV-2感染的预防。(A)展示叙利亚仓鼠(Syrian hamster)的免疫接种时程。S_FG(蓝色)、S_MG(红色)及对照(灰色)。(B)在叙利亚仓鼠中在WT SARS-CoV-2攻击的后量测体重变化。(C)展示经攻击的仓鼠的肺病毒效价。虚线指示侦测下限。(D)展示来自受感染仓鼠(3dpi)的肺的病理组织学、免疫组织化学及免疫荧光的代表性图像。第一列：苏木精及伊红(H&E)染色；比例尺，50μm。第二列：免疫组织化学(IHC)染色；比例尺，50μm。第三列：免疫荧光(IF)染色；比例尺，100μm。SARS-CoV-2N特异性多株抗体用于侦测病毒，在IHC中呈棕色点且在IF染色中呈绿色点。蓝色：4,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。(E)展示CAG-hACE2或K18-hACE2转殖基因小鼠的免疫接种时程。(F至I)展示自经免疫接种的CAG-hACE2转殖基因小鼠(n＝7)收集的血清样品的抗S IgG效价(F)、SARS-CoV-2WT微量中和效价(G)及亚型IgG分析，包括IgG1、IgG2c(H)及IgG2c:IgG1比率(I)。(J)展示受感染小鼠肺部(7dpi)的代表性病理组织学、免疫组织化学及免疫荧光。比例尺与(D)中相同。(K)受感染CAG-hACE2小鼠(n＝3)的肺病毒效价。虚线指示侦测下限。(L及M)展示经WT-SARS-CoV-2攻击的CAG-hACE2转殖基因小鼠(n＝4)的体重变化(L)及存活分析(M)。(N及O)展示经SARS-CoV-2Alpha变异体攻击的CAG-hACE2转殖基因小鼠(n＝5)的体重变化(N)及存活分析(O)。(P及Q)展示经SARS-CoV-2Gamma变异体攻击的CAG-hACE2转殖基因小鼠(n＝5)的体重变化(P)及存活分析(Q)。(R及S)展示经SARS-CoV-2Delta变异体攻击的K18-hACE2转殖基因小鼠(n＝4)的体重变化(R)及存活分析(S)。数据展示为平均值±SEM且藉由双侧曼-惠特尼U检验(two-sided Mann-Whitney U test)进行分析以比较两个实验组。ns，不显着；*P<0.05。

图3.S_MG疫苗接种在转殖基因hACE2小鼠中提供更好的对致死剂量SARS-CoV-2感染的预防。(a)转殖基因小鼠的免疫接种及攻击时程。(b)对在初始疫苗接种的后28天及42天收集的血清检查抗刺突蛋白特异性IgG。(c)藉由CPE分析对在初始疫苗接种的后42天收集的血清检查中和抗体效价。(d)在攻击的后转殖基因小鼠的体重变化(n＝3)。(e)在攻击的后的转殖基因小鼠存活率(n＝3)。数据为平均值±SEM(平均值的标准误差)。比较藉由t试验(Student's t-test)(未配对，双尾)进行。条柱上方的数值指示相对于S_FG疫苗由S_MG疫苗引发的抗体的结合及中和的增加倍数。蓝色正方形，经S_FG免疫接种的转殖基因小鼠；红色三角形，经S_MG免疫接种的转殖基因小鼠；灰色点，对照组动物(仅明矾组)。

图4.小鼠中由S_MG疫苗诱发的抗体增强针对SARS-CoV-2变异体的结合及中和的广度及效力。(a)示出SARS-CoV-2刺突蛋白结构的示意性图标及在此研究中使用的变异体的突变图谱。RBD，受体结合域。在突变图中，点(.)指示所述位置中与野生型相同的胺基酸且短划线(-)指示缺失。(b)藉由ELISA来测定SARS-CoV-2特异性IgG抗体效价。条柱上方的数值指示相对于S_FG疫苗由S_MG疫苗引发的抗体的结合的增加倍数。(c)展示SARS-CoV-2变异体假病毒中和曲线。(d)绘制实现SARS-CoV-2变异体50％假病毒中和(pNT50)的效价。条柱上方的数值指示相对于S_FG疫苗由S_MG疫苗引发的抗体的中和的增加倍数。(e)展示感染性SARS-CoV-2变异体中和曲线，其藉由蚀斑减少中和测试(PRNT)测定。(f)绘制实现SARS-CoV-2变异体50％中和(PRNT50)的效价。数据为平均值±SEM(平均值的标准误差)。藉由非线性回归，使用GraphPrism 9.0拟合曲线，且藉由多重t-试验(配对，双尾)进行比较。效价比较藉由t试验(Student's t-test)(未配对，双尾)进行。条柱上方的数值指示相对于S_FG疫苗由S_MG疫苗引发的抗体的中和的增加倍数。蓝色正方形，经S_FG免疫接种的转殖基因小鼠；红色三角形，经S_MG免疫接种的转殖基因小鼠；灰色点，对照组动物(PBS组)。

图5(A)至(G).S蛋白糖基化影响ACE2受体结合及SARS-CoV-2感染。(A至C)对来自BEAS-2B细胞(A)、HEK293T细胞(B)及未进行或进行Endo H分解的HEK293S(GnTIˉ)细胞(C)的以不同方式糖基化的S蛋白胞外域(S_FG，原始完全糖基化，蓝色；deS，未唾液酸化，淡蓝色；S_HM，高甘露糖，黄色；及S_MG，单GlcNAc装饰，红色)量测ACE2结合亲合力。三个技术重复实验的资料展示为平均值±SD，且针对EC50值，藉由非线性回归进行曲线拟合。(D)对相同输入量(0.3μg/ml p24同等物)的携带以不同方式糖基化的S蛋白的假病毒量测病毒感染性，着色相应地如(C)中。RLU，相对发光单位。六个技术重复实验的数据展示为平均值±SD且先后用一般单因子ANOVA检验及杜凯氏多重比较检验(Tukey's multiple comparisons test)进行分析。ns，不显着；****P<0.0001。(E)展示SARS-CoV-2S蛋白[野生型(WT)]的示意图，按区域着色，包括N端域(NTD；14-306；橙色)、受体结合域(RBD；319-541；红色)、两个亚域(SD1/2；542-685；黄色)、融合肽近端区(FPPR；816-856；绿色)、七肽重复1(HR1；912-984；蓝绿色)、连接域(CD；1063-1162；蓝色)、七肽重复2(HR2；1163-1211；紫色)及跨膜域(TM；1214-1234；白色)。N-聚糖(绘成分支)及O-聚糖(圆圈)位点用残基编号标记。上方展示S1及S2域。(F)展示携带野生型(WT)的S蛋白或移除所示各糖基化位点处的聚糖的突变体的假病毒的病毒效价，藉由p24定量归一化，且着色相应地如(E)中。(G)在五种表现hACE2的细胞株中测试的如(F)中的相同假病毒组的感染性。以三个独立实验的平均值±SD，针对WT值(被定义为100％，深灰色)归一化(F)及(G)中的值。

图6(A)至(E).S蛋白聚糖概况证明两种细胞株的差异且与序列保守相关。(A及B)展示自BEAS-2B肺上皮细胞(A)及HEK293T肾上皮细胞(B)表现的重组S蛋白的N-糖基化谱的比较。将聚糖分组且相应地着色：复合-S(唾液酸化复合型；深蓝色)、复合(未唾液酸化复合型；淡蓝色)、杂交-S(唾液酸化杂交型；深黄色)及杂交(非唾液酸化杂交型；淡黄色)、高甘露糖(绿色)及未占据(灰色)。以圆饼图展示各糖基化位点的各组百分比，且以直方图展示各糖形(第1至27号)的比例。条形图表示三个生物重复实验的平均值±SD。F杂交指示岩藻糖基化的杂交型聚糖。(C)在S胞外域的3D结构(自6VSB模型)上映像来自(A)及(B)的聚糖概况。如所标记，依据BEAS-2B(左)或HEK293T(右)资料的最高含量组别对聚糖着色(复合型，蓝色；杂交型，黄色；及高甘露糖，绿色)。用残基编号标记非复合型N-糖基化位点。(D)展示模型化S结构蛋白上相对表面可及性(relative surface accessibility,RSA)的映射，其中埋入的残基呈深黄色，遮蔽的聚糖呈黄色，且暴露的部分呈淡黄色。(E)展示模型化S蛋白结构上序列变异的映射，在热图中着色，其中较深红色表明较高突变率。其中更显示若干高度保守聚糖遮蔽区。(D)及(E)的更多细节可见于图S9及数据文件S1。

