CN114195867A - 一种rsv融合前f蛋白、表达质粒、细胞株和rsv疫苗组合物 - Google Patents

一种rsv融合前f蛋白、表达质粒、细胞株和rsv疫苗组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、稳定表达融合前F蛋白的细胞株和RSV疫苗组合物，涉及生物医药技术领域。本发明在融合前F蛋白基础上引入N70Q突变位点，消除该糖基化位点并增强免疫原性，并以GCN4基序替换跨膜区和胞内区形成稳定的分泌型三聚体从而获得分泌型三聚体化的融合前F蛋白(NQ)。本发明利用真核表达的方法，成功构建了稳定表达所述融合前F蛋白NQ的CHO细胞系，将表达的NQ和佐剂(Al(OH)3+CpG‑X1)组合后，制备疫苗组合物。本发明所述疫苗组合物可诱导产生Th1/Th2平衡免疫应答、高滴度的中和抗体，以及细胞免疫，为研制RSV亚单位疫苗奠定基础。

Description

一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、细胞株和RSV疫苗组合物
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、细胞株和RSV疫苗组合物。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(Humanrespiratory syncytial virus，RSV)是导致婴幼儿、老年人和免疫力低下成年人下呼吸道感染(Lower respiratory tract infections，LRTI)的最重要病毒病原，几乎100％的婴幼儿在2岁以内感染过1次以上。在1月至1岁儿童全因死亡的单病原感染因素分析中，RSV引起的死亡人数约占总死亡人数的6.7％，排列第二位。RSV还是导致5岁以下的儿童因肺炎死亡的最重要病毒病原。因此，急需RSV疫苗降低RSV感染和RSV相关死亡人数，但是经过多年不懈努力，RSV的预防及治疗依然缺乏有效、可靠的方法。因此WHO将RSV疫苗列为二十一世纪应优先发展的疫苗。研发可用于预防RSV感染的疫苗，必将有助于提高婴幼儿和老年人的健康水平、助力实现健康中国的发展战略。
随着人们对RSV免疫逃逸机制的深入认识，以及对FI-RSV引起ERD原因的逐步理解，随着疫苗研究技术和方法的日益丰富，以限制病毒复制和降低RSV感染后严重下呼吸道症状为目的的RSV疫苗研制工作已看到希望，在亚单位疫苗(Subunitvaccine)及活疫苗(Live virus vaccine)的研究上取得了有意义的进展。亚单位疫苗是指由纯化的一种或几种RSV病毒蛋白组成的非复制型疫苗，能产生很好的抗体应答，但对新生儿仍存在疾病增强作用的风险，适宜于RSV血清阳性儿童、孕妇和老年人群提高免疫力，但是目前没有针对RSV的亚单位疫苗上市。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、细胞株和RSV疫苗组合物，所述RSV疫苗组合物能够诱导产生了Th1/Th2平衡免疫应答、高滴度的中和抗体，以及细胞免疫，为研制RSV亚单位疫苗奠定基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白NQ，所述融合前F蛋白NQ为在呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列中引入N70Q突变位点，并以GCN4基序替换跨膜区和胞内区。
优选的，所述融合前F蛋白NQ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种包含上述融合前F蛋白NQ的编码基因的表达质粒，所述表达质粒以真核表达质粒pMEW为基础载体；
所述真核表达质粒pMEW的制备方法，包括配利用MAR、EF-1a启动子、BGH poly(A)和WPRE的基因序列替换pcDNA3.1(+)的CMV启动子、多克隆位点和SV40 poly(A)序列。
优选的，所述真核表达质粒PMEW的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述表达质粒的构建方法，包括以下步骤：将上述融合前F蛋白的编码基因插入真核表达质粒pMEW的EcoRV和SpeI酶切位点之间。
本发明还提供了一种稳定表达上述融合前F蛋白NQ的细胞株，所述细胞株以CHO细胞株为基础细胞。
本发明还提供了上述细胞株的构建方法，包括以下步骤：利用上述表达质粒转染CHO细胞，筛选获得稳定表达融合前F蛋白NQ的CHO细胞株。
本发明还提供了上述融合前F蛋白NQ或上述表达质粒或上述细胞株在制备抗呼吸道合胞病毒感染的制剂中的应用。
本发明还提供了一种预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括上述融合前F蛋白NQ或利用上述重组细胞株生产得到的融合前F蛋白和佐剂(Al(OH)3+CpG-X1)。
优选的，所述佐剂的类型包括CpG-X1和Al(OH)3。
有益效果：本发明提供了一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的融合前F蛋白(NQ)，在融合前F蛋白(SC-TM)基础上引入N70Q突变位点，消除该糖基化位点增强免疫原性，从而获得新的preF(NQ)。本发明利用真核表达的方法，成功构建了稳定表达NQ的CHO细胞系，将表达的NQ和佐剂组合后，制备疫苗组合物。
本发明实施例中，将制备得到的疫苗组合物，经肌肉注射免疫小鼠诱导产生了Th1/Th2平衡免疫应答、高滴度的中和抗体，以及细胞免疫，为研制RSV亚单位疫苗奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例所述的血清ELISA抗体；
图2为本发明实施例所述的血清中和抗体；
图3为本发明实施例所述的血清IgG1和血清IgG2a；
图4为本发明实施例所述的细胞免疫。
具体实施方式
本发明提供一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白NQ，所述融合前F蛋白为NQ在呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列中引入N70Q突变位点，并以GCN4基序替换跨膜区和胞内区。本发明通过引入所述N70Q突变位点，可消除该糖基化位点并增强免疫原性，本发明通过用GCN4基序替换跨膜区和胞内区形成稳定的分泌型三聚体。本发明所述融合前F蛋白NQ的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。本发明所述呼吸道合胞病毒融合前F蛋白已在中国专利CN202010863762.X中进行公开，在此不再赘述。
本发明还提供了一种包含上述融合前F蛋白NQ的编码基因的表达质粒，所述表达质粒以真核表达质粒pMEW为基础载体；
所述真核表达质粒pMEW的制备方法，包括配利用MAR、EF-1a启动子、BGH poly(A)和WPRE的基因序列替换pcDNA3.1(+)的CMV启动子、多克隆位点和SV40 poly(A)序列。
