JP2002538788A - 核酸呼吸器シンシチウムウイルスワクチン - Google Patents
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- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
Abstract
(57)【要約】
in vivoでの免疫形成のための,呼吸器シンシチウムウイルス(RSV)のF蛋白質をコート゛するヌクレオチト゛配列,及びこのような配列に対するフ゜ロモーター,好ましくはサイトメカ゛ロウイルスフ゜ロモーターを含有する非複製性ヘ゛クターが記述されている。RSV F蛋白質をコート゛するヌクレオチト゛配列は、同種シク゛ナルヘ゜フ゜チト゛をコート゛する配列を欠くが,RSV F蛋白質の発現を増強する異種シク゛ナルヘ゜フ゜チト゛を有する。フ゜ラスミト゛を含むこのような非複製性ヘ゛クターは,in vivoで発現するときのRSV F蛋白質の免疫保護能を増強するために,RSV F蛋白質コート゛化配列に隣接して配置された追加のヌクレオチト゛配列も含むことができる。RSVによる感染で発症する疾患に対して,投与によってヒト宿主を含む宿主を免疫するために,このような非複製性ヘ゛クターを使用することができ,このような目的のために,薬剤として許容し得る担体と共に,免疫原性組成物として製剤することができる。検体においてRSV感染検出用抗体を産生するためにも,このようなヘ゛クターを使用することができる。
Description
【０００１】 (発明の分野) 本発明は、呼吸器シンシチウムウイルス(ＲＳＶ)ワクチンの分野に関し、とり
わけＲＳＶの融合(Ｆ)蛋白質をコードする核酸配列を含むワクチンに関する。
わけＲＳＶの融合(Ｆ)蛋白質をコードする核酸配列を含むワクチンに関する。
【０００２】 (発明の背景) パラミクソウイルス科のウイルスに属する負鎖ＲＮＡウイルスである呼吸器シ
ンシチウムウイルス(ＲＳＶ)は、幼児や低年齢児童における細気管支炎および肺
炎の原因となる主要なウイルス病原体である(参考文献１-この出願明細書全体を
通して、本発明に関わる技術の状況をより完全に説明するために、様々な参考文
献を括弧内に引用する。各引用に対する完全な文献情報を本明細書の終わり、請
求項の直前に示す。これによって、これらの参考文献の開示内容を本明細書中に
参考として組込む。)。ＲＳＶが引起す急性気道感染のために、米国では年間約9
0000人が入院し、4500人が死亡している(参考文献２)。ＲＳＶ感染による医療経
費は、米国だけで年間３億４千万ドルを超えている(参考文献３)。現在のところ
、ＲＳＶに対する認可されたワクチンはない。ＲＳＶワクチンを開発するための
主な手法は、不活性化ウイルス、弱毒化生ウイルスおよびサブユニットワクチン
を含んできた。
ンシチウムウイルス(ＲＳＶ)は、幼児や低年齢児童における細気管支炎および肺
炎の原因となる主要なウイルス病原体である(参考文献１-この出願明細書全体を
通して、本発明に関わる技術の状況をより完全に説明するために、様々な参考文
献を括弧内に引用する。各引用に対する完全な文献情報を本明細書の終わり、請
求項の直前に示す。これによって、これらの参考文献の開示内容を本明細書中に
参考として組込む。)。ＲＳＶが引起す急性気道感染のために、米国では年間約9
0000人が入院し、4500人が死亡している(参考文献２)。ＲＳＶ感染による医療経
費は、米国だけで年間３億４千万ドルを超えている(参考文献３)。現在のところ
、ＲＳＶに対する認可されたワクチンはない。ＲＳＶワクチンを開発するための
主な手法は、不活性化ウイルス、弱毒化生ウイルスおよびサブユニットワクチン
を含んできた。
【０００３】 ＲＳＶのＦ蛋白質は、このウイルスの最も重要な保護抗原のひとつとみなされ
ている。ＲＳＶサブグループＡおよびＢから得たＦ蛋白質のアミノ酸配列には、
顕著な類似性(89％の同一性)が見られ(参考文献３)、抗Ｆ抗体は両サブグループ
のウイルスを交差中和するだけでなく、両サブグループのウイルスによる感染に
対して免疫動物を保護することができる(参考文献４)。その上、Ｆ蛋白質は、マ
ウスおよびヒトにおけるＲＳＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球にとっての主要ター
ゲットと確認されてきた(参考文献３および参考文献５)。
ている。ＲＳＶサブグループＡおよびＢから得たＦ蛋白質のアミノ酸配列には、
顕著な類似性(89％の同一性)が見られ(参考文献３)、抗Ｆ抗体は両サブグループ
のウイルスを交差中和するだけでなく、両サブグループのウイルスによる感染に
対して免疫動物を保護することができる(参考文献４)。その上、Ｆ蛋白質は、マ
ウスおよびヒトにおけるＲＳＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球にとっての主要ター
ゲットと確認されてきた(参考文献３および参考文献５)。
【０００４】 ＲＳＶ蛋白質をワクチンとして使用することは、傷害を伴う恐れがある。非経
口的に投与したワクチン候補物質は、セロネガティブなヒトまたはチンパンジー
における中和抗体の誘導に関して、これまでのところ免疫原性が弱いことがわか
った。これらの抗原によって誘導される血清抗体反応は、大部分の低年齢幼児が
もつ経胎盤獲得母性抗体のような受動獲得抗体の存在下で、更に減衰する恐れが
ある。ＲＳＶ感染細胞培養物から得た精製した融合蛋白質から成り、イムノアフ
ィニティまたはイオン交換クロマトグラフィーによって精製したＲＳＶに対する
サブユニットワクチン候補物質について、説明がなされてきた(参考文献６)。こ
の製剤によるセロネガティブまたはセロポジティブなチンパンジーの非経口的免
疫処置が行われ、約１：50 のＲＳＶ血清中和力価を誘導するために、50μgの投
与量３回分がセロネガティブな動物において必要とされた。その後、これらの動
物を野生型ＲＳＶで攻撃したとき、ウイルス暴露や臨床疾患に対する免疫処置の
効果を上部気道では検出できなかった。このワクチンによる免疫処理が下部気道
におけるウイルス暴露に及ぼす効果は調べられなかったが、この部分は非経口的
免疫処置によって誘導される血清抗体が最大の効果を示すと予想し得る部位であ
る。少数のセロポジティブな人々において、安全性および免疫原性の研究が行わ
れてきた。セロポジティブな子どもおよびセロネガティブな３人の子ども(年齢
は全員 2.4歳を超えている)において、そのワクチンは安全であることが判明し
た。免疫処置を受けた子どもが少数であったために、下部気道疾患に対する免疫
処置の効果を決定することができなかった。セロポジティブな子どもにおける１
回の免疫処置で、その子ども達の 40 から 60％に４倍のウイルス中和抗体力価
の増加が誘導された。したがって、このワクチンのＲＳＶ誘発疾患に対する効力
を評価するために、十分な情報は得られていない。サブユニットＲＳＶワクチン
が直面する他の問題は、セロネガティブな被験者に免疫原性製剤を接種すると、
ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンに見られるものに類似した疾患増強(時々、
免疫増強と云われる)が起こる可能性である。幾つかの研究において、ＲＳＶ Ｆ
蛋白質または合成ＲＳＶ ＦＧ融合蛋白質による免疫処置に対する免疫反応が、
ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンが誘導するものに似た疾患増強をネズミ類に
引起した。非複製性抗原を用いた免疫処置が疾患増強を伴うことは、セロネガテ
ィブなヒトにそのような抗原を使用する場合、注意が必要であることを示してい
る。
口的に投与したワクチン候補物質は、セロネガティブなヒトまたはチンパンジー
における中和抗体の誘導に関して、これまでのところ免疫原性が弱いことがわか
った。これらの抗原によって誘導される血清抗体反応は、大部分の低年齢幼児が
もつ経胎盤獲得母性抗体のような受動獲得抗体の存在下で、更に減衰する恐れが
ある。ＲＳＶ感染細胞培養物から得た精製した融合蛋白質から成り、イムノアフ
ィニティまたはイオン交換クロマトグラフィーによって精製したＲＳＶに対する
サブユニットワクチン候補物質について、説明がなされてきた(参考文献６)。こ
の製剤によるセロネガティブまたはセロポジティブなチンパンジーの非経口的免
疫処置が行われ、約１：50 のＲＳＶ血清中和力価を誘導するために、50μgの投
与量３回分がセロネガティブな動物において必要とされた。その後、これらの動
物を野生型ＲＳＶで攻撃したとき、ウイルス暴露や臨床疾患に対する免疫処置の
効果を上部気道では検出できなかった。このワクチンによる免疫処理が下部気道
におけるウイルス暴露に及ぼす効果は調べられなかったが、この部分は非経口的
免疫処置によって誘導される血清抗体が最大の効果を示すと予想し得る部位であ
る。少数のセロポジティブな人々において、安全性および免疫原性の研究が行わ
れてきた。セロポジティブな子どもおよびセロネガティブな３人の子ども(年齢
は全員 2.4歳を超えている)において、そのワクチンは安全であることが判明し
た。免疫処置を受けた子どもが少数であったために、下部気道疾患に対する免疫
処置の効果を決定することができなかった。セロポジティブな子どもにおける１
回の免疫処置で、その子ども達の 40 から 60％に４倍のウイルス中和抗体力価
の増加が誘導された。したがって、このワクチンのＲＳＶ誘発疾患に対する効力
を評価するために、十分な情報は得られていない。サブユニットＲＳＶワクチン
が直面する他の問題は、セロネガティブな被験者に免疫原性製剤を接種すると、
ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンに見られるものに類似した疾患増強(時々、
免疫増強と云われる)が起こる可能性である。幾つかの研究において、ＲＳＶ Ｆ
蛋白質または合成ＲＳＶ ＦＧ融合蛋白質による免疫処置に対する免疫反応が、
ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンが誘導するものに似た疾患増強をネズミ類に
引起した。非複製性抗原を用いた免疫処置が疾患増強を伴うことは、セロネガテ
ィブなヒトにそのような抗原を使用する場合、注意が必要であることを示してい
る。
【０００５】 ＲＳＶが引起す疾患に対する弱毒化生ワクチンは、主に２つの理由によって有
望と思われる。第１に、弱毒化生ワクチンによる感染によって、粘膜抗体と血清
抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球を含む均衡のとれた免疫反応が誘導される。第
２に、弱毒化生ワクチン候補物質または自然獲得野生型ウイルスによる幼児の感
染は、その後の再自然感染時に疾患増強を伴わない。ウイルス中和性母性抗体を
有するより低年齢の幼児に対し免疫原性を示すが、年齢６カ月以上のセロネガテ
ィブな幼児には弱毒化されている弱毒化生ワクチンを産生することは、挑戦に値
する課題であろう。弱毒化生ウイルスワクチンには、残存病原性および遺伝的不
安定性という危険性もある。
望と思われる。第１に、弱毒化生ワクチンによる感染によって、粘膜抗体と血清
抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球を含む均衡のとれた免疫反応が誘導される。第
２に、弱毒化生ワクチン候補物質または自然獲得野生型ウイルスによる幼児の感
染は、その後の再自然感染時に疾患増強を伴わない。ウイルス中和性母性抗体を
有するより低年齢の幼児に対し免疫原性を示すが、年齢６カ月以上のセロネガテ
ィブな幼児には弱毒化されている弱毒化生ワクチンを産生することは、挑戦に値
する課題であろう。弱毒化生ウイルスワクチンには、残存病原性および遺伝的不
安定性という危険性もある。
【０００６】 幾つかの研究で、外来蛋白質をコードする配列を含有するプラスミドＤＮＡを
注入することによって、外来蛋白質の発現およびその抗原に対する抗体と細胞傷
害性Ｔリンパ球反応の誘導が起こることが示された(例えば、参考文献７、８、
９を参照されたい)。免疫処置を目的として、ウイルス蛋白質を発現させるため
にプラスミドＤＮＡ接種を使用することによって、前に概説した各戦略に優る幾
つもの利点が生じ得る。第１に、ウイルス自体に対する抗体の存在下、その抗体
によるウイルスの中和のために効力を失うことなく、ウイルス抗原をコードする
ＤＮＡを投与することができる。第２に、in vivo で発現される抗原は本来のコ
ンフォメーションを示すはずであり、したがって、野生型ウイルス感染において
存在する抗原が誘導する抗体反応に類似した反応を誘導するはずである。それと
は対照的に、蛋白質の精製に使用する幾つかのプロセスは、コンフォメーション
の変化を誘発することができ、その結果、保護エピトープの免疫原性と恐らく免
疫増強が失われる恐れがある。第３に、注入したプラスミドＤＮＡからの蛋白質
の発現を、ウイルス感染細胞の場合よりかなり長い期間 in vivo で検出するこ
とができ、これによって細胞傷害性Ｔ細胞の誘導が延長し、抗体反応が増強する
という理論的な利点が得られる。第４に、抗原の in vivo 発現によって、外来
アジュバントを必要とせずに保護が得られるかもしれない。
注入することによって、外来蛋白質の発現およびその抗原に対する抗体と細胞傷
害性Ｔリンパ球反応の誘導が起こることが示された(例えば、参考文献７、８、
９を参照されたい)。免疫処置を目的として、ウイルス蛋白質を発現させるため
にプラスミドＤＮＡ接種を使用することによって、前に概説した各戦略に優る幾
つもの利点が生じ得る。第１に、ウイルス自体に対する抗体の存在下、その抗体
によるウイルスの中和のために効力を失うことなく、ウイルス抗原をコードする
ＤＮＡを投与することができる。第２に、in vivo で発現される抗原は本来のコ
ンフォメーションを示すはずであり、したがって、野生型ウイルス感染において
存在する抗原が誘導する抗体反応に類似した反応を誘導するはずである。それと
は対照的に、蛋白質の精製に使用する幾つかのプロセスは、コンフォメーション
の変化を誘発することができ、その結果、保護エピトープの免疫原性と恐らく免
疫増強が失われる恐れがある。第３に、注入したプラスミドＤＮＡからの蛋白質
の発現を、ウイルス感染細胞の場合よりかなり長い期間 in vivo で検出するこ
とができ、これによって細胞傷害性Ｔ細胞の誘導が延長し、抗体反応が増強する
という理論的な利点が得られる。第４に、抗原の in vivo 発現によって、外来
アジュバントを必要とせずに保護が得られるかもしれない。
【０００７】 本発明の譲受人に譲渡され、その開示内容が参考として本明細書に組込まれて
いる 1996年12月19日に公表された国際公開第96/04095号および米国特許第58439
13号、第5880104号、第6019980号および第6022864号において、ＲＳＶに対する
免疫反応を起こすために宿主に投与するための、非複製性ベクター、とりわけプ
ラスミドベクター、およびそれらを含む免疫原性組成物の提供が記載されている
。このようなベクターは、ＲＳＶ Ｆ蛋白質と特異的に反応する抗体および/また
は細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)を発生させるＲＳＶ Ｆ蛋白質またはＲＳＶ Ｆ
蛋白質断片をコードする第１のヌクレオチド配列、宿主中にＲＳＶ Ｆ蛋白質を
発現させるために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結合したプロモーター配
列、およびＲＳＶ Ｆ蛋白質が宿主中でベクターから in vivo で発現したときの
免疫保護能を増強するために、第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列の間
に配置された第２のヌクレオチド配列を含む。
いる 1996年12月19日に公表された国際公開第96/04095号および米国特許第58439
13号、第5880104号、第6019980号および第6022864号において、ＲＳＶに対する
免疫反応を起こすために宿主に投与するための、非複製性ベクター、とりわけプ
ラスミドベクター、およびそれらを含む免疫原性組成物の提供が記載されている
。このようなベクターは、ＲＳＶ Ｆ蛋白質と特異的に反応する抗体および/また
は細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)を発生させるＲＳＶ Ｆ蛋白質またはＲＳＶ Ｆ
蛋白質断片をコードする第１のヌクレオチド配列、宿主中にＲＳＶ Ｆ蛋白質を
発現させるために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結合したプロモーター配
列、およびＲＳＶ Ｆ蛋白質が宿主中でベクターから in vivo で発現したときの
免疫保護能を増強するために、第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列の間
に配置された第２のヌクレオチド配列を含む。
【０００８】 ＲＳＶによって発症する疾患に対して、ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするＤＮＡ
分子の投与によって免疫処置をすることができることは、上記の国際公開第96/0
4095号に記載される発明までは知られていなかった。特に、分泌形態のＲＳＶ
Ｆ蛋白質をコードする遺伝子を用いたＲＳＶ誘発疾患に対する免疫処置の効力は
、知られていなかった。ＲＳＶによる感染は重度の疾患を起こす。ＲＳＶによっ
て発症する疾患に対する保護のため、および診断用試薬やキットの調製のために
、ワクチンを含めた免疫原性製剤に使用するために、ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコード
する遺伝子を分離し、in vivo で投与するためのベクターを改良することは、有
用であり、望ましいことであろう。とりわけ、セロネガティブな幼児を含むヒト
において免疫原性で保護性であり、疾患増強(免疫増強)を引起さない改良ワクチ
ンを提供することは、望ましいことであろう。
分子の投与によって免疫処置をすることができることは、上記の国際公開第96/0
4095号に記載される発明までは知られていなかった。特に、分泌形態のＲＳＶ
Ｆ蛋白質をコードする遺伝子を用いたＲＳＶ誘発疾患に対する免疫処置の効力は
、知られていなかった。ＲＳＶによる感染は重度の疾患を起こす。ＲＳＶによっ
て発症する疾患に対する保護のため、および診断用試薬やキットの調製のために
、ワクチンを含めた免疫原性製剤に使用するために、ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコード
する遺伝子を分離し、in vivo で投与するためのベクターを改良することは、有
用であり、望ましいことであろう。とりわけ、セロネガティブな幼児を含むヒト
において免疫原性で保護性であり、疾患増強(免疫増強)を引起さない改良ワクチ
ンを提供することは、望ましいことであろう。
【０００９】 (発明の概要) 本発明は、呼吸器シンシチウムウイルスによって引起される疾患に対して宿主
を免疫処置する方法、その方法で使用される核酸分子、およびその核酸分子を利
用した診断手順に関する。とりわけ、本発明は、改良された核酸呼吸器シンシチ
ウムウイルスワクチンの提供を対象としている。
を免疫処置する方法、その方法で使用される核酸分子、およびその核酸分子を利
用した診断手順に関する。とりわけ、本発明は、改良された核酸呼吸器シンシチ
ウムウイルスワクチンの提供を対象としている。
【００１０】 本発明の一態様に従えば、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫保護反応を宿主内で
起こすために、宿主に in vivo で投与される免疫原性組成物であり、かつ、投
与される宿主内で非複製性であるプラスミドベクターを含むベクターであって、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を欠くＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードし、その
代わりに、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチド配列をコ
ードする配列を含むヌクレオチド配列と、 ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現のために前記ヌクレオチド配列と動作可能に結合した
プロモーター配列 を含むベクターを含む組成物が提供される。
起こすために、宿主に in vivo で投与される免疫原性組成物であり、かつ、投
与される宿主内で非複製性であるプラスミドベクターを含むベクターであって、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を欠くＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードし、その
