CN112226444A - 呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品 - Google Patents

呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品。该全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列包括S155C、S190F、V207L和S290C四个突变位点，保留了融合糖蛋白的跨膜区及胞内区，其序列表如序列1所示。还提供了一种含有全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列的猩猩复制缺陷型重组腺病毒载体pChAd63或人复制缺陷型重组腺病毒载体pAd26，腺病毒载体出发毒株为猩猩腺病毒63型或人腺病毒26型，缺失了腺病毒E1和E3区、且E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6。以及应用重组腺病毒的产品。本发明的重组腺病毒载体免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应，产生的抗体对融合前F识别能力较强，具有较好的免疫效果和免疫保护作用。

Description

呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺 病毒载体及其应用产品
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病毒病原，同时也是引起免疫缺陷患者和老年人等高危人群住院治疗及死亡的重要病毒病原。从婴幼儿感染情况看，1岁时有70％的婴幼儿感染过RSV，2岁时已全部感染过至少1次。从儿童感染RSV后的死亡情况看，在1月至1岁的儿童死亡原因中，RSV感染引起的死亡人数约占总数的6.7％，紧随疟疾位列第二位，5岁以下儿童因下呼吸道感染引起死亡的病因中，RSV感染引起的死亡人数约占总数的6.29％，紧随肺炎球菌排列第二位，在病毒病原中位列第一位。在我国，RSV是引起儿童流行性喘憋性肺炎(简称流喘肺炎)及儿童期应变性哮喘的主要病原，26.5％的婴幼儿急性呼吸道感染是由于RSV感染引起[5]。全球每年约有3310万5岁以下儿童感染RSV，其中约有320万感染儿童需要住院治疗，5.96万住院儿童死亡，这其中，99％的死亡发生在发展中国家，给世界各国尤其是发展中国家带来沉重的经济和社会负担。
RSV属肺病毒科、正肺病毒属，单股负链RNA包膜病毒[7]，病毒粒子直径为150-300nm，共编码11种蛋白，其中融合糖蛋白(Fusion glycoprotein，F)和黏附糖蛋白(Attachment glycoprotein，G)为主要中和抗原[8]，根据G蛋白抗原性存在的差异，RSV分为A和B两个亚型。F蛋白的抗原性较稳定，针对F蛋白的中和抗体对A、B两个亚型的RSV感染具有交叉保护作用，可减少高危人群对RSV感染的严重程度，在RSV流行季节，针对F蛋白的单克隆抗体(Palivizumab,帕利珠单抗)已用于对高危人群的预防，提示诱导产生足够高的针对RSV F蛋白的中和抗体的疫苗可以预防RSV感染。因此，F蛋白成为RSV疫苗研究的主要目标抗原。
RSV F蛋白属I型跨膜糖蛋白，最初翻译得到的是无活性前体形式F0，F0存在2个furin-like蛋白酶酶切位点，分别位于109/110氨基酸位点处和136/137氨基酸位点处，当F0通过高尔基体时，被furin-like蛋白酶在109/110氨基酸位点处和136/137氨基酸位点处分别酶切，产生3个片段，即：羧基端大片段F1、氨基端小片段F2和27个氨基酸的短片段p27(即RSV F蛋白编码序列aa110-136)，F1和F2通过2个二硫键结合在一起形成成熟的RSV F蛋白，p27被游离出来。成熟的RSV F主要存在两种构象状态：即亚稳态的融合前F(pre-fusionfusion glycoprotein，pre-F)构象和稳定的融合后F(post-fusion fusionglycoprotein，post-F)构象，为了从pre-F转变为post-F，包含有融合肽(fusion peptide，FP)和七肽重复A(heptad repeat A，HRA)的位于F1上的RR1(refolding region 1)(137-216aa)，由α-螺旋、β-折叠和loops的二级结构转变为一个长的、连续的α-螺旋，同时，位于F1蛋白N端的高度疏水的FP能够从病毒膜外展、并插入到靶细胞的细胞膜中。随后，包含七肽重复B(heptad repeat B，HRB)的RR2(refolding region2)重新定位到F蛋白顶部的另一侧，形成pre-F刺突C末端杆(C-terminal stem)。最后，HRB结合到HRA卷曲螺旋三聚物(coiled-coil trimer)，形成6HB结构(six-helix bundle)，从而完成膜融合，也完成了由亚稳定的pre-F结构转变为稳定post-F结构。
在已鉴定的RSV F蛋白的中和抗原表位中，SiteI主要位于post-F上，SiteII和SiteIV在pre-F和post-F上均存在，SiteIII主要位于pre-F，
Figure BDA0002649044260000021
和SiteV仅存在于pre-F。研究表明，在感染者血清中的具有保护作用的主要中和抗体是针对中和性抗原表位III、
Figure BDA0002649044260000022
和V的抗体，进一步研究显示，pre-F能够诱导机体产生更高活性的中和抗体、具有更好的保护作用。因此，近年来，pre-F成为RSV疫苗研制的重点与核心。
腺病毒载体因其安全性好、免疫原性强、生产方便等优点，被广泛用于疫苗载体，目前，使用最广泛的是人Ad5型腺病毒载体，但是超过90％的我国人群感染过Ad5，因而，严重干扰了疫苗的免疫效果。为避免预存Ad5预存免疫反应对疫苗免疫效果的影响，研究者选用人稀有血清型腺病毒、非人腺病毒载体替代Ad5用于疫苗研究，能够有效避免预存Ad5预存免疫反应对疫苗免疫效果的影响。鉴于猩猩63型腺病毒(chimpanzee adenovirusserotype 63，ChAd63)和人26型腺病毒(human adenovirus serotype 26，Ad26)在人体感染率低，且具有高度免疫原性等优点，以及尚未见ChAd63用作RSV疫苗研制的原因。
发明内容
本发明提供了一种呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品，以克服现有技术的问题。
为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。
一种呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列，该全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列包括S155C、S190F、V207L和S290C四个突变位点，保留了融合糖蛋白的跨膜区及胞内区，该全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列的序列表如序列1所示：
一种含有所述全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列的重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体为猩猩复制缺陷型重组腺病毒载体pChAd63，出发毒株为猩猩腺病毒63型，缺失了腺病毒E1和E3区、且E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6；
或者；
所述重组腺病毒载体为人复制缺陷型重组腺病毒载体pAd26，出发毒株为人腺病毒26型，缺失了腺病毒E1和E3区、且E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6。
优选地，所述缺失腺病毒E1和E3区，E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6的骨架载体pChAd63的序列表如序列2所示：
优选地，缺失腺病毒E1和E3区，E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6的骨架载体pAd26的序列表如序列3所示：
序列3：
ttaattaagaggtaggtttgagtagtgggcgtggctaaggtgactataaaggcgggtgtcttacgagggtctttttgcttttctgcagacatcatgaacgggactggcggggccttcgaaggggggctttttagcccttatttgacaacccgcctgccgggatgggccggagttcgtcagaatgtgatgggatcgacggtggatgggcgcccagtgcttccagcaaattcctcgaccatgacctacgcgaccgtggggaactcgtcgctcgacagcaccgccgcagccgcggcagccgcagccgccatgacagcgacgagactggcctcgagctacatgcccagcagcggtagtagcccctctgtgcccagttccatcatcgccgaggagaaactgctggccctgctggccgagctggaagccctgagccgccagctggccgccctgacccagcaggtgtccgagctccgcgaacagcagcagcagcaaaataaatgattcaataaacacagattctgattcaaacagcaaagcatctttattatttattttttcgcgcgcggtaggccctggtccacctctcccgatcattgagagtgcggtggattttttccaggacccggtagaggtgggattggatgttgaggtacatgggcatgagcccgtcccgtgggtggaggtagcaccactgcatggcctcgtgctctggggtcgtgttgtagatgatccagtcatagcaggggcgctgggcgtggtgctggatgatgtccttgaggaggagactgatggccacggggagccccttggtgtaggtgttggcaaaacggttgagctgggagggatgcatgcggggggagatgatgtgcagtttggcctggatcttgaggttggcgatgttgccacccagatcccgccgggggttcatgttgtgcaggaccaccagaacggtgtagcccgtgcacttggggaacttgtcatgcaacttggaagggaatgcgtggaagaatttggagacgcccttgtgcccgcccaggttttccatgcactcatccatgatgatggcaatgggcccgtgggctgcggctttggcaaagacgtttctggggtcagagacatcgtaattatgctcctgggtgagatcatcataagacattttaatgaatttggggcggagggtgccagattgggggacgatggttccctcgggccccggggcgaagttcccctcgcagatctgcatctcccaggctttcatctcggagggggggatcatgtccacctgcggggcgatgaaaaaaacggtttccggggcgggggtgatgagctgcgaggagagcaggtttctcaacagctgggacttgccgcacccggtcgggccgtagatgaccccgatgacgggttgcaggtggtagttcaaggacatgcagctgccgtcgtcccggaggaggggggccacctcgttgagcttgtctctgacttggaggttttcccggacgagctcgccgaggaggcggtccccgcccagcgagagaagctcttgcagggaagcaaagtttttcaggggcttgagcccgtcggccatgggcatcttggcgagggtctgcgagaggagctccaggcggtcccagagctcggtgacgtgctctacggcatctcgatccagcagacttcctcgtttcgggggttgggacgactgcgactgtagggcacgagacgatgggcgtccagcgcggccagcgtcatgtccttccagggtctcagggtccgcgtgagggtggtctccgtcacggtgaaggggtgggccgcgggctgggcgcttgcaagggtgcgcttgagactcatcctgctggtgctgaaacgggcacggtcttcgccctgcgcgtcggcgagatagcagttgaccatgagctcgtagttgagggcctcggcggcgtggcccttggcgcggagcttgcccttggaagagcgcccgcaggcgggacagaggagggattgcagggcgtagagcttgggcgcgagaaagacggactcgggggcgaaggcgtccgctccgcagtgggcgcagacggtctcgcactcgactagccaggtgagctcgggctgctcggggtcaaaaaccagttttcccccgttctttttgatgcgcttcttacctcgcgtctccatgagtctgtgtccgcgctcggtgacaaacaggctgtctgtgtccccgtagacggacttgatgggcctgtcctgcaggggcgtcccgcggtcctcctcgtagagaaactcagaccactctgagacgaaggcgcgcgtccacgccaagacaaaggaggccacgtgcgaggggtagcggtcgttgtccaccagggggtccaccttttccacggtatgcaggcacatgtccccctcctccgcatccaagaaggtgattggcttgtaggtgtaggccacgtgacctggggttcccgacgggggggtataaaagggggcgggtctgtgctcgtcctcactctcttccgcgtcgctgtccacgagcgccagctgttggggtaggtattccctctcaagagcgggcatgacctcggcactcaggttgtcagtttctagaaacgaggaggatttgatgtgggcctgccctgccgcgatgctttttaggagactttcatccatctggtcagaaaagactatttttttattgtcaagcttggtggcgaaggagccatagagggcgtttgagagaagcttggcgatggatctcatggtctgatttttgtcacggtcggcgcgctccttggccgcgatgttgagctggacatattcgcgcgcgacacacttccattcggggaagacggtggtgcgctcgtcgggcacgatcctgacgcgccagccgcggttatgcagggtgaccaggtccacgctggtggccacctcgccgcgcaggggctcgttggtccagcagagtctgccgcccttgcgcgagcagaacgggggcagcacatcaagcagatgctcgtcaggggggtccgcatcgatggtgaagatgcccggacagagttccttgtcaaaataatcgatttttgaggatgcatcgtccaaggccatctgccactcgcgggcggccagcgctcgctcgtaggggttgaggggcggaccccaaggcatgggatgcgtgagggcggaggcgtacatgccgcagatgtcatagacatagatgggctccgagaggatgccgatgtaggtgggatagcagcgccccccgcggatgcttgcgcgcacgtagtcatacaactcgtgcgagggggccaagaaggcggggccgagattggtgcgctggggctgctcggcgcggaagacgatctggcgaaagatggcgtgcgagttggaggagatggtgggccgttggaagatgttaaagtgggcgtgaggcaggcggaccgagtcgcggatgaagtgcgcgtaggagtcttgcagcttggcgacgagctcggcggtgacgaggacgtccatggcgcagtagtccagcgtttcgcggatgatgtcataactcgcctctcctttcttctcccacagctcgcggttgagggcgtattcctcgtcatccttccagtactcccggagcgggaatcctcgatcgtccgcacggtaagagcccagcatgtagaaatggttcacggccttgtagggacagcagcccttctccacggggagggcgtaagcttgagcggccttgcggagcgaggtgtgcgtcagggcaaaggtgtccctgaccatgactttcaagaactggtacttgaagtccgagtcgtcgcagccgccgtgctcccagagctcgaaatcggtgcgcttcttcgagagggggttaggcagagcgaaagtgacgtcattgaagagaatcttgcctgcccgcggcatgaaattgcgggtgatgcggaaagggcccgggacggaggctcggttgttgatgacctgggcggcgaggacgatctcgtcaaagccgttgatgttgtgcccgacgatgtagagttccatgaatcgcgggcggcctttgatgtgcggcagctttttgagctcctcgtaggtgaggtcctcggggcattgcaggccgtgctgctcgagcgcccactcctggagatgtgggttggcttgcatgaaggaagcccagagctcgcgggccatgagggtctggagctcgtcgcgaaagaggcggaactgctggcccacggccatcttttctggggtgacgcagtagaaggtgagggggtcccgctcccagcgatcccagcgtaaacgcacggcgagatcgcgagcgagggcgaccagctctgggtccccggagaatttcatgaccagcatgaaggggacgagctgcttgccgaaggaccccatccaggtgtaggtttctacatcgtaggtgacaaagagccgctccgtgcgaggatgagagccgattgggaagaactggatttcctgccaccagttggacgagtggctgttgatgtgatgaaagtagaaatcccgccggcgaaccgagcactcgtgctgatgcttgtaaaagcgtccgcagtactcgcagcgctgcacgggctgtacctcatccacgagatacacagcgcgtcccttgaggaggaacttcaggagtggcggccctggctggtggttttcatgttcgcctgcgtgggactcaccctggggctcctcgaggacggagaggctgacgagcccgcgcgggagccaggtccagatctcggcgcggcgggggcggagagcgaagacgagggcgcgcagttgggagctgtccatggtgtcgcggagatccaggtccgggggcagggttctgaggttgacctcgtagaggcgggtgagggcgtgcttgagatgcagatggtacttgatttctacgggtgagttggtggtcgtgtccacgcattgcatgagcccgtagctgcgcggggccacgaccgtgccgcggtgcgcttttagaagcggtgtcgcggacgcgctcccggcggcag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一种应用重组腺病毒的产品，产品的活性成分包含所述重组腺病毒载体。
