CN115960181A - 预防新型冠状病毒感染的通用三聚体重组蛋白疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了预防新型冠状病毒感染的通用三聚体重组蛋白疫苗。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的突变蛋白RBD4M及氨基酸序列是SEQ ID No.4的第26‑277位、第1‑277位和SEQ ID No.4的融合蛋白。本发明还公开了含有所述融合蛋白的疫苗,进一步开发了含有所述融合蛋白和双佐剂的三聚体重组蛋白疫苗。实验表明,本发明制备的疫苗在动物体内能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,微量蛋白即可激发小鼠非常高的免疫反应,有很好的保护效果,可同时产生针对多种流行株的新型冠状病毒的高滴度中和抗体,是一种广谱有效的新冠疫苗,对于预防新型冠状病毒感染具有重要的意义和广泛的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及预防新型冠状病毒感染的通用三聚体重组蛋白疫苗。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种单股正链的RNA病毒,基因组约为30KB,由内部的遗传物质RNA以及刺突蛋白(Spike Protein,S蛋白)、包膜蛋白(Envelop Protein,E蛋白)、膜蛋白(Membrane Protein,M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleoprotein,N蛋白)等构成。其中刺突蛋白(S蛋白)是形成病毒“冠状”形态的主要蛋白之一,介导SARS-CoV-2进入细胞,其在病毒粒子表面形成较大的皇冠状突起,高度糖基化,是病毒感染宿主细胞的武器。冠状病毒宿主特异性的重要决定因素就是位于囊膜表面的三聚体刺突糖蛋白。S蛋白可分为N端的S1亚单位和靠近病毒膜的C端S2区,跨膜区和一段小的胞内区。SARS-CoV-2的受体结合区(Receptor binding domain,RBD)位于S1的C端,约有240个氨基酸残基,可以与哺乳动物细胞上的受体ACE2(血管紧张素转换酶2,Angiotensin converting enzyme 2)结合,并介导SARS-CoV-2病毒进入细胞,病毒进入细胞后,不断增殖的SARS-CoV-2病毒颗粒通过胞吐作用进入细胞外液中,进而感染其他宿主细胞。
SARS-CoV-2是一种RNA病毒,容易在复制过程中出错,大量复制可引起多种变异,并且变异速度极快,因此经常会因为突变而出现免疫逃逸的现象,导致疫苗的保护性下降。随着新冠病毒的不断进化,现有疫苗的保护效果受到不同程度的影响。因此,研究和开发更为有效的、针对各种突变毒株的通用型疫苗对于预防新型冠状病毒感染具有重要的意义和广泛的临床应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何针对新型冠状病毒各种突变株有效地预防新型冠状病毒感染。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题,本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了解决上述技术问题,本发明首先提供了突变蛋白,所述突变蛋白可为下述任一种:
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质;
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质;
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。
所述突变蛋白命名可为RBD4M蛋白。
本文所述取代可为保守性取代(也称为保守性替换)或非核心功能区的非保守性取代。本领域技术人员所公知,保守性取代或是在非核心功能区进行非保守取代,对蛋白质的功能通常不会产生质的影响。本文所述取代不包括本发明所述4个突变位点上的氨基酸残基的取代。
本文所述标签包括但不限于:GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本文中,同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性,如NCBI主页网站的BLAST网页。例如,可在高级BLAST2.1中,通过使用blastp作为程序,将Expect值设置为10,将所有Filter设置为OFF,使用BLOSUM62作为Matrix,将Gap existence cost,Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11,1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算,然后即可获得同一性的值(%)。
本文中,所述80%以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
本发明还提供了融合蛋白,所述融合蛋白可包括所述突变蛋白(RBD4M蛋白)和标签,所述标签优选为三聚体标签,更优选,所述标签为氨基酸序列如SEQ ID No.4的第252-277位所示的三聚体标签。
其所述三聚体标签可以使任意目的蛋白与三聚体标签融合后形成三聚体。
进一步地,所述三聚体标签可以使任意目的蛋白三聚体化,该目的蛋白与三聚体标签融合后形成的三聚体可以模拟其在体内生理状态发挥功能的结构,作为免疫原时针对这种三聚体结构产生的中和抗体更加有效。
进一步地,所述三聚体标签可为能够使本文任一所述突变蛋白或融合蛋白形成三聚体的任何多肽或蛋白质。
所述形成三聚体可为形成生物分子复合物,使三个相同的分子聚合成一个单一的三聚体。
所述三聚体标签包括但不限于T4噬菌体纤维蛋白(foldon)“折叠”三聚体结构域(T4Foldon)、源自酵母转录激活因子GCN4的异亮氨酸拉链和卷曲螺旋三聚体结构域、前胶原C-前肽结构域(Trimer-Tag)、大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)的催化亚基、胶原蛋白XV的三聚体结构域、胶原蛋白XVIII的三聚体结构域、真核热休克转录因子的卷曲螺旋三聚体结构域等。
进一步地,所述三聚体标签具体可为T4噬菌体纤维蛋白(foldon)“折叠”三聚体结构域(T4Foldon)。
进一步地,所述T4Foldon的氨基酸序列可如SEQ ID No.4的第252-277位所示。
进一步地,所述三聚体标签可直接或通过接头连接在所述RBD4M蛋白的N端或C端。
进一步地,所述三聚体标签可通过接头连接在所述RBD4M蛋白的C端。
进一步地,所述接头(linker)可为柔性肽接头,如包括甘氨酸和/或丝氨酸残基的肽接头。所述接头可为GGGGS(SEQ ID No.9)、GSGSGSG(SEQ ID No.10)、GGGGSGGGGS(SEQ IDNo.11)或GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No.12)但不限于此。所述接头具体可为GSGSGSG(SEQID No.10)。
进一步地,所述融合蛋白可为下述任一种:
B1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的第26-277位的蛋白质;
B2)将SEQ ID No.4的第26-277位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质;
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质;
其中优选,B3)所述融合蛋白质可为下述任一种:
C1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的第1-277位的蛋白质或将SEQ ID No.4的第1-277位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.4的第1-277位所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质;
C2)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质或将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.4所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。
B1)-B3)所述的融合蛋白命名可为RBD4M-T4Foldon三聚体融合蛋白(简称RBD4M-T4Foldon蛋白)。