代わりに、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチド配列をコ
ードする配列を含むヌクレオチド配列と、 ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現のために前記ヌクレオチド配列と動作可能に結合した
プロモーター配列 を含むベクターを含む組成物が提供される。
【００１１】 ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、トランスメンブラン領域
が欠如したＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするものであってよい。トランスメンブラ
ン領域の発現が欠如すると、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の分泌形態が生成する。ＲＳＶ Ｆ
蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、成熟したＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードす
る部分を含んでよい。
が欠如したＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするものであってよい。トランスメンブラ
ン領域の発現が欠如すると、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の分泌形態が生成する。ＲＳＶ Ｆ
蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、成熟したＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードす
る部分を含んでよい。
【００１２】 ＲＳＶ Ｆ蛋白質の in vivo 発現量の増強に有用であることが判明したひとつ
の異種シグナルペプチドは、単純疱疹ウイルスI(ＨＳＶ I)gＤのシグナルペプチ
ドである。既に引用した国際公開第96/04095号に記載のように、このような増強
された発現量は、自家シグナルペプチド配列を有するベクターと同じ投与量でそ
のベクターの免疫原性の改良をもたらす。ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードし、本発明
のこの態様によって提供されるベクターは、とりわけ、図10 に見られるような
プラスミドp82Ｍ35Ｂであってよい。
の異種シグナルペプチドは、単純疱疹ウイルスI(ＨＳＶ I)gＤのシグナルペプチ
ドである。既に引用した国際公開第96/04095号に記載のように、このような増強
された発現量は、自家シグナルペプチド配列を有するベクターと同じ投与量でそ
のベクターの免疫原性の改良をもたらす。ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードし、本発明
のこの態様によって提供されるベクターは、とりわけ、図10 に見られるような
プラスミドp82Ｍ35Ｂであってよい。
【００１３】 ＲＳＶ Ｆ蛋白質が宿主内でベクターから in vivo で発現されるとき、その免
疫保護能を増強するために、ベクターは第２のヌクレオチド配列を含んでよい。
第２のヌクレオチド配列は、異常なｍＲＮＡスプライシングを防止することによ
って、実質的に全ての転写ｍＲＮＡがＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするために、一
対のスプライス部位を含んでよい。このような第２のヌクレオチド配列は、第１
のヌクレオチド配列とプロモーター配列との間に配置されてよい。このような第
２のヌクレオチド配列は、図８に示すようなウサギβ-グロビンイントロンIIの
配列であってよい(ＳＥＱ IＤ番号:５)。
疫保護能を増強するために、ベクターは第２のヌクレオチド配列を含んでよい。
第２のヌクレオチド配列は、異常なｍＲＮＡスプライシングを防止することによ
って、実質的に全ての転写ｍＲＮＡがＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするために、一
対のスプライス部位を含んでよい。このような第２のヌクレオチド配列は、第１
のヌクレオチド配列とプロモーター配列との間に配置されてよい。このような第
２のヌクレオチド配列は、図８に示すようなウサギβ-グロビンイントロンIIの
配列であってよい(ＳＥＱ IＤ番号:５)。
【００１４】 ベクターの中に使用されるプロモーター配列は、宿主内でＲＳＶ Ｆ蛋白質の
発現をもたらす適当な任意のプロモーターであってよい。そのプロモーター配列
は、iｍｍediate early サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターであってよ
い。
発現をもたらす適当な任意のプロモーターであってよい。そのプロモーター配列
は、iｍｍediate early サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターであってよ
い。
【００１５】 本発明で提供されるベクターのいくつかは、免疫原性組成物の形でベクターを
投与した後にＲＳＶ Ｆ蛋白質の in vivo 発現によってＲＳＶ感染または疾患に
対して宿主を免疫処置するのに使用できる。
投与した後にＲＳＶ Ｆ蛋白質の in vivo 発現によってＲＳＶ感染または疾患に
対して宿主を免疫処置するのに使用できる。
【００１６】 本発明の他の態様に従えば、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫保護反応を宿主内
に起こすために、宿主にin vivo投与するためであって、本発明で提供される非
複製性ベクターおよび薬剤として許容し得るそのための担体を含む免疫原性組成
物が提供される。
に起こすために、宿主にin vivo投与するためであって、本発明で提供される非
複製性ベクターおよび薬剤として許容し得るそのための担体を含む免疫原性組成
物が提供される。
【００１７】 本発明の更に他の態様に従えば、呼吸器シンシチウムウイルスによる感染で発
症する疾患に対して、宿主を免疫処置する方法であって、本発明にて提供される
免疫原性組成物の有効量を宿主に投与することを含む方法が提供される。
症する疾患に対して、宿主を免疫処置する方法であって、本発明にて提供される
免疫原性組成物の有効量を宿主に投与することを含む方法が提供される。
【００１８】 本発明は更に、ＲＳＶによる感染で発症する疾患に対して、宿主を免疫処置す
るための免疫原として使用するときの、本発明にて提供されるベクターにまで拡
張される。その上、本発明は、ＲＳＶによる感染で発症する疾患に対して、宿主
を免疫処置するための医薬の製造における、本発明にて提供されるベクターの使
用にまで拡張される。
るための免疫原として使用するときの、本発明にて提供されるベクターにまで拡
張される。その上、本発明は、ＲＳＶによる感染で発症する疾患に対して、宿主
を免疫処置するための医薬の製造における、本発明にて提供されるベクターの使
用にまで拡張される。
【００１９】 本発明は、自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を欠き、ＲＳＶ Ｆ蛋白質の発
現量を増強する異種シグナルペプチドを含んだＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするヌ
クレオチド配列を使用する新規な方法であって、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を有するＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする遺
伝子を分離すること、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、ＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列で置換することによって、前記ヌクレオチド配列を形成すること、 前記ヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列と動作可能に連結すること
による非複製性ベクターの産生において、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫反応を
起こすために前記ベクターを宿主に投与するとき、前記制御配列はＲＳＶ Ｆ蛋
白質の発現を指示するものであること、および そのベクターを宿主に投与すること を含む方法も含んでいる。
現量を増強する異種シグナルペプチドを含んだＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードするヌ
クレオチド配列を使用する新規な方法であって、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を有するＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする遺
伝子を分離すること、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、ＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列で置換することによって、前記ヌクレオチド配列を形成すること、 前記ヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列と動作可能に連結すること
による非複製性ベクターの産生において、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫反応を
起こすために前記ベクターを宿主に投与するとき、前記制御配列はＲＳＶ Ｆ蛋
白質の発現を指示するものであること、および そのベクターを宿主に投与すること を含む方法も含んでいる。
【００２０】 本発明のこの態様に従って提供される手順は、 前記ヌクレオチド配列を免疫保護増強配列と動作可能に連結することによって
、好ましくは免疫保護増強配列を制御配列とヌクレオチド配列の間に導入するこ
とによって、宿主内でＲＳＶ Ｆ蛋白質による免疫保護を増強する 段階を更に含み得る。
、好ましくは免疫保護増強配列を制御配列とヌクレオチド配列の間に導入するこ
とによって、宿主内でＲＳＶ Ｆ蛋白質による免疫保護を増強する 段階を更に含み得る。
【００２１】 その上、本発明は、呼吸器シンシチウムウイルスによる感染によって発症する
疾患に対して、宿主を保護するワクチンを生産する方法であって、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を有するＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする第
１のヌクレオチド配列を分離すること、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、ＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列で置換することによって、第２のヌクレオチド配列を形成すること、 第２のヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列と動作可能に連結するこ
とによる、プラスミドベクターを含む非複製性ベクターの産生において、宿主内
でそのベクターから in vivo で発現するときの、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫
反応を起こすために宿主に投与するとき、その制御配列はＲＳＶ Ｆ蛋白質の発
現を指示するものであること、および そのベクターを in vivo 投与のためのワクチンとして製剤すること を含む方法を含んでいる。
疾患に対して、宿主を保護するワクチンを生産する方法であって、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を有するＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする第
１のヌクレオチド配列を分離すること、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、ＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列で置換することによって、第２のヌクレオチド配列を形成すること、 第２のヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列と動作可能に連結するこ
とによる、プラスミドベクターを含む非複製性ベクターの産生において、宿主内
でそのベクターから in vivo で発現するときの、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫
反応を起こすために宿主に投与するとき、その制御配列はＲＳＶ Ｆ蛋白質の発
現を指示するものであること、および そのベクターを in vivo 投与のためのワクチンとして製剤すること を含む方法を含んでいる。
【００２２】 宿主内でベクターから in vivo で発現するときのＲＳＶ Ｆ蛋白質の免疫保護
能を増強するために、第２のヌクレオチド配列を更に第３のヌクレオチド配列に
動作可能に連結してもよい。そのベクターはプラスミドベクターp82Ｍ35Ｂであ
ってよい。本発明は更に、本明細書で説明したベクターの免疫有効量を含む免疫
原性組成物だけでなく、この方法によって生産されるヒト宿主を含む宿主に投与
するためのワクチンも含む。
能を増強するために、第２のヌクレオチド配列を更に第３のヌクレオチド配列に
動作可能に連結してもよい。そのベクターはプラスミドベクターp82Ｍ35Ｂであ
ってよい。本発明は更に、本明細書で説明したベクターの免疫有効量を含む免疫
原性組成物だけでなく、この方法によって生産されるヒト宿主を含む宿主に投与
するためのワクチンも含む。
【００２３】 前記のように、本発明で提供されるベクターは、診断用途において有用である
。したがって、本発明の他の態様において、検体中のＲＳＶ Ｆ蛋白質の存在量
を決定する方法であって、 (a)本発明で提供される非複製性ベクターで宿主を免疫処置することによって
、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に特異的な抗体を産生する段階と、 (b)ＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体を分離する段階と、 (c)検体を分離抗体と接触させることによって、検体中に存在する任意のＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質とＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体とを含む複合体を生成させる段階と、 (d)複合体の生成量を決定する段階 を含む方法が提供される。
。したがって、本発明の他の態様において、検体中のＲＳＶ Ｆ蛋白質の存在量
を決定する方法であって、 (a)本発明で提供される非複製性ベクターで宿主を免疫処置することによって
、ＲＳＶ Ｆ蛋白質に特異的な抗体を産生する段階と、 (b)ＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体を分離する段階と、 (c)検体を分離抗体と接触させることによって、検体中に存在する任意のＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質とＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体とを含む複合体を生成させる段階と、 (d)複合体の生成量を決定する段階 を含む方法が提供される。
【００２４】 抗体を引出すために使用する非複製性ベクターは、プラスミドベクターp８２
Ｍ３５Ｂであってよい。
Ｍ３５Ｂであってよい。
【００２５】 本発明は、検体中のＲＳＶ Ｆ蛋白質の存在を検出するための診断キットであ
って、 (a)ＲＳＶ Ｆ蛋白質に特異的な抗体を産生するための、本発明で提供される非
複製性ベクターと、 (b)前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体を分離するための分離手段と、 (c)分離したＲＳＶ Ｆ特異抗体を検体と接触させることによって、検体中に存
在する任意のＲＳＶ Ｆ蛋白質とＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体とを含む複合体を生成
させる接触手段と、 (d)複合体の生成量を決定するための同定手段 を含むキットも含む。
って、 (a)ＲＳＶ Ｆ蛋白質に特異的な抗体を産生するための、本発明で提供される非
複製性ベクターと、 (b)前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体を分離するための分離手段と、 (c)分離したＲＳＶ Ｆ特異抗体を検体と接触させることによって、検体中に存
在する任意のＲＳＶ Ｆ蛋白質とＲＳＶ Ｆ蛋白質特異抗体とを含む複合体を生成
させる接触手段と、 (d)複合体の生成量を決定するための同定手段 を含むキットも含む。
【００２６】 本発明は更に、ＲＳＶ Ｆ蛋白質特異ポリクローナル抗体を産生する方法であ
って、本明細書に記述した免疫処置法の使用を含み、免疫処置した動物からＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質特異ポリクローナル抗体を分離する段階を更に含む方法も対象とす
る。
って、本明細書に記述した免疫処置法の使用を含み、免疫処置した動物からＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質特異ポリクローナル抗体を分離する段階を更に含む方法も対象とす
る。
【００２７】 本発明は、ＲＳＶのＦ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を産生する方法で
あって、 (a)本発明で提供される非複製性ベクターを構築する段階、 (b)そのベクターを少なくとも１匹のマウスに投与することによって、少なく
とも１匹の免疫マウスを産生する段階、 (c)少なくとも１匹のその免疫マウスからＢリンパ球を除く段階、 (d)少なくとも１匹のその免疫マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合
することによって、ハイブリドーマを産生する段階、 (e)そのハイブリドーマをクローニングする段階、 (f)抗Ｆ蛋白質抗体を産生するクローンを選択する段階、 (g)抗Ｆ蛋白質抗体産生クローンを培養する段階、および (h)抗Ｆ蛋白質モノクローナル抗体を分離する段階 を含む方法も対象とする。
あって、 (a)本発明で提供される非複製性ベクターを構築する段階、 (b)そのベクターを少なくとも１匹のマウスに投与することによって、少なく
とも１匹の免疫マウスを産生する段階、 (c)少なくとも１匹のその免疫マウスからＢリンパ球を除く段階、 (d)少なくとも１匹のその免疫マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合
することによって、ハイブリドーマを産生する段階、 (e)そのハイブリドーマをクローニングする段階、 (f)抗Ｆ蛋白質抗体を産生するクローンを選択する段階、 (g)抗Ｆ蛋白質抗体産生クローンを培養する段階、および (h)抗Ｆ蛋白質モノクローナル抗体を分離する段階 を含む方法も対象とする。
【００２８】 本出願明細書において、「ＲＳＶ Ｆ蛋白質」という用語は、(１)長さの完全
な成熟ＲＳＶ Ｆ蛋白質であって、様々なＲＳＶ株中に自然に発生する変異を含
め、アミノ酸配列に変異を有する蛋白質、(２)トランスメンブラン領域を欠いた
ＲＳＶ Ｆ蛋白質の分泌形態、および(３)ＲＳＶ Ｆ蛋白質の機能的類縁体、を定
義するために使用される。本出願明細書において、第１の蛋白質が第２の蛋白質
と免疫学的に関連し、および/または第２の蛋白質と同じ機能を有する場合、第
１の蛋白質は第２の蛋白質の「機能的類縁体」である。機能的類縁体は、例えば
、その蛋白質の断片、または、その置換型、付加型または欠失型の突然変異体で
あってよい。ＲＳＶ Ｆ蛋白質と特異的に反応する抗体および/またはＣＴＬを生
じるＲＳＶ Ｆ蛋白質断片が、その中に含まれる。
な成熟ＲＳＶ Ｆ蛋白質であって、様々なＲＳＶ株中に自然に発生する変異を含
め、アミノ酸配列に変異を有する蛋白質、(２)トランスメンブラン領域を欠いた
ＲＳＶ Ｆ蛋白質の分泌形態、および(３)ＲＳＶ Ｆ蛋白質の機能的類縁体、を定