优选地，所述产品包括：呼吸道合胞病毒疫苗和用于中和呼吸道合胞病毒的药物。
由上述本发明的实施例提供的技术方案可以看出，本发明的复制缺陷型重组腺病毒免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应，产生的抗体对融合前F识别能力较强，具有较好的免疫效果和免疫保护作用。可以应对世界范围内5型腺病毒载体重组疫苗预存免疫水平较高的问题。此外，该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于预防RSV感染。可以应对世界范围内5型腺病毒载体重组疫苗预存免疫水平较高的问题，同时保留了腺病毒的高滴度、易于生产储存等优点，对人呼吸道合胞病毒提出了有效预防方法，具有广泛应用前景。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的一种质粒pShuttle63分别经PacI单酶切、PmeI单酶切后的电泳图。
图2为本发明提供的一种质粒pShuttle26分别经PacI单酶切、BamHI和PmeI双酶切后的电泳图。。
图3为本发明提供的一种质粒pChAd63分别经NdeI和AvrII双酶切、XbaI和SpeI双酶切、EcoRV单酶切后的电泳图。
图4为本发明提供的一种质粒pAd26经SpeΙ、AvrⅡ双酶切的电泳图。
图5为本发明提供的一种质粒pcDNA3.1-mDS-Cav1经HindⅢ和XhoⅠ双酶切酶切后的电泳图。
图6为本发明提供的一种携带外源基因的穿梭质粒酶切鉴定的电泳图。
A：质粒pShuttle26-mDS-Cav1经KpnI和NotⅠ双酶切后的电泳图。
B：质粒pShuttle63-mDS-Cav1经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后的电泳图。
图7为本发明提供的一种重组质粒酶切鉴定的电泳图。
A：质粒pAd26-mDS-Cav1分别经PacI、BamHI单酶切和EcoRV单酶切后的电泳图。
B：质粒pChAd63-mDS-Cav1分别经MluI和AvrⅡ双酶切、NdeI单酶切和EcoRI单酶切后的电泳图。
图8为本发明提供的一种Western blot检测重组腺病毒蛋白表达情况，检测用抗体为RSV多抗。
图9为本发明提供的一种斑点印记(Dot Blot)鉴定F蛋白融合前表位。
图10为本发明提供的一种透射电镜观察纯化的腺病毒样品(1％磷钨酸，pH 6.8负染，TECNAI-12，97000×)。
图11为本发明提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的RSV特异性IgG。
图12为本发明提供的一种基于RSV-mGFP的中和抗体分析方法分析重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的RSV特异性中和抗体应答。
图13为本发明提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的RSV F特异性CD8+T细胞免疫应答。
图14为本发明提供的一种RSV感染免疫后小鼠体重变化及肺组织病毒滴度。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。
本发明首先利用常规分子克隆和DNA Assembly方法构建穿梭质粒(pShuttle63)和骨架质粒(pChAd63)，然后采用定点突变方法将S155C、S190F、V207L和S290C四个突变位点引入全长RSV F基因，获得构象稳定的pre-F(mDS-Cav1)。随后，将mDS-Cav1和野生型RSVF基因(Fsyn)分别亚克隆到pShuttle63，得到穿梭质粒pShuttle63-mDS-Cav1和pShuttle63-Fsyn，经ScaⅠ单酶切后，采用DNA Assembly方法与pChAd63进行DNA组装，得到重组腺病毒质粒pChAd63-mDS-Cav1和pChAd63-Fsyn。随后，经PacⅠ单酶切，利用脂质体2000转染至293细胞，获得重组腺病毒rChAd63-mDS-Cav1和rChAd63-Fsyn。经氯化铯梯度超速离心法纯化后，经滴鼻途径免疫BABL/c小鼠，对疫苗的安全性、免疫原性及其免疫保护作用进行系统、全面的评价。
本发明提供了一种重组腺病毒的制备方法和包含重组腺病毒的产品，该产品的活性成分为上述得重组腺病毒，所述产品可以为呼吸道合胞病毒疫苗和用于中和呼吸道合胞病毒的药物等，比如，可以为携带呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体疫苗。
本发明提供的重组腺病毒的制备方法，是将重组腺病毒质粒转染包装细胞，然后进行细胞培养得到腺病毒包装细胞，该腺病毒包装细胞中具有5型腺病毒E1基因。所属重组质粒是将特异DNA分子插入猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体中得到的；所述特异DNA分子包括构象稳定的融合前融合糖蛋白(mDS-Cav1)的编码基因。
实施例1、重组腺病毒的制备
一、穿梭质粒(pShuttle63和pShuttle26)的构建
将人工合成DNA序列插入pShuttle-CMV载体的两个PacΙ酶切位点之间，于DH5α感受态细胞中进行转化，提取质粒，获得穿梭质粒pShuttle63和pShuttle26。
二、骨架质粒(pChAd63和pAd26)的构建
采用酶切连接方法和DNA Assembly方法获得缺失缺失腺病毒E1和E3区，E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6的骨架质粒pChAd63和pAd26。
三、携带外源基因的穿梭质粒的构建
1、设计mDS-Cav1定点突变引物，将S155C、S190F、V207L和S290C四个突变位点引入全长RSV F基因，突变引物5'端磷酸化，进行突变链合成反应，DpnⅠ消化扩增产物，转化到
Figure BDA0002649044260000131
感受态细胞、得到带有构象稳定的融合前融合糖蛋白(mDS-Cav1)的重组质粒pcDNA3.1-mDS-Cav1。构象稳定的融合前融合糖蛋白(mDS-Cav1)序列见序列表序列1。突变引物如下：
S155C primer:5'-cggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacct-3'
S190F primer:5'-cgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctg-3'
V207L primer:5'-cagctgctgcccatcctgaacaagcagagct-3'
S290C primer:5'-cagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagagg-3'
2、将突变得到的片段连接到载体pcDNA3.1上，于DH5α感受态细胞中进行转化，提取质粒，用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切pcDNA3.1-mDS-Cav1，酶切后可见1700bp目的条带和15400bp载体条带，得到质粒pcDNA3.1/mDS-Cav1。
3、用限制性核酸内切酶AflⅡ和XhoⅠ分别双酶切pShuttle63和pcDNA3.1-mDS-Cav1，凝胶电泳回收约3600bp的pShuttle63载体片段和约1700bp的mDS-Cav1目的片段，连接载体片段和目的片段，于DH5α感受态细胞中进行转化，提取质粒，用限制性核酸内切酶PacⅠ单酶切，酶切后为约1700bp和3600bp两条带，用限制性核酸内切酶pmeI单酶切，不能正常酶切，见质粒大小条带，得到重组质粒pShuttle63-mDS-Cav1。
四、重组腺病毒质粒的构建
用限制性核酸内切酶ScaI和AflⅡ双酶切pShuttle63-mDS-Cav1，凝胶电泳回收约2600bp的pShuttle63目的片段，用限制性核酸内切酶HpaI单酶切pChAd63，用虾碱性磷酸酶(rSAP)去磷酸化，再用无水乙醇沉淀回收约34000bp的载体片段。运用HiFi DNA Assembly试剂盒的方法，组装载体片段和目的片段，得到重组腺病毒质粒pChAd63-mDS-Cav1。
五、重组腺病毒的拯救
细胞培养条件：37℃、5％CO2恒温培养箱
1、用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养293细胞至细胞密度达到80％。
2、取12.5μg重组腺病毒质粒pChAd63-mDS-Cav1和pAd26-mDS-Cav1，用限制性核酸内切酶PacⅠ过夜酶切，乙醇沉淀回收，得到线性化质粒。
3、借助Lipofectamine 2000将所得线性化质粒转染到步骤1培养细胞中并培养5h(无胎牛血清的DMEM培养液)，然后换用含有10％胎牛血清的DMEM培养液过夜培养，最后换用含有2％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养，在转染后6～7d，细胞出现肿胀、变圆等细胞病变，获得的病毒称为：rChAd63-mDS-Cav1和rAd26-mDS-Cav1。
六、重组腺病毒体外鉴定
1、蛋白质印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒的蛋白表达情况
取P4代重组腺病毒病毒液rChAd63-mDS-Cav1、rChAd63-Fsyn和rChAd63-empty各2μl，分别接种于细胞密度为80％的293细胞。48h后收集细胞，用细胞裂解液裂解后，收取等量的上清，利用RSV多抗进行Western blot来检测重组腺病毒蛋白表达情况，结果显示rChAd63-Fsyn和rChAd63-mDS-Cav1均表达F蛋白，条带大小为170KD。
2、免疫斑(Dot Blot)检测各重组腺病毒表达的蛋白融合前表位
取P4代重组腺病毒病毒液rChAd63-mDS-Cav1、rChAd63-Fsyn和rChAd63-empty各2μl，分别接种于细胞密度为80％的293细胞。48h后细胞发生病变，收集细胞，利用识别不同表位的F蛋白单克隆抗体，采用Dot Blot的方法检测重组腺病毒表达的F蛋白的融合前表位情况，结果显示：与rChAd63-Fsyn表达的野生型F蛋白相比，rChAd63-mDS-Cav1表达的mDS-Cav1含有更多的融合前表位III、V和
Figure BDA0002649044260000141
(我们以Palivizumab的表位含量为1，计算出其他表位的百分比)。
实施例2、重组腺病毒的应用
一、动物免疫
6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，分成4组，每组5只，分别处理如下：
第一组(G1组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rChAd63-empty病毒液(病毒量为1×1010VP)；
第二组(G2组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rChAd63-Fsyn病毒液(病毒量为1×1010VP)；
第三组(G3组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rChAd63-mDS-Cav1病毒液(病毒量为1×1010VP)；
第四组(G4组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为FI-RSV病毒液(病毒量为1.25×106PFU)；
第五组(G5组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rAd26-empty病毒液(病毒量为1×1010VP)；
第六组(G6组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rAd26-Fsyn病毒液(病毒量为1×1010VP)；
第七组(G7组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rAd26-mDS-Cav1病毒液(病毒量为1×1010VP)；
以上各组中，滴鼻方式免疫的免疫体积均为30μl，肌肉注射方式免疫的体积均为50μl，用pH 7.2的PBS缓冲液作为溶剂调整病毒浓度。
免疫前1d，眼内眦静脉采集基础血。第0d，用0.4％戊巴芘妥钠经腹腔注射麻醉小鼠(40-50mg/Kg体重)，待小鼠深麻后，滴鼻免疫。在免疫后第21d，眼内眦静脉采集免疫后血。免疫后第28d，经滴鼻途径进行攻毒实验，攻毒的剂量为1×106PFU/50μl的wtRSV-Long。
二、免疫后小鼠体液免疫效果分析
待测溶液为：步骤一中免疫后第21d采集小鼠静脉血，分离获得血清。
采用ELISA方法检测小鼠的血清抗体滴度。首先用棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度。RSV按2500pfu/孔包被酶标板采用ELISA方法检测小鼠血清抗体IgG。
三、抗体中和实验
1、RSV抗体中和实验，按照2.5×104细胞/孔的密度将HEp-2细胞接种到96孔板上，培养24h。
2、将免疫后小鼠血清于56℃，灭活30min，用维持液2倍稀释，注意每稀释一个稀释度都必须换一个枪头吸管。并用2％胎牛血清的DMEM培养液进行2倍稀释。不同稀释度的血清中，加入RSV-mGFP(RSV-mGFP的终浓度为1000PFU/100μl)，混合后于37℃孵育1h。
3、弃96孔板培养基，PBS洗涤1-2次后，将100μl混合液(含1000PFU的RSV-mGFP)加入到铺有单层HEp-2细胞的96孔板中，37℃培养48h。同时设立空白对照(无病毒、无血清或抗体)、阴性对照组(有RSV-mGFP，无血清)和阳性对照组(RSV多抗替代血清)，培养2d。
4、完成步骤9后，采用多功能酶标仪SpectraMax M5e检测每孔中绿色荧光蛋白的荧光强度(激发波长479nm、发射波长517nm，检测10s)。
5、实验组、阴性对照组、阳性对照组均分别减去空白对照组，利用SPSS建立建立实验组的线性回归方程，通过线性回归方程，计算出荧光强度减少50％的抗体滴度(IC50)。或者以“(实验组-空白组)/(阴性对照组-空白组)是否小于0.5为判断标准。
四、免疫后小鼠细胞免疫效果分析
待测细胞为：步骤一中免疫后第21d小鼠脾细胞。
1、脱颈处死免疫后21d的小鼠，在超净台中无菌采集脾细胞。
2、利用ELISPOT的方法分析细胞免疫效果，计数RSV F蛋白H-2Kd限制性CTL表位刺激后分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数量。
3、实验检测前一天，在超净台中，向预包被板加入200μl/孔1640培养基，室温静置5-10min后，弃1640培养基。
4、按2×105细胞/孔浓度将细胞悬液加入各实验孔，100μl/孔，同时注意设置阴性对照孔(未加阳性刺激物)和背景对照孔(不加细胞，只加1640)。
5、阳性对照孔中加入阳性刺激物工作液，10μl/孔，阴性对照孔和背景对照孔加入1640无血清培养基；刺激物为RSV F蛋白H-2Kd限制性CTL表位(KYKNAVTEL和TYMLTNSELL,纯度≥95％，冻干分装保存于-20℃冰箱)(2×105细胞中各加0.5μg),盖好板盖，37℃，5％CO2温箱孵育16-20h。
6、完成步骤5后，弃去原孔内培养基，加入冰冷的去离子水，200μl/孔，于4℃冰箱放置10min,低渗裂解细胞。
7、倒出孔内液体，1xWashing buffer洗涤5次，200μl/孔，，每次停留30s，最后一次洗涤完毕后在吸水纸上扣干。
8、将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100μl/孔，37℃孵育1h。
完成步骤8后，到处孔内液体，1xWashing buffer，200μl/孔，洗涤5-7次，每次停留30s，并吸水纸上扣干。
9、按照说明书稀释亲和素标记的二抗工作液，100μl/孔加入各实验孔，37℃孵育1h。
10、倾倒孔内液体，1xWashing buffer洗涤5次，200μl/孔，每次停留30s，最后一次洗涤完毕后在吸水纸上扣干；
11、按照说明书配制AEC显色工作液，100μl/孔加入各实验孔，室温静置15-30min。
12、待斑点生长到合适的大小之后，倾倒孔内液体，之后揭开板底座，用以去离子水洗涤板底座5遍，终止显色反应，然后将板放置到室温阴凉处自然晾干，待板彻底干燥后，用ELISPOT reader对96孔板进行成像，并ImmunoSpot image analyzer software v4.0分析读取斑点数。
五、攻毒后小鼠免疫保护作用分析
待测溶液为：步骤一中攻毒后第7d小鼠肺组织匀浆。
1、脱颈处死攻毒后第7d的小鼠，在生物安全柜内制备小鼠肺组织匀浆。
2、采用RT-qPCR的方法检测攻毒后小鼠的肺病毒滴度。Trizol法提取小鼠肺组织匀浆中的病毒RNA，并通过RT-qPCR合成cDNA。
3、根据wtRSV-LongN基因相对保守的序列，设计扩增引物。扩增引物如下：
RSA-1:5′-AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA-3′
RSA-2:5′-GCACATCATAATTAGGAGTATCAAT-3′；
质粒pMD-18T-N作为标准品，计算其拷贝数：拷贝数(copies/μl)＝OD260×50×稀释倍数/(碱基数×324)×6×1014。按如下方法准备qPCR反应管：
Figure BDA0002649044260000161
按如下反应条件进行qPCR：
Figure BDA0002649044260000162
Figure BDA0002649044260000171
每个循环最后一步结束时收集荧光值，使根据45℃-95℃溶解曲线计算出Ct值并给出定量的结果。
