KR20220144829A - 코로나바이러스 질환, 2019 (covid-19)의 검출, 예방 및 치료용 기획된 펩티드 및 단백질 - Google Patents

코로나바이러스 질환, 2019 (covid-19)의 검출, 예방 및 치료용 기획된 펩티드 및 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR20220144829A
KR20220144829A KR1020227031724A KR20227031724A KR20220144829A KR 20220144829 A KR20220144829 A KR 20220144829A KR 1020227031724 A KR1020227031724 A KR 1020227031724A KR 20227031724 A KR20227031724 A KR 20227031724A KR 20220144829 A KR20220144829 A KR 20220144829A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
rbd
peptide
cov
sars
Prior art date
Application number
KR1020227031724A
Other languages
English (en)
Inventor
창 이 왕
펑 린
솽 딩
원-준 펑
Original Assignee
유나이티드 바이오메디칼 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유나이티드 바이오메디칼 인크. filed Critical 유나이티드 바이오메디칼 인크.
Publication of KR20220144829A publication Critical patent/KR20220144829A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/17—Metallocarboxypeptidases (3.4.17)
    • C12Y304/17023—Angiotensin-converting enzyme 2 (3.4.17.23)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)

Abstract

요약서
본 명세서는 COVID-19의 효과적인 검출, 예방 및 치료를 위한 구제 체계에 관한 것이며, 여기에는 (1) 바이러스 감염 검출 및 역학적 감시를 위한 혈청학적 진단 분석, (2) SARS-CoV-2에 의한 감염 예방을 위한 고도-정밀, 부위-지향적 펩티드 면역원 구조체, (3) 감염된 환자의 질병 치료를 위한 수용체-기반 항바이러스 치료요법, 그리고 (4) S1-RBD-sFc를 함유하는 기획 단백질 백신이 내포된다. 상기 기술된 구제 체계는 COVID-19의 검출, 예방 및 치료를 위한 진단법, 백신, 그리고 항바이러스 치료요법으로써, 최적 SARS-CoV-2 항원성 펩티드, 펩티드 면역원 구조체들, CHO-유래된 단백질 면역원 구조체들, 오래-작용하는 CHO-유래된 ACE2 단백질들, 그리고 이의 제형들을 기획 및 제작을 위해, SARS-CoV-2 단백질들 뿐만 아니라 인간 수용체의 아미노산 서열들을 이용한다.

Description

코로나바이러스 질환, 2019 (COVID-19)의 검출, 예방 및 치료용 기획된 펩티드 및 단백질
본 출원은 2020년 2월 19일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호 62/978,596, 2020년 3월 16일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호 62/990,382, 2020년 5월 19일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호 63/027,290, 2020년 11월 25일자로 제출된 U.S. 가특허 출원 일련 번호 63/118,596에 대해 우선권을 주장하며, 이들 출원은 모두 이들 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
발명의 분야
본 명세서는 바이러스 SARS-CoV-2에 기인된 COVID-19의 검출, 예방 및 치료를 위한 코로나바이러스 질환, 2019 (COVID-19) 구제 체계에 관계한다. 상기 기술된 구제 체계는 COVID-19의 검출, 예방 및 치료를 위한 진단법, 백신, 그리고 항바이러스 치료요법으로써, 최적의 SARS-CoV-2 항원성 펩티드, 펩티드 면역원 구조체들, CHO-유래된 단백질 면역원 구조체들, 오래-작용하는 CHO-유래된 ACE2 단백질들, 그리고 이의 제형들을 제작하기 위한 용도로 바이러스 및 숙주-수용체 아미노산 서열을 이용한다.
발명의 배경
2019년 12월, 인수공통전염병 코로나바이러스는 종의 구별없이, 최근 수십 년 동안 세 번째로 인류를 감염시켰다. SARS-CoV-2 바이러스로 인한 이 질환은 2019년 말에 질환이 처음 발견되었기 때문에, World Health Organization(WHO)에서 공식적으로 2019년 코로나바이러스 질환을 "COVID-19"로 명명했다. SARS-CoV-2 바이러스는 중국, Wuhan에서 처음 확인되었으며, 다른 살아있는 동물을 판매하는 해제품 도매 시장에 노출된 사람들에게 감염되었다. SARS-CoV-2 바이러스는 사람에서 사람으로 전염되며, 두 가지 다른 병원성 사람 호흡기 코로나바이러스 (가령, 중증 급성 호흡기 증후군 관련 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 중동 호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV))에 의한 발병과 유사한 중증 호흡기 질환을 일으킨다.
코로나바이러스 (계통 코로나비리데, 목(order) 니도비랄레스)는 전형적인 왕관-모양의 외피를 가진 크고, 외피가 있는 양성-가닥 RNA 바이러스다(웹사이트: en.wikipedia.org/wiki/Coronavirus). 그들의 바이러스 게놈(26~32kb)은 모든 RNA 바이러스 중에서 가장 큰 것으로 알려져 있다. 코로나바이러스는 스파이크 (S) 단백질, 외피 (E) 단백질, 막 (M) 단백질, 그리고 뉴클레오켑시드 (N) 단백질의 항원성 상관관계에 우선 근거하여, 네 가지 하위그룹(알파코로나바이러스, 베타로나바이러스, 감마코로나바이러스, 그리고 델타코로나바이러스)으로 분류된다. 베타코로나바이러스 하위그룹에는 HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV, 그리고 SARS-CoV-2가 내포된다. 유전자 재조합은 증가된 유전적 다양성을 위한 기회를 제공하는 동일한 하위 그룹과 상이한 하위 그룹의 구성원 간에 용이하게 일어난다.
Zhu, N., et al., 2020은 SARS-CoV-2를 확인하였고, 특징화시키고, 임상 표본 (기관지 폐포-세척액) 및 인간 기도 상피 세포 바이러스 분리주로부터 바이러스 게놈의 염기서열을 분석했다. 이들 서열은 기존 공개된 박쥐 SARS-유사 CoV 게놈(bat-SL-CoVZC45, MG772933.1)과 86.9% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 추가 문헌 (Chen, Y., et al., 2020 및 Perlman, S., 2020)에서는 SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2를 비롯한 신종 코로나바이러스의 게놈 구조, 복제 및 발병기전에 대해 추가 특징화되었다. SARS-CoV-2 구조의 개략도는 도 1에 도시되어 있다. 바이러스 표면 단백질들 (S 단백질, E 단백질, M단백질, 그리고 N 단백질)은 숙주 세포에 의해 만들어진 지질 이중층 외피에 매립되며, 단일 가닥으로 된 양성-센스 바이러스 RNA는 뉴클레오켑시드 단백질과 연합된다. 기타 베타코로나바이러스와 달리, SARS-CoV-2는 헤마토글루티닌 에스테라제 당단백질을 보유하지 않는다.
SARS-CoV-2는 SARS-CoV 및 MERS-CoV 성장에 사용되는 동일한 세포에서 전파될 수 있다. 그러나, SARS-CoV-2는 주요 인간 기도 상피세포에서 더 잘 성장하며, 반면 SARS-CoV 및 MERS-CoV는 상부 기도 세포보다는 폐내 상피세포에 감염된다. 또한, SARS-CoV 및 MERS-CoV의 전파는 주로 질병의 알려진 징후와 증상을 보이는 환자에 발생하며, 한편 SARS-CoV-2는 무증상 환자들 또는 경증 또는 비-특이적 징후가 있는 환자들로부터 전염될 수 있다. 이러한 차이는 SARS-CoV 및 MERS-CoV에 비해 SARS-CoV-2의 더 빠르고 광범위한-전파에 기여할 수 있다.
SARS-CoV-2는 세포 진입을 위해 세포 수용체 hACE2(인간 안지오텐신 전환 효소 2)를 사용하는 것으로 보고되었는데, 이것은 SARS-CoV에서 사용하는 것과 동일한 수용체이며, MERS-CoV에서 사용하는 CD26 수용체와 상이하다 (Zhou, P., et al, 2020 및 Lei, C., 2020). 따라서, SARS-CoV-2의 전파는 하부-기도 질환의 징후가 발생한 후에만 예상되는 것으로 암시되었다.
SARS-CoV는 2002-2004년 유행하는 동안, 돌연변이되어, 세포 수용체에 더 잘 결합하고, 인간 세포에서 복제에 최적화됨으로써, 이의 독성이 강화되었다. 코로나바이러스는 오류-유발성 RNA-의존적 RNA 중합효소를 갖고 있어, 돌연변이와 재조합 사례가 빈번하게 일어나기 때문에, 개작(adaptation)이 용이하다. 반면, MERS는 2012년 발견된 이후, 인간에서 감염력을 유의미적으로 강화시키는 돌연변이가 발견되지 않았다. SARS-CoV-2는 SARS-CoV와 더 유사하게 행동할 것이고, hACE2에 대한 결합이 강화되어, 인간 숙주에 더 적응할 것이다.
SARS-CoV 및 MERS-CoV 유행성 전염병 이후, 코로나바이러스 프로테아제, 중합효소, MTase 및 진입 단백질을 표적으로 하는 새로운 항바이러스제의 개발에 많은 노력을 기울였다. 그러나, 그들 중 어느 것도 임상 시험에서 효과적인 것으로 밝혀진 것은 없었다 (Chan, JFW, et al., 2013; Cheng, KW, et al., 2015; Wang, Y., et al., 2015). 회복기 환자들에게서 채취한 혈장과 항체는 응급상황에서 벗어난, 중증 임상증상을 보이는 환자를 치료하는 데 사용되었다 (Mair-Jenkins, J., et al., 2015). 또한, SARS-CoV 및 MERS-CoV를 표적으로 하는 각종 백신, 이를 테면, 불활성화된 바이러스, 약독화된 생-바이러스, 바이러스 벡터-기반 백신, 소단위 백신, 재조합 단백질 및 DNA 백신 다양한 백신 전략이 개발되었지만, 지금까지 동물에게서만 평가되었다 (Graham, RL, et al., 2013; de Wit, E., et al., 2016).
COVID-19의 비극적인 발생에 대해 효과적인 치료법이나 백신이 없기 때문에, 바이러스의 전파를 줄이고 막대한 경제적 손실을 초래하는 불필요한 사회적 공황을 피하기 위한 현재 취할 수 있는 최선의 조치는 (1) RT-PCR 분석에 의한 조기 발견, (2) 건강 관리 환경에서 보편적 예방 조치를 엄격하게 준수하면서, 확진된 양성 개체와 접촉한 사람들의 사례 보고 및 격리, (3) 지원 처리, 그리고 (4) 유행성 전염병 정보를 적시에 게시를 통하여 감염 원천을 통제하는 것이다. 개인들은 개인 위생을 철저히 하고, 얼굴에 맞는 마스크를 사용하고, 그리고 붐비는 장소를 피함으로써, SARS-CoV-2의 전파 감소를 또한 도울 수 있다.
발병을 통제하고, 사망을 비롯한, 발병으로 인한 고통을 줄이기 위해, (a) SARS-CoV-2의 효과적이고, 신속한 검출 및 감시를 위한 혈청학적 분석법, (b) 감염되지 않은 개체들이 SARS-CoV-2에 감염되는 것을 방지하기 위한 백신, 그리고 (c) SARS-CoV-2에 감염된 개체들을 효과적으로 치료하기 위한 항바이러스 요법이 절실하다.
참고자료:
본 출원에서 인용된 하기 문서 및 여기에 인용된 추가 참고 문헌은 마치 본 명세서에 온전히 개시된 것처럼 그 전문이 참고 자료에 편입된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
발명의 요약
본 명세서는 COVID-19의 효과적인 검출, 예방 및 치료를 위한 구제 체계에 관한 것이며, 여기에는 (1) 바이러스 감염 검출 및 역학적 감시를 위한 혈청학적 진단 분석, (2) SARS-CoV-2에 의한 감염 예방을 위한 고도-정밀, 부위-지향적 펩티드 면역원 구조체, (3) 감염된 환자의 질병 치료를 위한 수용체-기반 항바이러스 치료요법, 그리고 (4) S1-RBD-sFc를 함유하는 기획 단백질 백신이 내포된다. 상기 기술된 구제 체계는 COVID-19의 검출, 예방 및 치료를 위한 진단법, 백신, 그리고 항바이러스 치료요법으로써, 최적 SARS-CoV-2 항원성 펩티드, 펩티드 면역원 구조체들, CHO-유래된 단백질 면역원 구조체들, 오래-작용하는 CHO-유래된 ACE2 단백질들, 그리고 이의 제형들을 기획 및 제작을 위해, SARS-CoV-2 단백질들 뿐만 아니라 인간 수용체의 아미노산 서열들을 이용한다.
더 구체적으로, 본 발명은 (1) 감염된 개체 및/또는 백신접종된 개체에서 바이러스 감염을 검출하고. 역학적 감시, 또는 혈청 중화 항체들을 모니터링 하기 위해 M 단백질 (가령, 서열 식별 번호: 4 및 5), N 단백질 (가령, 서열 식별 번호: 17 및 18, 259, 261, 263, 265, 266, 그리고 270), 그리고 S 단백질 (가령, 서열 식별 번호: 23, 24, 26-34, 37, 38, 281, 308, 321, 322, 323, 324)로부터 유래된 변형된 SARS-CoV-2 항원성 펩티드를 이용하는 혈청학적 진단 분석; (2) B 에피토프 면역원 구조체들로부터 유래된 높은 정확성 S-RBD (SARS-CoV-2의 S 단백질로부터 수용체 결합 도메인, 또한 S1-RBD로도 지칭됨) (서열 식별 번호: 107-144, 20, 226, 227, 239, 240, 241, 246, 247), SARS-CoV-2 유래된 CTL 에피토프 펩티드 (서열 식별 번호: 145-160), 병원체 단백질로부터 유래된 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프 (가령, 서열 식별 번호: 49-100), SARS-CoV-2로부터 유래된 Th 에피토프 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 161-165), (3) COVID-19 치료용 항바이러스 치료요법으로써, CHO-발현된 S1-RBD-단일 쇄 Fc (s-Fc) 융합 단백질들 (서열 식별 번호: 235 및 236) 및 CHO-발현된 ACE2-ECD-단일 쇄 Fc 융합 단백질들 (ACE2의 세포-외 도메인) (서열 식별 번호: 237 및 238) 단백질들; 그리고 (4) S1-RBD-sFc를 함유하는 기획 단백질 백신 (가령, 서열 식별 번호: 235 및 236)을 개발하고; SARS-CoV-2 항원성 펩티드, 펩티드 면역원 구성체, 오래 작용하는 ACE2 수용체 단백질 및 이의 제형들의 기획 및 제조를 위한 SARS-CoV-2 바이러스 및 수용체 아미노산 서열을 포함한 생물정보학 활용하기 위한 체계적인 접근방법에 관계한다.
도면의 간단한 설명
도 1. SARS-CoV-2의 구조를 나타내는 구성도. 바이러스 표면 단백질들 (스파이크, 외피, 그리고 막)은 숙주 세포로부터 유래된 지질 이중층 외피에 매립된다. 기타 베타코로나바이러스와 달리, SARS-CoV-2는 헤마토글루티닌 에스테라제 당단백질을 보유하지 않는다. 단일 가닥으로 된 양성-센스 바이러스 RNA는 뉴클레오켑시드 단백질과 연합된다.
도 2. ACE2의 개작된 3D 구조 및 SARS-CoV 결합 복합체의 구조를 기반으로, 차례로 속박된(constrained) 루프 A, 루프 B, 그리고 루프 C를 포함하는 SARS-CoV-2 S-RBD (즉, 스파이크 단백질로부터 수용체 결합 도메인) 유래된 B 세포 에피토프 펩티드 면역원 구조체들의 대표적인 기획 (Protein Data Bank(PDB) 항목을 통해 획득한 이미지: 2AJF).
도 3. SARS-CoV-2, SARS-CoV, 그리고 MERS-CoV의 M 단백질 서열들의 정렬. 별표(*)는 위치에 있어서 동일한 아미노산을 나타내고, 콜론(:)은 보존된 치환을 나타내고, 마침표(.)는 절반-보존된 치환을 나타내고, 밑줄(_)은 항원성 펩티드를 나타낸다.
도 4. SARS-CoV-2, SARS-CoV, 그리고 MERS-CoV의 N 단백질 서열들의 정렬. 별표(*)는 위치에 있어서 동일한 아미노산을 나타내고, 콜론(:)은 보존된 치환을 나타내고, 마침표(.)는 절반-보존된 치환을 나타내고, 밑줄(_)은 항원성 펩티드를 나타내고, 파선(--)은 CTL 에피토프를 나타내고, 그리고 점선(…)은 Th 에피토프를 나타낸다.
도 5A-5C. SARS-CoV-2, SARS-CoV, 그리고 MERS-CoV의 S 단백질 서열들의 정렬. 별표(*)는 위치에 있어서 동일한 아미노산을 나타내고, 콜론(:)은 보존된 치환을 나타내고, 마침표(.)는 절반-보존된 치환을 나타내고, 밑줄(_)은 항원성 펩티드를 나타내고, 파선(--)은 CTL 에피토프를 나타내고, 그리고 점선(…)은 Th 에피토프를 나타내고, 그리고 상자(□)는 B 세포 에피토프를 나타낸다.
도 6A-6D. 본 명세서의 다양한 구체예들에 따른 단일 쇄 융합 단백질의 기획을 예시한다. 도 6A는 N-말단에서 인간 IgG의 힌지 영역과 Fc 단편 (CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 공유적으로 연계시키는 S-RBD를 포함하는 융합 단백질의 구조를 예시한다. 도 6B는 N-말단에서 링커를 통하여 인간 IgG의 힌지 영역과 Fc 단편 (CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 공유적으로 연계시키는, SARS-CoV-2의 S-RBD를 포함하는 융합 단백질의 구조를 예시한다. 도 6C는 N-말단에서 인간 IgG의 힌지 영역과 Fc 단편 (CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 공유적으로 연계시키는, ACE2-ECD (즉, ACE2의 세포-외 도메인)를 포함하는 융합 단백질의 구조를 예시한다. 도 6D는 N-말단에서 링커를 통하여 인간 IgG의 힌지 영역과 Fc 단편 (CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 공유적으로 연계시키는, ACE2-ECD를 포함하는 융합 단백질의 구조를 예시한다.
도 7. pZD/S-RBD-sFc 플라스미드의 맵을 도시한다. 상기 pZD/S-RBD-sFc 플라스미드는 본 발명의 구체예에 따른 S-RBD-sFc 융합 단백질을 인코드한다.
도 8. pZD/hACE2-sFc 플라스미드의 맵을 도시한다. 상기 pZD/hACE2-sFc 플라스미드는 본 발명의 구체예에 따른 ACE2-sFc 융합 단백질을 인코드한다.
도 9. 비-환원 조건 및 환원 조건에서, 기획된 S1-RBD-sFC 대표적인 정제 단백질의 생화학적 특성을 Coomassie 블루 착색을 사용한 SDS-PAGE에 의해 나타낸다.
도 10. 비-환원 조건 및 환원 조건에서, 기획된 S1-RBD-His 대표적인 정제 단백질의 생화학적 특성을 Coomassie 블루 착색을 사용한 SDS-PAGE에 의해 나타낸다.
도 11. 비-환원 조건 및 환원 조건에서, 기획된 ACE2-ECD-sFC 대표적인 정제 단백질의 생화학적 특성을 Coomassie 블루 착색을 사용한 SDS-PAGE에 의해 나타낸다.
도 12. 비-환원 조건 및 환원 조건에서, 기획된 S1-RBD-His 대표적인 정제 단백질의 생화학적 특성을 LC 질량 분광 분석에 의해 나타낸다.
도 13. 서열 식별 번호: 235의 서열을 갖는 대표적인 정제된 기획 S1-RBD-sFc 단백질의 N-당화 패턴 및 O-당화 패턴을 나타낸다.
도 14. 비-환원 조건 및 환원 조건에서, 기획된 S1-RBD-sFc 대표적인 정제 단백질의 생화학적 특성을 LC 질량 분광 분석에 의해 나타낸다.
도 15. 서열 식별 번호: 237의 서열을 갖는 대표적인 정제된 기획 ACE2-ECD-sFc 단백질의 N-당화 패턴 및 O-당화 패턴을 나타낸다.
도 16. 비-환원 조건 및 환원 조건에서, 기획된 ACE2-ECD-sFc 대표적인 정제 단백질의 생화학적 특성을 MALDI-TOF 질량 분광 분석에 의해 나타낸다.
도 17. SARS-CoV-2 N (뉴클레오켑시드) 단백질로부터 항원성 펩티드를 기획 및 확인하는 것을 나타낸다. 전장의 N 단백질의 개략도는 상단에 표시되고, 본원에 개시된 기획 펩티드 항원은 하기에 표시된다.
도 18. SARS-CoV-2 S (스파이크) 단백질의 항원성 펩티드를 기획 및 확인하는 것을 나타낸다. 전장의 S 단백질의 개략도는 상단에 표시되고, 본원에 개시된 기획 펩티드 항원은 하기에 표시된다.
도 19. SARS-CoV-2 M (막) 단백질의 항원성 펩티드를 기획 및 확인하는 것을 나타낸다. 전장의 M 단백질의 개략도는 상단에 표시되고, 본원에 개시된 기획 펩티드 항원은 하기에 표시된다.
도 20. SARS-CoV-2 E (외피) 단백질의 항원성 펩티드를 기획 및 확인하는 것을 나타낸다. 전장의 E 단백질의 개략도는 상단에 표시되고, 본원에 개시된 기획 펩티드 항원은 하기에 표시된다.
도 21. SARS-CoV-2 ORF9b 단백질의 항원성 펩티드를 기획 및 확인하는 것을 나타낸다. 전장의 ORF9b 단백질의 개략도는 상단에 표시되고, 본원에 개시된 기획 펩티드 항원은 하기에 표시된다.
도 22. SARS-CoV-2 N (뉴클레오켑시드) 단백질의 각종 영역에서 확인된 항원성 펩티드와 대표적인 COVID-19 환자들로부터 수득한 혈청 항체들의 반응성을 도시한다.
도 23. SARS-CoV-2 S (스파이크) 단백질의 항원성 영역들을 대표적인 COVID-19 환자들의 혈청 항체에 의한 맵핑을 도시한다.
도 24. SARS-CoV-2 S (스파이크) 단백질 상의 네 개 항원성 펩티드 위치를 3D 구조로 도시한다.
도 25. SARS-CoV-2 E (외피) 단백질의 항원성 영역들을 대표적인 COVID-19 환자들의 혈청 항체에 의해 도시한다.
도 26. SARS-CoV-2 M (막) 단백질의 항원성 영역들을 대표적인 COVID-19 환자들의 혈청 항체에 의해 도시한다.
도 27. SARS-CoV-2 ORF9b 단백질의 항원성 영역들을 대표적인 COVID-19 환자들의 혈청 항체에 의해 도시한다.
도 28. 대표적인 PCR 양성 COVID-19 환자들의 혈청과 SARS-CoV-2 ELISA의 분석학적 민감도를 도시한다.
도 29. N 단백질 (서열 식별 번호: 18, 261, 그리고 266), M 단백질 (서열 식별 번호: 5), 그리고 S 단백질 (서열 식별 번호: 38, 281, 그리고 322)로부터 유래된 개별 항원성 펩티드로 피복된 플레이트의 ELISA에 의해 검출된 COVID-19 환자 혈청의 혈청-반응성 패턴을 도시한다.
도 30. N 단백질 (서열 식별 번호: 18, 261, 그리고 266), M 단백질 (서열 식별 번호: 5), 그리고 S 단백질 (서열 식별 번호: 38, 281, 그리고 322)로부터 유래된 개별 항원성 펩티드로 피복된 플레이트의 확인용 ELISA에 의해 SARS-CoV-2 ELISA 양성, 무증상 개체의 혈청-반응성 패턴을 도시한다.
도 31. 플레이트 실행에 의한 평균 비-반응 대조군 (NRC) 값의 분포를 보여준다.
도 32. 입원-후 10일 이내, 입원-후 10일 이상, 퇴원 당일, 병원 퇴원-후 14일 시점에 채취한 샘플로부터 COVID-19 환자에 대한 OD450nm 판독값 분포를 보여준다.
도 33. COVID-19 환자들에서 상이한 시간대별로 취한 샘플과 SARS-CoV-2 감염과 무관한 개체들에서 수거한 샘플의 S/C 비율의 분포는 나타낸다.
도 34. ACE2-ECD-sFc에 HRP 콘쥬게이트된 S1-RBD 단백질의 결합을 ELISA에 의해 나타낸다.
도 35. S1-RBD 면역화에 의해 생성된 면역 혈청을 이용하여 ACE2-ECD-sFc에 S1-RBD의 결합 저해를 ELISA에 의해 도시한다.
도 36. S1 단백질 피복된 플레이트를 이용하여 기획 단백질들의 형태를 변화시키면서, 이와 연합된 면역원성을 ELISA를 통하여 평가한 것을 도시한다.
도 37A-37B. ELISA를 통하여 S1-RBD 융합 단백질들의 면역원성 및 중화 평가를 도시한다. 도 37A는 S1 단백질 피복된 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 면역 혈청의 역가(3 및 5 WPI)에 의한 면역원성 평가를 제공한다. 도 37B는 5 WPI에서 기니아 피그 면역 혈청의 ELISA에서 ACE2에 대한 S1 단백질 결합에 있어서 중화 및 억제성 희석 ID50(기하학적 평균 역가; GMT)를 제공한다.
도 38. S1 단백질 피복된 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 면역 혈청의 역가(3 및 5 WPI)에 의한 면역원성 평가를 도시한다.
도 39. 두 가지 별개 방법, 방법 A 및 방법 B를 사용하여 S1-RBD 및 ACE2 결합 억제 분석에 의한 중화 항체 역가의 평가를 도시한다.
도 40. 방법 A를 사용하여, 상이한 혈청 희석액에서 다양한 형태의 기획 S1-RBD 단백질 면역원에 의해 생성된 면역 혈청(5 WPI)에 의한 S1-RBD 및 ACE2 결합 억제의 평가를 도시한다.
도 41. 상이한 혈청 희석액에서 기획 S1-RBD 단백질 면역원의 형태를 변화시키는 방법(B)에 의해 생성된 면역 혈청에 의한 S1-RBD 및 ACE2 결합 억제의 평가를 도시한다.
도 42. 세포-기반 차단 분석을 통하여 기획 S1-RBD 단백질 면역원의 형태를 변화시킴으로써 생성된 면역 혈청에 의한 S1-RBD 및 ACE2 결합 억제의 평가를 도시한다.
도 43. 상이한 혈청 희석에서 세포-기반 차단 분석을 통하여 기획 S1-RBD 단백질 면역원의 형태를 변화시킴으로써 생성된 면역 혈청에 의한 S1-RBD 및 ACE2 결합 억제의 평가를 도시한다.
도 44. 상이한 혈청에서 세포-기반 차단 분석을 통하여 기획 S1-RBD 단백질 면역원의 형태를 변화시킴으로써 생성된 면역 혈청(0, 3 및 5 WPI)에 의한 S1-RBD 및 ACE2 결합 억제의 평가를 도시한다.
도 45. SARS-CoV-2에 대항하는 대표적인 기획 백신에 대한 I 상 임상 실험안을 도시한다.
도 46. 건강한 성인 지원자들로부터 백신 선별 기준을 설명한다.
도 47. 건강한 성인 지원자들에서 SARS-CoV-2에 대항하는 기획 백신의 안전성, 내성, 그리고 면역원성을 평가하기 위한, I 상, 오픈-라벨 연구의 임상기획안을 도시한다.
도 48. 건강한 성인 지원자들에서 SARS-CoV-2에 대항하는 기획 백신의 안전성, 내성, 그리고 면역원성을 평가하기 위한, I 상, 오픈-라벨 연구와 연합된 임상 활동을 도시한다.
도 49. 4개 코호트로, 두 단계에서 건강한 성인 지원자들에서 SARS-CoV-2에 대항하는 기획 백신의 안전성, 내성, 그리고 면역원성을 평가하기 위한, I 상, 오픈-라벨 연구의 임상기획안을 도시한다.
도 50. ACE2-sFc는 SARS-CoV-2 S1 단백질에 높은 결합 친화력으로 결합함을 도시한다.
도 51. ACE2-sFc는 ELISA 플레이트에 피복된 ACE2에 S1 단백질 결합을 차단시킬 수 있음을 설명한다.
도 52A-52C. S1-RBD-sFc의 아미노산 서열, 구조, 그리고 기능을 도시한다. 도 52A는 S1-RBD-sFc의 서열을 제공하며, N-연계된 당화 부위 (*), O-연계된 당화 부위 (+), Asn-에서-His로의 돌연변이 (밑줄친 잔기), 그리고 이황화결합 (연결된 선)을 확인한다. 도 52B는 S1-RBD-sFc 융합 단백질에서 이황화 결합을 요약한다. 도 53C는 광학 밀도를 통하여 hACE2에 S1-RBD-sFc의 결합 능력을 보여주는 그래프다.
도 53. 기니아 피그 혈청(sear) 및 회복기 혈청에서 비교용S1-RBD:ACE2 결합 억제를 설명한다. 정상적인 건강한 사람 (NHP, n=10)과 1:20 희석에서 테스트된 바이러스 진단된 COVID-19 환자들 (n=10)에서 SARS-CoV-2 억제율이 평가되었다. 3 WPI 및 5 WPI에서 수거된 S1-RBD-sFc 백신접종된 GP로부터 풀링된 면역 혈청을 차례로, 1:1000 및 1:8000 희석에서 테스트하였다.
도 54. 면역 혈청에 의한 생(live) SARS-CoV-2의 중화 효능을 도시한다. 0 및 3 WPI에서 S1-RBD-sFc, S1-RBDa-sFc, 그리고 MONTANIDE™ ISA 50V2와 함께 S1-RBD-Fc로 백신접종맞은 기니아 피그로부터 5 WPI에서 수거된 면역 혈청을 분석하였다. 바이러스-혈청 혼합물로 감염된 Vero-E6 세포의 단층을 면역형광법 (IFA)으로 평가했다. 세포를 인간 항-SARS-CoV-2 N 단백질 항체로 착색시키고, 항-인간 IgG-488(밝은 음영)으로 검출했다. 핵은 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)으로 대조착색되었다 (짙은 음영).
도 55. 블라인드 혈청 샘플에서의 중화 테스트를 설명한다. 바이러스 복제에 대한 판독값으로 형광 신호를 사용하여 네온 녹색 단백질 (ic-SARS-CoV-2-mNG)을 발현시키는 재조합 SARS-CoV-2로 중화를 평가했다. 분석의 검출 한계는 1:20이고, 음성 샘플에는 1:10 역가가 할당되었다. 양성 대조군으로써, 회복기 COVID-19 인간 환자가 내포된다. 이 분석에서 Academia Sinica에서 얻은 중화 역가와 강력한 상관관계(R=0.94)가 있었다.
도 56. 본원에 기술된 멀티토프(multitope) 단백질/펩티드 백신의 구성요소들을 설명하는 개략도이다. 상기 백신 조성물은 B 세포 에피토프를 위한 S1-RBD-sFc 융합 단백질, SARS-CoV-2 S, M, 그리고 N 단백질들로부터 유래된 클라스 I 및 II MHC 분자들을 위한 5개의 합성 Th/CTL 펩티드, 그리고 UBITh®1a 펩티드를 함유한다. 이들 구성 요소는 쌍극자 상호작용에 의해 양으로(기획된) 하전 펩티드에 결합하고, 어쥬번트로도 작용하는 CpG1과 혼합되고, 그 다음 ADJU-PHOS® 어쥬번트에 결합되어, 멀티토프 백신 의약품으로 구성된다.
도 57A-57C. 렛에서 체액성 면역원성 테스트를 도시한다. 도 57A는 ISA51/CpG3 (좌측 패널) 또는 ADJU-PHOS®/CpG1 (우측 패널)로 어쥬번트된 백신 조성물의 면역원성을 보여준다. Sprague Dawley 렛에게 0주차 시점과 2주차 시점에 백신 조성물로 면역화주사하였다 (합성 기획 펩티드와 어쥬번트로 제형화된, S1-RBD-sFc을 10-300μg/투여분량 범위로). 0, 2, 3, 그리고 4 WPI에서 면역 혈청은 ELISA에서 S1-RBD 단백질에 직접적인 결합에 대해 분석되었다. 도 57B (좌측 패널) 4 WPI에서 취한 샘플의 ISA51/CpG3 또는 ADJU-PHOS®/CpG1로 어쥬번트화된 백신 조성물로 면역접종받은 렛의 항체에 의한 hACE 결합 억제를 보여준다. 도 57B (우측 패널) ISA51/CpG3 또는 ADJU-PHOS®/CpG1로 어쥬번트화된 백신 조성물에 있어서 렛 면역 혈청에 의한 생 SARS-CoV-2의 중화 효능(VNT50으로 나타냄)을 보여준다. 도 57C는 회복기 COVID-19 환자(왼쪽 패널) 및 살아있는 SARS-CoV-2의 강력한 중화(오른쪽 패널)(VNT50으로 나타냄)와 비교하여, 다양한 투여분량의 백신 조성물로 면역접종된 렛의 혈청 RBD:ACE2 억제 역가를 보여준다.
도 58A-58C. 렛에서 세포 면역원성 테스트를 설명한다 (백신 조성물로 면역접종받은 렛에서 IFN-γ, IL-2 및 IL-4 분비 세포의 ELISpot 검출). 도 58A는 0 및 2 WPI에서 1μg~100μg 범위의 백신 조성물로 면역접종받은 렛의 Th/CTL 펩티드 풀로 자극된 세포에서 IFN-γ 및 IL-4-분비 ELISpot 분석을 보여준다. 도 58B는 0 및 2 WPI에서 1μg~100μg 범위의 백신 조성물로 면역접종받은 렛의 Th/CTL 펩티드 풀로 자극된 세포에서 IL-2 및 IL-4-분비 ELISpot 분석을 보여준다. 도 58C는 표시된 개별 펩티드로 자극된 세포로부터의 IL-2 및 IL-4 반응을 보여준다. 백만개 세포당 사이토킨-방출 세포(SC)는 음성 대조군 웰로부터 차감시킴으로써 산출된다. 막대는 평균 SD를 나타낸다(n = 3). IFN-γ 또는 IL-2의 분비는 30 및 100μg 그룹에서 IL-4보다 유의미하게 높은 것으로 관찰되었지만 (최소 제곱 평균 및 쌍을 이루는 현명한 비교 사용 *** p < 0.005) 그러나, 이들은 1 또는 3μg 용량 그룹에서 통계적으로 상이하지 않았다. 레인 1, 2, 3 및 4는 각각 백신 조성물의 1, 3, 30 및 100㎍/용량으로 면역접종을 받은 동물을 나타낸다.
도 59A-59C. 개시된 백신 조성물의 상이한 투여분량을 제공받은 후, hACE-형질도입된 마우스에서 생 SARS-CoV-2 공격 테스트의 결과를 예시한다. 도 59A는 면역화 및 공격 일정을 나타내는 개략도이다. 도 59B는 생 바이러스로 공격받은 마우스의 RT-PCR(왼쪽 패널) 및 TCID50(오른쪽 패널)에 의한 SARS-CoV-2 역가를 보여준다. 도 59C는 생 바이러스로 공격받은 마우스로부터 단리된 폐의 착색된 부분을 보여준다.