图7(A)至(S).在BALB/c小鼠中，与S_FG相比，S_MG疫苗接种引发更强体液免疫应答及细胞免疫应答。(A)展示S_FG及S_MG蛋白疫苗的结构模型(根据图2C)。蓝色：聚糖；灰色：蛋白质。S_FG为由HEK293E表现无进一步修饰的刺突蛋白。S_MG藉由酶分解以截断HEK293SGnTIˉ表现的S_HM的所有N-聚糖，形成单个GlcNAc来获得，而O-聚糖未经修饰。(B)在BALB/c小鼠(各实验中n＝5)中使用如(A)中的蛋白质作为免疫原的免疫接种时程。S_FG(蓝色)、S_HM(黄色)、S_MG(红色)及对照物(灰色)。明矾，氢氧化铝。(C)藉由ELISA分析血清样品的抗S蛋白IgG效价。(D)使用具有WT S蛋白的假病毒来量测血清样品的中和效价。(E至G)血清的IgG亚型分析，包括IgG1(E)、IgG2a(F)及IgG2a:IgG1比率(G)。(H至K)藉由流动式细胞测量术，BALB/c小鼠的淋巴结(LN)中活化非调节CD4 T细胞中的Tfh百分比(H)及表现IFN-γ(I)、IL-4(J)及IL-21(K)的Tfh细胞(CD4+CD19-CD44hiFoxp3-PD-1+CXCR5+)的百分比。(L)藉由流动式细胞测量术分析的BALB/c小鼠的LN中产生颗粒酶B的CD8+ T细胞(CD3+B220-CD8+CD49b-)的百分比。(M)展示脾中相对于荧光扣除对照(FMO)染色(无S蛋白下染色)(百分比)归一化的S蛋白特异性B细胞(CD3-CD19+S蛋白+)(百分比)的比率。(N)展示κ及λ轻链的使用。(O及P)B细胞库分析的重(O)及κ(P)链分布。小于5％的使用以白色展示。(Q至S)展示在三剂针对SARS-CoV-2WT(或D614G)及变异体的所指示疫苗的后自BALB/c小鼠分离的血清的抗S蛋白IgG效价(Q)、假病毒中和效价(R)及可靠病毒中和效价(S)(各条柱上方的数值指示与S_FG组相比S_MG的增加倍数)。pNT50表示实现50％中和的稀释倒数。条形图中的点线表示侦测下限。数据展示为平均值±SEM且藉由双侧曼-惠特尼U检验分析以比较两个实验组，(N)除外，其中五种样品汇集在一起且使用卡方检验。P值展示在各条柱上方。*P<0.05；**P<0.01。

图8(A)至(L).藉由S_MG疫苗接种引发的抗体m31A7的功能、预防性及结构表征指示交叉中和能力。(A)m31A7对S1、S2、RBD或整个S胞外域的ELISA结合。(B)m31A7与表现SARS-CoV-2WT及变异体的S蛋白的HEK293T细胞的结合的流动式细胞测量术分析。(C)m31A7针对携带WT或变异S蛋白的假病毒的中和活性。(A)、(B)及(C)的三个技术重复实验的资料展示为平均值±SD，且针对EC50值，藉由非线性回归进行曲线拟合。(D)展示K18-hACE2转殖基因小鼠(n＝3)的抗体注射及攻击时程。(E及F)展示用m31A7或PBS处理的小鼠的体重变化(E)及体温变化(F)。数据呈现为平均值±SEM。(G)呈现m31A7 IgG及Fab与S蛋白的结合动力学，其中解离常数(Kd)展示在上方。(H)以时程展示藉由m31A7的HDX-MS进行的抗原表位定位，揭露两种候选肽419-433及471-482，其中在15秒ΔHDX大于10％。数据展示为平均值±SD且在各时间点藉由多个t检验分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。(I)展示符合m31A7-Fab/S蛋白复合物结构的cryo-EM图。重链，深绿色；轻链，淡绿色；RBD，红色；NTD，橙色；S1其余部分，淡灰色；S2，深灰色；及N-聚糖，蓝色。(J)展示RBD-m31A7界面的放大视图。星号标记m31A7轻链与N165-聚糖的间的附近区域。(K)先前报导的mAb S2E12(洋红色)、COV253(粉色)及B1-182.1(淡蓝色)(PDB 7BEN、7K4N及7MLZ)重迭至m31A7结合的RBD(灰色)上。已显示受体结合模体及RBD尖端。(L)RBD(灰色)上COV253(粉色)及m31A7(绿色)的占据面积比较显示相似性，其中引发关切的病毒变体(VOC)的残基经标记且绘制为红色球体。

图9(A)至(C).Delta S_MG疫苗接种引发更多的针对SARS-CoV-2变异假病毒的中和抗体。(A)疫苗接种的流程。在第0周及第2周用Delta S_FG或S_MG疫苗对BALB/c小鼠(n＝5)进行免疫接种。在第6周收集血清且随后使用假病毒分析测试中和能力。(B)针对SARS-CoV-2变异假病毒，其中包括野生型(WH01)及引发关切的病毒变体(VOC)(包括Alpha、Beta、Gamma、Delta及Omicron的变异株)，血清的50％中和效价倒数(50percent reciprocalneutralization titer,pNT50)。资料展示为平均值(在各条柱上方指示)±SEM且藉由双侧曼-惠特尼U检验分析以比较两个实验组。*P<0.05。(C)藉由以不同方式稀释的血清提供的SARS-CoV-2变异假病毒细胞感染的抑制(％)。数据展示为平均值±SEM且曲线藉由非线性回归使用Graph Prism 9.0拟合。

图10(A)及(B).Delta或WT S_MG疫苗接种引发更多的针对SARS-CoV-2Omicron变异假病毒的中和抗体。(A)疫苗接种的流程。在第0周及第2周用Delta/WT S_FG或S_MG疫苗对BALB/c小鼠(n＝5)进行免疫接种。在第6周收集血清且随后使用假病毒分析测试中和能力。(B)藉由以不同方式稀释的血清提供的SARS-CoV-2变异假病毒细胞感染的抑制(％)。数据展示为平均值±SEM且曲线藉由非线性回归使用Graph Prism 9.0拟合。

图11(A)至(C).Delta S_MG蛋白可呈溶液或呈粉末储存于室温下。(A及B)具有两种胺基酸(pbs-aa)、50mM L-精胺酸及50mM L-麸胺酸的磷酸盐缓冲盐水添加剂中Delta S_MG蛋白经0.22μm过滤器过滤且储存于室温(RT)或4℃下。在包括3天、7天、14天、21天及3个月的不同时间点收集蛋白质。将所收集的样品与5X SDS-PAGE装载染料混合，在100℃下加热5分钟且储存于4℃下，直至跑胶。(C)在不同缓冲液及冻干条件中的Delta S_MG蛋白储存测试。针对在4℃下储存Delta S_HM或S_MG(前3个泳道)，测试有或无50mM L-精胺酸及50mM L-麸胺酸的PBS。测试在有或无赋形剂下冻干的Delta S_MG且在室温下储存超过2周(后2个泳道)。

图12展示SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域(RBD)中存在的高度保守抗原表位(E1、E2、E3、E4、E5、E6及E7)的示意图，所述刺突蛋白含有N端域(NTD)、受体结合域(RBD)、融合肽(FP)、七肽重复序列1(HR1)、七肽重复序列2(HR2)、跨膜域(TM)、细胞质域(CD)及S2次单元。

图13展示SARS-CoV-2刺突蛋白的七肽重复序列2(HR2)中存在的高度保守抗原表位(E8、E9、E10、E11、E12)的示意图。

具体实施方式

在本发明的实施例的以下详细描述中，参考附图，在附图中相同的组件符号指示相似的组件，且藉助于图示，展示可实践本发明的特定实施例。详细描述此等实施例到足以使熟习此项技术者能够实践本发明，且应理解，可利用其他实施例，且可在不脱离本发明的范畴的情况下作出其他改变。因此，不应在限制性意义上看待以下详细描述。

除非以下另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语均意欲具有与一般技术者通常所理解相同的含义。对本文中所采用的技术的提及意欲指代如在此项技术中通常理解的技术，包括熟习此项技术者将显而易见的对彼等技术的变化或等效技术或后来开发的技术的取代。另外，为更清晰且简明地描述本发明的主题，提供本说明书及所附申请专利范围中所使用的某些术语的以下定义。

除非上下文另外明确规定，否则如本文中及所附申请专利范围中所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述”包括复数个提及物。因此，举例而言，提及“蛋白质”可指一种蛋白质或此类蛋白质的混合物，且提及“所述方法”包括提及熟习此项技术者已知的同等步骤及/或方法等等。

如本文所用，术语“突变”是指病毒基因体(遗传密码)的单个变化。突变频繁发生，但仅有时会改变病毒特征。

如本文所用，术语“谱系”是指一组具有共同祖先的紧密相关病毒。SARS-CoV-2具有许多谱系；均引起COVID-19。

如本文所用，术语“变异体”是指可含有一或多个突变的病毒基因体(遗传密码)。在一些情况下，具有相似遗传变化的一组变异体，诸如谱系或一组谱系，可因可能需要公共卫生行动的共享属性及特征而被公共卫生组织称为引发关切的病毒变体(VOC)或值得注意的病毒变体(VOI)。

如本文所用，术语“佐剂”是指当与免疫原组合使用时加强或以其他方式改变或调节针对免疫原诱导的免疫应答的化合物。免疫应答的调节可包括加强或拓宽任一种或两种抗体的特异性及细胞免疫应答。

如本文所用，术语“约”或“大约”在位于数值的前时指示所述值加或减10％的范围。举例而言，“约100”涵盖90及110。

如本文所用，“免疫原性组合物”为一种包含抗原的组合物，其中向个体投与所述组合物引起个体中对所述抗原发展体液及/或细胞免疫应答。

如本文所述，术语“刺突蛋白”及“刺突糖蛋白”及“冠状病毒刺突蛋白”可互换使用。

本文所用的术语“实质上均质”意欲意谓组合物中存在的至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的糖蛋白由一种期望糖形(例如经单GlcNAc装饰)表示，组合物中存在痕量非期望糖形。“痕量”意欲糖蛋白组合物中存在的任何既定非期望糖形以小于总糖蛋白的5％、较佳小于4％、小于3％、小于2％、小于1％及甚至小于0.5％或甚至小于0.1％存在。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”及“治疗(reating)”是指一种获得有益或期望结果，例如临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或期望结果可包括抑制或遏制感染或疾病的起始或进展；改善感染或疾病的症状或减少其发展；或所述等结果的组合。