4、动物体重统计，将攻毒当天设为第0d，连续记录攻毒后的0-7d小鼠体重变化。
5、攻毒后小鼠肺病理分析，步骤一中取出的肺组织用10％甲醛进行固定，再用石蜡进行包埋，做成厚度为4μm的切片，进行HE染色。
6、每张切片选择10个视野进行拍照，分析肺组织病理的相关指标，包括肺泡腔内炎性细胞数、肺脏小气管周围炎性细胞数、肺间质炎性细胞数以及肺泡壁厚度，并采用盲法对各个指标进行评分，得分范围是0-4，0分为无病理，4分为病理变化严重，以FI-RSV作为阳性对照。
序列表
序列1
稳定的pre-F(mDS-Cav1)序列
gccaccATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCTGTGACCTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGCGGACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAAAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGATCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACCGGGCTAGACGCGAGCTGCCTCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCAGCGCCATTGCTAGCGGAGTGGCCGTGTGCAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGTCCGCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCTTCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCCTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGTGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGGCTGGTACTGCGATAATGCCGGCAGCGTGTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCTCCAAGACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGGTGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGCTGCTGCACAATGTGAATGCCGTGAAGTCCACCACCAATATCATGATCACCACAATCATCATCGTGATCATCGTCATCCTGCTGTCCCTGATCGCCGTGGGCCTGCTGCTGTACTGCAAGGCCCGGTCCACCCCTGTGACCCTGTCCAAGGACCAGCTGAGCGGCATCAACAATATCGCCTTCTCCAACTGA
序列2
缺失腺病毒E1和E3区，E4orf6替换为人5型腺病毒的骨架载体pChAd63序列
tGATATCCTTAATTAAcatcatcaataatatacctcaaacttttggtgcgcgttaatatgcaaatgaggtgtttgaatttggggatgcggggcgctgattggctgagagacgggcgaccgttaggggcggggcgggtgacgttttgatgacgtggccgtgaggcggagccggtttgcaagttctcgtgggaaaagtgacgtcaaacgaggtgtggtttgaacacggaaatactcaattttcccgcgctctctgacaggaaatgaggtgtttctgggcggatgcaagtgaaaacgggccattttcgcgcgaaaactgaatgaggaagtgaaaatctgagtaattccgcgtttatggcagggaggagtatttgccgagggccgagtagactttgaccgattacgtgggggtttcgattaccgtatttttcacctaaatttccgcgtacggtgtcaaagtccggtgtttttacgtaggcgtcagctgatcgccagggtatttaaacctgcgctctctagtcaagaggccactcttgagtgccagcgagtagagttaacgggacggagttcggctccagcggggaagaatctgactagagtgagtagtgtttgggggtgggtgggagcctgcatgatgggcagaatgactaaaatctgtgtttttctgtgtgttgcagcagcatgagcggaagcgcctcctttgagggaggggtattcagcccttatctgacggggcgtctcccctcctgggcgggagtgcgtcagaatgtgatgggatccacggtggacggccggcccgtgcagcccgcgaactcttcaaccctgacctacgcgaccctgagctcctcgtccgtggacgcagctgccgccgcagctgctgcttccgccgccagcgccgtgcgcggaatggccctgggcgccggctactacagctctctggtggccaactcgagttccaccaataatcccgccagcctgaacgaggagaagctgttgctgctgatggcccagctcgaggccctgacccagcgcctgggcgagctgacccagcaggtggctcagctgcaggcggagacgcgggccgcggttgccacggtgaaaaccaaataaaaaatgaatcaataaataaacggagacggttgttgattttaacacagagtcttgaatctttatttgatttttcgcgcgcggtaggccctggaccaccggtctcgatcattgagcacccggtggatcttttccaggacccggtagaggtgggcttggatgttgaggtacatgggcatgagcccgtcccgggggtggaggtagctccattgcagggcctcgtgctcgggggtggtgttgtaaatcacccagtcatagcaggggcgcagggcgtggtgctgcacgatgtctttgaggaggagactgatggccacgggcagccccttggtgtaggtgttgacgaacctattgagctgggagggatgcatgcggggggagatgagatgcatcttggcctggatcttgagattggcgatgttcccgcccagatcccgccgggggttcatgttgtgcaggaccaccagcacggtgtatccggtgcacttggggaatttgtcatgcaacttggaagggaaggcgtgaaagaatttggagacgcccttgtgaccgcccaggttttccatgcactcatccatgatgatggcgatgggcccgtgggcggcggcctgggcaaagacgtttcgggggtcggacacatcgtagttgtggtcctgggtgagctcgtcataggccattttaatgaatttggggcggagggtacccgactgggggacaaaggtgccctcgatcccgggggcgtagttcccctcgcagatctgcatctcccaggccttgagctcggagggggggatcatgtccacctgcggggcgatgaaaaaaacggtttccggggcgggggagatgagctgcgccgaaagcaggttccggagcagctgggacttgccgcagccggtggggccgtagatgaccccgatgaccggctgcaggtggtagttgagggagagacagctgccgtcctcgcggaggaggggggccacctcgttcatcatctcgcgcacatgcatgttctcgcgcacgagttccgccaggaggcgctcgccccccagcgagaggagctcttgcagcgaggcgaagtttttcagcggcttgagcccgtcggccatgggcattttggagagggtctgttgcaagagttccagacggtcccagagctcggtgatgtgctctagggcatctcgatccagcagacctcctcgtttcgcgggttggggcgactgcgggagtagggcaccaggcgatgggcgtccagcgaggccagggtccggtccttccagggtcgcagggtccgcgtcagcgtggtctccgtcacggtgaaggggtgcgcgccgggctgggcgcttgcgagggtgcgcttcaggctcatccggctggtcgagaaccgctcccggtcggcgccctgcgcgtcggccaggtagcaattgagcatgagttcgtagttgagcgcctcggccgcgtggcccttggcgcggagcttacctttggaagtgtgtccgcagacgggacagaggagggacttgagggcgtagagcttgggggcgaggaagacggactcgggggcgtaggcgtccgcgccgcagctggcgcagacggtctcgcactccacgagccaggtgaggtcggggcggtcggggtcaaaaacgaggtttcctccgtgctttttgatgcgtttcttacctctggtctccatgagctcgtgtccccgctgggtgacaaagaggctgtccgtgtccccgtagaccgactttatgggccggtcctcgagcggggtgccgcggtcctcgtcgtagaggaaccccgcccactccgagacgaaggcccgggtccaggccagcacgaaggaggccacgtgggaggggtagcggtcgttgtccaccagcgggtccaccttctccagggtatgcaagcacatgtccccctcgtccacatccaggaaggtgattggcttgtaagtgtaggccacgtgaccgggggtcccggccgggggggtataaaagggggcgggcccctgctcgtcctcactgtcttccggatcgctgtccaggagcgccagctgttggggtaggtattccctctcgaaggcgggcatgacctcggcactcaggttgtcagtttctagaaacgaggaggatttgatattgacggtgccgttggagacgcctttcatgagcccctcgtccatctggtcagaaaagacgatctttttgttgtcgagcttggtggcgaaggagccgtagagggcgttggagagcagcttggcgatggagcgcatggtctggttcttttccttgtcggcgcgctccttggcggcgatgttgagctgcacgtactcgcgcgccacgcacttccattcggggaagacggtggtgagctcgtcgggcacgattctgacccgccagccgcggttgtgcagggtgatgaggtccacgctggtggccacctcgccgcgcaggggctcgttggtccagcagaggcgcccgcccttgcgcgagcagaaggggggcagcgggtccagcatgagctcgtcgggggggtcggcgtccacggtgaagatgccgggcaggagctcggggtcgaagtagctgatgcaggtgcccagatcgtccagacttgcttgccagtcgcgcacggccagcgcgcgctcgtaggggctgaggggcgtgccccagggcatggggtgcgtgagcgcggaggcgtacatgccgcagatgtcgtagacgtagaggggctcctggaggacgccgatgtaggtggggtagcagcgccccccgcggatgctggcgcgcacgtagtcgtacagctcgtgcgagggcgcgaggagccccgtgccgagattggagcgctgcggcttttcggcgcggtagacgatctggcggaagatggcgtgggagttggaggagatggtgggcctctggaagatgttgaagtgggcatggggcagtccgaccgagtccctgatgaagtgggcgtaggagtcctgcagcttggcgacgagctcggcggtgacgaggacgtccagggcgcagtagtcgagggtctcttggatgatgtcgtacttgagctggcccttctgcttccacagctcgcggttgagaaggaactcttcgcggtccttccagtactcttcgagggggaacccgtcctgatcggcacggtaagagcccaccatgtagaactggttgacggccttgtaggcgcagcagcccttctccacggggagggcgtaagcttgcgcggccttgcgcagggaggtgtgggtgagggcgaaggtgtcgcgcaccatgactttgaggaactggtgcttgaagtcgaggtcgtcgcagccgccctgctcccagagctggaagtccgtgcgcttcttgtaggcggggttgggcaaagcgaaagtaacatcgttgaagaggatcttgcccgcgcggggcatgaagttgcgagtgatgcggaaaggctggggcacctcggcccggttgttgatgacctgggcggcgaggacgatctcgtcgaagccgttgatgttgtgcccgacgatgtagagttccacgaatcgcgggcggcccttgacgtggggcagcttcttgagctcgtcgtaggtgagctcggcggggtcgctgagcccgtgctgctcgagggcccagtcggcgacgtgggggttggcgctgaggaaggaagtccagagatccacggccagggcggtctgcaagcggtcccggtactgacggaactgctggcccacggccattttttcgggggtgacgcagtagaaggtgcgggggtcgccgtgccagcggtcccacttgagctggagggcgaggtcgtgggcgagctcgacgagcggcgggtccccggagagtttcatgaccagcatgaaggggacgagctgcttgccgaaggaccccatc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综上所述，本发明实施例的复制缺陷型重组腺病毒具有与猩猩63型腺病毒(serotype63Chimpanzee adenovirus，ChAd63)完全一致的颗粒结构，基因组中缺失腺病毒E1和E3区，E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6，呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白基因表达框嵌入腺病毒基因组包装信号之后，在293中能够有效包装，感染细胞后可以稳定表达呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白。该复制缺陷型重组腺病毒免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应，产生的抗体对融合前F识别能力较强，具有较好的免疫效果和免疫保护作用。可以应对世界范围内5型腺病毒载体重组疫苗预存免疫水平较高的问题。此外，该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于预防RSV感染。可以应对世界范围内5型腺病毒载体重组疫苗预存免疫水平较高的问题，同时保留了腺病毒的高滴度、易于生产储存等优点，对人呼吸道合胞病毒提出了有效预防方法，具有广泛应用前景。
本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内和口服。本发明优选采用鼻内途径，合适的剂量为1×1010VP。
本发明获得的携带呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体疫苗还具有下述优势。感染细胞后可以稳定表达呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白。免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应，产生的抗体对融合前F识别能力较强。此外，该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于预防RSV感染。
本领域普通技术人员可以理解：附图只是一个实施例的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京交通大学
<120> 呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应
用产品
<130> 2020.12.11
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1731
<212> DNA
<213> Prefusion fusion glycoprotein
<400> 1
gccaccatgg aactgctgat cctgaaggcc aacgccatca ccaccatcct gaccgctgtg 60
accttctgct tcgccagcgg ccagaacatc accgaggaat tctaccagag cacctgtagc 120
gccgtgtcca agggctacct gagcgccctg cggaccggct ggtacaccag cgtgatcacc 180
atcgagctga gcaacatcaa gaaaaacaag tgcaacggca ccgacgccaa gatcaagctg 240
atcaagcagg aactggacaa gtacaagaac gccgtgaccg agctgcagct gctgatgcag 300
agcacccccg ccaccaacaa ccgggctaga cgcgagctgc ctcggttcat gaactacacc 360
ctgaacaacg ccaaaaagac caacgtgacc ctgagcaaga agcggaagcg gcggttcctg 420
ggcttcctgc tgggcgtggg cagcgccatt gctagcggag tggccgtgtg caaggtgctg 480
cacctggaag gcgaagtgaa caagatcaag tccgccctgc tgagcaccaa caaggccgtg 540