도 60A-60C. 개시된 백신 조성물의 상이한 투여분량을 제공받은 후, 히말라야 원숭이 (RM)에서 면역원성 결과를 예시한다. 도 60A는 S1-RBD에 대한 RM 면역 혈청의 직접 결합을 ELISA으로 보여준다. ELISA-기반 혈청 항체 역가(평균 Log10 SD)는 컷오프 값보다 높은 OD450 값을 갖는 가장 높은 희석 배수로 정의되었다 (* p
Figure pct00004
0.05, ** p
Figure pct00005
0.01). 도 60B는 RM 면역 혈청에 의한 생 SARS-CoV-2의 중화 효능을 도시한다. 0주차 시점과 4주차 시점에 백신을 접종받은 RM으로부터 42일차에 수집한 면역 혈청을 SARS-CoV-2 감염된 Vero-E6 세포에서 세포변성 효과(CPE)에 대해 분석했다. 도 60C는 35일차에 수집되고, Th/CTL 펩티드 풀로 자극받았던 RM 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 IFN-γ ELISpot 분석을 보여준다 (** p
Figure pct00006
0.01).
발명의 상세한 설명
본 명세서는 COVID-19의 효과적인 검출, 예방 및 치료를 위한 구제 체계에 관한 것이며, 여기에는 (1) 바이러스 감염 검출 및 역학적 감시를 위한 혈청학적 진단 분석, (2) SARS-CoV-2에 의한 감염 예방을 위한 고도-정밀, 부위-지향적 펩티드 면역원 구조체, (3) 감염된 환자의 질병 치료를 위한 수용체-기반 항바이러스 치료요법, 그리고 (4) S1-RBD-sFc 단백질을 함유하는 기획 단백질 백신이 내포된다. 상기 기술된 구제 체계는 COVID-19의 검출, 예방 및 치료를 위한 진단법, 백신, 그리고 항바이러스 치료요법으로써, 최적 SARS-CoV-2 항원성 펩티드, 펩티드 면역원 구조체들, CHO-유래된 단백질 면역원 구조체들, 오래-작용하는 CHO-유래된 ACE2 단백질들, 그리고 이의 제형들을 기획 및 제작을 위해, SARS-CoV-2 단백질들 뿐만 아니라 인간 수용체의 아미노산 서열들을 이용한다.
상기 기술된 구제 체계의 각 측면은 하기에서 더 상세하게 논의된다.
일반적 내용
본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 오로지 구획을 구분하려는 목적을 위함이며, 서술된 주제를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 출원에서 언급된 모든 자료 또는 자료의 일부분은 완전한 명세서는 모든 목적으로 참고자료에 편입된다.
다른 설명이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적 숙련자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 정관사 및 부정관사 용어("a", "an" 및 "the")에는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 지시 대상이 내포된다. 유사하게, "또는"이라는 단어는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, "및"이 내포되도록 의도된다. 따라서, "A 또는 B를 포함하는"이라는 문구는 A, 또는 B, 또는 A와 B를 포함하는 것을 의미한다. 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 아미노산 크기, 그리고 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며, 설명을 위해 제공됨을 추가로 이해해야 한다. 본 명세서에서 설명된 것과 유사한 또는 대등한 임의의 방법들 및 재료들이 개시된 방법의 실행 또는 테스트에 이용될 수 있지만, 적절한 방법들 및 재료들이 하기에서 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 그 전문이 참고문헌으로 포함된다. 충돌이 있는 경우, 용어 설명을 비롯한 본 명세서의 내용이 우선한다. 추가적으로, 본원에서 개시된 재료, 방법, 그리고 실례는 단지 예시이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 이용된 용어 "SARS-CoV-2"는 2019 신종 코로나바이러스 계통을 지칭하며, 중국, Wuhan에서 처음 확인되었으며, 다른 살아있는 동물을 판매하는 해제품 도매 시장에 노출된 사람들에게 감염되었다. SARS-CoV-2는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)로도 또한 알려져 잇고, 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-ID)의 병인이다.
본원에서 이용된 용어 "COVID-19"는 SARS-CoV-2 바이러스 균주에 기인된 인간 감염성 질환을 지칭한다. COVID-19는 초기 SARS-CoV-2 급성 호흡기 질환으로 알려졌다. 이 질환은 초기에 증상이 거의 없거나, 또는 없을 수 있으며, 또는 열, 기침, 숨가쁨, 근육통 및 피로로 발전할 수 있다. 합병증에는 폐렴 및 급성 호흡 곤란 증후군이 내포될 수 있다.
A. 바이러스 감염을 검출 및 역학적 감시를 위한 혈청학적 진단 분석
1. 이론적근거
상기 기술된 구제 체계의 첫번째 측면은 바이러스 감염을 검출 및 역학적 감시를 위한 혈청학적 진단 분석에 관계한다.
감염된 환자의 혈청 샘플에서 두 차례 또는 이상의 시점에서 항체를 검출하는 것은 감염 시 혈청전환 상태 입증에 중요하다. 위험에 처한 집단의 혈청학적 데이터 수집 및 분석은 의료 전문가가 SARS-CoV-2에 의한 COVID-19 발병에 대한 대응을 안내하는 감시 피라미드를 구성하는 데 도움이 될 것이다. 현재, SARS-CoV-2가 인간에서-인간으로 전염가능성 규모에 속하는지에 대해 아는 것은 없다. Wuhan에서 SARS-CoV-2 발병이 공식 발표된 후 한 달 이내, 이 바이러스는 겉보기에는 병원성이 낮아 보이고, 따라서 개인 수준에서 건강 위협이 더 낮다고 하지만, SARS-CoV 및 MERS-CoV에 비해 훨씬 더 전염성이 높은 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이 발병은 슈퍼-전파자 사례를 통해 대규모 확산을 초래했으며, 집단 수준에서 전례 없는 높은 위험을 초래했고, 전 세계 공중 보건 시스템의 혼란과 경제적 손실을 초래했다.
SARS-CoV-2의 전염 사슬을 끊기 위해 감염된 개인을 추적 및 진단하고, 위험에 처한 개인을 모니터링하는 것을 목표로 하는 적극적인 대응은 SARS-CoV-2에 대한 항체를 검출하는 신속 정확하며, 수행-용이한 혈청 검사가 필요하다. 바람직하게는, 이러한 혈청학적 검사는 자동화된 혈액 스크리닝 작업을 사용하여 처리될 수 있다. SARS-CoV-2에 대한 항체 검출을 위한 신속 정확하며, 수행-용이한 혈청 검사는 SARS-CoV-2의 식별, 통제 및 제거에 상당한 가치가 있을 것이다.
본 명세서의 한 측면은 SARS-CoV-2에 의한 감염을 검출 및 진단하기 위한 면역흡착제로서 면역분석 검정 및/또는 진단 키트에 사용하기 위한 하나 또는 그 이상의 SARS-CoV-2 항원성 펩티드, 또는 그의 단편(들)에 관한 것이다. 항원성 펩티드, 또는 이의 단편(들)을 하나 또는 그 이상 함유하는 면역분석 및/또는 진단 키트는 감염으로 인해 유도된 항체들 또는 백신접종에 의해 유도된 항체들을 식별 및 검출에 유용하다. 이러한 테스트는 임상에서 SARS-CoV-2 감염의 존재를 스크리닝하고, 역학적 감시를 위해, 백신의 효능을 검사하는 데 사용할 수 있다.
2. 감염된 개체들에서 SARS-CoV-2의 M 단백질, N 단백질, 그리고 S 단백질에 대한 항체 검출을 위한 항원성 펩티드
상기 기술된 혈청학적 진단 분석은 SARS-CoV-2의 전장의 막 (M) 단백질, 뉴클레오켑시드 (N) 단백질, 그리고 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 단편들을 이용한다. 일부 구체예들에서, 상기 진단 분석은 SARS-CoV-2의 M 단백질, N 단백질, 그리고 S 단백질의 아미노산 서열들로부터 유래된 항원성 펩티드를 이용한다. 이러한 항원성 펩티드는 항체 인지를 위한 에피토프를 형성하는 M 단백질, N 단백질, 그리고 S 단백질에 아미노산 서열들중 일부에 상응한다. 바람직하게는, 상기 항원성 펩티드는 COVID-19 환자들이 항체를 만드는 SARS-CoV-2의 B 세포 에피토프다. 이러한 에피토프는 SARS-CoV-2에 감염된 것으로 알려진 COVID-19 환자들의 샘플을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 상기 항원성 펩티드를 이용한 당분야에 공지된 임의의 면역분석 (가령, ELISA, 면역점, 면역블랏, 등등)을 이용하여 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 안에 SARS-CoV-2 항체들이 존재하는 지를 검출할 수 있다.
상기 항원성 펩티드의 길이는 M 단백질 (서열 식별 번호: 1), N 단백질 (서열 식별 번호: 6), 또는 S 단백질 (서열 식별 번호: 20)의 약 15개 아미노산 잔기에서부터 전장의 아미노산 서열까지 다양할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항원성 펩티드는 약 20개 ~ 약 70개 아미노산 잔기다.
SARS-CoV의 해당 단백질 서열과 생물정보학 및 서열 정렬을 사용하는 SARS-CoV-2의 M 단백질, N 단백질, 그리고 S 단백질의 항원성 펩티드. 그들은 처음에 기획되고, 합성되고, 그리고 COVID-19 환자들의 혈청의 대규모 패널에 의해 이들 환자 혈청에 결합되는 능력에 대해 광범위하게 테스트되었다. SARS-CoV-2 양성 혈청 패널에 대해 가장 중요하고 일관된 항원성과 결합 친화력을 갖는 것으로 간주되는 이 접근법을 사용하여, SARS-CoV-2의 몇 가지 항원성 펩티드가 확인되었다:
M 단백질: 아미노산 잔기 1-23 (서열 식별 번호: 4);
N 단백질: 아미노산 잔기 355-419 (서열 식별 번호: 17, 259, 261, 263, 265, 266, 270); 그리고
S 단백질: 아미노산 잔기 785-839 (서열 식별 번호: 37, 281, 308, 321, 322, 323, 324).
이들 3가지 항원성 펩티드는 차례로, 서열 식별 번호:5, 18, 그리고 38의 최적화된 항원성 펩티드를 생성하기 위해, 이들의 N-말단 단부에서 3개의 리신 잔기(KKK)를 추가함으로써, 용해도 및 플레이트 코팅 효율을 증가시키기 위해 추가로 최적화되었다. N-말단 리신 꼬리를 함유하는 최적화된 항원성 펩티드 (서열 식별 번호: 5, 18, 그리고 38)를 혈청학적 진단 분석 개별적으로 이용할 수 있거나, 또는 이들은 SARS-CoV-2에 대한 항체를 검출하기 위한 최적 항체 포획 단계를 만들기 위해 혼합물로 복합될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 혈청학적 진단 분석 및/또는 진단 키트는 SARS-CoV-2에 대한 항체 검출용 항체 포획 단계로 서열 식별 번호: 5, 18, 259, 261, 263, 265, 266, 270, 38, 281, 308, 321, 322, 323, 그리고 324로부터 선택된 최적화된 항원성 펩티드의 혼합물을 이용한다. 특정 구체예들에서, 최적화된 항원성 펩티드에 대한 항체 결합은 ELISA를 이용하여 검출된다.
3. 백신접종된 개체에서 항체 검출용 항원성 펩티다
환자들이 SARS-CoV-2에 감염되었는지 여부를 감지하고 진단하는 것 외에도, 본원에 공개된 SARS-CoV-2 백신으로 면역접종받은 환자에서의 효능을 평가하는 것도 중요하다. 백신 조성물에 사용되는 항원성 펩티드를 사용하는 혈청학적 분석은 백신을 사용한 면역화 효능 결정에 사용될 수 있다.
B 세포 클러스터 항원성 펩티드는 백신접종된 개체들에서 생성된 항체 검출에 사용할 수 있는 SARS-CoV-2의 S 단백질로부터 수용체 결합 도메인(RBD)(서열 번
Figure pct00007
: 226) 또는 중화 부위 주변에서 확인되었고, 기획되었다. 상기 S1 단백질의 RBD로부터 대표적인 B 세포 클러스터 항원성 펩티드 번호는 표 3, 11, 그리고 13에 제시된다 (가령, 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 226, 227, 그리고 319). 이들 B 세포 에피토프 펩티드중 일부는 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 생성된 순환/루프 구조를 함유하며, 이로 인하여 형태학적 보존을 위한 국소적 억압이 허용된다.
일부 구체예들에서, 감염된 개체들과 본원에서 기술된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 제공받은 백신접종된 개체들에서 만들어진 SARS-CoV-2 항체들을 검출하기 위한 혈청학적 분석에서 이들 항체 포획 단계로써 서열 식별 번호: 26, 38, 226, 227, 281, 315-319, 그리고 322의 B 세포 에피토프 펩티드들이 이용된다. 특정 구체예들에서, 상기 B 세포 에피토프 펩티드에 대한 항체 결합은 ELISA를 이용하여 검출된다.
4. SARS-CoV-2에 대한 항체 검출용 두 가지 혈청학적 테스트
본 명세서는 SARS-CoV-2에 대한 항체 검출용 두 가지 혈청학적 테스트에 관계한다. 한 구체예에서, 상기 혈청학적 테스트는 SARS-CoV-2에 감염된 개체들을 식별해내기 위해, 서열 식별 번호: 5, 18 및 38, 259, 261, 263, 265, 266, 270, 281, 308, 321, 322, 323, 그리고 324로부터 선택된 펩티드로 피복된 고형상을 이용한다. 첫번째 테스트와는 상이할 수 있는 두 번째 테스트에서, 고형상은 중화 항체들의 역가를 사정하기 위해, 서열 식별 번호: 26, 226, 227 또는 319의 펩티드로 피복시킨다. SARS-CoV-2 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 5, 18, 그리고 38, 259, 261, 263, 265, 270, 38, 281, 308, 321, 322, 323, 그리고 324), 그리고 (서열 식별 번호: 26, 226, 227 또는 319)를 포함하는 진단 테스트 키트의 생산 및 사용은 본 명세서의 다양한 예시적인 구체예의 범위 내에 있다.
특이적 구체예들에서, 상기 항원성 펩티드 또는 B 세포 에피토프 펩티드는 COVID-19 진단을 위해 환자의 생물학적 샘플 안에 SARS-CoV-2 항체 검출에 유용하다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 점액, 대변, 조직 추출물 및 조직액을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 항체가 내포될 수 있는 모든 체액 또는 조직이 내포된다. 환자라는 용어는 영장류가 아닌 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 렛, 등등) 및 영장류 (예를 들어, 원숭이 및 인간)와 같은 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간을 포괄하는 의미이다.
본 명세서의 항원성 펩티드 및 B 세포 에피토프 펩티드는 환자의 생물학적 샘플 안에 SARS-CoV-2 항체 존재를 검출하는 면역 분석에 이용될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 면역분석이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 생물학적 샘플에 하나 또는 그 이상의 SARS-CoV-2 항원성 또는 B 세포 에피토프 펩티드 또는 이의 면역학적 기능 유사체를 결합을 유도하는 조건 하에서 접촉시킬 수 있다. 상기 생물학적 샘플과 항원성 또는 B 세포 에피토프 펩티드 또는 이의 면역학적 기능 유사체 간의 임의의 결합은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 전술한 생물학적 샘플과 SARS-CoV-2 항원성 펩티드 또는 이의 면역학적 기능 유사체 간의 결합 검출은 해당 샘플 안에 SARS-CoV-2가 존재함을 나타낸다. 더욱 특이적인 구체예에서, ELISA 면역분석를 이용하여 샘플 안에 SARS-CoV-2 항체들의 존재를 평가할 수 있다. 이러한 ELISA 면역분석은 다음의 단계들을 포함한다:
i. 고형 서포트에 항원성 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 4-5, 17-18, 37-38, 259, 261, 263, 265, 266, 270, 281, 308, 321, 322, 323, 그리고 324) 또는 B 세포 에피토프 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 23-24, 26, 27, 그리고 29-34, 226, 227 및 315-319)를 포함하는 펩티드, 또는 펩티드들의 혼합물을 부착시키는 단계,
ii. 해당 환자로부터의 항체를 함유하는 생물학적 샘플에 고형 서포트에 부착된 항원성 펩티드 또는 B 세포 에피토프 펩티드를 이들 펩티드에 대한 항체의 결합을 유도하는 조건 하에서 노출시키는 단계, 그리고
iii. 상기 고형 서포트에 부착된 펩티드에 결합된 항체가 존재하는 지를 검출하는 단계.
5. SARS-CoV-2 펩티드의 면역학적으로 기능성 상동체 및 유사체
일부 구체예들에서, 상기 항원성 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 4-5, 17-18, 37-38, 259, 261, 263, 265, 266, 270, 281, 308, 321, 322, 323, 그리고 324) 또는 B 세포 에피토프 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 23-24, 26, 27, 29-34, 226, 227, 그리고 315-319)에는 SARS-CoV-2의 돌연변이 및 변이 균주로부터 상응하는 서열 및 입체형태적 요소들을 갖는 면역학적으로 기능성 상동체 및/또는 유사체들이 내포된다.
상기 기술된 SARS-CoV-2 펩티드의 상동체 및/또는 유사체는 SARS-CoV-2에 의해 유도된 항체들에 결합하거나, 또는 가교-반응하며, 이들은 본 명세서에 내포된다. 대립유전자, 종 및 유도된 변이체를 포함한 유사체는 보존적 치환으로 인하여, 1개, 2개 또는 소수의 위치에서 자연적으로 발생되는 펩티드들과는 일반적으로 상이하다. 유사체들은 전형적으로 천연 펩티드와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 유사체들에는 이들의 하나, 둘 또는 몇 개 위치에서 비-천연 아미노산 또는 N-말단 아미노산 또는 C-말단 아미노산의 변형이 또한 내포된다.
기능성 유사체인 변이체들은 아미노산 위치에서 보존적 치환을 가질 수 있고; 전체 하전에서의 변화를 가질 수 있으며; 또다른 모이어티에 공유적 부착을 가질 수 있거나; 또는 아미노산 추가, 삽입, 또는 결손을 가질 수 있거나; 및/또는 이의 임의의 조합을 가질 수 있다.
보존적 치환은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 화학적 속성들을 갖는 또다른 아미노산 잔기로 치환될 때 보존적 치환이다. 예를 들면, 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 내포되며; 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 내포되며; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 내포되며; 그리고 음으로 하전된 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 내포된다.
특정 구체예에서, 상기 기능성 유사체는 원래 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는다. 또다른 구체예에서, 상기 기능성 유사체는 원래 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 기능성 유사체는 원래 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 기능성 유사체는 원래 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는다.
상동성 SARS-CoV-2 펩티드는 대응하는 펩티드와 비교하였을 때, 원래 SARS-CoV-2 펩티드와 실질적으로 동일한 면역원성은 유지하면서, 어느 정도 변형된(가령, 서열 또는 하전에서의 변화, 또다른 모이어티에 공유적 부착, 하나 또는 그 이상의 분기된 구조의 추가, 및/또는 다량체화) 서열들을 함유한다.
상동체는 Clustal Omega 또는 단백질 BLAST 분석과 같은 서열 정렬 프로그램을 통해 쉽게 식별해낼 수 있다. 도 3-5에서는 SARS-CoV-2, SARS CoV, 그리고 MERS CoV의 코로나바이러스 균주들로부터 취한 아미노산 서열들을 정렬시킨 것이 제공된다. 이들 상동성 펩티드는 개별적으로 이용될 수 있거나, 또는 혼합물로 복합시켜, 감염된 개체 또는 백신접종된 개체의 생물학적 샘플 안에 면역분석 (가령, ELISA)에 의해 SARS-CoV-2의 M 단백질, N 단백질, 그리고 S 단백질에 대한 항체 검출용 가장 최적의 항체 포획상을 구성시킬 수 있다. 상기 기술된 펩티드의 상동체란 변이체 균주들, 이를 테면, 해당 펩티드에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는 SARS-CoV 또는 MERS-CoV의 아미노산 서열들의 상응하는 위치로부터 유래된 펩티드로 추가 특정된다.
일부 구체예들에서, 상기 변이체 펩티드 상동체는 SARS-CoV-2의 서열 식별 번호: 1, 6, 20에 대해 약 >50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는, SARS-CoV 또는 MERS-CoV의 서열 (가령, 서열 식별 번호: 2, 3, 7, 8, 21, 또는 22)의 아미노산 위치로부터 유래된다. 또다른 구체예에서, SARS 균주 S-RBD 펩티드 상동체 (서열 식별 번호: 28)는 서열 식별 번호: 26에 대해 약 58.6% 동일성을 갖는다.
SARS-CoV-2의 검출 및 이의 감염 진단용으로 환자의 생물학적 샘플 안에 SARS-CoV-2에 대한 항체 검출용으로, SARS-CoV-2 M 단백질 (가령, 서열 식별 번호: 4-5), N 단백질 (가령, 서열 식별 번호: 17-18, 259, 261, 263, 265, 266, 그리고 270), 그리고 S 단백질 (가령, 서열 식별 번호: 37-38, 281, 308, 321, 322, 323, 그리고 324) 및 이의 상동체들의 항원성 영역들을 제시하는 일련의 합성 펩티드를 단독으로, 또는 조합으로 이용할 수 있다. 추가적으로, 본원에 기술된 제형으로 백신접종을 맞은 개체의 면역화 효능을 결정하기 위해, 생물학적 샘플 안에 SARS-CoV-2에 대한 항체 검출용으로, SARS-CoV-2의 S 단백질 (S-RBD 또는 S1-RBD)의 수용체 결합 도메인을 나타나낸 일련의 합성 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 26, 226, 227 또는 315-319) 및 이의 상동체를 단독으로, 또는 조합으로 이용할 수 있다.
6. UBI® SARS-CoV-2 ELISA 제품
a. 상품명 및 의도된 용도
UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 인간 혈청 및 혈장 (헤파린 나트륨 또는 EDTA 이칼륨(K2))에서 SARS-CoV-2에 대한 IgG 항체의 정성적 검출을 위한 효소-연계된 면역흡착 분석법(ELISA)이다. UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 최근 또는 이전 감염을 나타내는 SARS-CoV-2에 대한 적응 면역 반응이 있는 개체 식별에 도움을 주기 위한 의도된 용도를 갖는다. 현재로서는, 감염-후 항체가 얼마나 오래 지속되는지, 항체의 존재로 보호 면역이 부여되는지 여부는 모른다. UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 급성 SARS-CoV-2 감염을 진단하거나, 또는 배제하는데 사용해서는 안된다. 테스트는 1988년 Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA), 42 U.S.C 263a에 의거하여 인증된 검사실로 한정되며, 이 검사실은 고도로 복잡한 검사를 수행하기 위한 요구 사항을 충족시킨다.
결과는 IgG SARS CoV-2 항체의 검출에 대한 것이다. SARS-CoV-2에 대한 IgG 항체는 일반적으로 초기 감염-후 며칠 후에 혈액에서 검출할 수 있지만, 감염-후 항체가 존재하는 기간은 잘 특성화되지 않는다. 개체들에는 혈청 전환-후, 몇 주 동안 검출 가능한 바이러스가 존재할 수 있다.
미국 및 미국 영토 내의 실험실은 모든 결과를 적절한 공중 보건 당국에 보고해야 한다.
감염 초기에 UBI® SARS-CoV-2 ELISA의 민감도는 알려져 있지 않다. 음성 결과는 급성 SARS-CoV-2 감염을 배제시키지 않는다. 급성 감염이 의심되는 경우, SARS-CoV-2에 대한 직접 검사가 필요하다.
기존 항체의 교차 반응성 또는 기타 가능한 원인으로 인해 UBI SARS-CoV-2 ELISA의 거짓-양성 결과가 발생할 수 있다. 거짓-양성 결과의 위험 때문에, 제 2의, 상이한 IgG 항체 분석을 사용하여 양성 결과의 확정을 고려해야만 한다.
증상 발병-후, 15일 이상 경과한 개체에게서만 샘플을 테스트해야 한다.
UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 현재, Food and Drug Administration의 긴급 사용 승인 하에서만 사용할 수 있다.
b. 테스트 요약 및 설명
UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 인간 혈청 또는 혈장에서 SARS-CoV-2에 대한 항체 검출을 위해, SARS-CoV-2의 매트릭스(M), 스파이크(S) 및 뉴클레오켑시드(N) 단백질에서 파생된 합성 펩티드를 사용하는 면역 분석법이다. 재조합 바이러스 단백질이 생산되는 세포-없는, 또는 대장균-유래된 불순물이 없는, 이러한 합성 펩티드들은 SARS-CoV-2 구조적 M 단백질, N 단빅질 및 S 단백질의 항원성이 높은 세그먼트에 대해 특이적인 항체에 결합하고, 고형-상(phase) 항원성 면역흡착제를 구성한다. 컷오프 값 (즉, 컷-오프에 대한 신호 비율 ≥ 1.00)보다 크거나 또는 대등한 흡광도 값을 갖는 표본은 양성으로 정의된다.
c. 절차의 화학적 원리 및 생물학적 원리
UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 SARS-CoV-2의 스파이크 (S) 단백질, 매트릭스 (M) 단백질 및 뉴클레오켑시드 (N) 단백질의 항원성이 높은 세그먼트에 대해 특이성을 가진 항체를 포획하는 합성 펩티드로 구성된 반응 마이크로플레이트의 웰에 결합된 면역흡착제를 사용한다.
분석 과정에서, 희석된 음성 대조군과 표본을 반응 마이크로플레이트 웰에 추가하고, 항온처리한다. SARS-CoV-2-특이적 항체들 (존재한다면)은 상기 면역흡착제에 결합할 것이다. 결합되지 않은 항체 및 기타 혈청/혈장 성분들을 제거하기 위해, 반응 마이크로플레이트 웰을 철저히 세척한 후, 인간 IgG에 특이적인 양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG 항체의 표준화된 조제물을 각 웰에 첨가한다. 그 다음, 이러한 콘쥬게이트 조제물은 포획된 항체들과 반응할 수 있다. 결합되지 않은 양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 항체를 제거하기 위해, 웰을 다시 완전히 세척한 후, 과산화수소 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 함유하는 기질 용액을 첨가한다. 대부분의 설정에서 존재하는 SARS-CoV-2 특이적 IgG 항체 (만약 있다면)의 양에 비례하여, 청색이 나타난다. 각 웰의 흡광도는 Molecular Devices®의 VERSAMAX™ 또는 등가물과 같은 마이크로플레이트 판독기를 사용하여, 450 nm에서 15분 이내에 측정된다.
d. 시약 구성요소들 및 이들의 보관 조건
UBI® SARS-CoV-2 ELISA 192개 테스트
SARS-CoV-2 반응 마이크로플레이트 192개 웰
각 마이크로플레이트 웰은 흡착된 SARS-CoV-2 합성 펩티드를 함유한다. 건조제로 밀봉하여, 2-8℃에서 보관한다.
비-반응성 대조군/ 측정기(Calibrator) 0.2 mL
0.1% 아지드화나트륨과 0.02% 젠타마이신을 보존제로 함유한 비-활성화된 정상적인 인간 혈청. 2-8℃에서 보관한다.
표본 희석제 (완충제 I) 45 mL
카제인, 젤라틴, 그리고 보존제를 함유하는 인산염 완충된 염 수용액: 0.1% 아지드 나트륨 및 0.02% 젠타마이신. 2-8℃에서 보관한다.
콘쥬게이트 0.5 mL
0.02% 젠타마이신 및 0.05% 4-디메틸아미노안티피린과 함께, 양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG 항체. 2-8℃에서 보관한다.
콘쥬게이트 희석제 (완충제 II) 30 mL
보존제로써 0.02% 젠타마이신과 함께, 계면활성제 및 열-처리된 정상적인 염소 혈청을 함유하는 인산염 완충된 염. 2-8℃에서 보관한다.
TMB 용액 14 mL
3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액. 2-8℃에서 보관한다.
기질 희석제 14 mL
과산화수소를 함유하는 구연산염 완충제. 2-8℃에서 보관한다.
중단 용액 25 mL
희석된 황산 용액 (1.0M H2SO4). 2-30℃에서 보관한다.
세척 완충제 농축물 150 mL
계면활성제와 함께, 인산염 완충된 염의 25-배 농축물. 2-30℃에서 보관한다.
희석 마이크로플레이트 192개 웰
표본의 사전-희석을 위한, 비어 있는(blank), 노란색 마이크로플레이트. 2°~30℃에서 보관한다.
플레이트 커버 6개 쉬트
각 항온처리-동안, 반응 마이크로플레이트 웰을 덮는 데 사용할 투명한, 플라스틱 접착성 쉬트. 반응 마이크로플레이트 웰의 전체 플레이트보다 적은 양이 분석될 때마다, 종이 뒷면을 제거하기 전, 플라스틱 시트를 절단할 수 있다. 대안으로, 표준 마이크로플레이트 뚜껑을 사용할 수 있다.
필요한 재료 - 제공되지 않음
1. 항-SARS-CoV-2 양성 대조군 0.2 mL
SARS-CoV-2 IgG 항체를 함유하는 비-활성화된 인간 혈장. ≤ -20℃에서 보관한다. UBI SARS-CoV-2 ELISA를 위해 항-SARS-CoV-2 양성 대조군(PN 200238)으로 별도로 구입할 수 있다.
2. 수동 또는 자동 다중-채널-8 또는 12 채널 피펫터(50μL ~ 300μL).
3. 수동 또는 자동 가변성 피펫터 (1μL ~ 200μL).
4. 인큐베이터 (37 ± 2℃).
5. 캡이 있는 폴리프로필렌 또는 유리 용기(25mL 용량).
6. 차아염소산나트륨 용액, 5.25% (액상, 가정용 표백제).
7. 450 ± 2 nm의 파장에서 빛을 전달할 수 있는 마이크로플레이트 판독기.
8. 250-350μL를 분주(dispensing) 및 흡인할 수 있는 자동 또는 수동 흡인-세척 시스템.
9. 피펫터 홈통(troughs) 또는 보트.
10. 시약 등급 (또는 그 이상의) 물.
11. 일회용 장갑.
12. 타이머.
13. 흡수성 티슈.
14. 생물학적 유해 폐기물 용기.
15. 피펫터 팁(tips).
경고 및 주의사항
시험관내 진단 연구 용도
현재 처방전용으로만 사용
현재 응급용으로만 승인
1. 이건 출원 제출일 현재:
a. 이 테스트는 FDA 인가 또는 승인을 받지 않았지만, 1988년 Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA), 42 U.S.C. 263a에 의거하여 인증된 검사실에서 이용하기 위한 EUA 하에 응급 용도로 승인받았고, 이때 검사실은 고도로 복잡한 테스트를 수행하기 위한 요구 사항을 충족시킨다.
b. 이 테스트의 응급 사용은 임의의 다른 바이러스 또는 병원체가 아닌, SARS-CoV-2에 대한 IgG 항체 검출용으로만 승인되었다.
c. 이 테스트의 응급 사용은 연방 식품, 의약품 및 화장품 법령, 21 U.S.C. § 360bbb-3(b)(1)의 564(b)(1)항에 따라, COVID-19의 검출 및/또는 진단을 위한, 시험관내 진단 테스트의 응급 사용 승인을 정당화하는 상황이 존재한다는 선언 기간 동안에만 승인된다 (이러한 선언이 종료되지 않는 한, 또는 승인이 조만간 취소되지 않는 한)
2. 분석 표본, 반응성 및 비-반응성 대조군들은 이들이 마치 감염원을 전염시킬 수 있는 것처럼 취급한다. 테스트 절차 내내 일회용 장갑을 착용한다. 이들 장갑은 생물학적 유해 폐기물로 폐기한다. 그 후에는 손을 철저히 씻는다.
3. 한 키트 로트의 시약들은 또다른 시약으로 대체하지 않는다. 콘쥬게이트와 반응 마이크로플레이트는 최적의 수행을 위해 맞춘 것이다. 제조업체에서 제공한 시약만을 사용한다.
4. 이들 시약의 유효 날짜가 경과된 키트 구성 요소들은 사용하지 않는다.
5. 비-반응성 대조군/측정기는 표본의 각 실행 때 마다 각 플레이트에서 3중 분석해야 하고, 해당 표본과 동일한 방법으로 희석해야 한다.
6. 세척 완충제 농축물을 희석시키려면, 시약 등급 품질의 물만 사용한다.
7. 모든 키트 시약 및 재료들은 이들의 사용하기 전, 실온 (15 ~ 30℃)에 도달하도록 한다.
8. 마이크로플레이트는 필요할 때까지, 보관용 백으로부터 꺼내지 않는다. 사용하지 않은 스트립은 제공된 건조제와 함께, 이의 호일 파우치에 안전하게 밀봉하여 2~8℃에서 보관해야 한다.
9. 주의 사항: 중단 용액 (1 mol/L H2SO4)은 화상 원인이 된다. 이 제품에 물을 절대 넣으면 안된다. 눈에 들어간 경우, 즉시 다량의 물로 씻어내고, 의사의 진찰을 받는다.
10. 1 mol/L 황산 (중단 용액)과 산화제 또는 금속의 접촉을 피한다.
11. 마이크로플레이트 판독기와 자동 마이크로플레이트 세척기 모두, 이들 기기 제조업체에서 제공한 설치, 작동, 보정 및 유지보수 지침을 준수한다.
12. 유출물은 요오드퍼(iodophor) 소독제 또는 차아염소산나트륨 용액을 사용하여 철저히 닦아내어야 한다.
요오드퍼 소독제: 최소 100ppm의 사용 가능한 요오드를 제공하는 희석액으로 사용해야 한다.
차아염소산 나트륨:
a. 산을 함유하지 않은 유출물은 5.25% 차아염소산 나트륨 용액으로 철저히 닦아내야 한다.
b. 산을 함유한 유출물은 닦아 내고, 건조시켜야 한다. 그런 다음, 엎질러진 부분을 5.25% 차아염소산 나트륨 용액 (액상 가정용 표백제)으로 닦아야 한다.
13. 이 제품은 보존제로써 아지드 나트륨을 함유하고 있다. 아지드 나트륨은 실험실 배관에서 납 또는 구리 아지드를 형성할 수 있다.
이러한 아지드는 망치질과 같은 충격으로 폭발할 수 있다. 납 또는 구리 아지드의 형성을 방지하기 위해, 폐액을 처리-후 배수구를 물로 완전히 씻어낸다. 아지드 축적이 의심되는 것을 제거하기 위해, National Institute for Occupational Safety and Health (USA)는 다음을 권장한다: (1) 배수 트랩에서 호스를 사용하여 액체를 사이펀하고, (2) 10% 수산화나트륨 용액으로 채우고, (3) 16시간 동안 방치하고, (4) 물로 잘 씻어낸다.
폐기물 처리
검사 수행에 사용된 모든 표본 및 재료는 이들에 감염원이 함유하는 것처럼 폐기한다. 소각 전에 121℃ 이상의 고압증기멸균을 권장한다.
산을 포함하지 않는 액체 폐기물은 최종 혼합물에 1.0% 차아염소산나트륨이 함유되도록 차아염소산나트륨과 혼합될 수 있다. 산을 함유한 액체 폐기물은 차아염소산나트륨을 추가하기 전, 비례량의 염기로 중화해야 한다. 오염 제거가 완료될 때까지, 실온에서 최소 30분을 둔다. 그런 다음, 이 액체는 지역 조례에 따라 처리될 수 있다.
표본 수집 및 준비
1. UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 인간 혈청 또는 혈장(항-응고제 헤파린 나트륨 또는 EDTA 이칼륨)에서 수행할 수 있다. 침전물 또는 미립자 물질들이 함유된 표본은 일관되지 않은 테스트 결과를 제공할 수 있다. 필요한 경우, 테스트-전, 원심분리를 통해 표본을 정화시켜야 한다.