義するために使用される。本出願明細書において、第１の蛋白質が第２の蛋白質
と免疫学的に関連し、および/または第２の蛋白質と同じ機能を有する場合、第
１の蛋白質は第２の蛋白質の「機能的類縁体」である。機能的類縁体は、例えば
、その蛋白質の断片、または、その置換型、付加型または欠失型の突然変異体で
あってよい。ＲＳＶ Ｆ蛋白質と特異的に反応する抗体および/またはＣＴＬを生
じるＲＳＶ Ｆ蛋白質断片が、その中に含まれる。
【００２９】 本発明はさらに、図に係る以下の概括的な説明および実施例からさらに詳しく
理解されよう。
理解されよう。
【００３０】 (発明の全般的説明) 上記のように、本発明は一般に、ＤＮＡを含むポリヌクレオチド、呼吸系発疹
ウイルス(ＲＳＶ)による感染に対して防御を獲得する免疫、および特別のベクタ
ーを利用する診断法に関する。本発明において、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する
ヌクレオチド配列を含ませるために幾つかの組換えベクターが構築された。ここ
に記載されたベクターのうちのあるものはまた、前記の国際公開第96/04095号に
記載されているが、それら調製の記載以外、本発明の部分を形成しておらず、免
疫化研究における使用は完全さを期するため、また比較のためにここに含まれる
。
ウイルス(ＲＳＶ)による感染に対して防御を獲得する免疫、および特別のベクタ
ーを利用する診断法に関する。本発明において、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する
ヌクレオチド配列を含ませるために幾つかの組換えベクターが構築された。ここ
に記載されたベクターのうちのあるものはまた、前記の国際公開第96/04095号に
記載されているが、それら調製の記載以外、本発明の部分を形成しておらず、免
疫化研究における使用は完全さを期するため、また比較のためにここに含まれる
。
【００３１】 自己由来シグナルペプチドをコード化する配列を有する完全長ＲＳＶ Ｆ遺伝
子のヌクレオチド配列を図２(ＳＥＱ IＤ番号:１)に示す。ここに用意されたあ
る一定の構築物は、完全長ＲＳＶ Ｆ(ＳＥＱ IＤ番号:２)蛋白をコード化するヌ
クレオチド配列を含むが、他のものは、末端コドンを膜内外のコード化領域(図
３を参照、ＳＥＱ IＤ番号:３)のすぐ上流への挿入により修飾されたＲＳＶ Ｆ
遺伝子を含み、蛋白の膜内外部分の発現を防止し、膜内外領域(ＳＥＱ IＤ番号:
４)を欠如する分泌形または切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白を産生する。さらに、本発明に
従ってここに用意されたある一定の構築物は、自生のシグナルペプチド配列より
はむしろ、非相同性シグナルペプチド配列をコード化する核酸配列を含み蛋白発
現の数および免疫原性の増強を提供する。具体的に、ＨＳＶ IgＤに関するシグ
ナルペプチド配列は、好ましい実施形態におけるこのような目的のために使用さ
れる。しかしながら、ヒト組織のプラスミノーゲン活性化因子(ＴＰＡ)などの他
の非相同性シグナルペプチドを使用してもよい。
子のヌクレオチド配列を図２(ＳＥＱ IＤ番号:１)に示す。ここに用意されたあ
る一定の構築物は、完全長ＲＳＶ Ｆ(ＳＥＱ IＤ番号:２)蛋白をコード化するヌ
クレオチド配列を含むが、他のものは、末端コドンを膜内外のコード化領域(図
３を参照、ＳＥＱ IＤ番号:３)のすぐ上流への挿入により修飾されたＲＳＶ Ｆ
遺伝子を含み、蛋白の膜内外部分の発現を防止し、膜内外領域(ＳＥＱ IＤ番号:
４)を欠如する分泌形または切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白を産生する。さらに、本発明に
従ってここに用意されたある一定の構築物は、自生のシグナルペプチド配列より
はむしろ、非相同性シグナルペプチド配列をコード化する核酸配列を含み蛋白発
現の数および免疫原性の増強を提供する。具体的に、ＨＳＶ IgＤに関するシグ
ナルペプチド配列は、好ましい実施形態におけるこのような目的のために使用さ
れる。しかしながら、ヒト組織のプラスミノーゲン活性化因子(ＴＰＡ)などの他
の非相同性シグナルペプチドを使用してもよい。
【００３２】 コード化ＲＳＶ Ｆ蛋白の発現のために、実際にはＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化す
るヌクレオチド配列をプロモーター配列に結合させる。このプロモーター配列は
直接早期のサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターであってもよい。このプ
ロモーターは引用文献13 に記載されている。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲなどの
構築プロモーター類、メタロチオニンプロモーターなどの誘導プロモーター類、
および組織特異的プロモーター類など任意の他の好適なプロモーターを使用して
もよい。
るヌクレオチド配列をプロモーター配列に結合させる。このプロモーター配列は
直接早期のサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターであってもよい。このプ
ロモーターは引用文献13 に記載されている。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲなどの
構築プロモーター類、メタロチオニンプロモーターなどの誘導プロモーター類、
および組織特異的プロモーター類など任意の他の好適なプロモーターを使用して
もよい。
【００３３】 動物に投与する場合、投与される動物における抗体反応により示されるように
、ここに提供されたベクター類はin vivo ＲＳＶ Ｆ蛋白発現で働く。下記にさ
らに詳述するように、このような抗体類は、ここで試料中のＲＳＶ蛋白の検出に
用いることが可能である。コード化されたＲＳＶ Ｆ蛋白が、プラスミドpＸＬ１
(図４)のように膜内外領域を欠いているＲＳＶ Ｆ蛋白の形態である場合、下記
実施例に見られるように、ベクターの投与は、抗体および細胞介在免疫反応を中
和する生ＲＳＶウイルスおよび免疫化された動物における免疫強化の欠如による
チャレンジに対して、マウスおよびコトンラットにおいて防御を提供した。
、ここに提供されたベクター類はin vivo ＲＳＶ Ｆ蛋白発現で働く。下記にさ
らに詳述するように、このような抗体類は、ここで試料中のＲＳＶ蛋白の検出に
用いることが可能である。コード化されたＲＳＶ Ｆ蛋白が、プラスミドpＸＬ１
(図４)のように膜内外領域を欠いているＲＳＶ Ｆ蛋白の形態である場合、下記
実施例に見られるように、ベクターの投与は、抗体および細胞介在免疫反応を中
和する生ＲＳＶウイルスおよび免疫化された動物における免疫強化の欠如による
チャレンジに対して、マウスおよびコトンラットにおいて防御を提供した。
【００３４】 組換えベクターはまた、ヌクレオチド配列をコード化するＲＳＶ Ｆ蛋白に隣
接して位置する第２のヌクレオチド配列を含んで、宿主の in vivo で発現され
る際にＲＳＶ Ｆ蛋白の免疫防御能力を増強することもできる。このような増強
は、in vivo 発現の増大、例えばｍＲＮＡ安定性の増大、転写および/または翻
訳の増大により与えることができる。この追加配列は、プロモーター配列とＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白コード化配列との間に位置することが好ましい。
接して位置する第２のヌクレオチド配列を含んで、宿主の in vivo で発現され
る際にＲＳＶ Ｆ蛋白の免疫防御能力を増強することもできる。このような増強
は、in vivo 発現の増大、例えばｍＲＮＡ安定性の増大、転写および/または翻
訳の増大により与えることができる。この追加配列は、プロモーター配列とＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白コード化配列との間に位置することが好ましい。
【００３５】 この増強配列には、転写および翻訳中の異所ｍＲＮＡスプライシングを防止す
る１対のスプライス部位を含んでもよく、その結果、実質的に全ての転写ｍＲＮ
Ａが、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する。具体的には、図７に示されたウサギβ-グ
ロビンイントロンII配列(ＳＥＱ IＤ番号:５)は、引用文献15 にも記載されてい
るように、このようなスプライス部位を備えることができる。
る１対のスプライス部位を含んでもよく、その結果、実質的に全ての転写ｍＲＮ
Ａが、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する。具体的には、図７に示されたウサギβ-グ
ロビンイントロンII配列(ＳＥＱ IＤ番号:５)は、引用文献15 にも記載されてい
るように、このようなスプライス部位を備えることができる。
【００３６】 イントロンII配列、ＣＭＶプロモーター、および膜内外領域を欠く切頭形ＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白にコード化するヌクレオチド配列を含有する構築物、すなわちプラス
ミドpＸＬ２(図５)は、下記の実施例に見られるように、生ＲＳＶによるチャレ
ンジに対してマウスにおける完全防御を誘導した。さらに、イントロンII配列、
ＣＭＶプロモーター、および完全長ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化するヌクレオチド
配列を含有する構築物、すなわちプラスミドpＸＬ４(図７)は、下記の実施例に
見られるように、生ＲＳＶによるチャレンジに対してマウスにおける防御を提供
した。プラスミドpＸＬ１、pＸＬ２、pＸＬ３およびpＸＬ４は全て、自己由来シ
グナルペプチド配列を含有し、前記国際公開第96/04095号に従って構築される。
Ｖ Ｆ蛋白にコード化するヌクレオチド配列を含有する構築物、すなわちプラス
ミドpＸＬ２(図５)は、下記の実施例に見られるように、生ＲＳＶによるチャレ
ンジに対してマウスにおける完全防御を誘導した。さらに、イントロンII配列、
ＣＭＶプロモーター、および完全長ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化するヌクレオチド
配列を含有する構築物、すなわちプラスミドpＸＬ４(図７)は、下記の実施例に
見られるように、生ＲＳＶによるチャレンジに対してマウスにおける防御を提供
した。プラスミドpＸＬ１、pＸＬ２、pＸＬ３およびpＸＬ４は全て、自己由来シ
グナルペプチド配列を含有し、前記国際公開第96/04095号に従って構築される。
【００３７】 イントロンII配列、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ IgＤシグナルペプチドコー
ド化配列、および膜内外領域を欠く切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化するヌクレ
オチド配列を含有する構築物、すなわちプラスミドp82Ｍ35Ｂ(図10)は、本発明
に従い下記の実施例に見られるように、心臓毒による前処理が完全保護を授ける
pＸＬ２にとり必要とされる条件下、心臓毒の前処理無しで完全防御を誘導した
。
ド化配列、および膜内外領域を欠く切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化するヌクレ
オチド配列を含有する構築物、すなわちプラスミドp82Ｍ35Ｂ(図10)は、本発明
に従い下記の実施例に見られるように、心臓毒による前処理が完全保護を授ける
pＸＬ２にとり必要とされる条件下、心臓毒の前処理無しで完全防御を誘導した
。
【００３８】 ここで提供されたベクターはまた、ＲＳＶからのさらなる抗原をコード化する
第３のヌクレオチド配列、少なくとも１つの他の病原体またはサイトカインなど
の少なくとも１つの免疫調節剤も含んでよい。このようなベクターは、キメラ構
造またはビシストロン構造における前記第３のヌクレオチド配列を含んでもよい
。あるいは、第３のヌクレオチド配列を含有するベクター類を個々に構築しても
よく、ここに提供された核酸分子と共に宿主に共に投与してもよい。
第３のヌクレオチド配列、少なくとも１つの他の病原体またはサイトカインなど
の少なくとも１つの免疫調節剤も含んでよい。このようなベクターは、キメラ構
造またはビシストロン構造における前記第３のヌクレオチド配列を含んでもよい
。あるいは、第３のヌクレオチド配列を含有するベクター類を個々に構築しても
よく、ここに提供された核酸分子と共に宿主に共に投与してもよい。
【００３９】 本発明の種々の実施形態は、ワクチン接種、ＲＳＶ感染の診断と治療の分野に
多くの応用を有することは当業者にとって実に明白となる。このような利用につ
いて、さらに非限定の検討をさらに下記に示す。
多くの応用を有することは当業者にとって実に明白となる。このような利用につ
いて、さらに非限定の検討をさらに下記に示す。
【００４０】 １.ワクチン調製並びに利用 ワクチンとして用いるのに好適な免疫原性組成物は、ここに開示されるような
ＲＳＶ Ｆ遺伝子類およびベクター類から調製できる。このワクチンは、被験者
に抗Ｆ抗体の産生などの免疫反応を誘発する。核酸を含有するワクチンなどの免
疫原組成物は、ポリヌクレオチド投与のために生理学的に許容できる液体溶液ま
たは乳濁液での注射剤として調製可能である。この核酸は、核酸リポソーム(例
えば、引用文献17 の国際公開第9324640号に記載されるような)として当業界に
知られるレシチンリポソーム類または他のリポソーム類などのリポソーム類と関
連づけられ、またはこの核酸は、さらに以下に詳細が記載されるようにアジュバ
ントと関連づけられる。カチオン性脂質を含んで成るリポソーム類は、自発的に
且つ迅速にＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリアニオン類と相互作用し、ポリヌクレ
オチドの 100％まで捕捉するリポソーム/または核酸複合体となる。さらに、ポ
リカチオン性複合体は細胞膜と融合し、リソソーム区画の分解性酵素を迂回する
ポリヌクレオチドの細胞内送達を生じさせる。公表されたＰＣＴ出願国際公開第
94/27435号には、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含んで成る遺伝子免
疫化に関する組成物を記載している。カルシウムイオン類、ウイルス蛋白および
他のトランスフェクション促進剤などの核酸の細胞内取り込みを補助する試薬の
使用が有利と成り得る。
ＲＳＶ Ｆ遺伝子類およびベクター類から調製できる。このワクチンは、被験者
に抗Ｆ抗体の産生などの免疫反応を誘発する。核酸を含有するワクチンなどの免
疫原組成物は、ポリヌクレオチド投与のために生理学的に許容できる液体溶液ま
たは乳濁液での注射剤として調製可能である。この核酸は、核酸リポソーム(例
えば、引用文献17 の国際公開第9324640号に記載されるような)として当業界に
知られるレシチンリポソーム類または他のリポソーム類などのリポソーム類と関
連づけられ、またはこの核酸は、さらに以下に詳細が記載されるようにアジュバ
ントと関連づけられる。カチオン性脂質を含んで成るリポソーム類は、自発的に
且つ迅速にＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリアニオン類と相互作用し、ポリヌクレ
オチドの 100％まで捕捉するリポソーム/または核酸複合体となる。さらに、ポ
リカチオン性複合体は細胞膜と融合し、リソソーム区画の分解性酵素を迂回する
ポリヌクレオチドの細胞内送達を生じさせる。公表されたＰＣＴ出願国際公開第
94/27435号には、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含んで成る遺伝子免
疫化に関する組成物を記載している。カルシウムイオン類、ウイルス蛋白および
他のトランスフェクション促進剤などの核酸の細胞内取り込みを補助する試薬の
使用が有利と成り得る。
【００４１】 ポリヌクレオチド免疫原性製剤はまた、生分解性の持効性粒子を含むマイクロ
カプセルとして製剤化することもできる。このように米国特許第5,151,264号に
は、バイオベクタースプラ分子(Ｂio Ｖecteurs Ｓupra Ｍoleculaires)(ＢＶＳ
Ｍ)と呼ばれたリン脂質/糖脂質/多糖種の微粒子担体を記載している。この微粒
子担体は、その層のうちの１層に生物活性を有する多様な分子を輸送するために
意図される。
カプセルとして製剤化することもできる。このように米国特許第5,151,264号に
は、バイオベクタースプラ分子(Ｂio Ｖecteurs Ｓupra Ｍoleculaires)(ＢＶＳ
Ｍ)と呼ばれたリン脂質/糖脂質/多糖種の微粒子担体を記載している。この微粒
子担体は、その層のうちの１層に生物活性を有する多様な分子を輸送するために
意図される。
【００４２】 米国特許第5,075,109号には、50：50 ポリ(ＤＬ-ラクチデコ-グリコリド)中、
抗原のトリフェニル化キーホールリンペットヘモシニアンおよびブドウ球菌エン
テロトキシンＢのカプセル化を記載している。カプセル化用の他のポリマー類に
は、ポリ(グリコリド)、ポリ(ＤＬ-ラクチド-コ-グリコリド)、コポリオキサレ
ート類、ポリカプロラクトン、ポリ(ラクチド-コ-カプロラクトン)、ポリ(エス
テルアミド類)、ポリオルトエステル類、およびポリ(８-ヒドロキシ酪酸)および
ポリ無水物などが考えられる。
抗原のトリフェニル化キーホールリンペットヘモシニアンおよびブドウ球菌エン
テロトキシンＢのカプセル化を記載している。カプセル化用の他のポリマー類に
は、ポリ(グリコリド)、ポリ(ＤＬ-ラクチド-コ-グリコリド)、コポリオキサレ
ート類、ポリカプロラクトン、ポリ(ラクチド-コ-カプロラクトン)、ポリ(エス
テルアミド類)、ポリオルトエステル類、およびポリ(８-ヒドロキシ酪酸)および
ポリ無水物などが考えられる。
【００４３】 公表されたＰＣＴ出願国際公開第91/06282号には、複数の生体接着ミクロスフ
ェア類および抗原類を含んで成る送達媒体を記載している。ミクロスフェアは、
デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンである。この
送達媒体は、特に鼻粘膜を通ってのワクチンの取り込み用のものである。この送
達媒体は、さらに吸収増強剤を含んでよい。
ェア類および抗原類を含んで成る送達媒体を記載している。ミクロスフェアは、
デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンである。この
送達媒体は、特に鼻粘膜を通ってのワクチンの取り込み用のものである。この送
達媒体は、さらに吸収増強剤を含んでよい。
【００４４】 ＲＳＶ Ｆ遺伝子並びにベクター類は、それと適合する製剤上許容できる賦形
剤と混合することができる。このような賦形剤としては、水、生理食塩水、デキ
ストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを挙げること
ができる。この免疫原性組成物およびワクチンは、その効果を強化するために湿
潤剤または乳化剤、pＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの補助剤をさらに含有
してもよい。この免疫原性組成物およびワクチンを、可能ならば局所麻酔による
注射部位の前処理後、皮下注射、静脈注射、皮内注射または筋内注射により非経
口的に投与してもよい。あるいは、本発明に従って形成された免疫原性組成物は
、粘膜表面で免疫反応を誘発する様式で製剤化並びに送達されてもよい。このよ
うに免疫原性組成物は、例えば鼻または経口(胃内)経路により粘膜表面に投与で
きる。あるいは、坐薬および経口製剤などの他の投与態様を所望できる。坐薬に
関して、結合剤および担体には、例えば、ポリアルカレングリコール類またはト
リグリセリド類を含んでよい。経口製剤は、通常、例えば製薬グレードのサッカ
リン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの初発剤を含んでよい。
剤と混合することができる。このような賦形剤としては、水、生理食塩水、デキ
ストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを挙げること
ができる。この免疫原性組成物およびワクチンは、その効果を強化するために湿
潤剤または乳化剤、pＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの補助剤をさらに含有
してもよい。この免疫原性組成物およびワクチンを、可能ならば局所麻酔による
注射部位の前処理後、皮下注射、静脈注射、皮内注射または筋内注射により非経
口的に投与してもよい。あるいは、本発明に従って形成された免疫原性組成物は