如本文所用，术语“预防(preventing)”及“预防(prevention)”可与“预防(prophylaxis)”互换使用，且可意谓完全预防感染，或预防感染症状的发展；延迟感染或其症状的发作；或降低随后发展的感染或其症状的严重程度。

如本文所用，“有效量”是指免疫原足以诱导免疫应答，减少病原体感染的至少一种症状的量。有效剂量或有效量可藉由例如用斑块中和、补体结合、酶联结免疫吸附剂(ELISA)或微量中和分析法量测中和分泌抗体及/或血清抗体的量来确定。

如本文所用，术语“疫苗”是指一种免疫原性组合物(有或无佐剂)，诸如来源于冠状病毒的免疫原，其用于诱导针对冠状病毒的免疫应答，提供保护性免疫(例如保护个体避免感染冠状病毒及/或降低由感染冠状病毒所引起的病状的严重程度的免疫性)。保护性免疫应答可包括形成抗体及/或细胞介导的反应。视上下文而定，术语“疫苗”亦可指向个体投与以产生保护性免疫的免疫原的悬浮液或溶液。

如本文所用，术语“个体”包括人类及其他动物。通常，个体为人类。举例而言，个体可为成人、少年、儿童(2岁至14岁)、婴儿(出生至2岁)或新生儿(至多2个月)。在特定态样中，个体至多4月龄或至多6月龄。在一些态样中，成人为约65岁以上或约60岁以上的老年人。在一些态样中，个体为孕妇或欲怀孕的女性。在其他态样中，个体不为人类；例如非人类灵长类动物；例如狒狒、黑猩猩、大猩猩或猕猴。在某些态样中，个体可为宠物，诸如狗或猫。

如本文所用，术语“医药学上可接受”意谓经美国联邦政府或州政府的监管机构批准或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出用于动物，且更具体用于人类。此等组合物可用作用于在脊椎动物中诱导保护性免疫应答的疫苗及/或抗原组合物。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是一种引起冠状病毒疾病2019(COVID-19)的正单链RNA包膜病毒。病毒粒子包括侵入宿主细胞所需的RNA遗传物质及结构蛋白。一旦在细胞内部，感染RNA用于编码构成病毒粒子的结构蛋白、引导病毒组装、转录、复制及宿主控制的非结构蛋白及功能尚未确定的辅助蛋白。SARS-CoV-2的结构蛋白包括包膜蛋白(E)、刺突蛋白或表面糖蛋白(S)、膜蛋白(M)及核衣壳蛋白(N)。在病毒粒子的外部发现刺突糖蛋白且其使冠状病毒呈王冠样外观。此糖蛋白介导病毒粒子的附接及进入宿主细胞。

藉由肺上皮细胞产生的S蛋白具有与感染性增加相关联的糖形。与完全糖基化的S蛋白相比，用N-聚糖修整为单GlcNAc装饰状态的S蛋白(S_MG)进行免疫接种引发针对引发关切的病毒变体(VOC)的更强免疫应答且更好地保护人类血管收缩素转化酶2(hACE2)转殖基因小鼠。另外，自经S_MG免疫接种的小鼠鉴别广泛中和单株抗体，其可以低于皮莫耳的效力中和野生型SARS-CoV-2及引发关切的病毒变体(VOC)。

本发明的经糖工程改造的刺突蛋白包含具有SEQ ID NO:1的胺基酸序列或与SEQID NO:1的胺基酸序列具有至少90％序列一致性的其变异体或所述胺基酸序列或所述变异体的免疫活性片段的多肽。下文展示SEQ ID NO:1的胺基酸序列。

SEQ ID NO:1

QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDIS

TEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCG

PKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE

ILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGS

NVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTM

SLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLL

QYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSK

PSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDE

MIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIAN

QFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILS

RLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKR

VDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFV

SNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELD

KYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY

在一个实施例中，本发明的经糖工程改造的刺突蛋白包含具有如以下SEQ ID NO:2中所示的胺基酸的多肽。

SEQ ID NO:2

如本文所述，SARS-CoV-2或其变异体的经糖工程改造的刺突蛋白可包括包含如下胺基酸序列的刺突蛋白：(i)与SEQ ID NO:1中所示的胺基酸序列实质上一致(例如与SEQID NO:1至少90％、95％或97％一致，诸如SEQ ID NO:2)；及(ii)由能够在至少中度严格条件下与编码本文所阐述的刺突蛋白的任何核酸序列杂交或能够在至少中度严格条件下与编码本文所阐述的刺突蛋白的任何核酸序列杂交但使用同义密码子(例如不具有一致核苷酸序列但编码一致胺基酸的密码子)的核酸序列编码。

对细胞特异性糖形分布的分析、序列保守、聚糖遮蔽及其相互相关性引起设计上移除实质上所有遮蔽的聚糖的S_MG疫苗。SARS-CoV-2S蛋白糖基化对病毒感染、蛋白质完整性及免疫应答具有重大影响。来自肺上皮细胞的S蛋白含有更多唾液酸化复合型聚糖以促进受体结合，且糖基化位点N801及N1194显示是S蛋白折迭及病毒感染所不可或缺的。此使得保守抗原表位更好地暴露于免疫系统，因此可针对病毒及变异体引发更有效且具有广泛保护性的B细胞及T细胞反应。

本发明的经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白靶向整个S蛋白胞外域，尤其由聚糖遮蔽的保守域，刺激RBD与非RBD中和抗体及对于交叉保护而言至关重要的CD8 T细胞反应的诱发。

在某些态样中，本发明提供一种包含如本文所述的免疫原的疫苗或医药组合物。本发明亦提供一种用于治疗或预防冠状病毒感染的方法，其中所述方法包含向有需要的个体(例如哺乳动物)投与有效量的如本文所述的免疫原、医药组合物或疫苗。

在一个实施例中，疫苗可包括佐剂。示例性佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝、不完全弗氏佐剂(IFA)、角鲨烯、明矾、铝胶、MF59、QS-21、CpG 1018、AS03、AS37、Matrix-M或其组合。

疫苗或医药组合物可使用任何适合的方法调配。可使用医药领域中的常规方法，用标准医药学上可接受的载剂及/或赋形剂进行调配。调配物的确切性质将视若干因素而定，包括待投与的疫苗及所需投与途径。适合类型的调配物充分描述于Remington'sPharmaceutical Sciences,第19版,Mack Publishing Company,Eastern Pennsylvania,USA中。

如本文所述的疫苗或医药组合物可藉由任何途径投与。此类方法包含例如非经肠，诸如经由注射至皮肤中或穿过皮肤的所有途径施用：例如肌肉内、静脉内、腹膜内、皮内、经黏膜、黏膜下层或皮下。此外，其可藉由以液滴、喷雾、凝胶或软膏形式局部施用至眼部、鼻、口、肛门或阴道的黏膜上皮，或局部施用至身体的任一部分处的外表皮上进行施用。其他可能的施用途径是经由呼吸道吸入来施用喷雾、气溶胶或散剂。或者，可经由消化道途径施用。疫苗组合物的有效量可视许多变数而定，包括(但不限于)物种、品种、体型、身高、体重、年龄、患者的整体健康状况、调配物的类型或投药模式或方式。适当有效量通常可由熟习此项技术者使用常规优化技术及行医者的知情判断及熟习此项技术者显而易见的其他因素确定。

在一个实施例中，组合物可包含额外治疗剂，诸如抗病毒剂。所提供的医药组合物适用于治疗冠状病毒感染。额外抗病毒剂的实例包括但不限于利巴韦林(ribavirin)、喷昔洛韦(penciclovir)、硝唑尼特(nitazoxanide)、萘莫司他(nafamostat)、氯奎宁(chloroquine)、瑞德西韦(remdesivir，GS-5734)及法匹拉韦(favipiravir，T-705)、干扰素(interferon)、阿德福韦(adefovir)、替诺福韦(tenofovir)、阿克洛韦(acyclovir)、布立夫定(brivudin)、西多福韦(cidofovir)、福米韦生(fomivirsen)、膦甲酸(foscarnet)、更昔洛韦(ganciclovir)、金刚胺(amantadine)、金刚烷乙胺(rimantadine)、扎那米韦(zanamivir)、瑞德西韦(remdesivir)、莫努拉韦(molnupiravir)及帕克洛维德(paxlovid)。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语均具有与一般技术者通常理解相同的含义。尽管与本文所述的彼等方法及材料类似或同等的方法及材料可用于实践或测试本发明，但下文描述适合方法及材料。本文中提及的所有公开案、专利申请案、专利及其他参考文献均以全文引用的方式并入本文中。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法及实例仅为说明性的且并不意欲为限制性的。

实例

实例1：基因构筑体

基于自GISAID数据库下载的基因序列设计SARS-CoV-2刺突蛋白序列。自全球全球共享流感数据倡议组织(Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，GISAID)数据库(版本：2021年4月18日)撷取所有可用SARS-CoV-2病毒株的总共1,117,474个S蛋白序列。

来自SARS-CoV-2及Delta变异体的刺突蛋白的DNA序列用针对人类细胞表现优化的密码子合成。弗林蛋白酶切割位点(furine cleavage site)替换为GSAG且为蛋白质设计2P替代物以停留在融合前状态。在刺突蛋白C端，跨膜域替换为凝血酶切割位点(thrombincleavage site)、折迭子(foldon)及组胺酸标签(histidine-tag)。将经修饰的HA序列选殖至pTT载体中以表现蛋白质及纯化。