2. 분석-전, 표본은 열-불활성화되어서는 안된다.
3. 표본은 최대 48시간 동안 2 ~ 8℃에서, 또는 최대 2개월 동안 ≤ -20℃에서 보관할 수 있다.
4. 표본은 한 차례 동결 및 해동될 수 있다.
시약들의 준비
냉장고에서 분석 시약을 꺼낸 후, 실온에 도달하도록 하고, 피펫팅-전 부드럽게 휘저어 완전하게 혼합되도록 한다.
세척 완충제:
분석 절차를 시작하기 전, 준비하고 플레이트 세척기에 로딩한다. 1-부피의 세척 완충제 농축물을 24-부피의 시약 등급의 물로 희석시킨다. 잘 혼합시킨다. 일단 준비되면, 희석된 세척 용액은 3개월 동안 안정적이며, 간헐적으로 혼합한다. 2 ~ 30℃에 보관한다. 희석된 세척 용액을 냉장고에 보관한 경우, 이 용액에 실온 (15~30℃)에 도달할 때까지 사용하지 않는다.
작업 콘쥬게이트 용액:
단계 6의 분석 절차로 준비한다. 콘쥬게이트 희석제를 사용하여 콘쥬게이트를 1:100으로 희석시킨다. 작업 콘쥬게이트 용액의 정확한 양을 준비하기 위해, 하기 차트를 참조한다. 균일한 용액이 되도록 잘 섞는다.
작업 콘쥬게이트 용액 조제물 차트
스트립 수 테스트 수 콘쥬게이트 (μL) 희석제 (mL)
1 ~ 2 8 ~ 24 25 2.5
3 ~ 6 25 ~ 48 50 5.0
7 ~ 9 49 ~ 72 75 7.5
10 ~ 12 73 ~ 96 100 10.0
TMB 기질 용액:
단계 8의 분석 절차로 준비한다. TMB 용액과 기질 희석제를 동일한 부피로 혼합한다. 준비할 TMB 기질 용액의 정확한 양은 아래 차트를 참조한다. 직사광선을 피하고, 준비 후 10분 이내에 사용한다.
TMB 기질 용액 준비
테스트 수 TMB 완충제 (mL) 기질 희석제 (mL)
16 1.1 1.1
24 1.6 1.6
32 2.1 2.1
40 2.5 2.5
48 2.8 2.8
56 3.5 3.5
64 3.8 3.8
72 4.0 4.0
80 4.5 4.5
88 5.0 5.0
96 5.5 5.5
모든 재료는 실온(15~30℃)에서 사용해야 한다. 액체 시약은 사용하기 전에 철저하고, 부드럽게 혼합되도록 한다.
보관 지침
1. UBI® SARS-CoV-2 ELISA 키트 및 구성 요소를 사용하지 않을 때는 2 ~ 8℃에서 보관하고, 키트 유효 기간까지만 사용한다.
2. 개봉 후, 반응 마이크로플레이트의 사용하지 않은 스트립은 제공된 건조제와 함께 포일 파우치에 안전하게 밀봉시켜 2 ~ 8℃에서 보관해야 한다. 2 ~ 8℃의 밀폐된 파우치에 보관할 경우, 한 번 개봉한 후 반응 마이크로 플레이트는 8주 동안 안정적이다.
불안정성 또는 불량 징후
1. 제공된 시약의 물리적 외관 변화는 이러한 물질의 품질 저하를 나타낼 수 있다. 눈에 띄게 탁한 시약은 사용하지 않는다.
2. TMB 용액, 기질 희석제 및 준비된 기질 용액은 적절한 분석 성능을 위해 무색에서 옅은 노란색이어야 한다. 임의의 기타 색깔은 TMB 용액 및/또는 기질 용액의 변질을 나타낼 수 있다.
불안정성 또는 불량 징후
항-SARS-CoV-2 양성 대조군은 테스트 샘플과 동일한 방식으로 처리되며, 테스트 실행을 검증에 사용된다. 양성 대조군은 각 실행에서 환자 표본과 동시에 별개 웰에서 실행하는 것을 권장한다. 양성 대조군 흡광도 값은 ≥ 0.5이어야 하고, 컷오프에 대한 신호 비율은 >1.0이어야 한다. 흡광도 값, 또는 컷오프에 대한 신호 비율이 한계값을 벗어나면, 해당 플레이트를 무효화시키고, 테스트를 반복해야 한다.
비-반응성 대조군/측정기는 분석 절차 섹션에 설명된 대로 테스트된다.
비-반응성 대조군/측정기의 예상 결과는 분석 검증 섹션에서 제공된다.
분석 절차
1. 희석 마이크로플레이트에 대해:
A. 200μL의 표본 희석제 (완충제 I)를 모든 웰에 분배한다.
B. 웰 A1은 시약 블랭크로 사용한다.
C. 10μL의 비-반응성 대조군/측정기를 웰 B1, C1, D1에 추가한다.
D. 10μL의 항-SARS-CoV-2 양성 대조군을 적절한 웰에 추가한다.
E. 10μL의 테스트 표본을 적합한 웰에 추가한다.
2. 이들 웰의 내용물이 완전히 혼합되었는지 확인한다. 피펫을 이용하여 수작업으로 혼합하거나, 또는 플레이트를 부드럽게 진동시키는 것이 허용된다.
3. 호일 파우치를 열고, 반응 마이크로플레이트를 빼낸다. 전체 반응 마이크로플레이트를 사용하지 않을 때는 프레임에서 여분의 스트립을 제거하고, 제공된 보관 파우치에 다시 넣고 단단히 밀봉시킨다. 사용되는 세척 시스템에 따라, 대체 스트립을 삽입해야 할 수도 있다.
4. 100μL의 시약 블랭크, 비-반응성 대조군/측정기 및 희석 표본을 희석 마이크로플레이트의 각 웰에서 반응 마이크로플레이트의 해당 웰로 옮긴다.
5. 뚜껑을 덮고, 37 ± 2℃에서 60 ± 2분 동안 항온처리한다.
6. 반응 마이크로플레이트를 세척하기 전, 시약 준비에 설명된 대로 작업 콘쥬게이트 용액(1:101)을 준비한다.
7. 시약 준비에서 기술된 바와 같이, 마이크로플레이트를 세척 완충제로 세척한다.
A. 자동 마이크로플레이트 세척기 - 여섯 (6) 차례 세척을 이용하며, 웰당 세척당 적어도 300μL를 사용한다.
B. 수동 마이크로플레이트 세척기 또는 피펫터 (8개 또는 12개 채널) - 여섯 (6) 차례 세척, 웰당 세척당 적어도 300μL를 사용한다. 전체 플레이트를 채운 다음, 동일한 순서로 흡입한다.
8. 예를 들어, 플레이트를 흡수성 종이 위에서 두드려 건조시키고, 잔류 부피가 최소가 되도록 한다.
9. 100μL의 준비된 작업 콘쥬게이트 용액 (1:101)을 반응 플레이트에 추가한다. 뚜껑을 덮고, 37 ± 2℃에서 30 ± 1분 동안 항온처리한다.
10. 시약 준비에 따라, 사용-전 항온처리 동안, TMB 기질 용액을 준비한다. 용액에 직사광선을 차단시킨다.
11. 단계 7과 단계 8에서와 같이, 세척 절차를 반복한다.
12. 100μL의 준비된 TMB 기질 용액을 반응 마이크로플레이트의 각 웰에 추가한다.
13. 뚜껑을 덮고, 37 ± 2℃에서 15 ± 1분 동안 항온처리한다.
14. 100μL의 중단-용액을 반응 마이크로플레이트의 각 웰에 추가한다. 예를 들어, 이 플레이트를 부드럽게 두드리거나 진동시켜 혼합시킨다.
15. 에어 블랭크를 450 ± 2 nm에서 흡광도를 판독한다. 주석: 상기 중단 용액을 반응 마이크로플레이트에 추가한 후 15분 이내에 흡광도를 판독해야 한다.
분석 검증 및 결과 산출
SARS-CoV-2에 특이적인 항체의 유무는 검체의 흡광도를 컷-오프 값과 관련시켜 결정된다.
분석 검증
분석이 유효하려면:
1. 시약 블랭크 흡광도 값은 0.150 미만이어야 한다. 만약 한계치를 벗어난다면, 해당 플레이트를 무효화시키고, 테스트를 반복해야 한다.
2. 개체 비-반응성 대조군/측정기 흡광도 값은 0.200 미민이면서, 시약 블랭크보다는 더 커야 한다. 세 개의 비-반응성 대조군/측정기 값 중 하나가 이러한 한계를 벗어나면, 두 개의 허용가능한 제어 값을 기반으로 비-반응성/측정기 평균을 재-산출한다. 세 가지 대조군 값 중 두 개 또는 그 이상이 한계를 벗어난 경우 (0.200 미만이면서, 시약 블랭크보다 더 큰 경우), 해당 플레이트를 무효화시키고, 테스트를 반복해야 한다.
3. 항-SARS-CoV-2 양성 대조군 흡광도 값은 ≥ 0.5이어야 하고, 컷오프에 대한 신호 비율은 >1.0이어야 한다. 흡광도 값, 또는 컷오프에 대한 신호 비율이 한계값을 벗어나면, 해당 플레이트를 무효화시키고, 테스트를 반복해야 한다.
결과 산출
1. 시약 블랭크 (RB)의 흡광도
실시예: 시약 블랭크 흡광도
웰 A1 0.044
2. 비-반응성 대조군/측정기 (NRC)의 평균을 결정한다.
실시예: NRC 흡광도
웰 B1 0.062
웰 C1 0.066
웰 D1 0.063
총합 0.191
평균 0.191 ÷ 3 = 0.064
3. 컷-오프 값 산출:
컷-오프 값 = 평균 NRC + 0.2
실시예: 평균 NRC = 0.064
컷-오프 값 = 0.064 + 0.2 = 0.264
4. 컷-오프 (S/C)에 대한 신호 비율 산출:
S/C 비율 = 샘플의 OD ÷ 컷-오프 값
실시예: 샘플 OD = 0.542
컷-오프 값 = 0.264
S/C 비율 = 0.542/0.264 = 2.05
결과의 해석
1. 컷-오프 값 (즉, 컷-오프에 대한 신호 비율 < 1.00)보다 작은 흡광도 값을 갖는 표본은 UBI® SARS-CoV-2 ELISA 기준에 따라 음성이며, SARS-CoV-2에 대한 IgG 항체에 대해 음성으로 간주될 수 있다.
2. 컷-오프 값 (즉, 컷-오프에 대한 신호 비율 ≥ 1.00)에 대등하거나, 또는 이보다 큰 흡광도 값을 갖는 표본은 UBI® SARS-CoV-2 ELISA 기준에 따라 양성이며, SARS-CoV-2에 대한 항체에 대해 양성으로 간주될 수 있다.
UBI® SARS-CoV-2 ELISA 결과는 다음과 같이 해석된다:
S/C 비율 결과 해석
<1.00 음성 SARS-CoV-2에 대한 IgG 항체에 대해 음성
≥1.00 양성 SARS-CoV-2에 대한 IgG 항체에 대해 양성
컷-오프를 초과하는 측정 결과의 규모는 해당 샘플에 존재하는 항체의 총량을 나타내지 않는다.
절차의 제약
1. UBI SARS CoV-2 ELISA의 사용은 교육을 받은 실험실 직원으로 국한된다. 가정용이 아니다.
2. UBI® SARS-CoV-2 ELISA 절차 및 결과 해석 섹션은 반드시 밀접하게 연계되어야 한다.
3. 성능은 의도된 용도에 적시된 표본 유형에서만 설정되었다. 기타 표본 유형들은 평가되지 않았으므로, 이 분석에 사용해서는 안 된다.
4. 이 분석은 핑거스틱 표본으로 평가되지 않았다. 이 테스트는 핑거스틱 전혈에 대한 사용은 승인되지 않는다.
5. 증상이 15일 미만 동안 나타난 환자들로부터 수집된 샘플에서 SARS-CoV-2 항체는 검출가능한 수준 미만일 수 있다. 증상 발현-후, ≥15일의 개체들에게서 샘플을 채취해야 한다. 증상 발현-후, 15일이 지나지 않은 개체들로부터 채취한 샘플을 검사해서는 안 된다.
6. 임상의가 개별 환자에 대한 결정을 내리는 데 도움이 되도록, 다른 임상 및 실험실 방법과 함께, 분석 결과를 활용해야 한다.
7. 분석 결과는 급성 COVID-19 감염을 진단하거나, 또는 배제하거나, 또는 감염 상태를 알리는 데 사용되어서는 안 된다. 급성 감염이 의심되는 경우, 직접적인 바이러스 핵산 검출 또는 항원 검출 방법을 수행해야 한다.
8. 기존 항체의 교차 반응성 또는 기타 가능한 원인으로 인해 거짓-양성 결과가 발생할 수 있다.
9. 개체 대상체에 대한 음성 결과는 검출가능한 항-SARS-CoV-2 항체가 없음을 나타낸다. 음성 결과는 SARS-CoV-2 감염을 배제하지 않으며, 환자 관리 결정의 유일한 근거로 사용되어서는 안 된다. 감염-후 초기에 이 분석의 민감도는 알려져 있지 않다.
10. 표본에 존재하는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체의 양이 분석의 검출 한계 미만인 경우, 또는 검출된 항체가 샘플이 수집되는 질병 단계 동안 존재하지 않는 경우, 음성 결과가 발생할 수 있다.
11. 비-SARS-CoV-2 코로나바이러스 (감기) 균주들, 이를 테면, HKU1, NL63, OC43 또는 229E에 대한 항체의 직접적인 증거가 있는 가계도 표본들은 이 분석으로 평가되지 않았다.
12. 결과가 임상 증거와 일치하지 않으면, 결과를 확인하기 위해 추가 검사를 제시한다.
13. SARS-CoV-2에 대한 항체의 존재가 감염에 대한 면역성을 부여하는지 여부는 현재 알려져 있지 않다.
14. 양성 결과는 기존 SARS-CoV-2 감염을 나타내지 않을 수 있다. 면역 반응을 확인하기 위해 제 2의, 상이한 혈청 검사의 필요성을 평가할 때, 임상 병력 및 지역적 질환 유병률을 비롯한 기타 정보들을 고려한다.
15. UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 수동 분석 절차와 함께 사용하도록 승인되었다. 자동화 기기 플랫폼에서 사용하기 위한 분석 수행은 확립되지 않았다.
16. 기증된 혈액의 스크리닝을 위한 것은 아니다.
실험실 승인 조건
UBI® SARS-CoV-2 ELISA 승인서, 의료 제공자를 위한 승인된 정보지, 환자를 위한 승인된 정보지 및 승인된 라벨은 FDA 웹사이트에서 제공된다 (웹사이트: www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas).
UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 사용하는 승인받은 실험실은 아래 열거된 승인서에 명시된 승인 조건을 준수해야 한다:
1. UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 이용하는 승인받은 실험실 ("Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988(CLIA), 42 U.S.C. §263a 하에 승인된 실험실은 매우 복잡한 시험을 수행하기 위한 요구 사항을 충족하는 "공인 실험실"임)에는 테스트 결과 보고서와 함께 모든 승인된 사실 자료들이 내포되어야 한다. 긴급 상황에서는 이러한 사실 자료를 배포하기 위한 다른 적절한 방법을 사용할 수 있으며, 여기에는 대중 매체가 내포될 수 있다.
2. 공인 실험실은 승인 라벨에 개요된 바와 같이, UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 사용해야 한다. 승인된 임상 표본 유형, 승인된 대조군 물질, 승인된 기타 보조 시약 및 제품 사용에 필요한 승인된 재료를 비롯하여, 승인된 절차에서 벗어나는 것은 허용되지 않는다.
3. UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 받는 공인 실험실은 테스트를 시작하기 전, 관련 공중 보건 당국에 분석을 실행할 의도를 고지해야 한다.
4. UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 사용하는 공인 실험실은 적절한 경우, 의료 서비스 제공자 및 관련 공중 보건 당국에 검사 결과를 보고하는 절차를 마련해야 한다.
5. 공인 실험실은 UBI® SARS-CoV-2 ELISA의 성능에 대한 정보를 수집하고, DMD/OHT7-OIR/OPEQ/CDRH(이메일을 통하여, CDRH EUA-Reporting(at)fda.hhs.gov) 및 UBI Technical Support (website: www.unitedbiomedical.com/support.html)에 임의의 거짓-양성 또는 거짓-음성 결과로 의심되는 발생, 그리고 이런 것들이 인지된 분석의 확립된 성능 특성과의 상당한 편차에 대해 보고해야 한다.
6. UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 사용하는 모든 실험실 직원은 면역분석 기술에 대해 적절한 교육을 받아야 하며, 이 키트 및 UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 취급할 때 승인된 라벨에 따라, 적절한 실험실 장비 및 개인 보호 장비를 사용해야 한다. 이 분석을 사용하는 모든 실험실 직원은 UBI® SARS-CoV-2 ELISA 결과 해석에 대해 또한 교육을 받아야 하고, 이를 숙지해야 한다.
7. UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 사용하는 공인 유통업체인 United Biomedical Inc., 그리고 공인 실험실은 FDA에서 달리 통지할 때까지, EUA와 관련된 모든 기록이 유지되도록 해야 한다. 이러한 기록들은 감찰을 위해 요청 시, FDA에 제공될 것이다.
수행 평가
수행 평가 연구는 하기 실시예 11에 더 자세히 설명되어 있다.
7. 특이적 구체예들
(1) SARS-CoV-2의 M 단백질 (서열 식별 번호: 1), N 단백질 (서열 식별 번호: 6), 그리고 S 단백질 (서열 식별 번호: 20)로부터 항원성 펩티드를 포함하는, COVID-19 바이러스 감염 검출 및 역학적 감시를 위한 혈청학적 진단 분석.
(2) (1)의 혈청학적 진단 분석, 이때 상기 항원성 펩티드는 서열 식별 번호: 4-5, 17-18, 37-38, 259, 261, 263, 265, 266, 270, 281, 308, 321, 322, 323, 그리고 324, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
(3) (1)의 혈청학적 진단 분석, 이때 상기 항원성 펩티드는 서열 식별 번호: 5, 18, 38, 261, 266, 281, 322, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
(4) SARS-CoV-2에 의한 감염을 검출하는, 다음을 포함하는 방법:
a) 서열 식별 번호: 4-5, 17-18, 23-24, 26, 29-34, 37-38, 259, 261, 263, 265, 266, 270, 281, 308, 321, 322, 323, 그리고 324 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 항원성 펩티드를 고형 서포트에 부착시키고,
b) 해당 환자로부터의 항체를 함유하는 생물학적 샘플에 (a)의 고형 서포트에 부착된 항원성 펩티드를 이들 펩티드에 대한 항체의 결합을 유도하는 조건 하에서 노출시키고, 그리고
c) 상기 고형 서포트에 부착된 펩티드에 결합된 항체가 존재하는 지를 검출한다.
(5) (4)의 방법, 이때 (a)의 항원성 펩티드는 서열 식별 번호: 5, 18, 38, 261, 266, 281, 322, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
B. SARS-CoV-2에 의한 감염 예방을 위한 고도-정밀, 부위-지향적 펩티드 면역원 구조체들
상기 기술된 구제 체계의 제 2 측면은 SARS-CoV-2에 의한 감염을 예방하기 위한 고도-정밀, 부위-지향적 펩티드 면역원 구조체들에 관계한다.
1. S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 개발
본 명세서는 스파이크 단백질의 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 (RBD) (S-RBD 또는 S1-RBD) (서열 식별 번호: 226) 또는 이의 상동체 또는 변이체 (가령, 서열 식별 번호: 227)로부터 유래된 약 6개 ~ 약 100개 아미노산을 갖는 B 세포 에피토프 펩티드를 함유하는 펩티드 면역원 구조체들을 제공한다. 특정 구체예들에서, 상기 B 세포 에피토프 펩티드는 표 3 및 13에서 제시된 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
상기 B 세포 에피토프는 병원체 단백질 (가령, 표 6에 나타낸 서열 식별 번호: 49-100)로부터 유래된 이질성 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프에 직접적으로, 또는 선택적 이질성 스페이서 (가령, 표 7의 서열 식별 번호: 101-103)를 경유하여, 공유적으로 연계될 수 있다. 기획된 B 세포-에피토프 및 Th-에피토프를 모두 함유하는 이들 구조체들은 함께 작용하여 S-RBD 부위 (서열 식별 번호: 226) 및 이의 단편들 (가령, 서열 식별 번호: 26)과 교차-반응성이 있는 특이성이 매우 높은 항체 생산을 자극한다.
본원에서 이용된 어구 "S-RBD 펩티드 면역원 구조체" 또는 "S1-RBD 펩티드 면역원 구조체" 또는 "펩티드 면역원 구조체"는 (a) S-RBD 결합 부위 (서열 식별 번호: 226 또는 227), 또는 이의 변이체 (이를 테면, 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319)의 대략 6개 이상의 연속 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프; (b) 이질성 Th 에피토프 (가령, 서열 식별 번호: 49-100); 그리고 (c) 선택적 이질성 스페이서를 함유하는, 약 20개 이상의 아미노산으로 된 펩티드를 지칭한다.
특정 구체예들에서, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체는 다음의 식으로 표현될 수 있다:
(Th)m-(A)n-(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-X
또는
(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-(A)n-(Th)m-X
또는
(Th)m-(A)n-(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-(A)n-(Th)m-X
이때
Th는 이질성 T 헬퍼 에피토프이며;
A는 이질성 스페이서이며;
(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)는 S-RBD (서열 식별 번호: 226) 또는 SARS-CoV-2에 대항하는 이를 지향하는 항체를 유도할 수 있는 이의 변이체의 6~약 35개 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프 펩티드이며;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이며;
m은 1 ~ 약 4이며; 그리고
n은 0 ~ 약 10이다.
본 명세서의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 다음을 비롯한, 다수의 이론적 근거에 기초하여 기획 및 선택되었다:
i. 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드는 단백질 담체 또는 강력한 T 헬퍼 에피토프(들)를 사용하여, 면역원성이 될 수 있고;
ii. 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 면역원성이 부여되고, 숙주에게 투여될 때, 해당 펩티드 면역원 구조체는
a. 단백질 담체 또는 T 헬퍼 에피토프(들)가 아닌, S-RBD B 세포 에피토프(들)를 우선적으로 지향하는 고-역가 항체를 유도하고;
b. SARS-CoV-2를 중화시킬 수 있는 고도로 특이적인 항체를 생성시키고; 그리고
c. S-RBD의 수용체 ACE2에 대한 이의 결합을 억제할 수 있는 고도로 특이적인 항체를 생성시킨다.
상기 기술된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들 및 이의 제형들은 (COVID-19)를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물 또는 백신 제형으로 효과적으로 기능을 할 것이다.
상기 기술된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들의 다양한 구성요소들은 하기에서 추가로 상세하게 기술된다.
a. S-RBD로부터 B 세포 에피토프 펩티드
본 명세서는 S-RBD 부위 (가령, 서열 식별 번호: 226 또는 227) 그리고 이의 단편들 (가령, 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319)에 대해 특이성을 갖는 고-역가 항체 생산을 위한 신종 펩티드 조성물에 관계한다. 펩티드 면역원 구조체들의 부위-특이성으로 S-RBD의 다른 영역들 상의 무관한 부위, 또는 담체 단백질들 상의 무관한 부위들을 지향하는 항체 생성을 최소화시키고, 따라서 높은 안전 계수가 제공된다.
본원에서 이용된 용어 "S-RBD" 또는 "S1-RBD"란 200개 아미노산을 함유하는 수용체 결합 도메인을 지칭하며, 이의 ACE2 수용체에 결합하는 시스테인 간에 4개 이황화다리를 형성하는 8개 시스테인을 보유한다 (도 2). 본 명세서의 한 가지 측면은 능동 면역화를 통하여 SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 치료하는 것이다. 따라서, 본 명세서는 SARS-CoV-2에 대항하는 중화 항체 또는 SARS-CoV-2가 인간 수용체 ACE2에 결합하는 것을 저해하는 항체를 유도하기 위해, S-RBD의 일부분 (가령, 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319) 그리고 이의 제형들을 표적으로 하는 펩티드 면역원 구조체들에 관한 것이다.
상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 B 세포 에피토프 일부분은 상기 S-RBD 부위 (서열 식별 번호: 226) 또는 이의 변이체로부터 약 6개 ~ 약 35개 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 B 세포 에피토프 펩티드는 표 3 및 표 13에서 제시된, 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 본 명세서의 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에는 상이한 코로나바이러스 균주들로부터 S-RBD 서열들을 비롯한 S-RBD의 면역학적으로 기능성 유사체 또는 상동체, 이를 테면, SARS-CoV (서열 식별 번호: 21) 및 MERS-CoV (서열 식별 번호: 22) (표 3에서 제시된)이 또한 내포된다. S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 면역학적으로 기능성 유사체 또는 상동체에는 단백질의 주요 프레임워크 내 아미노산 위치에서 치환; 전체 하전에서의 변화며; 또다른 모이어티에 공유적 부착; 또는 아미노산 추가, 삽입, 또는 결손; 및/또는 이의 임의의 조합을 가질 수 있는 변이체들이 내포된다. 일부 구체예들에서, S-RBD의 서열 변이체에는 천연 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 대체시켜, 이황화결합에 의해 속박될 수 있는 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 24, 32, 그리고 34)를 만들 수 있는 부위-지향적 돌연변이들이 내포된다.
S-RBD의 B 세포 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 구조체로부터 생성된 항체는 전장의 S-RBD 결합 부위 (가령, 서열 식별 번호: 226) 또는 이의 단편들 (가령, 서열 식별 번호: 26)에 대해 매우 특이적이며, 가교-반응성이 있다. 이들의 독특한 특성 및 속성에 기초하여, 개시된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에 의해 유도된 항체는 SARS-CoV-2 감염에 대한 예방적 접근을 제공할 수 있다.
b. 이질성 T 헬퍼 세포 에피토프 (Th 에피토프)
본 명세서는 이질성 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프에 직접적으로 또는 선택적 이질성 스페이서를 경유하여 공유적으로 연계된 S-RBD로부터 B 세포 에피토프를 함유하는 펩티드 면역원 구조체들을 제공한다.
상기 펩티드 면역원 구조체에서 이질성 Th 에피토프는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 면역원성을 강화시키고, 이것은 최적화된 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드를 지향하고, 설계 이론적 근거를 기반으로 선별 및 선택된, 특이적인 고-역가 항체의 생산을 촉진시킨다.
본원에 사용된 용어 "이질성"이란 S-RBD의 야생형 서열의 일부가 아니거나, 또는 이와 상동성을 갖지 않는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 이질성 Th 에피토프는 S-RBD에서 자연적으로 발견되지 않는 아미노산 서열로부터 유래된 Th 에피토프다 (즉, Th 에피토프는 S-RBD에 대해 자가유래된 것이 아니다). 상기 Th 에피토프는 S-RBD에 대해 이질성이기 때문에, S-RBD의 천연 아미노산 서열은 상기 이질성 Th 에피토프가 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 공유적으로 연계될 때, N-말단 또는 C-말단 방향으로 연장되지 않는다.
본 명세서의 이질성 Th 에피토프는 S-RBD에서 자연적으로 발견되지 않는 아미노산 서열을 보유하지 않는 임의의 Th 에피토프일 수 있다. 상기 Th 에피토프는 다수 종의 MHC 클라스 II 분자들에 난잡성(promiscuous) 결합 모티프를 또한 보유할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 Th 에피토프는 다수의 난잡성 MHC 클래스 II 결합 모티프를 포함하여, T 헬퍼 세포의 최대 활성화를 허용함으로써, 면역 반응의 개시 및 조절로 이어진다. 상기 Th 에피토프는 바람직하게는 그 자체로는 면역-침묵성이며, 즉, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들에 의해 생성된 항체들중 (항체가 있다고 치더라도), Th 에피토프를 지향하는 것은 거의 없으며, 따라서 S-RBD 분자의 표적화된 B 세포 에피토프 펩티드에 대해 매우 집중된 면역 반응을 허용한다.
본 명세서의 Th 에피토프에는 표 6에서 구체화된 바와 같이, 외부 병원체로부터 유래된 아미노산 서열 (가령, 서열 식별 번호: 49-100)이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 특정 구체예들에서, 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 면역원성을 강화시키는데 이용된 상기 이질성 Th 에피토프는 천연 병원체 EBV BPLF1 (서열 식별 번호: 93), EBV CP (서열 식별 번호: 91), 클로스트리디움 테타니 (서열 식별 번호: 82-87), 콜레라 톡신 (서열 식별 번호: 81), 그리고 쉬스토소마 만소니 (서열 식별 번호: 100)로부터 유래되거나, 뿐만 아니라 단일 서열 (가령, MVF의 경우 서열 식별 번호: 49-52, 54-57, 59-60, 62-63, 65-66, 그리고 HBsAg의 경우 서열 식별 번호: 67-71, 73-74, 76-78) 또는 조합 서열들 (가령, MvF의 경우 서열 식별 번호: 53, 58, 61, 64, 그리고 HBsAg의 경우 서열 식별 번호: 72 및 75)의 형태로 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF 49-66) 및 B형 간염 표면 항원 (HBsAg 67-79)로부터 유래된 최적화된 인공적인 Th 에피토프다. 상기 조합된 최적화 인공적인 Th 에피토프는 이러한 특정 펩티드의 경우 상동체의 가변 잔기들을 기반으로 펩티드 프레임워크 내 특이적 위치에 제시되는 아미노산 잔기 혼합물을 함유한다. 조합 펩티드들의 어셈블리(assembly)는 합성 과정에서 명시된 위치에 있는 하나의 특정 아미노산 대신, 명시된 보호 아미노산의 혼합물을 추가시킴으로써, 하나의 프로세스로 합성할 수 있다. 이러한 조합 이질성 Th 에피토프 펩티드 어셈블리는 다양한 유전적 배경을 갖는 동물들을 위한 광범위한 Th 에피토프 적용이 가능할 수 있다. 이질성 Th 에피토프 펩티드의 대표적인 조합 서열들에는 서열 식별 번호: 서열 식별 번호: 53, 58, 61, 64, 72, 그리고 75이 내포되며, 이들은 표 6에 나타낸다. 본 발명의 Th 에피토프 펩티드는 유전적으로 다양한 집단의 동물들과 환자들에게 광범위한 반응성 및 면역원성을 제공한다.
c. 이질성 스페이서
상기 기술된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 상기 이질성 T 헬퍼 세포 (Th) 에피토프에 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드를 공유적으로 연계시키는 이질성 스페이서를 선택적으로 함유한다.
상기 논의된 바와 같이, 용어 "이질성"이란 S-RBD의 천연형 서열의 일부가 아니거나, 또는 이와 상동성을 갖지 않는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, S-RBD의 천연 아미노산 서열은 해당 스페이서가 상기 S-RBD 서열에 이질성이기 때문에, 이러한 이질성 스페이서가 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 공유적으로 연계될 때, N-말단 또는 C-말단 방향으로 연장되지 않는다.
상기 스페이서는 두 개 아미노산 및/또는 펩티드를 함께 연계시킬 수 있는 임의의 분자 또는 화학 구조다. 상기 스페이서는 용도에 따라, 길이 또는 극성이 가변적일 수 있다. 상기 스페이서 부착은 아미드-링키지 또는 카르복실-링키지를 통하여 이루어질 수 있지만, 다른 기능기도 가능하다. 상기 스페이서에는 화학적 화합물, 자연-발생적 아미노산, 또는 자연-발생적이 아닌 아미노산이 내포될 수 있다.
상기 스페이서는 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에 구조적 특징을 제공할 수 있다. 구조적으로, 상기 스페이서는 상기 Th 에피토프를 상기 S-RBD 단편의 B 세포 에피토프와 물리적으로 분리시킨다. 상기 스페이서에 의한 물리적 분리는 상기 Th 에피토프를 상기 B 세포 에피토프에 연결시켜 만들어지는 임의의 인공적인 이차 구조를 분열시킬 수 있다. 또한, 상기 스페이서에 의한 에피토프의 물리적 분리는 Th 세포 반응 및/또는 B 세포 반응 간의 간섭을 제거할 수 있다. 더욱이, 상기 스페이서는 상기 펩티드 면역원 구조체의 이차 구조를 창출시키도록 또는 변형시키도록 기획될 수 있다. 예를 들면, Th 에피토프와 B 세포 에피토프 간의 분리가 고양시키기 위해, 스페이서가 유연성 힌지 역할을 하도록 기획될 수 있다. 유연성 힌지 스페이서는 제시된 펩티드 면역원과 적합한 Th 세포 및 B 세포 간의 보다 효율적인 상호작용을 또한 허용할 수 있고, Th 에피토프 및 B 세포 에피토프에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 유연성 힌지를 인코딩하는 서열의 예로는 흔히, 프롤린이 풍부한 면역글로불린 중쇄 힌지 영역에서 볼 수 있다. 스페이서로 이용될 수 있는 특별히 유용한 한 가지 유연성 힌지는 서열 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 식별 번호: 103)에 의해 제공되며, 여기에서 Xaa는 임의의 아미노산이며, 바람직하게는 아스파르트산이다.
상기 스페이서는 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에 기능적 특징을 또한 제공할 수 있다. 예를 들면, 상기 스페이서는 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 용해도에 영향을 미칠 수 있는 해당 펩티드 면역원 구조의 전체 전하를 변경하도록 기획될 수 있다. 추가로, S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 전체 전하를 변경시키면, 다른 화합물 및 시약들과 연합하는 펩티드 면역원 구조체의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, S-RBD 펩티드 면역원 구조체는 정전기적 연합을 통하여, 고-하전된 올리고뉴클레오티드, 이를 테면, CpG 올리고머와 안정적인 면역자극 복합체로 형성될 수 있다. 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 전체 전하는 이러한 안정적인 면역자극 복합체의 형성에 중요하다.
스페이서로 이용될 수 있는 화학적 화합물에는 다음의 것들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: (2-아미노에톡시)아세트산(AEA), 5-아미노발레르산(AVA), 6-아미노카프로산(Ahx), 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(AEEA, 미니-PEG1), 12-아미노-4,7,10-트리옥사도데칸산(미니-PEG2), 15-아미노-4,7,10,13-테트라옥사펜타데칸산(미니-PEG3), 트리옥사트리데칸-숙신산(Ttds), 12-아미노-도데칸산, Fmoc-5-아미노-3-옥사펜탄산(O1Pen), 그리고 이와 유사한 것들.
자연-발생적 아미노산에는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린이 내포된다.
자연-발생적이 아닌 아미노산에는 다음의 것들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: ε-N 리신, β-알라닌, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 티록신, γ-아미노 부티르산, 호모세린, 시트룰린, 아미노벤조산, 6-아미노카프로산 (Aca; 6-아미노헥사노익산), 히드록시프롤린, 메르캅토프로피온산 (MPA), 3-니트로-티로신, 피로글루탐산, 그리고 이와 유사한 것들.