、粘膜表面で免疫反応を誘発する様式で製剤化並びに送達されてもよい。このよ
うに免疫原性組成物は、例えば鼻または経口(胃内)経路により粘膜表面に投与で
きる。あるいは、坐薬および経口製剤などの他の投与態様を所望できる。坐薬に
関して、結合剤および担体には、例えば、ポリアルカレングリコール類またはト
リグリセリド類を含んでよい。経口製剤は、通常、例えば製薬グレードのサッカ
リン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの初発剤を含んでよい。
【００４５】 免疫原性製剤並びにワクチンは、投薬剤形に適合した様式、および治療上効果
的であり、防御的および免疫原性となるような用量で投与される。投与量は、例
えばＲＳＶ Ｆ蛋白およびそれに対する抗体を合成し、要すれば細胞介在の免疫
反応を生じさせる個々の免疫系の能力など治療を受ける被験者に依存する。投与
に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断に依る。しかしながら、好適な投薬
量の範囲は、当業者により容易に決定でき、ＲＳＶ Ｆ遺伝子およびベクターの
約１μgから約１ｍgのレベルであり得る。初発投与並びに追加抗原投与量に係る
好適な用法-用量もまた変わり得るが、初発投与に引き続く投与を含んでもよい
。投薬量は、投与経路にも依存し、宿主のサイズに従って変えられる。１種の病
原体のみに対して防御するワクチンは単価ワクチンである。幾つかの病原体の抗
原物質を含むワクチンは、組み合わせワクチンであり、また本発明に属すことが
できる。このような組み合わせワクチンは、例えば種々の病原体、または同一病
原体の種々の株、または種々の病原体の組み合わせからの物質を含む。
的であり、防御的および免疫原性となるような用量で投与される。投与量は、例
えばＲＳＶ Ｆ蛋白およびそれに対する抗体を合成し、要すれば細胞介在の免疫
反応を生じさせる個々の免疫系の能力など治療を受ける被験者に依存する。投与
に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断に依る。しかしながら、好適な投薬
量の範囲は、当業者により容易に決定でき、ＲＳＶ Ｆ遺伝子およびベクターの
約１μgから約１ｍgのレベルであり得る。初発投与並びに追加抗原投与量に係る
好適な用法-用量もまた変わり得るが、初発投与に引き続く投与を含んでもよい
。投薬量は、投与経路にも依存し、宿主のサイズに従って変えられる。１種の病
原体のみに対して防御するワクチンは単価ワクチンである。幾つかの病原体の抗
原物質を含むワクチンは、組み合わせワクチンであり、また本発明に属すことが
できる。このような組み合わせワクチンは、例えば種々の病原体、または同一病
原体の種々の株、または種々の病原体の組み合わせからの物質を含む。
【００４６】 ベクター類が、リン酸緩衝生理食塩水中 0.05％から 0.1％溶液として一般に
使用されるアジュバント類と共に投与されると、免疫原性は有意に改善される。
アジュバント類は抗原の免疫原性を増強するが、必ずしもそれ自体が免疫原性で
はない。アジュバント類は投与部位近くの局所に抗原を保持することにより作用
し、免疫系の細胞に対する抗原の緩やかな放出の維持を促進する貯留効果を生じ
させる。アジュバント類はまた、貯留抗原に対し免疫系の細胞を引きつけること
ができ、そのような細胞が免疫反応を誘発するように刺激できる。
使用されるアジュバント類と共に投与されると、免疫原性は有意に改善される。
アジュバント類は抗原の免疫原性を増強するが、必ずしもそれ自体が免疫原性で
はない。アジュバント類は投与部位近くの局所に抗原を保持することにより作用
し、免疫系の細胞に対する抗原の緩やかな放出の維持を促進する貯留効果を生じ
させる。アジュバント類はまた、貯留抗原に対し免疫系の細胞を引きつけること
ができ、そのような細胞が免疫反応を誘発するように刺激できる。
【００４７】 免疫刺激剤またはアジュバント類は、例えばワクチンに対する宿主の免疫反応
を改善するために長年使用されてきた。したがって、アジュバント類は、抗原に
対する免疫反応を増強することが認められてきた。しかしながら、これらのアジ
ュバントの幾つかは毒性があり、ヒトおよび多数の動物における使用を不都合に
させる望ましくない副作用を引き起こし得る。実際、水酸化アルミニウムおよび
リン酸アルミニウム(一般に集合的にアルムと呼ばれる)のみが、通常ヒトおよび
獣医用ワクチンにおけるアジュバントとして使用される。
を改善するために長年使用されてきた。したがって、アジュバント類は、抗原に
対する免疫反応を増強することが認められてきた。しかしながら、これらのアジ
ュバントの幾つかは毒性があり、ヒトおよび多数の動物における使用を不都合に
させる望ましくない副作用を引き起こし得る。実際、水酸化アルミニウムおよび
リン酸アルミニウム(一般に集合的にアルムと呼ばれる)のみが、通常ヒトおよび
獣医用ワクチンにおけるアジュバントとして使用される。
【００４８】 広範囲の外因性アジュバントおよび他の免疫調節物質は、抗原に対し効力のあ
る免疫反応を誘発することができる。これらには、膜蛋白抗原に対して錯体を作
るサポニン類が挙げられ、モノホリル脂質Ａ、ＱＳ21 およびポリホスファゼン
と同様、免疫刺激複合体(ＩＳＣＯＭＳ)、鉱油との複雑なポリマー、鉱油中の殺
菌マイコバクテリア、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド(ＭＤ
Ｐ)およびリポ多糖(ＬＰＳ)などの細菌産生物を産生する。
る免疫反応を誘発することができる。これらには、膜蛋白抗原に対して錯体を作
るサポニン類が挙げられ、モノホリル脂質Ａ、ＱＳ21 およびポリホスファゼン
と同様、免疫刺激複合体(ＩＳＣＯＭＳ)、鉱油との複雑なポリマー、鉱油中の殺
菌マイコバクテリア、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド(ＭＤ
Ｐ)およびリポ多糖(ＬＰＳ)などの細菌産生物を産生する。
【００４９】 本発明の詳細な実施形態において、ＲＳＶのＦ蛋白をコード化する第１のヌク
レオチド配列を含んで成るベクターは、免疫系の細胞など選択された細胞に対し
てこのベクターを標的にする標的分子と協働して送達できる。
レオチド配列を含んで成るベクターは、免疫系の細胞など選択された細胞に対し
てこのベクターを標的にする標的分子と協働して送達できる。
【００５０】 ポリヌクレオチドは、多様な方法、例えばウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)をコード
化するＤＮＡで被覆された金ミクロ発射物のマウスの皮膚への導入は、マウスに
抗ＢＧＨ抗体を産生させることを開示したＴangら(引用文献10)の方法、他方、
ジェットインジェクタが生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪および哺乳動物の組織に
トランスフェクションするのに使用できることを示したＦurthら(引用文献11)の
方法により宿主に送達可能である。
化するＤＮＡで被覆された金ミクロ発射物のマウスの皮膚への導入は、マウスに
抗ＢＧＨ抗体を産生させることを開示したＴangら(引用文献10)の方法、他方、
ジェットインジェクタが生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪および哺乳動物の組織に
トランスフェクションするのに使用できることを示したＦurthら(引用文献11)の
方法により宿主に送達可能である。
【００５１】 ２.イムノアッセイ 本発明のＲＳＶ Ｆ遺伝子およびベクター類は、酵素結合免疫吸着法(ＥＬＩＳ
Ａ)、ＲＩＡsおよび他の非酵素的結合抗体結合アッセイまたは当業界に知られた
方法などのイムノアッセイでの利用のために抗Ｆ抗体の生成に係る免疫原として
有用である。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、先ずベクターを宿主に投与し、ＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白に特異的な抗体を生成する。これらのＲＳＶ Ｆ特異的抗体を、選択さ
れた表面、例えばポリスチレン微量定量プレートのウェルなどの抗体を結合でき
る表面上に固定化する。不完全に吸着された抗体を除去するために洗浄後、試験
試料に関して抗原的に中性であると知られているウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)の
溶液などの非特異的蛋白を選択された表面に結合させ得る。これは、固定化表面
上の非特異的吸着部位の遮断を可能にし、したがって抗血清の表面上への非特異
的結合により生じた背景を減じることができる。
Ａ)、ＲＩＡsおよび他の非酵素的結合抗体結合アッセイまたは当業界に知られた
方法などのイムノアッセイでの利用のために抗Ｆ抗体の生成に係る免疫原として
有用である。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、先ずベクターを宿主に投与し、ＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白に特異的な抗体を生成する。これらのＲＳＶ Ｆ特異的抗体を、選択さ
れた表面、例えばポリスチレン微量定量プレートのウェルなどの抗体を結合でき
る表面上に固定化する。不完全に吸着された抗体を除去するために洗浄後、試験
試料に関して抗原的に中性であると知られているウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)の
溶液などの非特異的蛋白を選択された表面に結合させ得る。これは、固定化表面
上の非特異的吸着部位の遮断を可能にし、したがって抗血清の表面上への非特異
的結合により生じた背景を減じることができる。
【００５２】 次いで固定化表面を、臨床的または生物学的材料などの試料と接触させ、免疫
複合体(抗原/抗体)形成に資した方法で試験する。この方法は、ＢＳＡ、ウシガ
ンマグロブリン(ＢＧＧ)および/またはリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)/Ｔｗeen
の溶液などの希釈剤で試料を希釈することを含んでもよい。次に試料を、約20℃
から 37℃の温度範囲などで約２時間から４時間培養させる。培養後、試料接触
面を洗浄し、非免疫複合体物質を除去する。洗浄方法は、ＰＢＳ/Ｔｗeen また
はホウ酸緩衝剤などの溶液での洗浄を含んでよい。試験試料と結合ＲＳＶ Ｆ特
異的抗体との間の特異的免疫複合体の形成、引き続く洗浄後、免疫複合体形成の
発生率および平均量が決定できる。
複合体(抗原/抗体)形成に資した方法で試験する。この方法は、ＢＳＡ、ウシガ
ンマグロブリン(ＢＧＧ)および/またはリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)/Ｔｗeen
の溶液などの希釈剤で試料を希釈することを含んでもよい。次に試料を、約20℃
から 37℃の温度範囲などで約２時間から４時間培養させる。培養後、試料接触
面を洗浄し、非免疫複合体物質を除去する。洗浄方法は、ＰＢＳ/Ｔｗeen また
はホウ酸緩衝剤などの溶液での洗浄を含んでよい。試験試料と結合ＲＳＶ Ｆ特
異的抗体との間の特異的免疫複合体の形成、引き続く洗浄後、免疫複合体形成の
発生率および平均量が決定できる。
【００５３】 生物材料 ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する遺伝子を含み、ここに言及するある一定のプラ
スミドは、ブダペスト条約に従って本願書の出願前に、米国 20110-2209 バージ
ニア州マナサス、10801大学通り、アメリカ型培養収集(Ａｍerica Ｔype Ｃultu
re Ｃollection)(ＡＴＣＣ)に寄託されている。寄託プラスミドの試料は、これ
または米国特許出願に基づき特許を認可する上で公衆にとって入手できることに
なり、寄託物の入手に関する全ての制限はこの時点で除かれる。寄託保管所が生
存試料を施行できない場合、この寄託物は交換されることになる。寄託された実
施形態が発明の例証としてのみ意図されるものであることから、ここに記載され
特許請求された発明は、寄託プラスミドによる範囲において限定されない。本出
願に記載されるものと同様のまたは等しい抗原をコード化する任意の等しいかま
たは同様のプラスミドが本発明の範囲内にある。
スミドは、ブダペスト条約に従って本願書の出願前に、米国 20110-2209 バージ
ニア州マナサス、10801大学通り、アメリカ型培養収集(Ａｍerica Ｔype Ｃultu
re Ｃollection)(ＡＴＣＣ)に寄託されている。寄託プラスミドの試料は、これ
または米国特許出願に基づき特許を認可する上で公衆にとって入手できることに
なり、寄託物の入手に関する全ての制限はこの時点で除かれる。寄託保管所が生
存試料を施行できない場合、この寄託物は交換されることになる。寄託された実
施形態が発明の例証としてのみ意図されるものであることから、ここに記載され
特許請求された発明は、寄託プラスミドによる範囲において限定されない。本出
願に記載されるものと同様のまたは等しい抗原をコード化する任意の等しいかま
たは同様のプラスミドが本発明の範囲内にある。
【００５４】 プラスミド ＡＴＣＣ名称 寄託日 pＸＬ１ 97167 1995年5月30日 pＸＬ２ 97168 1995年5月30日 pＸＬ３ 97169 1995年5月30日 pＸＬ４ 97170 1995年5月30日 p82Ｍ35Ｂ 203790 1999年2月23日 実施例 上記開示は、広く本発明を説明する。より完全な理解は、以下の具体的実施例
を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、単に例証目的のた
めに説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。同等物の形体
変化および代用物の変化は、状況を示唆でき、または都合よくできるように熟慮
されている。特殊な用語がここでは用いられているが、このような用語は、説明
上意図されているものであり、限定目的のためではない。
を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、単に例証目的のた
めに説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。同等物の形体
変化および代用物の変化は、状況を示唆でき、または都合よくできるように熟慮
されている。特殊な用語がここでは用いられているが、このような用語は、説明
上意図されているものであり、限定目的のためではない。
【００５５】 分子遺伝学、蛋白生化学および免疫学の方法を用いるが、本開示において明白
には説明されず、これらの実施例は、科学文献に詳細に記載されており、十分に
当業者の技量内にあるものである。
には説明されず、これらの実施例は、科学文献に詳細に記載されており、十分に
当業者の技量内にあるものである。
【００５６】 実施例１ 本実施例は、ＲＳＶ Ｆ遺伝子を含有するベクターの構築を説明する。
【００５７】 図１は、呼吸系発疹ウイルスのＦ蛋白をコード化する遺伝子の制限マップを示
し、図２は、完全長のＲＳＶ Ｆ蛋白(ＳＥＱ IＤ番号:１)および推測されたアミ
ノ酸配列(ＳＥＱ IＤ番号:２)をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を示す
。図３は、分泌されるＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する遺伝子(ＳＥＱ IＤ番号:３)
および推測されたアミノ酸配列(ＳＥＱ IＤ番号:４)を示す。
し、図２は、完全長のＲＳＶ Ｆ蛋白(ＳＥＱ IＤ番号:１)および推測されたアミ
ノ酸配列(ＳＥＱ IＤ番号:２)をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を示す
。図３は、分泌されるＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する遺伝子(ＳＥＱ IＤ番号:３)
および推測されたアミノ酸配列(ＳＥＱ IＤ番号:４)を示す。
【００５８】 ＲＳＶ Ｆをコード化するcＤＮＡが、直接早期のプロモーター、エンハンサー
およびヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)のイントロンＡ配列の下流域、および
ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)Ｐoly-Ａ部位の上流域にサブクローン化した、４種の
プラスミドＤＮＡ構築物のセットが作製された(図４から図７に図式的に示され
るように)。プロモーターを含有する 1.6ＫbＳspl-ＰstIフラグメント、エンハ
ンサーおよびＣＭＶタウン株のイントロンＡ配列は、ジョンズホプキンス大学の
Ｇ.Ｓ.Ｈayｗard博士から恵与されたプラスミドpＲＬ43a(引用文献20)から最初
に誘導され、ＥcoＲＶとpＢluescript11ＳＫ＋/−のＰstI部位(層遺伝子)との間
でサブクローン化した。Ｆ蛋白の分泌体を発現するプラスミド(図４および図５
のpＸＬ１およびpＸＬ２)の構築に関しては、サブグループＡに属する臨床単離
体から独自にクローン化されたＦcＤＮＡの切頭形体を含有する 1.6ＫbＥcoＲI-
ＢaｍＨIフラグメントが、pＲＳＶＦから切除され(引用文献18および国際公開第
93/14207号)、ＥcoＲIとpＳＧ５のＢaｍＨI部位(層遺伝子、引用文献14)との間
でサブクローン化した。次に 1.6ＫbＥcoＲI-ＢaｍＨIフラグメントまたは 2.2
ＫbＣlaI-ＢaｍＨIフラグメントのいずれかをpＳＧ５構築物から切除し、クレノ
ウで充填し、プロモーターとイントロンＡ配列を含有するpＢluescriptIIＳＫ＋
/-構築物のＳｍaI部位にサブクローン化した。pＳＧ５から誘導された 0.6ＫbＣ
laI-ＥcoＲIフラグメントは、ウサギβ-グロビンからのイントロンII配列を含ん
でいた。引き続きプラスミドは、ＨindIIIで消化され、クレノウで充填され、Ｘ
baIで消化され、3.2Ｋbまたは 3.8Ｋbのいずれかのフラグメントを生成した。こ
れらのフラグメントは、pＲc/ＣＭＶ(インビトロゲン)にＣＭＶプロモーターを
含有する 0.8ＫbＮruI-ＸbaIフラグメントの代わりに使用され、それぞれ最終の
pＸＬ１およびpＸＬ２構築体となる。
およびヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)のイントロンＡ配列の下流域、および
ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)Ｐoly-Ａ部位の上流域にサブクローン化した、４種の
プラスミドＤＮＡ構築物のセットが作製された(図４から図７に図式的に示され
るように)。プロモーターを含有する 1.6ＫbＳspl-ＰstIフラグメント、エンハ
ンサーおよびＣＭＶタウン株のイントロンＡ配列は、ジョンズホプキンス大学の
Ｇ.Ｓ.Ｈayｗard博士から恵与されたプラスミドpＲＬ43a(引用文献20)から最初
に誘導され、ＥcoＲＶとpＢluescript11ＳＫ＋/−のＰstI部位(層遺伝子)との間
でサブクローン化した。Ｆ蛋白の分泌体を発現するプラスミド(図４および図５
のpＸＬ１およびpＸＬ２)の構築に関しては、サブグループＡに属する臨床単離
体から独自にクローン化されたＦcＤＮＡの切頭形体を含有する 1.6ＫbＥcoＲI-
ＢaｍＨIフラグメントが、pＲＳＶＦから切除され(引用文献18および国際公開第
93/14207号)、ＥcoＲIとpＳＧ５のＢaｍＨI部位(層遺伝子、引用文献14)との間
でサブクローン化した。次に 1.6ＫbＥcoＲI-ＢaｍＨIフラグメントまたは 2.2
ＫbＣlaI-ＢaｍＨIフラグメントのいずれかをpＳＧ５構築物から切除し、クレノ
ウで充填し、プロモーターとイントロンＡ配列を含有するpＢluescriptIIＳＫ＋
/-構築物のＳｍaI部位にサブクローン化した。pＳＧ５から誘導された 0.6ＫbＣ
laI-ＥcoＲIフラグメントは、ウサギβ-グロビンからのイントロンII配列を含ん
でいた。引き続きプラスミドは、ＨindIIIで消化され、クレノウで充填され、Ｘ
baIで消化され、3.2Ｋbまたは 3.8Ｋbのいずれかのフラグメントを生成した。こ
れらのフラグメントは、pＲc/ＣＭＶ(インビトロゲン)にＣＭＶプロモーターを
含有する 0.8ＫbＮruI-ＸbaIフラグメントの代わりに使用され、それぞれ最終の
pＸＬ１およびpＸＬ２構築体となる。
【００５９】 完全長Ｆ蛋白(pＸＬ３およびpＸＬ４-図６および図７)を発現するプラスミド
の構築に関して、完全長ＲＳＶ ＦcＤＮＡは、挿入体(引用文献18および国際公
開第93/14207号)を含有する組換えpＢluescript Ｍ１３-ＳＫ(層遺伝子)から 1.