本发明所述替换优选包括利用MluⅠ和PmeⅠ双酶切pcDNA3.1(+)后，与人工合成包含MAR、EF-1a启动子、BGH poly(A)和WPRE的基因序列连接，从而获得真核表达质粒pMEW。本发明所述真核表达质粒PMEW的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述表达质粒以pMEW为基础载体，并将所述融合前F蛋白NQ的编码基因插入真核表达质粒pMEW的EcoRV和SpeI酶切位点之间，从而构建得到所述表达质粒。本发明对所述MluⅠ和PmeⅠ双酶切及EcoRV和SpeI双酶切的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规双酶切方法即可。
本发明还提供了上述表达质粒的构建方法，包括以下步骤：将上述融合前F蛋白NQ的编码基因插入真核表达质粒pMEW的EcoRV和SpeI酶切位点之间。
本发明优选采用双酶切的方法将上述编码基因插入pMEW的EcoRV和SpeI酶切位点之间，获得表达质粒pMEW-NQ。
本发明还提供了一种表达上述融合前F蛋白NQ的重组细胞株，所述重组细胞株以CHO细胞株为基础细胞。
本发明优选利用所述表达质粒pMEW-NQ转染CHO细胞，并用抗生素G418进行筛选获得稳定表达preF蛋白(NQ)的CHO细胞株。
本发明还提供了上述重组细胞株的构建方法，包括以下步骤：利用上述表达质粒转染CHO细胞株，筛选获得稳定表达融合前F蛋白NQ的CHO细胞株。本发明所述筛选优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明所述转染时的CHO细胞的丰度优选为90％。本发明所述转染优选包括利用pMEW-NQ转染90％丰度的CHO细胞，37℃5％CO2孵育5h后，补加含10％血清的DMEM，37℃5％CO2，继续培养。转染后24h，按1:20、1:50、1:200、1:500、1:1000等多个稀释梯度传代，同时添加最小致死浓度的G418，待对照组细胞(未转染质粒)全部死亡，即可采用克隆环挑取单克隆。本发明所述最小致死浓度优选为800μg/ml。
在本发明中，优选对单克隆细胞进行扩大培养并对目的蛋白进行表达鉴定，筛选表达量高的单克隆进行扩大培养，从而进行融合前F蛋白NQ的表达。
本发明对所述扩大培养和表达的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
本发明还提供了上述融合前F蛋白NQ或上述表达质粒或上述细胞株在制备抗呼吸道合胞病毒感染的制剂中的应用。
本发明所述制剂优选包括药物、抗体、诊断试剂和疫苗。本发明对所述制剂的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法制备相应的制剂即可。
本发明还提供了一种预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括上述融合前F蛋白NQ或利用上述重组细胞株生产得到的融合前F蛋白NQ和佐剂。
本发明所述疫苗组合物优选为注射剂，采用肌肉注射给药方式，通过两次给予受试者相同用量的有效剂量的疫苗组合物，其中在首次给予疫苗组合物后第21～30d，给予第二次疫苗组合物。在本发明中，所述疫苗组合物中上述融合前F蛋白NQ的含量优选为5～100μg/ml，更优选为10～30μg/ml。本发明所述疫苗组合物中，所述佐剂优选包括CpG-X1和Al(OH)3，且CpG-X1的含量优选为10μg/ml，Al(OH)3的含量优选为100μg/ml。本发明CpG-X1序列已在中国专利ZL200810004736.0进行过公开，实施例中所用的具体序列为全链硫代修饰的SEQ ID NO.3：TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT，本发明所用CpG-X1由CN201010527003.2专利发明人许洪林提供。
下面结合实施例对本发明提供的一种RSV融合前F蛋白的融合前F蛋白、表达质粒、重组细胞株和RSV疫苗组合物进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
构建表达呼吸道合胞病毒(RSV)融合前融合蛋白(NQ)的CHO细胞株
一、pMEW真核表达质粒的构建
MluⅠ和PmeⅠ双酶切pcDNA3.1(+)后，与人工合成包含MAR、EF-1a启动子、BGHpoly(A)和WPRE的基因序列连接获得真核表达质粒pMEW。
二、pMEW-preF真核表达质粒的构建
通过EcoRV和SpeI将preF基因(SC-TM)连接到pMEW，获得pMEW-NQ。
三、稳定表达NQ蛋白的CHO细胞株的筛选
将CHO细胞接种于24孔板，待细胞贴壁后生长丰度约30～40％时，弃去原培养液，分别加入含不同浓度G418(设300、400、500、600、700、800、900和1000μg/ml)的完全培养液，持续培养14d，经14d的筛选后确定G418对筛选目的细胞的最小致死浓度为800μg/mL。
在转染前24h将CHO细胞接种于100mM细胞培养皿中，转染时细胞的丰度为90％。利用Lipofectamine 2000将纯化后的6μg pMEW-preF转染至CHO细胞上，37℃，5％CO2孵育5h后，补加含10％血清的DMEM 3000l，37℃，5％CO2，继续培养。转染后24小时，按1:20、1:50、1:200、1:500、1:1000等多个稀释梯度传代，同时添加800μg/mL的G418待对照组细胞(未转染质粒)全部死亡，即可采用克隆环挑取单克隆。
四、NQ表达鉴定及单克隆细胞扩大培养
采用斑点印记和免疫印记筛选表达量高的单克隆细胞，并进行扩大培养。
五、NQ纯化
采用镍柱纯化，纯化后采用凝血酶切除his标签。
实施例2
呼吸道合胞病毒疫苗组合物的初免-加强免疫
一、动物免疫
6～-8周龄的雌性BALB/c小鼠，分成3组，第0d，采集基础血清，第1d，第一次肌肉注射免疫。在免疫后第21d，第一次免疫后血。第28d，第二次肌肉注射免疫，两次免疫剂量均为50μl/鼠(其中，NQ或F为2μg，CpG-X1为10μg，Al(OH)3为100μg，溶解在PBS中。)。第49d，第二次免疫后血。第56d，经滴鼻途径进行攻毒实验，攻毒的剂量为1×106pfu/50μl的wtRSV。
分组及处理如下：
第一组(G1组)：Al(OH)3+NQ组；
第二组(G2组)：Al(OH)3+CpG-X1+NQ组；
第三组(G3组)：Al(OH)3+CpG-X1+野生型RSV F组；
二、免疫后小鼠血清IgG检测
待测溶液为：步骤一中免疫后第49d采集小鼠静脉血，分离获得血清。
采用ELISA方法检测小鼠的血清抗体滴度。纯化RSV按2500PFU/孔包被酶标板、融合前F蛋白(preF)按450ng/孔包被酶标板，融合后F蛋白(postF)1200ng/孔包被酶标板，ELISA方法检测小鼠血清抗体IgG。
结果如图1和图3所示，Al(OH)3+CpG-X1+NQ组免疫小鼠后，诱导产生较强的、Th1/Th2平衡的血清抗体。
三、免疫后小鼠血清中和抗体
1、按照2.0×104细胞/孔的密度将HEp-2细胞接种到96孔板上，培养24h。