상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에서 스페이서는 Th 에피토프와 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 N-말단 또는 C- 말단 단부에서 공유적으로 연계될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 스페이서는 Th 에피토프의 C-말단 단부, 그리고 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 N-말단 단부에 공유적으로 연계된다. 다른 구체예들에서, 상기 스페이서는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 C-말단 단부, 그리고 Th 에피토프의 N-말단 단부에 공유적으로 연계된다. 특정 구체예들에서, 예를 들면, 하나 이상의 Th 에피토프가 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에 존재할 때, 하나 이상의 스페이서가 이용될 수 있다. 하나 이상의 스페이서가 이용될 때, 각 스페이서는 서로 동일하거나, 또는 각각 상이할 수 있다. 추가적으로, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에 하나 이상의 Th 에피토프가 존재할 때, 이 Th 에피토프는 동일한 또는 서로 상이한 스페이서와 분리되어 있을 수 있거나, 상기 스페이서를 이용하여 Th 에피토프를 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드와 분리시킬 수 있다. Th 에피토프 또는 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드와 관련하여, 스페이서의 배열에는 제한이 없다.
특정 구체예들에서, 상기 이질성 스페이서는 자연-발생적 아미노산 또는 자연-발생적이 아닌 아미노산이다. 다른 구체예들에서, 상기 스페이서는 하나 이상의 자연-발생적 또는 자연-발생적이 아닌 아미노산을 함유한다. 특이적 구체예들에서, 상기 스페이서는 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α,ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101), 또는 Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102)이다.
d. S-RBD 펩티드 면역원 구조체들의 특이적 구체예들
특정 구체예들에서, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 다음의 식으로 나타낼 수 있다:
(Th)m-(A)n-(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-X
또는
(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-(A)n-(Th)m-X
또는
(Th)m-(A)n-(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-(A)n-(Th)m-X
이때
Th는 이질성 T 헬퍼 에피토프이며;
A는 이질성 스페이서이며;
(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)는 S-RBD (서열 식별 번호: 226 또는 227), 또는 SARS-CoV-2를 중화시킬 수 있는, 또는 S-RBD가 이의 수용체 ACE2에 결합하는 것을 저해시킬 수 있는 항체를 만들 수 있는 이의 변이체로부터 6 ~ 35개 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프 펩티드이며;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이며;
m은 1 ~ 약 4이며; 그리고
n은 0 ~ 약 10이다.
상기 B 세포 에피토프 펩티드는 서열 식별 번호: 226로 나타낸 전장의 S-RBD 폴리펩티드의 일부분으로부터 약 6 ~ 약 35개 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 B 세포 에피토프는 표 3 및 표 13에서 제시된, 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에서 상기 이질성 Th 에피토프는 표 6에 나타낸 서열 식별 번호: 49-100중 임의의 것으로부터 선택된, 그리고 이의 조합으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에 하나 이상의 Th 에피토프가 존재한다.
상기 선택적 이질성 스페이서는 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 식별 번호: 103), ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102), 그리고 이의 임의의 조합으로부터 선택되며, 여기에서 Xaa는 임의의 아미노산이지만, 그러나 아스파르트산이 선호된다. 특이적 구체예들에서, 상기 이질성 스페이서는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101) 또는 Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102)이다.
특정 구체예들에서, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체는 표 8에 나타낸 서열 식별 번호: 107-144중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
Th 에피토프를 포함하는 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 S-RBD 단편과 나란하게, 단일 고형-상 펩티드 합성에서 동시에 생성된다. Th 에피토프에는 Th 에피토프의 면역학적 유사체가 또한 내포된다. 면역학적 Th 유사체는 면역-강화 유사체, 교차-반응성 유사체, 그리고 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 대한 면역 반응을 향상 또는 자극하기에 충분한 이들 Th 에피토프 중 임의의 에피포트의 세그먼트들이 내포된다.
상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에서 Th 에피토프는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 N-말단 또는 C- 말단 단부에서 공유적으로 연계될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Th 에피토프는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 N-말단 단부에 공유적으로 연계된다. 다른 구체예들에서, 상기 Th 에피토프는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 C-말단 단부에 공유적으로 연계된다. 특정 구체예들에서, 하나 이상의 Th 에피토프는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 공유적으로 연계된다. 하나 이상의 Th 에피토프가 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 연계될 때, 각 Th 에피토프는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 보유할 수 있다. 또한, 하나 이상의 Th 에피토프가 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 연계될 때, 해당 Th 에피토프는 임의의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들면, 상기 Th 에피토프는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 N-말단 단부에 연속적으로 연계될 수 있거나, 또는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 C-말단 단부에 연속적으로 연계될 수 있거나, 또는 Th 에피토프는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 N-말단 단부에 공유적으로 연계되면서, 한편으로 별개 Th 에피토프는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 C-말단 단부에 공유적으로 연계된다. 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드와 관련하여 Th 에피토프의 배열에는 제한이 없다.
일부 구체예들에서, 상기 Th 에피토프는 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 직접적으로 공유적으로 연계된다. 다른 구체예들에서, 상기 Th 에피토프는 상기 S-RBD 단편에 이질성 스페이서를 통하여 공유적으로 연계된다.
e. 변이체, 상동체, 그리고 기능성 유사체
바람직한 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 대한 항체를 유도하고, 및/또는 교차-반응하는 면역원성 펩티드 구조체들의 변이체 및 유사체가 또한 사용될 수 있다. 대립유전자, 종 및 유도된 변이체를 포함한 유사체는 아미노산 치환으로 인하여, 1개, 2개 또는 소수의 위치에서 자연적으로 발생되는 펩티드들과는 일반적으로 상이하다. 유사체들은 전형적으로 천연 펩티드와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 유사체들에는 이들의 하나, 둘 또는 몇 개 위치에서 비-천연 아미노산 또는 N-말단 아미노산 또는 C-말단 아미노산의 변형이 또한 내포된다.
기능성 유사체인 변이체들은 아미노산 위치에서 치환을 가질 수 있고; 전체 하전에서의 변화를 가질 수 있으며; 또다른 모이어티에 공유적 부착을 가질 수 있거나; 또는 아미노산 추가, 삽입, 또는 결손을 가질 수 있거나; 및/또는 이의 임의의 조합을 가질 수 있다.
보존적 치환은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 화학적 속성들을 갖는 또다른 아미노산 잔기로 치환될 때 보존적 치환이다. 예를 들면, 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 내포되며; 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 내포되며; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 내포되며; 그리고 음으로 하전된 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 내포된다.
특정 구체예에서, 상기 기능성 유사체는 원래 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성을 갖는다. 또다른 구체예에서, 상기 기능성 유사체는 원래 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 기능성 유사체는 원래 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는다. 여전히 또다른 구체예에서, 상기 기능성 유사체는 원래 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는다.
상기 Th 에피토프 펩티드의 기능성 면역학적 유사체 또한 효과적이며, 본 발명의 일부분으로 내포된다. 기능적 면역학적 Th 유사체에는 Th 에피토프에서 1 ~ 약 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환, 추가, 결손 및 삽입이 내포될 수 있는데, 이들은 Th 에피토프의 Th-자극 기능을 본질적으로 변형시키지 않는다. 이러한 보존적 치환, 추가, 그리고 삽입은 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드에 대해 상기 기재된 바와 같이, 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산으로 달성될 수 있다. 표 6은 Th 에피토프 펩티드에 대한 기능적 유사체의 또 다른 변형을 확인한다. 특히, MvF1 및 MvF2 Th의 서열 식별 번호: 54와 55는 차례로 MvF4 및 MvF5의 서열 식별 번호: 62-64 및 65의 기능성 유사체이며, 이때 이들은 N-말단 및 C- 말단에서 각각 두 아미노산의 결손(서열 식별 번호: 54 및 55) 또는 함입(서열 식별 번호: 62-64 및 65)에 의해 아미노산 프레임에서 상이하다. 이들 두 개 일련의 유사 서열 간의 차이는 이들 서열 내에 함유된 Th 에피토프의 기능에 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 기능성 면역학적 Th 유사체에는 홍역 바이러스 융합 단백질 MvF1-4 Ths (서열 식별 번호: 54-64) 및 간염 표면 단백질 HBsAg 1-3 Ths (서열 식별 번호: 67-76)로부터 유래된 몇 가지 형태의 Th 에피토프가 내포된다.
2. 조성물
본 명세서는 상기 기술된 S-RBD 면역원 펩티드 구조체들을 포함하는 조성물들을 또한 제공한다.
a. 펩티드 조성물
상기 기술된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 조성물은 액체 또는 고체/냉동건조된 형태일 수 있다. 액체 조성물에는 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들의 구조적 속성 또는 기능적 속성을 변경시키지 않는, 물, 완충액, 용매, 염, 및/또는 임의의 기타 허용되는 시약들이 내포될 수 있다. 펩티드 조성물은 상기 기술된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 하나 또는 그 이상 함유할 수 있다.
b. 약제학적 조성물
본 명세서는 상기 기술된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 약제학적 조성물에 또한 관계한다.
약제학적 조성물은 약제학적으로 수용가능한 전달 시스템에 담체 및/또는 기타 부가물을 함유할 수 있다. 따라서, 약제학적 조성물은 약제학적으로-수용가능한 담체, 어쥬번트, 및/또는 기타 부형제 이를 테면, 희석제, 부가제, 안정화제, 보존제, 가용화제, 완충제, 그리고 이와 유사한 것들과 함께, 약제학적으로 유효량의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 특이적 항원 효과 자체를 갖지 않으면서, S-RBD 펩티드 면역원 구조체에 대한 면역 반응을 가속화시키고, 연장시키고, 또는 향상시키는 작용(들)을 하는 하나 또는 그 이상의 어쥬번트를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물에 사용되는 어쥬번트에는 오일, 오일 에멀젼, 알루미늄 염, 칼슘 염, 면역 자극 복합체, 박테리아 및 바이러스 유도체, 비로좀(virosomes), 탄수화물, 사이토킨, 중합체성 마이크로입자가 내포될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 다음으로부터 선택될 수 있다: 명반(인산 알루미늄 칼륨), 인산 알루미늄(예: ADJU-PHOS®), 수산화 알루미늄(예: ALHYDROGEL®), 인산칼슘, 불완전 프로인트 어쥬번트(IFA), 프로인트 완전 어쥬번트, MF59, 보조제 65, Lipovant, ISCOM, 리포신, 사포닌, 스쿠알렌, L121, EMULSIGEN®, EmulsIL-6n®, 모노포스포릴 지질 A(MPL), Quil A, QS21, MONTANIDE® ISA 35, ISA 50V, ISA 50V2, ISA 51, ISA 206, ISA 720, 리포솜, 리포솜 펩티도글리칸, 지질다당류(LPS), ASO1, ASO2, ASO3, ASO4, AF03, 친유성 인지질 (지질 A), 감마 이눌린, 알가물린, 글루칸, 덱스트란, 글루코만난, 갈락토만난, 레반, 자일란, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA), 뿐만 아니라 기타 어쥬번트 및 유화제.
일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 MONTANIDE™ ISA 51(유-중-수 에멀젼의 생산을 위한 식물성 오일 및 만니드 올레이트로 구성된 오일 어쥬번트 조성물), TWEEN® 80(또한, 폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트로 알려짐), CpG 올리고뉴클레오티드, 및/또는 이들의 임의의 조합을 함유한다. 다른 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 어쥬번트로서, EMULSIGEN 또는 EMULSIGEN D를 갖는 수-중-유-중-수(즉, w/o/w) 에멀젼이다.
약제학적 조성물에는 약제학적으로 수용가능한 부가제 또는 부형제가 또한 내포될 수 있다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 항산화제, 결합제, 완충제, 증량제, 담체, 킬레이트제, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 충전제, 겔형성제, pH 완충제, 보존제, 가용화제, 안정제, 그리고 이와 유사한 것들을 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 즉시 방출 제형, 또는 지속 방출 제형으로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 상기 약제학적 조성물은 면역원 포획 및 미립자와의 공동-투여를 통한, 전신 또는 국소 점막 면역의 유도를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 전달 시스템는 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
약제학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액의 주사제로 제조될 수 있다. 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 액체 비히클이 또한 주사-전, 준비될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 임의의 적합한 투여 방식, 예를 들어 i.d., i.v., i.p., i.m., 비강내, 경구, 피하 등등, 그리고 임의의 적합한 전달 장치로 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 피하, 피내(intradermal) 또는 근육내 투여용으로 제형화된다. 경구 및 비강내 투여를 비롯한 다른 투여 방식에 적합한 약제학적 조성물이 또한 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 적합한 투약 단위형(dosage unit form)으로 제형화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 체중 kg당 약 0.1μg ~ 약 1mg의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유한다. 상기 약제학적 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 그리고 해당 환자가 인간인지 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 그리고 처치가 예방을 위한 것인지, 또는 치료를 위한 것인지 등을 비롯한 다수의 상이한 요인에 따라 가변적이다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 그러나, 유전자삽입된 포유류를 비롯한, 비-인간 포유류도 또한 치료할 수 있다. 다중 투여량으로 전달되는 경우, 약제학적 조성물은 투약 단위형당 적합한 양으로 편리하게 분할될 수 있다. 투여되는 투약량은 치료 분야에 잘 알려진 바와 같이 대상체의 연령, 체중 및 전반적인 건강 상태에 따라 달라질 것이다.
일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유한다. 하나 이상의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 혼합물을 함유하여, 이들 구조체의 면역 효능의 상승적 향상을 허용하는 약제학적 조성물. 하나 이상의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약제학적 조성물은 광범위한 MHC 클래스 II 적용 범위로 인해, 더 큰 유전자 집단에서 더 효과적일 수 있고, 따라서 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에게 개선된 면역 반응을 제공한다.
일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 표 8의 서열 식별 번호: 107-144, 뿐만 아니라 상동체, 유사체 및/또는 이의 조합으로부터 선택된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유할 수 있다.
특정 구체예들에서, MvF 및 HBsAg로 부터 유래된, 조합 형태의 이질성 Th 에피토프 (서열 식별 번호: 59-61, 67-72)와 함께, S-RBD 펩티드 면역원 구조체들 (서열 식별 번호: 126 및 127)은 다양한 유전적 배경을 갖는 숙주 집단의 최대 적용 범위를 허용하는 제형에 사용하기 위해 등가-몰비로 혼합될 수 있다.
더욱이, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들 (가령, UBITh®1을 이용; 서열 식별 번호: 107-116)에 의해 유도된 항체 반응은 면역원성 강화를 위해 이용된 이질성 Th 에피토프를 지향하는 것이 많지 않고(만약 있더라도), S-RBD의 B 세포 에피토프 펩티드에 대항하는 원하는 교차-반응성에 거의 집중된다(>90%). 이것은 이러한 S-RBD 펩티드 면역원성 향상에 사용되는 기존의 단백질, 이를 테면, KLH 또는 기타 생물학적 단백질 담체와 극명한 대조를 이룬다.
다른 구체예들에서, 현탁액 제형을 만들기 위해, 어쥬번트로서 명반 겔(ALHYDROGEL) 또는 인산 알루미늄(ADJUPHOS)을 비롯하여, 미네랄 염들과 접촉하는 펩티드 조성물, 예를 들어, S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 숙주에게 투여하는데 사용하였다.
S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약제학적 조성물을 이용하여 투여시 숙주에서 면역 반응을 유도하고, 항체를 만들 수 있다.
c. 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 펩티드 및 CTL 에피토프 펩티드를 또한 함유하는 약제학적 조성물
S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약제학적 조성물에는 이들 펩티드 면역원 구조체와는 별도의 (즉, 이 펩티드에 공유적으로 연계되지 않은) 내생성 SARS-CoV-2 T 헬퍼 에피토프 펩티드 및/또는 CTL 에피토프 펩티드들이 또한 내포될 수 있다. 약제학적/백신 제형 안에 Th 에피토프 및 CTL 에피토프가 존재함으로써 항원 특이적 T 세포 활성화가 개시됨으로써 치료받게 되는 대상체에서 면역 반응을 프라이밍시키고, 이것이 SARS-CoV-2 감염으로부터 보호하는 것과 관련된다. 추가적으로, SARS-CoV-2의 단백질에 제시된 신중하게 선택된 내생성 Th 에피토프 및/또는 CTL 에피토프가 내포된 제형은 광범위한 세포-매개된 면역을 생성할 수 있고, 이로써 다양한 유전적 구성을 갖는 대상체를 치료하고, 보호하는 데 이 제형은 효과적이 된다.
S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 약제학적 조성물 안에 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 및/또는 CTL 에피토프를 함유하는 하나 또는 그 이상의 별개 펩티드가 내포됨으로써 해당 펩티드들이 서로 밀접하게 접촉되며, 이로 인하여 항원 제공 B 세포, 대식세포, 수지상 세포, 등등에 의해 상기 에피토프들을 보고, 처리할 수 있게 된다. 이들 세포는 항원을 처리하고, 항체 생성을 위한 B 세포와, 바이러스 감염된 세포의 사멸을 매개하는 데 도움이 되는 추가 T 세포 반응을 촉발시키는 T 세포와 접촉하도록 표면에 제시한다.
일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체와는 별개의 하나 또는 그 이상의 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 펩티드를 함유한다. 특정 구체예들에서, 상기 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 펩티드는 SARS-CoV-2의 N 단백질 또는 S 단백질이다. 특이적 구체예들에서, 상기 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 펩티드는 서열 식별 번호: 13, 39-41, 그리고 44 (표 5), 서열 식별 번호: 161-165 (표 8), 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 서열 식별 번호: 161-165 (표 8)의 상기 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 펩티드는 차례로 서열 식별 번호: 39, 40, 44, 41, 그리고 13의 서열에 대응하나, N-말단에는 Lys-Lys-Lys (KKK) 꼬리를 함유한다. 서열 식별 번호: 161-165의 상기 내생성 Th 에피토프는 CpG 올리고뉴클레오티드 (ODN)와 면역자극 복합체로 제형화된 약제학적 조성물에 이용될 때 특히 유용한데, 그 이유는 양이온성 KKK 꼬리는 정전기적 연합을 통해 CpG ODN과 상호작용할 수 있기 때문이다. 상기 펩티드 면역원 구조체에서 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프의 사용으로 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 면역원성을 강화시킬 수 있고, 감염시, 최적화된 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드를 지향하고, 설계 이론적 근거를 기반으로 선별 및 선택된, 특이적인 고-역가 항체의 생산을 촉진시킬 수 있다.
다른 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체와는 별개의 하나 또는 그 이상의 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 펩티드를 함유한다. 특정 구체예들에서, 상기 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 펩티드는 SARS-CoV-2의 N 단백질 또는 S 단백질이다. 특이적 구체예에서, 상기 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 펩티드는 서열 식별 번호: 9-12, 14-16, 19, 35-36, 42-43, 45-48 (표 4), 서열 식별 번호: 145-160 (표 8), 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 서열 식별 번호: 145-160의 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 펩티드는 차례로 서열 식별 번호: 45, 42, 46, 36, 48, 43, 47, 35, 12, 11, 10, 14, 19, 9, 16, 그리고 15의 서열에 대응하나, N-말단에 Lys-Lys-Lys (KKK) 꼬리를 함유한다. 서열 식별 번호: 145-160의 상기 내생성 CTL 에피토프는 CpG 올리고뉴클레오티드 (ODN)와 면역자극 복합체로 제형화된 약제학적 조성물에 이용될 때 특히 유용한데, 그 이유는 양이온성 KKK 꼬리는 정전기적 연합을 통해 CpG ODN과 상호작용할 수 있기 때문이다. 상기 펩티드 면역원 구조체에서 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프의 사용으로 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 면역원성을 강화시킬 수 있고, 감염시, 최적화된 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드를 지향하고, 설계 이론적 근거를 기반으로 선별 및 선택된, 특이적인 고-역가 항체의 생산을 촉진시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 펩티드 (서열 식별 번호: 13, 39-41, 44, 161-165, 또는 이의 임의의 조합) 및/또는 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 펩티드 (서열 식별 번호: 9-12, 14-16, 19, 35-36, 42-43, 45-48, 145-160, 또는 이의 임의의 조합)를 함유하는 하나 또는 그 이상의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들 (서열 식별 번호: 107-144 또는 이의 임의의 조합)을 함유한다.
d. 면역자극성 복합체
본 명세서는 CpG 올리고뉴클레오티드와 함께 면역자극성 복합체 형태로 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 약제학적 조성물에 또한 관계한다. 이러한 면역자극성 복합체들은 어쥬번트 및/또는 펩티드 면역원 안정제로 작용하도록 특별히 개작된다. 상기 면역자극성 복합체들은 미립자 형태로써, S-RBD 펩티드 면역원을 면역계의 세포에 효율적으로 제시하여 면역 반응을 일으킬 수 있다. 상기 면역자극 복합체는 비-경구(parenteral) 투여용 현탁액으로 제형화될 수 있다. 상기 면역자극 복합체는 비-경구 투여 후, 숙주의 면역계 세포로 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 효율적인 전달을 위해, 미네랄 염 또는 제-자리(in-situ) 겔형성 중합체와 복합된 현탁액으로서, 유중수(w/o) 에멀젼의 형태로 제형화될 수 있다.
상기는 안정화된 면역자극성 복합체는 S-RBD 펩티드 면역원 구제체들이 정전기적 연합을 통해 음이온성 분자, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합과 함께 복합체화함으로써, 형성될 수 있다. 상기 안정화된 면역자극성 복합체는 면역원 전달 시스템으로 약제학적 조성물에 통합될 수 있다.
특정 구체예들에서, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체는 pH5.0 ~ 8.0 범위에서 양으로 하전된 양이온 부분을 함유하도록 기획된다. 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체, 또는 구조체들의 혼합물의 양이온 부분 상의 순 전하는 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) 각각의 경우 전하 +1, 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E) 각각의 경우 전하 -1, 그리고 해당 서열의 다른 아미노산 각각의 경우 전하 0을 할당함으로써 산출된다. 상기 전하는 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 양이온 부분 내에서 합산되고, 평균 순 전하로 표시된다. 적합한 펩티드 면역원은 +1의 순 평균 양전하를 갖는 양이온 부분을 갖는다. 바람직하게는, 상기 펩티드 면역원은 +2보다 더 큰 범위의 순 양전하를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 양이온 부분은 이질성 스페이서이다. 특정 구체예들에서, 상기 스페이서 서열이 (α,ε-N)Lys, (α,ε-N)-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101), 또는 Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102)일 때, 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 양이온 부분은 +4이다.
본원에 기재된 "음이온 분자"는 pH 5.0-8.0 범위에서 음으로 하전된 임의의 분자를 지칭한다. 특정 구체예들에서, 상기 음이온 분자는 올리고머 또는 중합체다. 올리고머 또는 중합체의 순 음전하는 올리고머의 각 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 그룹에 대해 전하 -1을 할당하여 산출된다. 적합한 음이온 올리고뉴클레오티드는 8~64개의 뉴클레오타이드 염기를 가진 단일 가닥 DNA 분자이며, 이때 CpG 모티프의 반복 횟수는 1~10 범위다. 바람직하게는, CpG 면역자극성 단일-가닥으로 된 DNA 분자들은 18-48개 뉴클레오티드 염기를 함유하며, 이때 CpG 모티프의 반복 횟수는 3~8 범위다.
더욱 바람직하게는, 상기 음이온 올리고뉴클레오티드는 다음 식으로 나타낸다: 5' X1CGX2 3' 이때 C 및 G는 메틸화되지 않았고; 그리고 X1은 A (아데닌), G (구아닌) 및 T (티민)으로 구성된 군에서 선택되며; 그리고 X2는 C (시토신) 또는 T (티민)이다. 또는, 상기 음이온 올리고뉴클레오티드는 다음 식으로 나타낸다: 5' (X3)2CG(X4)2 3' 이때 C 및 G는 메틸화되지 않았고; 그리고 X3은 A, T 또는 G로 구성된 군에서 선택되며; 그리고 X4는 C 또는 T이다. 특이적 구체예들에서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드는 CpG1의 서열을 갖는다: 5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT TTg TCg TT 3' (완전하게 포스포로티오에이트화됨) (서열 식별 번호: 104), CpG2: 5' 인산염 TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3' (완전하게 포스포로티오에이트화됨) (서열 식별 번호: 105), 또는 CpG3 5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3' (완전하게 포스포로티오에이트화됨) (서열 식별 번호: 106).
생성된 면역자극 복합체는 일반적으로 1-50 마이크론 범위의 크기를 갖는 입자 형태이며, 상대 전하 화학량론 및 상호 작용 종의 분자량을 비롯한 많은 기능 인자의 함수다. 미립자화된 면역자극 복합체는 생체내 특이적 면역 반응의 어쥬번트화 (adjuvantation) 및 상향 조절을 제공하는 이점이 있다. 추가적으로, 상기 안정화된 면역자극성 복합체는 유-중-수 에멀젼, 미네랄 염 현탁액 및 중합체 겔을 비롯한 다양한 공정에 의해 약제학적 조성물을 제조하는 데 적합하다.
본 명세서는 또한 COVID-19의 예방 및/또는 치료를 위한 제형을 비롯한, 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 약제학적 조성물은 안정화된 면역자극성 복합체를 포함하고, 이 조성물은 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들의 면역원성을 더 강화시키고, 서열 식별 번호: 226의 S-RBD 결합 부위 또는 이의 단편들, 이를 테면, 서열 식별 번호: 26과 교차-반응성인 항체들을 유도하기 위해, 정전기적 연합을 통하여 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들 (가령, 서열 식별 번호: 107-144) 혼합물을 함유하는 펩티드 조성물과 CpG 올리고머를 혼합시켜 형성된다.
여전히 다른 구체예들에서, 약제학적 조성물은 숙주에게 투여하기 위한 현탁액 제형을 만들기 위해 높은 안전 계수를 갖는 어쥬번트로써 명반 겔 (ALHYDROGEL) 또는 인산 알루미늄 (ADJUPHOS)을 비롯한, 미네랄 염과 선택적으로 혼합된 CpG 올리고머와 안정화된 면역자극성 복합체 형태의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들의 혼합물 (가령, 서열 식별 번호: 107-144의 임의의 조합)을 함유한다.
3. 항체
본 명세서는 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들에 의해 유도된 항체들을 또한 제공한다.
본 명세서는 SARS-CoV-2에 대한 고-역가 중화 항체를 유도할 수 있고, S-RBD가 이의 수용체 ACE2에 결합을 억제할 수 있고, 면역접종된 숙주에서 높은 반응율을 갖는 최적의 기획안으로, 그리고 제조 비용면에서 효과적인 S-RBD 펩티드 면역원 구조체 및 이의 제형을 제공한다. 일부 구체예들에서, 항체를 유도하는 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 병원성 단백질들, 이를 테면, 홍역 바이러스 융합 (MVF) 단백질 및 기타 (가령, 표 6의 서열 식별 번호: 49-100) 및/또는 SARS-CoV-2 유래된 내생성 Th 에피토프 (표 5의 서열 식별 번호: 13, 39-41, 그리고 44, 그리고 표 8의 161-165)로부터 유래된 이질성 Th 에피토프에 선택적 이질성 스페이서를 통하여 연계된 전장의 S-RBD (서열 식별 번호: 226) 안에 SARS-CoV-2 S480-509 영역 (서열 식별 번호: 26) 주변에 있는 S-RBD 부위를 표적으로 하는 S-RBD 펩티드 하이브리드를 포함한다. 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들의 상기 B 세포 에피토프 펩티드 및 Th 에피토프 펩티드는 함께 전장의 S-RBD 부위 (서열 식별 번호: 226) 또는 이의 단편들 (가령, 서열 식별 번호: 26)과 교차-반응하는 특이성이 매우 높은 항체 생성을 자극한다.
펩티드를 면역강화시키기 위한 전통적인 방법, 이를 테면, 담체 단백질, 예를 들면, 키홀 림페트 헤모시아닌 (KLH) 또는 기타 담체 단백질들 이를 테면, 디프테리아 톡소이드 (DT) 및 테타누스 톡소이드 (TT) 단백질들에 화학적 커플링을 통한 방법으로 일반적으로 이들 담체 단백질에 대항하여 이를 지향하는 다량의 항체가 생성된다. 따라서, 이러한 펩티드-담체 단백질 조성물의 주요 결함은 이 면역원에 의해 생성된 항체의 대부분 (>90%)은 해당 담체 단백질 KLH, DT 또는 TT에 대항하여 이를 지향하는 비-기능성 항체들이며, 이는 에피토프 억제로 이어질 수 있다.
펩티드를 면역강화시키는 전통적인 방법과 달리, 상기 기술된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들 (가령, 서열 식별 번호: 107-144)로부터 생성된 항체들은 전장의 S-RBD 부위 (서열 식별 번호: 226) 또는 이의 단편들 (가령, 서열 식별 번호: 26)에 높은 특이성으로 결합할 수 있으며, 상기 이질성 Th 에피토프 (가령, 서열 식별 번호: 49-100), 상기 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 (서열 식별 번호: 13, 39-41,44, 그리고 161-165), 또는 선택적 이질성 스페이서에 대항하여 이를 지향하는 항체들은 거의 없다(만약 있다고 하더라도).
4. 방법
본 명세서는 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들, 조성물, 그리고 약제학적 조성물을 만들고, 이를 이용하는 방법에 또한 관계한다.
a. 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 제작하는 방법
상기 기술된 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 통상의 기술자에게 잘 알려진 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있다 (가령, Fields, G.B., et al., 1992 참고). 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 예를 들어, Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A 또는 431에서 측쇄 보호된 아미노산을 사용하여, t-Boc 또는 F-moc 화학에 의해 보호된 α-NH2를 사용하여 고형-상 합성의 자동화된 Merrifield 기술을 사용하여 합성할 수 있다. Th 에피토프에 대한 조합 라이브러리 펩티드를 포함하는 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 제조는 주어진 가변 위치에서 커플링을 위한 대체 아미노산의 혼합물을 제공함으로써 달성될 수 있다.
원하는 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 완전한 어셈블리 후, 수지는 이 수지로부터 펩티드를 절단하기 위한 표준 절차에 따라 처리될 수 있고, 아미노산 측쇄 상의 기능기들은 차단-해제될 수 있다. 유리(free) 펩티드는 HPLC에 의해 정제될 수 있고, 생화학적으로 특징화, 예를 들어, 아미노산 분석 또는 시퀀싱에 의해 특징화될 수 있다. 펩티드에 대한 정제 및 특징화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
이런 화학 공정에 의해 생성된 펩티드의 품질을 관리하고, 특정할 수 있으며, 결과적으로 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 재생산성, 면역원성 및 수율을 확보할 수 있다. 고형-상 펩티드 합성을 통한 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 제조에 대한 상세한 설명은 실시예 1에서 제공된다.
의도된 면역학적 활성 보유를 허용하는 구조적 가변성 범위는 작은 분자 약물에 의한 특이적 약물 활성 보유, 또는 생물학적으로-유래된 약물들과 공동-생산된 큰 분자에서 발견되는 원하는 활성과 원치않는 독성을 보유를 위해 허용되는 구조적 가변성 범위 이상으로 훨씬 더 편의적인 것으로 밝혀졌다.
따라서, 의도적으로 기획된, 또는 의도한 펩티드와 유사한 크로마토그래피 및 면역학적 속성을 갖는 결손 서열 부산물들의 혼합물로써 합성 과정에서 실수로 불가피하게 만들어진 펩티드 유사체는 대개 해당 원하는 펩티드의 정제된 조제물만큼 효과적이다. 기획된 유사체들과 의도하지 않은 유사체 혼합물은 이러한 펩티드들을 사용하는 최종 제품의 재현성과 효능을 보장하기 위한 감식력을 갖춘 QC 절차가 제조 공정과 제품 평가 과정을 모두 모니터링하기 위해 개발되는 한, 효과적이다.
상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 핵산 분자, 벡터 및/또는 숙주 세포를 비롯한 재조합 DNA 기술을 사용하여 또한 만들 수 있다. 이와 같이, S-RBD 펩티드 면역원 구조체 및 이의 면역학적 기능 유사체를 인코딩하는 핵산 분자도 본 발명의 일부로서 본 명세서에 포괄된다. 유사하게, 핵산 분자를 비롯한 발현 벡터를 비롯한 벡터, 뿐만 아니라 이들 벡터를 함유하는 숙주 세포도 본 발명의 일부로서 본 명세서에 포괄된다.
예시적인 다양한 구체예들은 S-RBD 펩티드 면역원 구조체 및 이의 면역학적 기능적 유사체를 생산하는 방법을 또한 포괄한다. 예를 들면, 방법에은 S-RBD 펩티드 면역원 구조체 및/또는 이의 면역학적 기능 유사체를 인코딩하는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 이들 펩티드 및/또는 유사체가 발현되는 조건에서 배양하는 단계가 내포될 수 있다. 더 긴 합성 펩티드 면역원은 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 수 있다. 이러한 기술은 자세한 프로토콜과 함께 잘 알려진 표준 매뉴얼에 제공된다. 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 유전자를 구축하기 위해, 이들 아미노산 서열은 이 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 얻기 위해, 바람직하게는 해당 유전자가 발현되는 유기체에 최적인 코돈으로 역-해독된다. 다음으로, 합성 유전자는 일반적으로 필요한 경우, 펩티드 및 임의의 조절 요소를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 만들어진다. 합성 유전자는 적합한 클로닝 벡터에 삽입되고, 숙주 세포에 형질감염된다. 그 다음, 이 펩티드는 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적합한 적절한 조건 하에 발현된다. 이 펩티드는 표준 방법으로 정제되고, 특징화된다.
b. 면역자극성 복합체 제조 방법
예시적인 다양한 구체예들은 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들과 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 분자를 포함하는 면역자극성 복합체를 만드는 방법을 또한 포괄한다. 안정화된 면역자극성 복합체 (ISC)는 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 양이온 부분 및 다중음이온 CpG ODN 분자로부터 유래된다. 자가-어셈블리 시스템은 전하의 정전기적 중화에 의해 구동된다. S-RBD 펩티드 면역원 구조체의 양이온성 부분 대비 음이온성 올리고머의 몰 전하 비율의 화학량론은 연합 정도를 결정한다. S-RBD 펩티드 면역원 구조체와 CpG ODN의 비-공유적 정전기적 연합은 전적으로 재현가능한 과정이다. 상기 펩티드/CpG ODN 면역자극성 복합체 응집체(aggregates)는 면역계의 "전문적인" 항원 제시 세포(APC)에 제공을 촉진시키고, 따라서 이들 복합체의 면역원성이 더욱 향상된다. 이러한 복합체는 제조 중 품질 관리를 위해 쉽게 특징화된다. 상기 펩티드/CpG ISC는 생체내에서 잘 용인된다. CpG ODN 및 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 포함하는 이러한 신규 미립자 시스템은 CpG ODN 사용과 관련된 일반화된 B 세포 유사분열성의 이점을 이용하고, 균형 잡힌 Th-1/Th-2 유형 반응을 촉진하도록 설계되었다.
상기 기술된 약제학적 조성물내 CpG ODN은 반대 전하의 정전기 중화에 의해 매개되는 과정에서 면역원에 100% 결합되어, 마이크론-크기 미립자가 형성된다. 미립자 형태는 CpG 어쥬번트의 통상적인 사용시 CpG의 용량을 상당히 감소시키고, 선천성 역작용 면역 반응의 가능성을 줄이며, 그리고 항원 제시 세포(APC)를 비롯한 대체 면역원 처리 경로를 용이하게 만든다. 결과적으로, 그러한 제형은 개념적으로 새롭고, 대체 기전에 의한 면역 반응의 자극을 촉진함으로써 잠재적인 이점을 제공한다.
c. 약제학적 조성물 제조 방법
예시적인 다양한 구체예들은 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 약제학적 조성물을 또한 포괄한다. 특정 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 유중수 에멀젼 및 미네랄 염 현탁액을 사용한다.