9ＫbＥcoＲIフラグメントとして切除し、pＳＧ５(層遺伝子)のＥcoＲI部位にサ
ブクローン化した。次いで 1.9ＫbＥcoＲIフラグメントまたは２.５ＫbＣlaI-Ｂ
aｍＨIフラグメントのいずれかをpＳＧ５構成物から切除し、クレノウで充填し
、プロモーターとイントロンＡ配列を含有するpＢluescriptIIＳＫ＋/−構成物
のＳｍaI部位にサブクローン化した。残りのpＸＬ３およびpＸＬ４に関する構築
は、上記のpＸＬ１およびpＸＬ２の構築と同じであった。したがって、ＣＭＶプ
ロモーターとイントロンＡ配列以外のpＸＬ１〜４における残りのベクター成分
は、プラスミドpＲc/ＣＭＶから誘導された。プラスミドpＸＬ１およびpＸＬ２
は、停止コドンを輸送するＦ蛋白の切頭形/分泌形を発現するのに作製され、不
活性分子と比較して、膜内外(ＴＭ)およびＣ末端サイトソール尾部を含む４８個
のアミノ酸のＣ-末端欠失となった。これに対してpＸＬ３およびpＸＬ４は、Ｔ
ＭおよびサイトソールＣ末端尾部を含むＲＳＶ Ｆ分子の不活性膜付着体を発現
するために作製された。pＸＬ２およびpＸＬ４中のイントロンII配列の存在根拠
は、このイントロンがＲＮＡの正確なスプライシングを仲介すると報告されたこ
とであった。ＲＳＶ-Ｆに関するｍＲＮＡが、異所スプライシングの傾向がある
と思われたことから、イントロンII配列の存在は、これを克服する助けとなると
思われる。４種の全てのプラスミド構築体は、ＤＮＡ塩基配列決定分析により確
認された。プラスミドpＸＬ１、pＸＬ２、pＸＬ３およびpＸＬ４は全て、自己由
来シグナルペップチド配列を含有し、前記の国際公開第96/04095号に従って構築
される。
の構築に関して、完全長ＲＳＶ ＦcＤＮＡは、挿入体(引用文献18および国際公
開第93/14207号)を含有する組換えpＢluescript Ｍ１３-ＳＫ(層遺伝子)から 1.
9ＫbＥcoＲIフラグメントとして切除し、pＳＧ５(層遺伝子)のＥcoＲI部位にサ
ブクローン化した。次いで 1.9ＫbＥcoＲIフラグメントまたは２.５ＫbＣlaI-Ｂ
aｍＨIフラグメントのいずれかをpＳＧ５構成物から切除し、クレノウで充填し
、プロモーターとイントロンＡ配列を含有するpＢluescriptIIＳＫ＋/−構成物
のＳｍaI部位にサブクローン化した。残りのpＸＬ３およびpＸＬ４に関する構築
は、上記のpＸＬ１およびpＸＬ２の構築と同じであった。したがって、ＣＭＶプ
ロモーターとイントロンＡ配列以外のpＸＬ１〜４における残りのベクター成分
は、プラスミドpＲc/ＣＭＶから誘導された。プラスミドpＸＬ１およびpＸＬ２
は、停止コドンを輸送するＦ蛋白の切頭形/分泌形を発現するのに作製され、不
活性分子と比較して、膜内外(ＴＭ)およびＣ末端サイトソール尾部を含む４８個
のアミノ酸のＣ-末端欠失となった。これに対してpＸＬ３およびpＸＬ４は、Ｔ
ＭおよびサイトソールＣ末端尾部を含むＲＳＶ Ｆ分子の不活性膜付着体を発現
するために作製された。pＸＬ２およびpＸＬ４中のイントロンII配列の存在根拠
は、このイントロンがＲＮＡの正確なスプライシングを仲介すると報告されたこ
とであった。ＲＳＶ-Ｆに関するｍＲＮＡが、異所スプライシングの傾向がある
と思われたことから、イントロンII配列の存在は、これを克服する助けとなると
思われる。４種の全てのプラスミド構築体は、ＤＮＡ塩基配列決定分析により確
認された。プラスミドpＸＬ１、pＸＬ２、pＸＬ３およびpＸＬ４は全て、自己由
来シグナルペップチド配列を含有し、前記の国際公開第96/04095号に従って構築
される。
【００６０】 プラスミドＤＮＡは、製造元の使用説明書に従ってＱiagen社(米国カリフォル
ニア州チャッツワース)からのプラスミドメガキットを用いて精製された。
ニア州チャッツワース)からのプラスミドメガキットを用いて精製された。
【００６１】 実施例２ 本実施例では、マウスの免疫化を説明する。マウスは引用文献16に記載される
ようにＲＳＶによる感染に鋭敏である。
ようにＲＳＶによる感染に鋭敏である。
【００６２】 筋内(i.ｍ.)免疫化について、９匹のＢＡＬＢ/cマウス群(オス、６〜８週齢)(
米国メイン州バーハーバー、Jackson Ｌab.)の前脛骨筋に、pＸＬ１〜４のそれ
ぞれ２×50μg(ＰＢＳ中１μg/μL)を両側に注射した。ＤＮＡ注射５日前に、筋
肉を２×50μL(ＰＢＳ中10μＭ)の心臓毒剤(Ｌatoxan、仏国)で処理した。心臓
毒剤による筋肉の前処理は、ＤＮＡ取り込みを増加し、それに続く筋内経路によ
る免疫反応を増強すると報告されている(引用文献２４)。これらのマウスは、１
カ月後同様に抗原追加された。対照群のマウスを、同一のスケジュールに従って
ＲＳＶ Ｆ遺伝子の無い同一のベクター要素配列を含有するプラセボプラスミド
で免疫化した。皮内(i.d.)免疫化に関しては、100μgのpＸＬ２(ＰＢＳ中２μg/
μL)を背基部から１〜２cｍ遠位の皮膚に注射した。これらのマウスは、１カ月
後同様に抗原追加された。
米国メイン州バーハーバー、Jackson Ｌab.)の前脛骨筋に、pＸＬ１〜４のそれ
ぞれ２×50μg(ＰＢＳ中１μg/μL)を両側に注射した。ＤＮＡ注射５日前に、筋
肉を２×50μL(ＰＢＳ中10μＭ)の心臓毒剤(Ｌatoxan、仏国)で処理した。心臓
毒剤による筋肉の前処理は、ＤＮＡ取り込みを増加し、それに続く筋内経路によ
る免疫反応を増強すると報告されている(引用文献２４)。これらのマウスは、１
カ月後同様に抗原追加された。対照群のマウスを、同一のスケジュールに従って
ＲＳＶ Ｆ遺伝子の無い同一のベクター要素配列を含有するプラセボプラスミド
で免疫化した。皮内(i.d.)免疫化に関しては、100μgのpＸＬ２(ＰＢＳ中２μg/
μL)を背基部から１〜２cｍ遠位の皮膚に注射した。これらのマウスは、１カ月
後同様に抗原追加された。
【００６３】 第２の免疫化後 75日目に、マウスは、105.4プラーク形成単位(pfu)のマウス
適合ＲＳＶのＡ２サブタイプ(米国テキサス州ヒューストン、ベイラー医科大学
Ｐ.Ｗyde博士より恵与された)によりチャレンジされた。肺は４日後無菌的に除
去され、重量計測し、２ｍＬの完全培地中均質化した。肺ホモジネートにおける
pfu数は、ワクチン品質のベロ細胞を用いて前記(引用文献19)のように２回で決
定された。これらのデータは、ＳigｍaＳtat(カナダ国オンタリオ州ゲルフ、Ｊa
ndel Ｓcientific Ｓoftｗare)を用いて統計解析に供された。
適合ＲＳＶのＡ２サブタイプ(米国テキサス州ヒューストン、ベイラー医科大学
Ｐ.Ｗyde博士より恵与された)によりチャレンジされた。肺は４日後無菌的に除
去され、重量計測し、２ｍＬの完全培地中均質化した。肺ホモジネートにおける
pfu数は、ワクチン品質のベロ細胞を用いて前記(引用文献19)のように２回で決
定された。これらのデータは、ＳigｍaＳtat(カナダ国オンタリオ州ゲルフ、Ｊa
ndel Ｓcientific Ｓoftｗare)を用いて統計解析に供された。
【００６４】 免疫化マウスから得られた血清を、酵素結合免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)による抗
ＲＳＶ Ｆ抗体力価(それぞれIgＧ、IgＧ１およびIgＧ２a)およびＲＳＶ特異的プ
ラーク減少力価に関して分析した。ＥＬＩＳＡは、免疫親和性精製ＲＳＶ Ｆ蛋
白(50ng/ｍL)で被覆された 96ウェルプレートおよび２倍連続希釈の免疫血清を
用いて実施された。アルカリホスファターゼ(カナダ国オンタリオ州 Ｍississau
ga、Jackson IｍｍunoＲes.)抱合ヤギ抗マウスIgＧ抗体を、二次抗体として用い
られた。IgＧ１およびIgＧ２a抗体力価の測定のために、使用される二次抗体は
、それぞれ単一特異性のアルカリホスファターゼ抱合ヒツジ抗マウスIgＧ１抗体
(カナダ国オンタリオ州トロント、Ｓerotic)およびラット抗マウスIgＧ２a抗体(
米国カリフォルニア州サンフランシスコ、Ｚyｍed)であった。プラーク減少力価
は、ワクチン品質のベロ細胞を用いてＰrinceら(引用文献19)に従って決定され
た。４倍連続希釈の免疫血清は、培地中 50pfuのＲＳＶ長株(ＡＴＣＣ)と共に５
％ＣＯ2存在下、37℃１時間培養した。次にベロ細胞をこの混合に感染させた。
プラークを 80％メタノールで固定し、５日後ペルオキシダーゼ(カナダ国オンタ
リオ州 Ｍississauga、Jackson IｍｍunoＲes.)抱合マウス抗ＲＳＶ Ｆモノクロ
ーナルIgＧ１抗体およびロバ抗マウスIgＧ抗体を用いて展開した。ＲＳＶ特異的
プラーク減少力価は、プラーク数の６０％減少を生じる血清試料の希釈として定
義された。ＥＬＩＳＡおよびプラーク減少アッセイの双方は、２重に実施され、
データは２つの測定平均として表される。これらのデータはＳigｍaＳtat(カナ
ダ国オンタリオ州ゲルフ、Jandel Ｓcientific Ｓoftｗare)を用いて統計解析に
供された。
ＲＳＶ Ｆ抗体力価(それぞれIgＧ、IgＧ１およびIgＧ２a)およびＲＳＶ特異的プ
ラーク減少力価に関して分析した。ＥＬＩＳＡは、免疫親和性精製ＲＳＶ Ｆ蛋
白(50ng/ｍL)で被覆された 96ウェルプレートおよび２倍連続希釈の免疫血清を
用いて実施された。アルカリホスファターゼ(カナダ国オンタリオ州 Ｍississau
ga、Jackson IｍｍunoＲes.)抱合ヤギ抗マウスIgＧ抗体を、二次抗体として用い
られた。IgＧ１およびIgＧ２a抗体力価の測定のために、使用される二次抗体は
、それぞれ単一特異性のアルカリホスファターゼ抱合ヒツジ抗マウスIgＧ１抗体
(カナダ国オンタリオ州トロント、Ｓerotic)およびラット抗マウスIgＧ２a抗体(
米国カリフォルニア州サンフランシスコ、Ｚyｍed)であった。プラーク減少力価
は、ワクチン品質のベロ細胞を用いてＰrinceら(引用文献19)に従って決定され
た。４倍連続希釈の免疫血清は、培地中 50pfuのＲＳＶ長株(ＡＴＣＣ)と共に５
％ＣＯ2存在下、37℃１時間培養した。次にベロ細胞をこの混合に感染させた。
プラークを 80％メタノールで固定し、５日後ペルオキシダーゼ(カナダ国オンタ
リオ州 Ｍississauga、Jackson IｍｍunoＲes.)抱合マウス抗ＲＳＶ Ｆモノクロ
ーナルIgＧ１抗体およびロバ抗マウスIgＧ抗体を用いて展開した。ＲＳＶ特異的
プラーク減少力価は、プラーク数の６０％減少を生じる血清試料の希釈として定
義された。ＥＬＩＳＡおよびプラーク減少アッセイの双方は、２重に実施され、
データは２つの測定平均として表される。これらのデータはＳigｍaＳtat(カナ
ダ国オンタリオ州ゲルフ、Jandel Ｓcientific Ｓoftｗare)を用いて統計解析に
供された。
【００６５】 ＤＮＡ免疫化後ＲＳＶ特異的ＣＴＬの誘導を検討するために、２匹の免疫化マ
ウスから脾臓を除去し、集められた単細胞懸濁液を調製した。脾細胞は、１ＴＣ
IＤ50/細胞ＲＳＶ(長株)に２時間感染させてガンマ放射された(3,000ラド)同系
脾細胞(2.5×106個の細胞/ｍL)を用いて 10Ｕ/ｍLマウスインターロイキン２(Ｉ
Ｌ-２)を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で 2.5×106個の細胞/ｍLにて培養した。
マウスＩＬ-２源は、バーゼル免疫研究所のＨ.Ｋarasuyaｍa博士(引用文献20)か
ら恵与された高濃度のＩＬ-２を構成的に分泌するマウス細胞系の上澄液であっ
た。ＣＴＬ活性は、標準的な４時間のクロム放出アッセイにおいて in vitro の
再刺激５日後に試験した。標的細胞は、それぞれ５種の51Ｃr標識未感染ＢＡＬ
Ｂ/c線維芽細胞(ＢＣ細胞)および永続的ＲＳＶ感染ＢＣＨ14線維芽細胞であった
。洗浄された応答細胞は、９６ウェルＶ字底組織培養プレートにて37℃４時間、
200μＬ中目標比率に対してエフェクターを変えて２×103個の標的細胞を用いて
培養した。自発的且つ総クロム放出は、応答リンパ球の不在下、培地または 2.5
％トリトン-Ｘ100 のいずれかを用いて標的細胞を培養することにより決定され
た。特異的なクロム放出パーセントは、(カウント-自発的カウント)/(総カウン
ト-自発的カウント)×100 として算出された。試験は３回実施され、データは３
回の測定平均として表される。ＣＴＬアッセイにおける抗体遮断試験に関して、
クロム標識ＢＣまたはＢＣＨ４細胞を添加する前に、エフェクター細胞は、ＣＤ
４(ＧＫ1.5)(引用文献21)に対する精製ｍＡbまたはマウスＣＤ８(53-6.7)(引用
文献22)に対する精製ｍＡbの最終10μg/ｍLにより１時間培養した。殺ＣＴＬに
おける抗クラスＩＭＨＣ抗体の効果を決定するために、クロム標識標的細胞ＢＣ
またはＢＣＨ４を、エフェクター細胞の添加前にクラスＩＭＨＣ(34-１-２Ｓ)(
引用文献23)のＫdおよびＤdを認識するｍＡbを分泌するハイブリドーマの培養上
澄の 20μＬで培養した。
ウスから脾臓を除去し、集められた単細胞懸濁液を調製した。脾細胞は、１ＴＣ
IＤ50/細胞ＲＳＶ(長株)に２時間感染させてガンマ放射された(3,000ラド)同系
脾細胞(2.5×106個の細胞/ｍL)を用いて 10Ｕ/ｍLマウスインターロイキン２(Ｉ
Ｌ-２)を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で 2.5×106個の細胞/ｍLにて培養した。
マウスＩＬ-２源は、バーゼル免疫研究所のＨ.Ｋarasuyaｍa博士(引用文献20)か
ら恵与された高濃度のＩＬ-２を構成的に分泌するマウス細胞系の上澄液であっ
た。ＣＴＬ活性は、標準的な４時間のクロム放出アッセイにおいて in vitro の
再刺激５日後に試験した。標的細胞は、それぞれ５種の51Ｃr標識未感染ＢＡＬ
Ｂ/c線維芽細胞(ＢＣ細胞)および永続的ＲＳＶ感染ＢＣＨ14線維芽細胞であった
。洗浄された応答細胞は、９６ウェルＶ字底組織培養プレートにて37℃４時間、
200μＬ中目標比率に対してエフェクターを変えて２×103個の標的細胞を用いて
培養した。自発的且つ総クロム放出は、応答リンパ球の不在下、培地または 2.5
％トリトン-Ｘ100 のいずれかを用いて標的細胞を培養することにより決定され
た。特異的なクロム放出パーセントは、(カウント-自発的カウント)/(総カウン
ト-自発的カウント)×100 として算出された。試験は３回実施され、データは３
回の測定平均として表される。ＣＴＬアッセイにおける抗体遮断試験に関して、
クロム標識ＢＣまたはＢＣＨ４細胞を添加する前に、エフェクター細胞は、ＣＤ
４(ＧＫ1.5)(引用文献21)に対する精製ｍＡbまたはマウスＣＤ８(53-6.7)(引用
文献22)に対する精製ｍＡbの最終10μg/ｍLにより１時間培養した。殺ＣＴＬに
おける抗クラスＩＭＨＣ抗体の効果を決定するために、クロム標識標的細胞ＢＣ
またはＢＣＨ４を、エフェクター細胞の添加前にクラスＩＭＨＣ(34-１-２Ｓ)(
引用文献23)のＫdおよびＤdを認識するｍＡbを分泌するハイブリドーマの培養上
澄の 20μＬで培養した。
【００６６】 実施例３ 本実施例では、筋内経路によるポリヌクレオチド免疫化による免疫原性および
防御を説明する。
防御を説明する。
【００６７】 筋内ＤＮＡ投与後抗体応答を特性化するために、免疫血清を、ＥＬＩＳＡによ
る抗ＲＳＶ ＦIgＧ抗体力価に関してまたＲＳＶ特異的プラーク減少力価に関し
てそれぞれ分析した。４種のプラスミド構築物はすべて免疫原性であることが判
った。pＸＬ１〜４で免疫化されたマウスから得た血清は、プラセボ群と比較し
て、有意な抗ＲＳＶ ＦIgＧ力価またＲＳＶ特異的プラーク減少力価を示した(下
記の表１)(それぞれＰ＜0.0061および＜0.0001、マン‐ホイットニー検定)。し
かしながら、pＸＬ１、pＸＬ２、pＸＬ３、pＸＬ４のいずれで免疫化したマウス