SEQ ID No.4的第26-277位所示的RBD4M-T4Foldon蛋白是在SEQ ID No.1所示的RBD4M蛋白的C端通过接头(GSGSGSG)融合三聚体标签T4Foldon(SEQ ID No.4的第252-277位)得到的三聚体融合蛋白。
B3)中所述信号肽的氨基酸序列可为SEQ ID No.4的第1-25位,所述信号肽的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1-75位。
SEQ ID No.4的第1-277位所示的融合蛋白命名可为RBD4MFoldon蛋白,其是为了便于蛋白的分泌表达,在SEQ ID No.4的第26-277位所示的RBD4M-T4Foldon蛋白的N端融合了SEQ ID No.4的第1-25位所示的信号肽得到的融合蛋白。
SEQ ID No.4所示的融合蛋白命名可为RBD4MFoldon-his蛋白,其是为了便于蛋白的纯化和检测,在SEQ ID No.4的第1-277位所示的RBD4MFoldon蛋白的C端融合了His标签(8-HisTag,HHHHHHHH,SEQ ID No.8)得到的融合蛋白。其中,SEQ ID No.4的第1-25位为信号肽的氨基酸序列(即SEQ ID No.4的第1-25位),SEQ ID No.4的第26-244位为RBD4M蛋白的氨基酸序列(即SEQ ID No.1),SEQ ID No.4的第245-251位为接头序列(即GSGSGSG,SEQID No.10),SEQ ID No.4的第252-277位为三聚体标签(T4Foldon)的氨基酸序列(即SEQ IDNo.4的第252-277位),SEQ ID No.4的第278-285位为His标签序列(8-HisTag,即SEQ IDNo.8)。
本发明还提供了生物材料,所述生物材料可为下述任一种:
D1)编码所述突变蛋白(RBD4M蛋白)的核酸分子;
D2)编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子;
D3)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的表达盒;
D4)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体;
D5)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物;
D6)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有D3)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有D4)所述重组载体的重组宿主细胞;
优选,所述核酸分子可为下述任一种:
E1)编码序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位或SEQ ID No.3的DNA分子;
E2)核苷酸序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7的DNA分子。
进一步地,D3)所述表达盒、D4)所述重组载体、D5)所述重组微生物和D6)所述重组宿主细胞均可表达D1)和/或D2)所述核酸分子。
SEQ ID No.2所示的DNA分子可为对RBD4M蛋白(SEQ ID No.1)的核苷酸进行密码子优化,得到的编码RBD4M蛋白的DNA分子,其命名可为RBD4M基因。
SEQ ID No.3的第76-831位所示的DNA分子可为对RBD4M-T4Foldon蛋白(SEQIDNo.4的第26-277位)的核苷酸序列进行密码子优化,得到的编码RBD4M-T4Foldon蛋白的DNA分子,其命名可为RBD4M-T4Foldon基因。
SEQ ID No.3的第1-831位所示的DNA分子可为编码RBD4MFoldon蛋白(SEQ IDNo.4的第1-277位)的DNA分子,其命名可为RBD4MFoldon基因。
SEQ ID No.3所示的DNA分子可为编码RBD4MFoldon-his蛋白(SEQ ID No.4)的DNA分子,其命名可为RBD4MFoldon-his基因。
SEQ ID No.7所示的DNA分子可为对三聚体融合蛋白RBD4Mfoldon(RBD4MFoldon-his)的编码序列(SEQ ID No.3)经密码子优化,并在两端增加Not I和HindIII识别位点,最终优化得到的DNA分子。其中:SEQ ID No.7的第1-6位为HindIII识别位点序列,SEQ IDNo.7的第7-15位为Kozak序列,SEQ ID No.7的第16-90位为信号肽核苷酸序列(即SEQ IDNo.3的第1-75位),SEQ ID No.7的第91-747位为RBD4M基因的核苷酸序列(即SEQ IDNo.2),SEQ ID No.7的第748-768位为接头(GSGSGSG)的核苷酸序列,SEQ ID No.7的第769-846位为三聚体标签(T4Foldon)的核苷酸序列,SEQ ID No.7的第847-870位为His标签(HHHHHHHH)的核苷酸序列,SEQ ID No.7的第871-876位为2个终止密码子序列,SEQ IDNo.7的第877-884位为Not I识别位点序列。
SEQ ID No.7的第16-870位即为SEQ ID No.3所示的DNA分子(RBD4MFoldon-his基因)。
所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性,本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体,所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体,包括但不限于:质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。在本发明的一个或多个实施方案中,所述载体为pUC57载体和/或pKS001载体。
本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中,所述细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等但不限于此,例如所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。在本发明的一个或多个实施方案中,所述微生物为TOP10感受态细胞。
本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞,而且也指这种细胞的后代,且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变,该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致,但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的,其中:所述植物细胞可为拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)等植物细胞但不限于此;所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、小鼠乳腺癌细胞(C127细胞)、人胚胎肾细胞(HEK293细胞)、人HeLa细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、T细胞或NK细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(Xenopuslaevis)细胞或大鲵(Andrias davidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如Sf21细胞或Sf-9细胞)等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中,所述宿主细胞为CHO-K1Q细胞。
本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体DNA分子,可以任何合适的方式构建,只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。
本文所述重组微生物(或重组宿主细胞)是指对目的微生物(或目的宿主细胞)的基因进行操作和修饰,从而得到功能发生变化的重组微生物(或功能发生变化的重组宿主细胞)。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物(或目的宿主细胞)后得到的重组微生物(或重组宿主细胞),或直接对目的微生物(或目的宿主细胞)的内源基因进行基因编辑后得到的重组微生物(或重组宿主细胞)。所述重组微生物(或重组宿主细胞)可理解为不仅是指特定的重组微生物(或重组宿主细胞),而且也指这种细胞的后代,且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变,该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致,但仍包括在重组微生物(或重组宿主细胞)的范围中。