实例2：SARS-CoV-2S蛋白表现及纯化

藉由使用转染试剂(聚伸乙基亚胺或FectoPRO)，将编码分泌的SARS-CoV-2刺突蛋白的质体转染至HEK293EBNA(ATCC编号CRL-10852)或HEK293S GnTIˉ细胞的人类胚胎肾细胞株中，且在补充有0.5％胎牛血清的Freestyle 293表现培养基(Invitrogen)中培养。在转染的后5天收集上清液且藉由离心清除。接着，刺突蛋白用镍螯合层析法纯化且藉由Millipore Amicon超滤器(100kDa)浓缩溶离部分，且装载至在基于tris的缓冲液(20mMtris/HCl、20mM NaCl、50mM麸胺酸、50mM精胺酸)中预平衡的superposeTM 6凝胶过滤管柱(10/300GL；GE)上，且收集对应三聚体部分。在室温下将经纯化的S_HM用Endo H(NEB)处理隔夜以产生在糖基化位点具有单个GlcNAc的刺突蛋白S_MG。对于EndoH移除，藉由缓冲液交换，使用Millipore Amicon超滤器(100kDa)进一步纯化S_MG。自PNAS中公开的实验室先前研究修改表现及纯化方法。

经聚糖工程改造的假病毒(图1D)的产生遵循先前研究(Y.Watanabe,J.D.Allen,D.Wrapp,J.S.McLellan,M.Crispin,Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2spike.Science 369,330-333(2020)；Q.Yang,T.A.Hughes,A.Kelkar,X.Yu,K.Cheng,S.Park,W.-C.Huang,J.F.Lovell,S.Neelamegham,Inhibition of SARS-CoV-2viralentry upon blocking N-and O-glycan elaboration.eLife 9,e61552(2020))。为产生糖基化位点特异性S突变假病毒(图1F)，将HEK293T细胞用在各糖基化位点携带突变的pVax-nCoV-SΔ19构筑体及表现荧光素酶的HIV-1基因体质体(pNL4-3.luc.RE)短暂转染。

实例3：S_MG蛋白表征

为表征SMG蛋白，使用在基于tris的缓冲液(20mM tris/HCl、20mM NaCl、50mM麸胺酸、50mM精胺酸)中预平衡的ENrichTM SEC 650(10×300管柱；Biorad)进行尺寸排阻色谱法。接着，为检验蛋白质样品的纯度，将样品与装载缓冲液组合，藉由7.5％SDS-PAGE分离且藉由考马斯亮蓝-Plus(EBL)染色。

实例4：藉由质谱分析进行糖肽分析

使来自两个生物学重复实验的两个20μg SARS-CoV-2刺突蛋白等分试样在含有10mM参(2-羧基乙基)膦的50mM三乙铵碳酸氢盐缓冲液中在55℃下变性1小时。随后，还原刺突蛋白，且藉由添加18mM碘乙酰胺(IAA)烷基化，且在黑暗中培育30分钟。使用比率为1:10(w/w)的胰凝乳蛋白酶或α溶解蛋白酶或比率为1:20(w/w)的胰蛋白酶的不同组合，分开消化烷基化Env蛋白。(质谱法级别，Promega)在消化隔夜的后，样品在SpeedVac浓缩器中干燥且经加工用于测定LC-MS/MS。根据由Graphpad Prism 9.0.0侦测及目测的组成，遵循先前研究进行聚糖分类。

实例5：疫苗接种及攻击实验

在第0天及第14天，将雌性6至7周龄金色叙利亚仓鼠(n＝5)在肌肉内用与250μg氢氧化铝混合的25μg经纯化的S_FG或S_MG蛋白进行免疫接种。在第一次免疫接种的后28天及42天收集血液，且自各仓鼠收集血清样品。在第二次免疫接种的后4周，用1×104PFU SARS-CoV-2TCDC#4(hCoV-19/Taiwan/4/2020，GISAID寄存ID：EPI_ISL_411927)以每只仓鼠100μL的体积鼻内攻击仓鼠。在感染的后每日记录各仓鼠的体重。在攻击后第3天，藉由二氧化碳对仓鼠施以安乐死。收集右肺以用于病毒负荷测定(TCID50分析)。将左肺固定于4％三聚甲醛中以用于组织病理学检验。所有动物实验均经台湾地区“中央研究院”的实验动物照护及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)评估及批准。

或者，对于利用两剂时程的小鼠疫苗接种，在第0天及第14天，将雌性6至8周龄BALB/c小鼠(n＝5)在肌肉内用与氢氧化铝(50μg)混合的10μg经纯化的S_FG、S_HM或S_MG进行免疫接种。在第一次疫苗接种的后第28天收集血清，用于评估抗S IgG丰度、IgG亚型及中和效价(补充材料及方法中描述)。在第一次疫苗接种的后第21天收集经S_FG或S_MG免疫接种的小鼠的淋巴结，用于T细胞反应分析(补充材料及方法中描述)。对于B细胞库分析及针对变异体的血清效价，在第0、14及56天，将雌性6至8周龄BALB/c小鼠(n＝5)在肌肉内经与氢氧化铝(20μg)混合的20μg经纯化的S_FG或S_MG进行免疫接种；在第84天对小鼠施以安乐死以收集全血，用于抗S IgG及中和效价评估，且收集脾，用于分选S蛋白特异性B细胞(补充材料及方法中描述)。

对于仓鼠疫苗接种及病毒攻击研究，在第0天及第14天将雄性6至7周龄金色叙利亚仓鼠(n＝5)在肌肉内用与氢氧化铝(250μg)混合的25μg经纯化的S_FG或S_MG进行免疫接种。在第二次免疫接种的后四周，用100μl PBS中1×104TCID50 SARS-CoV-2(hCoV-19/Taiwan/4/2020)鼻内攻击各仓鼠。在感染的后每日记录体重。在攻击后第3天，藉由二氧化碳对仓鼠施以安乐死。将左肺上叶固定于10％三聚甲醛中以用于组织病理学检查，且收集其余肺以用于病毒负荷测定(TCID50分析)。

对于转殖基因小鼠疫苗接种及病毒攻击研究，在第0及14天将雄性6至8周龄CAG-hACE2转殖基因小鼠或雄性12周龄K18-hACE2转殖基因小鼠(购自the JacksonLaboratory)在肌肉内用与氢氧化铝(50μg)混合的10μg经纯化的S_FG或S_MG进行免疫接种。在第二次免疫接种的后4周，用1×103TCID50 WT SARS-CoV-2鼻内攻击CAG-hACE2转殖基因小鼠。在第一次试验(n＝3)中，在7dpi对所有小鼠施以安乐死以对左肺上叶进行组织病理学检查；在第二个试验(n＝7)中，在4dpi对三只小鼠施以安乐死以获得肺病毒效价，且保持四只小鼠直至14dpi，以进行存活分析。在病毒攻击的前1天收集血清。

对于使用引发关切的病毒变体(VOC)的攻击研究，用每只小鼠50μl PBS中1×103TCID50 Alpha变异体(hCoV-19/Taiwan/792/2020)(n＝5)或Gamma变异体(hCoV-19/Taiwan/906/2021)SARS-CoV-2攻击CAG-hACE2小鼠。另外，在第二次免疫接种的后4周，用每只小鼠50μl PBS中1×104TCID50 Delta SARS-CoV-2(hCoV-19/Taiwan/1144/2021)(n＝4)鼻内攻击K18-hACE2小鼠。对于所有SARS-CoV-2变异体攻击模型，每日记录各小鼠的体重直至14dpi。

对于抗体的预防性保护测试，向雄性8周龄K18-hACE2转殖基因小鼠(n＝3)腹膜内注射m31A7(15mg/kg)或PBS，1天后用1×103TCID50 WT SARS-CoV-2(hCoV-19/Taiwan/4/2020)鼻内攻击。每日记录体重及体温直至5dpi。所有动物实验均经台湾地区“中央研究院”的实验动物照护及使用委员会评估及批准(批准编号21-10-1716、18-12-1272及20-10-1522)。

实例6：组织学及免疫组织化学(IHC)染色

在3dpi立即收集仓鼠肺且置放于10％中性缓冲福尔马林中，固定24小时，随后转移至70％乙醇中，保持72小时。将石蜡包埋的肺组织修整至5mm的厚度。对于组织学染色，将组织用苏木精及伊红(H&E)染色。对于免疫组织化学(IHC)染色，用二甲苯将切片的组织去石蜡且用乙醇梯度再水合。藉由在微波烘箱中在10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中将载片加热至95℃持续10分钟进行抗原修复。在室温下冷却且用PBS洗涤后，施加3％H₂O₂以消除内源过氧化酶活性。将切片的组织用含5％正常山羊血清及1％BSA的1X PBST阻断1小时，随后与1:50稀释的兔抗N及抗S初级抗体(抗SARS-CoV-2多株抗体)在4℃下一起培育隔夜。随后将组织与1:500稀释的山羊抗兔HRP二级抗体一起培育1小时且藉由与3,3-二胺基联苯胺(DAB)受质一起培育且用苏木精对比染色进行目测。

实例7：免疫荧光(IF)染色

对于免疫荧光染色，在抗原修复步骤的后，用含Triton X-100的PBS渗透组织。将切片的组织用含5％正常山羊血清及1％BSA的1X PBST阻断1小时。接着，与自体荧光猝灭剂一起培育5分钟。随后将样品与1:50稀释的兔抗N及抗S初级抗体(抗SARS-CoV-2多株抗体)在4℃下一起培育隔夜，与二级抗体Alexa Fluor-488(1:500，Thermo Fisher)在室温下一起培育1小时，且与核染料4,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在室温下一起培育3分钟。将盖玻片安装在显微镜载片上且在具有HC PL APO CS2 10x/1.40镜片的Leica TCS SP8X共焦显微镜(Leica AG,Wetzlar,Germany)下成像。