gtgtccctga gcaacggcgt gtccgtgctg accttcaagg tgctggatct gaagaactac 600
atcgacaagc agctgctgcc catcctgaac aagcagagct gcagcatcag caacatcgag 660
acagtgatcg agttccagca gaagaacaac cggctgctgg aaatcacccg cgagttcagc 720
gtgaacgccg gcgtgaccac ccccgtgtcc acctacatgc tgaccaacag cgagctgctg 780
agcctgatca acgacatgcc catcaccaac gaccagaaaa agctgatgag caacaacgtg 840
cagatcgtgc ggcagcagag ctactccatc atgtgcatca tcaaagaaga ggtgctggcc 900
tacgtggtgc agctgcccct gtacggcgtg atcgacaccc cctgctggaa gctgcacacc 960
agccccctgt gcaccaccaa caccaaagag ggcagcaaca tctgcctgac ccggaccgac 1020
cggggctggt actgcgataa tgccggcagc gtgtcattct ttccacaagc cgagacatgc 1080
aaggtgcaga gcaaccgggt gttctgcgac accatgaaca gcctgaccct gccctccgaa 1140
gtgaacctgt gcaacgtgga catcttcaac cctaagtacg actgcaagat catgacctcc 1200
aagaccgacg tgtccagctc cgtgatcacc tccctgggcg ccatcgtgtc ctgctacggc 1260
aagaccaagt gcaccgccag caacaagaac cggggcatca tcaagacctt cagcaacggc 1320
tgcgactacg tgtccaacaa gggggtggac accgtgtccg tgggcaacac cctgtactac 1380
gtgaacaaac aggaaggcaa gagcctgtac gtgaagggcg agcccatcat caacttctac 1440
gaccccctgg tgttccccag cgacgagttc gacgccagca tcagccaggt caacgagaag 1500
atcaaccaga gcctggcctt catcagaaag agcgacgagc tgctgcacaa tgtgaatgcc 1560
gtgaagtcca ccaccaatat catgatcacc acaatcatca tcgtgatcat cgtcatcctg 1620
ctgtccctga tcgccgtggg cctgctgctg tactgcaagg cccggtccac ccctgtgacc 1680
ctgtccaagg accagctgag cggcatcaac aatatcgcct tctccaactg a 1731
<210> 2
<211> 32791
<212> DNA
<213> The backbone plasmid based on the Chimpanzee serotype 63 adenovirus
<400> 2
tgatatcctt aattaacatc atcaataata tacctcaaac ttttggtgcg cgttaatatg 60
caaatgaggt gtttgaattt ggggatgcgg ggcgctgatt ggctgagaga cgggcgaccg 120
ttaggggcgg ggcgggtgac gttttgatga cgtggccgtg aggcggagcc ggtttgcaag 180
ttctcgtggg aaaagtgacg tcaaacgagg tgtggtttga acacggaaat actcaatttt 240
cccgcgctct ctgacaggaa atgaggtgtt tctgggcgga tgcaagtgaa aacgggccat 300
tttcgcgcga aaactgaatg aggaagtgaa aatctgagta attccgcgtt tatggcaggg 360
aggagtattt gccgagggcc gagtagactt tgaccgatta cgtgggggtt tcgattaccg 420
tatttttcac ctaaatttcc gcgtacggtg tcaaagtccg gtgtttttac gtaggcgtca 480
gctgatcgcc agggtattta aacctgcgct ctctagtcaa gaggccactc ttgagtgcca 540
gcgagtagag ttaacgggac ggagttcggc tccagcgggg aagaatctga ctagagtgag 600
tagtgtttgg gggtgggtgg gagcctgcat gatgggcaga atgactaaaa tctgtgtttt 660
tctgtgtgtt gcagcagcat gagcggaagc gcctcctttg agggaggggt attcagccct 720
tatctgacgg ggcgtctccc ctcctgggcg ggagtgcgtc agaatgtgat gggatccacg 780
gtggacggcc ggcccgtgca gcccgcgaac tcttcaaccc tgacctacgc gaccctgagc 840
tcctcgtccg tggacgcagc tgccgccgca gctgctgctt ccgccgccag cgccgtgcgc 900
ggaatggccc tgggcgccgg ctactacagc tctctggtgg ccaactcgag ttccaccaat 960
aatcccgcca gcctgaacga ggagaagctg ttgctgctga tggcccagct cgaggccctg 1020
acccagcgcc tgggcgagct gacccagcag gtggctcagc tgcaggcgga gacgcgggcc 1080
gcggttgcca cggtgaaaac caaataaaaa atgaatcaat aaataaacgg agacggttgt 1140
tgattttaac acagagtctt gaatctttat ttgatttttc gcgcgcggta ggccctggac 1200
caccggtctc gatcattgag cacccggtgg atcttttcca ggacccggta gaggtgggct 1260
tggatgttga ggtacatggg catgagcccg tcccgggggt ggaggtagct ccattgcagg 1320
gcctcgtgct cgggggtggt gttgtaaatc acccagtcat agcaggggcg cagggcgtgg 1380
tgctgcacga tgtctttgag gaggagactg atggccacgg gcagcccctt ggtgtaggtg 1440
ttgacgaacc tattgagctg ggagggatgc atgcgggggg agatgagatg catcttggcc 1500
tggatcttga gattggcgat gttcccgccc agatcccgcc gggggttcat gttgtgcagg 1560
accaccagca cggtgtatcc ggtgcacttg gggaatttgt catgcaactt ggaagggaag 1620
gcgtgaaaga atttggagac gcccttgtga ccgcccaggt tttccatgca ctcatccatg 1680
atgatggcga tgggcccgtg ggcggcggcc tgggcaaaga cgtttcgggg gtcggacaca 1740
tcgtagttgt ggtcctgggt gagctcgtca taggccattt taatgaattt ggggcggagg 1800
gtacccgact gggggacaaa ggtgccctcg atcccggggg cgtagttccc ctcgcagatc 1860
tgcatctccc aggccttgag ctcggagggg gggatcatgt ccacctgcgg ggcgatgaaa 1920
aaaacggttt ccggggcggg ggagatgagc tgcgccgaaa gcaggttccg gagcagctgg 1980
gacttgccgc agccggtggg gccgtagatg accccgatga ccggctgcag gtggtagttg 2040
agggagagac agctgccgtc ctcgcggagg aggggggcca cctcgttcat catctcgcgc 2100
acatgcatgt tctcgcgcac gagttccgcc aggaggcgct cgccccccag cgagaggagc 2160
tcttgcagcg aggcgaagtt tttcagcggc ttgagcccgt cggccatggg cattttggag 2220
agggtctgtt gcaagagttc cagacggtcc cagagctcgg tgatgtgctc tagggcatct 2280
cgatccagca gacctcctcg tttcgcgggt tggggcgact gcgggagtag ggcaccaggc 2340
gatgggcgtc cagcgaggcc agggtccggt ccttccaggg tcgcagggtc cgcgtcagcg 2400
tggtctccgt cacggtgaag gggtgcgcgc cgggctgggc gcttgcgagg gtgcgcttca 2460
ggctcatccg gctggtcgag aaccgctccc ggtcggcgcc ctgcgcgtcg gccaggtagc 2520
aattgagcat gagttcgtag ttgagcgcct cggccgcgtg gcccttggcg cggagcttac 2580
ctttggaagt gtgtccgcag acgggacaga ggagggactt gagggcgtag agcttggggg 2640
cgaggaagac ggactcgggg gcgtaggcgt ccgcgccgca gctggcgcag acggtctcgc 2700
actccacgag ccaggtgagg tcggggcggt cggggtcaaa aacgaggttt cctccgtgct 2760
ttttgatgcg tttcttacct ctggtctcca tgagctcgtg tccccgctgg gtgacaaaga 2820
ggctgtccgt gtccccgtag accgacttta tgggccggtc ctcgagcggg gtgccgcggt 2880
cctcgtcgta gaggaacccc gcccactccg agacgaaggc ccgggtccag gccagcacga 2940
aggaggccac gtgggagggg tagcggtcgt tgtccaccag cgggtccacc ttctccaggg 3000
tatgcaagca catgtccccc tcgtccacat ccaggaaggt gattggcttg taagtgtagg 3060
ccacgtgacc gggggtcccg gccggggggg tataaaaggg ggcgggcccc tgctcgtcct 3120
cactgtcttc cggatcgctg tccaggagcg ccagctgttg gggtaggtat tccctctcga 3180
aggcgggcat gacctcggca ctcaggttgt cagtttctag aaacgaggag gatttgatat 3240
tgacggtgcc gttggagacg cctttcatga gcccctcgtc catctggtca gaaaagacga 3300
tctttttgtt gtcgagcttg gtggcgaagg agccgtagag ggcgttggag agcagcttgg 3360
cgatggagcg catggtctgg ttcttttcct tgtcggcgcg ctccttggcg gcgatgttga 3420
gctgcacgta ctcgcgcgcc acgcacttcc attcggggaa gacggtggtg agctcgtcgg 3480
gcacgattct gacccgccag ccgcggttgt gcagggtgat gaggtccacg ctggtggcca 3540
cctcgccgcg caggggctcg ttggtccagc agaggcgccc gcccttgcgc gagcagaagg 3600
ggggcagcgg gtccagcatg agctcgtcgg gggggtcggc gtccacggtg aagatgccgg 3660
gcaggagctc ggggtcgaag tagctgatgc aggtgcccag atcgtccaga cttgcttgcc 3720
agtcgcgcac ggccagcgcg cgctcgtagg ggctgagggg cgtgccccag ggcatggggt 3780
gcgtgagcgc ggaggcgtac atgccgcaga tgtcgtagac gtagaggggc tcctggagga 3840
cgccgatgta ggtggggtag cagcgccccc cgcggatgct ggcgcgcacg tagtcgtaca 3900
gctcgtgcga gggcgcgagg agccccgtgc cgagattgga gcgctgcggc ttttcggcgc 3960
ggtagacgat ctggcggaag atggcgtggg agttggagga gatggtgggc ctctggaaga 4020
tgttgaagtg ggcatggggc agtccgaccg agtccctgat gaagtgggcg taggagtcct 4080
gcagcttggc gacgagctcg gcggtgacga ggacgtccag ggcgcagtag tcgagggtct 4140
cttggatgat gtcgtacttg agctggccct tctgcttcca cagctcgcgg ttgagaagga 4200
actcttcgcg gtccttccag tactcttcga gggggaaccc gtcctgatcg gcacggtaag 4260
agcccaccat gtagaactgg ttgacggcct tgtaggcgca gcagcccttc tccacgggga 4320
gggcgtaagc ttgcgcggcc ttgcgcaggg aggtgtgggt gagggcgaag gtgtcgcgca 4380
ccatgacttt gaggaactgg tgcttgaagt cgaggtcgtc gcagccgccc tgctcccaga 4440
gctggaagtc cgtgcgcttc ttgtaggcgg ggttgggcaa agcgaaagta acatcgttga 4500
agaggatctt gcccgcgcgg ggcatgaagt tgcgagtgat gcggaaaggc tggggcacct 4560
cggcccggtt gttgatgacc tgggcggcga ggacgatctc gtcgaagccg ttgatgttgt 4620
gcccgacgat gtagagttcc acgaatcgcg ggcggccctt gacgtggggc agcttcttga 4680
gctcgtcgta ggtgagctcg gcggggtcgc tgagcccgtg ctgctcgagg gcccagtcgg 4740
cgacgtgggg gttggcgctg aggaaggaag tccagagatc cacggccagg gcggtctgca 4800
agcggtcccg gtactgacgg aactgctggc ccacggccat tttttcgggg gtgacgcagt 4860
agaaggtgcg ggggtcgccg tgccagcggt cccacttgag ctggagggcg aggtcgtggg 4920
cgagctcgac gagcggcggg tccccggaga gtttcatgac cagcatgaag gggacgagct 4980
gcttgccgaa ggaccccatc caggtgtagg tttccacatc gtaggtgagg aagagccttt 5040
cggtgcgagg atgcgagccg atggggaaga actggatctc ctgccaccag ttggaggaat 5100
ggctgttgat gtgatggaag tagaaatgcc gacggcgcgc cgagcactcg tgcttgtgtt 5160
tatacaagcg tccgcagtgc tcgcaacgct gcacgggatg cacgtgctgc acgagctgta 5220
cctgggttcc tttgacgagg aatttcagtg ggcagtggag cgctggcggc tgcatctggt 5280
gctgtactac gtcctggcca tcggcgtggc catcgtctgc ctcgatggtg gtcatgctga 5340
cgagcccgcg cgggaggcag gtccagacct cggctcggac gggtcggaga gcgaggacga 5400
gggcgcgcag gccggagctg tccagggtcc tgagacgctg cggagtcagg tcagtgggca 5460
gcggcggcgc gcggttgact tgcaggagct tttccagggc gcgcgggagg tccagatggt 5520
acttgatctc cacggcgccg ttggtggcga cgtccacggc ttgcagggtc ccgtgcccct 5580
ggggcgccac caccgtgccc cgtttcttct tgggcggcgg cggctccatg cttagaagcg 5640
gcggcgagga cgcgcgccgg gcggcagggg cggctcgggg cccggaggca ggggcggcag 5700
gggcacgtcg gcgccgcgcg cgggcaggtt ctggtactgc gcccggagaa gactggcgtg 5760