약제학적 조성물이 큰 집단에서 사용되기 위해서는 안전성도 고려해야 할 또 다른 중요한 요소가 된다. 많은 임상 시험에서 유-중-수 에멀젼이 사용되었음에도 불구하고, 명반(Alum)은 안전성으로 인해 제형에 사용하기 위한 주요 어쥬번트로 유지된다. 따라서, 명반 또는 이의 미네랄 염 인산 알루미늄(ADJUPHOS)은 임상 적용을 위한 조제에서 어쥬번트제로 자주 사용된다.
다른 어쥬번트 및 면역자극제에는 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (MPL) 또는 3-DMP, 중합체 또는 단량체 아미노산, 예를 들어, 폴리글루탐산 또는 폴리리신이 내포된다. 이러한 어쥬번트들은 다른 특이적 면역자극제, 이를 테면, 무라밀 펩티드 (가령, N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (노르-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸무라밀-L-Al-D-이소글루-L-Ala-디팔리톡시 프로필아미드 (DTP-DPP) THERAMIDE™), 또는 기타 박테리아 세포 벽 구성요소들과 함께, 또는 이러한 자극제없이 이용될 수 있다. 수-중-유 에멀젼에는 5% 스쿠알렌, 0.5% TWEEN 80, 그리고 0.5% Span 85 (선택적으로 다양한 양의 MTP-PE를 함유함)을 함유하는, 미세유동화기를 이용한 서브-마이크론 미립자로 제형화된 MF59 (Van Nest, G., et al.,의 WO 1990/014837 참고, 이의 전문이 본원의 참고자료에 편입됨); 10% 스쿠알렌, 0.4% TWEEN 80, 5% 플루로닉-블록화된 중합체 L121, 그리고 thr-MDP를 함유하고, 서브-마이크론 에멀젼으로 미세유동화되거나, 또는 더 큰 입자 크기 에멀젼을 생성하기 위해 볼텍스거친 SAF; 그리고 2% 스쿠알렌, 0.2% TWEEN 80, 그리고 모노포스포릴지질 A (MPL), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 그리고 세포 벽 골격 (CWS), 바람직하게는 MPL+CWS (Detox™)으로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 박테리아 세포 벽 구성요소들을 함유하는, RIBI™ 어쥬번트 시스템 (RAS) (RIBI ImmunoChem, Hamilton, Mont.)이 내포된다. 기타 어쥬번트에는 프로인트 완전 어쥬번트 (CFA), 프로인트 불완전 어쥬번트 (IFA), 그리고 사이토킨, 이를 테면, 인터루킨 (IL-1, IL-2, 그리고 IL-12), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 그리고 종양 괴사 인자 (TNF-α)가 내포된다.
어쥬번트의 선택은 어쥬번트를 함유하는 면역원성 제형의 안정성, 투여 경로, 투여 일정, 면역접종받게 되는 종에 대한 어쥬번트의 효능에 따라 달라지며, 그리고 인간에서 약제학적으로 수용가능한 어쥬번트는 관련 규제 기관의 승인을 받았거나, 또는 인간에게 투여할 수 있도록 승인받을 수 있는 것이다. 예를 들면, 명반, MPL 또는 프로인트 불완전 어쥬번트(Chang, J.C.C., et al., 1998) (이의 전문이 본원에 참고자료에 편입됨) 단독으로, 또는 선택적으로 이들의 모든 조합이 인간 투여에 적합하다.
상기 조성물에는 동물 또는 인간에게 투여하기 위한 약제학적 조성물을 제형화하는데 통상적으로 사용되는 비히클로서 특정되는 약제학적으로-허용되는 무-독성 담체 또는 희석제들이 내포될 수 있다. 상기 희석제는 해당 조합의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리학적 인산염-완충 식염수, 링거 용액, 포도당 용액 및 행크(Hank) 용액이다. 또한, 상기 약제학적 조성물 또는 제형에는 다른 담체, 보조제, 또는 무-독성의 비-치료요법적, 비-면역원성 안정화제, 그리고 이와 유사한 것들이 또한 내포될 수 있다.
약제학적 조성물에는 크고, 서서히 대사되는 거대분자들, 이를 테면, 단백질들, 단백질, 키토산과 같은 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(가령, 라텍스 작용화된 세파로스, 아가로스, 셀룰로스 및 이와 유사한 것들), 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 지질 응집체(가령, 오일 방울 또는 리포솜)이 또한 내포될 수 있다. 추가적으로, 이들 담체는 면역자극제(즉, 어쥬번트)로 기능할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에는 적합한 전달 비히클이 더 내포될 수 있다. 적합한 전달 비히클에는 바이러스, 박테리아, 생분해성 미소구체, 미세입자, 나노입자, 리포솜, 콜라겐 미니펠렛 및 코크리트(cochleates)가 내포되지만, 이에 국한되지는 않는다.
일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 펩티드 (서열 식별 번호: 13, 39-41, 44, 161-165, 또는 이의 임의의 조합) 및/또는 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 펩티드 (서열 식별 번호: 9-12, 14-16, 19, 35-36, 42-43, 45-48, 145-160, 또는 이의 임의의 조합)를 함유하는 하나 또는 그 이상의 별개 펩티드와 하나 또는 그 이상의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들 (서열 식별 번호: 107-144 또는 이의 임의의 조합)을 CpG ODN를 함유하는 면역자극성 복합체 형태로 복합시킴으로써 준비된다.
d. 약제학적 조성물을 이용하는 방법
본 명세서는 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 약제학적 조성물을 이용하는 방법들이 또한 내포된다.
특정 구체예들에서, S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 상기 약제학적 조성물은 COVID-19의 예방 및/또는 치료에 이용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 약제학적으로 유효량의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 숙주에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 S-RBD의 전장의 서열 (서열 식별 번호: 226) 안에 SARS-CoV-2 S480-509 영역 (서열 식별 번호: 26) 주변에 있는 S-RBD 부위, 또는 기타 코로나바이러스 (가령, SARS-CoV 또는 MERS-CoV)의 S-RBD 서열과 교차-반응하는 매우 특이적인 항체를 유발시키기 위해, 약제학적으로 유효량의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 포함하는 약제학적 조성물을 온혈 동물 (가령, 인간, 히말라야원숭이, 기니아 피그, 마우스, 고양이, 등등)에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 구체예들에서, S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 상기 약제학적 조성물은 SARS-CoV-2에 의한 감염으로 인한 COVID-19를 예방하는데 이용될 수 있다.
e. 시험관내 기능성 분석 및 생체 내 개념 증명 연구
S-RBD 펩티드 면역원 구조체에 의해 면역화된 숙주에서 유도된 항체는 시험관내 기능 검정에서 사용될 수 있다. 이러한 기능 분석에는 다음이 내포되지만, 이에 국한되지는 않는다:
(1) ELISA 분석을 비롯한 혈청학적 분석법에 의해 S-RBD (서열 식별 번호: 226) 안에 S-RBD 부위 (서열 식별 번호: 26)으로의 시험관내 결합;
(2) S-RBD가 이의 수용체 ACE2로 결합하는 것을 시험관내 억제;
(3) 숙주 세포의 SARS-CoV-2에 의해 매개된 감염의 시험관내 중화;
(4) 동물 모델에서 면역접종된 숙주에게서 SARS-CoV-2 매개된 감염의 생체내 예방
5. 특이적 구체예들
(1) 약 20개 또는 그 이상의 아미노산을 갖고, 다음 식으로 나타내는 S-RBD 펩티드 면역원 구조체:
(Th)m-(A)n-(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-X
또는
(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-(A)n-(Th)m-X
또는
(Th)m-(A)n-(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-(A)n-(Th)m-X
이때
Th는 이질성 T 헬퍼 에피토프이며;
A는 이질성 스페이서이며;
(S-RBD B 세포 에피토프 펩티드)는 S-RBD (서열 식별 번호: 226)의 6~약 35개 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프 펩티드, 또는 이의 변이체이며;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이며;
m은 1 ~ 약 4이며; 그리고
n은 0 ~ 약 10이다.
(2) (1)에 따른 S-RBD 펩티드 면역원 구조체, 이때 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드는 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 그리고 29-34로 구성된 군에서 선택된 에피토프를 국소적으로 속박시키는 내부-이황화결합을 형성한다.
(3) (1)에 따른 S-RBD 펩티드 면역원 구조체, 이때 상기 이질성 T 헬퍼는 서열 식별 번호: 49-100로 구성된 군에서 선택된다.
(4) (1)에 따른 S-RBD 펩티드 면역원 구조체, 이때 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드는 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319로 구성된 군에서 선택되며, 상기 Th 에피토프는 서열 식별 번호: 49-100로 구성된 군에서 선택된다.
(5) (1)에 따른 S-RBD 펩티드 면역원 구조체, 이때 상기 펩티드 면역원 구조체는 서열 식별 번호: 107-144로 구성된 군에서 선택된다.
(6) 다음을 포함하는, S-RBD 펩티드 면역원 구조체:
a. 서열 식별 번호: 226의 S-RBD 서열에서 약 6 ~ 약 35개 아미노산 잔기를 포함하는 B 세포 에피토프;
b. 서열 식별 번호: 49-100으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 그리고 이의 임의의 조합을 포함하는 이질성 T 헬퍼 에피토프; 그리고
c. 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α,ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102), 그리고 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 식별 번호: 103), 그리고 이의 임의의 조합로 구성된 군에서 선택된 선택적 이질성 스페이서,
이때 상기 B 세포 에피토프는 T 헬퍼 에피토프에 직접적으로, 또는 선택적 이질성 스페이서를 경유하여 공유적으로 연계된다.
(7) (6)의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체, 이때 상기 B 세포 에피토프는 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319로 구성된 군에서 선택된다.
(8) (6)의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체, 이때 상기 선택적 이질성 스페이서는 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102), 또는 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 식별 번호:103)이며, 여기에서 Xaa는 임의의 아미노산이다.
(9) (6)의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체, 이때 상기 T 헬퍼 에피토프는 상기 B 세포 에피토프의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 공유적으로 연계된다.
(10) (6)의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체, 이때 상기 T 헬퍼 에피토프는 상기 선택적 이질성 스페이서를 통하여 B 세포 에피토프의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 공유적으로 연계된다.
(11) (1)에 따른 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 포함하는 조성물.
(12) 다음을 포함하는 약제학적 조성물:
a. (1)에 따른 펩티드 면역원 구조체; 그리고
b. 약제학적으로 수용가능한 전달 비히클 및/또는 어쥬번트.
(13) (12)의 약제학적 조성물, 이때
a. 상기 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드는 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319로 구성된 군에서 선택되며;
b. 상기 이질성 T 헬퍼 에피토프는 서열 식별 번호: 49-100으로 구성된 군에서 선택되며; 그리고
c. 상기 이질성 스페이서는 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α,ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102), 그리고 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 식별 번호: 103), 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되며; 그리고
이때 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되어 안정화된 면역자극성 복합체를 형성한다.
(14) (12)의 약제학적 조성물, 이때
a. 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체는 서열 식별 번호: 107-144로 구성된 군에서 선택되며; 그리고
이때 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되어 안정화된 면역자극성 복합체를 형성한다.
(15) (14)의 약제학적 조성물, 이때 상기 약제학적 조성물은 서열 식별 번호: 13, 39-41, 44, 161-165의 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 서열, 또는 이의 임의의 조합을 함유하는 별개 펩티드를 더 함유한다.
(16) (14)의 약제학적 조성물, 이때 상기 약제학적 조성물은 서열 식별 번호: 9-12, 14-16, 19, 35-36, 42-43, 45-48, 145-160의 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 서열, 또는 이의 임의의 조합을 함유하는 별개 펩티드를 더 함유한다.
(17) (14)의 약제학적 조성물, 이때 상기 약제학적 조성물은 다음을 더 함유한다:
a. 서열 식별 번호: 13, 39-41, 44, 161-165의 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 서열, 또는 이의 임의의 조합을 함유하는 별개 펩티드; 그리고
b. 서열 식별 번호: 9-12, 14-16, 19, 35-36, 42-43, 45-48, 145-160의 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 서열, 또는 이의 임의의 조합을 함유하는 별개 펩티드
(18) (12)에 따른 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 S-RBD에 대항하는 항체를 생성시키는 방법.
(19) (15)에 따른 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 S-RBD에 대항하는 항체를 생성시키는 방법.
(20) (16)에 따른 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 S-RBD에 대항하는 항체를 생성시키는 방법.
(21) (17)에 따른 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 S-RBD에 대항하는 항체를 생성시키는 방법.
(22) 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 또는 226의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(23) (22)에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체에 결합한다.
(24) (22)에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 조성물.
(25) COVID-19를 예방 및/또는 치료하는 방법으로, 이 방법은 (12)의 약제학적 조성물을 이 동물에게 투여하는 것을 포함한다.
(26) COVID-19를 예방 및/또는 치료하는 방법으로, 이 방법은 (15)의 약제학적 조성물을 이 동물에게 투여하는 것을 포함한다.
(27) COVID-19를 예방 및/또는 치료하는 방법으로, 이 방법은 (16)의 약제학적 조성물을 이 동물에게 투여하는 것을 포함한다.
(28) COVID-19를 예방 및/또는 치료하는 방법으로, 이 방법은 (17)의 약제학적 조성물을 이 동물에게 투여하는 것을 포함한다.
C. 감염된 환자들에게서 COVID-19를 치료하기 위한 수용체-기반 항바이러스 치료요법
상기 기술된 구제 체계의 세번째 측면은 감염 환자들에게서 COVID-19를 치료하기 위한 수용체-기반 항바이러스 치료요법에 관한 것이다.
본 명세서는 생활성 분자와 면역글로불린 분자의 일부분을 포함하는 신규한 융합 단백질에 관계한다. 본 명세서의 다양한 측면은 융합 단백질들, 이의 조성물, 그리고 상기 기술된 융합 단백질들을 만들고, 이용하는 방법에 관계한다. 상기 기술된 융합 단백질들은 유기체에서 생활성 분자들의 혈청 반감기 연장에 유용하다.
다음은 당업자가 본 발명을 실시하는 데 도움이 되도록 제공된 상세한 설명이다. 당업자는 여기에 포함된 정보의 정신 또는 범위를 벗어나지 않는, 본 명세서에서 명시적으로 설명된 실시예의 수정 또는 변형이 본 명세서에 포함된다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 하기에 사용된 섹션 제목은 오로지 구획을 구분하려는 목적을 위함이며, 서술된 주제를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
1. 융합 단백질
본원에 사용된 "융합 단백질" 또는 "융합 폴리펩티드"는 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 방식으로 함께 연결된 적어도 두 개의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드이다.
본 명세서의 한 측면은 면역글로불린 (Ig) Fc 단편과 생활성 분자를 포함하는 융합 단백질에 관계한다. 개시된 융합 단백질에 혼입된 생활성 분자는 융합되지 않은, 또는 선행 기술에 기재된 융합 단백질 (가령, 2개 쇄 Fc 영역을 함유하는 융합 단백질)에 혼입된 동일한 생활성 분자와 비교하였을 때, 개선된 생물학적 특성을 갖는다. 예를 들면, 개시된 융합 단백질에 혼입된 생활성 분자는 융합되지 않은 대응물에 비해, 더 긴 혈청 반감기를 갖는다. 추가적으로, 상기 기술된 융합 단백질은 기능적 감소 없이, 해당 생활성 분자의 완전한 생물학적 활성을 유지시키고, 이것은 2개 쇄 Fc 영역으로 인한 입체적 방해로 인하여 활성이 감소된 선행 기술의 융합 단백질에 비해 개선된 것이다.
본 명세서의 융합 단백질은 융합안된 생물활성 분자 및 선행 기술에 기재된 융합 단백질에 혼입된 생물활성 분자와 비교하여, 해당 생물활성 분자에 상당한 생물학적 이점을 제공한다.
상기 기술된 융합 단백질은 다음 식들중 임의의 것을 가질 수 있다(도 6A-6D에 또한 도시됨):
(B)-(힌지)-(CH2-CH3)
또는
(CH2-CH3)-(힌지)-(B)
또는
(B)-(L)m-(힌지)-(CH2-CH3)
또는
(CH2-CH3)-(힌지)-(L)m-(B)
이때
"B"는 생활성 분자이고;
"힌지"는 IgG 분자의 힌지 영역이며;
"CH2-CH3"는 IgG 중쇄의 CH2 및 CH3 불변 영역 도메인이며;
"L"은 선택적 링커이며; 그리고
"m"은 임의의 정수 또는 0일 수 있다.
상기 융합 단백질의 다양한 부분/단편들은 하기에서 추가 논의된다.
a. Fc 영역 및 Fc 단편
본 명세서의 융합 단백질은 면역글로불린 (Ig) 분자의 Fc 단편을 함유한다.
하기에서 사용된 바와 같이, "Fc 영역"이란 중쇄 불변 영역의 c-말단에 위치한 면역글로불린의 일부를 지칭한다. Fc 영역은 면역계 활성화를 돕기 위해, 세포 표면 수용체(Fc 수용체) 및 보체 시스템의 다른 단백질과 상호작용하는 면역글로불린의 부분이다. IgG, IgA 및 IgD 아이소형에서, 상기 Fc 영역은 두 개의 중쇄 도메인 (CH2 도메인과 CH3 도메인)을 함유한다. IgM 및 IgE 아이소형에서, 상기 Fc 영역은 세 개의 중쇄 불변 도메인 (CH2 도메인~ CH4 도메인)을 함유한다. Fc 부분의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 부분은 일반적으로 잔기 C226 또는 P230에서 카르복실 말단까지를 포함하는 것으로 정의되며, 이때 번호매김은 EU 지표에 따른다.
특정 구체예들에서, 상기 융합 단백질은 FcRn 결합 단편이며, 순환계로 재순환될 수 있는 CH2-CH3 도메인을 포함한다. 이 도메인을 갖는 융합 단백질들은 이들 융합 단백질들의 생체내 반감기 증가를 나타낸다.
본원에 사용된, "Fc 단편"은 임의의 아이소형으로부터의 면역글로불린 분자의 Fc 영역에 상응하는 융합 단백질의 부분을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc 단편은 IgG의 Fc 영역을 포함한다. 특이적 구체예들에서, 상기 Fc 단편은 IgG1의 전체 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc 단편은 당업계에 특성화되고, 기술된 바와 같은 면역글로불린 분자의 전장 Fc 영역을 지칭한다. 다른 구체예들에서, 상기 Fc 단편에는 전장의 Fc 영역의 일부분 또는 단편, 이를 테면, 중쇄 도메인 (가령, CH2 도메인, CH3 도메인, 등등)의 일부분 및/또는 상기 Fc 영역에서 전형적으로 발견되는 힌지 영역이 내포된다. 예를 들면,의 Fc 단편은 CH2 도메인의 전부 또는 일부 및/또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc 단편에는 전장의 Fc 영역 또는 이의 일부분의 기능성 유사체가 내포된다.
본원에 사용된 "기능성 유사체"란 원래 서열과 실질적으로 동일한 기능성 특징들 (결합 인지, 결합 친화력, 등등)을 유지시키는 아미노산 서열 또는 핵산 서열 변이체를 지칭한다. 기능성 유사체의 예시로는 원래 서열과 유사하지만, 그러나, 아미노산 위치에서 보존적 치환; 전체 하전에서의 변화; 다른 모이어티에 공유적 부착; 또는 소수의 추가, 삽입, 결손 또는 보존적 치환 및/또는 이의 임의의 조합을 갖는 서열들이 내포된다. 상기 Fc 단편의 기능성 유사체는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 합성에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들면, 기능성 유사체는 부위-지향적 돌연변이에 의한 아미노산의 추가, 결손, 및/또는 치환으로 공지 아미노산 서열을 변형시켜 만들 수 있다. 일부 구체예들에서, 기능성 유사체는 주어진 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 두 서열 간의 동일성 퍼센트는 두 서열이 정렬 알고리즘, 이를 테면, ClustalOmega와 같은 표준 정렬 알고리즘에 따라 가장 잘 정렬될 때 결정된다.
상기 면역글로불린 분자는 임의의 동물 (가령, 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 렛, 기니아 피그)로부터 얻거나 또는 유래될 수 있다. 추가적으로, 면역글로불린의 Fc 단편은 임의의 아이소형 (가령, IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM) 또는 아이소형 안의 하위클라스 (IgG1, IgG2, IgG3, 그리고 IgG4)로부터 얻거나 또는 유래될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc 단편은 IgG로부터 얻거나 또는 유래될 수 있고, 특정 구체예들에서, 상기 Fc 단편은 인간화된 IgG를 비롯한 인간 IgG로부터 얻거나 또는 유래될 수 있다.
상기 Fc 단편은 당분야에 공지된 방법을 이용하여 얻거나 또는 만들 수 있다. 예를 들면, 상기 Fc 단편은 동물로부터 단리 및 정제될 수 있고, 재조합적으로 발현되거나 또는 합성적으로 생산될 수 있다. 일부 구체예들에서, Fc 단편은 핵산 분자(가령, DNA 또는 RNA)에 인코딩되고 세포, 생식선, cDNA 라이브러리 또는 파아지 라이브러리로부터 단리된다.
상기 Fc 영역 및/또는 Fc 단편에는 일부 면역글로불린 아이소형 (IgA, IgD, 그리고 IgG)에서 발견되는 힌지 영역이 내포될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 Fc 단편은 Cys를 함유하지 않고, 이황화 결합을 형성할 수 없도록 힌지 영역을 돌연변이시킴으로써, 변형된다. 상기 힌지 영역은 하기에서 더 논의된다.
상기 기술된 융합 단백질의 Fc 단편은 바람직하게는 단일 쇄 Fc이다. 본원에 사용된 "단일 쇄 Fc" ("sFc")은 Fc 단편이 이량체를 형성하는 것을 방지하는 방식으로 변형(예를 들어, 화학적 변형 또는 부가, 결실 또는 치환에 의한 아미노산의 돌연변이)되는 것을 지칭한다.
특정 구체예들에서, 상기 융합 단백질의 Fc 단편은 인간 IgG1로부터 유래되며, 여기에는 야생형 인간 IgG1 아미노산 서열 또는 이의 변이들이 내포될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 융합 단백질의 Fc 단편은 고유의 인간 IgG1 분자의 아미노산 위치 297에서 (U.S. 특허 번호 7,501,494에서 논의된 IgG1에 대한 유럽 번호매김 체계를 기반으로) N-당화 부위로 기능하는 Asn (N) 아미노산을 함유하며, 이는 Fc 단편 (서열 식별 번호: 231) (표 11에 나타냄)에서 잔기 67에 상응한다. 다른 구체예들에서, 상기 Fc 단편에서 N-당화 부위는 Asn (N) 잔기를 His (H) (서열 식별 번호: 232) 또는 Ala (A) (서열 식별 번호: 233) (표 11)으로 돌연변이시켜, 제거할 수 있다. 상기 N-당화 부위에 가변적 위치를 함유하는 Fc 단편은 표 11에서 서열 식별 번호: 234로 나타낸다.
일부 구체예들에서, 상기 Fc 단편의 CH3-CH2 도메인은 야생형 서열 (서열 식별 번호: 231에서 개시된)에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구체예들에서, 상기 Fc 단편의 CH3-CH2 도메인은 서열 식별 번호: 232의 아미노산 서열을 갖고, 여기에서 N-당화 부위는 Asn (N) 잔기를 His (H)로 돌연변이시킴으로써, 제거된다. 특정 구체예들에서, 상기 Fc 단편의 CH3-CH2 도메인은 서열 식별 번호: 233의 아미노산 서열을 갖고, 여기에서 N-당화 부위는 Asn (N) 잔기를 Ala (A)로 돌연변이시킴으로써, 제거된다.
b. 힌지 영역
상기 기술된 융합 단백질에는 일부 면역글로불린 아이소형 (IgA, IgD, 그리고 IgG)에서 발견되는 힌지 영역이 내포될 수 있다. 상기 힌지 영역은 Fc 영역을 Fab 영역과 분리시키고, 해당 분자에 유연성을 부가하며, 그리고 이황화결합을 통하여 두 개 중쇄를 연계시킬 수 있다. 2개의 CH2-CH3 도메인을 포함하는 이량체의 형성이 온전한 Fc 영역에 의해 제공되는 기능에 요구된다. 야생형 힌지 영역에서 시스테인 사이의 사슬-간(interchain) 이황화 결합은 기능 단위를 창출하도록 Fc 분자의 두 쇄의 유지를 지원한다.
특정 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 IgG, 바람직하게는 IgG1로부터 유래된다. 상기 힌지 영역은 전장의, 또는 변형된 (절두된) 힌지 영역일 수 있다.
특이적 구체예들에서, 상기 힌지 영역은 상기 융합 단백질이 또다른 융합 단백질 또는 면역글로불린 분자와 이황화결합 형성을 방해하는 변형을 함유한다. 특이적 구체예들에서, 이황화결합 형성을 방해하기 위해 하나 또는 그 이상의 시스테인 아미노산을 돌연변이시킴으로써, 및/또는 결손시킴으로써 상기 힌지 영역은 변형된다. 전장의 힌지 영역의 N-말단 또는 C-말단이 결손되어, 절두된 힌지 영역이 형성될 수 있다. 이황화결합 형성을 회피하기 위해, 상기 힌지 영역에서 시스테인 (Cys)은 Cys이외의 아미노산으로 치환되거나, 또는 결손될 수 있다. 특이적 구체예들에서, 힌지 영역의 Cys는 Ser, Gly, Ala, Thr, Leu, Ile, Met 또는 Val으로 치환될 수 있다. IgG1~IgG4까지의 야생형 힌지 영역과 돌연변이된 힌지 영역의 예시에는 표 9에 나타낸 아미노산 서열(서열 식별 번호: 166-187)이 내포된다. 돌연변이된 서열을 함유하는 두 힌지 영역 사이에서 이황화 결합은 형성될 수 없다. IgG1 힌지 영역은 표 10에 나타낸 서열(서열 식별 번호: 188-225)을 갖는 다양하게 돌연변이된 힌지 영역을 수용하도록 변형되었다.
c. 링커
상기 융합 단백질은 상기 Fc 단편의 N-말단에 연계된 생활성 분자를 보유할 수 있다. 대안으로, 상기 융합 단백질은 상기 Fc 단편의 C-말단에 연계된 생활성 분자를 보유할 수 있다. 상기 링키지는 공유 결합이며, 바람직하게는 펩티드 결합이다.
본 발명에서, 하나 또는 그 이상의 생활성 분자는 상기 Fc 단편의 C-말단 또는 N-말단에 직접적으로 연계될 수 있다. 바람직하게는, 상기 생활성 분자(들)은 상기 Fc 단편의 힌지에 직접적으로 연계될 수 있다.
추가적으로, 상기 융합 단백질은 선택적으로 적어도 한 개 링커를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 생활성 분자는 상기 Fc 단편에 직접적으로 연계되지 않을 수 있다. 상기 링커는 상기 생활성 분자와 상기 Fc 단편 사이에 끼어있을 수 있다. 상기 링커는 상기 Fc 단편의 N-말단 또는 상기 Fc 단편의 C-말단에 연계될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 링커에는 아미노산이 내포된다. 상기 링커에는 1-5개 아미노산이 내포될 수 있다.
d. 생활성 분자
본원에 사용된 "생물학적으로 활성 분자"란 세포로 바이러스 진입에 연루된 SARS-CoV-2 또는 숙주-수용체의 단백질로부터 유래된 단백질이거나, 또는 이들 단백질의 일부분을 지칭한다. 생물학적으로 활성 분자들의 예시에는 2019-CoV, 인간 수용체 ACE2 (hACE2)의 스파이크 (S), 외피 (E), 막 (M), 그리고 뉴클레오켑시드 (N) 단백질, 및/또는 이의 단편들이 내포된다.
한 구체예에서, 상기 생물학적으로 활성 분자는 SARS-CoV-2의 S 단백질 (서열 식별 번호: 20)이다. 특정 구체예들에서, 상기 생물학적으로 활성 분자는 SARS-CoV-2의 S 단백질 (S-RBD 또는 S1-RBD)의 수용체 결합 도메인 (RBD) (서열 식별 번호: 226)이며, 이는 전장의 S 단백질의 아미노산 잔기 331-530에 상응한다. 특정 구체예들에서, 서열 식별 번호: 226의 S-RBD 서열의 위치 61과 위치 195의 시스테인 (C) 잔기는 서열 식별 번호: 227에 나타낸 것과 같이 알라닌 (A) 잔기로 돌연변이된다 (S-RBD의 잔기 61과 잔기 195는 서열 식별 번호: 20의 전장의 S 단백질의 잔기 391 및 잔기 525에 대응한다). 본 명세서에서 돌연변이된 S-RBD 서열은 S-RBDa로도 지칭된다. 상기 S-RBD 서열에서 C61A 돌연변이 및 C195A 돌연변이는 재조합 단백질 발현에서 이황화결합 형성 불일치를 회피하기 위해 도입된다.
또다른 구체예에서, 상기 생물학적으로 활성 분자는 인간 수용체 ACE2 (hACE2) (서열 식별 번호: 228)이다. 특정 구체예들에서, 상기 생물학적으로 활성 분자는 hACE2 (hACE2ECD)의 세포외 도메인 (ECD) (서열 식별 번호: 229)이며, 이는 전장의 hACE2 단백질의 아미노산 잔기 1-740에 대응한다. 일부 구체예들에서, 서열 식별 번호: 229의 hACE2ECD 서열에서 위치 374 및 위치 378의 히스티딘(H) 잔기는 서열 식별 번호: 230에 나타낸 것과 같이, 아스파리긴(N) 잔기로 돌연변이된다 (본원에서 ACE2NECD로도 지칭된다). H374N 돌연변이 및 H378N 돌연변이를 도입시켜 hACE2의 펩티다제 활성을 없앤다.
2. 조성물
특정 구체예들에서, 본 발명은 상기 융합 단백질, 그리고 약제학적으로 수용가능한 담체, 어쥬번트, 및/또는 기타 부형제 이를 테면, 희석제, 부가제, 안정화제, 보존제, 가용화제, 완충제, 그리고 이와 유사한 것들을 포함하는 약제학적 조성물을 비롯한, 조성물에 관계한다.
약제학적 조성물은 상기 융합 단백질에 선택적으로 약제학적으로 수용가능한 담체를 혼합시켜 만들어질 수 있다. 약제학적으로 수용가능한 담체에는 용매, 분산 매질, 등장성 제제 및 이와 유사한 것들이 내포된다. 담체의 예로는 물, 염 용액 또는 기타 완충제 (이를 테면, 인산염, 구연산염 완충제), 오일, 알코올, 단백질들 (이를 테면, 혈청 알부민, 젤라틴), 탄수화물 (이를 테면, 단당류, 이당류 및 포도당, 자당, 트레할로스, 만노스, 만니톨, 소르비톨 또는 덱스트린), 겔, 지질, 리포솜, 안정제, 방부제, 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제, 킬레이트제, 이를 테면, EDTA; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 비-이온성 계면활성제, 이를 테면, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 또는 이의 조합이 내포된다.
약제학적 조성물은 특이적 항원 효과 자체를 갖지 않으면서, 상기 융합 단백질에 대한 면역 반응을 가속화시키고, 연장시키고, 또는 향상시키는 작용(들)을 하는 하나 또는 그 이상의 어쥬번트를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물에 사용되는 어쥬번트에는 오일, 오일 에멀젼, 알루미늄 염, 칼슘 염, 면역 자극 복합체, 박테리아 및 바이러스 유도체, 비로좀(virosomes), 탄수화물, 사이토킨, 중합체성 마이크로입자가 내포될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 다음으로부터 선택될 수 있다: 명반(인산 알루미늄 칼륨), 인산 알루미늄(예: ADJU-PHOS®), 수산화 알루미늄(예: ALHYDROGEL®), 인산칼슘, 불완전 프로인트 어쥬번트(IFA), 프로인트 완전 어쥬번트, MF59, 보조제 65, Lipovant, ISCOM, 리포신, 사포닌, 스쿠알렌, L121, EMULSIGEN®, EmulsIL-6n®, 모노포스포릴 지질 A(MPL), Quil A, QS21, MONTANIDE® ISA 35, ISA 50V, ISA 50V2, ISA 51, ISA 206, ISA 720, 리포솜, 리포솜 펩티도글리칸, 지질다당류(LPS), ASO1, ASO2, ASO3, ASO4, AF03, 친유성 인지질 (지질 A), 감마 이눌린, 알가물린, 글루칸, 덱스트란, 글루코만난, 갈락토만난, 레반, 자일란, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA), 뿐만 아니라 기타 어쥬번트 및 유화제.
일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 MONTANIDE™ ISA 51(유-중-수 에멀젼의 생산을 위한 식물성 오일 및 만니드 올레이트로 구성된 오일 어쥬번트 조성물), TWEEN® 80(또한, 폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트로 알려짐), CpG 올리고뉴클레오티드, 및/또는 이들의 임의의 조합을 함유한다. 다른 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 어쥬번트로서, EMULSIGEN 또는 EMULSIGEN D를 갖는 수-중-유-중-수(즉, w/o/w) 에멀젼이다.
약제학적 조성물에는 약제학적으로 수용가능한 부가제 또는 부형제가 또한 내포될 수 있다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 항산화제, 결합제, 완충제, 증량제, 담체, 킬레이트제, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 충전제, 겔형성제, pH 완충제, 보존제, 가용화제, 안정제, 그리고 이와 유사한 것들을 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 즉시 방출 제형, 또는 지속 방출 제형으로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 상기 약제학적 조성물은 면역원 포획 및 미립자와의 공동-투여를 통한, 전신 또는 국소 점막 면역의 유도를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 전달 시스템는 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
약제학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액의 주사제로 제조될 수 있다. 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유하는 액체 비히클이 또한 주사-전, 준비될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 임의의 적합한 투여 방식, 예를 들어 i.d., i.v., i.p., i.m., 비강내, 경구, 피하 등등, 그리고 임의의 적합한 전달 장치로 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 피하, 피내(intradermal) 또는 근육내 투여용으로 제형화된다. 경구 및 비강내 투여를 비롯한 다른 투여 방식에 적합한 약제학적 조성물이 또한 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 적합한 투약 단위형(dosage unit form)으로 제형화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 체중 kg당 약 0.1μg ~ 약 1mg의 상기 융합 단백질을 함유한다. 상기 약제학적 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 그리고 해당 환자가 인간인지 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 그리고 처치가 예방을 위한 것인지, 또는 치료를 위한 것인지 등을 비롯한 다수의 상이한 요인에 따라 가변적이다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 그러나, 유전자삽입된 포유류를 비롯한, 비-인간 포유류도 또한 치료할 수 있다. 다중 투여량으로 전달되는 경우, 약제학적 조성물은 투약 단위형당 적합한 양으로 편리하게 분할될 수 있다. 투여되는 투약량은 치료 분야에 잘 알려진 바와 같이 대상체의 연령, 체중 및 전반적인 건강 상태에 따라 달라질 것이다.
일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 융합 단백질을 함유한다. 하나 이상의 융합 단백질 혼합물을 함유하여, 이들 융합 단백질의 면역 효능의 상승적 향상을 허용하는 약제학적 조성물. 하나 이상의 융합 단백질을 함유하는 약제학적 조성물은 광범위한 MHC 클래스 II 적용 범위로 인해, 더 큰 유전자 집단에서 더 효과적일 수 있고, 따라서 이 융합 단백질에게 개선된 면역 반응을 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 활성 화합물을 또한 함유할 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 하나 또는 그 이상의 융합 단백질 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가적인 유익한 화합물(들)을 함유할 수 있다. 상기 활성 성분은 예를 들어, 혼합물, 용액, 현탁액, 유화, 캡슐화, 흡수 등과 같은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로 담체와 조합될 수 있으며, 그리고 주사, 주입 등에 적합한 분말(동결건조 분말을 비롯하여), 현탁액과 같은 제제로 제조될 수 있다. 서방성(sustained-release) 제재로 또한 준비될 수 있다.