实例8：转殖基因小鼠疫苗接种及攻击实验

在第0天及第14天，将雄性8周龄CAG-hACE2转殖基因小鼠(n＝3)在肌肉内经与50μg氢氧化铝混合的10μg经纯化的S_FG或S_MG蛋白进行免疫接种。¹⁴在第一次免疫接种的后28天及42天收集血液，且自各转殖基因小鼠收集血清样品。在第二次免疫接种的后6周，用1×10³PFU SARS-CoV-2TCDC#4(hCoV-19/Taiwan/4/2020，GISAID寄存ID:EPI_ISL_411927)以每只小鼠100μL的体积鼻内攻击仓鼠。感染后每日记录各转殖基因小鼠的体重及存活率。在攻击的后第7天，藉由二氧化碳对所有转殖基因小鼠施以安乐死。将肺固定于4％三聚甲醛中以用于组织病理学检验。所有动物实验均经台湾地区“中央研究院”的实验动物照护及使用委员会评估及批准。

实例9：藉由细胞培养感染分析对肺组织中的病毒效价进行定量(TCID50)

使用均质器，使仓鼠的中腔、下腔及后腔肺叶于600μl具有2％FBS及1％青霉素/链霉素的DMEM中均质化。以15,000rpm将组织均质物离心5分钟且收集上清液以用于活病毒滴定。简言的，将各样品的10倍连续稀释液添加于Vero E6细胞单层上，一式四份，且培育4天。细胞随后用10％甲醛固定且用0.5％结晶紫染色20分钟。用自来水洗涤培养盘且对感染进行评分。藉由李-明法(Reed and Muench method)计算50％组织培养物感染剂量(TCID50)/mL。

实例10：小鼠疫苗接种研究

在第0天、第14天及第56天，将雌性6至8周龄BALB/c小鼠(n＝5)在肌肉内经与20μg氢氧化铝混合的20μg经纯化的S_FG或S_MG蛋白免疫接种。在第三次免疫接种的后14天收集血液，且自各小鼠收集血清样品。所有动物实验均经台湾地区“中央研究院”的实验动物照护及使用委员会评估及批准。

实例11：血清抗体效价评估

抗S ELISA用于测定血清IgG效价。将培养盘用5％脱脂乳阻断，且依次添加小鼠多株抗S初级抗体及HRP结合的二级抗体。使用过氧化酶受质溶液(TMB)及1M H₂SO₄终止溶液且藉由微定量盘式读数器读取吸亮度(OD 450nm)。测试病毒株包括SARS-CoV-2(野生型、变异体B.1.1.7及B.1.135)、RnGT13及SARS-CoV-1。

藉由单一B细胞筛选分析分离m31A7抗体且随后使特征化。基于先前出版物设计引子(T.Tiller,C.E.Busse,H.Wardemann,Cloning and expression of murine Ig genesfrom single B cells.J.Immunol.Methods 350,183-193(2009))。聚合酶链式反应(PCR)在50℃下进行30分钟，在95℃下进行15分钟，接着进行94℃下培育30秒、50℃下培育30秒及72℃下培育1分钟的循环40个，最终延伸在72℃下进行10分钟。使用KOD One PCR主混合物(TOYOBO)利用1μl未纯化的第一轮PCR产物进行半巢式第二轮PCR，在98℃下2分钟，接着进行98℃下培育10秒、55℃下培育10秒及68℃下培育10秒的循环45个，最终延伸在68℃下进行1分钟。随后藉由电泳及定序分析PCR产物。在国际ImMunoGeneTics信息系统(http://imgt.org/IMGT_vquest/input)上鉴别Ig V及L基因。接着利用单一基因特异性V及L基因引子，自第二轮PCR产物扩增基因，所述等引子含有用于选殖至含有人类IgH或IgL表现主链的载体中的限制位点。将嵌合IgH及IgL表现构筑体共转染至Expi293中以产生抗体。在分离m31A7的后，随后藉由ELISA及荧光活化细胞分选对抗体评估S蛋白结合、假病毒中和效力、结合动力学、抗原表位定位及结构测定。

实例12：假病毒中和分析

为确定假型慢病毒载体的感染单位，在感染前1天，吾人在96孔(每孔100μL)组织培养盘中以适当密度接种293T-ACE2细胞。在培育隔夜(37℃、5％CO₂)的后，将100mL三个预混合的假病毒上清液及免疫接种小鼠血清的四倍连续稀释液添加在涂铺的细胞中。将细胞在37℃/5％CO₂下培育48小时以允许表现Nano-Luciferase报导基因。藉由ELISA读数器量测荧光素酶活性。藉由以下等式100×[1-(RLU_样品/RLU_模拟处理)]计算抑制百分比。使用Graphpad Prism分析数据且藉由获取所有样品的50％抑制浓度值计算pNT₅₀值。

实例13：蚀斑减少分析

在感染前1天，将Vero E6细胞于具有10％FBS及抗生素的DMEM中接种至24孔培养盘中。将SARS-CoV-2与抗体在37℃下一起培育1小时，随后再添加至细胞单层中，保持一小时。随后，移除病毒-抗体混合物，且用PBS洗涤细胞单层一次，随后用含有1％甲基纤维素的培养基覆盖5-7天。将细胞用10％甲醛固定隔夜。在移除上覆培养基的后，将细胞用0.7％结晶紫染色且计数蚀斑。抑制百分比计算为[1-(VD/VC)]×100％，其中VD及VC分别是指在血清存在及不存在下的病毒效价。

对于基于CPE的中和分析，将Vero E6细胞以2×10⁵个细胞/孔涂铺至6孔盘上隔夜，90％细胞覆盖率。将血清及病毒混合，随后再添加至细胞单层上，保持一小时。使培养盘在室温下固化30分钟，接着在37℃下培育，直至观测到细胞病变作用(CPE)。

统计分析：所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差。对于所有分析，除使用t试验(Student's t-test)(配对，双尾)进行曲线比较以外，自t试验(Student's t-test)(未配对，双尾)获得P值。所有图皆用GraphPad Prism版本9.0.0软件产生。

实例14：经糖工程改造的经单GlcNAc修饰的刺突蛋白(S_MG)疫苗的设计及特征

具有来自原始SARS-CoV-2病毒株的序列(胺基酸14-1209)的重组天然蛋白经密码子优化以用于人类细胞表现，其中GSAG残基替换原始弗林蛋白酶切割位点且进行2个脯胺酸突变以将刺突蛋白的天然蛋白固定在其融合前状态，且在其C端处添加折迭子三聚序列及His标签，且用人类HEK293S细胞表现(图1)。首先获得中间物高甘露糖型刺突蛋白重组天然蛋白(S_HM)且纯化，其中由分支符号(图1a)指示的所有N-聚糖均是Man5 N-聚糖。随后使用内切糖基化酶EndoH移除过量聚糖且产生终产物单糖基化刺突蛋白天然蛋白(图1b)。经纯化的S_MG为在溶液中表观分子量为约520kDa且具有高纯度的三聚体(图1c及图1d)。与普通S_FG及中间物S_HM相比，藉由SDS-PAGE分析由N-聚糖的移除所致的尺寸减小(图1d)。关于S_MG的质谱分析指示，大部分N-糖基化位点具有靠近100％单糖，亦即N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)，N603及N1194除外，GlcNAc>90％(图1f)。相比的下，原始完全糖基化刺突蛋白天然蛋白在所有其N-糖基化位点上具有非均质N-聚糖，含有复合型、杂交型及其他类型。

实例15：S_MG疫苗在活体内提供对SARS-CoV-2及变异体的优良防护

为评估S_MG疫苗针对SARS-CoV-2的活体内防护功效，首先在经S_MG或S_FG疫苗接种的叙利亚仓鼠中进行WT SARS-CoV-2攻击(图2A)。与S_FG及磷酸盐缓冲盐水(PBS)组相比，经S_MG疫苗接种的仓鼠(n＝5)展示体重减少较少(图2B)，而在经S_FG及S_MG疫苗接种的仓鼠的肺中观测到相似病毒效价减少(图2C)。另外，根据组织病理学染色及抗核衣壳(N)蛋白质免疫染色数据，在经免疫接种的仓鼠的肺中观测到较少病变(图2D)。因为仓鼠在SARS-CoV-2感染的后仅展示轻度至中度恶心，接着使用严重疾病模型，高感CAG-hACE2(C.-Y.Tsai,C.-Y.Chen,J.-T.Jan,Y.-C.Chou,M.-L.Chang,L.A.Lu,P.-Y.Huang,M.F.C.Chu,T.-T.Hsu,Y.-P.Hsueh,Sex-biased response to and brain cell infection by SARS-CoV-2in ahighly susceptible human ACE2 transgenic model.bioRxiv,2021)或K18-hACE2(E.S.Winkler,A.L.Bailey,N.M.Kafai,S.Nair,B.T.McCune,J.Yu,J.M.Fox,R.E.Chen,J.T.Earnest,S.P.Keeler,J.H.Ritter,L.-I.Kang,S.Dort,A.Robichaud,R.Head,M.J.Holtzman,M.S.Diamond,SARS-CoV-2infection of human ACE2-transgenic micecauses severe lung inflammation and impaired function.Nat.Immunol.21,1327-1335(2020)转殖基因小鼠(图2E)。对CAG-hACE2小鼠中抗S IgG结合效价、中和效价、抗S亚型IgG及IgG2c:IgG1比率(图2，F至I)的分析均展示与BALB/c小鼠相似的结果(图6，C至G)。在用WT SARS-CoV-2鼻内攻击的后，在感染后第7天(dpi)藉由抗N染色(图2J)或在4dpi藉由中值组织培养物感染剂量(TCID₅₀)分析(图2K)在经S_FG及S_MG疫苗接种的CAG-hACE2小鼠(n＝3)的肺中无法侦测到病毒，而在对照组中观测到超过1,000TCID₅₀的病毒效价(图2K)。在14dpi，S_MG组(n＝4)展现比S_FG(50％)更佳的存活率(75％)(图2，L及M)。接着评估CAG-hACE2小鼠(n＝5)中由S_MG疫苗接种赋予的对Alpha变异体攻击的防护程度。发现S_MG疫苗接种提供100％存活率，直至14dpi(图2，N及O)。经S_MG疫苗接种的小鼠亦展示在CAG-hACE2小鼠(n＝5)中Gamma变异体攻击中60％存活率(图22P及Q)及在K18-hACE2小鼠(n＝4)中Delta变异体攻击中75％存活率(图4，R及S)，而在Gamma及Delta变异体攻击中，少于50％经S_FG疫苗接种的小鼠存活，直至14dpi(图2，Q至S)。由S_MG疫苗接种赋予的经改良的活体内防护进一步证明自免疫原移除聚糖遮蔽是引发优良免疫应答的有利策略。