agcgacgacg cgacggttga cgtcctggat ctgacgcctc tgggtgaagg ccacgggacc 5820
cgtgagtttg aacctgaaag agagttcgac agaatcaatc tcggtatcgt tgacggcggc 5880
ctgccgcagg atctcttgca cgtcgcccga gttgtcctgg taggcgatct cggtcatgaa 5940
ctgctcgatc tcctcctcct gaaggtctcc gcggccggcg cgctcgacgg tggccgcgag 6000
gtcgttggag atgcggccca tgagctgcga gaaggcgttc atgccggcct cgttccagac 6060
gcggctgtag accacggctc cgtcggggtc gcgcgcgcgc atgaccacct gggcgaggtt 6120
gagctcgacg tggcgcgtga agaccgcgta gttgcagagg cgctggtaga ggtagttgag 6180
cgtggtggcg atgtgctcgg tgacgaagaa gtacatgatc cagcggcgga gcggcatctc 6240
gctgacgtcg cccagggctt ccaagcgctc catggcctcg tagaagtcca cggcgaagtt 6300
gaaaaactgg gagttgcgcg ccgagacggt caactcctcc tccagaagac ggatgagctc 6360
ggcgatggtg gcgcgcacct cgcgctcgaa ggccccgggg ggctcctctt ccatttcctc 6420
ctcttcctcc tccactaaca tctcttctac ttcctcctca ggaggcggcg gcgggggagg 6480
ggccctgcgt cgccggcggc gcacgggcag acggtcgatg aagcgctcga tggtctcccc 6540
gcgccggcga cgcatggtct cggtgacggc gcgcccgtcc tcgcggggcc gcagcgtgaa 6600
gacgccgccg cgcatctcca ggtggccgcc gggggggtct ccgttgggca gggagagggc 6660
gctgacgatg catcttatca attgacccgt agggactccg cgcaaggacc tgagcgtctc 6720
gagatccacg ggatccgaaa accgctgaac gaaggcttcg agccagtcgc agtcgcaagg 6780
taggctgagc ccggtttctt gttcttcggg tatttggtcg ggaggcgggc gggcgatgct 6840
gctggtgatg aagttgaagt aggcggtcct gagacggcgg atggtggcga ggagcaccag 6900
gtccttgggc ccggcttgct ggatgcgcag acggtcggcc atgccccagg cgtggtcctg 6960
acacctggcg aggtccttgt agtagtcctg catgagccgc tccacgggca cctcctcctc 7020
gcccgcgcgg ccgtgcatgc gcgtgagccc gaacccgcgc tgcggctgga cgagcgccag 7080
gtcggcgacg acgcgctcgg cgaggatggc ctgctggatc tgggtgaggg tggtctggaa 7140
gtcgtcgaag tcgacgaagc ggtggtaggc tccggtgttg atggtgtagg agcagttggc 7200
catgacggac cagttgacgg tctggtggcc ggggcgcacg agctcgtggt acttgaggcg 7260
cgagtaggcg cgcgtgtcga agatgtagtc gttgcaggtg cgcacgaggt actggtatcc 7320
gacgaggaag tgcggcggcg gctggcggta gagcggccat cgctcggtgg cgggggcgcc 7380
gggcgcgagg tcctcgagca tgaggcggtg gtagccgtag atgtacctgg acatccaggt 7440
gatgccggcg gcggtggtgg aggcgcgcgg gaactcgcgg acgcggttcc agatgttgcg 7500
cagcggcagg aagtagttca tggtggccgc ggtctggccc gtgaggcgcg cgcagtcgtg 7560
gatgctctag acatacgggc aaaaacgaaa gcggtcagcg gctcgactcc gtggcctgga 7620
ggctaagcga acgggttggg ctgcgcgtgt accccggttc gaatctcgaa tcaggctgga 7680
gccgcagcta acgtggtact ggcactcccg tctcgaccca agcctgctaa cgaaacctcc 7740
aggatacgga ggcgggtcgt tttttggcct tggtcgctgg tcatgaaaaa ctagtaagcg 7800
cggaaagcgg ccgcccgcga tggctcgctg ccgtagtctg gagaaagaat cgccagggtt 7860
gcgttgcggt gtgccccggt tcgagcctca gcgctcggcg ccggccggat tccgcggcta 7920
acgtgggcgt ggctgccccg tcgtttccaa gaccccttag ccagccgact tctccagtta 7980
cggagcgagc ccctcttttt ttcttgtgtt tttgccagat gcatcccgta ctgcggcaga 8040
tgcgccccca ccctccacca caaccgcccc taccgcagca gcagcaacag ccggcgcttc 8100
tgcccccgcc ccagcagcag cagccagcca ctaccgcggc ggccgccgtg agcggagccg 8160
gcgttcagta tgacctggcc ttggaagagg gcgaggggct ggcgcggctg ggggcgtcgt 8220
cgccggagcg gcacccgcgc gtgcagatga aaagggacgc tcgcgaggcc tacgtgccca 8280
agcagaacct gttcagagac aggagcggcg aggagcccga ggagatgcgc gcctcccgct 8340
tccacgcggg gcgggagctg cggcgcggcc tggaccgaaa gcgggtgctg agggacgagg 8400
atttcgaggc ggacgagctg acggggatca gccccgcgcg cgcgcacgtg gccgcggcca 8460
acctggtcac ggcgtacgag cagaccgtga aggaggagag caacttccaa aaatccttca 8520
acaaccacgt gcgcacgctg atcgcgcgcg aggaggtgac cctgggcctg atgcacctgt 8580
gggacctgct ggaggccatc gtgcagaacc ccacgagcaa gccgctgacg gcgcagctgt 8640
ttctggtggt gcagcacagt cgggacaacg agacgttcag ggaggcgctg ctgaatatca 8700
ccgagcccga gggccgctgg ctcctggacc tggtgaacat tctgcagagc atcgtggtgc 8760
aggagcgcgg gctgccgctg tccgagaagc tggcggccat caacttctcg gtgctgagcc 8820
tgggcaagta ctacgctagg aagatctaca agaccccgta cgtgcccata gacaaggagg 8880
tgaagatcga tgggttttac atgcgcatga ccctgaaagt gctgaccctg agcgacgatc 8940
tgggggtgta ccgcaacgac aggatgcacc gcgcggtgag cgccagccgc cggcgcgagc 9000
tgagcgacca ggagctgatg cacagcctgc agcgggccct gaccggggcc gggaccgagg 9060
gggagagcta ctttgacatg ggcgcggacc tgcgctggca gcccagccgc cgggccttgg 9120
aagctgccgg cggcgtgccc tacgtggagg aggtggacga tgaggaggag gagggcgagt 9180
acctggaaga ctgatggcgc gaccgtattt ttgctagatg cagcaacagc caccgccgcc 9240
gcctcctgat cccgcgatgc gggcggcgct gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc 9300
ggacgattgg acccaggcca tgcaacgcat catggcgctg acgacccgca atcccgaagc 9360
ctttagacag cagcctcagg ccaaccggct ctcggccatc ctggaggccg tggtgccctc 9420
gcgctcgaac cccacgcacg agaaggtgct ggccatcgtg aacgcgctgg tggagaacaa 9480
ggccatccgc ggcgacgagg ccgggctggt gtacaacgcg ctgctggagc gcgtggcccg 9540
ctacaacagc accaacgtgc agacgaacct ggaccgcatg gtgaccgacg tgcgcgaggc 9600
ggtgtcgcag cgcgagcggt tccaccgcga gtcgaacctg ggctccatgg tggcgctgaa 9660
cgccttcctg agcacgcagc ccgccaacgt gccccggggc caggaggact acaccaactt 9720
catcagcgcg ctgcggctga tggtggccga ggtgccccag agcgaggtgt accagtcggg 9780
gccggactac ttcttccaga ccagtcgcca gggcttgcag accgtgaacc tgagccaggc 9840
tttcaagaac ttgcagggac tgtggggcgt gcaggccccg gtcggggacc gcgcgacggt 9900
gtcgagcctg ctgacgccga actcgcgcct gctgctgctg ctggtggcgc ccttcacgga 9960
cagcggcagc gtgagccgcg actcgtacct gggctacctg cttaacctgt accgcgaggc 10020
catcgggcag gcgcacgtgg acgagcagac ctaccaggag atcacccacg tgagccgcgc 10080
gctgggccag gaggacccgg gcaacctgga ggccaccctg aacttcctgc tgaccaaccg 10140
gtcgcagaag atcccgcccc agtacgcgct gagcaccgag gaggagcgca tcctgcgcta 10200
cgtgcagcag agcgtggggc tgttcttgat gcaggagggg gccacgccca gcgccgcgct 10260
cgacatgacc gcgcgcaaca tggagcccag catgtacgcc cgcaaccgcc cgttcatcaa 10320
taagctgatg gactacttgc atcgggcggc cgccatgaac tcggactact ttaccaacgc 10380
catcttgaac ccgcactggc tcccgccgcc cgggttctac acgggcgagt acgacatgcc 10440
cgaccccaac gacgggttcc tgtgggacga cgtggacagc agcgtgttct cgccgcggcc 10500
caccaccacc accgtgtgga agaaagaggg cggggaccgg cggccgtcct cggcgctgtc 10560
cggtcgcgcg ggtgctgccg cggcggtgcc cgaggctgcc agccccttcc cgagcctgcc 10620
cttttcgctg aacagcgtgc gcagcagcga gctgggtcgg ctgacgcggc cgcgcctgct 10680
gggcgaggag gagtacctga acgactcctt gttgaagccc gagcgcgaga agaacttccc 10740
caataacggg atagagagcc tggtggacaa gatgagccgc tggaagacgt acgcgcacga 10800
gcacagggac gagccccgag ctagcagcgc aggcacccgt agacgccagc ggcacgacag 10860
gcagcgggga ctggtgtggg acgatgagga ttccgccgac gacagcagcg tgttggactt 10920
gggtgggagt ggtggtggta acccgttcgc tcacctgcgc ccccgtatcg ggcgcctgat 10980
gtaagaatct gaaaaaataa aagacggtac tcaccaaggc catggcgacc agcgtgcgtt 11040
cttctctgtt gtttgtagta gtatgatgag gcgcgtgtac ccggagggtc ctcctccctc 11100
gtacgagagc gtgatgcagc aggcggtggc ggcggcgatg cagcccccgc tggaggcgcc 11160
ttacgtgccc ccgcggtacc tggcgcctac ggaggggcgg aacagcattc gttactcgga 11220
gctggcaccc ttgtacgata ccacccggtt gtacctggtg gacaacaagt cggcggacat 11280
cgcctcgctg aactaccaga acgaccacag caacttcctg accaccgtgg tgcagaacaa 11340
cgatttcacc cccacggagg ccagcaccca gaccatcaac tttgacgagc gctcgcggtg 11400
gggcggccag ctgaaaacca tcatgcacac caacatgccc aacgtgaacg agttcatgta 11460
cagcaacaag ttcaaggcgc gggtgatggt ctcgcgcaag acccccaacg gggtcacggt 11520
aggggatgat tatgatggta gtcaggacga gctgacctac gagtgggtgg agtttgagct 11580
gcccgagggc aacttctcgg tgaccatgac catcgatctg atgaacaacg ccatcatcga 11640
caactacttg gcggtggggc ggcagaacgg ggtgctggag agcgacatcg gcgtgaagtt 11700
cgacacgcgc aacttccggc tgggctggga ccccgtgacc gagctggtga tgccgggcgt 11760
gtacaccaac gaggccttcc accccgacat cgtcctgctg cccggctgcg gcgtggactt 11820
caccgagagc cgcctcagca acctgctggg catccgcaag cggcagccct tccaggaggg 11880
cttccagatc ctgtacgagg acctggaggg gggcaacatc cccgcgctct tggatgtcga 11940
agcctatgaa gaaagtaagg aaaaagcaga ggctgaggca actacagccg tggctaccgc 12000
cgcgactgtg gcagatgcca ctgtcaccag gggcgataca ttcgccaccc aggcggagga 12060
agcagccgcc ctagcggcga ccgatgatag tgaaagtaag atagtcatca agccggtgga 12120
gaaggacagc aagaacagga gctacaacgt tctaccggat ggaaagaaca ccgcctaccg 12180
cagctggtac ctggcctaca actacggcga ccccgagaag ggcgtgcgct cctggacgct 12240
gctcaccacc tcggacgtca cctgcggcgt ggagcaagtc tactggtcgc tgcccgacat 12300
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agatcacggg accctgccgc tgcgcagcag tatccgggga gtccagcgcg tgaccgtcac 12600
tgacgccaga cgccgcacct gcccctacgt ctacaaggcc ctgggcgtag tcgcgccgcg 12660
cgtcctctcg agccgcacct tctaaaaaat gtccattctc atctcgccca gtaataacac 12720
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gcgctcgcgc accaccgtcg acgacgtgat cgaccaggtg gtggccgacg cgcgcaacta 12900
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cacccccgcc atgcgcgcgg cgcgagcctt gctgcgcagg gccaggcgca cgggacgcag 13080
