CN116836243B - 呼吸道合胞病毒融合前f蛋白突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体及其应用，属于生物工程技术领域。突变方式包括以下两种：(1)在野生型融合前F蛋白全长序列基础上进行氨基酸点突变；(2)将野生型融合前F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，获得SEQ ID NO.2所示序列，并在该序列的基础上再进行氨基酸点突变。本发明突变体的表达量和融合前构象稳定性均强于野生型F蛋白，对机体具有较强的免疫保护作用，可用于以融合前F蛋白为抗原的RSV诊断试剂、抗体及各种类型疫苗的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体及其应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是常见的呼吸道感染病原体，易感人群主要为婴幼儿，可导致患者出现细支气管炎和肺炎等症状。几乎所有婴幼儿在成长过程中至少会经历过一次RSV感染，发病率最高为出生后的2至3个月。全球范围内由RSV所引起的婴幼儿急性下呼吸道感染发生率约为22％，发展中国家的发病率是发达国家2倍以上(Lancet,2010，375：1545-1555)。据统计，仅2015年，全球因RSV引起的急性下呼吸道感染病例超过3300万次，导致约320万人住院治疗，其中包括约6万名5岁以下儿童住院甚至死亡(Lancet,2017，390：946-958)。尽管RSV给人类健康和社会经济造成了巨大的损害，但目前尚无有效的疫苗上市。
RSV融合蛋白(F蛋白)属于I类跨膜蛋白，由574个氨基酸残基组成。在宿主细胞内最初生成为F蛋白的前体F0，F0蛋白在高尔基体上糖基化，随后通过细胞内弗林蛋白酶水解释放出27个氨基酸组成的多肽pep27(J Biol Chem，2001，276：31642-31650)，在该肽段的N和C端切割位点分别产生F1和F2两个亚基，F2亚基由信号肽SP和七肽重复序列HRC组成，F1亚基由融合肽FP、七肽重复区HRA和HRB、Domain I和Domain II、跨膜区TM以及胞质域CP组成，F1和F2通过二硫键连接，形成一个异二聚体(Viruses-Basel，2013，5：211-225)。三个异二聚体组装成一个成熟的F蛋白三聚体。RSV F蛋白三聚体不稳定，存在融合前(prefusion)和融合后(postfusion)两种构象。在病毒包膜表面的F蛋白最初为亚稳态的prefusion构象，当病毒吸附到细胞膜表面后，prefusion F蛋白在细胞受体、温度和离子浓度等因素的触发下，其构象发生改变，生成高度稳定的postfusion F三聚体，该过程释放能量，可介导病毒包膜与细胞膜发生融合(Science，2013，340：1113-1117)。由于prefusion F的构象高度不稳定，因此，在体外分离纯化得到的蛋白通常为postfusion F(PNAS，2011，108：9619-9624)。但亚稳态的prefusion F构象是病毒介导膜融合过程所必需，也是诱导人体产生免疫应答的重要抗原。因此，如何获得稳定且高表达的prefusion F蛋白已成为RSV抗体类药物和疫苗开发面临的重要难题。
发明内容
本发明的目的在于提出构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体及其应用，本发明突变体的表达量和融合前构象稳定性均强于野生型F蛋白，对机体具有较强的免疫保护作用，可用于以融合前F蛋白为抗原的RSV诊断试剂、抗体及各种类型疫苗的制备。
本发明中所使用的术语“野生型”表示自然界中存在，未经过人工的任何修饰或加工产物。本领域技术人员了解，野生RSV F蛋白可以是多种序列，这些序列可能存在细微差别，但生物活性基本一致。本发明中提及的野生型全长F蛋白参照GenBank提供的序列，具体序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明中使用的DS-Cav1为本领域专业技术人员熟知的一种融合前RSV F蛋白突变体，Addavax为疫苗研发过程中较为常见的佐剂。
本发明的目的在于提供多种具融合前构象的F蛋白突变体及其应用，这些突变体构象稳定，且在哺乳动物细胞中具较高表达水平，旨在克服上述背景介绍中存在的技术问题。
主要氨基酸序列如表1所示：
表1氨基酸缩写表
| 名称 | 三字母 | 单字母 | 侧链极性 | 疏水参数 |
| 丙氨酸 | Ala | A | 非极性 | 1.8 |
| 精氨酸 | Arg | R | 极性 | -4.5 |
| 天冬酰胺 | Asn | N | 极性 | -3.5 |
| 天冬氨酸 | Asp | D | 极性 | -3.5 |
| 半胱氨酸 | Cys | C | 非极性 | 2.5 |
| 谷氨酸 | Glu | E | 极性 | -3.5 |
| 谷氨酰胺 | Gln | Q | 极性 | -3.5 |
| 甘氨酸 | Gly | G | 非极性 | -0.4 |
| 组氨酸 | His | H | 极性 | -3.2 |
| 异亮氨酸 | IIe | I | 非极性 | 4.5 |
| 亮氨酸 | Leu | L | 非极性 | 3.8 |
| 赖氨酸 | Lys | K | 极性 | -3.9 |
| 甲硫氨酸 | Met | M | 非极性 | 1.9 |