实例16：S_MG疫苗接种在转殖基因hACE2小鼠中提供更好的对致死剂量SARS-CoV-2感染的预防

CAG-hACE2转殖基因小鼠在感染SARS-CoV-2病毒时可能发展严重疾病且死亡。在第0及14天在肌肉内给与两剂S_FG、S_MG疫苗或仅佐剂，在第28及42天收集血清，使用1×10³TCID50 SARS-CoV-2经鼻内感染各小鼠(图3a)。经S_MG免疫接种的小鼠的刺突蛋白特异性抗体IgG效价比S_FG组高1.9倍(40,000对比20.000)，且S_MG的中和效价比S_FG组高2.8倍(图3b及图3c)。意外地，在此严重疾病模型中，如观测到体重迅速下降且所有小鼠在病毒感染的后第7天前全部死亡，S_FG疫苗接种未能保护CAG-hACE2转殖基因小鼠免于严重疾病。经S_FG疫苗接种的组的疾病进展仅比仅佐剂组略好(图3d及图3e)。相比的下，经S_MG疫苗接种的组展现重量略微减轻，且所有小鼠均经受住SARS-CoV-2感染。此结果证明SARS-CoV-2严重疾病转殖基因小鼠模型中S_MG疫苗接种的优越性。

实例17：小鼠中由S_MG疫苗诱发的抗体增强针对SARS-CoV-2变异体的结合及中和的广度及效力

接着关于中和新出现的需要关注的SARS-CoV-2变异体的能力，分析由具有刺突蛋白天然序列的S_FG或S_MG的任一疫苗接种引发的抗体反应是否存在差异(图4)。与S_FG相比，S_MG免疫接种引发更佳的刺突蛋白特异性抗体IgG与来自WT的刺突蛋白天然蛋白的结合，且亦引发与变异体D614G、B.1.1.7、B.1.351、蝙蝠CoV RnGT13及SARS-CoV-1的结合(图4b)。使用SARS-CoV-2变异体的假型病毒(pseudotyped viruse)测量中和经疫苗免疫接种的血清中的感染的能力。此外，来自S_MG免疫接种的血清对D614G、B.1.1.7及B.1.351假病毒具有优良的中和能力，且其分别比S_FG诱发的血清优良1.4、2.7及1.5倍(图4c及图4d)。最终，在蚀斑中和分析中使用SARS-CoV-2实际病毒D614G及B.1.1.7(图4e及图4f)。与S_FG疫苗接种相比，S_MG疫苗接种对D614G及B.1.1.7变异体引发更佳的中和抗体反应，且其分别优良2.0及1.4倍。

实例18：糖基化影响假病毒S蛋白与若干细胞类型上的ACE2的相互作用

为了解糖基化的重要性，自肺上皮细胞(用于感染的初级细胞)表现S蛋白，且发现对受体的较高亲合力需要S蛋白的唾液酸化(图5A)。对HEK293T细胞产生的S蛋白亦观测到相似模式(图5B)，且对仅具有高甘露糖聚糖或呈所有N-聚糖修整为单一N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的糖形的S蛋白的亲合力亦减少(图5C)。藉由表现人类血管收缩素转化酶2(hACE2)的HEK293T细胞中的假病毒感染进一步测试其糖基化的影响，揭露当施加相同量的病毒时一致的倾向(图5D)。此使吾人得出结论，复合型聚糖及唾液酸化在功能上对于S蛋白介导的感染性为重要的。亦产生一组完整24种基于慢病毒的假病毒变异体(包含22个N-糖基化位点及2个O-糖基化位点)，用于评估五种表现hACE2的细胞株(包括HEK293T、Vero-E6及三种人类肺细胞株A549、Calu-1及Calu-3细胞)中的病毒进入效率(图5，E至G)。此等假病毒是基于具有C端19个胺基酸缺失的S构筑体，其产生最高病毒效价。藉由p24免疫分析定量假病毒产生，且结果相对于各突变病毒株的效价归一化(图5F)。由于化学相似性，每个N-糖基化位点的天冬酰胺(Asn)经取代为麸酰胺酸(Gln)以最小化结构影响，且各O-糖基化位点的苏胺酸(Thr)或丝胺酸(Srn)经取代为丙胺酸(Ala)。因为突变诱发改变胺基酸，所以所引起的感染性变化将来自共有的因素，包括影响受体接合的糖基化相关的构形变化，及受蛋白质表现、折迭及运输影响的S蛋白表面丰度。结果表明S蛋白糖基化的破坏降低感染性。对于受体结合域(RBD)中的两个突变N331Q及N343Q以及对于两个O-糖基化位点(T323A及S325A)的突变，观测到实质性降低，尽管后者的占有率低(图5G)。另外，N端域(NTD)中的N122糖基化缺失引起感染性降低及低蛋白质表现(图5G)。两个NTD突变N149Q及N165Q分别在Vero-E6及Calu-1细胞中增加感染性，不过在其他细胞中观测到感染减少(图5G)。应注意，附接于此N165残基的聚糖在结构上接近三聚S蛋白中的相邻RBD，且其突变减少ACE2结合，很可能由于RBD的构形变化至“向下”状态。鉴别两种突变体N801 Q及N1194Q(图5F)，其在所有五种细胞中普遍消除病毒感染性。糖基化位点N801位置靠近融合肽近端区(FPPR)，且N1194靠近七肽重复2(HR2)螺旋的中心且为跨膜域前的最后一个N-糖基化位点(图5E)。此等突变均引起低产率表现。N801 Q突变体更倾向于降解，且N1194Q突变体破坏S蛋白三聚体，此可能部分地解释了携带此等突变体的假病毒感染性的降低。

实例19：来自肺上皮细胞的S蛋白含有更多唾液酸化复合型聚糖且S蛋白中的高度保守抗原表位主要经聚糖遮蔽

S蛋白的聚糖概况分析显示与人类肾上皮细胞细胞株HEK293T中产生的S蛋白(分别61％及23％)(图6B)相比，人类肺上皮细胞细胞株BEAS-2B中产生的S蛋白中复合型聚糖丰度较高(78％)且杂交型聚糖较少(小于1％)(图6A)。在高甘露糖型聚糖中，N连接的甘露糖-5聚糖(man5)是在HEK293T表现的S蛋白中发现的主要类型，尽管仅在来自BEAS-2B细胞的位点N61处看到。另外，在来自BEAS-2B细胞的位点N74、N149、N282及N1194处的复合型聚糖比来自HEK293T细胞的聚糖更多样地进行加工(多个触角、半乳糖基化、岩藻糖基化或唾液酸化)。相比的下，在位点N122、N331、N1098及N1134处的聚糖多样化程度较低。此外，在BEAS-2B中N149及N17无核心岩藻糖。观测到来自BEAS-2B的所有22个N-糖基化位点上的唾液酸化程度(53％)总体上高于来自HEK293T(35％)、HEK293E(26％)或先前报导的HEK293F细胞(15％)(Y.Watanabe,J.D.Allen,D.Wrapp,J.S.McLellan,M.Crispin,Site-specificglycan analysis of the SARS-CoV-2spike.Science 369,330-333(2020))。详言的，BEAS-2B中RBD的两个N-糖基化位点(N331及N343)(99％及39％)比HEK293T(49％及15％)更多唾液酸化。尽管有差异，但来自所有细胞类型的S蛋白均含有位于S2域的中间区段周围的非复合型聚糖带(图6C)，其中N-糖基化位点N801对于感染很重要(图5G)，N1074含有多样化聚糖，且N717是S蛋白表现不可或缺的。

自模型化SARS-CoV-2S蛋白结构及来自BEAS-2B细胞的聚糖概况，对蛋白质表面积上的聚糖覆盖度进行结构分析，且与使用1,117,474个S蛋白序列的多个比对结果重迭(S.Elbe,G.Buckland-Merrett,Data,disease and diplomacy:GISAID's innovativecontribution to global health.Global Chall.1,33-46(2017))。其揭露高度保守但经聚糖遮蔽的若干区域，包括RBD的下侧面、具有非复合型聚糖带的S2茎区及涉及连接域(CD)及HR2的S2 C端部分(图6，D及E)。在一级序列上，此等区域展示为保守抗原表位。序列保守分析亦展示，大部分糖基化位点区域高度保守，且大部分保守糖基化位点(突变率低于0.02％)包括NTD(N61、N122、N165及N234)、RBD(S325、N331及N343)、亚域1/2(SD1/2)(N603及N657)、次单元2(S2)的茎区(N709、N1098、N1134、N1158、N1173及N1194)及靠近FPPR的N801中的彼等糖基化位点。此等区域中的大部分含有约20％至40％保守表面残基，且其中一定百分比的残基经聚糖遮蔽，RBD中36％及其他区域中约50％。尽管不具有N-糖基化位点，但HR1区69％的保守表面残基被源于相邻域的聚糖覆盖。此等结果突出显示S蛋白糖基化在结构上及进化上的重要性，从而产生以下想法：暴露经聚糖遮蔽的保守区可能引发针对保守抗原表位的免疫应答。(将12个保守抗原表位描述为疫苗设计的目标是更重要的。12个抗原表位中的10个经聚糖遮蔽；且所遮蔽聚糖的移除暴露保守抗原表位，从而引起广泛保护反应)