D4)所述重组载体可为pUC57-RBD4Mfoldon和/或pKS001-RBD4MFoldon-his(也称为PKSRBD4mFoldonhis)。
所述重组载体pUC57-RBD4Mfoldon是将pUC57载体的HindIII、Not I识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的DNA片段,保持pUC57载体的其他核苷酸序列不变,得到的重组表达载体。重组载体pUC57-RBD4Mfoldon表达氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的三聚体融合蛋白RBD4MFoldon-his。
所述重组载体pKS001-RBD4MFoldon-his(也称为PKSRBD4mFoldonhis),载体图谱如图1所示,重组载体pKS001-RBD4MFoldon-his表达氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的RBD4MFoldon-his蛋白。
D5)所述重组微生物可为TOP10/pKS001-RBD4MFoldon-his。所述TOP10/pKS001-RBD4MFoldon-his是将所述重组载体pKS001-RBD4MFoldon-his导入TOP10感受态细胞得到的重组微生物。
D6)所述重组宿主细胞可为CHO/pKS001-RBD4MFoldon-his。所述CHO/pKS001-RBD4MFoldon-his是将所述重组载体pKS001-RBD4MFoldon-his导入CHO-K1Q得到的重组宿主细胞。
所述导入可为通过化学转化法(如Ca2+诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法)或电穿孔转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌;也可为通过噬菌体转导的方法将本发明DNA分子转导进入宿主菌。所述导入还可为通过磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、电穿孔法或病毒载体法等任何已知的转染方法将携带本发明DNA分子的载体转染宿主细胞。
本发明还提供了所述突变蛋白,和/或,本文中任一所述的融合蛋白,和/或,所述生物材料的下述任一种应用:
F1)在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的产品中的应用;
F2)在制备用于诱导SARS-CoV-2抗原免疫反应的药剂中的应用;
F3)在制备预防SARS-CoV-2感染引起的疾病的疫苗中的应用;
F4)在预防和/或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病中的应用;
F5)在用于诱导SARS-CoV-2抗原免疫反应中的应用;
F6)在预防SARS-CoV-2感染中的应用。
本文所述产品可为试剂或药物。
F1)中所述用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的产品可为SARS-CoV-2抗体,包括全长抗体或抗原结合片段(如Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体(ScFv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(MRU)等但不限于此)。
进一步地,所述SARS-CoV-2抗体可为特异性结合SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor binding domain,RBD)的中和抗体。所述中和抗体可为针对多种流行株的新型冠状病毒的高滴度中和抗体。
上述应用中,所述SARS-CoV-2感染引起的疾病可包括呼吸系统感染和/或消化系统感染,
优选,所述呼吸系统感染可包括呼吸道感染和/或肺部感染,
优选,所述消化系统感染可包括肠道疾病、纳差、恶心、呕吐、腹痛和/或腹泻,
更优选,所述呼吸道感染可包括严重急性呼吸道综合征、低氧性呼吸衰竭、脓毒症、脓毒性休克、鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎,
更优选,所述肺部感染可包括肺炎和/或肺损伤,
更优选,所述肺部感染可包括新型冠状病毒感染。
SARS-CoV-2可以与表达于消化道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合,进而累及消化道(李明松,刘占举,董卫国,田德安.关于炎症性肠病患者有效预防和治疗SARS-CoV-2感染的共识.现代消化及介入诊疗2020,25(2):146-149.)。
本发明还提供了一种疫苗,所述疫苗可包括本文中任一所述的融合蛋白,或包括所述突变蛋白,优选,所述疫苗还可包括佐剂,优选,所述疫苗还可包括双佐剂,更优选,所述双佐剂可为铝佐剂和CpG-cjx1佐剂。
所述疫苗可用于预防新型冠状病毒感染。
所述疫苗的活性成分可包括本文中任一所述的融合蛋白,或包括所述突变蛋白。
进一步地,所述疫苗可包括RBD4M-T4Foldon蛋白(SEQ ID No.4的第26-277位)、RBD4MFoldon蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)和/或RBD4MFoldon-his蛋白(SEQ IDNo.4)。
所述疫苗的活性成分可包括RBD4M-T4Foldon蛋白(SEQ ID No.4的第26-277位)、RBD4MFoldon蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)和/或RBD4MFoldon-his蛋白(SEQ IDNo.4)。
所述疫苗也可称为预防新型冠状病毒感染的通用三聚体重组蛋白疫苗(或简称三聚体重组蛋白疫苗),可用于提供抗SARS-CoV-2的免疫应答。所述疫苗可为基因工程亚单位疫苗(gene engineered subunit vaccine),所述基因工程亚单位疫苗是利用基因工程表达的蛋白抗原经纯化后,配合相应的佐剂制备而成的疫苗。
所述疫苗还可包括佐剂(adjuvant)和/或疫苗递送系统(vaccine deliverysystem)。
所述佐剂可为一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂可以是本领域技术人员公知的,包括但不限于:植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、CpG基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。在本发明的一个或多个实施方案中,所述佐剂为氢氧化铝佐剂(AL(OH)3佐剂)、CpG1018佐剂(购自广州锐博生物技术有限公司,批号0210426)、CpG-cjx1佐剂(序列为5’-TGACTGAACGTTTTAACGTCAGACTGA-3’,SEQ ID No.5)、CpG7909佐剂(序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’,SEQ ID No.6)中的至少任一种。
所述疫苗递送系统可为一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统,并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为吕盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。
本领域技术人员所熟知的是,为了增强抗原蛋白的免疫原性,除了加入具有免疫增强作用的化合物作为佐剂外,还可通过调整基因组合使之表达成颗粒性结构;或在体外加以聚团化,包入脂质体或胶囊微球中。
进一步地,所述铝佐剂可为AL(OH)3(氢氧化铝)佐剂。
所述CpG-cjx1佐剂可为吉诺卫自主研发设计的全硫代修饰的线性CpG ODN佐剂,核苷酸序列为5’-TGACTGAACGTTTTAACGTCAGACTGA-3’(SEQ ID No.5)。
所述双佐剂中,所述AL(OH)3(氢氧化铝)佐剂与CpG-cjx1佐剂的质量比可为(22-28):1,具体可为22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1或28:1,优选为25:1。