間でも抗ＲＳＶ ＦIgＧ力価またＲＳＶ特異的プラーク減少力価のいずれにおい
ても有意差はない。
る抗ＲＳＶ ＦIgＧ抗体力価に関してまたＲＳＶ特異的プラーク減少力価に関し
てそれぞれ分析した。４種のプラスミド構築物はすべて免疫原性であることが判
った。pＸＬ１〜４で免疫化されたマウスから得た血清は、プラセボ群と比較し
て、有意な抗ＲＳＶ ＦIgＧ力価またＲＳＶ特異的プラーク減少力価を示した(下
記の表１)(それぞれＰ＜0.0061および＜0.0001、マン‐ホイットニー検定)。し
かしながら、pＸＬ１、pＸＬ２、pＸＬ３、pＸＬ４のいずれで免疫化したマウス
間でも抗ＲＳＶ ＦIgＧ力価またＲＳＶ特異的プラーク減少力価のいずれにおい
ても有意差はない。
【００６８】 下気道の初回抗原刺激のＲＳＶ感染に対してpＸＬ１〜４の防御能力を評価す
るために、免疫化マウスをマウス適合ＲＳＶで鼻腔内にチャレンジし、およびチ
ャレンジ後のウイルス肺力価を評価した。４種のプラスミド構成体すべてが、Ｒ
ＳＶ感染に対してマウスを防御することが判った。プラセボ群と比較して、ウイ
ルス肺力価における有意な減少が、pＸＬ１〜４で免疫化されたマウスに観察さ
れた(Ｐ＜0.0001、マン‐ホイットニー検定)。しかしながら、防御程度の変化が
プラスミドに依存して観察された。特に、pＸＬ１は、pＸＬ３よりも防御性があ
り(Ｐ＝0.00109、マン‐ホイットニー検定)、およびpＸＬ４はpＸＬ３よりも防
御性あったが(Ｐ＝0.00125)、一方、pＸＬ２のみが完全防御を誘導した。この結
論は、エンドポイントとして多くの完全防御マウスでの他の解析により確認され
た(フィッシャーの完全検定)。構築体pＸＬ１、pＸＬ２またはpＸＬ４は、プラ
セボ以上の効果が無かったpＸＬ３よりも高程度の防御を与えた(Ｐ＜0.004、フ
ィッシャーの完全検定)。pＸＬ２のみが全ての免疫化マウスの中で完全防御を与
えた。
るために、免疫化マウスをマウス適合ＲＳＶで鼻腔内にチャレンジし、およびチ
ャレンジ後のウイルス肺力価を評価した。４種のプラスミド構成体すべてが、Ｒ
ＳＶ感染に対してマウスを防御することが判った。プラセボ群と比較して、ウイ
ルス肺力価における有意な減少が、pＸＬ１〜４で免疫化されたマウスに観察さ
れた(Ｐ＜0.0001、マン‐ホイットニー検定)。しかしながら、防御程度の変化が
プラスミドに依存して観察された。特に、pＸＬ１は、pＸＬ３よりも防御性があ
り(Ｐ＝0.00109、マン‐ホイットニー検定)、およびpＸＬ４はpＸＬ３よりも防
御性あったが(Ｐ＝0.00125)、一方、pＸＬ２のみが完全防御を誘導した。この結
論は、エンドポイントとして多くの完全防御マウスでの他の解析により確認され
た(フィッシャーの完全検定)。構築体pＸＬ１、pＸＬ２またはpＸＬ４は、プラ
セボ以上の効果が無かったpＸＬ３よりも高程度の防御を与えた(Ｐ＜0.004、フ
ィッシャーの完全検定)。pＸＬ２のみが全ての免疫化マウスの中で完全防御を与
えた。
【００６９】 上記の統計解析は、pＸＬ１がpＸＬ３よりも有意な防御を提供することを明ら
かにした。前者は切頭形および分泌形を発現し、後者はＲＳＶ Ｆ蛋白の不活性
膜固定形を発現する。さらに、pＸＬ４はpＸＬ３よりも防御性があることが示さ
れた。これら２つの構築体間の相違は、pＸＬ４におけるイントロンII配列の存
在である。イントロンII配列と関連してＲＳＶ-Ｆの分泌形を発現する構築体pＸ
Ｌ２は、実施例２のプロトコルにて免疫化された全マウスにおいて完全防御を提
供するのは唯一のプラスミドであった。
かにした。前者は切頭形および分泌形を発現し、後者はＲＳＶ Ｆ蛋白の不活性
膜固定形を発現する。さらに、pＸＬ４はpＸＬ３よりも防御性があることが示さ
れた。これら２つの構築体間の相違は、pＸＬ４におけるイントロンII配列の存
在である。イントロンII配列と関連してＲＳＶ-Ｆの分泌形を発現する構築体pＸ
Ｌ２は、実施例２のプロトコルにて免疫化された全マウスにおいて完全防御を提
供するのは唯一のプラスミドであった。
【００７０】 実施例４ 本実施例では、免疫原性および防御能力におけるpＸＬ２の投与経路の影響を
説明する。
説明する。
【００７１】 ＤＮＡ投与の筋内および皮内経路を、抗ＲＳＶ Ｆ抗体力価およびＲＳＶ特異
的プラーク減少力価の観点で免疫原性に関して比較した。免疫血清の解析により
(下記の表２)、ＤＮＡ投与の皮内投与を抗ＲＳＶ ＦIgＧおよびIgＧ１抗体応答
により判定すると、筋内経路と同じく免疫原性であり、ＲＳＶ特異的プラーク減
少力価も同様であることが明らかとなった。しかしながら、筋内経路のみが有意
な抗ＲＳＶ ＦIgＧ２a抗体応答を誘導したが、一方、皮内経路が使用された場合
、IgＧ２aイソタイプ力価は無視してよいものであった。筋内および皮内経路は
また、ＲＳＶ特異的ＣＴＬの誘導に関して比較した。有意なＲＳＶ特異的ＣＴＬ
活性が、筋内免疫化マウスにおいて検出された。対照的に、細胞応答は皮内接種
されたマウスにおいて有意により低かった(下記の表３)。これらの相違にもかか
わらず、下気道の初回抗原刺激のＲＳＶ感染に対する防御は、いずれかの経路を
経て免疫化された両群のマウスにおいても観察された(下記の表４)。ＲＳＶ-Ｆ
ＤＮＡにより誘導されたＣＴＬは、古典的なＣＤ８＋クラスI制限ＣＴＬである
。標的細胞のＢＣＨ４線維芽細胞は、クラスＩＭＨＣのみを発現し、クラスIIＭ
ＨＣを発現しない。さらに、抗クラスＩＭＨＣ抗体を有するＢＣＨ４標的細胞の
前培養は、ＲＳＶ-Ｆ ＤＮＡ誘導ＣＴＬ系列の溶菌活性を有意に遮断した。抗Ｃ
Ｄ８抗体は、ＢＣＨ４細胞の溶菌を部分的に遮断できたが、ＣＤ４分子の抗体は
全く効果が無かった(下記の表５)。ｍＡbからＣＤ８による全遮断の欠如は、Ｃ
Ｄ８に影響を受けないＣＴＬ(たとえそれらがＣＤ８＋ＣＴＬであっても、それ
らのＴＣＲがクラスＩＭＨＣ＋ペプチドに十分な親和性を有し、クラスIＭＨＣ
のアルファ３とＣＤ８との相互作用を必要としないことを意味する)によるか、
またはこれらの実験に用いられた抗体量が制限されていたことによると考えられ
る。ＹＡＣ-１(ＮＫ感受性標的)細胞の溶菌は検出できなかった(データは示さず
)。
的プラーク減少力価の観点で免疫原性に関して比較した。免疫血清の解析により
(下記の表２)、ＤＮＡ投与の皮内投与を抗ＲＳＶ ＦIgＧおよびIgＧ１抗体応答
により判定すると、筋内経路と同じく免疫原性であり、ＲＳＶ特異的プラーク減
少力価も同様であることが明らかとなった。しかしながら、筋内経路のみが有意
な抗ＲＳＶ ＦIgＧ２a抗体応答を誘導したが、一方、皮内経路が使用された場合
、IgＧ２aイソタイプ力価は無視してよいものであった。筋内および皮内経路は
また、ＲＳＶ特異的ＣＴＬの誘導に関して比較した。有意なＲＳＶ特異的ＣＴＬ
活性が、筋内免疫化マウスにおいて検出された。対照的に、細胞応答は皮内接種
されたマウスにおいて有意により低かった(下記の表３)。これらの相違にもかか
わらず、下気道の初回抗原刺激のＲＳＶ感染に対する防御は、いずれかの経路を
経て免疫化された両群のマウスにおいても観察された(下記の表４)。ＲＳＶ-Ｆ
ＤＮＡにより誘導されたＣＴＬは、古典的なＣＤ８＋クラスI制限ＣＴＬである
。標的細胞のＢＣＨ４線維芽細胞は、クラスＩＭＨＣのみを発現し、クラスIIＭ
ＨＣを発現しない。さらに、抗クラスＩＭＨＣ抗体を有するＢＣＨ４標的細胞の
前培養は、ＲＳＶ-Ｆ ＤＮＡ誘導ＣＴＬ系列の溶菌活性を有意に遮断した。抗Ｃ
Ｄ８抗体は、ＢＣＨ４細胞の溶菌を部分的に遮断できたが、ＣＤ４分子の抗体は
全く効果が無かった(下記の表５)。ｍＡbからＣＤ８による全遮断の欠如は、Ｃ
Ｄ８に影響を受けないＣＴＬ(たとえそれらがＣＤ８＋ＣＴＬであっても、それ
らのＴＣＲがクラスＩＭＨＣ＋ペプチドに十分な親和性を有し、クラスIＭＨＣ
のアルファ３とＣＤ８との相互作用を必要としないことを意味する)によるか、
またはこれらの実験に用いられた抗体量が制限されていたことによると考えられ
る。ＹＡＣ-１(ＮＫ感受性標的)細胞の溶菌は検出できなかった(データは示さず
)。
【００７２】 実施例５ 本実施例では、pＸＬ２を用いたコトンラットにおける免疫化試験を説明する
。
。
【００７３】 ＤＮＡ免疫化に対するコトンラットの免疫反応は、下記の表６に示されたプロ
トコルにより分析された。５日目に、40匹のコトンラットを無作為に選び、各５
匹の８グループに分けた。グループ１からグループ７のコトンラットは、心臓毒
剤(1.0μＭ)を前脛骨(ＴＡ)の両側筋肉に筋内接種された。１日目に、グループ
８のコトンラットはブピバカイン(0.25％)をＴＡ筋肉内に接種された。０日目に
、各グループの数匹の動物を採血し、ワクチン投与前の試験動物の血清中のＲＳ
Ｖ特異的抗体濃度を決定した。次いで全ての動物に、200μgのプラスミドＤＮＡ
、プラセボ(ＲＳＶ非特異的ＤＮＡ)、ＲＳＶの 100 中央値のコトンラット感染
量(ＣＲＩＤ50；ポジティブコントロール)またはＨep-２組織培養細胞で調製し
たホルマリン不活化ＲＳＶを接種し、アルムにて抗原増強された。44日後グルー
プ１および７のコトンラットのＴＡ筋にカルジオトキシンを接種した。４日後(
ワクチンによる初回抗原刺激の 48日後)、グループ８の動物は、右肢のＴＡ筋に
ブピバカインを再接種した。翌日(ワクチンによる初回抗原刺激の７週後)、全て
の動物を採血し、生存ＲＳＶを投与したグループの動物を除く全ての動物を０日
目に用いた同一物質の同一用量で抗原追加を行った。29日後、各コトンラットを
採血し、次いでＨep-２組織培養細胞で増殖した 100 ＣＲＩＤ５０ ＲＳＶ Ａ２
により鼻孔内(i.n.)チャレンジした。このウイルスチャレンジの４日後(＋88日
目)、全てのコトンラットを殺し、肺を除去した。各肺のセットから１葉をホル
マリンで固定し、肺組織病理学の組織評価が施された。残りの肺葉は、ＲＳＶの
存在と濃度について評価された。０日目、49日目および 78日目に採取された各
血清を、ＲＳＶ中和活性、抗ＲＳＶ融合活性およびＲＳＶ特異的ＥＬＩＳＡ抗体
について試験した。
トコルにより分析された。５日目に、40匹のコトンラットを無作為に選び、各５
匹の８グループに分けた。グループ１からグループ７のコトンラットは、心臓毒
剤(1.0μＭ)を前脛骨(ＴＡ)の両側筋肉に筋内接種された。１日目に、グループ
８のコトンラットはブピバカイン(0.25％)をＴＡ筋肉内に接種された。０日目に
、各グループの数匹の動物を採血し、ワクチン投与前の試験動物の血清中のＲＳ
Ｖ特異的抗体濃度を決定した。次いで全ての動物に、200μgのプラスミドＤＮＡ
、プラセボ(ＲＳＶ非特異的ＤＮＡ)、ＲＳＶの 100 中央値のコトンラット感染
量(ＣＲＩＤ50；ポジティブコントロール)またはＨep-２組織培養細胞で調製し
たホルマリン不活化ＲＳＶを接種し、アルムにて抗原増強された。44日後グルー
プ１および７のコトンラットのＴＡ筋にカルジオトキシンを接種した。４日後(
ワクチンによる初回抗原刺激の 48日後)、グループ８の動物は、右肢のＴＡ筋に
ブピバカインを再接種した。翌日(ワクチンによる初回抗原刺激の７週後)、全て
の動物を採血し、生存ＲＳＶを投与したグループの動物を除く全ての動物を０日
目に用いた同一物質の同一用量で抗原追加を行った。29日後、各コトンラットを
採血し、次いでＨep-２組織培養細胞で増殖した 100 ＣＲＩＤ５０ ＲＳＶ Ａ２
により鼻孔内(i.n.)チャレンジした。このウイルスチャレンジの４日後(＋88日
目)、全てのコトンラットを殺し、肺を除去した。各肺のセットから１葉をホル
マリンで固定し、肺組織病理学の組織評価が施された。残りの肺葉は、ＲＳＶの
存在と濃度について評価された。０日目、49日目および 78日目に採取された各
血清を、ＲＳＶ中和活性、抗ＲＳＶ融合活性およびＲＳＶ特異的ＥＬＩＳＡ抗体
について試験した。
【００７４】 ＋49日目および＋78日目のＲＳＶ中和活性は、それぞれ下記の表７(a)および
表７(b)に示す。表７(a)に示された結果から理解できるように、＋49日目の生Ｒ
ＳＶおよび免疫ＤＮＡで免疫化された動物は、重要なＲＳＶ結成中和力価を有し
ていた。ホルマリン不活化ＲＳＶで免疫化された動物は、＋49日目のプラセボグ
ループと等しい中和力価を有したが、＋78日目までの抗原追加後は、5.8(log10/
0.05)に到達した。追加抗原では、生ＲＳＶまたは筋内プラスミド免疫化により
免疫化された動物においては有意な効果は無かった。
表７(b)に示す。表７(a)に示された結果から理解できるように、＋49日目の生Ｒ
ＳＶおよび免疫ＤＮＡで免疫化された動物は、重要なＲＳＶ結成中和力価を有し
ていた。ホルマリン不活化ＲＳＶで免疫化された動物は、＋49日目のプラセボグ
ループと等しい中和力価を有したが、＋78日目までの抗原追加後は、5.8(log10/
0.05)に到達した。追加抗原では、生ＲＳＶまたは筋内プラスミド免疫化により
免疫化された動物においては有意な効果は無かった。
【００７５】 ＋82日目の鼻(上気道)洗浄におけるＲＳＶ力価を下記の表８に示す。＋82日目
の肺(下気道)のＲＳＶ力価を下記の表９に示す。全てのワクチンは、肺感染に対
して防御を呈したが、これらの条件下で、生菌ウイルスのみが上気道感染に対し
て全体防御を呈した。
の肺(下気道)のＲＳＶ力価を下記の表９に示す。全てのワクチンは、肺感染に対
して防御を呈したが、これらの条件下で、生菌ウイルスのみが上気道感染に対し
て全体防御を呈した。
【００７６】 コトンラットからの肺を、肺組織病理学に関して組織学的に調査し、この結果
を下記の表10 に示す。実質的に感染細胞の無いまたは感染徴候の無いグループ
９、および本試験で見られた最大の肺病理を示したグループ３から得られた肺切
片を除いて、他のグループから得られた全ての肺切片は、よく知られたものが観
察され、すなわち、散乱した感染細胞が大抵の領域存在し、幾らかの隔膜厚みが
あった。これらには軽度の感染症の徴候がある。大多数の感染細胞および他の感
染徴候がグループ３(すなわち、ウイルスチャレンジ前にホルマリン不活化[ＦI]
ＲＳＶワクチンが投与された)からの肺切片に存在する。この結果は、ＲＳＶ Ｆ
蛋白を発現するプラスミドＤＮＡでの免疫化は、プラセボと異なり肺組織病理と
ならないが、ＦI-ＲＳＶはより重篤な病理を生じた。
を下記の表10 に示す。実質的に感染細胞の無いまたは感染徴候の無いグループ
９、および本試験で見られた最大の肺病理を示したグループ３から得られた肺切
片を除いて、他のグループから得られた全ての肺切片は、よく知られたものが観
察され、すなわち、散乱した感染細胞が大抵の領域存在し、幾らかの隔膜厚みが
あった。これらには軽度の感染症の徴候がある。大多数の感染細胞および他の感
染徴候がグループ３(すなわち、ウイルスチャレンジ前にホルマリン不活化[ＦI]
ＲＳＶワクチンが投与された)からの肺切片に存在する。この結果は、ＲＳＶ Ｆ
蛋白を発現するプラスミドＤＮＡでの免疫化は、プラセボと異なり肺組織病理と
ならないが、ＦI-ＲＳＶはより重篤な病理を生じた。
【００７７】 実施例６ 本実施例では、ＲＳＶチャレンジ後のpＸＬ２により免疫化したマウスにおけ
る局所サイトカイン発現プロフィルの測定を説明する。
る局所サイトカイン発現プロフィルの測定を説明する。
【００７８】 Ｂalb/Ｃマウスを実施例１に記載した通り調製したpＸＬ２ 100μgにより、０
週目および６週目に免疫化し、10週目に鼻腔内ＲＳＶチャレンジを行った。対照
マウスを同一プロトコルに従って、ＦI-ＲＳＶおよび生ＲＳＶで免疫化し、ＲＳ
Ｖでチャレンジさせた。ウイルスチャレンジの４日後、免疫化マウスから肺を除
去し、直ちに液体窒素中で凍らせた。総ＲＮＡは、クロロホルム抽出とイソプロ
パノール沈殿により、ＴＲＩzol/β-メルカプトエタノール中ホモジナイズした
肺から調製した。次に、クローン法からのＩＬ４、ＩＬ５またはＩＦＮ-γ特異
的プライマーを用いて、ＲＮＡ試料において逆転写ポリメラーゼチェイン反応(