특정 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 인간에 사용을 위한 융합 단백질을 함유한다. 상기 약제학적 조성물은 적절한 pH에서 구연산염, 인산염, 트리스, BIS-Tris 등을 비롯한, 그러나 이에 국한되지 않는 적절한 완충액에서 제조될 수 있고, 또한 당 (50mM 내지 500mM의 수크로스, 트레할로스, 만니톨 또는 이들의 혼합물), 계면활성제 (가령, 0.025% ~ 0.5%의 TWEEN 20 또는 TWEEN 80), 및/또는 기타 시약들을 또한 함유할 수 있다. 다양한 양의 융합 단백질을 함유하도록 상기 제형을 만들 수 있다. 일반적으로, 대상체에게 투여하기 위한 제형은 약 0.1μg/mL ~ 약 200μg/mL을 함유한다. 특정 구체예들에서, 상기 제형들은 약 0.5μg/mL ~ 약 50μg/mL; 약 1.0μg/mL ~ 약 50μg/mL; 약 1μg/mL ~ 약 25μg/mL; 또는 약 10μg/mL ~ 약 25μg/mL의 융합 단백질을 함유할 수 있다. 특이적 구체예들에서, 상기 제형은 약 1.0μg/mL, 약 5.0μg/mL, 약 10.0μg/mL, 또는 약 25.0μg/mL의 융합 단백질을 함유한다.
3. 방법
본 발명의 또다른 측면은 융합 단백질 및 이의 조성물을 만들고, 이용하는 방법들에 관계한다.
a. 상기 융합 단백질 생산
일부 구체예들에서, 상기 융합 단백질을 만드는 방법은 다음을 포함한다: (i) 생활성 분자, 그리고 힌지 영역을 포함하는 Fc 단편을 제공하고, (ii) 이황화결합을 형성하는 것을 막기 위해 이 영역을 변형시키고, 그리고 (iii) 상기 융합 단백질, 이의 하이브리드, 이의 콘쥬게이트, 또는 이의 조성물이 형성되도록 하기 위해, sFc에 직접적으로, 또는 상기 돌연변이된 힌지 영역을 통하여 sFc에 간접적으로 상기 생활성 분자를 연계시킨다. 본 명세서는 상기 융합 단백질을 정제하는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (i) 융합 단백질을 제공하고, 그리고 (ii) 단백질 A 또는 단백질 G-기반 크로마토그래피 배지에서 이들 융합 단백질을 정제한다.
대안적으로, 상기 융합 단백질은 잘 알려진 분자 생물학 기술에 의해 발현될 수 있다. 분자 클로닝 기술에 대한 표준 매뉴얼은 재조합 DNA 및 RNA의 발현을 통하여 본 발명의 융합 단백질을 생산하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 유전자를 구축하기 위해, 아미노산 서열은 바람직하게는 유전자가 발현될 유기체에 대해 최적화된 코돈을 사용하여 핵산 서열로 역-해독된다. 다음으로, 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자는 일반적으로 융합 단백질 및 필요한 조절 요소를 인코딩하는 중첩 올리고뉴클레오티드를 합성하여 만든다. 합성 유전자를 어셈블리하여, 원하는 발현 벡터로 삽입한다. 본 발명에 포괄되는 합성 핵산 서열에는 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 것이 내포되며, 인코딩된 분자의 생물학적 활성을 변경하지 않는 넌-코딩 서열에서의 변화에 의해 특징화된 핵산 구조체들이 내포된다. 합성 유전자를 적합한 클로닝 벡터에 삽입하고, 재조합체를 얻고 특징화시킨다. 상기 융합 단백질은 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적합한 조건 하에서 발현된다. 상기 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G (가령, SOFTMAX®, ACROSEP®, SERA-MAG®, 또는 SEPHAROSE®)의 친화력 컬럼에서 정제된다.
본 발명의 융합 단백질은 포유동물 세포, 하등 진핵생물 또는 원핵생물에서 생산될 수 있다. 포유동물 세포의 예로는 원숭이 COS 세포, CHO 세포, 인간 신장 293 세포, 인간 표피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 3T3 세포, CV-1 세포, 기타 형질전환된 영장류 세포주, 정상적인 이배체(diploid) 세포, 일차 조직의 시험관내 배양으로부터 유래된 세포주, 일차 외식편, HeLa 세포, 마우스 L 세포, BHK, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포가 내포된다.
본 발명은 면역글로불린 G의 단일 사슬 Fc (sFc) 영역을 만드는 방법을 제공하는데, 이 방법은 또한 IgG의 Fc의 힌지 영역에서 Cys를 돌연변이, 치환 또는 결실시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, Cys는 Ser, Gly, The, Ala, Val, Leu, Ile, 또는 Met로 치환된다. 또다른 구체예에서, Cys는 결손된다. 추가적인 구체예에서, 상기 힌지의 단편은 결손된다.
본 발명은 융합 단백질을 만드는 방법을 더 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 생활성 분자, 그리고 힌지 영역을 포함하는 IgG Fc 단편을 제공하고, (b) 상기 힌지 영역을 아미노산 치환 및/또는 결손에 의한 돌연변이를 시켜, 이황화결합 형성없이 돌연변이된 Fc를 만들고, 그리고 (c) 상기 생활성 분자와 돌연변이된 Fc를 복합시킨다.
b. 상기 융합 단백질을 사용
상기 융합 단백질들을 함유하는 약제학적 조성물은 즉시 방출 제형, 또는 지속 방출 제형으로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 상기 약제학적 조성물은 면역원 포획 및 미립자와의 공동-투여를 통한, 전신 또는 국소 점막 면역의 유도를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 전달 시스템는 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
본 발명의 융합 단백질은 정맥내, 피하, 근육내, 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들어, 경구, 설하, 협측, 설하, 비강, 직장, 질 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 피하, 피내(intradermal) 또는 근육내 투여용으로 제형화된다. 경구 및 비강내 투여를 비롯한 다른 투여 방식에 적합한 약제학적 조성물이 또한 제조될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 투여분량은 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 요구되는 용량은 융합 단백질, 대상체의 종 및 대상체의 체격을 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 용량은 0.1~100,000μg/kg 체중 범위일 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 용량은 체중 kg당 약 0.1μg ~ 약 1mg의 상기 융합 단백질이다. 상기 융합 단백질은 단일 용량으로, 24시간 동안 여러 번 투여하거나, 연속 주입으로 투여할 수 있다. 상기 융합 단백질은 연속적으로 또는 특정 일정에 따라 투여될 수 있다. 유효한 투여분량은 동물 모델에서 얻은 투여분량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
4. 특이적 구체예들
본 발명의 특이적 구체예들에는 다음이 내포되나, 그러나 이에 국한되지 않는다:
(1) IgG 분자의 Fc 단편과 생활성 분자를 포함하는 융합 단백질, 이때 상기 Fc 단편은 단일 쇄 Fc (sFc)이다.
(2) (1)에 따른 융합 단백질, 이때 상기 Fc 단편은 힌지 영역을 포함한다.
(3) (2)에 따른 융합 단백질, 이때 상기 힌지 영역은 돌연변이되고, 이황화결합을 형성하지 않는다.
(4) (2)에 따른 융합 단백질, 이때 상기 힌지 영역은 서열 식별 번호: 166-225로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
(5) (2)에 따른 융합 단백질, 이때 상기 힌지 영역은 서열 식별 번호: 188의 아미노산 서열을 포함한다.
(6) (1)에 따른 융합 단백질, 이때 상기 생활성 분자는 서열 식별 번호: 226의 SARS-CoV-2로부터 S 단백질 (S-RBD)의 수용체 결합 도메인 (RBD)이거나, 또는 서열 식별 번호: 227의 S-RBD의 돌연변이된 형태이다
(7) (1)에 따른 융합 단백질, 이때 상기 생활성 분자는 서열 식별 번호: 228의 인간 수용체 ACE2의 세포외 도메인 (ECD) (ECD-hACE2), 또는 서열 식별 번호: 229의 ECD-hACE2의 돌연변이된 형태이다.
(8) (1)에 따른 융합 단백질, 이때 상기 생활성 분자는 돌연변이된 힌지 영역을 통하여 Fc 단편에 연계된다.
(9) (1)에 따른 융합 단백질, 이때 상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 235-238로 구성된 군에서 선택된다.
(10) (1) ~ (9)중 임의의 하나에 따른 융합 단백질과 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
(11) 융합 단백질을 생산하는 방법, 이 방법은 다음을 포함한다:
a) 생활성 분자, 그리고 힌지 영역을 포함하는 Fc 단편을 제공하고,
b) 상기 힌지 영역을 아미노산 치환 및/또는 결손에 의해 돌연변이시켜, 돌연변이된 Fc를 만들고, 그리고
c) 상기 생활성 분자와 돌연변이된 Fc를 복합시킨다.
(12) (11)에 따른 방법, 이때 상기 힌지 영역은 시스테인 잔기의 치환 및/또는 결손에 의해 돌연변이된다.
(13) (11)에 따른 방법, 이때 상기 생활성 분자는 상기 힌지 영역을 통하여 돌연변이된 Fc와 복합된다.
(14) (11)에 따른 방법, 이때 상기 생활성 분자는 서열 식별 번호: 226의 SARS-CoV-2로부터 S 단백질 (S-RBD)의 수용체 결합 도메인 (RBD)이거나, 또는 서열 식별 번호: 227의 S-RBD의 돌연변이된 형태이다.
(15) (11)에 따른 방법, 이때 상기 생활성 분자는 서열 식별 번호: 228의 인간 수용체 ACE2의 세포외 도메인 (ECD) (ECD-hACE2), 또는 서열 식별 번호: 229의 ECD-hACE2의 돌연변이된 형태이다.
본 발명의 추가적인 특이적 구체예들에는 다음의 실시예들이 내포되지만, 그러나, 이에 국한되지 않는다.
D. SARS-CoV-2에 의한 감염 예방용 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물
상기 기술된 구제 체계의 네 번째 측면은 SARS-CoV-2에 의한 감염 예방용 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물에 관계한다. 본원에서 기술된 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물은 또한 "UB-612"로 지칭된다.
1. S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질
현재 임상 시험 중인 대부분의 백신은 중화 항체 반응을 유도하기 위해 전장 S 단백질만을 표적으로 삼고 있다. T 세포 반응의 유도는 천연 다중유전자 SARS-CoV-2 감염에 의해 생성된 반응에 비교하여 제한적일 것이다. S1-RBD 영역은 SARS-CoV-2의 결정적인 구성요소다. 이 영역은 세포 부착에 필요하며, 매우 유사한 SARS-CoV 바이러스의 주요 중화 도메인을 나타내고, 전장 S 항원으로 달성할 수 없는 안전 한계를 제공하고, 치명적인 부작용의 가능성을 제거하는데, 이는 달리 효과적인 불-활성화된 RSV 백신의 중단으로 이어진다. 따라서, FDA 긴급 사용 승인을 통해 승인된 신규 진단된 COVID-19 치료용 단일클론성 항체(Lilly의 중화항체 밤라니비맙, LY-CoV555 및 REGN-COV2 항체 칵테일)는 모두 S1-RBD를 지향한다.
강력한 S1-RBD 백신 구성요소의 명백한 이점으로 인하여, 이러한 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물 (UB-612)은 상기 파트 C에서 기술된 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질을 포함한다. 전술한 바와 같이, S1-RBD-sFc는 인간 IgG1의 단일 쇄 단편 결정화가능한 영역 (sFc)에 SARS-CoV-2의 S1-RBD를 융합시켜 만들어진 재조합 단백질이다. Fc 단편에 백신 항원의 유전적 융합으로 뱅골 원숭이에서 HIV gp120에 대항하는 항체 유도 및 중화 활성, 또는 BALB/c 마우스에서 Epstein Barr 바이러스 gp350에 대항하는 항체 유도 및 중화 활성을 촉진시킨 것을 보여주었다 (Shubin, Z., et al., 2017; 그리고 Zhao, B., et al., 2018). 또한, 공작된 Fc는 비-특이적 결합을 최소화시키고, 용해도, 수율, 열안정성 및 생체-내 반감기를 증가시키는 해결책으로 많은 치료 항체에서 사용되었다 (Liu, H., et al., 2017).
일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc 융합 단백질을 함유한다. S1-RBD-sFc 단백질 (서열 식별 번호: 235)은 S1-RBD 펩티드 (서열 식별 번호: 226)을 함유하고, 이는 IgG (서열 식별 번호: 188)의 돌연변이된 힌지 영역을 통하여 단일 쇄 Fc 펩티드 (서열 식별 번호: 232)에 융합된, SARS-CoV-2의 전장의 S 단백질의 아미노산 잔기 331-530에 상응한다.
일부 구체예들에서, 서열 식별 번호: 226의 S-RBD 서열의 위치 61과 위치 195의 시스테인 (C) 잔기는 서열 식별 번호: 227에 나타낸 것과 같이 알라닌 (A) 잔기로 돌연변이된다 (S-RBD의 잔기 61과 잔기 195는 서열 식별 번호: 20의 전장의 S 단백질의 잔기 391 및 잔기 525에 대응한다). 본 명세서에서 돌연변이된 S-RBD 서열은 S-RBDa로도 지칭된다. 상기 S-RBD 서열에서 C61A 돌연변이 및 C195A 돌연변이는 재조합 단백질 발현에서 이황화결합 형성 불일치를 회피하기 위해 도입된다. 단일 쇄 Fc 펩티드 (S-RBDa-sFc)에 융합된 S-RBDa의 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 236이다.
상기 백신 조성물에서 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질의 양은 필요 또는 적용에 따라 가변적일 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 1μg ~ 약 1,000μg의 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질을 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 약 10μg ~ 약 200μg의 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질을 함유한다.
2. Th/CTL 펩티드
S 단백질 단독에 대한 중화 반응은 SARS-CoV-2 및 돌연변이 B 세포 에피토프가 있는 이의 새로운 변이체에 대한 지속적인 보호를 제공할 것 같지 않다. 오래-지속되는 세포 반응은 초기 중화 반응(기억 B 세포 활성화를 통해)을 증가시키고, 항체 역가가 약해짐에 따른 훨씬 더 긴 면역 기간을 제공할 수 있다. 최근 연구에 따르면 SARS-CoV-2 감염자의 >90% 에서 2-3개월 이내에 S에 대한 IgG 반응이 급격히 감소했다 (Long, Q.-X., et al., 2020). 대조적으로, SARS에 대한 기억 T 세포는 2003년 SARS 발병 이후 11-17년 동안 지탱하는 것으로 나타났다 (Ng., O.-W., et al., 2016; 그리고 Le Bert, N., et al., 2020). S 단백질은 대부분 CD4+ 에피토프를 함유하는 체액성 면역 유발에 중요한 항원이다 (Braun, J., et al., 2020). SARS-CoV-2 감염을 벗어나기 위해, 세포 면역 반응을 상승/증진에 다른 항원이 필요하다. SARS-CoV-2 단백질에서 보고된 CD8+ T 세포 에피토프의 대다수는 ORF1ab, N, M 및 ORF3a 영역에 있고; 3개만 S에 있고, 오직 1개 CD8+ 에피토프만 S1-RBD에 있다 (Ferretti, A.P., et al., 2020). 더 작은 M 구조 단백질 및 N 구조 단백질은 감염을 성공적으로 제어한 환자들의 T 세포에 의해 인지된다. UK에서 거의 3,000명을 대상으로 한 연구에서, 더 많은 수의 T 세포를 가진 개체들은 낮은 T 세포 반응을 가진 개체들에 비해, SARS-CoV-2로부터 더 많이 보호되는 것으로 밝혀졌고, 이것으로 T 세포 면역이 COVID-19 예방에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다(Wyllie, D., et al., 2020).
T 세포 반응을 유도하는 면역원을 제공하기 위해, SARS-CoV 및 SARS-CoV-2의 S 단백질, N 단백질 및 M 단백질 (가령, Ahmed, S.F., et al., 2020/0)로부터 파생된 상당히 보존된 서열의 Th/CTL 에피토프들이 광범위한 문헌 검색 후에 확인되었다. 이들 Th/CTL 펩티드는 표 4 및 표 5에 나타낸다. 이 영역들 내의 몇 가지 펩티드들이 선택되었고, 추가적으로 설계되었다. 선택된 각 펩티드는 MHC I 또는 II 결합에 대한 사전 검증된 Th 또는 CTL 에피토프를 함유하고, 우수한 제조 특성(고-품질 합성을 위한 최적의 길이와 순도)을 나타낸다. 이들 합리적으로 설계된 Th/CTL 펩티드는 펩티드 용해도를 개선시키고, 백신 제형에 사용하기 위한 양전하를 풍부하도록, 각 펩티드의 N-말단에 Lys-Lys-Lys 꼬리를 추가함으로써 더 변형되었다. 5개의 최종 펩티드와 각각의 HLA 대립유전자의 디자인과 서열은 표 32에 나타낸다.
면역 반응을 향상시키기 위해, 특허등록 펩티드 UBITh®1a (서열 번호: 66)를 백신 조성물의 펩티드 혼합물에 첨가할 수 있다. UBITh®1a는 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF)로부터 유래된 원래 프레임워크 서열을 가진 특허등록된 합성 티드이다. 이 서열은 19개 아미노산의 짧은 펩티드 내에서 다중 MHC 클래스 II 결합 모티프의 수용을 허용하도록 서열 내 팔린드롬(palindromic) 프로파일을 나타내도록 추가로 변형되었다. 이러한 인공적인 Th 펩티드의 N 말단에도 Lys-Lys-Lys 서열을 추가하여 양전하를 증가시켰고, 따라서 상당히 음으로 하전된 CpG 올리고뉴클레오티드 분자에 대한 펩티드의 후속 결합을 촉진시킴으로써 "전하 중화"를 통해 면역자극 복합체가 형성된다. 기존 연구에서, UBITh®1a를 자가-단백질로부터 유래된 표적 "기능성 B 에피토프 펩티드"에 부착시키면, 자가-펩티드가 면역원성을 갖게 되고, 따라서 면역 내성이 파괴된다(Wang, C.Y., et al, 2017). UBITh®1의 Th 에피토프는 표적 펩티드에 공유 결합되어 있든, 아니면 다른 기획된 표적 펩티드와 함께 투여된 자유 전하 펩티드로 있던, 이러한 자극 활성을 나타내고, 이것은 CpG1과 함께, "전하 중화" 효과를 통해 부위-지향적 B 또는 CTL 응답을 이끌어낸다. 이러한 면역자극성 복합체는 동반 표적 면역원의 약하거나 또는 중간 정도의 반응을 향상시키는 것으로 나타났다 (가령, WO 2020/132275A1). CpG1은 합리적으로 설계된 면역원들이 함께 "전하 중화"를 통해 백신접종된 숙주에서 균형잡힌 B 세포(중화 항체 유도) 및 Th/CTL 반응 생성을 허용하도록 설계되었다. 또한, CpG에 의한 TLR-9 신호전달의 활성화는 IgA 생성을 촉진시키고, Th1 면역 반응을 조력하는 것으로 알려져 있다. UBITh®1 펩티드는 이들의 항-바이러스 활성을 위해 SARS-CoV-2 유래된 Th 및 CTL 에피토프 펩티드를 더욱 강화하기 위해, 이의 "에피토프 클러스터" 속성을 위한 Th 펩티드 중 하나로 통합되었다. UBITh®1의 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 65이고, UBITh®1a의 서열은 서열 식별 번호: 66이다. CpG1의 핵산 서열은 서열 식별 번호: 104이다.
상기의 관점에서, 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물은 하나 또는 그 이상의 Th/CTL 펩티드를 함유할 수 있다. 상기 Th/CTL 펩티드에는 다음의 것들이 내포될 수 있다:
a. 서열 식별 번호: 1의 SARS-CoV-2 M 단백질로부터 유래된 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 361);
b. 서열 식별 번호: 6의 SARS-CoV-2 N 단백질로부터 유래된 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 9-16, 19, 153-160, 165, 347, 350, 351, 그리고 363);
c. 서열 식별 번호: 20의 SARS-Cov-2 S 단백질로부터 유래된 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 35-36, 39-48, 145-152, 161-164, 345-346, 348, 362, 364, 그리고 365); 및/또는
d. 병원체 단백질들로부터 유래된 인공적인 Th 에피토프 (가령, 서열 식별 번호: 49-100).
상기 백신 조성물은 하나 또는 그 이상의 상기 Th/CTL 펩티드를 함유할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 하나 이상의 Th/CTL 펩티드의 혼합물을 함유한다. 혼합물에 존재할 때, 각 Th/CTL 펩티드는 다른 펩티드 또는 펩티드들과 비교하여, 임의의 양 또는 비율로 존재할 수 있다. 예를 들면, Th/CTL 펩티드는 등몰량, 등가-중량의 양으로 혼합될 수 있거나, 또는 이 혼합물에 있는 각 펩티드의 양이 이 혼합물에 있는 다른 펩티드(들)의 양과 상이할 수 있다. 2개 이상의 Th/CTL 펩티드가 혼합물에 존재하는 경우, 이들 펩티드의 양은 해당 혼합물의 다른 펩티드와 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
상기 백신 조성물에 존재하는 Th/CTL 펩티드(들)의 양은 필요에 따라 또는 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 백신 조성물은 총합으로 약 0.1μg ~ 약 100μg의 상기 Th/CTL 펩티드(들)을 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 총합으로 약 1μg ~ 약 50μg의 상기 Th/CTL 펩티드(들)을 함유한다.
특정 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 혼합물을 함유한다. 이들 Th/CTL 펩티드는 등몰량, 동일 중량-으로 혼합될 수 있거나, 또는 이 혼합물에 있는 각 펩티드의 양이 이 혼합물에 있는 다른 펩티드(들)의 양과 상이할 수 있다. 특정 구체예들에서, 이들 Th/CTL 펩티드는 상기 백신 조성물에서 등가-중량의 양으로 혼합된다.
3. 부형제
상기 백신 조성물은 약제학적으로 수용가능한 부형제를 또한 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "부형제" 또는 "부형제들"이란 상기 백신 조성물 안에 있는, (a) S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질 또는 (b) Th/CTL 펩티드(들)이외의 임의의 구성요소를 지칭한다. 부형제의 예시로는 항산화제, 결합제, 완충제, 증량제, 담체, 킬레이트제, 계면활성제, 용매, 착색제, 희석제, 붕해제, 유화제, 충전제, 겔형성제, pH 완충제, 보존제, 가용화제, 안정제, 그리고 이와 유사한 것들이 내포된다. 따라서, 상기 백신 조성물은 약제학적으로 수용가능한 부형제과 함께, 약제학적으로 유효량의 활성 약제학적 성분 (API), 이를 테면, S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질 및/또는 하나 또는 그 이상의 Th/CTL 펩티드를 함유할 수 있다.
상기 백신 조성물은 자체적으로 임의의 특이적 항원성 효과없이, API에 대한 면역 반응을 가속화시키고, 연장시키고, 또는 향상시키는 작용을 하는 하나 또는 그 이상의 어쥬번트를 함유할 수 있다. 어쥬번트에는 오일, 오일 에멀젼, 알루미늄 염, 칼슘 염, 면역 자극 복합체, 박테리아 및 바이러스 유도체, 비로좀, 탄수화물, 사이토킨, 중합체성 마이크로입자가 내포될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 어쥬번트는 다음으로부터 선택될 수 있다: CpG 올리고뉴클레오티드, 명반(인산 알루미늄 칼륨), 인산 알루미늄(예: ADJU-PHOS®), 수산화 알루미늄(예: ALHYDROGEL®), 인산칼슘, 불완전 프로인트 어쥬번트(IFA), 프로인트 완전 어쥬번트, MF59, 보조제 65, Lipovant, ISCOM, 리포신, 사포닌, 스쿠알렌, L121, EMULSIGEN®, EmulsIL-6n®, 모노포스포릴 지질 A(MPL), Quil A, QS21, MONTANIDE® ISA 35, ISA 50V, ISA 50V2, ISA 51, ISA 206, ISA 720, 리포솜, 리포솜 펩티도글리칸, 지질다당류(LPS), ASO1, ASO2, ASO3, ASO4, AF03, 친유성 인지질 (지질 A), 감마 이눌린, 알가물린, 글루칸, 덱스트란, 글루코만난, 갈락토만난, 레반, 자일란, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA), 뿐만 아니라 기타 어쥬번트 및 유화제.
일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 ADJU-PHOS® (인산 알루미늄), MONTANIDE™ ISA 51(유-중-수 에멀젼의 생산을 위한 식물성 오일 및 만니드 올레이트로 구성된 오일 어쥬번트 조성물), TWEEN® 80(또한, 폴리소르베이트 80 또는 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트로 알려짐), CpG 올리고뉴클레오티드, 및/또는 이들의 임의의 조합을 함유한다. 다른 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 어쥬번트로서, EMULSIGEN 또는 EMULSIGEN D를 갖는 수-중-유-중-수(즉, w/o/w) 에멀젼이다.
특정 구체예들에서, 상기 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물은 면역 반응을 개선시키기 위해 ADJU-PHOS® (인산 알루미늄)를 어쥬번트로 함유한다. 인산 알루미늄은 수용체 단백질 3(NLRP3) 인플라마솜(inflammasome) 경로와 같은 뉴클레오티드 결합 올리고머화 도메인(NOD)을 통해 Th2 지향된 어쥬번트로 작용한다. 추가적으로, 그것은 식작용을 촉진성(pro-phagocytic) 효과 및 저장(repository) 효과를 가지고 있는데, 오랜 안전성 기록과 많은 백신 제형에서 표적 단백질에 대한 면역 반응을 개선하는 능력이 있다.
상기 백신 조성물은 pH 조절제 및/또는 완충제, 이를 테면, 염산, 인산, 구연산, 아세트산, 히스티딘, 히스티딘 HClㆍH2O, 젖산, 트로메타민, 글루콘산, 아스파르트산, 글루탐산, 타르타르산, 숙신산, 말산, 푸마르산, α-케토글루타르산 및 아르기닌 HCl을 함유할 수 있다.
상기 백신 조성물은 계면활성제 및 유화제, 이를 테면, 올리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (폴리소르베이트, TWEEN®), 폴리옥시에틸렌 15 히드록시 스테아레이트 (Macrogol 15 히드록시 스테아레이트, SOLUTOL HS15®), 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체 (CREMOPHOR® EL, ELP, RH 40), 폴리옥시에틸렌 스테아레이트 (MYRJ®), 소르비탄 지방산 에스테르 (SPAN®), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (BRIJ®), 그리고 폴리옥시에틸렌 노닐페놀 에테르 (NONOXYNOL®)를 함유할 수 있다.
상기 백신 조성물은 담체, 용매 또는 삼투압 유지제, 이를 테면, 물, 알코올 및 식염수 (가령, 염화나트륨)를 함유할 수 있다.
상기 백신 조성물은 보존제, 이를 테면, 알킬/아릴 알코올 (가령, 벤질 알코올, 클로르부탄올, 2-에톡시에탄올), 아미노 아릴 산 에스테르 (가령, 메틸, 에틸, 프로필 부틸 파라벤 및 조합), 알킬/아릴 산 (가령, 벤조산, 소르브산), 비구아나이드 (가령, 클로르헥시딘), 방향족 에테르 (가령, 페놀, 3-크레졸, 2-페녹시에탄올), 유기 수은 (가령, 티메로살, 페닐머큐레이트 염)을 함유할 수 있다.
4. 제형
상기 백신 조성물은 즉시 방출 제형, 또는 지속 방출 제형으로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 상기 백신 조성물은 면역원 포획 및 미립자와의 공동-투여를 통한, 전신 또는 국소 점막 면역의 유도를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 전달 시스템는 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
상기 백신 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조될 수 있다. 상기 백신 조성물를 함유하는 액체 비히클이 또한 주사-전, 준비될 수 있다. 상기 백신 조성물은 임의의 적합한 투여 방식, 예를 들어 i.d., i.v., i.p., i.m., 비강내, 경구, 피하 등등, 그리고 임의의 적합한 전달 장치로 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 피하, 피내(intradermal) 또는 근육내 투여용으로 제형화된다. 상기 백신 조성물은 또한 경구 및 비강내 적용을 포함하는 다른 투여 방식을 위해 제조될 수 있다.
상기 백신 조성물은 또한 적합한 투약 단위형으로 제형화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 약 1μg ~ 약 1,000μg의 API (가령, S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질 및/또는 하나 또는 그 이상의 Th/CTL 펩티드)를 함유한다. 상기 백신 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 대상체의 생리학적 상태, 그리고 해당 대상체가 인간인지 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 그리고 처치가 예방을 위한 것인지, 또는 치료를 위한 것인지 등을 비롯한 다수의 상이한 요인에 따라 가변적이다. 일반적으로, 상기 대상체는 인간이지만, 인간이 아닌 포유류도 치료할 수 있다. 다중 투여량으로 전달되는 경우, 백신 조성물은 투약 단위형당 적합한 양으로 편리하게 분할될 수 있다. 투여되는 투약량은 치료 분야에 잘 알려진 바와 같이 대상체의 연령, 체중 및 전반적인 건강 상태에 따라 달라질 것이다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 부가제 및/또는 부형제가 있는 제형 안에 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질과 하나 또는 그 이상의 Th/CTL 펩티드를 함유한다. 특정 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 부가제 및/또는 부형제가 있는 제형 안에 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질과 하나 이상의 Th/CTL 펩티드를 함유한다. 하나 이상의 Th/CTL 펩티드 혼합물을 함유하는 백신 조성물은 이 조성물의 면역효과의 상승적 강화를 제공할 수 있다. 부가제 및/또는 부형제가 있는 제형 안에 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질과 하나 이상의 Th/CTL 펩티드를 함유하는 백신 조성물은 상기 기획 단백질 또는 하나의 Th/CTL 펩티드만을 함유하는 조성물과 비교하였을 때, 광범위한 MHC 클라스 II 적용범위로 인하여, 따라서 백신 조성물에 대한 개선된 면역 반응을 제공함으로써, 더 많은 유저적 집단에 더 효과적일 것이다.
상기 백신 조성물이 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질과 API로써 하나 또는 그 이상의 Th/CTL 펩티드를 함유할 때, 이들 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드의 상대적인 양은 서로에 대한 임의의 양 또는 비율로 존재할 수 있다. 예를 들면, 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드(들)은 등몰량, 등가-중량의 양으로 혼합될 수 있거나, 또는 상기 기획 단백질의 양과 Th/CTL 펩티드(들)의 양은 상이할 수 있다. 또한, 하나 이상의 Th/CTL 펩티드가 이 조성물에 존재할 경우, 상기 기획 단백질의 양과 각 Th/CTL 펩티드(들)의 양은 서로 동일하거나, 또는 서로 상이할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기획 단백질의 몰 또는 무게 양은 Th/CTL 펩티드보다 더 많은 양으로 이 조성물 안에 존재한다. 다른 구체예들에서, 상기 기획 단백질의 몰 또는 무게 양은 Th/CTL 펩티드보다 더 적은 양으로 이 조성물 안에 존재한다. 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드(들)의 비율(중량:중량)은 필요 또는 적용에 따라 가변적일 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드(들)의 비율(w:w)은 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 또는 90:10일 수 있다. 특이적 구체예들에서, 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드(들)의 비율(w:w)은 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14, 또는 85:15이다. 특이적 구체예들에서, 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드(들)의 비율(w:w)은 88:12이다.
일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 서열 식별 번호: 235의 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질을 포함한다. 다른 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 하나 또는 그 이상의 Th/CTL 펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 Th/CTL 펩티드와 조합하여, 서열 식별 번호: 235의 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 하나 또는 그 이상의 어쥬번트 및/또는 부형제 함께, 서열 식별 번호: 235의 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질, 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 Th/CTL 펩티드를 포함한다. 각종 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 Th/CTL 펩티드와 함께 서열 식별 번호: 235를 포함하고, 여기에서 Th/CTL 펩티드는 서로에 대해 등가-중량 비율로 존재하고, 서열 식별 번호: 235와 조합된 중량 Th/CTL 펩티드의 비율(w:w)은 88:12이다. 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 Th/CTL 펩티드와 함께, S1-RBD-sFC 단백질 (서열 식별 번호: 235)의 총량 기반으로 20μg/mL, 60μg/mL, 그리고 200μg/mL를 함유하는 백신 조성물의 특정 구체예들이 차례로, 표 33-35에 제공된다.
5. 항체
본 명세서는 상기 백신 조성물에 의해 유도된 항체들을 또한 제공한다.
본 명세서는 부가제 및/또는 부형제와 함께 제형 안에 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질 (가령, 서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc) 및 하나 또는 그 이상의 Th/CTL 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66)를 함유하는 백신 조성물을 제공하는데, 이 백신 조성물은 면역접종된 숙주에서 높은 응답율을 가지고, SARS-CoV-2에 대항하는 고-역가 중화 항체를 유도할 수 있고, S-RBD가 이의 수용체 ACE2에 결합을 억제시킬 수 있다.
상기 기술된 백신 조성물에 의해 유도된 항체들이 또한 본 명세서에 내포된다. 이러한 항체들을 당분야에 공지된 방법들을 이용하여 단리시키고, 정제시킬 수 있다. 단리되고, 정제된 항체들은 SARS-CoV-2에 노출된 대상체를 예방 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한 용도의 약제학적 조성물 또는 제형에 내포될 수 있다.
6. 방법
본 명세서는 상기 백신 조성물 및 이의 제형을 만들고, 이를 이용하는 방법에 또한 관계한다.
a. S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질 및 Th/CTL 펩티드를 제작하는 방법
상기 기술된 S1-수용체-결합 영역-기반 기획 단백질은 상기 파트 C (3)에 기재된 방법에 따라, 또는 실시예 15에 따라 제조될 수 있다. 또한, 상기 기술된 Th/CTL 펩티드는 상기 파트 B(4)에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
b. 상기 백신 조성물을 이용하는 방법
예방적 적용에서, COVID-19의 원인이 되는 SARS-CoV-2 바이러스 감염 위험을 제거하거나, 그 위험을 감소시키고, 해당 질환의 중증도를 경감시키거나 또는 해당 질환의 개시를 지연시키기 위해, 상기 바이러스에 감염된 것으로 의심되는, 또는 감염 위험에 처한, 또는 감염된 대상체에게 개시된 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물을 투여할 수 있다.
예방적 치료를 하기 위한 적절한 백신 조성물의 양은 예방-효과적인 투여분량으로 정의된다. 상기 기술된 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물은 SARS-CoV-2에 의한 감염을 예방하기 위해, 충분한 면역 반응을 생성하도록 하나 또는 그 이상의 투여분량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 면역 반응을 모니터링하고, 만약 이 면역 반응이 약해지기 시작하면 반복적으로 용량이 제공된다.
상기 백신 조성물은 즉시 방출 제형, 또는 지속 방출 제형으로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 상기 백신 조성물은 면역원 포획 및 미립자와의 공동-투여를 통한, 전신 또는 국소 점막 면역의 유도를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 전달 시스템는 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
상기 백신 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조될 수 있다. 상기 백신 조성물를 함유하는 액체 비히클이 또한 주사-전, 준비될 수 있다. 상기 백신 조성물은 임의의 적합한 투여 방식, 예를 들어 i.d., i.v., i.p., i.m., 비강내, 경구, 피하 등등, 그리고 임의의 적합한 전달 장치로 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 피하, 피내(intradermal) 또는 근육내 투여용으로 제형화된다. 상기 백신 조성물은 또한 경구 및 비강내 적용을 포함하는 다른 투여 방식을 위해 제조될 수 있다.