所述疫苗中,抗原蛋白(RBD4M-T4Foldon蛋白、RBD4MFoldon蛋白或RBD4MFoldon-his蛋白)的含量可为10-80μg/ml,具体可为50μg/ml。
所述疫苗中,AL(OH)3(氢氧化铝)佐剂的含量可为400-600μg/ml,具体可为500μg/ml。
所述疫苗中,CpG-cjx1佐剂的含量可为10-30μg/ml,具体可为20μg/ml。
本发明所述用于预防新型冠状病毒感染的疫苗可为肌肉内液体注射剂、静脉内液体注射剂、鼻腔内液体注射剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。
本发明还提供了药物组合物,所述药物组合物可包括本文中任一所述融合蛋白,或包括本文中任一所述突变蛋白。
进一步地,所述药物组合物的活性成分可包括本文中任一所述融合蛋白,或包括本文中任一所述突变蛋白。
进一步地,所述药物组合物具有下述至少一种用途:
M1)用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病;
M2)用于诱导SARS-CoV-2抗原免疫反应;
M3)用于预防SARS-CoV-2感染。
M4)用于在受试者中引起免疫反应。
进一步地,所述药物组合物还包括一种或者是多种药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
本发明还提供了所述突变蛋白或本文中任一所述融合蛋白的制备方法,所述方法可包括使编码所述突变蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达得到所述突变蛋白,或使编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达得到所述融合蛋白,
优选,所述方法可包括如下步骤:
H1)构建含有编码所述突变蛋白的核酸分子的重组表达载体;
H2)将所述重组表达载体导入宿主细胞,得到重组细胞;
H3)培养所述重组细胞,经分离和/或纯化得到所述突变蛋白;
优选,所述方法可包括如下步骤:
G1)构建含有编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子的重组表达载体;
G2)将所述重组表达载体导入宿主细胞,得到重组细胞;
G3)培养所述重组细胞,经分离和/或纯化得到所述融合蛋白;
更优选,H1)中所述核酸分子可为SEQ ID No.2所示的DNA分子,
更优选,G1)中所述核酸分子可为SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7所示的DNA分子。
G1)中所述融合蛋白可为RBD4M-T4Foldon蛋白、RBD4MFoldon蛋白或RBD4MFoldon-his蛋白。
进一步地,编码RBD4M-T4Foldon蛋白(SEQ ID No.4的第26-277位)的核酸分子可为SEQ ID No.3的第76-831位所示的RBD4M-T4Foldon基因;编码RBD4MFoldon蛋白(SEQ IDNo.4的第1-277位)的核酸分子可为SEQ ID No.3的第1-831位所示的RBD4MFoldon基因;编码RBD4MFoldon-his蛋白(SEQ ID No.4)的核酸分子可为SEQ ID No.3所示的RBD4MFoldon-his基因。
进一步地,所述宿主细胞可为CHO-K1Q细胞。
进一步地,所述导入可通过电转方式导入。
本发明还提供了一种产生免疫应答的方法,所述方法可包括给受试者施用所述药物组合物或所述疫苗。
上述方法中,给受试者施用所述药物组合物或所述疫苗后,可在受试者中引发针对SARS-CoV-2的免疫反应。所述免疫反应可为细胞免疫反应,或体液免疫反应,或细胞免疫反应和体液免疫反应。
所述细胞免疫反应可包括B细胞免疫反应和T细胞免疫反应。
本文所述受试者可为人类或非人类动物。
进一步地,所述非人类动物可为非人类哺乳动物。
所述非人类哺乳动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪,犬,羊,猴,兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。
本文所述受试者包括但不限于健康受试者、有症状感染受试者、无症状感染受试者或康复受试者(SARS-CoV-2感染后恢复的受试者)。
本文所述施用包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、微针注射、粘膜给药、口服、口鼻腔喷入或雾化吸入。
本发明还提供了一种制备用于预防新型冠状病毒感染的三聚体重组蛋白疫苗的方法,所述方法可包括如下步骤:
1)制备融合蛋白(如RBD4M-T4Foldon蛋白、RBD4MFoldon蛋白或RBD4MFoldon-his蛋白);
2)以步骤1)中制备的融合蛋白作为免疫原,用含有20mM组氨酸盐酸盐、140mM精氨酸盐酸盐和体积百分比为0.02%的聚山梨酯80的缓冲液(pH 6.0)稀释,室温条件下与佐剂混合,制备得到疫苗溶液。
上述方法中,所述佐剂可为铝佐剂、CpG1018佐剂(购自广州锐博生物技术有限公司,批号0210426)、CpG-cjx1佐剂(序列为5’-TGACTGAACGTTTTAACGTCAGACTGA-3’,SEQ IDNo.5)或CpG7909佐剂(序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’,SEQ IDNo.6)中的至少任一种。
具体地,所述佐剂可为双佐剂,所述双佐剂可为500μg/ml的AL(OH)3(氢氧化铝)佐剂和20μg/ml的CpG-cjx1佐剂。
本发明还提供了预防和/或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的方法,所述方法可包括给受试者施用所述药物组合物或所述疫苗。
上述方法中,所述SARS-CoV-2感染引起的疾病可包括呼吸系统感染和/或消化系统感染。
上述方法中,所述呼吸系统感染可包括呼吸道感染和/或肺部感染。
上述方法中,所述呼吸道感染可包括严重急性呼吸道综合征、低氧性呼吸衰竭、脓毒症、脓毒性休克、鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎,所述肺部感染可包括肺炎和/或肺损伤。
上述方法中,所述肺部感染可包括新型冠状病毒感染。
上述方法中,所述消化系统感染可包括肠道疾病、纳差、恶心、呕吐、腹痛和/或腹泻。
本发明还提供了预防或抑制SARS-CoV-2感染的方法,所述方法可包括给受试者施用所述药物组合物或所述疫苗。
上述方法中,给受试者施用所述药物组合物或所述疫苗后,可在受试者中引发针对SARS-CoV-2的免疫反应。所述免疫反应可为细胞免疫反应,或体液免疫反应,或细胞免疫反应和体液免疫反应。
所述细胞免疫反应可包括B细胞免疫反应和T细胞免疫反应。
本文所述受试者可为人类或非人类动物。
进一步地,所述非人类动物可为非人类哺乳动物。
所述非人类哺乳动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪,犬,羊,猴,兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。
本文所述受试者包括但不限于健康受试者、有症状感染受试者、无症状感染受试者或康复受试者(SARS-CoV-2感染后恢复的受试者)。
本文所述施用包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、微针注射、粘膜给药、口服、口鼻腔喷入或雾化吸入。
本发明疫苗的设计是基于新型冠状病毒原始病毒RBD区域的抗原表位序列,同时分析后期发现的变异病毒的RBD区域中的关键抗原表位,通过比对SARS-Cov-2不同亚型的基因序列,参考已报道的SARS-Cov RBD蛋白三聚体结构相关研究,对SARS-Cov-2 RBD基因做了进一步的改造,设计了4个重要位点突变,得到突变蛋白(RBD4M蛋白,SEQ ID No.1),在此基础上,通过引入三聚体标签T4Foldon(SEQ ID No.4的第252-277位)获得三聚体融合蛋白RBD4M-T4Foldon(SEQ ID No.4的第26-277位),同时,为了更便于蛋白的分泌表达,在RBD4M-T4Foldon蛋白(SEQ ID No.4的第26-277位)的N端融合了信号肽(SEQ ID No.4的第1-25位),得到RBD4MFoldon蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位),进一步在RBD4MFoldon蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)的C端融合8-HisTag得到RBD4MFoldon-his蛋白(SEQ ID No.4)以便纯化和检测。