2、将免疫后小鼠血清于56℃，灭活30min，并用2％胎牛血清的DMEM培养液进行2倍稀释。不同稀释度的血清中，加入RSV-mGFP使终浓度为1000PFU/100μl，混合后于37℃孵育1h。
3、弃96孔板培养基，PBS洗涤1～2次后，将100μl混合液(含1000PFU的RSV-mGFP)加入到铺有单层HEp-2细胞的96孔板中，37℃培养48h。同时设立空白对照(无病毒、无血清或抗体)、阴性对照组(有RSV-mGFP，无血清)和阳性对照组，培养2d。
4、完成步骤3后，采用多功能酶标仪SpectraMax M5e检测每孔中绿色荧光蛋白的荧光强度(激发波长479nm、发射波长517nm，检测10s)。
5、实验组、阴性对照组、阳性对照组均分别减去空白对照组，利用SPSS建立建立实验组的线性回归方程，通过线性回归方程，计算出荧光强度减少50％的抗体滴度(IC50)。
结果如图2所示，Al(OH)3+CpG-X1+NQ组免疫小鼠后，诱导产生较强的中和抗体。
四、免疫后小鼠细胞免疫效果分析
1、分离未免疫BAbl/C小鼠脾淋巴细胞(分离后的淋巴细胞采用10％FBS的1640完全培养基重悬)，一部分淋巴细胞中加入RSV F蛋白H-2Kd限制性CTL表位，另一部分淋巴细胞中加入无关蛋白或不加蛋白，4℃孵育过夜或37℃孵育4h。
2、孵育结束后，1200rpm室温离心5min。
3、PBS洗涤2次去除血清，预热到室温的PBS重悬细胞。
4、CFSEhigh：RSV F蛋白H-2Kd限制性CTL表位刺激过的淋巴细胞中加入的CFSE终浓度为5μM，颠倒混匀，室温避光孵育10min。
CFSElow：无关蛋白刺激或未加蛋白刺激的淋巴细胞中加入的CFSE终浓度为0.5μM，颠倒混匀，室温避光孵育10min。
5、避光孵育结束后，加入4～5倍体积的含10％FBS的预冷PBS，1200rpm 4℃离心5min，弃上清，加入含10％FBS的PBS重洗一次。
6、加入适量预热到室温的PBS重悬细胞，并计数细胞数量。
7、将浓度为0.5×l07细胞/100μl的CFSEhigh和CFSElow淋巴细胞按1:1比例混合。
8、按1.0×l07细胞/200μl/鼠，经尾静脉注射200μl到疫苗免疫鼠和未免疫组体内；
9、5～12h后，处死受体小鼠，分离脾淋巴细胞；
10、通过流式细胞仪计数的CFSEhigh和CFSElow淋巴细胞数目；
11、％Specific lysi＝(％CFSEhigh-％CFSElow)/％CFSEhigh×100％。
或
100％×[1-(CFSElow/CFSEhigh cells of
Figure BDA0003412664880000081
mice)/(CFSElow/CFSEhighcells ofimmunized mice)]。
结果如图4所示，Al(OH)3+CpG-X1+NQ组免疫小鼠后，诱导产生较强的体内细胞免疫。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京交通大学
<120> 一种RSV融合前F蛋白、表达质粒、细胞株和RSV疫苗组合物
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaactgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcaccacca tcctgaccgc tgtgaccttc 60
tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg 120
tccaagggct acctgagcgc cctgcggacc ggctggtaca ccagcgtgat caccatcgag 180
ctgagcaaca tcaagaaaat caagtgccag ggcaccgacg ccaagatcaa gctgatcaag 240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgagctgc agctgctgat gcagagcacc 300
cccgccacca acaaccaggc tagaggcagc ggaagcggac ggtccctggg cttcctgctg 360
ggcgtgggca gcgccattgc tagcggagtg gccgtgtcaa aggtgctgca cctggaaggc 420
gaagtgaaca agatcaagtc cgccctgctg agcaccaaca aggccgtggt gtccctgagc 480
aacggcgtgt ccgtgctgac cagcaaggtg ctggatctga agaactacat cgacaagcag 540
ctgctgccca tcgtgaacaa gcagagctgc agcatcccca acatcgagac agtgatcgag 600
ttccagcaga agaacaaccg gctgctggaa atcacccgcg agttcagcgt gaacgccggc 660
gtgaccaccc ccgtgtccac ctacatgctg accaacagcg agctgctgag cctgatcaac 720
gacatgccca tcaccaacga ccagaaaaag ctgatgagca acaacgtgca gatcgtgcgg 780
cagcagagct actccatcat gagcatcatc aaagaagagg tgctggccta cgtggtgcag 840
ctgcccctgt acggcgtgat cgacaccccc tgctggaagc tgcacaccag ccccctgtgc 900
accaccaaca ccaaagaggg cagcaacatc tgcctgaccc ggaccgaccg gggctggtac 960
tgcgataatg ccggcagcgt gtcattcttt ccacaagccg agacatgcaa ggtgcagagc 1020
aaccgggtgt tctgcgacac catgaacagc ctgaccctgc cctccgaagt gaacctgtgc 1080
aacgtggaca tcttcaaccc taagtacgac tgcaagatca tgacctccaa gaccgacgtg 1140
tccagctccg tgatcacctc cctgggcgcc atcgtgtcct gctacggcaa gaccaagtgc 1200
accgccagca acaagaaccg gggcatcatc aagaccttca gcaacggctg cgactacgtg 1260
tccaacaagg gggtggacac cgtgtccgtg ggcaacaccc tgtactacgt gaacaaacag 1320
gaaggcaaga gcctgtacgt gaagggcgag cccatcatca acttctacga ccccctggtg 1380
ttccccagcg accagttcga cgccagcatc agccaggtca acgagaagat caaccagagc 1440