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gtgcagtggc gcgggcggaa agtgaaaccg gtgctgcggc ccggcaccac ggtggtcttc 13560
acgcccggcg agcgttccgg ctccgcctcc aagcgctcct acgacgaggt gtacggggac 13620
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cgccccgcgc ccttgaaaga ggaggcggtg tccatcccgc tggaccacgg caaccccacg 13740
ccgagcctga agccggtgac cctgcagcag gtgctgccga gcgcggcgcc gcgccggggc 13800
ttcaagcgcg agggcggcga ggatctgtac ccgaccatgc agctgatggt gcccaagcgc 13860
cagaagctgg aggacgtgct ggagcacatg aaggtggacc ccgaggtgca gcccgaggtc 13920
aaggtgcggc ccatcaagca ggtggccccg ggcctgggcg tgcagaccgt ggacatcaag 13980
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cggagagtgt atcgcagcgg gcgcgagcct ctgaccctgc cgcgcgcgcg ctaccacccg 14340
agcatcgcca tttaactacc gcctcctact tgcagatatg gccctcacat gccgcctccg 14400
cgtccccatt acgggctacc gaggaagaaa gccgcgccgt agaaggctga cggggaacgg 14460
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cgtggcggtg caggcctctc agcgccactg agacacaaaa aagcatggat ttgtaataaa 14640
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tcgtccctgg caccgcgaca cggcacgcgg ccgtttatgg gcacctggag cgacatcggc 14760
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ctgagggaaa agctgaaaga gcagaacttc cagcagaagg tggtcgatgg cctggcctcg 14940
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gcacatcgcc ggacaggacg cttcggagta cctgagtccg ggtctggtgc agttcgcccg 15600
cgccacagac acctacttca gtctggggaa caagtttagg aaccccacgg tggcgcccac 15660
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tgacaccata atttatgctg ataaaacttt ccaaccagag ccacaggttg gaagtgacag 16080
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ctttgacagc aaaaatattg cagctaacta cgatccagat attgtaatgt acacagaaaa 16320
tgttgagttg caaactccag atactcatat tgtgtttaag ccaggaactt cagatgaaag 16380
ttcagaagcc aatttgggcc agcaggccat gcccaacaga cccaactaca tcgggttcag 16440
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ccagctcttg cttgactctc tgggtgacag aaccaggtat ttcagtatgt ggaatcaggc 16620
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ctacaagtac acgccggcca acatcacgct gccgaccaac accaacacct acgattacat 16980
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cttccgcaag gacgtcaaca tgatcctgca gagctccctc ggcaacgacc tgcgcacgga 17280
cggggcctcc atcgccttca ccagcatcaa cctctacgcc accttcttcc ccatggcgca 17340
caacaccgcc tccacgctcg aggccatgct gcgcaacgac accaacgacc agtccttcaa 17400
cgactacctc tcggcggcca acatgctcta ccccatcccg gccaacgcca ccaacgtgcc 17460
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catcccctac ctcgacggca ccttctacct caaccacacc ttcaagaagg tctccatcac 17640
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ctggttcctg gtccagatgc tggcccacta caacatcggc taccagggct tctacgtgcc 17820
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caactacccc tacccgctca tcggcaagag cgccgtcgcc agcgtcaccc agaaaaagtt 18060
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gctcaccgac ctcggccaga acatgctcta cgccaactcc gcccacgcgc tagacatgaa 18180
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cttctcggcc ggcaacgcca ccacctaaag ccccgctctt gcttcttgca agatgacggc 18360
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cttcctgggc accttcgaca agcgcttccc gggattcatg gccccgcaca agctggcctg 18480
cgccatcgtc aacacggccg gccgcgagac cgggggcgag cactggctgg ccttcgcctg 18540
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ctccgcctac tttcgctccc accgcgcgcg catcgagaag gccaccgcct tcgaccgcat 18960
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cagccgggct tgtggttgca atcgcagtgc agggggatca gcatcatctg agcctgctcg 19500
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ttctcgctcg ccacatccat ctcgatcgtg tgctccttct ggatcatcac ggtcccgtgc 19800
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cggcctccgc gacctcctcc ccatgaacta atcaccccct tatccagtga aataaagatc 24600
atattgatga tgattttaca gaaataaaga tacaatcata ttgatgattt gagtttaata 24660
aaaaataaag aatcacttac ttgaaatctg ataccaggtc tctgtccatg ttttctgcca 24720
acaccacttc actcccctct tcccagctct ggtactgcag gccccggcgg gctgcaaact 24780
tcctccacac gctgaagggg atgtcaaatt cctcctgtcc ctcaatcttc attttatctt 24840
ctatcagatg tccaaaaagc gcgtccgggt ggatgatgac ttcgaccccg tctaccccta 24900
cgatgcagac aacgcaccga ccgtgccctt catcaacccc cccttcgtct cttcagatgg 24960
attccaagag aagcccctgg gggtgctgtc cctgcgactg gccgaccccg tcaccaccaa 25020
gaacggggaa atcaccctca agctgggaga gggggtggac ctcgactcct cgggaaaact 25080
catctccaac acggccacca aggccgccgc ccctctcagt ttttccaaca acaccatttc 25140
ccttaacatg gatcacccct tttacactaa agatggaaaa ttatccttac aagtttctcc 25200
accattaaat atactgagaa caagcattct aaacacacta gctttaggtt ttggatcagg 25260
tttaggactc cgtggctctg ccttggcagt acagttagtc tctccactta catttgatac 25320
tgatggaaac ataaagctta ccttagacag aggtttgcat gttacaacag gagatgcaat 25380
tgaaagcaac ataagctggg ctaaaggttt aaaatttgaa gatggagcca tagcaaccaa 25440
cattggaaat gggttagagt ttggaagcag tagtacagaa acaggtgttg atgatgctta 25500
cccaatccaa gttaaacttg gatctggcct tagctttgac agtacaggag ccataatggc 25560
tggtaacaaa gaagacgata aactcacttt gtggacaaca cctgatccat cgccaaactg 25620
tcaaatactc gcagaaaatg atgcaaaact aacactttgc ttgactaaat gtggtagtca 25680
aatactggcc actgtgtcag tcttagttgt aggaagtgga aacctaaacc ccattactgg 25740
caccgtaagc agtgctcagg tgtttctacg ttttgatgca aacggtgttc ttttaacaga 25800
acattctaca ctaaaaaaat actgggggta taggcaggga gatagcatag atggcactcc 25860
atataccaat gctgtaggat tcatgcccaa tttaaaagct tatccaaagt cacaaagttc 25920
tactactaaa aataatatag tagggcaagt atacatgaat ggagatgttt caaaacctat 25980
gcttctcact ataaccctca atggtactga tgacagcaac agtacatatt caatgtcatt 26040
ttcatacacc tggactaatg gaagctatgt tggagcaaca tttggggcta actcttatac 26100
cttctcatac atcgcccaag aatgaacact gtatcccacc ctgcatgcca acccttccca 26160
ccccactctg tggaaaaaac tctgaaacac aaaataaaat aaagttcaag tgttttattg 26220
attcaacagt tttacaggat tcgagcagtt atttttcctc caccctccca ggacatggaa 26280
tacaccaccc tctccccccg cacagccttg aacatctgaa cgccattggt gatggacatg 26340
cttttggtct ccacgttcca cacagtttca gagcgagcca gtctcgggtc ggtcagggag 26400
atgaaaccct ccgggcatac acagtccttt ctccccggct ggccttaaaa agcatcatat 26460
catgggtaac agacatattc ttaggtgtta tattccacac ggtttcctgt cgagccaaac 26520
gctcatcagt gatattaata aactccccgg gcagctcact taagttcatg tcgctgtcca 26580
gctgctgagc cacaggctgc tgtccaactt gcggttgctt aacgggcggc gaaggagaag 26640
tccacgccta catgggggta gagtcataat cgtgcatcag gatagggcgg tggtgctgca 26700
gcagcgcgcg aataaactgc tgccgccgcc gctccgtcct gcaggaatac aacatggcag 26760
tggtctcctc agcgatgatt cgcaccgccc gcagcataag gcgccttgtc ctccgggcac 26820
agcagcgcac cctgatctca cttaaatcag cacagtaact gcagcacagc accacaatat 26880
tgttcaaaat cccacagtgc aaggcgctgt atccaaagct catggcgggg accacagaac 26940
ccacgtggcc atcataccac aagcgcaggt agattaagtg gcgacccctc ataaacacgc 27000
tggacataaa cattacctct tttggcatgt tgtaattcac cacctcccgg taccatataa 27060
acctctgatt aaacatggcg ccatccacca ccatcctaaa ccagctggcc aaaacctgcc 27120
cgccggctat acactgcagg gaaccgggac tggaacaatg acagtggaga gcccaggact 27180
cgtaaccatg gatcatcatg ctcgtcatga tatcaatgtt ggcacaacac aggcacacgt 27240
gcatacactt cctcaggatt acaagctcct cccgcgttag aaccatatcc cagggaacaa 27300
cccattcctg aatcagcgta aatcccacac tgcagggaag acctcgcacg taactcacgt 27360
tgtgcattgt caaagtgtta cattcgggca gcagcggatg atcctccagt atggtagcgc 27420
gggtttctgt ctcaaaagga ggtagacgat ccctactgta cggagtgcgc cgagacaacc 27480
gagatcgtgt tggtcgtagt gtcatgccaa atggaacgcc ggacgtagtc atattaactt 27540
ttaatccaaa cggtctcgga gcacttcaaa atgaagatcg cggagatggc acctctcgcc 27600
cccgctgtgt tggtggaaaa taacagccag gtcaaaggtg atacggttct cgagatgttc 27660
cacggtggct tccagcaaag cctccacgcg cacatccaga aacaagacaa tagcgaaagc 27720
gggagggttc tctaattcct caatcatcat gttacactcc tgcaccatcc ccagataatt 27780
ttcatttttc cagccttgaa tgattcgaac tagttcctga ggtaaatcca agccagccat 27840
gataaagagc tcgcgcagag cgccctccac cggcattctt aagcacaccc tcataattcc 27900
aagatattct gctcctggtt cacctgcagc agattgacaa gcggaatatc aaactctctg 27960
ccgcgatccc taagctcctc cctcagcaat aactgtaagt actctttcat atcctctccg 28020
aaatttttag ccataggacc gccaggaata agattagggc aagccacagt acagataaac 28080
cgaagtcctc cccagtgagc attgccaaat gcaagactgc tataagcatg ctggctagac 28140
ccggtgatat cttccagata actggacaga aaatcgccca ggcaattttt aagaaaatca 28200
acaaaagaaa aatcctccag gtgcacgttt agagcctcgg gaacaacgat ggagtaaatg 28260
caagcggtgc gttccagcat ggttagttag ctgatctgta gaaaaaacaa aaatgaacat 28320
taaaccatgc tagcctggcg aacaggtggg taaatcgttc tttccagcac caggcaggcc 28380