虽然本发明设计构建了三聚体融合蛋白RBD4M-T4Foldon、RBD4MFoldon和RBD4MFoldon-his,但本发明不限于该特定融合蛋白序列,本领域技术人员可对三聚体融合蛋白中的三聚体标签、接头、信号肽和/或纯化标签进行替换。例如采用本领域公知的其他三聚体标签(如源自酵母转录激活因子GCN4的异亮氨酸拉链和卷曲螺旋三聚体结构域、前胶原C-前肽结构域(Trimer-Tag)、大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)的催化亚基、胶原蛋白XV的三聚体结构域、胶原蛋白XVIII的三聚体结构域或真核热休克转录因子的卷曲螺旋三聚体结构域等),只要该三聚体标签能够使本文所述突变蛋白(RBD4M蛋白)形成三聚体,并且得到的三聚体复合物与本发明所述融合蛋白功能相同,均可视为与本发明融合蛋白等同的融合蛋白,这些等同的融合蛋白均未脱离本发明的保护范围。
本发明利用CHO真核细胞表达体系,表达纯化RBD4mFoldon三聚体蛋白,经SDS-PAGE检测蛋白表达成功。纯化的RBD4mFoldon三聚体蛋白作为抗原辅以佐剂后免疫小鼠获得抗体血清,通过Elisa,Elispot,以及假病毒中和试验加以认证。结果表明本发明制备的疫苗在动物体内有很好的保护效果,其能有效的阻断病毒的结合,中和病毒感染。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)引入三聚体标签T4Foldon,形成三聚体立体蛋白。
(2)实验表明,本发明构建表达的三聚体蛋白使用非常小的剂量就能够引起小鼠特异性抗体的产生,对新型冠状病毒RBD蛋白具有特异性中和作用。为后期研发新型冠状病毒重组蛋白疫苗提供了实验基础。
(3)广谱抗原,可同时产生针对多种流行株的新型冠状病毒的高滴度中和抗体,能有效中和新冠原始毒株和各种变异毒株。
(4)通过有选择性地选择关键抗原表位作为免疫原,可以精准产生具有病毒感染中和性的抗体,避免产生其他非中和性抗体,从而避免可能潜在的ADE风险,同时避免大量非中和抗体生成所导致过度“免疫消耗”。
(5)采用佐剂包括铝佐剂和吉诺卫自主研发设计的全硫代修饰的线性CpG ODN佐剂,可同时刺激B细胞和T细胞免疫,微量蛋白即可激发小鼠非常高的免疫反应,短时间内即可达到良好的保护效果。
本发明开发的预防新型冠状病毒感染的通用三聚体重组蛋白疫苗能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,是一种广谱(通用)、有效的新冠疫苗,对于预防新型冠状病毒感染具有重要的意义和广泛的临床应用前景。
附图说明
图1为载体PKSRBD4mFoldonhis结构图。
图2为实施例1中重组质粒鉴定(菌落PCR鉴定)的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。Marker:核酸分子标准,菌液1~10均为阳性克隆。
图3为实施例1中重组载体pKS001-RBD4MFoldon-his的酶切鉴定电泳图。
图4为实施例1中RBD4MFoldon三聚体融合蛋白SDS-PAGE检测结果图。
图5为实施例2中针对新冠原始株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。
图6为实施例2中针对新冠Delta株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。
图7为实施例2中针对新冠Omicron株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。
图8为实施例2中针对新冠Omicron Ba.4/5株不同疫苗组合的ELISA效价检测结果。
图9为实施例2中不同疫苗处方的ELISpot检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的pUC57载体由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。
下述实施例中的Balb/c雌性小鼠均购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。
实施例1、RBD4MFoldon三聚体融合蛋白的制备
本发明疫苗的设计是基于新型冠状病毒原始病毒RBD区域的抗原表位序列,同时分析后期发现的变异病毒的RBD区域中的关键抗原表位。通过比对SARS-Cov-2不同亚型的基因序列,参考已报道的SARS-Cov RBD蛋白三聚体结构相关研究,对SARS-Cov-2 RBD基因做了进一步的改造,设计了4个重要位点突变。
设计得到的突变蛋白命名为RBD4M蛋白,RBD4M蛋白是在新型冠状病毒原始病毒株RBD序列的基础上经过改造获得,其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,其中SEQ ID No.1第99位的天冬氨酸(Asn,N)是由赖氨酸(Lys,K)突变而来,SEQ ID No.1第128位的丝氨酸(Ser,S)是由甘氨酸(Gly,G)突变而来,SEQ ID No.1第134位的精氨酸(Arg,R)是由亮氨酸(Leu,L)突变而来,SEQ ID No.1第166位的丙氨酸(Ala,A)是由谷氨酸(Glu,E)突变而来。
进一步对RBD4M蛋白的核苷酸进行密码子优化,得到编码RBD4M蛋白的DNA分子,命名为RBD4M基因,RBD4M基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在此基础上通过引入三聚体标签T4Foldon(其氨基酸序列如SEQ ID No.4的第252-277位所示)从而获得三聚体融合蛋白,命名为RBD4M-T4Foldon,其氨基酸序列如SEQID No.4的第26-277位所示。SEQ ID No.4的第26-277位所示的RBD4M-T4Foldon蛋白是在SEQ ID No.1所示的RBD4M蛋白的C端通过接头(GSGSGSG,SEQ ID No.10)融合三聚体标签T4Foldon(SEQ ID No.4的第252-277位)得到的三聚体融合蛋白。
进一步对RBD4M-T4Foldon三聚体融合蛋白(简称RBD4M-T4Foldon蛋白)的核苷酸序列进行密码子优化,得到编码RBD4M-T4Foldon蛋白的DNA分子,命名为RBD4M-T4Foldon基因,RBD4M-T4Foldon基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第76-831位所示。
同时,为了更便于蛋白的分泌表达,在RBD4M-T4Foldon蛋白的N端增加(融合)了信号肽,该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第1-25位所示,核苷酸序列如SEQ IDNo.3的第1-75位所示。将N端融合了信号肽的RBD4M-T4Foldon蛋白命名为RBD4MFoldon蛋白,三聚体融合蛋白RBD4MFoldon的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第1-277位所示,其编码基因命名为RBD4MFoldon基因,RBD4MFoldon基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第1-831位所示。
进一步地,为了便于蛋白的纯化和检测,在RBD4MFoldon蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)的C端融合His标签(HHHHHHHH,SEQ ID No.8),得到命名为RBD4MFoldon-his的三聚体融合蛋白(简称RBD4MFoldon-his蛋白)。RBD4MFoldon-his蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示,其编码基因命名为RBD4MFoldon-his基因,RBD4MFoldon-his基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
RBD4MFoldon三聚体融合蛋白的制备方法如下:
1、RBD4MFoldon三聚体融合蛋白表达载体构建
1.1、含有目的基因(RBD4MFoldon-his基因)载体的获得
模板合成:三聚体融合蛋白RBD4Mfoldon(RBD4MFoldon-his)的编码序列(SEQIDNo.3)经密码子优化,并在两端增加Not I和HindIII识别位点,最终优化得到核苷酸序列为SEQ ID No.7的DNA分子(884bp),其中:
SEQ ID No.7的第1-6位为HindIII识别位点序列,SEQ ID No.7的第7-15位为Kozak序列,SEQ ID No.7的第16-90位为信号肽核苷酸序列(即SEQ ID No.3的第1-75位),SEQ IDNo.7的第91-747位为RBD4M基因的核苷酸序列(即SEQ ID No.2),SEQ ID No.7的第748-768位为接头(GSGSGSG)的核苷酸序列,SEQ ID No.7的第769-846位为三聚体标签(T4Foldon)的核苷酸序列,SEQ ID No.7的第847-870位为His标签(HHHHHHHH)的核苷酸序列,SEQ ID No.7的第871-876位为2个终止密码子序列,SEQ ID No.7的第877-884位为NotI识别位点序列。SEQ ID No.7的第16-870位即为SEQ ID No.3所示的DNA分子(RBD4MFoldon-his基因)。
将SEQ ID No.7所示的DNA分子通过Not I和HindIII识别位点插入至pUC57质粒中得到重组载体pUC57-RBD4Mfoldon(由南京金斯瑞生物科技有限公司提供)。
重组载体pUC57-RBD4Mfoldon是将pUC57载体的Not I和HindIII识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.7的DNA片段,保持pUC57载体的其他核苷酸序列不变,得到的重组表达载体。重组载体pUC57-RBD4Mfoldon表达氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的三聚体融合蛋白RBD4MFoldon-his。
融合蛋白RBD4MFoldon-his中,SEQ ID No.4的第1-25位为信号肽的氨基酸序列(即SEQ ID No.4的第1-25位),SEQ ID No.4的第26-244位为RBD4M蛋白的氨基酸序列(即SEQ ID No.1),SEQ ID No.4的第245-251位为接头序列(即GSGSGSG,SEQ ID No.10),SEQID No.4的第252-277位为三聚体标签(T4Foldon)的氨基酸序列(即SEQ ID No.4的第252-277位),SEQ ID No.4的第278-285位为His标签序列(8-HisTag,即SEQ ID No.8)。
1.2、含有目的基因载体和基础载体质粒的双酶切
pKS001载体(购自中山康晟生物,货号A13201)和重组载体pUC57-RBD4Mfoldon分别使用Not I(购自NEB,货号R3189L)与Hind III限制性核酸内切酶(购自NEB,货号R3104V)双酶切,酶切体系见表1。
表1双酶切体系
按照表1配制双酶切体系,混匀后,37℃酶切1.5hr,进行核酸电泳鉴定,显示条带正确后,进行胶回收,测定DNA浓度,进行下一步试验。
双酶切pKS001载体得到pKS001载体片段(大片段),双酶切重组载体pUC57-RBD4Mfoldon得到含有RBD4MFoldon-his基因(SEQ ID No.3)的DNA片段1。
1.3、连接与转化
(1)连接
将步骤1.2得到的DNA片段1与pKS001载体片段(大片段)连接,连接体系(20ul)如表2所示:
表2连接反应体系
混合反应液置于室温(25℃)反应5~10min,得到连接产物。
(2)连接产物的转化
将连接产物加入到50~100ul冰浴上融化的TOP10感受态细胞(购自北京全式金生物,货号CD101)中,在冰上静置30min,使得感受态细胞与连接产物充分混匀。将上述产物置于42℃中热激90s,然后迅速将其转移到冰上冰浴2min。在上述产物中加入400ul灭菌的LB培养基(不含抗生素),将其混合均匀后置于37℃,220rpm摇床中培养1hr。将全部菌液吹匀后,均匀涂布于氨苄抗性的LB琼脂培养基。将平板倒置于37℃温箱,过夜培养。
(3)重组质粒的鉴定
使用PCR方法对重组质粒进行检测鉴定。引物为适用于阳性pKS001载体鉴定的特异性引物PLHS,构建的质粒为模板,PCR扩增区域大小约为900bp。PCR鉴定结果显示片段大小约为900bp,与理论值相符,真核表达质粒构建完成。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图2所示。
(4)选择扩增出目的条带的菌株送去测序。
(5)将测序无误的菌株在含有氨苄抗性的LB培养基中大量培养,使用去内毒素质粒提取试剂盒大量提取表达质粒,并通过酶切鉴定,结果如图3所示。
测序无误的质粒(重组载体)命名为pKS001-RBD4MFoldon-his或PKSRBD4mFoldonhis(如图1所示)。
将含有上述重组载体pKS001-RBD4MFoldon-his(PKSRBD4mFoldonhis)的重组菌命名为TOP10/pKS001-RBD4MFoldon-his。所述TOP10/pKS001-RBD4MFoldon-his是将所述重组载体pKS001-RBD4MFoldon-his导入TOP10感受态细胞得到的重组微生物。
2、RBD4MFoldon三聚体融合蛋白的表达
(1)细胞系的维持与传代:CHO-K1Q细胞P3代细胞(购自中山康天晟合生物技术有限公司,货号A14101)复苏后置于含30mL CD04培养基(中山康晟生物有限公司,货号A11004)的125mL规格平底锥形瓶内,在37℃,5% CO2孵箱中125rpm摇动培养3~4天。而后每日吸取少量细胞加入台盼蓝染液,镜下计数并判断细胞活力。当细胞活力>95%、细胞密度达到2×106~4×106cells/ml时进行传代扩增,细胞稀释至0.5×106cells/ml于相同条件进行培养3~4天。
(2)细胞转染:
1)将活力良好,处于对数生长期的CHO-K1Q细胞以浓度2×106cells/ml传代至含100ml CD04培养基(中山康晟生物有限公司,货号A11004)的500ml锥形瓶内,在37℃5%CO2孵箱中125rpm摇动培养过夜。次日收集细胞,去除细胞培养液。用PBS轻柔冲洗细胞一次,离心,去上清。用电转试剂调整细胞密度至1×107cells/ml,轻轻吹打细胞,使其形成单细胞悬液。混合质粒(pKS001-RBD4MFoldon-his)与电转试剂,于室温静置5min,将混合好的液体加入200ul细胞中,并立即轻柔混匀,吸取放入电转杯中,避免产生气泡。
2)选择合适的电穿孔方案,并按下触摸屏上的Start(开始)键。电脉冲释放后,触摸屏上会显示完成,提示电穿孔完成。
3)将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热不含加压试剂CHOCD04无血清培养基(购自QuaCell,货号A11004)的T75培养瓶中。细胞继续放置于37℃5%CO2孵箱,静置培养16-48h。
(3)换液:收集培养了16-48h转染细胞,离心,去上清,加入含有25uM MSX(L-Methionine Sulfoximine,购自Sigma,货号M5379-1G)的无血清加压培养基30ml,将细胞转入125ml摇瓶,37℃5% CO2摇动培养。观察细胞生长状态,每5~7天更换一次加压培养基,直至细胞开始扩增生长。
(4)细胞传代:定时观察细胞生长情况,待细胞生长密度大于2×106/ml时,即可进行细胞的传代或保株。一般3~5天即可传代一次,按照1:4进行细胞稀释,直至补充CD04培养基(中山康晟生物有限公司,货号A11004)至1L。
(5)添加补料:建议根据FEED说明书推荐策略添加补料(购自QuaCell,货号A11952和A11902A)。每天取样计数,以确定补料策略。细胞活率小于60%时收获细胞。获得的细胞为重组细胞,命名为CHO/pKS001-RBD4MFoldon-his。
重组细胞CHO/pKS001-RBD4MFoldon-his是将所述重组载体pKS001-RBD4MFoldon-hi s导入CHO-K1Q细胞中得到的重组细胞。重组细胞CHO/pKS001-RBD4MFoldon-his含有SEQID No.3所示的DNA分子,表达氨基酸序列是SEQ ID No.4的RBD4MFoldon-his蛋白。
3、RBD4MFoldon三聚体融合蛋白的纯化及检测
重组抗原C端含有8×His标签,采用Ni离子亲和纯化的方式进行抗原的纯化。
培养重组细胞CHO/pKS001-RBD4MFoldon-his,离心收集上清,用0.45μm滤膜过滤,经镍柱亲和纯化后,对洗脱蛋白进行SDS-PAGE检测分析。将洗脱后的蛋白浓缩后,进行SDS-PAGE检测(图4),其中M为Marker,“还”为RBD4MFoldon三聚体融合蛋白(还原),“非”为RBD4MFoldon三聚体融合蛋白(非还原)。
实施例2、疫苗组合物的筛选及免疫原性研究
本发明预防新型冠状病毒感染的通用三聚体重组蛋白疫苗是利用RBD4MFoldon三聚体融合蛋白(SEQ ID No.4的第1-277位)作为疫苗抗原,本实施例选用实施例1中制备的带有组氨酸标签的RBD4MFoldon三聚体融合蛋白(即实施例1中表达纯化的RBD4MFoldon-his蛋白)制备三聚体重组蛋白疫苗。