ＲＴ-ＰＣＲ)を実施した。次に増殖産生物をクローン法からのサイトカイン特異
的32Ｐ標識プローブと液体ハイブリッド形成を行い、５％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分析し、ゲル中の放射性シグナルの走査により定量化した。各処理群から
３つのマウス肺を除去し、最低２回肺サイトカイン発現の分析を行った。データ
は図９に示し、これらの測定平均値と標準偏差を示している。
週目および６週目に免疫化し、10週目に鼻腔内ＲＳＶチャレンジを行った。対照
マウスを同一プロトコルに従って、ＦI-ＲＳＶおよび生ＲＳＶで免疫化し、ＲＳ
Ｖでチャレンジさせた。ウイルスチャレンジの４日後、免疫化マウスから肺を除
去し、直ちに液体窒素中で凍らせた。総ＲＮＡは、クロロホルム抽出とイソプロ
パノール沈殿により、ＴＲＩzol/β-メルカプトエタノール中ホモジナイズした
肺から調製した。次に、クローン法からのＩＬ４、ＩＬ５またはＩＦＮ-γ特異
的プライマーを用いて、ＲＮＡ試料において逆転写ポリメラーゼチェイン反応(
ＲＴ-ＰＣＲ)を実施した。次に増殖産生物をクローン法からのサイトカイン特異
的32Ｐ標識プローブと液体ハイブリッド形成を行い、５％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分析し、ゲル中の放射性シグナルの走査により定量化した。各処理群から
３つのマウス肺を除去し、最低２回肺サイトカイン発現の分析を行った。データ
は図９に示し、これらの測定平均値と標準偏差を示している。
【００７９】 図９に示されたデータから判るように、 １.生ＲＳＶによる鼻腔内(i.n.)免疫化は、平均したサイトカインプロフィル(
ＩＦＮ-γ、ＩＬ-４およびＩＬ-５)となり、他方、ＦＩ-ＲＳＶによる筋内(i.ｍ
.)免疫化は、Ｔh２優位(ＩＬ-４およびＩＬ-５の上昇)となった。これらの結果
は、文献で報告された結果と同様である。
ＩＦＮ-γ、ＩＬ-４およびＩＬ-５)となり、他方、ＦＩ-ＲＳＶによる筋内(i.ｍ
.)免疫化は、Ｔh２優位(ＩＬ-４およびＩＬ-５の上昇)となった。これらの結果
は、文献で報告された結果と同様である。
【００８０】 ２.ＦIの分泌(sec.)体を含むpＸＬ２によるi.ｍ.または皮内(i.d.)経路を介し
ての免疫化により、生ＲＳＶ免疫化によるものと同様の平均したサイトカインプ
ロフィルが増大した。
ての免疫化により、生ＲＳＶ免疫化によるものと同様の平均したサイトカインプ
ロフィルが増大した。
【００８１】 ３.分泌形蛋白を発現するpＸＬ２を用いてのi.ｍ.およびi.d.免疫化によるサ
イトカイン反応の大きさは、生ＲＳＶ免疫化によるものよりも有意に高い。
イトカイン反応の大きさは、生ＲＳＶ免疫化によるものよりも有意に高い。
【００８２】 実施例７ 本実施例では、本発明に従って、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化し、５’ＵＴＲお
よび単純ヘルペスウイルスI(ＨＳＶＩ)gＤのシグナルペプチドを含むプラスミド
ベクターの構築を説明する。
よび単純ヘルペスウイルスI(ＨＳＶＩ)gＤのシグナルペプチドを含むプラスミド
ベクターの構築を説明する。
【００８３】 プラスミドp82Ｍ35Ｂは、図10 に示された計画に従って調製された。ＣＭＶプ
ロモーター、イントロンＡおよびＢＧＨポリＡ配列を含むプラスミドpＶＲ1012(
Ｖical)(図11:ＳＥＱ IＤ番号:６)は、制限酵素ＰstIにより線状化し、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼにより末端鈍化させた。ウサギβグロビンイントロンII配列をＣ
laIおよびＥcoＲI消化によりプラスミドpＳＧ５(層遺伝子:引用文献14)より回収
し、0.6Ｋbフラグメントを単離し、クレノウフラグメントポリメラーゼを用いた
処理によって末端鈍化させた。次に、ウサギβ-グロビンイントロンIIフラグメ
ントをＰst I/末端鈍化ＶＲ1012 プラスミドと結合させた(図10)。このベクター
を次にＥcoＲＶによって制限化し、脱リン酸した。
ロモーター、イントロンＡおよびＢＧＨポリＡ配列を含むプラスミドpＶＲ1012(
Ｖical)(図11:ＳＥＱ IＤ番号:６)は、制限酵素ＰstIにより線状化し、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼにより末端鈍化させた。ウサギβグロビンイントロンII配列をＣ
laIおよびＥcoＲI消化によりプラスミドpＳＧ５(層遺伝子:引用文献14)より回収
し、0.6Ｋbフラグメントを単離し、クレノウフラグメントポリメラーゼを用いた
処理によって末端鈍化させた。次に、ウサギβ-グロビンイントロンIIフラグメ
ントをＰst I/末端鈍化ＶＲ1012 プラスミドと結合させた(図10)。このベクター
を次にＥcoＲＶによって制限化し、脱リン酸した。
【００８４】 ＲＳＶ Ｆの分泌体をＳalIを用いた消化によってプラスミドpＸＬ２より単離
し(実施例１；図５)、クレノウフラグメントポリメラーゼを用いた処理により末
端鈍化し、次いでＫpnIにより制限化し、５’ＫpnI,３’末端鈍化フラグメント
を産生した。ＨＳＶIgＤ配列は図12に示されるように、ＤＮＡ(ＳＥＱ IＤ番号:
７)、および誘導アミノ酸(ＳＥＱ IＤ番号:８)配列を有する合成オリゴペプチド
として合成した。
し(実施例１；図５)、クレノウフラグメントポリメラーゼを用いた処理により末
端鈍化し、次いでＫpnIにより制限化し、５’ＫpnI,３’末端鈍化フラグメント
を産生した。ＨＳＶIgＤ配列は図12に示されるように、ＤＮＡ(ＳＥＱ IＤ番号:
７)、および誘導アミノ酸(ＳＥＱ IＤ番号:８)配列を有する合成オリゴペプチド
として合成した。
【００８５】 gＤオリゴヌクレオチドは５’鈍化末端と３’ＫpnI認識配列を有する。単離し
たＲＳＶ Ｆフラグメント、gＤオリゴおよびＶＲ1012 プラスミドを用いて、３
方向結合を実施しプラスミドp82Ｍ35Ｂを産生した(図10)。
たＲＳＶ Ｆフラグメント、gＤオリゴおよびＶＲ1012 プラスミドを用いて、３
方向結合を実施しプラスミドp82Ｍ35Ｂを産生した(図10)。
【００８６】 実施例８ 本実施例では、in vitro におけるＲＳＶ Ｆ蛋白の発現および分泌を示す。
【００８７】 ＢＨＫ細胞は、実施例７に記載した通り調製され、p82Ｍ35Ｂによって取り込
まれ、その対の一方が実施例６に記載した通りに調製された自己由来のＲＳＶ
Ｆシグナルペプチド(pＸＬ２)を含むか、またはリポフェクチン(Ｇtibco/ＢＲＬ
)を用いてベクター要素のみ(プラセボ)によって取り込まれるかのいずれかであ
る。取り込み４８時間後に上澄液分画を回収し、Ｆ特異的酵素結合免疫吸着法(
ＥＬIＳＡ)を用いて、ＲＳＶ Ｆ蛋白の定量化に供した。３つの独立した取り込
みアッセイを各々のベクターについて行った。
まれ、その対の一方が実施例６に記載した通りに調製された自己由来のＲＳＶ
Ｆシグナルペプチド(pＸＬ２)を含むか、またはリポフェクチン(Ｇtibco/ＢＲＬ
)を用いてベクター要素のみ(プラセボ)によって取り込まれるかのいずれかであ
る。取り込み４８時間後に上澄液分画を回収し、Ｆ特異的酵素結合免疫吸着法(
ＥＬIＳＡ)を用いて、ＲＳＶ Ｆ蛋白の定量化に供した。３つの独立した取り込
みアッセイを各々のベクターについて行った。
【００８８】 捕捉剤として、１つのアフィニティー精製したマウスモノクロ-ナル抗ＲＳＶ
Ｆ抗体(２μg/ｍL)を、また、検出剤としてもう１つのビオチン化モノクローナ
ル抗ＲＳＶ Ｆ抗体(0.1μg/ｍL)を用いてＥＬIＳＡを行った。続いて、セイヨウ
ワサビペルオキシダーゼ標識アビジン(Ｐierce)を用いた。用いたＲＳＶ Ｆ標準
蛋白は、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、培養ウイルスの界面活
性剤溶菌液から精製した。
Ｆ抗体(２μg/ｍL)を、また、検出剤としてもう１つのビオチン化モノクローナ
ル抗ＲＳＶ Ｆ抗体(0.1μg/ｍL)を用いてＥＬIＳＡを行った。続いて、セイヨウ
ワサビペルオキシダーゼ標識アビジン(Ｐierce)を用いた。用いたＲＳＶ Ｆ標準
蛋白は、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、培養ウイルスの界面活
性剤溶菌液から精製した。
【００８９】 表11(下記)に得られた結果を示す。表11に見られるように、プラセボに比べて
、p82Ｍ35ＢとpＸＬ２は双方とも取り込み 48時間後にＢＨＫからのＦ蛋白の有
意な発現/分泌を媒介した。さらにp82Ｍ35Ｂ取り込みＢＨＫ細胞の上澄液分画に
おいては、pＸＬ２取り込み細胞の上澄液分画よりも顕著に高濃度のＦ蛋白が一
貫して検出され、後者の 5.4倍の改善を示した。これらの結果は、自己由来のＲ
ＳＶ Ｆシグナルペプチドのコード配列を５’ＵＴＲのコード化配列およびＨＳ
ＶIgＤのシグナルペプチドに置き換えることにより、in vitro でのＦ蛋白の発
現/分泌が有意に増大することを示している。
、p82Ｍ35ＢとpＸＬ２は双方とも取り込み 48時間後にＢＨＫからのＦ蛋白の有
意な発現/分泌を媒介した。さらにp82Ｍ35Ｂ取り込みＢＨＫ細胞の上澄液分画に
おいては、pＸＬ２取り込み細胞の上澄液分画よりも顕著に高濃度のＦ蛋白が一
貫して検出され、後者の 5.4倍の改善を示した。これらの結果は、自己由来のＲ
ＳＶ Ｆシグナルペプチドのコード配列を５’ＵＴＲのコード化配列およびＨＳ
ＶIgＤのシグナルペプチドに置き換えることにより、in vitro でのＦ蛋白の発
現/分泌が有意に増大することを示している。
【００９０】 実施例９ 本実施例では、p82Ｍ35Ｂを用いて実施された免疫原性試験を示す。
【００９１】 ＢＡＬＢ/cマウス(オス、６〜８週齢)(米国メイン州バーハーバー、Jackson
Ｌab.)の前脛骨筋の両側に、２×50μg(ＰＢＳ中１μg/μL)のp８２Ｍ３５Ｂ、p
ＸＬ２またはベクター要素のみ(プラセボ)を注射した。幾つかの群では、ＤＮＡ
注射５日前に、該筋肉を２×50μL(ＰＢＳ中 10μＭ)の心臓毒剤(Ｌatoxan、仏
国)で処理したが、その他の群ではこの前処理は行わなかった。これらのマウス
に６週間後、同じ投与量のプラスミドＤＮＡで抗原追加した。ポジティブコント
ロール群のマウスに、Ｈep２細胞(引用文献16)で増殖したＡ２サブタイプの臨床
ＲＳＶ株の 106プラーク形成単位(pfu)で鼻腔内(i.n.)免疫化を行った。
Ｌab.)の前脛骨筋の両側に、２×50μg(ＰＢＳ中１μg/μL)のp８２Ｍ３５Ｂ、p
ＸＬ２またはベクター要素のみ(プラセボ)を注射した。幾つかの群では、ＤＮＡ
注射５日前に、該筋肉を２×50μL(ＰＢＳ中 10μＭ)の心臓毒剤(Ｌatoxan、仏
国)で処理したが、その他の群ではこの前処理は行わなかった。これらのマウス
に６週間後、同じ投与量のプラスミドＤＮＡで抗原追加した。ポジティブコント
ロール群のマウスに、Ｈep２細胞(引用文献16)で増殖したＡ２サブタイプの臨床
ＲＳＶ株の 106プラーク形成単位(pfu)で鼻腔内(i.n.)免疫化を行った。
【００９２】 免疫化マウスから得られた抗血清を、特異的ＥＬＩＳＡを用いて抗ＲＳＶ ＦI
gＧ抗体力価の分析およびＲＳＶ特異的プラーク減少力価の分析を行った。免疫
アフィニティー精製したＲＳＶ Ｆ蛋白(50ng/ｍL)を塗布した 96ウェルプレート
および免疫血清の２倍連続血清希釈液を用いてＥＬIＳＡを行った。アルカリホ
スファターゼ抱合ヤギ抗マウスIgＧ抗体(カナダ国オンタリオ州 Ｍississauga、
Jackson IｍｍunoＲes.)を二次抗体として使用した。プラーク減少力価は、ワク
チン品質のベロ細胞を用いてＰrinceら(引用文献19)に従って決定した。免疫血
清の４倍連続希釈液を 50pfuのＲＳＶ長株(ＡＴＣＣ)と共に５％のＣＯ2存在下
、培養温度 37℃で１時間培養し、混合物を用いてベロ細胞に感染させた。プラ
ークを 80％メタノールで固定し、５日後にマウス抗ＲＳＶ ＦモノクローナルIg
Ｇ１抗体およびペルオキシダーゼ抱合ロバ抗マウスIgＧ抗体(カナダ国オンタリ
オ州 Ｍississauga、Jackson IｍｍunoＲes.)を用いて展開した。ＲＳＶ特異的
プラーク減少力価は、プラーク数において 60％減少となる血清試料の希釈とし
て定義した。ＥＬＩＳＡおよびプラーク減少アッセイは双方とも２回実施し、デ
ータは２回の測定平均を表した。
gＧ抗体力価の分析およびＲＳＶ特異的プラーク減少力価の分析を行った。免疫
アフィニティー精製したＲＳＶ Ｆ蛋白(50ng/ｍL)を塗布した 96ウェルプレート
および免疫血清の２倍連続血清希釈液を用いてＥＬIＳＡを行った。アルカリホ
スファターゼ抱合ヤギ抗マウスIgＧ抗体(カナダ国オンタリオ州 Ｍississauga、
Jackson IｍｍunoＲes.)を二次抗体として使用した。プラーク減少力価は、ワク
チン品質のベロ細胞を用いてＰrinceら(引用文献19)に従って決定した。免疫血
清の４倍連続希釈液を 50pfuのＲＳＶ長株(ＡＴＣＣ)と共に５％のＣＯ2存在下
、培養温度 37℃で１時間培養し、混合物を用いてベロ細胞に感染させた。プラ
ークを 80％メタノールで固定し、５日後にマウス抗ＲＳＶ ＦモノクローナルIg
Ｇ１抗体およびペルオキシダーゼ抱合ロバ抗マウスIgＧ抗体(カナダ国オンタリ
オ州 Ｍississauga、Jackson IｍｍunoＲes.)を用いて展開した。ＲＳＶ特異的
プラーク減少力価は、プラーク数において 60％減少となる血清試料の希釈とし
て定義した。ＥＬＩＳＡおよびプラーク減少アッセイは双方とも２回実施し、デ
ータは２回の測定平均を表した。
【００９３】 これらの試験結果を下記の表12 に示す。血清抗体反応の誘導(表12)に関して
は、p82Ｍ35Ｂは、使用されたＤＮＡ投与量および免疫化法の下で、心臓毒剤前
処理の必要性無しで効果的であり、２回免疫化後 7.2±1.1(log2力価/100)の抗
Ｆ IgＧ力価および 11.8±0.9(log2)のＲＳＶ特異的プラーク減少力価となった
。それに対し、心臓毒剤前処理無しでpＸＬ２によって誘発された抗体力価はそ
れより有意に低かった(2.9±2.3 のIgＧ力価および 8.2±1.9 のプラーク減少力
価)。しかし、pＸＬ２により誘発された血清抗体反応は、心臓毒剤前処理工程に
よって有意に改善した(7.4±1.1 のIgＧ力価および 10.5±0.8 のプラーク減少
力価)。プラセボは、心臓毒剤前処理工程の有無にかかわらず検出し得る血清抗
体反応を誘発することはできなかった。
は、p82Ｍ35Ｂは、使用されたＤＮＡ投与量および免疫化法の下で、心臓毒剤前
処理の必要性無しで効果的であり、２回免疫化後 7.2±1.1(log2力価/100)の抗
Ｆ IgＧ力価および 11.8±0.9(log2)のＲＳＶ特異的プラーク減少力価となった
。それに対し、心臓毒剤前処理無しでpＸＬ２によって誘発された抗体力価はそ
れより有意に低かった(2.9±2.3 のIgＧ力価および 8.2±1.9 のプラーク減少力
価)。しかし、pＸＬ２により誘発された血清抗体反応は、心臓毒剤前処理工程に
よって有意に改善した(7.4±1.1 のIgＧ力価および 10.5±0.8 のプラーク減少
力価)。プラセボは、心臓毒剤前処理工程の有無にかかわらず検出し得る血清抗
体反応を誘発することはできなかった。
【００９４】 この傾向は、防御試験の結果(表12)に拡張させることができた。ベクターp82
Ｍ35Ｂは心臓毒剤前処理無しで肺のＲＳＶ感染に対し完全防御を与えた。それに
対し、pＸＬ２は同一条件で部分的な防御を与えるのみであった。しかし、免疫
化法に心臓毒剤前処理工程を含めた場合はpＸＬ２ベクターにより完全防御が達
成された。プラセボでは、心臓毒剤前処理工程の有無にかかわらず防御は見られ