acggggtctc cggcacgacc ctcgtaaaaa ttgtcgctat gattgaaaac catcacagag 28440
agacgttccc ggtggccggc gtgaatgatt cgacaagatg aatacacccc cggaacattg 28500
gcgtccgcga gtgaaaaaaa gcgcccgagg aagcaataag gcactacaat gctcagtctc 28560
aagtccagca aagcgatgcc atgcggatga agcacaaaat tctcaggtgc gtacaaaatg 28620
taattactcc cctcctgcac aggcagcaaa gcccccgatc cctccaggta cacatacaaa 28680
gcctcagcgt ccatagctta ccgagcagca gcagcagcac acaacaggcg caagagtcag 28740
agaaaggctg agctctaacc tgtccacccg ctctctgctc aatatatagc ccagatctac 28800
actgacgtaa aggccaaagt ctaaaaatac ccgccaaata gtcacacacg cccagcacac 28860
gcccagaaac cggtgacaca ctcaaaaaaa tacgcgcact tcctcaaacg cccaaactgc 28920
cgtcatttcc gggttcccac gctacgtcat caaaacacga ctttcaaatt ccgtcgaccg 28980
ttaaaaacgt cacccgcccc gcccctaacg gtcgcccgtc tctcagccaa tcagcgcccc 29040
gcatccccaa attcaaacac ctcatttgca tattaacgcg caccaaaagt ttgaggtata 29100
ttattgatga tgttaattaa agcacgcgtg gatcctacgt ctcgaccgat gcccttgaga 29160
gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt 29220
atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt 29280
ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc 29340
ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc 29400
gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt cttgctggcg 29460
ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc cggcggcatc 29520
gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca tcagggacag 29580
cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc gctgatcgtc 29640
acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat tgtaggcgcc 29700
gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg ggccacctcg 29760
acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga attggagcca 29820
atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac atatccatcg 29880
cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg tcctggccac 29940
gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg ggttgcctta 30000
ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc tgctgcaaaa 30060
cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg taaagtctgg 30120
aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca ggatgctgct 30180
ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga ccctgagtga 30240
tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa cgttccagta 30300
accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt ttcatcggta 30360
tcattacccc catgaacaga aattccccct tacacggagg catcaagtga ccaaacagga 30420
aaaaaccgcc cttaacatgg cccgctttat cagaagccag acattaacgc ttctggagaa 30480
actcaacgag ctggacgcgg atgaacaggc agacatctgt gaatcgcttc acgaccacgc 30540
tgatgagctt taccgcagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 30600
catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 30660
ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 30720
tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 30780
gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 30840
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 30900
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 30960
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 31020
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 31080
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 31140
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 31200
ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 31260
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 31320
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 31380
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 31440
tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 31500
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tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 31800
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ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 31980
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cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 32280
ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 32340
tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 32400
acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 32460
tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 32520
actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 32580
aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 32640
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 32700
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 32760
cgaaaagtgc cacctgtcta gctacgaatt c 32791

Claims (6)

1.一种呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列，其特征在于，该全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列包括S155C、S190F、V207L和S290C四个突变位点，保留了融合糖蛋白的跨膜区及胞内区，该全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列的序列表如序列1所示：
序列1：
gccaccATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCTGTGACCTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGCGGACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAAAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGATCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACCGGGCTAGACGCGAGCTGCCTCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCAGCGCCATTGCTAGCGGAGTGGCCGTGTGCAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGTCCGCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCTTCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCCTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGTGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGGCTGGTACTGCGATAATGCCGGCAGCGTGTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCTCCAAGACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGGTGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGCTGCTGCACAATGTGAATGCCGTGAAGTCCACCACCAATATCATGATCACCACAATCATCATCGTGATCATCGTCATCCTGCTGTCCCTGATCGCCGTGGGCCTGCTGCTGTACTGCAAGGCCCGGTCCACCCCTGTGACCCTGTCCAAGGACCAGCTGAGCGGCATCAACAATATCGCCTTCTCCAACTGA。
2.一种含有如权利要求1所述全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列的重组腺病毒载体，其特征在于，所述重组腺病毒载体为猩猩复制缺陷型重组腺病毒载体pChAd63，出发毒株为猩猩腺病毒63型，缺失了腺病毒E1和E3区、且E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6；
或者；
所述重组腺病毒载体为人复制缺陷型重组腺病毒载体pAd26，出发毒株为人腺病毒26型，缺失了腺病毒E1和E3区、且E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6。
3.根据权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述缺失腺病毒E1和E3区，E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6的骨架载体pChAd63的序列表如序列2所示：
序列2：
tGATATCCTTAATTAAcatcatcaataatatacctcaaacttttggtgcgcgttaatatgcaaatgaggtgtttgaatttggggatgcggggcgctgattggctgagagacgggcgaccgttaggggcggggcgggtgacgttttgatgacgtggccgtgaggcggagccggtttgcaagttctcgtgggaaaagtgacgtcaaacgaggtgtggtttgaacacggaaatactcaattttcccgcgctctctgacaggaaatgaggtgtttctgggcggatgcaagtgaaaacgggccattttcgcgcgaaaactgaatgaggaagtgaaaatctgagtaattccgcgtttatggcagggaggagtatttgccgagggccgagtagactttgaccgattacgtgggggtttcgattaccgtatttttcacctaaatttccgcgtacggtgtcaaagtccggtgtttttacgtaggcgtcagctgatcgccagggtatttaaacctgcgctctctagtcaagaggccactcttgagtgccagcgagtagagttaacgggacggagttcggctccagcggggaagaatctgactagagtgagtagtgtttgggggtgggtgggagcctgcatgatgggcagaatgactaaaatctgtgtttttctgtgtgttgcagcagcatgagcggaagcgcctcctttgagggaggggtattcagcccttatctgacggggcgtctcccctcctgggcgggagtgcgtcagaatgtgatgggatccacggtggacggccggcccgtgcagcccgcgaactcttcaaccctgacctacgcgaccctgagctcctcgtccgtggacgcagctgccgccgcagctgctgcttccgccgccagcgccgtgcgcggaatggccctgggcgccggctactacagctctctggtggccaactcgagttccaccaataatcccgccagcctgaacgaggagaagctgttgctgctgatggcccagctcgaggccctgacccagcgcctgggcgagctgacccagcaggtggctcagctgcaggcggagacgcgggccgcggttgccacggtgaaaaccaaataaaaaatgaatcaataaataaacggagacggttgttgattttaacacagagtcttgaatctttatttgatttttcgcgcgcggtaggccctggaccaccggtctcgatcattgagcacccggtggatcttttccaggacccggtagaggtgggcttggatgttgaggtacatgggcatgagcccgtcccgggggtggaggtagctccattgcagggcctcgtgctcgggggtggtgttgtaaatcacccagtcatagcaggggcgcagggcgtggtgctgcacgatgtctttgaggaggagactgatggccacgggcagccccttggtgtaggtgttgacgaacctattgagctgggagggatgcatgcggggggagatgagatgcatcttggcctggatcttgagattggcgatgttcccgcccagatcccgccgggggttcatgttgtgcaggaccaccagcacggtgtatccggtgcacttggggaatttgtcatgcaacttggaagggaaggcgtgaaagaatttggagacgcccttgtgaccgcccaggttttccatgcactcatccatgatgatggcgatgggcccgtgggcggcggcctgggcaaagacgtttcgggggtcggacacatcgtagttgtggtcctgggtgagctcgtcataggccattttaatgaatttggggcggagggtacccgactgggggacaaaggtgccctcgatcccgggggcgtagttcccctcgcagatctgcatctcccaggccttgagctcggagggggggatcatgtccacctgcggggcgatgaaaaaaacggtttccggggcgggggagatgagctgcgccgaaagcaggttccggagcagctgggacttgccgcagccggtggggccgtagatgaccccgatgaccggctgcaggtggtagttgagggagagacagctgccgtcctcgcggaggaggggggccacctcgttcatcatctcgcgcacatgcatgttctcgcgcacgagttccgccaggaggcgctcgccccccagcgagaggagctcttgcagcgaggcgaagtttttcagcggcttgagcccgtcggccatgggcattttggagagggtctgttgcaagagttccagacggtcccagagctcggtgatgtgctctagggcatctcgatccagcagacctcctcgtttcgcgggttggggcgactgcgggagtagggcaccaggcgatgggcgtccagcgaggccagggtccggtccttccagggtcgcagggtccgcgtcagcgtggtctccgtcacggtgaaggggtgcgcgccgggctgggcgcttgcgagggtgcgcttcaggctcatccggctggtcgagaaccgctcccggtcggcgccctgcgcgtcggccaggtagcaattgagcatgagttcgtagttgagcgcctcggccgcgtggcccttggcgcggagcttacctttggaagtgtgtccgcagacgggacagaggagggacttgagggcgtagagcttgggggcgaggaagacggactcgggggcgtaggcgtccgcgccgcagctggcgcagacggtctcgcactccacgagccaggtgaggtcggggcggtcggggtcaaaaacgaggtttcctccgtgctttttgatgcgtttcttacctctggtctccatgagctcgtgtccccgctgggtgacaaagaggctgtccgtgtccccgtagaccgactttatgggccggtcctcgagcggggtgccgcggtcctcgtcgtagaggaaccccgcccactccgagacgaaggcccgggtccaggccagcacgaaggaggccacgtgggaggggtagcggtcgttgtccaccagcgggtccaccttctccagggtatgcaagcacatgtccccctcgtccacatccaggaaggtgattggcttgtaagtgtaggccacgtgaccgggggtcccggccgggggggtataaaagggggcgggcccctgctcgtcctcactgtcttccggatcgctgtccaggagcgccagctgttggggtaggtattccctctcgaaggcgggcatgacctcggcactcaggttgtcagtttctagaaacgaggaggatttgatattgacggtgccgttggagacgcctttcatgagcccctcgtccatctggtcagaaaagacgatctttttgttgtcgagcttggtggcgaaggagccgtagagggcgttggagagcagcttggcgatggagcgcatggtctggttcttttccttgtcggcgcgctccttggcggcgatgttgagctgcacgtactcgcgcgccacgcacttccattcggggaagacggtggtgagctcgtcgggcacgattctgacccgccagccgcggttgtgcagggtgatgaggtccacgctggtggccacctcgccgcgcaggggctcgttggtccagcagaggcgcccgcccttgcgcgagcagaaggggggcagcgggtccagcatgagctcgtcgggggggtcggcgtccacggtgaagatgccgggcaggagctcggggtcgaagtagctgatgcaggtgcccagatcgtccagacttgcttgccagtcgcgcacggccagcgcgcgctcgtaggggctgaggggcgtgccccagggcatggggtgcgtgagcgcggaggcgtacatgccgcagatgtcgtagacgtagaggggctcctggaggacgccgatgtaggtggggtagcagcgccccccgcggatgctggcgcgcacgtagtcgtacagctcgtgcgagggcgcgaggagccccgtgccgagattggagcgctgcggcttttcggcgcggtagacgatctggcggaagatggcgtgggagttggaggagatggtgggcctctggaagatgttgaagtgggcatggggcagtccgaccgagtccctgatgaagtgggcgtaggagtcctgcagcttggcgacgagctcggcggtgacgaggacgtccagggcgcagtagtcgagggtctcttggatgatgtcgtacttgagctggcccttctgcttccacagctcgcggttgagaaggaactcttcgcggtccttccagtactcttcgagggggaacccgtcctgatcggcacggtaagagcccaccatgtagaactggttgacggccttgtaggcgcagcagcccttctccacggggagggcgtaagcttgcgcggccttgcgcagggaggtgtgggtgagggcgaaggtgtcgcgcaccatgactttgaggaactggtgcttgaagtcgaggtcgtcgcagccgccctgctcccagagctggaagtccgtgcgcttcttgtaggcggggttgggcaaagcgaaagtaacatcgttgaagaggatcttgcccgcgcggggcatgaagttgcgagtgatgcggaaaggctggggcacctcggcccggttgttgatgacctgggcggcgaggacgatctcgtcgaagccgttgatgttgtgcccgacgatgtagagttccacgaatcgcgggcggcccttgacgtggggcagcttcttgagctcgtcgtaggtgagctcggcggggtcgctgagcccgtgctgctcgagggcccagtcggcgacgtgggggttggcgctgaggaaggaagtccagagatccacggccagggcggtctgcaagcggtcccggtactgacggaactgctggcccacggccattttttcgggggtgacgcagtagaaggtgcgggggtcgccgtgccagcggtcccacttgagctggagggcgaggtcgtgggcgagctcgacgagcggcgggtccccggagagtttcatgaccagcatgaaggggacgagctgcttgccgaaggaccccatc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4.根据权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述缺失腺病毒E1和E3区，E4orf6替换为人5型腺病毒E4orf6的骨架载体pAd26的序列表如序列3所示：
序列3：
ttaattaagaggtaggtttgagtagtgggcgtggctaaggtgactataaaggcgggtgtcttacgagggtctttttgcttttctgcagacatcatgaacgggactggcggggccttcgaaggggggctttttagcccttatttgacaacccgcctgccgggatgggccggagttcgtcagaatgtgatgggatcgacggtggatgggcgcccagtgcttccagcaaattcctcgaccatgacctacgcgaccgtggggaactcgtcgctcgacagcaccgccgcagccgcggcagccgcagccgccatgacagcgacgagactggcctcgagctacatgcccagcagcggtagtagcccctctgtgcccagttccatcatcgccgaggagaaactgctggccctgctggccgagctggaagccctgagccgccagctggccgccctgacccagcaggtgtccgagctccgcgaacagcagcagcagcaaaataaatgattcaataaacacagattctgattcaaacagcaaagcatctttattatttattttttcgcgcgcggtaggccctggtccacctctcccgatcattgagagtgcggtggattttttccaggacccggtagaggtgggattggatgttgaggtacatgggcatgagcccgtcccgtgggtggaggtagcaccactgcatggcctcgtgctctggggtcgtgttgtagatgatccagtcatagcaggggcgctgggcgtggtgctggatgatgtccttgaggaggagactgatggccacggggagccccttggtgtaggtgttggcaaaacggttgagctgggagggatgcatgcggggggagatgatgtgcagtttggcctggatcttgaggttggcgatgttgccacccagatcccgccgggggttcatgttgtgcaggaccaccagaacggtgtagcccgtgcacttggggaacttgtcatgcaacttggaagggaatgcgtggaagaatttggagacgcccttgtgcccgcccaggttttccatgcactcatccatgatgatggcaatgggcccgtgggctgcggctttggcaaagacgtttctggggtcagagacatcgtaattatgctcctgggtgagatcatcataagacattttaatgaatttggggcggagggtgccagattgggggacgatggttccctcgggccccggggcgaagttcccctcgcagatctgcatctcccaggctttcatctcggagggggggatcatgtccacctgcggggcgatgaaaaaaacggtttccggggcgggggtgatgagctgcgaggagagcaggtttctcaacagctgggacttgccgcacccggtcgggccgtagatgaccccgatgacgggttgcaggtggtagttcaaggacatgcagctgccgtcgtcccggaggaggggggccacctcgttgagcttgtctctgacttggaggttttcccggacgagctcgccgaggaggcggtccccgcccagcgagagaagctcttgcagggaagcaaagtttttcaggggcttgagcccgtcggccatgggcatcttggcgagggtctgcgagaggagctccaggcggtcccagagctcggtgacgtgctctacggcatctcgatccagcagacttcctcgtttcgggggttgggacgactgcgactgtagggcacgagacgatgggcgtccagcgcggccagcgtcatgtccttccagggtctcagggtccgcgtgagggtggtctccgtcacggtgaaggggtgggccgcgggctgggcgcttgcaagggtgcgcttgagactcatcctgctggtgctgaaacgggcacggtcttcgccctgcgcgtcggcgagatagcagttgaccatgagctcgtagttgagggcctcggcggcgtggcccttggcgcggagcttgcccttggaagagcgcccgcaggcgggacagaggagggattgcagggcgtagagcttgggcgcgagaaagacggactcgggggcgaaggcgtccgctccgcagtgggcgcagacggtctcgcactcgactagccaggtgagctcgggctgctcggggtcaaaaaccagttttcccccgttctttttgatgcgcttcttacctcgcgtctccatgagtctgtgtccgcgctcggtgacaaacaggctgtctgtgtccccgtagacggacttgatgggcctgtcctgcaggggcgtcccgcggtcctcctcgtagagaaactcagaccactctgagacgaaggcgcgcgtccacgccaagacaaaggaggccacgtgcgaggggtagcggtcgttgtccaccagggggtccaccttttccacggtatgcaggcacatgtccccctcctccgcatccaagaaggtgattggcttgtaggtgtaggccacgtgacctggggttcccgacgggggggtataaaagggggcgggtctgtgctcgtcctcactctcttccgcgtcgctgtccacgagcgccagctgttggggtaggtattccctctcaagagcgggcatgacctcggcactcaggttgtcagtttctagaaacgaggaggatttgatgtgggcctgccctgccgcgatgctttttaggagactttcatccatctggtcagaaaagactatttttttattgtcaagcttggtggcgaaggagccatagagggcgtttgagagaagcttggcgatggatctcatggtctgatttttgtcacggtcggcgcgctccttggccgcgatgttgagctggacatattcgcgcgcgacacacttccattcggggaagacggtggtgcgctcgtcgggcacgatcctgacgcgccagccgcggttatgcagggtgaccaggtccacgctggtggccacctcgccgcgcaggggctcgttggtccagcagagtctgccgcccttgcgcgagcagaacgggggcagcacatcaagcagatgctcgtcaggggggtccgcatcgatggtgaagatgcccggacagagttccttgtcaaaataatcgatttttgaggatgcatcgtccaaggccatctgccactcgcgggcggccagcgctcgctcgtaggggttgaggggcggaccccaaggcatgggatgcgtgagggcggaggcgtacatgccgcagatgtcatagacatagatgggctccgagaggatgccgatgtaggtgggatagcagcgccccccgcggatgcttgcgcgcacgtagtcatacaactcgtgcgagggggccaagaaggcggggccgagattggtgcgctggggctgctcggcgcggaagacgatctggcgaaagatggcgtgcgagttggaggagatggtgggccgttggaagatgttaaagtgggcgtgaggcaggcggaccgagtcgcggatgaagtgcgcgtaggagtcttgcagcttggcgacgagctcggcggtgacgaggacgtccatggcgcagtagtccagcgtttcgcggatgatgtcataactcgcctctcctttcttctcccacagctcgcggttgagggcgtattcctcgtcatccttccagtactcccggagcgggaatcctcgatcgtccgcacggtaagagcccagcatgtagaaatggttcacggccttgtagggacagcagcccttctccacggggagggcgtaagcttgagcggccttgcggagcgaggtgtgcgtcagggcaaaggtgtccctgaccatgactttcaagaactggtacttgaagtccgagtcgtcgcagccgccgtgctcccagagctcgaaatcggtgcgcttcttcgagagggggttaggcagagcgaaagtgacgtcattgaagagaatcttgcctgcccgcggcatgaaattgcgggtgatgcggaaagggcccgggacggaggctcggttgttgatgacctgggcggcgaggacgatctcgtcaaagccgttgatgttgtgcccgacgatgtagagttccatgaatcgcgggcggcctttgatgtgcggcagctttttgagctcctcgtaggtgaggtcctcggggcattgcaggccgtgctgctcgagcgcccactcctggagatgtgggttggcttgcatgaaggaagcccagagctcgcgggccatgagggtctggagctcgtcgcgaaagaggcggaactgctggcccacggccatcttttctggggtgacgcagtagaaggtgagggggtcccgctcccagcgatcccagcgtaaacgcacggcgagatcgcgagcgagggcgaccagctctgggtccccggagaatttcatgaccagcatgaaggggacgagctgcttgccgaaggaccccatccaggtgtaggtttctacatcgtaggtgacaaagagccgctccgtgcgaggatgagagccgattgggaagaactggatttcctgccaccagttggacgagtggctgttgatgtgatgaaagtagaaatcccgccggcgaaccgagcactcgtgctgatgcttgtaaaagcgtccgcagtactcgcagcgctgcacgggctgtacctcatccacgagatacacagcgcgtcccttgaggaggaacttcaggagtggcggccctggctggtggttttcatgttcgcctgcgtgggactcaccctggggctcctcgaggacggagaggctgacgagcccgcgcgggagccaggtccagatctcggcgcggcgggggcggagagcgaagacgagggcgcgcagttgggagctgtccatggtgtcgcggagatccaggtccgggggcagggttctgaggttgacctcgtagaggcgggtgagggcgtgcttgagatgcagatggtacttgatttctacgggtgagttggtggtcgtgtccacgcattgcatgagcccgtagctgcgcggggccacgaccgtgccgcggtgcgcttttagaagcggtgtcgcggacgcgctcccggcggcag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5.一种应用重组腺病毒的产品，其特征在于，所述产品的活性成分包含权利要求2至4任一项所述的重组腺病毒载体。
6.根据权利要求5所述的应用重组腺病毒的产品，其特征在于，所述产品包括：呼吸道合胞病毒疫苗和用于中和呼吸道合胞病毒的药物。
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