具体地,本实施例以实施例1制备的RBD4MFoldon-his蛋白作为免疫原,用含有20mM组氨酸盐酸盐、140mM精氨酸盐酸盐和体积百分比为0.02%的聚山梨酯80的缓冲液(pH6.0)稀释至蛋白终浓度为50ug/ml,室温条件下分别与氢氧化铝佐剂混悬液(铝含量500ug/ml)、CpG1018佐剂(购自广州锐博生物技术有限公司,批号0210426)、吉诺卫自主研发设计的全硫代修饰的线性CpG ODN佐剂——CpG-cjx1佐剂(序列为5’-TGACTGAACGTTTTAACGTCAGACTGA-3’,SEQ ID No.5)或CpG7909佐剂(序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’,SEQ ID No.6)(上述两种佐剂通过生工生物Sangon Biotech合成)混合均匀,分别制备成含铝佐剂疫苗溶液、含CpG佐剂疫苗溶液以及含铝佐剂和CpG佐剂的双佐剂疫苗溶液,然后放置于2~8℃。
将2~8℃上述疫苗溶液,无菌条件下分装入2ml西林瓶内(或预填充玻璃注射器内),每瓶0.5ml(或1.0ml),密封后放置于2~8℃避光保存。
取出上述疫苗溶液(即疫苗组合物),以Balb/c小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)为动物模型进行免疫原性研究。
具体方法为:选择6-8周龄雌性Balb/c小鼠随机分3组,每组5只小鼠,肌肉注射上述疫苗组合物,并设置疫苗组、蛋白组和佐剂组,第0、3周免疫(每次免疫剂量为0.1ml),第3、5周采血,第5周取脾脏。采用ELISA法检测血清中的抗新冠原始株RBD、Delta RBD、Omicron RBD和Omicron4/5RBD蛋白的抗体滴度(即total IgG),以及假病毒中和试验测定针对新冠原始株、Delta株、Omicron株、Omicron4/5株的中和效价;采用ELISPOT法检测脾细胞中的细胞免疫水平,主要IFN-γ的表达。结果显示通过本发明提供的技术方案所获得的RBD4M蛋白所制备得到的疫苗组合物免疫原性非常好,可作为潜在的重组新冠疫苗抗原,具体操作如下:
一、ELISA方法
1、试剂配制
1.1、ELISA包被液(1×)配制:取ELISA包被液(10×)用无菌蒸馏水稀释至1×。
1.2、PBS配制:取出PBS powder(索莱宝公司产品,货号G0002),每袋用2L无菌蒸馏水溶解。
1.3、洗液:PBST(含0.05%Tween-20的PBS)
量取1L过滤后的PBS到蓝盖瓶中,加入500μLTween-20,充分混匀,存于2~8℃备用。根据实际情况,按此方法配制所需体积的PBST(现用现配,当天使用)。
1.4、封闭液和样品稀释液(含5%脱脂奶粉的PBS)
称取PBS体积的5%的脱脂奶粉(奶粉质量/g=PBS体积/mL×5%),将从2~8℃取出的PBS平衡至室温,量取所需体积的PBS溶液至已加入奶粉的离心管中,然后充分溶解,备用。封闭液和样品稀释液现用现配,当天使用。
1.5、稀释羊抗鼠二抗
将规格为1mL的二抗(命名Anti-Mouse IgG,HRP-Linked Antibody,公司CST,货号7076S)平衡至室温,然后进行分装,放置在-20℃±5℃保存。每次使用之前取出,按1:4000进行稀释,此处稀释液为PBS。稀释后的二抗,当天使用。
1.6、终止液(购自索莱宝)
2、ELISA检测血清结合抗体滴度:
2.1、包被:取原始株RBD-his、Delta RBD-his、Omicron RBD-his、Omicron Ba.4/5RBD-his蛋白抗原原液(以上蛋白均购自义翘神州,货号分别为:40592-V08H、40592-V08H90、40592-V08H121和40592-V08H130)用ELISA包被液(1×)稀释到1000ng/mL,包被酶标版,100μl/孔,4℃放置过夜。
2.2、封闭:将包被板从2~8℃取出后,洗板3次,每次洗液体积为300μl/孔,洗完后若孔内残留洗液,则要在吸水纸上拍干;然后在已包被孔中加入预先配制的封闭液,300μl/孔,盖封板膜,37℃,封闭60-90min。
2.3、血清稀释:在离心管内用样品稀释液将待检血清稀释至合适浓度。
2.4、加样:将封闭后的包被板洗板3次,每次洗液体积为300μl/孔,洗完后若孔内残留洗液,则要在吸水纸上拍干。将已稀释好的各个浓度的待检样品(即待检血清)依次加入至样品孔中,100μl/孔;加入100μl样品稀释液作为空白对照(Blk),设置5个复孔,盖上封板膜,37℃孵育60min。
2.5、加二抗:弃去样品,洗板3次,每次洗液体积为300μl/孔,洗完后若孔内残留洗液,则要在吸水纸上拍干;加入稀释后的二抗,100μl/孔,盖封板膜,37℃孵育60min。
2.6、显色:将96孔板洗板3次,每次洗液体积为300μl/孔,洗完后若孔内残留洗液,则要在吸水纸上拍干,加单组分TMB显色液1(提前从2~8℃取出,平衡至室温),100μl/孔,25℃避光显色,15min。
2.7、终止:显色后立即加入终止液终止反应,50μl/孔,轻晃混匀。
2.8、检测:将酶标板放入酶标仪,在450nm波长下测吸光度值。
2.9、判定:大于阴性小鼠OD值的2.1倍判为阳性。
以下检测结合抗体效价的ELISA方法都同上。
二、小鼠脾脏ELISPOT检测方法:
根据Murine IFN-γSingle-Color Enzymatic ELISPOT Assay(购自CTL(Cellular Technology Ltd.),货号mIFNgp-2M/2)试剂盒说明书对二免14d小鼠的脾淋巴细胞检测。具体步骤如下:
1、脾脏组织加入5ml小鼠淋巴细胞分离液,轻轻研磨,200目尼龙网过滤至洁净离心管中,在液面以上轻轻加入1ml PBS,以800g,30min,升速快降速慢离心,收集中间淋巴细胞层。
2、加入5ml PBS洗涤细胞,500g,离心5min,弃上清。
3、CTL-Test Medium(补充L-谷氨酰胺终浓度3mM)培养基重悬细胞,细胞计数(流式细胞仪计数)后调整细胞浓度为5×106/ml。
4、准备2倍终浓度的CTL-Test Medium:在1-9组,样本管分别加入原始株RBD-his、Delta RBD-his、Omicron RBD-his、Omicron Ba.4/5RBD-his混合物(2倍终浓度10ug/ml),100ul/孔。铺到对应的ELISPOT板中,另外预留阴性对照孔(不加任何刺激物)和阳性对照孔(加入Cell Stimulation Cocktail细胞激活剂(PMA和Ionomycin)500X,购自eBioscience,货号00-4970-93。最终使用量根据配置体积将其稀释成1X)。37℃,5% CO2孵育20min。
5、加入细胞100ul/孔,相当于5×105/孔,37℃,5% CO2培养48h。
6、用200ul/孔PBS清洗板2次,再用200ul/孔0.05%Tween-PBS清洗板3次。
7、加入anti-murine IFN-γ检测液80ul/孔,室温孵育2h。
8、用200ul/孔0.05%Tween-PBS清洗板3次。
9、加入Tertiary solution 80ul/孔,室温孵育30min。
10、用200ul/孔0.05%Tween-PBS清洗板2次,再用200ul/孔纯水清洗板2次。
11、加入Blue Developer Solution 80ul/孔,室温孵育15min。
12、倒掉液体,用纯水冲洗孔板3次终止反应。
13、ELISPOT板读值。
三、中和实验
假病毒试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,详细信息见表3。
表3、假病毒试剂盒详细信息
假病毒名称 | 试剂盒名称 | 货号 |
原始株假病毒 | SARS-CoV-2-Fluc WT | DD1746-01/02/03 |
Delta株假病毒 | SARS-CoV-2-Fluc B.1.617.2 | DD1754-01/02/03 |
Omicron株假病毒 | SARS-CoV-2-Fluc B.1.1.529 | DD1768-01/02/03 |
Omicron BA.4/BA.5假病毒 | SARS-CoV-2-Fluc BA.4/BA.5 | DD1776-01/02/03 |
1、筛选最佳的疫苗处方
取6-8周龄Balb/c雌性小鼠45只,随机分为9组,按表4设计的免疫方案免疫动物,第0,21d共免疫两次,通过检测1-9组二免14d ELISA效价以及通过ELISPOT检测1-9组二免14d脾淋巴细胞IFN-γ因子的表达,筛选到最佳疫苗处方。
表4、重组RBD4MFoldon疫苗不同处方免疫小鼠的免疫方案
表4中,RBD4MFoldon为实施例1中制备的RBD4MFoldon-his蛋白,i.m表示肌肉注射。