ctggccttca tcagaaagag cgacgagctg ctgagcgcca tcggcggata catccccgag 1500
gcccccaggg acggccaggc ctatgtgagg aaggacggag agtgggtgct gctgtccaca 1560
ttcctgctgg tgcctcgcgg ttcccaccac caccaccacc actaatgaac tagt 1614
<210> 2
<211> 9995
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 60
ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 120
aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 180
gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 240
ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg 300
ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca 360
cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc 420
gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct 480
ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg 540
ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc 600
ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg 660
attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg 720
aattaattct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 780
gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag 840
gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc 900
cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 960
atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat 1020
tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag 1080
cttgtatatc cattttcgga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 1140
aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 1200
actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 1260
ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 1320
aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 1380
ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 1440
tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 1500
tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 1560
gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 1620
aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 1680
atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 1740
tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 1800
tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 1860
tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 1920
tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 1980
acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 2040
ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc 2100
caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 2160
aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 2220
ttatcatgtc tgtataccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 2280
gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 2340
aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 2400
actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 2460
cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 2520
gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 2580
atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 2640
caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 2700
gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 2760
ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 2820
cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 2880
taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 2940
cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 3000
acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 3060
aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 3120
atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 3180
atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 3240
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 3300
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 3360
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 3420
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 3480
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 3540
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 3600
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 3660
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 3720
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 3780
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 3840
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 3900
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 3960
atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 4020
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 4080
aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 4140
gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 4200
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 4260
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 4320
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 4380
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtcgacg gatcgggaga 4440
tctcccgatc ccctatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 4500
cagtatctgc tccctgcttg tgtgttggag gtcgctgagt agtgcgcgag caaaatttaa 4560
gctacaacaa ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga atctgcttag ggttaggcgt 4620
tttgcgctgc ttcgcgatgt acgggccaga tatacgcgtt aaataaatta ttaatccttt 4680
aaaagtactt caggataaaa taataatggc ttccctaccc agaaagcttt tactattgaa 4740
catgtttgca catcagtcat ctctcgttgc tcccataatg gccccaggag aagcacaggc 4800
caggcaattc caactgtctt tctccagaga aggaggtcca ggaaccagct tccttgaaca 4860
aaaaggaata tctactccaa agagtctaca ttactacaag ctggcttcaa aattgctttc 4920
ttcatcaagt tcatttgcct tatttacctt tacctccaaa agaagtgggg catattgggt 4980
tctttctctt gtaatatcag aaaaaggctt gattttccca tgtggatatg gttaaaaata 5040
aaaaagacag actaccatgc ctttgtaata cctgcccaga aaacggccaa aaatgtacag 5100
cttcatttcc aggcagtgga gaaagacaac aaagtagaaa ataggtcaga taatttccaa 5160
agaaagagct taaatcagaa atttccccct ttaaaacttt tctatcatta aatacatatt 5220
acaagagaca caaattaaga cagaaacgga ttctttgaag agaagtggaa ccagaacaaa 5280
acccattgtc agacagtgat aatgaagaac aactgcttta tagaccacaa agtattggcg 5340
acagagttac cccaaccacc gaaaggcagt ccatgcacaa atccaacccc cagccaggga 5400
cagaagaaag gggaatgaca gttgtctaca aggctgtcat ccacattgtt caattgaacc 5460
atcgcacaga gtcaagctta ggcaaaaaca gtccagagaa aggcagaaaa gcatttagat 5520
acagttctga aacacaggcc tcaccaagca ggaaaagcca cctctgccct aaaagtaaga 5580
tgcaagaccg caattgttct gagcagcaaa ggcccatgac aaatgctcag ctaaagagac 5640