백신 조성물의 투여분량은 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 요구되는 용량은 대상체의 종 및 대상체의 체격을 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 용량은 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드의 복합 중량의 1μg 내지 1,000μg 범위일 수 있다. 상기 용량은 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드의 복합 중량의 약 1μg ~ 약 1mg, 약 10μg ~ 약 500μg, 약 20μg ~ 200μg일 수 있다. 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드의 복합 중량으로 측정하였을 때, 상기 용량은 약 10μg, 약 20μg, 약 30μg, 약 40μg, 약 50μg, 약 60μg, 약 70μg, 약 80μg, 약 90μg, 약 100μg, 약 110μg, 약 120μg, 약 130μg, 약 140μg, 약 150μg, 약 160μg, 약 170μg, 약 180μg, 약 190μg, 약 200μg, 약 250μg, 약 300μg, 약 400μg, 약 500μg, 약 600μg, 약 700μg, 약 800μg, 약 900μg, 약 1,000μg이다. 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드(들)의 비율(중량:중량)은 필요 또는 적용에 따라 가변적일 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드(들)의 비율(w:w)은 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 99:1이거나, 또는 투여 당 고정된 양의 Th/CTL 펩티드와 함께 제공될 수 있다. 특이적 구체예들에서, 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드(들)의 비율(w:w)은 95:5, 94:6, 93:7, 92:8, 91:9, 90:10, 89:11, 88:12, 87:13, 86:14, 또는 85:15이다. 특이적 구체예들에서, 상기 기획 단백질과 Th/CTL 펩티드(들)의 비율(w:w)은 88:12이다. 특이적 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 표 33-35에 나타낸 구성요소들을 함유한다.
상기 백신 조성물은 단일 용량으로, 일정 기간에 걸쳐 다중 용량으로 투여될 수 있다. 유효한 투여분량은 동물 모델에서 얻은 투여분량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 단일 투여로 대상체에게 제공된다. 다른 구체예들에서, 상기 백신 조성물은 다수 투여 (2회 또는 그 이상)로 대상체에게 제공된다. 다중 투여로 제공되는 경우, 투여 사이의 시격은 적용 또는 필요에 따라 달라질 수 있다. 일부 구체예들에서, 백신 조성물의 1차 투여분량이 대상체에게 투여되고, 2차 투여분량이 1차 투여분량-후 약 1주 ~ 약 12주차 시점에 투여된다. 특정 구체예들에서, 제 2 투여분량은 제 1 투여분량 투여 후, 약 1 주, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 또는 약 12 주차 시점에 투여된다. 특이적 구체예에서, 제 2 투여분량은 제 1 투여분량 투여 후, 약 4 주차 시점에 투여된다.
SARS-CoV-2에 대항하는 면역성을 증가시키기 위해 초기 백신접종 일정에 따라 상기 백신 조성물의 부스터 투여분량이 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 백신 조성물의 부스터 투여분량은 초기 백신접종 일정 이후, 약 6 개월 ~ 약 10 년 시점에 투여된다. 특정 구체예들에서, 상기 백신 조성물의 부스터 투여분량은 초기 백신접종 일정 이후, 또는 최종 부스터 투여분량 이후 약 6 개월, 약 1 년, 약 2 년, 약 3 년, 약 4 년, 약 5 년, 약 6 년, 약 7 년, 약 8 년, 약 9 년, 또는 약 10 년 시점에 투여된다.
7. 특이적 구체예들
(1) 서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc, 서열 식별 번호: 236의 S1-RBDa-sFc, 그리고 서열 식별 번호: 355의 S1-RBD-Fc으로 구성된 군에서 선택된 융합 단백질.
(2) 다음을 포함하는 COVID-19 백신 조성물:
a. (1)의 융합 단백질; 그리고
약제학적으로 수용가능한 부형제.
(3) (2)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 상기 융합 단백질은 서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc이다.
(4) (2)의 COVID-19 백신 조성물은 Th/CTL 펩티드를 더 포함한다.
(5) (4)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 상기 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 1의 SARS-CoV-2 M 단백질, 서열 식별 번호: 6의 SARS-CoV-2 N 단백질, 서열 식별 번호: 20의 SARS-Cov-2 S 단백질, 병원체 단백질, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다.
(6) (5)의 COVID-19 백신 조성물, 이때
a. SARS-CoV-2 M 단백질에서 유래된 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 361이며;
b. SARS-CoV-2 N 단백질에서 유래된 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 9-16, 19, 153-160, 165, 347, 350, 351, 그리고 363로 구성된 군에서 선택되며;
c. SARS-CoV-2 S 단백질에서 유래된 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 35-36, 39-48, 145-152, 161-164, 345-346, 348, 362, 364, 그리고 365로 구성된 군에서 선택되며;
d. 병원체 단백질로부터 유래된 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 49-100로 구성된 군에서 선택된다.
(7) (2)의 COVID-19 백신 조성물은 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 66의 Th/CTL 펩티드 혼합물을 더 포함한다.
(8) (7)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 각 Th/CTL 펩티드는 등가-중량의 양으로 이 혼합물에 존재한다.
(9) (8)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 Th/CTL 펩티드 혼합물의 총 중량에 대해 S1-RBD-sFc 단백질의 비율(w:w)은 88:12이다.
(10) (2)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 어쥬번트, 완충제, 계면활성제, 유화제, pH 조절제, 염 용액, 보존제, 용매, 또는 이의 임의의 조합이다.
(11) (2)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 CpG 올리고뉴클레오티드, ADJUPHOS (인산 알루미늄), 히스티딘, 히스티딘 HClㆍH2O, 아르기닌 HCl, TWEEN 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트), 염산, 염화나트륨, 2-페녹시에탄올, 물, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
(12) 다음을 포함하는 COVID-19 백신 조성물:
a. 서열 식별 번호: 235의 S-RBD-sFc 단백질;
b. 서열 식별 번호: 9-16, 19, 35-36, 39-100, 145-165, 345-348, 350, 351, 362-365, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 Th/CTL 펩티드;
c. 약제학적으로 수용가능한 부형제.
(13) (12)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 (b)에서 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 혼합물이다.
(14) (12)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 각 Th/CTL 펩티드는 등가-중량의 양으로 이 혼합물에 존재한다.
(15) (13)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 Th/CTL 펩티드 혼합물의 총 중량에 대해 S-RBD-sFc 단백질의 비율(w:w)은 88:12이다.
(16) (12)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 어쥬번트, 완충제, 계면활성제, 유화제, pH 조절제, 염 용액, 보존제, 용매, 또는 이의 임의의 조합이다.
(17) (12)의 COVID-19 백신 조성물, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 CpG 올리고뉴클레오티드, ADJUPHOS (인산 알루미늄), 히스티딘, 히스티딘 HClㆍH2O, 아르기닌 HCl, TWEEN 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트), 염산, 염화나트륨, 2-페녹시에탄올, 물, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
(18) (12)의 COVID-19 백신 조성물, 이때
상기 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 혼합물이며, 이때 각 펩티드는 등가-중량의 양으로 이 혼합물에 존재하고;
상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 물 안에 CpG1 올리고뉴클레오티드, ADJUPHOS (인산 알루미늄), 히스티딘, 히스티딘 HCl·H2O, 아르기닌 HCl, TWEEN 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트), 염산, 염화나트륨, 그리고 2-페녹시에탄올의 조합이다.
(19) (18)의 COVID-19 백신 조성물, 이때
서열 식별 번호: 235의 S-RBD-sFc 단백질의 총량은 약 10μg ~ 약 200μg이며; 그리고
Th/CTL 펩티드의 총량은 약 2μg ~ 약 25μg이다.
(20) (18)의 COVID-19 백신 조성물, 이때
서열 식별 번호: 235의 S-RBD-sFc 단백질의 총량은 약 17.6μg이며; 그리고
Th/CTL 펩티드의 총량은 약 2.4μg이다.
(21) (18)의 COVID-19 백신 조성물, 이때
서열 식별 번호: 235의 S-RBD-sFc 단백질의 총량은 약 52.8μg이며;
Th/CTL 펩티드의 총량은 약 7.2μg이다.
(22) (18)의 COVID-19 백신 조성물, 이때
서열 식별 번호: 235의 S-RBD-sFc 단백질의 총량은 약 176μg이며;
Th/CTL 펩티드의 총량은 약 24μg이다.
(23) 대상체에서 COVID-19를 예방하는 방법, 이 방법은 (12)에 따른 백신 조성물의 약제학적으로 유효량을 해당 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
(24) (23)의 방법, 이때 상기 약제학적으로 유효량의 상기 백신 조성물은 해당 대상체에게 2회 투여분량으로 투여된다.
(25) (24)의 방법, 이때 상기 백신 조성물의 제 1 투여분량이 해당 대상체에게 투여되고, 상기 백신 조성물의 제 2 투여분량은 제 1 투여분량이 투여된 후, 약 4주차 시점에 해당 대상체에게 투여된다.
(26) SARS-CoV-2에 대항하는 항체를 생성시키는 방법, 이 방법은 (12)에 따른 백신 조성물의 약제학적으로 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
(27) SARS-CoV-2 S 단백질의 S-RBD 일부분 (즉, 서열 식별 번호: 226)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(28) (27)에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 조성물.
(29) 표 28에 나타낸 양의 구성요소들을 포함하는 COVID-19 백신 조성물.
(30) 표 29에 나타낸 양의 구성요소들을 포함하는 COVID-19 백신 조성물.
(31) 표 30에 나타낸 양의 구성요소들을 포함하는 COVID-19 백신 조성물.
8. 기타 특이적 구체예들
(1) S1-RBD-sFc (서열 식별 번호: 235), S1-RBDa-sFc (서열 식별 번호: 236), 그리고 S1-RBD-Fc (서열 식별 번호: 255)로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
(2) (1)에 따른 융합 단백질을 포함하는 조성물.
(3) (2)의 조성물은 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 SARS-CoV-2 펩티드를 더 포함한다.
(4) (2 또는 3)중 임의의 하나에 따른 조성물은 UBITh®1a 펩티드 (서열 식별 번호: 66)를 더 포함한다.
(5) 청구항 2에 따른 조성물은 다음을 더 포함한다:
a) 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 SARS-CoV-2 펩티드; 그리고
b) UBITh®1a 펩티드 (서열 식별 번호: 66).
(6) 다음을 포함하는 조성물:
a) (1)에 따른 융합 단백질,
b) 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 그리고 361를 포함하는 SARS-CoV-2 펩티드의 혼합물; 그리고
c) UBITh®1a 펩티드 (서열 식별 번호: 66).
(7) (5 또는 6)중 임의의 하나에 따른 조성물, 이때 상기 융합 단백질은 S1-RBD-sFc (서열 식별 번호: 235)이다.
(8) (5 또는 6)중 임의의 하나에 따른 조성물, 이때 상기 융합 단백질은 S1-RBDa-sFc (서열 식별 번호: 236)이다.
(9) (5 또는 6)중 임의의 하나에 따른 조성물, 이때 상기 융합 단백질은 S1-RBD-Fc (서열 식별 번호: 355)이다.
(10) 다음을 포함하는 조성물:
a) S1-RBD-sFC 융합 단백질,
b) 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 그리고 361를 포함하는 SARS-CoV-2 펩티드의 혼합물; 그리고
c) UBITh®1a 펩티드 (서열 식별 번호: 66).
(11) (1)에 따른 융합 단백질과 약제학적으로 수용가능한 담체 및/또는 어쥬번트를 포함하는 SARS-CoV-2 백신 조성물.
(12) (11)에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물은 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 SARS-CoV-2 펩티드를 더 포함한다.
(13) (11 또는 12)중 임의의 하나에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물은 UBITh®1a 펩티드 (서열 식별 번호: 66)를 더 포함한다.
(14) (11)에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물은 다음을 더 포함한다:
a) 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 SARS-CoV-2 펩티드; 그리고
b) UBITh®1a 펩티드 (서열 식별 번호: 66).
(15) (11 ~ 14)중 임의의 하나에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 담체 및/또는 어쥬번트는 CpG1 (서열 식별 번호: 104)이다.
(16) 다음을 포함하는 SARS-CoV-2 백신 조성물:
a) (1)에 따른 융합 단백질,
b) 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 그리고 361를 포함하는 SARS-CoV-2 펩티드의 혼합물;
c) UBITh®1a 펩티드 (서열 식별 번호: 66), 그리고
d) 약제학적으로 수용가능한 담체 및/또는 어쥬번트.
(17) (11 ~ 16)중 임의의 하나에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물, 이때 상기 융합 단백질은 S1-RBD-sFc (서열 식별 번호: 235)이다.
(18) (11 ~ 16)중 임의의 하나에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물, 이때 상기 융합 단백질은 S1-RBDa-sFc (서열 식별 번호: 236)이다.
(19) (11 ~ 16)중 임의의 하나에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물, 이때 상기 융합 단백질은 S1-RBD-Fc (서열 식별 번호: 355)이다.
(20) (11 ~ 14 또는 16 ~ 19)중 임의의 하나에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 담체 및/또는 어쥬번트는 CpG1 (서열 식별 번호: 104)이다.
(21) 다음을 포함하는 SARS-CoV-2 백신 조성물:
a) S1-RBD-sFC 융합 단백질,
b) 다음을 포함하는 SARS-CoV-2 펩티드의 혼합물: 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 그리고 361;
c) UBITh®1a 펩티드 (서열 식별 번호: 66), 그리고
d) CpG1 올리고뉴클레오티드 (서열 식별 번호: 104).
(22) SARS-CoV-2에 대항하여 대상체를 면역화시키는 방법, 이 방법은 (11 ~ 21)중 임의의 하나에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물의 약제학적으로 유효량을 해당 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
(23) SARS-CoV-2에 대항하여 대상체를 면역화시키는 방법, 이 방법은 (21)에 따른 SARS-CoV-2 백신 조성물의 약제학적으로 유효량을 해당 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
(24) (1)에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열로 형질감염된 세포주.
(25) 청구항 24에 따른 세포주는 중국 헴스터 난소(CHO) 세포주다.
(26) (24 또는 25)중 임의의 하나에 따른 세포주, 이때 상기 융합 단백질은 S1-RBD-sFc (서열 식별 번호: 235)이다.
(27) (24 또는 25)중 임의의 하나에 따른 세포주, 이때 상기 융합 단백질은 S1-RBDa-sFc (서열 식별 번호: 236)이다.
(28) (24 또는 25)중 임의의 하나에 따른 세포주, 이때 상기 융합 단백질은 S1-RBD-Fc (서열 식별 번호: 355)이다.
(29) (24 또는 25)에 따른 세포주, 이때 상기 cDNA 서열은 S1-RBD-sFc (서열 식별 번호: 246), S1-RBDa-sFc (서열 식별 번호: 247), 그리고 S1-RBD-Fc (서열 식별 번호: 357)로 구성된 군에서 선택된다.
(30) (24 또는 25)에 따른 세포주, 이때 상기 cDNA 서열은 S1-RBD-sFc를 인코딩하는 서열 식별 번호: 246이다.
(31) (24 또는 25)에 따른 세포주, 이때 상기 cDNA 서열은 S1-RBDa-sFc를 인코딩하는 서열 식별 번호: 247이다.
(32) (24 또는 25)에 따른 세포주, 이때 상기 cDNA 서열은 S1-RBD-Fc를 인코딩하는 서열 식별 번호: 357이다.
실시예 1
S-RBD 관련된 펩티드의 합성 및 이의 제형들 준비
a. S-RBD 관련된 펩티드의 합성
S-RBD 펩티드 면역원 구조체들 개발에 내포된 SARS-CoV-2 항원성 펩티드, 내생성 Th 및 CTL, 그리고 S-RBD 관련된 펩티드를 합성하는 방법들이 기술된다. 펩티드는 혈청학적 분석, 실험실 파일럿 연구 및 현장 연구에 유용한 소규모 양으로 합성될 수 있을 뿐만 아니라, 약제학적 조성물의 산업적/상업적 생산에 유용한 대규모(킬로그램) 양으로 합성될 수 있다. 대략적으로 6개~ 80개 아미노산 길이를 갖는 서열을 갖는 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드의 다수 레퍼토리가 확인되었고, 효과적인 S-RBD 표적화 치료 백신에 사용하기 위한 펩티드 면역원 구조체에 대한 가장 최적의 서열이 되도록 선택되었다.
표 1 ~ 표 3은 SARS-CoV-2 M 단백질, N 단백질, 그리고 S 단백질의 전상 서열들 (차례로 서열 식별 번호: 1, 6, 그리고 20)을 제공한다. 표 1, 표 3, 표 11, 그리고 표 13은 항체 검출용 진단 분석에 사용하기 위한 고형 상/면역흡착 펩티드로 사용하기 위한, SARS-CoV-2 M, N, E, ORF9b, 그리고 S 단백질들 (서열 식별 번호: 4-5, 17-18, 37-38, 4-5, 17-18, 37-38, 226, 227, 250-252, 259, 261, 263, 265, 266, 270, 281, 308, 321, 322, 323, 324, 그리고 328-334)로부터 유래된 항원성 펩티드 서열들을 또한 제공한다. 또한, 표 3, 표 11, 그리고 표 13은 전장의 S-RBD, 이의 단편들 또는 이의 변형 서열들 (서열 식별 번호: 226, 227, 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319)을 제공한다.
선택된 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드를 홍역 바이러스 융합 단백질 (MVF), B형 간염 표면 항원 단백질 (HBsAg), 인플루엔자, 클로스트리둠 테타니, 그리고 Epstein-Barr 바이러스 (EBV) (표 6 (가령, 서열 식별 번호: 49-100)에서 확인됨)을 비롯한 병원체 단백질로부터 유래된 신중하게 기획된 헬퍼 T 세포 (Th) 에피토프 펩티드에 연계시킴으로써, S-RBD 펩티드 면역원 구조체들이 만들어질 수 있다. S-RBD 펩티드 면역원 구조체들의 면역원성을 강화시키기 위해, 상기 Th 에피토프 펩티드는 단일 서열 (가령, MVF의 경우 서열 식별 번호: 49-52, 54-57, 59-60, 62-63, 65-66, 그리고 HBsAg의 경우 서열 식별 번호: 67-71, 73-74, 76-78) 또는 조합 라이브러리 서열들 (가령, MvF의 경우 서열 식별 번호: 53, 58, 61, 64, 그리고 HBsAg의 경우 서열 식별 번호: 72 및 75)로 이용될 수 있다. SARS-CoV2에 대한 백신접종된 숙주의 B 세포 또는 CTL 반응 소환을 촉진시킬 수 있는 기억 T 세포를 생성시키기 위해, 공지의 MHC 결합 활성을 갖는 표 2, 3, 4, 5, 그리고 8 (서열 식별 번호: 9-19, 35-48, 345-351)에 나타낸 SARS-CoV2 유래된 내생성 Th 및 CTL 에피토프를 또한 합성 면역원 (가령, 서열 식별 번호: 345-351)으로 기획하고, 최종 SARS-CoV2 백신 제형에 함입시키기 위해 합성된다.
수백개 펩티드 구조체들로부터 선택된 대표적인 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들이 표 8 (서열 식별 번호: 107-144)에서 확인된다. 항-S-RBD 항체의 검출 및/또는 측정을 위한 면역원성 연구 또는 관련 혈청학적 시험에 사용할 수 있는 모든 펩티드는 Applied BioSystems Models 430A, 431 및 /또는 433을 이용하여 소-규모로 합성될 수 있다. 각 펩티드가 독립적인 합성에 의해 생성될 수 있는데, 고형-상 지지체에서 N-말단에 F-moc 보호 및 삼중-기능성 아미노산의 측쇄 보호 그룹을 갖는다. 합성 후, 상기 펩티드는 고형 서포트로부터 절단될 수 있고, 측쇄 보호기는 90% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 제거될 수 있다. 합성 펩티드 조제물은 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행-시간 (MALDI-TOF) 질량 분광분석으로 평가하여, 정확한 아미노산 함량을 확인할 수 있다. 각 합성 펩티드는 역상-HPLC(RP-HPLC)로 평가하여 이 조제물의 합성 프로필과 농도를 확인할 수도 있다. 합성 과정의 엄격한 관리 (커플링 효율의 단계적 모니터링을 비롯하여)에도 불구하고, 신장 주기 동안 아미노산 삽입, 결손, 치환 및 미완성 종결을 비롯한, 의도하지 않은 사건들로 인해 이들 펩티드의 유사체들이 생성될 수도 있다. 따라서, 합성된 조제물에는 일반적으로 표적화된 펩티드와 함께, 다중 펩티드 유사체들이 내포될 수 있다.
이러한 의도하지 않은 펩티드 유사체들의 함입에도 불구하고, 생성된 합성 펩티드 조제물은 그럼에도 불구하고 면역진단(항체 포획 항원으로 사용) 및 약제학적 조성물(펩티드 면역원으로 사용)을 비롯한, 면역학적 적용에 사용하기에 적합할 것이다. 일반적으로, 의도적으로 기획된, 또는 합성 과정을 통해 부산물의 혼합물로 생성되었던 간에, 이러한 펩티드 유사체들은 이러한 펩티드를 사용하는 최종 제품의 재현성과 효능을 보장하기 위해, 제조 공정과 제품 평가 공정을 모두 모니터링하기 위한 안목 있는 QC 절차가 개발되어 있다면, 원하는 펩티드의 정제된 조제물 만큼 효과적인 경우가 많다. 수백 ~ 킬로그램의 대규모 펩티드 합성은 15mmole ~ 150mmole 규모 이상에서, 맞춤형 자동화 펩티드 합성기 UBI2003 또는 이와 유사한 것들로 수행할 수 있다.
임상시험을 위한 최종 약학적 조성물에 사용되는 활성 성분의 경우, S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 표면적(shallow) 용리 구배 하에서, 예비 RP-HPLC로 정제할 수 있으며, MALDI-TOF 질량 분광분석, 아미노산 분석 및 순도 및 동일성을 위한 RP-HPLC를 이용하여 특징화된다.
b. S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 조성물의 준비
유-중-수 에멀젼 및 미네랄 염 현탁액을 사용하여 제형을 제조할 수 있다. 기획된 약제학적 조성물이 큰 집단에서 사용되기 위해서, 안전성은 고려해야 할 또다른 중요한 요소다. 유-중-수 에멀젼이 많은 임상 시험에서 약학적 조성물로 인간에게 사용되었다는 사실에도 불구하고, 명반은 안전성으로 인해 약제학적 조성물에 사용하기 위한 주요 어쥬번트로 남아 있다. 따라서, 명반 또는 이의 미네랄 염 ADJUPHOS (인산 알루미늄)은 임상 적용을 위한 조제에서 어쥬번트제로 자주 사용된다.
연구 그룹의 제형은 모든 유형의 기획 S-RBD 펩티드 면역원 구조체를 함유할 수 있다. 다수의 기획 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 B 세포 에피토프 펩티드 또는 전장 RBD 폴리펩티드로 사용되는 해당 S-RBD 펩티드 (서열 식별 번호: 226, 235, 236, 그리고 255)에 대항한 이들의 상대적 면역원성에 대해 기니피그에서 신중하게 평가할 수 있다. 상기 평가된 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 315-319, 그리고 335-344)로 피복된 플레이트를 이용한 ELISA 분석에 의해 다양한 상동성 펩티드들에서 에피토프 맵핑 및 혈청학적 교차-반응성이 분석될 수 있다.
다양한 양의 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 인간 사용을 위해 승인된 오일로써 Seppic MONTANIDE™ ISA 51과 함께 유-중-수 에멸전으로 조제될 수 있거나, 또는 미네랄 염 ADJUPHOS (인산 알루미늄) 또는 ALHYDROGEL (명반)과 혼합되어 준비될 수 있다 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 물에 약 20 ~ 2,000μg/mL로 용해시키고, MONTANIDE™ ISA 51과 함께 유-중-수 에멀젼 (부피 1:1) 또는 미네랄 염 ADJUPHOS 또는 ALHYDROGEL (명반) (부피 1:1)과 함께 제형화시켜, 조성물을 준비할 수 있다. 상기 조성물은 약 30분 동안 실온에서 유지시켜야 하고, 면역화-전 약 10 내지 15초 동안 볼텍스를 하여 혼합시켜야 한다. 동물에게 특정 조성물의 2 ~ 3회 투여분량으로 면역접종시킬 수 있으며, 이 경우 0 시점에 근육내 경로에 의해 접종시키고 (프라임) 및 초기 면역접종-후 3주차 (wpi) (부스트), 그리고 선택적으로 2차 부스트의 경우 5 또는 6wpi로 근육내 경로에 의해 면역접종시킬 수 있다. 그 다음, 이 제형에 존재하는 다양한 S-RBD 펩티드 면역원 구성체의 면역원성을 평가하기 위해, 면역접종된 동물들의 혈청을 선택된 B 세포 에피토프 펩티드(들)를 이용하여 테스트할 수 있고, 대응하는 혈청의 교차-반응성은 서열 식별 번호: 26의 S-RBD 부위, 또는 전장의 S-RBD 서열 (서열 식별 번호: 226)로 테스트할 수 있다. 기니피그의 초기 스크리닝에서 발견된 잠재적인 면역원성을 가진 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 대응하는 혈청의 기능적 속성에 대해 시험관 내 분석에서 추가로 테스트할 수 있다. 그 다음, 상기 선택된 후보 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들은 면역화 프로토콜에 의해 지시된 바와 같이, 명시된 기간 동안 투약 섭생에 대해 유-중-수 에멀젼, 미네랄 염 및 명반-기반 제형으로 조제될 수 있다.
가장 유망한 S-RBD 펩티드 면역원 구조체만이 SARS-CoV2 Th/CTL 펩티드 구성체와 함께, 또는 이러한 구조체 없이, 최종 제형에 통합되기 전, 연구용 신약 신청서 제출 및 뒤이어 COVID-19 환자에서 임상 시험을 위해, GLP 안내된 전-임상 연구에서 면역원성, 지속 기간, 독성 및 효능 연구에서 광범위하게 추가 평가될 것이다.
실시예 2
혈청학적 분석법 및 시약들
상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들 및 이의 제형들의 기능성 면역원성 평가를 위한 혈청학적 분석법과 시약들이 하기에서 상세하게 기술된다.
a. 면역원성 분석 및 항체 특이성 분석을 위한 S-RBD 또는 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드-기반 ELISA 테스트
COVID-19 검출을 위해 면역 혈청 샘플 및/또는 개인의 샘플을 평가하는 데 사용할 수 있는 ELISA 분석은 아래에 설명되어 있다.
96-웰 플레이트의 웰은 10mM NaHCO3 완충제, pH 9.5 (달리 명시되지 않는 한)에서 100μL의 S-RBD (서열 식별 번호: 226) 또는 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드 (가령, 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 및/또는 29-34) 2μg/mL (달리 명시되지 않는 한)로 37℃에서 1 시간 동안 개별적으로 피복된다.
비-특이적 단백질 결합 부위를 차단시키기 위해, 상기 S-RBD 또는 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드-피복된 웰은 37℃에서 1 시간 동안 PBS에서 250μL의 3중량%의 젤라틴으로 항온처리하고, 이어서 0.05부피% TWEEN® 20을 함유하는 PBS로 세 차례 세척하고, 그리고 건조시킨다. 분석될 혈청은 20부피% 정상적인 염소 혈청, 1중량% 젤라틴 및 0.05부피% TWEEN® 20를 함유하는 PBS로 1:20 (달리 명시되지 않는 한)로 희석시킨다. 희석된 시료(가령, 혈청, 혈장) 100μL를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 60분 동안 반응시킨다. 그런 다음, 웰을 PBS 안에 0.05부피% TWEEN® 20으로 6회 세척하여, 결합되지 않은 항체를 제거한다. 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-콘쥬게이트된 종 (가령, 기니아 피그 또는 렛(rat)) 특이적 염소 다중클론성 항-IgG 항체 또는 단백질 A/G를 양성 웰 안에 형성된 항체/펩티드 항원 복합체와 결합하는 라벨된 추적자로 이용된다. 100μL의 HRP 표지 검출 시약을 PBS 안에 0.05부피%의 TWEEN® 20와 1부피%의 정상 염소 혈청에서 사전-적정된 최적의 희석으로 각 웰에 첨가하고, 다시 30분 동안 37℃에서 항온처리한다. 상기 웰들을 PBS 안에 0.05부피%의 TWEEN® 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 시트르산나트륨 완충액 안에 0.04중량%의 3', 3', 5', 5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 및 0.12부피%의 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100μL와 추가 15분 동안 반응시킨다. 이 기질 혼합물은 유색 산물을 형성함으로써, 과산화효소 라벨을 검출하는데 이용된다. 100μL의 1.0M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450nm에서의 흡광도(A450)를 측정한다. 다양한 펩티드 백신 제형으로 백신접종을 받은 동물 또는 SARS-CoV-2 감염 검사를 받고 있는 개체의 항체 역가 측정을 위해, 1:100에서 1:10,000까지의 10-배 일련의 희석, 또는 1:100에서 1: 4.19 x 108까지 4-배 일련의 희석물을 테스트하고, 테스트된 혈청의 역가(Log10으로 표현됨)는 컷-오프 A450이 0.5로 설정된, A450의 선형 회귀 분석으로 산출된다.
b. Th 펩티드-기반 ELISA 테스트에 의해 Th 펩티드를 지향하는 항체 반응성 평가
96-웰 ELISA 플레이트의 웰을 상기에서 기술된 것과 유사한 ELISA 방법으로 10mM NaHCO3 완충액, pH 9.5 (달리 언급되지 않는 한)에서 2μg/mL의 Th 펩티드 100μL로 37℃에서 1시간 동안 개별적으로 피복시킨다. S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 다양한 제형을 제공받은 백신접종을 받은 동물의 항체 역가 측정을 위해, 1:100에서 1:10,000까지의 10-배 일련의 희석을 테스트하고, 테스트된 혈청의 역가(Log10으로 표현됨)는 컷-오프 A450이 0.5로 설정된, A450의 선형 회귀 분석으로 산출된다.
c. 면역원성 평가
동물 대상체로부터 면역-전 혈청 샘플과 면역 혈청 샘플을 실험적 백신 접종 프로토콜에 따라 수집하고, 56℃에서 30분 동안 가열하여 혈청 보체 인자를 비활성화시킨다. 상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들을 함유하는 제형의 투여-후, 프로토콜에 따라 혈액 샘플을 얻을 수 있으며, 특정 표적 부위(들)에 대한 이들의 면역원성은 대응하는 S-RBD B 세포 에피토프 펩티드-기반 ELISA 테스트를 사용하여 평가할 수 있다. 연속적으로 희석된 혈청을 테스트할 수 있으며, 양성 역가는 상호 희석의 Log10으로 표시할 수 있다. 특정 제형의 면역원성은 원하는 B 세포 반응을 향상시키기 위해 사용된 헬퍼 T 세포 에피토프에 대한 항체 반응성이 낮거나 무시할 수 있을 정도로 유지되면서, 표적 항원 내에서 원하는 에피토프 특이성을 지향하는 고-역가 항체 반응을 유도하는 능력 및 S-RBD 폴리펩티드와의 높은 교차 반응성에 대해 평가된다.
실시예 3
분석 제형에서 항원성 SARS-CoV-2 펩티드의 혼합물을 갖는 펩티드 조성물은 민감도를 향상시킨다
COVID-19의 조기 발견은 분자 프로브를 사용한 RT-PCR 분석과 같은 실험실 기준, 그리고 체온 상승, 마른 기침(non-productive cough) 등과 같은 임상 기준에 의해 이루어지지만, 민감하고 특이적인 항체 검출 분석은 혈청학적 감시에 바람직하다.
혈청 감시 및 진단을 위해 공개된 COVID-19 항체 검출 분석법을 개발할 때, 분석 특이성이 높은 우선순위로 간주된다. 환자를 불필요한 격리로 오진하지 않고, 발병을 억제하기 위한 긴급 공중 보건 조치의 불필요한 시행을 피하기 위해, 허용 가능한 COVID-19 항체 검사의 필수 조건은 높은 특이성이다.
혈청 감시 및 진단을 위해 허용되는 면역 분석법은 또한 높은 민감도를 가져야 한다. 따라서, SARS-CoV 혈청학에 대한 사전 지식을 기반으로, 펩티드 동족체로써 SARS-CoV-2 M 단백질, N 단백질, 그리고 S 단백질로부터 유래된 대응하는 항원성 펩티드의 혼합물 (가령, 서열 번호: 4, 17 및 37), 그리고 광범위한 혈청학적 검증을 통해 기획되고, 확인된 것들(가령, 서열 식별 번호: 4, 17, 37, 262, 265, 281, 322, 354)은 항체 검출을 위한 상보적 감도에 대한 항원으로 평가된다. ELISA 플레이트에 대한 선택된 펩티드의 결합 능력을 향상시키기 위해, 선택된 펩티드 유사체(예를 들어, 서열 번호: 5, 18, 그리고 38) 각각의 N-말단에 KKK-리신 꼬리가 추가된다. 더욱이, 광범위한 시험에서, 펩티드 혼합물의 사용으로 정상 혈청에 대한 펩티드 혼합물의 특이성이 손실되어서는 안 된다. 따라서, 서열 식별 번호: 5, 18, 그리고 38의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 항원성 펩티드 혼합물은 고형상 항원 흡착제로서 분석 제형을 위해 유지될 수 있다. 유사하게, 서열 식별 번호: 5, 18, 38, 261, 266, 281, 그리고 322의 아미노산 서열을 갖는 항원성 펩티드를 포함하는 혼합물은 분석 민감도를 향상시키기 위해 고형상 항원 흡착제로서 분석 제형에 사용될 수 있다(도 28). 서열 식별 번호: 5, 18, 38, 261, 266, 281, 322의 아미노산 서열을 갖는 이들 항원성 펩티드는 또한 각각 높은 특이성을 갖는 대응하는 성분 ELISAs에 대한 고형상 흡착제로서 개별적으로 제형화될 수 있고, 이들은 함께 SARS-CoV-2 감염에 대해 양성인 것으로 나타난 개체에 대한 항원 프로필을 제공하기 위해 확인 분석을 형성한다.