なかった。
Ｍ35Ｂは心臓毒剤前処理無しで肺のＲＳＶ感染に対し完全防御を与えた。それに
対し、pＸＬ２は同一条件で部分的な防御を与えるのみであった。しかし、免疫
化法に心臓毒剤前処理工程を含めた場合はpＸＬ２ベクターにより完全防御が達
成された。プラセボでは、心臓毒剤前処理工程の有無にかかわらず防御は見られ
なかった。
【００９５】 これらの結果は、自己由来ＲＳＶ Ｆシグナルペプチドのコード化配列を５’
ＵＴＲおよびＨＳＶIgＤのシグナルペプチドのコード化配列に置き換えることに
より、in vitro で評価されたＦ蛋白の発現/分泌(実施例８)における有意な増大
のみならず、Ｆ蛋白に対する免疫原性、またマウスモデルで評価されたＲＳＶ感
染に対する防御能力も増大することを示している。
ＵＴＲおよびＨＳＶIgＤのシグナルペプチドのコード化配列に置き換えることに
より、in vitro で評価されたＦ蛋白の発現/分泌(実施例８)における有意な増大
のみならず、Ｆ蛋白に対する免疫原性、またマウスモデルで評価されたＲＳＶ感
染に対する防御能力も増大することを示している。
【００９６】 (開示の概要) 本開示を要約すると、本発明は、ＲＳＶ Ｆ蛋白をコード化する遺伝子を含む
ある一定の新規のベクター、このようなベクターを用いる免疫化法およびこのよ
うなベクターを用いる診断法を提供する。本発明の範囲内での変更は可能である
。
ある一定の新規のベクター、このようなベクターを用いる免疫化法およびこのよ
うなベクターを用いる診断法を提供する。本発明の範囲内での変更は可能である
。
【００９７】
【表１】
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表３】
【０１００】
【表４】
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
【表６】
【０１０３】
【表７(a)】
【０１０４】
【表７(b)】
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
【表１０】
【０１０８】
【表１１】
【０１０９】
【表１２】
【０１１０】 参考文献
【０１１１】
【表１３】
【０１１２】
【表１４】
【図１】 呼吸系発疹ウイルスのＦ蛋白をコード化する遺伝子の制限マップを示す図であ
る。
る。
【図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ】 自己由来のシグナルペプチド(ＳＰ)を有する呼吸系発疹ウイルスのＦ蛋白の膜
付着形をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列(ＳＥＱ IＤ番号:１)、および
それによりコード化されたＲＳＶ Ｆ蛋白のアミノ酸配列(ＳＥＱ IＤ番号:２)を
示す図である。
付着形をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列(ＳＥＱ IＤ番号:１)、および
それによりコード化されたＲＳＶ Ｆ蛋白のアミノ酸配列(ＳＥＱ IＤ番号:２)を
示す図である。
【図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ】 自己由来のシグナルペプチド配列(ＳＰ)を有し、膜内外領域を欠如するＲＳＶ
Ｆ蛋白の分泌形をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列(ＳＥＱ IＤ番号:３
)、およびそれによりコード化された膜内外領域を欠如する切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白
のアミノ酸配列(ＳＥＱ IＤ番号:４)を示す図である。
Ｆ蛋白の分泌形をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列(ＳＥＱ IＤ番号:３
)、およびそれによりコード化された膜内外領域を欠如する切頭形ＲＳＶ Ｆ蛋白
のアミノ酸配列(ＳＥＱ IＤ番号:４)を示す図である。
【図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ】 膜内外領域を欠如するＲＳＶ Ｆ蛋白の分泌形をコード化する遺伝子を含有す
るプラスミドpＸＬ１の構築を示す図である。
るプラスミドpＸＬ１の構築を示す図である。
【図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ】 膜内外領域を欠如するＲＳＶ Ｆ蛋白の分泌形をコード化する遺伝子を含有し
、ウサギβ-グロビンイントロンII配列を含有するプラスミドpＸＬ２の構築を示
す図である。
、ウサギβ-グロビンイントロンII配列を含有するプラスミドpＸＬ２の構築を示
す図である。
【図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ】 ＲＳＶ Ｆ蛋白の完全長の膜付着形をコード化する遺伝子を含有するプラスミ
ドpＸＬ３の構築を示す図である。
ドpＸＬ３の構築を示す図である。
【図７】 ＲＳＶ Ｆ蛋白の膜付着形をコード化する遺伝子を含有し、ウサギβ-グロビン
イントロンII配列を含有するプラスミドpＸＬ４の構築を示す図である。
イントロンII配列を含有するプラスミドpＸＬ４の構築を示す図である。
【図８】 ウサギβ-グロビンイントロンII配列(ＳＥＱ IＤ番号:５)に関するヌクレオチ
ド配列を示す図である。
ド配列を示す図である。
【図９】 ＲＳＶチャレンジ後のＤＮＡ免疫化マウスにおける肺サイトカイン発現プロフ
ィルを示す図である。
ィルを示す図である。
【図１０】 膜内外領域を欠如するＲＳＶ Ｆ蛋白の分泌形をコード化する遺伝子を含有し
、ウサギβ-グロビンイントロンII配列およびシグナルペプチド配列ＨＳＶ IgＤ
を含有するプラスミドp82Ｍ35Ｂの組み立てを示す図である。
、ウサギβ-グロビンイントロンII配列およびシグナルペプチド配列ＨＳＶ IgＤ
を含有するプラスミドp82Ｍ35Ｂの組み立てを示す図である。
【図１１】 プラスミドＶＲ-1012 のヌクレオチド配列(ＳＥＱ IＤ番号:６)を示す図であ
る。
る。
【図１２】 ＤＮＡ(ＳＥＱ IＤ番号:７)および合成オリゴペプチドとして合成されたＨＳ
Ｖ IgＤシグナルペプチド配列の誘導アミノ酸(ＳＥＱ IＤ番号:８)配列を示す図
である。
Ｖ IgＤシグナルペプチド配列の誘導アミノ酸(ＳＥＱ IＤ番号:８)配列を示す図
である。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年９月５日（２００１．９．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/00 31/14 31/14 37/04 37/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エヴァシシン、 マリー イー． カナダ国 エム２アール ３エヌ７ オン タリオ州 トロント トレスデイル アヴ ェニュー 120 アパートメント 1506 (72)発明者 サンバラ、 サリーアプラカシュ カナダ国 エル３エス １ワイ１ オンタ リオ州 マーカム ハーネス サークル 50 (72)発明者 クライン、 マイケル エイチ． カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウイロウデイル モンロー ブー ルヴァード 16 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA06 DA02 EA04 FA02 GA11 HA17 4C085 AA03 AA13 AA14 AA16 AA21 BA57 BA83 BB23 CC08 DD62 DD86 EE01 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 MA01 NA14 ZA59 ZB01 ZB33
Claims (24)
- 【請求項１】 宿主に in vivo 投与するためのベクターであって、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を欠くＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードし、宿主
内でのＲＳＶ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、および 宿主内で前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質を発現するために前記ヌクレオチド配列と動作
可能に結合したプロモーター配列 を含むベクター。 - 【請求項２】 異種シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が
、単純疱疹ウイルスI(ＨＳＶ I)gＤをコードする請求項１に記載のベクター。 - 【請求項３】 前記第１のヌクレオチド配列が、トランスメンブランコード
領域を欠くＲＳＶ Ｆ蛋白質断片をコードする請求項１に記載のベクター。 - 【請求項４】 前記プロモーター配列が iｍｍediate early サイトメガロ
ウイルスプロモーターである請求項１に記載のベクター。 - 【請求項５】 宿主内で前記ベクターから in vivo で発現されるときの前
記ＲＳＶ Ｆ蛋白質の免疫保護能を増強するために、更に第２のヌクレオチド配
列を含む請求項１に記載のベクター。 - 【請求項６】 前記第２のヌクレオチド配列が、異常なｍＲＮＡスプライシ
ングを防止するために、一対のスプライス部位を含む請求項５に記載のベクター
。 - 【請求項７】 前記第２のヌクレオチド配列が、前記第１のヌクレオチド配
列と前記プロモーター配列との間に配置された請求項６に記載のベクター。 - 【請求項８】 前記第２のヌクレオチド配列が、ウサギβ-グロビンイント
ロンIIのヌクレオチド配列である請求項７に記載のベクター。 - 【請求項９】 プラスミドベクターである請求項１に記載のベクター。
- 【請求項１０】 図１０に示したプラスミドp８２Ｍ３５Ｂである請求項１
に記載のベクター。 - 【請求項１１】 ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫保護反応を宿主内に起こす
ために、宿主に in vivo 投与するための免疫原性組成物であって、請求項１で
請求するベクターおよび薬剤として許容し得るそのための担体を含む組成物。 - 【請求項１２】 呼吸器シンシチウムウイルス(ＲＳＶ)による感染によって
発症する疾患に対して宿主を免疫する方法であって、請求項１１に記載の免疫原
性組成物の有効量を前記宿主に投与することを含む方法。 - 【請求項１３】 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を欠き、ＲＳＶ Ｆ蛋
白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドを含んだＲＳＶ Ｆ蛋白質をコー
ドするヌクレオチド配列を使用する方法であって、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を有するＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする遺
伝子を分離すること、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、ＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列で置換することによって、前記ヌクレオチド配列を形成すること、 前記ヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列と動作可能に連結すること
によるベクターの産生において、前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫反応を起こ
すために前記ベクターを宿主に投与するとき、前記制御配列は前記ＲＳＶ Ｆ蛋
白質の発現を指示するものであること、および 前記ベクターを宿主に投与すること を含む方法。 - 【請求項１４】 異種シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列
が、単純疱疹ウイルスI(ＨＳＶ I)gＤをコードする請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 ＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列が、
トランスメンブラン領域を欠くＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする請求項１３に記載
の方法。 - 【請求項１６】 前記少なくとも１個の制御配列が、iｍｍediate early サ
イトメガロウイルスプロモーターを含む請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記宿主内で前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する免疫保護を増
強するために、前記ヌクレオチド配列を免疫保護増強配列と動作可能に連結する
段階を含む請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記免疫保護増強配列を、前記制御配列と前記ヌクレオチ
ド配列の間で前記ベクター中に導入する請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記免疫保護増強配列が、異常なｍＲＮＡスプライシング
を防止するために、一対のスプライス部位を含む請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記免疫保護増強配列が、ウサギβ-グロビンイントロン
II である請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記ヌクレオチド配列が、プラスミドベクターp８２Ｍ３
５Ｂの中に含まれる請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２２】 呼吸器シンシチウムウイルス(ＲＳＶ)による感染によって
発症する疾患に対して、宿主を保護するワクチンを生産する方法であって、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列を有するＲＳＶ Ｆ蛋白質をコードする第
１のヌクレオチド配列を分離すること、 自家ＲＳＶ Ｆシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、ＲＳ
Ｖ Ｆ蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列で置換することによって、第２のヌクレオチド配列を形成すること、 前記第２のヌクレオチド配列を少なくとも１個の制御配列と動作可能に連結す
ることによる非複製性ベクターの産生において、前記ＲＳＶ Ｆ蛋白質に対する
免疫反応を起こすために宿主に投与するとき、前記制御配列は前記ＲＳＶ Ｆ蛋
白質の発現を指示するものであること、および 前記ベクターを in vivo 投与のためのワクチンとして製剤すること を含む方法。 - 【請求項２３】 前記非複製性ベクターがプラスミドベクターp８２Ｍ３５
Ｂである請求項２２に記載の方法。 - 【請求項２４】 請求項２２に記載の方法によって生産されるワクチン。
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