agctcagctg gccgcagaga caagctcaca agcggttctc tccacccaca cccctgccta 5700
ctatggatca tacactgaga aaacacctcc cgttttcttt tggatccacg aactgctaaa 5760
ctctaaagct agagaagtcc tgagaagcaa gctagccgtc ccaggctcca cagctttatc 5820
ccatttatct ggttggccaa aggactgaat taatgtgtct tcatcaagac taaagaactg 5880
gaggctggag agatggctca gcggctaaga gcatgggctg ctcttccaga agacccaggt 5940
tcaattccca acacccactt ggcagctcac aactgtctat aacttcattt ccaaaatacc 6000
aatgcacatg aaataaaata aatttttaaa aagactaaag agctatggag gtacccaaca 6060
aaagcagtta tcatgggtcc caattattcc tccaagtaat ccaacaaaca caatgtctag 6120
cacacataag gaaattagac accatgaaga aaaaacaata cccaatatac acactcaagg 6180
agaaccataa agacaagtta gaattatcca atatgtcctc aataataaaa atgcaaataa 6240
cccaatcaaa caataggaaa agatctaaat agacatttca gaagatatac tgatgggtaa 6300
caagcacatg aaaagttggt cagcattact aattatagta atgcaaatca aatggaaatc 6360
aaaatctcaa agagaaacta ccttcaccca aaataatggc taacacaagg gaggaaaaca 6420
gaaaataaca aatgctggca aacttatgga caaataagaa cttacacttt ggagtatgta 6480
ctcaaatgaa gtttgcaaaa gcaaagattc agattttcat agatctatgt ggatggcata 6540
tgtcaaaagt tagacacaac tcaaggtgtc aaggggcaaa tagatataga aaatgtaata 6600
cttggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg 6660
gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa 6720
agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt 6780
gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt 6840
gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga 6900
attacttcca cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg 6960
tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc 7020
tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct 7080
gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc 7140
tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg 7200
gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg 7260
cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg 7320
cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca 7380
ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg 7440
aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt 7500
ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc 7560
gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg 7620
atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg 7680
taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag 7740
acagtggttc aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt gatatcgcca ccatggaact 7800
gctgatcctg aaggccaacg ccatcaccac catcctgacc gctgtgacct tctgcttcgc 7860
cagcggccag aacatcaccg aggaattcta ccagagcacc tgtagcgccg tgtccaaggg 7920
ctacctgagc gccctgcgga ccggctggta caccagcgtg atcaccatcg agctgagcaa 7980
catcaagaaa atcaagtgcc agggcaccga cgccaagatc aagctgatca agcaggaact 8040
ggacaagtac aagaacgccg tgaccgagct gcagctgctg atgcagagca cccccgccac 8100
caacaaccag gctagaggca gcggaagcgg acggtccctg ggcttcctgc tgggcgtggg 8160
cagcgccatt gctagcggag tggccgtgtc aaaggtgctg cacctggaag gcgaagtgaa 8220
caagatcaag tccgccctgc tgagcaccaa caaggccgtg gtgtccctga gcaacggcgt 8280
gtccgtgctg accagcaagg tgctggatct gaagaactac atcgacaagc agctgctgcc 8340
catcgtgaac aagcagagct gcagcatccc caacatcgag acagtgatcg agttccagca 8400