实例20：研发S_MG作为疫苗且S_MG疫苗使用不同抗体子类引发更好免疫应答

最初尝试使多个糖基化位点突变，导致S蛋白的表现明显减少。然而，当自GnTIHEK293S细胞表现前述的S蛋白时，能够产生一种具有良好产率及纯度的高甘露糖型S蛋白(S_HM)。接着在各N-糖基化位点处使用内切糖苷酶H(Endo H)将聚糖修整成单一GlcNAc，产生一种可溶性的经单GlcNAc修饰的修整S蛋白，称为S_MG(图7A)。藉由质谱分析证实S_MG，所有N-糖基化位点大部分经单一GlcNAc占据，且未处理O-聚糖的占有率太低而未侦测到。将此经修饰的S_MG及S_HM以及原始完全糖基化S蛋白(S_FG)与作为佐剂的氢氧化铝(明矾)混合，且随后用于藉由肌肉内注射对BALB/c小鼠(n＝5)进行免疫接种(图7B)。在此研究中用于比较的S_FG由HEK293E细胞表现且含有多样化聚糖；此类似于许多当前经批准或处于临床试验中的COVID-19疫苗中使用的免疫原，包括来自Sanofi及Novavax的昆虫细胞表现的S蛋白疫苗(P.J.Klasse,D.F.Nixon,J.P.Moore,Immunogenicity of clinically relevant SARS-CoV-2vaccines in nonhuman primates and humans.Sci.Adv.7,eabe8065(2021))、来自Medigen的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表现的重组S疫苗(T.-Y.Kuo,M.-Y.Lin,R.L.Coffman,J.D.Campbell,P.Traquina,Y.-J.Lin,L.T.-C.Liu,J.Cheng,Y.-C.Wu,C.-C.Wu,W.-H.Tang,C.-G.Huang,K.-C.Tsao,C.Chen,Development of CpG-adjuvanted stableprefusion SARS-CoV-2spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19.Sci.Rep.10,20085(2020))、来自AstraZeneca及Johnson&Johnson的基于腺病毒的疫苗及来自Pfizer-BioNTech及Moderna的mRNA疫苗(P.J.Klasse,D.F.Nixon,J.P.Moore,Immunogenicity of clinically relevant SARS-CoV-2vaccines in nonhuman primatesand humans.Sci.Adv.7,eabe8065(2021))。藉由阴性染色分析，S_FG与S_MG蛋白展现在溶液中基本上相同的三聚结构。

与S_FG相比，经S_MG免疫接种的小鼠在第二次免疫接种的后诱发优良体液免疫应答，针对S蛋白的免疫球蛋白G(IgG)效价显着较高，高1.44倍(终点效价：S_FG，39,408±1,619；S_MG，56,957±5,091；P＝0.0079)(图7C)且基于SARS-CoV-2假病毒感染的抑制，抗体中和效力强3.6倍(半最大中和效价倒数pNT₅₀：S_FG，1346±285；S_MG，4791±767；P＝0.0159)(图6D)，而经S_HM免疫接种的组展示相似抗S IgG效价(39,086±11,654)且与S_FG组相比pNT₅₀效价无差异。对IgG亚型效价及T滤泡辅助(Tfh)细胞的干扰素-γ(IFN-γ)或介白素-4(IL-4)产生的分析揭露，与经S_FG及S_HM疫苗接种的组相比，S_MG疫苗诱导BALB/c小鼠中更多IgG2a(其为T辅助1细胞(TH1)淋巴球的标记物)、更平衡的T_H1/T_H2反应及更多表现IFN-γ的Tfh细胞(图7，E至J)。此外，S_MG疫苗诱导更高频率的IL-21⁺Tfh细胞(图7K)及升高频率的产生颗粒酶B的CD8⁺ T细胞(图7L)。此等数据表明，由S_MG引发的体液及细胞适应性免疫应答比由S_FG诱发的体液及细胞适应性免疫应答更有效。接着检查来自经第三剂S_FG或S_MG免疫接种的小鼠的脾脏的S蛋白特异性B细胞(CD3^-CD19⁺S⁺)的频率(图6A)且发现经S_MG免疫接种的小鼠产生更多S蛋白特异性B细胞(图6M)。来自经S_FG及S_MG免疫接种的小鼠(n＝5)的B细胞库分析表明，与S_FG组中相比，S_MG组中使用更多λ轻链基因(S_FG，1.92％；S_MG，9.68％)(图7N)。另外，与S_FG组中相比，来源于Ig重链可变区(IGHV)的若干特定基因座(图7O)及Igκ链可变区(IGKV)基因(图7P)的抗体在S_MG组中过度表现，尤其IGHV1-18基因(图7O)。此发现表明在此两组中B细胞抗原表位可以不同方式加工，且仍然进一步探索此差异是否及为何具有免疫益处。另外，针对野生型(WT)S蛋白，三剂S_MG疫苗接种引发的终点效价IgG比两剂疫苗接种高(终点效价：S_FG，208,911±50,092；S_MG，376,410±80,873)。观测到藉由酶联免疫吸附分析(ELISA)针对来自SARS-CoV-2引发关切的病毒变体(VOC)的S蛋白量测的血清IgG结合曲线中S_MG与S_FG组的间的差异(P.R.Krause,T.R.Fleming,I.M.Longini,R.Peto,S.Briand,D.L.Heymann,V.Beral,M.D.Snape,H.Rees,A.-M.Ropero,R.D.Balicer,J.P.Cramer,C.-Fontela,M.Gruber,R.Gaspar,J.A.Singh,K.Subbarao,M.D.Van Kerkhove,S.Swaminathan,M.J.Ryan,A.-M.Henao-Restrepo,SARS-CoV-2variants andvaccines.N.Engl.J.Med385,179-186(2021))，包括Alpha(B.1.1.7；P＝0.0488)、Beta(B.1.351；P＝0.0010)、Gamma(P.1；P＝0.0068)及Delta(B.1.617.2；P＝0.0068)，但终点效价分析无统计差异(图7Q)。藉由假病毒中和曲线，亦观测到针对引发关切的病毒变体(VOC)的中和抗体反应的差异，包括Alpha(P＝0.0156)、Beta(P＝0.0156)及Delta(P＝0.0078)，但与S_FG相比，在假病毒或可靠病毒中和的pNT₅₀效价的值中未观测到差异(图7，R及S)。

实例21：自经S_MG免疫接种的小鼠的B细胞分离广泛中和抗体

自经S_MG免疫接种的小鼠分选的S蛋白特异性B细胞可自IGHV1-18扩增纯系鉴别单株抗体(mAb)m31A7，所述等B细胞是经S_MG免疫接种的B细胞库中特别丰富的子集(图8O)。此mAb与全长S蛋白、S1及RBD相互作用，但不与S2相互作用(图8A)，且结合于表现来自不同SARS-CoV-2变异株的S蛋白的HEK293T细胞(图8B)。另外，展示在低于皮莫耳半抑制浓度(IC₅₀)下m31A7中和各种假病毒变异体(WT、D614G、Alpha、Beta及Delta)，比报导的人类mAbEY6A高多达1000倍(图8C)。预防性研究亦证实在用WT SARS-CoV-2攻击的K18-hACE2小鼠(n＝3)中m31A7的良好活体内功效(图8D)。预防性处理的小鼠维持体重及温度(图8，E及F)。生物层干涉术(Biolayer interferometry,BLI)分析用于量测分别在70.9pM及4.66nM下m31A7及其Fab结合于S蛋白的解离常数(图8G)。藉由氢-氘交换质谱法(HDX-MS)的抗原表位定位揭露其潜在结合区在RBD上(图8H)，与在与m31A7-Fab的复合物中RBD的晶体结构中观测到的抗原表位重迭。冷冻电子显微法(EM)结构进一步阐明m31A7仅与“向上”状态的RBD结合(图8I)，其中来自相邻NTD的N165-聚糖在RBD-m31A7界面附近(图8J)。m31A7在RBD上的占据面积类似于人类VH1-58类别mAb(图8K)，但其自不同角度接近RBD，在尖端环上的局部接触面积变化，绕过引发关切的病毒变体(VOC)大部分关键突变残基，诸如E484 K417，但不绕过T478(图8L)。此S_MG引发的mAb的详细RBD-m31A7界面及抑制机制在进一步研究中。

实例22：Delta S_MG疫苗接种引发更多的针对SARS-CoV-2变异假病毒的中和抗体

SARS-CoV-2Delta变异体的S_MG蛋白表现构筑体

SEQ ID NO:3

来自A/Brisbane/59/2007(H1N1))的信号肽：MKVKLLVLLCTFTATYAGT(SEQ ID NO:4)

凝血酶切割位点：(SEQ ID NO:5)

T4折迭子：(SEQ ID NO:6)

HRV3C切割位点：GSGSLEVLFQGP(SEQ ID NO:7)