| 苯丙氨酸 | Phe | F | 非极性 | 2.8 |
| 脯氨酸 | Pro | P | 非极性 | -1.6 |
| 丝氨酸 | Ser | S | 极性 | -0.8 |
| 苏氨酸 | Thr | T | 极性 | -0.7 |
| 色氨酸 | Trp | W | 非极性 | -0.9 |
| 酪氨酸 | Tyr | Y | 极性 | -1.3 |
| 缬氨酸 | Val | V | 非极性 | 4.2 |
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体，其特征在于，突变方式包括以下两种：
(1)在野生型融合前F蛋白全长序列基础上进行氨基酸点突变；
(2)将野生型融合前F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，得到突变体序列如SEQ ID NO.2所示，在SEQ ID NO.2序列基础上再进行氨基酸点突变。
作为本发明的进一步改进，在野生型融合前F蛋白氨基酸序列第76位的I突变为V，第190位的S突变为F，第215位的S突变为P，得到F蛋白全长突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，发生第一次突变后，还进行第二次突变，第二次突变为上述突变体中第67位和第207位替换为疏水氨基酸。
作为本发明的进一步改进，所述疏水氨基酸选自L、I、P、M、F、W中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，所述突变方式包括如下：
(1)在第67为N突变L的基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(2)在第67位N突变为I的基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(3)在第67位N突变为P突变基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(4)在第67位N突变为M突变基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(5)在第67位N突变为F突变基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(6)在第67位N突变为W突变基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸。
通过以上突变，获得了一系列含或不含TM/CP的F蛋白突变体(表1所示)，其表达量和融合前构象稳定性均强于野生型F蛋白，其中多数表达量和稳定性优于DS-Cav1。
表2本发明构建的F蛋白突变体
作为本发明的进一步改进，将所述F蛋白全长突变体的第514至574位氨基酸删除，并在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，再进行氨基酸序列突变，其氨基酸序列第76位的I突变为V，第190位的S突变为F，第215位的S突变为P，得到F蛋白全长突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明进一步保护编码上述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体的核酸。其核酸序列为密码子优化后的序列，使其符合哺乳动物密码子使用偏好性。
本发明进一步保护如上述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体在制备呼吸道合胞病毒抗体中的应用。
本发明进一步保护如上述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体在制备呼吸道合胞病毒诊断试剂中的应用。
本发明进一步保护如上述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体在制备呼吸道合胞病毒重组蛋白疫苗、核酸疫苗、载体疫苗或病毒样颗粒疫苗中的应用。
本发明进一步保护如上述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体在以所述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体为抗原的RSV诊断试剂、抗体及各种类型疫苗的制备中的应用。
本发明具有如下有益效果：本发明制得的突变体表达量和融合前构象稳定性均强于野生型F蛋白，其中多数表达量和稳定性优于DS-Cav1。从中选择表达量和稳定性较好的Pre F-ΔTP-7、Pre F-ΔTP-16开展了动物体内免疫原性研究。体内研究结果表明，将PreF-ΔTP-7和Pre F-ΔTP-16免疫动物后，动物血清中产生了高滴度的病毒中和抗体，可显著抑制RSV感染。RSV攻毒实验结果显示，接种F蛋白突变体的小鼠肺组织中的病毒载量、核酸和炎症因子分泌水平均显著降低，且未观察到肺部炎症反应症状。以上研究结果表明，本发明中的F蛋白突变体具稳定的融合前构象、且具有较高的表达量，并对机体具有较强的免疫保护作用，可用于以融合前F蛋白为抗原的RSV诊断试剂、抗体及各种类型疫苗的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中所述的F蛋白及其突变体在HEK 293T细胞中表达水平检测结果。