gaagaacaac cggctgctgg aaatcacccg cgagttcagc gtgaacgccg gcgtgaccac 8460
ccccgtgtcc acctacatgc tgaccaacag cgagctgctg agcctgatca acgacatgcc 8520
catcaccaac gaccagaaaa agctgatgag caacaacgtg cagatcgtgc ggcagcagag 8580
ctactccatc atgagcatca tcaaagaaga ggtgctggcc tacgtggtgc agctgcccct 8640
gtacggcgtg atcgacaccc cctgctggaa gctgcacacc agccccctgt gcaccaccaa 8700
caccaaagag ggcagcaaca tctgcctgac ccggaccgac cggggctggt actgcgataa 8760
tgccggcagc gtgtcattct ttccacaagc cgagacatgc aaggtgcaga gcaaccgggt 8820
gttctgcgac accatgaaca gcctgaccct gccctccgaa gtgaacctgt gcaacgtgga 8880
catcttcaac cctaagtacg actgcaagat catgacctcc aagaccgacg tgtccagctc 8940
cgtgatcacc tccctgggcg ccatcgtgtc ctgctacggc aagaccaagt gcaccgccag 9000
caacaagaac cggggcatca tcaagacctt cagcaacggc tgcgactacg tgtccaacaa 9060
gggggtggac accgtgtccg tgggcaacac cctgtactac gtgaacaaac aggaaggcaa 9120
gagcctgtac gtgaagggcg agcccatcat caacttctac gaccccctgg tgttccccag 9180
cgaccagttc gacgccagca tcagccaggt caacgagaag atcaaccaga gcctggcctt 9240
catcagaaag agcgacgagc tgctgagcgc catcggcgga tacatccccg aggcccccag 9300
ggacggccag gcctatgtga ggaaggacgg agagtgggtg ctgctgtcca cattcctgct 9360
ggtgcctcgc ggttcccacc accaccacca ccactaatga actagtaatc aacctctgga 9420
ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg 9480
tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt 9540
ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag 9600
gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc 9660
caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga 9720
actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa 9780
ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg ctgctcgcct atgttgccac 9840
ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct 9900
tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca 9960
gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgc 9995
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgttcgttc gttcgttcgt t 21

Claims (10)

1.一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白NQ，其特征在于，所述融合前F蛋白NQ为在呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的氨基酸序列中引入N70Q突变位点，并以GCN4基序替换跨膜区和胞内区。
2.根据权利要求1所述融合前F蛋白NQ，其特征在于，所述融合前F蛋白NQ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种包含权利要求1或2所述融合前F蛋白NQ的编码基因的表达质粒，所述表达质粒以真核表达质粒pMEW为基础载体；
所述真核表达质粒pMEW的制备方法，包括配利用MAR、EF-1a启动子、BGH poly(A)和WPRE的基因序列替换pcDNA3.1(+)的CMV启动子、多克隆位点和SV40 poly(A)序列。
4.根据权利要求3所述表达质粒，其特征在于，所述真核表达质粒PMEW的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求3或4所述表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1或2所述融合前F蛋白NQ的编码基因插入真核表达质粒pMEW的EcoRV和SpeI酶切位点之间。
6.一种表达权利要求1或2所述融合前F蛋白NQ的细胞株，所述重组细胞株以CHO细胞株为基础细胞。
7.权利要求6所述细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求3或4所述表达质粒转染CHO细胞株，筛选获得表达融合前F蛋白NQ的CHO细胞株。
8.权利要求1或2所述融合前F蛋白NQ或权利要求3或4所述表达质粒或权利要求6所述细胞株在制备抗呼吸道合胞病毒感染的制剂中的应用。
9.一种预防呼吸道合胞病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括权利要求1或2所述融合前F蛋白NQ或利用权利要求6所述细胞株生产得到的融合前F蛋白和佐剂(Al(OH)3+CpG-X1)。
10.根据权利要求9所述疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂的类型包括CpG-X1和Al(OH)3。
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Title
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