结果见图5-图8,从图5-8的ELISA结果可以看出,RBD4MFoldon 5μg+50ug AL(OH)3+2μgCpG-cjx1这种疫苗组合(第7组)针对原始株、Delta株、Omicron株、OmicronBa.4/5株结合抗体效价最佳,优于单抗原组和单佐剂组。其中加铝佐剂组(7/8/9组)优于不加铝佐剂组(4/5/6),从而得出铝佐剂主要在增强体液免疫方面发挥作用;从图9的ELISpot结果可以看出,RBD4MFoldon 5μg+50ug AL(OH)3+2μgCpG-cjx1这种疫苗表达IFN-γ因子细胞数最多,优于单抗原组和单佐剂组,其中筛选了3种CpG,结果CpG-cjx1优于CpG1018和CpG7909。CpG1018和CpG7909两种CpG佐剂之间无显著性差异。其中加CpG佐剂组(7/8/9)优于不加CpG佐剂组(2),从而证实CpG佐剂主要在增强细胞免疫方面发挥作用。
2、双佐剂重组通用新冠疫苗假病毒中和抗体检测
取6-8周龄Balb/c雌性小鼠15只,随机分为3组,每组5只。按表5设计的免疫方案免疫动物,第0,21d共免疫两次,用假病毒中和试验方法分别检测小鼠二免14d血清针对原始株、Delta株、Omicron株、Omicron Ba.4/5的中和抗体效价。
表5、双佐剂重组通用新冠疫苗小鼠免疫方案
组别 | 免疫原 | 佐剂 | 免疫体积 | 免疫方式 | 免疫次数 | 动物数量 |
10 | PBS | - | 50ul | i.m | 2 | 5 |
11 | - | <![CDATA[AL(OH)<sub>3</sub>+CpG-cjx1]]> | 50ul | i.m | 2 | 5 |
12 | RBD4MFoldon | <![CDATA[AL(OH)<sub>3</sub>+CpG-cjx1]]> | 50ul | i.m | 2 | 5 |
表5中,RBD4MFoldon为实施例1中制备的RBD4MFoldon-his蛋白,i.m表示肌肉注射。表5中免疫原和佐剂的量同表4中的组别7。
假病毒中和试验结果如表6所示。
表6、针对不同新冠毒株假病毒中和抗体效价
结果显示,采用AL(OH)3+CpG-cjx1双佐剂的三聚体重组蛋白疫苗诱导的抗体可以有效中和不同SARS-CoV-2病毒株,增强体液免疫,是一种广谱(通用)、有效的预防新型冠状病毒感染的疫苗。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.突变蛋白,其特征在于,所述突变蛋白为下述任一种:
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质;
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质;
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白包括权利要求1所述的突变蛋白和标签,所述标签优选为三聚体标签,更优选,所述标签为氨基酸序列SEQ ID No.4的第252-277位所示的三聚体标签。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白为下述任一种:
B1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的第26-277位的蛋白质;
B2)将SEQ ID No.4的第26-277位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质;
B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质;
其中优选,B3)所述融合蛋白质为下述任一种:
C1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的第1-277位的蛋白质或将SEQ ID No.4的第1-277位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.4的第1-277位所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质;
C2)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质或将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.4所示的蛋白质具有80%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。
4.生物材料,其特征在于,所述生物材料为下述任一种:
D1)编码权利要求1所述突变蛋白的核酸分子;
D2)编码权利要求2或3中任一所述融合蛋白的核酸分子;
D3)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的表达盒;
D4)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体;
D5)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物;
D6)含有D1)和/或D2)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有D3)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有D4)所述重组载体的重组宿主细胞;
优选,所述核酸分子为下述任一种:
E1)编码序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位或SEQ ID No.3的DNA分子;
E2)核苷酸序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7的DNA分子。
5.权利要求1所述的突变蛋白,和/或,权利要求2或3中任一所述的融合蛋白,和/或,权利要求4所述生物材料的下述任一种应用:
F1)在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的产品中的应用;
F2)在制备用于诱导SARS-CoV-2抗原免疫反应的药剂中的应用;
F3)在制备预防SARS-CoV-2感染引起的疾病的疫苗中的应用;
F4)在预防和/或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病中的应用;
F5)在用于诱导SARS-CoV-2抗原免疫反应中的应用;
F6)在预防SARS-CoV-2感染中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述SARS-CoV-2感染引起的疾病包括呼吸系统感染和/或消化系统感染,
优选,所述呼吸系统感染包括呼吸道感染和/或肺部感染,
优选,所述消化系统感染包括肠道疾病、纳差、恶心、呕吐、腹痛和/或腹泻,
更优选,所述呼吸道感染包括严重急性呼吸道综合征、低氧性呼吸衰竭、脓毒症、脓毒性休克、鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎,
更优选,所述肺部感染包括肺炎和/或肺损伤,
更优选,所述肺炎包括新型冠状病毒肺炎。
7.一种疫苗,其特征在于,所述疫苗包括权利要求2或3中任一所述的融合蛋白,或包括权利要求1所述的突变蛋白,优选,所述疫苗还包括佐剂,优选,所述疫苗还包括双佐剂,更优选,所述双佐剂为铝佐剂和CpG-cjx1佐剂。
8.药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括权利要求2或3中任一所述的融合蛋白,或包括权利要求1所述的突变蛋白。
9.权利要求1所述的突变蛋白或权利要求2或3中任一所述融合蛋白的制备方法,其特征在于,所述方法包括使编码权利要求1所述突变蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达得到所述突变蛋白,或使编码权利要求2或3中任一所述融合蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达得到所述融合蛋白,
优选,所述方法包括如下步骤:
H1)构建含有编码权利要求1所述突变蛋白的核酸分子的重组表达载体;
H2)将所述重组表达载体导入宿主细胞,得到重组细胞;
H3)培养所述重组细胞,经分离和/或纯化得到所述突变蛋白;
优选,所述方法包括如下步骤:
G1)构建含有编码权利要求2或3中任一所述融合蛋白的核酸分子的重组表达载体;
G2)将所述重组表达载体导入宿主细胞,得到重组细胞;
G3)培养所述重组细胞,经分离和/或纯化得到所述融合蛋白;
更优选,H1)中所述核酸分子为SEQ ID No.2所示的DNA分子,
更优选,G1)中所述核酸分子为SEQ ID No.3的第76-831位、SEQ ID No.3的第1-831位、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7所示的DNA分子。
10.一种产生免疫应答的方法,其特征在于,所述方法包括给受试者施用权利要求8所述的药物组合物或权利要求7所述的疫苗。
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