图2为本发明实施例中所述的F蛋白及其突变体在HEK 293T细胞膜上热稳定性研究结果。
图3为本发明实施例中所述的F蛋白突变体在第2次免疫后诱导小鼠中和抗体滴度检测结果。
图4为本发明实施例中所述的F蛋白突变体在第3次免疫后诱导小鼠中和抗体滴度检测结果。
图5为本发明实施例中所述的F蛋白突变体免疫组小鼠在接受RSV攻毒后，其肺组织中病毒载量检测结果。
图6为本发明实施例中所述的F蛋白突变体免疫组小鼠在接受RSV攻毒后，其肺组织中核酸水平检测结果。
图7为本发明实施例中所述的F蛋白突变体免疫组小鼠在接受RSV攻毒后，其肺组织中炎症因子IFN-Y分泌水平检测结果。
图8为本发明实施例中所述的F蛋白突变体免疫组小鼠在接受RSV攻毒后，其肺组织中炎症因子IL-6分泌水平检测结果。
图9为本发明实施例中所述的F蛋白突变体免疫组小鼠在接受RSV攻毒后，其肺组织切片H&E染色结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1重组RSV F突变体的表达与纯化
将野生型F蛋白或突变F蛋白基因克隆到pcDNA3.1载体，随后转染至HEK293T细胞，转染4-5天后，收集细胞上清液并离心，将上清液通过镍柱进行纯化，测定样品中的蛋白浓度，计算各组样品中F蛋白的相对表达量，利用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western blot方法，对目的蛋白进行确证。
结果如图1所示，可溶性F蛋白突变体在HEK 293T细胞中的表达量明显高于野生型F蛋白(Fwt-ΔTP)，其中多数突变体表达量高于DS-Cav1。
实施例2稳定性研究
(1)F蛋白突变体在细胞膜上的稳定性研究
将HEK293T细胞接种于培养皿中，待细胞长至80％时，利用Lipofectamine2000转染试剂将携带F蛋白全长及其突变体的pcDNA3.1质粒转染至HEK293T细胞中，转染48h后，收集细胞，在55℃加热10min，设置不加热的细胞对照组。利用Motavizumab和D25单克隆抗体分别标记细胞中的F蛋白和融合前F蛋白，在室温孵育2h后，加入荧光二抗，于室温孵育1h，PBS清洗后，利用流式细胞仪检测荧光强度。
结果如图2所示，在55℃加热条件下，F蛋白全长突变体的融合前构象残留率明显高于野生型F蛋白(Fwt)，表明其具有较高的热稳定性。
(2)可溶性F蛋白突变体稳定性研究
a.热稳定性实验
将携带野生型F蛋白或F蛋白突变体基因的pcDNA3.1质粒转染至HEK 293T细胞中，转染4-5天后收集上清，将收集后的上清置于25℃或55℃分别加热10min、30min，随后进行Dot Blot实验。
Dot Blot实验具体方案如下：将上述处理后的细胞上清液点涂于硝酸纤维素膜上，待其晾干后，使用5％脱脂奶粉封闭1h，TBST洗三次，与prefusion F蛋白特异性一抗D25(1∶2000)或Motavizumab(1∶2000)室温孵育2h，TBST洗后与HRP人源二抗室温孵育1h，TBST洗三次，与显影液反应后进行显影，ImageJ软件统计灰度值，以未加热处理的对照组设置为1，实验组与对照组进行比较得到prefusion F残留率。
b.储存稳定性实验
将携带野生型F蛋白或F蛋白突变体基因的pcDNA3.1质粒转染至HEK 293T细胞中，转染4-5天后收集上清，上清收集后分别置于4℃或25℃环境中，在储存后第1天、5天、10天、30天进行Dot Blot实验，ImageJ软件统计灰度值。将第1天的对照组设置为1，实验组与对照组进行比较得到prefusion F残留率。
c.反复冻融稳定性实验
将携带野生型F蛋白或F蛋白突变体基因的pcDNA3.1质粒转染至HEK 293T细胞中，转染4-5天后收集上清，将收集的上清反复冻融0、10次后进行Dot blot实验。ImageJ软件统计灰度值，将未冻融的对照组设置为1，实验组与对照组进行比较得到prefusion F残留率。
d.酸碱稳定性实验
将携带野生型F蛋白或F蛋白突变体基因的pcDNA3.1质粒转染至HEK 293T细胞中，转染4-5天后收集上清，将蛋白上清pH值调节为3.5或10，孵育1h后，再调至pH为中性，上清液进行进行Dot blot实验。ImageJ软件统计灰度值，将未进行酸碱处理的对照组设置为1，实验组与对照组进行比较得到prefusion F残留率。
以上研究结果表明(表3所示)，可溶性F蛋白突变体在55℃加热、反复冻融、酸/碱、25℃储存等条件下均表现出了较高的稳定性，且其稳定性均强于野生型F蛋白(Fwt-ΔTP)，其中多数突变体的在上述条件下的prefusion F残留率高于DS-Cav1，其中Pre F-ΔTP-7的稳定性最佳。
表3不同条件下F蛋白突变体稳定性研究结果
实施例3体内免疫原性研究
将6周龄BALB/c小鼠随机分组，设置组别为：空白对照组、佐剂组(Addavax)、低剂量组(Addavax+重组蛋白)、高剂量组(Addavax+重组蛋白)。将Addavax与重组F蛋白及其突变体进行混合，随后将通过右后腿外侧肌肉注射的方式将重组蛋白注入小鼠体内，高、低剂量重组蛋白量分别为4μg/只、2μg/只，注射体积为50μL/只。在第14、28天分别以相同方式进行第2、3次免疫，注射蛋白的量和体积与第1次免疫相同。第24、38天分别取各组小鼠血清，检测血清中和抗体滴度，具体实验方法如下：
将HEp-2细胞接种在96孔板中，待细胞长至80％时，用MM培养基(含2％FBS的DMEM)梯度稀释血清，并将稀释后的血清与病毒液混合，将混合液放置在37℃孵育1h。随后，将病毒-血清混合液加入至铺有HEp-2细胞的培养板中，于37℃培养48h。随后，将细胞收集，加入4％多聚甲醛溶液于室温固定20min，离心后，用PBS将细胞清洗3次，0.1％Triton X-100破膜处理5min，PBS清洗2次后，加入5％BSA封闭1h。随后，加入RSV F蛋白特异性抗体，于室温孵育2h，PBS清洗2次后，加入荧光二抗，于室温孵育1h。采用流式细胞仪检测荧光强度，根据荧光强度值计算血清中和抗体滴度。
结果如图3-4所示，小鼠接种Pre F-ΔTP-7、Pre F-ΔTP-16两次后，其平均中和抗体滴度分别为1872、1213，接种DS-Cav1两次后，平均中和抗体滴度为163。在第3次免疫后，Pre F-ΔTP-7、Pre F-ΔTP-16处理组小鼠的平均中和抗体滴度分别为89642、45070，而相同条件下，DS-Cav1中和抗体为1839。
实施例4攻毒试验
在小鼠第3次免疫后，继续饲养30天，随后通过滴鼻的方式感染RSV，滴鼻前采用异氟烷将小鼠麻醉，随后将病毒稀释液缓缓滴入小鼠鼻腔，病毒滴度为2.5×106PFU/mL，滴鼻体积为100μL/只，在病毒感染后第5天，将小鼠安乐死，取其肺组织。采用RT-PCR、细胞病变(CPE)、ELISA、苏木精-伊红(H&E)染色方法分别检测肺组织中的核酸水平、病毒滴度、炎症因子分泌水平和病理变化。
结果如图5-9所示，经3次免疫的小鼠接受RSV攻毒后，其肺组织中的病毒载量和核酸水平显著低于佐剂(Addavax)免疫组小鼠，且明显低于DS-Cav1免疫组小鼠。接种Pre F-ΔTP-7突变体小鼠，其肺组织中平均病毒滴度降低2467倍，而DS-Cav1免疫组小鼠平均病毒滴度降低仅364倍。此外，免疫Pre F-ΔTP-7和Pre F-ΔTP-16的小鼠肺组织中的炎症因子显著低于Addavax佐剂免疫组小鼠，且H&E染色结果显示，Pre F-ΔTP-7和Pre F-ΔTP-16免疫组小鼠未出现明显的炎症浸润，且其保护效果强于DS-Cav1。
SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.2：
SEQ ID NO.3：
SEQ ID NO.4：
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体，其特征在于，
在野生型融合前F蛋白全长序列基础上进行氨基酸点突变，所述野生型融合前F蛋白全长序列如SEQ ID NO.1所示；
得到蛋白突变体如下表：
2.一种构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体，其特征在于，将野生型融合前F蛋白全长序列中的跨膜区/胞内区删除，并在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，得到突变体如SEQ ID NO.2所示，随后在SEQ ID NO.2基础上再进行氨基酸点突变，得到蛋白突变体如下表：
3.根据权利要求1所述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体，其特征在于，所述突变方式包括如下：
(1)在第67为N突变L的基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(2)在第67位N突变为I的基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(3)在第67位N突变为P突变基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(4)在第67位N突变为M突变基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(5)在第67位N突变为F突变基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸；
(6)在第67位N突变为W突变基础上，将第207V突变为L、I、P、M、F、W中任意一种氨基酸。
4.根据权利要求2所述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体，其特征在于，将所述F蛋白全长突变体的第514至574位氨基酸删除，并在其C末端连接fibritin/Throm/6his/Stretaq序列，再进行氨基酸序列突变，其氨基酸序列第76位的I突变为V，第190位的S突变为F，第215位的S突变为P，得到F蛋白全长突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.编码如权利要求1-4任一项所述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体的核酸。
6.如权利要求1-4任一项所述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体在制备呼吸道合胞病毒重组蛋白疫苗、载体疫苗或病毒样颗粒疫苗中的应用。
7.如权利要求5所述构象稳定和表达量较高的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突变体的核酸在制备核酸疫苗中的应用。
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