His标签：(SEQ ID NO:8)

在第0周及第2周将BALB/c小鼠(n＝5)用Delta S_FG或S_MG疫苗免疫接种两次。在第6周收集血清且随后使用假病毒分析测试中和能力(图9A)。使用SARS-CoV-2Delta变异体的假型病毒(pseudotyped viruse)测量中和经疫苗免疫接种的血清中的感染的能力。此外，来自S_MG免疫接种的血清对WT、Alpha、Beta、Gamma、Delta及Omicron假病毒具有优良中和能力。Delta S_FG对比S_MG的相应效价(pNT₅₀，愈高愈好)分别为1018对比3336(针对野生型WT假病毒)、1396对比2680(针对Alpha假病毒)、337对比2282(针对Beta假病毒)、814对比4424(针对Gamma假病毒)、1138对比6680(针对Delta假病毒)及144对比2628(针对Omicron假病毒)。

实例23：Delta或WT S_MG疫苗接种引发更多的针对SARS-CoV-2Omicron变异假病毒的中和抗体

在第0周及第2周将BALB/c小鼠(n＝5)用Delta/WT S_FG或S_MG疫苗免疫接种两次。在第6周收集血清且随后使用假病毒分析测试中和能力(图10A)。使用SARS-CoV-2Omicron变异体的假型病毒(pseudotyped viruse)测量中和经WT S_FG/S_MG或Delta S_FG/S_MG疫苗免疫接种的血清中的感染的能力。WT S_FG疫苗接种未引发针对Omicron假病毒的中和，而WT S_MG提供轻微保护。类似地，Delta S_FG疫苗接种引发极少的针对Omicron假病毒感染的中和，然而，Delta S_MG提供极佳中和。

实例24：Delta S_MG蛋白可呈溶液或呈粉末储存于室温下

具有两种胺基酸(pbs-aa)、50mM L-精胺酸及50mM L-麸胺酸的磷酸盐缓冲盐水添加剂中Delta S_MG蛋白经0.22μm过滤器过滤且储存于室温(RT)或4℃下。在包括3天、7天、14天、21天及3个月的不同时间点收集蛋白质。将所收集的样品与5X SDS-PAGE装载染料混合，在100℃下加热5分钟且储存于4℃下，直至跑胶(图11A及B)。针对在4℃下储存Delta S_HM或S_MG(前3个泳道)，测试有或无50mM L-精胺酸及50mM L-麸胺酸的PBS。测试在有或无赋形剂下冻干的Delta S_MG且在室温下储存超过2周(后2个泳道)(图11C)。稳定性测试指示DeltaS_MG蛋白可储存于溶液中且在室温或4℃下稳定至少21天。此外，Delta S_MG可经冻干且在室温下储存且保持稳定至少3个月。

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

SARS-CoV-2Delta变异体的S_MG蛋白表现构筑体

SEQ ID NO：3

A/Brisbane/59/2007(H1N1)经修饰的信号肽

凝血酶切割位点

T4折迭子

HRV3C切割位点

His标签

高度保守抗原表位

/>

Claims

1.一种免疫原，其包含经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白，所述经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白包含复数个截短N-聚糖及一或多个未经修饰的O-聚糖，其中所述经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白由SEQ ID NO：1的胺基酸序列或与SEQ ID NO：1的胺基酸序列具有至少90％序列一致性的其变异体或所述胺基酸序列或所述变异体的免疫活性片段组成。

2.如权利要求1的免疫原，其中所述复数个截短N-聚糖为单糖。

3.如权利要求2的免疫原，其中所述等单糖为N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。

4.如权利要求1的免疫原，其中所述复数个截短N-聚糖位于受体结合域(RBD)中，藉此暴露具有以下胺基酸序列的复数个高度保守抗原表位：TESIVRFPNITNL(SEQ ID NO.：41)、NITNLCPFGEVFNATR(SEQ ID NO：42)、LYNSASFSTFK(SEQ ID NO：43)、LDSKVGGNYN(SEQ IDNO：44)、KSNLKPFERDIST(SEQ ID NO：45)、KPFERDISTEIYQAG(SEQ ID NO：46)及/或GPKKSTNLVKNKC(SEQ ID NO：47)。

5.如权利要求1的免疫原，其中所述复数个截短N-聚糖位于七肽重复2(HR2)域中，藉此暴露具有以下胺基酸序列的复数个高度保守抗原表位：NCDVVIGIVNNTVY(SEQ ID NO：48)、PELDSFKEELDKYFKNHTS(SEQ ID NO：49)、VNIQKEIDRLNEVA(SEQ ID NO：50)、NLNESLIDLQ(SEQID NO：51)及/或LGKYEQYIKWP(SEQ ID NO：52)。

6.如权利要求1的免疫原，其中所述经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白藉由活体外糖工程改造自天然冠状病毒刺突蛋白衍生而来。

7.如权利要求6的免疫原，其中所述天然冠状病毒刺突蛋白为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SAR-CoV-2)或其变异体的刺突蛋白。

8.如权利要求7的免疫原，其中所述变异体是选自由以下组成的群：D614G、Alpha(B.1.1.7及Q谱系)、Beta(B.1.351及后代谱系)、Gamma(P.1及后代谱系)、Epsilon(B.1.427及B.1.429)、Eta(B.1.525)、Iota(B.1.526)、Kappa(B.1.617.1)、1.617.3、Mu(B.1.621、B.1.621.1)、Zeta(P.2)、Delta(B.1.617.2及AY谱系)及Omicron(B.1.1.529及BA谱系)。

9.如权利要求1的免疫原，其中所述经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白呈三聚体形式存在。

10.如权利要求6的免疫原，其中所述经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白保留与所述天然冠状病毒刺突蛋白相同的三级结构。

11.如权利要求4的免疫原，其中相对于所述天然冠状病毒刺突蛋白，所述经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白能够引发增强的免疫应答。

12.如权利要求11的免疫原，其中所述增强的免疫应答为增加的IgG效价、增加的IgM效价、增加的中和效价、增加的CD4 T细胞反应、增加的CD8 T细胞反应或其组合。

13.如权利要求6的免疫原，其中所述经糖工程改造的刺突蛋白是使用一或多种化学或酵素方法产生。

14.如权利要求13的免疫原，其中所述经糖工程改造的刺突蛋白是使用内切糖苷酶H(Endo H)产生。

15.如权利要求1的免疫原，其中所述经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白包含由SEQ IDNO：1的胺基酸序列组成的多肽，其中所述多肽由22个截短N-聚糖组成，各截短N-聚糖具有GlcNAc部分。

16.如权利要求1的免疫原，其中所述经糖工程改造的冠状病毒刺突蛋白包含由SEQ IDNO：2的胺基酸序列组成的多肽，其中所述多肽由21个截短N-聚糖组成，各截短N-聚糖具有GlcNAc部分。

17.一种免疫原性组合物，其包含：(a)如权利要求1至16中任一项的免疫原，及(b)视情况选用的佐剂。

18.如权利要求17的免疫原性组合物，其中所述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)、角鲨烯、明矾、铝胶、MF59、QS-21、CpG 1018、AS03、AS37、Matrix-M或其组合。

19.如权利要求17的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物为相对于使用天然冠状病毒刺突蛋白的疫苗，能够引发增强的免疫应答的经改良的冠状病毒疫苗。

20.如权利要求19的免疫原性组合物，其中所述冠状病毒为SAR-CoV-2或其变异体。

21.一种如权利要求17或18的免疫原性组合物作为制备用于在有需要的个体中引发针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的免疫应答的药物中的用途，其包含向所述个体投与有效量的所述免疫原性组合物。

22.如权利要求21的用途，其中所述免疫应答包含产生针对SARS-CoV-2或其变异体的中和抗体。

23.如权利要求22的用途，其中所述变异体是选自由以下组成的群：D614G、Alpha(B.1.1.7及Q谱系)、Beta(B.1.351及后代谱系)、Gamma(P.1及后代谱系)、Epsilon(B.1.427及B.1.429)、Eta(B.1.525)、Iota(B.1.526)、Kappa(B.1.617.1)、1.617.3、Mu(B.1.621、B.1.621.1)、Zeta(P.2)、Delta(B.1.617.2及AY谱系)及Omicron(B.1.1.529及BA谱系)。

24.一种如权利要求17或18的免疫原性组合物作为制备用于在有需要的个体中引发针对SARS-CoV-2或其变异体的免疫应答的药物中的用途，所述用途包含向所述有需要的个体投与有效量的所述免疫原性组合物。

25.如权利要求24的用途，其中所述免疫应答包含产生针对SARS-CoV-2或其变异体的中和抗体。

26.如权利要求25的用途，其中所述变异体是选自由以下组成的群：D614G、Alpha(B.1.1.7及Q谱系)、Beta(B.1.351及后代谱系)、Gamma(P.1及后代谱系)、Epsilon(B.1.427及B.1.429)、Eta(B.1.525)、Iota(B.1.526)、Kappa(B.1.617.1)、1.617.3、Mu(B.1.621、B.1.621.1)、Zeta(P.2)、Delta(B.1.617.2及AY谱系)及Omicron(B.1.1.529及BA谱系)。

27.一种如权利要求17或18的免疫原性组合物作为制备用于保护有需要的个体避免感染SARS-CoV-2或其变异体的药物中的用途，所述用途包含向所述有需要的个体投与有效量的所述免疫原性组合物。

28.一种如权利要求17或18的免疫原性组合物作为制备用于预防有需要的个体感染COVID-19疾病的药物中的用途，所述用途包含向所述有需要的个体投与有效量的所述免疫原性组合物。