실시예 4
대규모 분석에서 감염된 집단, 무작위 혈액 기증자 집단 및 SARS-CoV-2이 아닌 기타 감염 집단에 대한 COVID-19 효소 면역 측정법의 평가
a. 기타 바이러스에 감염된 환자의 혈청 및 정상 혈청
2000년 이전, COVID-19와 관련이 없는 기타 바이러스 감염 환자로부터 얻은 혈청은 혈청학적 마커로 잘 문서화되어 있다. 플로리다 혈액 은행에서 정상적인 혈액 기증자들의 다수 혈청 패널을 얻었다. 임의의 공개된 COVID-19 사례들이 보고되기 최소 3년 전에 수집된 이 혈청 패널에서 SARS-CoV-2에 대한 반응성에 대한 혈청 유병률은 COVID-19 ELISA의 특이성 평가에 사용되었다.
b. SARS-CoV-2 검출을 위한 혼합 펩티드-기반 COVID-19 ELISA에 의한 분석
SARS-CoV-2 검출을 위한 ELISA 분석은 SARS-CoV-2 M 펩티드, N 펩티드 및 S 펩티드의 혼합물로 코팅된 96-웰 미량적정 플레이트 상에서 하기 기술된 방법에 의해 1:20으로 희석된 혈청으로 수행되었다. 96-웰 플레이트의 웰은 10mM NaHCO3 완충액, pH 9.5(달리 명시되지 않는 한)에서 웰당 100μL를 사용하여 2μg/mL의 SARS-CoV-2 M 단백질, N 단백질 및 S 단백질로부터 유래된 펩티드 혼합물로 37℃에서 1시간 동안 개별적으로 피복되었다. 비-특이적 단백질 결합 부위를 차단시키기 위해, 상기 펩티드-피복된 웰은 37℃에서 1 시간 동안 PBS에서 250μL의 3중량%의 젤라틴으로 항온처리하고, 이어서 0.05부피% TWEEN 20을 함유하는 PBS로 세 차례 세척하고, 그리고 건조시킨다. IFA에 의한 SARS-CoV-2-반응 항체에 대해 양성인 환자 혈청과 대조군 항체는 달리 명시되지 않는 한, 20부피% 정상적인 염소 혈청, 1중량% 젤라틴 및 0.05부피% TWEEN 20을 함유하는 PBS로 1:20 희석에서 SARS-CoV-2 펩티드 피복된 웰과의 교차-반응을 통하여 양성 대조군으로 이용되었다. 희석된 시료(가령, 혈청, 혈장) 100μL를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 60분 동안 반응시킨다. 그런 다음, 웰을 PBS 안에 0.05부피% TWEEN 20으로 6회 세척하여, 결합되지 않은 항체를 제거한다. 양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG는 양성 웰에서 형성된 SARS-CoV-2 항체/펩티드 항원 복합체에 결합하는 라벨된 추적자로 이용되었다. PBS 안에 1부피% 정상적인 염소 혈청, 0.05부피% TWEEN 20과, 사전적정된 최적 희석의 과산화효소-라벨된 염소 항-인간 IgG 100μL를 각 웰에 첨가하였고, 37℃에서 다시 30분 동안 항온처리하였다. 상기 웰들을 PBS 안에 0.05부피%의 TWEEN 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였고, 시트르산나트륨 완충액 안에 0.04중량%의 3', 3', 5', 5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 및 0.12부피%의 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100μL와 추가 15분 동안 반응시켰다. 이 기질 혼합물은 유색 산물을 형성함으로써, 과산화효소 라벨을 검출하는데 이용되었다. 100μL의 1.0M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시켰고, 450nm에서의 흡광도 (A450)를 측정하였다.
c. 해석을 위한 기준
ELISA 포멧에서 상당한 반응성, 즉, 컷오프 값은 평균 A450에 정상적인 모집단의 혈청 분포의 6 표준 편차를 더한 값보다 더 큰 A450 흡광도로 점수화되었다.
d. 결과
혈청 유병률이 0으로 추정되는 500개 이상의 정상 혈장 샘플과 혈청 샘플 패널로부터 샘플을 1:20 희석률로 테스트하였고, 혼합된 펩티드 SARS-CoV-2 ELISA에서 각각의 반응성을 평가했다. 정상적인 기증자 샘플은 0.074 ± 0.0342(SD)의 평균 A450을 제공하여, A450 컷오프 값은 0.274로 설정했다. 정상 혈청에 대한 신호 대 컷오프(S/C) 비율의 분포는 피크 S/C 비율 값이 0.3이었고, 이들 샘플 중 어느 것도 양성 반응성을 나타내지 않았다. 따라서, 정상 샘플에 대한 ELISA의 특이성은 설정된 컷오프 값에서 100%이었다.
대응하는 SARS-CoV-2 유래된 서열들을 갖는 펩티드 상동체를 이용하여 SARS-CoV-2 ELISA은 간섭 물질이 추가된, SARS-CoV-2와 무관한 감염, 이를 테면, HIV-1, HIV 2, HCV, HTLV 1/II, 그리고 매독에 걸린 환자들 샘플의 다수 패널과 정상적인 혈청 샘플로 테스트하여 특이성을 추가 평가한다.
혼합 펩티드 SARS-CoV-2 ELISA의 효능을 재확인하기 위해, 대만, 상하이, 북경 및 Wuhan의 감염된 COVID-19 환자들로부터 얻은 혈청으로 추가 혈청 분석을 테스트할 예정이다. COVID-19가 확진된 환자들로부터 얻은 모든 혈청 및 IFA에서 검출된 SARS-CoV-2에 대한 항체 역가가 있는 것으로 나타난 샘플들은 혈청전환 과정 및 그러한 항체의 지속성에 대해, 0일에서 30일 사이의 연속 출혈 날짜 및 더 긴 기간 동안 테스트될 것이다. 이러한 가계도 혈청전환 패널의 결과는 감염 시 항-SARS-CoV-2 M 항체, N 항체 및 S 항체의 가장 초기 검출 가능한 수준 및 그러한 항체의 지속 기간을 나타내는 정보를 제공할 것이다. SARS-CoV-2에 감염되고, 바이러스 부하는 높지만 무증상 상태를 유지하는 희귀 슈퍼 전파자(출원일 까지 발견된 것이 <2%임)를 식별해내고, 의도하지 않은 일반 대중의 건강을 위협하는 알려지지 않은 감염을 최소화시키기 위해, 병원 의료 종사자, 택시 운전사, 비행기 승무원 및 일반 대중과 지속적으로 접촉하는 사람들을 비롯한, 위험에 처한 개체에 대한 대규모 혈청 검사를 수행하는 것이 특히 중요하다.
요약하면, COVID-19에 대한 혈청 감시의 대규모 적용을 위해 간단하고, 신속하며, 편리한 ELISA 포멧의 매우 민감하고, 특이적인 SARS-CoV-2 항체 검출 테스트가 개발되었다. 이 테스트는 SARS-CoV-2 M 단백질, N 단백질 및 S 단백질의 세그먼트에 대응하는 항원성 합성 펩티드와 이의 면역학적 기능 유사체, 분기형 및 선형 형태, 콘쥬게이트 및 중합체를 포함하는 고형상 면역흡착제를 기반으로 한다. 이 면역분석은 분자 프로브 기반 또는 기타 바이러스 검출 시스템과 함께 사용하기에 적합하다. SARS-CoV-2 항원성 펩티드의 선택에 부과된 높은 엄격함과 상보적인 부위-특이적인 에피토프를 갖는 펩티드 혼합물에 의해 제공되는 높은 민감도에 의해 제공되는 이러한 펩티드-기반 SARS-CoV-2 면역분석 시스템의 높은 특이성으로 국가적 역학 조사에 적합한 테스트가 된다. 이러한 테스트는 COVID-19 발병으로 고통받거나, 또는 COVID-19의 존재가 의심되는 국가에서 유행병 연구를 위해 사용할 수 있다. 또한, 무관한 호흡기 바이러스 및 박테리아로 인한 질환과 SARS-CoV-2 감염의 분별에 매우 특이적인 면역 분석을 사용할 수 있다. 본 발명의 면역분석은 COVID-19의 부적절한 과잉- 보고를 없애고, 격리된 환자의 수를 줄이며, 질환 전파를 억제하기 위한 응급 조치와 관련된 기타 비용을 줄일 수 있다.
실시예 5
안전성, 면역원성, 독성, 그리고 효능 연구에 이용된 동물
a. 기니아 피그:
면역원성 연구는 다자란, 순진한(
Figure pct00008
), 성체 수컷 및 암컷 Duncan-Hartley 기니피그(300-350g/BW)에서 수행할 수 있다. 이 실험은 그룹당 최소 3마리의 기니피그를 사용한다.
Duncan-Hartley 기니피그 (8-12주령; Covance Research Laboratories, Denver, PA, USA)와 관련된 프로토콜은 UBI 후원 하에 계약된 동물 시설에서 승인된 IACUC 응용 프로그램에 따라 수행된다.
b. 시노몰구스 원숭이(Cynomolgus macaques):
성체 수컷 및 암컷 원숭이(필리핀 원숭이(Macaca fascicularis), 대략적으로 3-4세; JOINN Laboratories, Suzhou, China)에 대한 면역원성 및 반복된 투여분량 독성 연구는 UBI 후원 하에 계약된 동물 시설에서 승인된 IACUC 적용 하에 수행되었다.
실시예 6
상기 S-RBD 펩티드 면역원 구조체들과 이의 제형들에 의해 유도된 항체의 기능적 속성 평가
기니아 피그에서 생성된 면역 혈청 또는 정제된 항-S-RBD 항체들은 (1) 서열 식별 번호: 26, 226, 그리고 227의 서열을 갖는 S-RBD 펩티드 및 폴리펩티드에 결합하는 능력; (2) ELISA 분석 및 면역형광 ACE2 표면 발현 결합 분석에서 ACE2 수용체에 S-RBD 단백질이 결합하는 것을 저해시키는 능력; 그리고 (3) 시험관내 표적 세포 바이러스 복제를 중화시키는 능력에 대해 추가 테스트될 수 있다.
a. 항체 결합 분석
이 분석의 목적은 면역화된 기니피그에서 파생된 면역 혈청이 SARS-CoV-2 스파이크 (S) 단백질을 인지할 수 있음을 입증하는 것이다. 구체적으로, 1μg/ml 재조합 S 단백질을 사용하여 4℃에서 밤새 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.6)에서 96-웰 미량적정 플레이트(MaxiSorp NUNC)에 피복시킨다. 2% BSA로 차단시킨 후, 연속 희석된 항혈청을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 항온처리한 다음, 0.1% TWEEN 20을 함유하는 PBS로 4회 세척한다. 결합된 항혈청은 37℃에서 1시간 동안 염소 항-기니피그 IgG H&L (HRP) (ABcam, ab6908)로 검출된 후, 4회 세척한다. 기질, 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 각 웰에 추가하고, 37℃에서 20분 동안 항온처리한다. 450 nm에서 흡광도는 ELISA 플레이트 판독기 (Molecular Device)를 이용하여 측정한다.
b. 항체 중화 분석
이 분석의 목적은 S-RBD 펩티드 면역원 구조체 (서열 번호: 107-144) 또는 S-RBD 융합 단백질 (S-RBD-sFc 및 S-RBDa-sFc (차례로, 각각 서열 번호: 235 및 236)을 투여받은 동물의 면역 혈청에 있는 항체들이 ACE2 수용체의 존재 하에 중화 또는 수용체 결합 억제 속성을 갖는 지를 실증하는 것이다. 구체적으로, 1μg/ml 재조합 S 단백질 (서열 식별 번호: 20) 또는 S-RBD 단백질 (서열 식별 번호: 226, 227)을 사용하여 4℃에서 밤새 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.6)에서 96-웰 미량적정 플레이트(MaxiSorp NUNC)에 피복시킨다. 2% BSA을 이용하여 차단시킨 후, 연속적으로 희석된 면역 혈청을 S 단백질 또는 S-RBD 폴리펩티드 피복된 96 웰 플레이트에서 37℃에서 1 시간 동안 hACE2와 함께 공동-항온처리한 후, 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS로 4회 세척시킨다. 결합된 ACE2ECD 또는 ACE2NECD 펩티드 (서열 식별 번호: 229-230)는 37℃에서 1 시간 동안 염소-항-HuACE2 Ab (HRP) (R&D System)로 검출하고, 4회 세척시킨다. 기질, 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 각 웰에 추가하고, 37℃에서 20분 동안 항온처리한다. 450 nm에서 흡광도는 ELISA 플레이트 판독기 (Molecular Device)를 이용하여 측정한다. 신호는 중화 항체 농도에 역-비례한다. 중화 역가는 혈청 희석 배수의 역수로 표시된다.
c. 세포-기반 중화 분석 (유동 세포측정법)
S-RBD (S-RBD 펩티드 면역원 구조체들, S-RBD-sFc 융합 단백질, 또는 S-RBDa-sFc 융합 단백질)를 지향하는 면역 혈청에 의해 ACE2-발현된 세포에 대한 SARS-CoV-2 S 단백질 결합의 중화 분석은 유동 세포측정법에 의해 측정된다. 간략하게 설명하자면, 106 HEK293/ACE2 세포를 탈착시키고, 수거하고, HBSS (Sigma-Aldrich)로 세척한다. SARS-CoV-2의 S 단백질은 연속적으로 희석된 면역 혈청의 존재 또는 부재 하에, 1μg/mL의 최종 농도로 세포에 첨가되고, 30 분동안 실온에서 항온처리한다. 세포를 HBSS로 세척하고, 추가 30분 동안 실온에서 1/50 희석으로 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 (HRP)와 함께 항온처리한다. 세척 후, 세포를 PBS에서 1% 포름알데히드로 고정시키고, FACSCalibur 유세포분석기 (BD Biosciences)에서 소프트웨어를 이용하여 분석한다.
d. SARS-CoV-2 감염의 중화
S-RBD 펩티드 면역원 구조체들, S-RBD-sFc 융합 단백질, 또는 S-RBDa-sFc 융합 단백질로 면역접종된 기니아 피그로부터 유래된 면역 혈청이 시험관내 분석에서 hACE2 중화에 효과를 실증한 후, 이 면역 혈청을 SARS-CoV-2 중화 분석에서 테스트할 것이다.
간략하게 설명하자면, Vero E6 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 5 x 104 세포로 플레이팅하고, 하룻밤 동안 성장시킨다. SARS-CoV-2의 100μL의 50% 조직-배양 감염 투여분량을 등가 부피의 희석된 기니아 피그 면역 혈청과 혼합하고, 37℃에서 1 h 동안 항온처리한다. 혼합물을 Vero E6 세포의 단층에 첨가한다. 세포병변성 효과(CPE)는 감염-후 3일차 시점에 기록된다. 웰의 50%에서 CPE를 완전하게 막은 GP 면역 혈청의 희석을 나타내는 중화 역가는 Reed-Muench 방법에 의해 산출된다.
실시예 7
항바이러스 치료요법으로써 ACE2-SFC 융합 단백질 개발에 이용된 분석
1. hACE2 단백질 약물 개발을 위한 분석
a. 결합 분석
다음 분석은 hACE2 융합 단백질들 (ACE2-ECD-sFc, 서열 식별 번호: 237-238의 ACE2N-ECD-sFc)이 ACE2-ECD-Fc와 비교하였을 때, 이의 천연 리간드 (SARS-CoV-2의 S 단백질)에 의해 인지될 수 있는 지를 실증하기 위해 기획된다. 구체적으로, 1μg/ml 재조합 S 단백질 (Sino Biological)사용하여 4℃에서 밤새 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.6)에서 96-웰 미량적정 플레이트(MaxiSorp NUNC)에 피복시킨다. 2% BSA로 차단시킨 후, 0.5μg/mL의 농도로 ACE2 단백질을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 항온처리한 다음, 0.1% TWEEN 20을 함유하는 PBS로 4회 세척한다. 결합된 ACE2 단백질들은 37℃에서 1 h 동안 토끼 항-인간 ACE2 다중클론성 항체:HRP (My Biosource, CN: MBS7044727)로 검출된 후, 4회 세척한다. 기질, 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 각 웰에 추가하고, 37℃에서 20분 동안 항온처리한다. 450 nm에서 흡광도는 ELISA 플레이트 판독기 (Molecular Device)를 이용하여 측정한다.
b. 차단 분석
이 분석의 목적은 ACE2-ECD-Fc와 비교하였을 때, S 단백질과 ACE2 간의 결합이 ACE2 융합 단백질 (차례로, 각각 서열 식별 번호: 237 및 238의 ACE2-ECD-sFc 및 ACE2N-ECD-sFc)에 의해 차단될 수 있는지 여부를 실증하는 것이다. 구체적으로, 1μg/ml ACE2를 사용하여 4℃에서 밤새 0.1M 탄산염 완충액(pH 9.6)에서 96-웰 미량적정 플레이트(MaxiSorp NUNC)에 피복시킨다. 2% BSA을 이용하여 차단시킨 후, 연속적으로 희석된 재조합 ACE2 단백질들을 SARS-CoV-2 S 단백질과 함께 37℃에서 1 시간 동안 공동-항온처리한 후, 0.1% TWEEN 20을 함유하는 PBS로 4회 세척시킨다. 결합된 S 단백질은 37℃에서 1 시간 동안 항-SARS-CoV-2 S 항체 (HRP)로 검출하고, 4회 세척시킨다. 기질, 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘 (TMB)을 각 웰에 추가하고, 37℃에서 20분 동안 항온처리한다. 450 nm에서 흡광도는 ELISA 플레이트 판독기 (Molecular Device)를 이용하여 측정한다. 신호는 단백질의 희석 배수에 역-비례한다.
c. 세포-기반 중화 분석 (유동 세포측정법)
ACE2 융합 단백질들 (차례로, 각각 서열 식별 번호: 237 및 238의 ACE2-ECD-sFc 및 ACE2N-ECD-sFc)에 의해 ACE2-발현되는 세포에 SARS-CoV-2 S 단백질 결합 중화를 유동 세포측정법으로 측정한다. 간략하게 설명하자면, 106 HEK293/ACE2 세포를 탈착시키고, 수거하고, HBSS (Sigma-Aldrich)로 세척한다. SARS-CoV-2 S 단백질은 연속적으로 희석된 ACE2 재조합 단백질들의 존재 또는 부재 하에, 1μg/mL의 최종 농도로 세포에 첨가되고, 30 분동안 실온에서 항온처리한다. 세포를 HBSS로 세척하고, 추가 30분 동안 실온에서 1/50 희석으로 항-SARS-CoV-2 S Ab (HRP)와 함께 항온처리한다. 세척 후, 세포를 PBS에서 1% 포름알데히드로 고정시키고, FACSCalibur 유세포분석기 (BD Biosciences)에서 소프트웨어를 이용하여 분석한다.
d. SPR 분석에 의한 친화력 결정
S-RBD-Fc는 포집 키트(GE, BR100839)의 사용 설명서와 함께, SPR 기기(GE, Biacore X100)를 사용하여, CM5 센서 칩에 고정된다. 반응 주기 동안, 일정한 수준의 재조합 단백질이 초기에 센서 칩 상에 포집된다. 순차적으로, 샘플 (ACE2-ECD-sFc 또는 ACE2N-ECD-sFc)은 연합을 위해 칩을 통해 각 주기에서 다양한 농도로 유동된 다음, 해리를 위해 러닝 완충제를 통하여 유동된다. 마지막으로, 상기 칩은 다음 반응 주기를 위해 재생 완충제로 재생된다. 데이터 분석을 위해, 최소 5회 반응 주기로부터 결합 패턴(또는 센소그램)을 BIAevaluation 소프트웨어로 분석하여, 친화력 매개변수, 이를 테면, KD, Ka 및 kd를 얻는다.
실시예 8
CHO 세포에서 S-RBD 융합 단백질들의 기획, 플라스미드 작제 및 이들 단백질 발현
1. cDNA 서열의 기획
CHO 세포 발현을 위해 SARS-CoV-2 (서열 식별 번호: 239)의 S 단백질의 cDNA 서열을 최적화시킨다. 이 핵산은 서열 식별 번호: 20에 나타낸 S 단백질을 인코드한다. S 단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD)은 SARS-CoV의 S 단백질 서열 (서열 식별 번호: 21)은 SARS-CoV-2의 대응하는 서열 (서열 식별 번호: 20)과 정렬시킴으로써 확인되었다. SARS-CoV-2의 S-RBD 폴리펩티드 (aa331-530) (펩티드 서열 식별 번호: 226; DNA 서열 식별 번호: 240)는 SARS-CoV의 S-RBD 서열에 대응하며, 이는 hACE2에 높은 친화력으로 결합하는 결합 도메인으로 입증되었다.
COVID-19 감염으로부터 개체들을 보호하기 위한 약제학적 조성물을 개발하기 위해, S 단백질의 RBD는 면역화 후, SARS-CoV-2를 중화시키는 항체를 유도하는 중요한 표적이다. 상기 S-RBD-Fc 융합 단백질 (DNA 서열 식별 번호: 246)를 만들기 위해, SARS-CoV-2의 S-RBD (aa331-530)를 인코딩하는 핵산 서열 (DNA 서열 식별 번호: 240)을 면역글로불린 Fc (DNA 서열 식별 번호: 245)의 단일 쇄의 N-말단에 융합시킨다(도 6A 그리고 도 7에 나타낸 플라스미드 지도) CHO 발현 시스템에서 S-RBD 융합 단백질에서 결정적이지 않은 이황화결합 형성의 불일치를 회피하기 위해, S-RBD 폴리펩티드 (아미노산 서열 식별 번호: 227; DNA 서열 식별 번호: 241)에서 Cys391은 Ala391로 대체되며, Cys525는 Ala525로 대체된 S-RBDa-sFc 융합 단백질 (아미노산 서열 식별 번호: 236; DNA 서열 식별 번호: 247)이 생성된다.
수동 면역화로써 바이러스 억제에 의한 중화 중재를 발달시키기 위해, 바이러스 진입을 매개하는 SARS-CoV-2의 수용체로 작용하는 인간 안지오텐신 전환 효소 II (ACE2 수탁 NP_001358344, 아미노산 서열 식별 번호: 228; DNA 서열 식별 번호: 242)는 S 단백질을 차단시키는 주요 표적이다. 기존 연구 (Sui J., et al. 2004)에서, 결합 친화력은 1.70E-9이며, 이는 중화에 대한 유효한 mAb에 해당한다. 고혈압 치료에 대한 일부 ACE2 임상 시험에서 매우 높은 투여분량 투여시 안전성 프로파일이 입증되었기 때문에 (Arendse, L.B. et al. 2019), ACE2의 높은 투여분량 투여는 코로나바이러스 감염 환자의 치료에 충분히 안전해야 한다.
ACE2의 세포-외 도메인 (아미노산 서열 식별 번호: 229; DNA 서열 식별 번호: 243)은 단일 쇄 면역글로불린 Fc (아미노산 서열 식별 번호: 232; DNA 서열 식별 번호: 245)와 융합되어 S-ACE2ECD-Fc 융합 단백질 (DNA 서열 식별 번호: 248)을 만든다(도 6C에 나타내며, 도 8에는 플라스미드 맵을 나타낸다). 안전성 불확실성을 줄이기 위해, CHO 발현 시스템에서 ACE2ECD 융합 단백질의 펩티다제 활성을 제거하는 융합 단백질을 생산할 수 있다. 구체적으로, ACE2의 아연 결합 도메인 (아미노산 서열 식별 번호: 230; DNA 서열 식별 번호: 244)에서 His374는 Asn374로 대체되며, His378은 Asn378로 대체되어 ACE2NECD 융합 단백질 (아미노산 서열 식별 번호: 238; DNA 서열 식별 번호: 249)이 만들어진다. 상기 힌지 영역에 이황화결합 형성이 없기 때문에, sFc와의 큰 단백질 융합은 가장 강력한 중화 효과를 얻기 위해 S 단백질에 결합을 강요하지 않을 것이다. 단일 사슬 Fc의 구조는 정제 과정에서 단백질 A 결합과 용리에 의해 정제되는 장점도 있다. Cys345-Cys370, Cys388-Cys441 및 Cys489-Cys497와의 다른 이황화결합 형성은 ACE2에 대한 형태 결합을 유지하도록 서열 디자인에 여전히 보존된다.
2. 플라스미드 구축 및 단백질 발현
a. 플라스미드 구축
상기 S-RBD-Fc 및 S-RBDa-Fc 융합 단백질들을 발현시키기 위해, 이들 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열들은 적합한 세포주에서 생산될 수 있다. 상기 cDNA 단편의 N-말단이 단백질 분비를 위한 리더 신호 서열에 추가되며, C-말단은 트롬빈 분열 서열 다음에 단일-쇄 Fc (sFc) 또는 His-테그에 연계될 수 있다. cDNA 단편들은 pND 발현 벡터에 삽입될 수 있고, 이 벡터는 선별용 네오마이신 내성 유전자와 유전자 증폭용 dhfr 유전자를 함유한다. 상기 벡터 및 cDNA 단편들은 PacI/EcoRV 제한 효소로 절단되고, 그 다음 결찰되어, 4개의 발현 벡터, pS-RBD, pS-RBD-sFc, pS-RBDa, 그리고 pS-RBDa-sFc가 수득된다.
ACE2ECD 및 ACE2NECD 융합 단백질들을 발현시키기 위해, 이들 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열들은 적합한 세포주에서 생산될 수 있다. 상기 cDNA 단편의 C-말단은 트롬빈 분열 서열 다음 단일-쇄 Fc 또는 His-테그에 연계될 수 있다. 상기 cDNA 단편들을 pND 발현 벡터로 삽입시켜, 4개의 발현 벡터, pACE2-ECD, pACE2-ECD-sFc, pACE2N-ECD, pACE2N-ECD-sFc를 얻는다.
b. 숙주 세포주
CHO-S™ 세포주 (Gibco, A1134601)는 성체 중국 햄스터의 난소에서 확립된 안정적인 이수성 세포주다. 상기 숙주 세포주 CHO-S™는 무-혈청 현탁액에서 성장되도록 개작하며, 높은 형질감염 효율을 갖는 FREESTYLE™ MAX 시약에 필적한다. CHO-S 세포는 8mM 글루타민 보충제(Life Technologies, Cat. 25030081) 및 항-응집제(Gibco, Cat. 0010057DG)가 보충된 DYNAMIS™ 배지(Gibco, Cat. A26175-01)에서 배양된다.
ExpiCHO-S™ 세포주 (Gibco, Cat. A29127)는 CHO-S 세포주의 클론 유도체다. ExpiCHO-S™ 세포는 임의의 보충물없이, ExpiCHO™ 발현 배지(Gibco, Cat. A29100)에서 고-밀도 현탁 배지에 맞도록 개작된다. 이들 세포는 8% CO2로 가습화된 대기와 함께, 37℃ 인큐베이터에서 유지된다.
c. 일과성 발현
일과성 발현을 위해, 발현 벡터들은 EXPIFECTAMINE™ CHO 키트 (Gibco, Cat. A29129)를 이용하여 ExpiCHO-S 세포로 개별적으로 형질감염된다. 형질감염-후 1일차 시점에, EXPIFECTAMINE™ CHO 인핸서와 첫 번째 공급물(feed)이 첨가되고, 세포는 8% CO2의 가습 대기가 있는 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2의 가습 대기가 있는 32℃ 인큐베이터로 이동시킨다. 그 다음, 제 2 공급물을 형질감염-후 5일차 시점에서 추가하며, 세포 배양물은 형질감염-후 12-14일차 시점에서 수거한다. 상기 세포 배양물을 수거한 후, 상청액을 원심분리 및 0.22-μm 여과로 정화시킨다. 단일-쇄 Fc 및 His-테그를 함유하는 재조합 단백질은 차례로 단백질 A 크로마토그래피 (Gibco, Cat. 101006) 및 Ni-NTA 크로마토그래피 (Invitrogen, Cat. R90101)에 의해 정제된다.
d. 안정적 형질감염 및 세포 선별
상기 발현 벡터는 FreeStyle MAX 시약 (Gibco, Cat. 16447500)을 이용하여 CHO-S 세포로 형질감염시키고, 그 다음 8mM L-글루타민, 항-응집제(1:100 희석으로), 푸로마이신 (InvovoGen, Cat. ant-pr-1), 그리고 MTX (Sigma, Cat. M8407)을 함유하는 선별 DYNAMIS™ 배지와 함께 항온처리한다. 2 라운드의 선택 단계 후, 4개의 안정적인 풀(1A, 1B, 2A, 2B)을 얻는다. 더욱이, 세포 클론을 반-고체 CloneMedia(Molecular Devices, Cat. K8700)에 플레이팅하고, 클론 스크리닝 및 고처리량 시스템 ClonePixTM2(CP2)에 의한 단일 세포 단리를 위한 검출 항체를 동시에 첨가한다. CP2에 의해 선별된 클론은 선별 없이, 8mM 글루타민 및 항-응집제가 포함된 DYNAMIS™ 배지에서 14-일 포도당 단순 유가식(fed-batch) 배양을 사용하여 스크리닝된다. 스크리닝 후, 클론을 제한 희석에 의해 고-수율의 단일 세포 단리를 수행하고, CloneSelect Imager(Molecular Devices)를 사용하여 이미징하여 단일클론성을 확인한다.
e. 단순 유가식 배양물
단순 유가식 배양은 재조합 단백질을 발현시키는 CHO-S 세포의 생산성 결정에 사용된다. CHO-S 세포는 125-mL 쉐이커 플라스크에 8mM 글루타민 및 응집 방지제(1:100 희석)가 보충된 30mL DYNAMIS 배지에서 3 x 105 세포/mL로 씨딩된다. 이들 세포는 8% CO2로 가습화된 대기와 함께, 37℃ 인큐베이터에서 항온처리된다. 3일차 및 5일차 시점에 4g/L의 포도당이 추가되고, 7일차 시점에 6g/L의 포도당이 추가된다. 세포 생존율이 50% 미만으로 떨어지거나 또는 배양 14일차에 도달할 때까지, 배양물을 매일 수집하여 세포 밀도, 생존율 및 생산성을 결정한다.
f. 유전자 전사체의 정확도
CHO-S 발현 세포에 의한 유전자 전사의 정확도는 RT-PCR에 의해 확인된다. 간략하게 설명하자면, 세포의 전체 RNA는 PURELINK™ RNA Mini Kit (Invitrogen Cat. 12183018A)를 이용하여 단리된다. 그 다음, 첫 번째 가닥 cDNA는 Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Cat. K1652)를 사용하여 전체 RNA로부터 역전사된다. 재조합 단백질들의 cDNA를 정제하고, yT&A 벡터 (Yeastern Biotech Co., Ltd Cat.YC203)에 결찰시킨다. 끝으로, 상기 cDNA 서열은 DNA 서열화에 의해 확인된다.
g. 발현 세포의 안정성
상기 세포를 1~2 x 105 세포/mL로 씨딩하고, 선별 시약이 없는 배지에서 60세대 동안 배양한다. 이 기간 동안, 배양물의 세포 밀도가 1.0 x 106 세포/mL 이상에 도달하면, 배양물을 다시 1~2 x 105 세포/mL의 세포 밀도로 계대한다. 60세대 동안 배양한 후, 세포 수행능 및 생산성을 포도당 단순 유가식 배양을 사용하여 LMCB에서 방금 해동한 세포와 비교한다. 세포 내 산물 생산성의 안정성 기준은 60-세대 배양 후 역가가 70% 이상이다.
실시예 9
sFc 융합 단백질 및 HIS-태그된 단백질의 정제 및 생화학적 특성화
1. sFc 융합 단백질들의 정제
모든 sFc 융합 단백질을 수확된 세포 배양 조건 배지로부터 단백질 A-세파로스 크로마토그래피에 의해 정제하였다. sFc 융합 단백질은 단백질 A 친화성 컬럼에 의해 포획되었다. 세척 및 용리 후, 단백질 용액의 pH를 3.5로 조정하였다. 이어서, 1M Tris 염기 완충액, pH 10.8을 첨가하여 단백질 용액을 pH 6.0으로 중화시켰다. 상기 융합 단백질의 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정하였다. 280 nm의 파장에서 UV 흡광도에 따라 단백질 농도를 측정하였다.
2. His-테그된 단백질들
컨디셔닝된 배지를 Ni-NTA 수지와 혼합하여, 제조업체 설명서에 따라 융합 단백질을 정제했다. His-테그된 단백질들은 pH 8.0에서 50 mmolㆍL-1 NaH2PO4, 300 mmolㆍL-1 NaCl 및 250 mmolㆍL-1 이미다졸을 포함하는 용출에서 용출되었다. 상기 용출된 용액을 Amicon YM-5를 이용하여 농축시킨 후, 불순물을 제거하는 Sephadex G-75 컬럼과 염을 제거하는 Sephadex G-25 컬럼에 통과시켰고; 그 다음 수집된 단백질 용액은 냉동건조되었다. His-테그된 단백질들의 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정하였다. 280 nm의 파장에서 UV 흡광도에 따라 단백질 농도를 측정하였다.
3. (1) SARS-CoV-2 감염된 개체, 이로부터 회복된 개체 또는 백진접종을 받은 개체에서 중화 항체 측정을 위한 고-정밀 ELISA에 이용되는, (2) SARS-CoV-2 감염 예방을 위한 면역원으로써 이용되는, 그리고 (3) 오래-작용하는 항바이러스 단백질 COVID-19 치료용으로 이용되는 sFc 융합 단백질들과 His-테그된 단백질들의 생물화학적 특징화
(1) COVID-19에 감염되고, 회복된 환자들, 또는 SARS-CoV-2 백신접종된 개체에서 중화 항체 측정을 위한 고도의 정확한 ELISA에 시약으로 사용을 위해, (2) SARS-CoV-2 감염 예방을 위한 높은 정확성 기획 백신 제형에서 대표적인 면역원으로 사용을 위해, 그리고 (3) 오래 작용하는 항바이러스 단백질 COVID-19 치료용으로 사용을 위해, 상기 기술된 방법에 따라 S1-RBD-His (서열 식별 번호: 335), S1-RBD-sFc (서열 식별 번호: 235), 그리고 ACE2-ECD-sFc (서열 식별 번호: 237)를 준비하였고, 정제하였다.
sFc 융합 단백질 및 His-테그된 단백질의 정제 후, 단백질의 순도는 비-환원 조건 및 환원 조건 하에서 테그된 블루 착색을 사용하여, SDS-PAGE에 의해 결정되었다 (도 9-11). 도 9는 비-환원 조건(레인 2) 및 환원 조건(레인 3)에서 S1-RBD-sFc 단백질의 고도로 정제된 조제물을 보여주는 이미지이다. 도 10은 비-환원 조건(레인 2) 및 환원 조건(레인 3)에서 S1-RBD-His 단백질의 고도로 정제된 조제물을 보여주는 이미지이다. 도 11은 비-환원 조건(레인 2) 및 환원 조건(레인 3)에서 ACE2-ECD-sFc 단백질의 고도로 정제된 조제물을 보여주는 이미지이다.
상기 정제된 단백질들을 질량 분광 분석 및 당화 분석을 통하여 추가 특징화시켰다.
a. S1-RBD-His - LC 질량 분석
상기 정제된 S1-RBD-His 단백질을 LC 질량 분광 분석에 의해 추가 특징화시켰다. S1-RBD-His 단백질의 아미노산 서열에 기초하여, 이 단백질의 이론적인 분자량은 당화를 비롯한, 해독-후 변형을 고려하지 않은 경우, 24,100.96 Da이다. 도 12는 분자량이 26,783 Da~28,932 Da 사이인 분자 종의 그룹이 검출되었으며, 주요 피크는 27,390.89 Da으로써, 이 단백질이 당화되었음을 암시한다.
b. S-RBD-sFc - LC 질량 분석 및 당화 분석
i. 당화
당단백질들은 두 가지 유형의 당화 링키지를 가질 수 있다: N-연계된 당화 및 O-연계된 당화. N-연계된 당화는 일반적으로 서열 Asn-Xaa-Ser/Thr안에 아스파라긴(Asn) 잔기에서 발생하며, 여기에서 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산 잔기이고, 탄수화물 모이어티는 아스파라긴의 측쇄 상의 NH2를 통하여 이 단백질에 부착된다. O-연계된 당화는 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기의 측쇄 OH 그룹을 이용한다.
S-RBD-sFc의 당화 부위는 트립신 분해 후 LC-MS 및 MS/MS로 조사되었다(도 13 및 도 14). 도 13에서는 S-RBD-sFc가 아미노산 위치 13 (N13)의 아르기닌 잔기 상에 N-연계된 당화 부위, 그리고 아미노산 위치 211 (S211) 및 224 (S224)의 세린 잔기 상에 O-당화 부위를 갖는다는 것을 보여준다.
ii. N-당화
S-RBD-sFc의 N-연계된 글리칸 구조는 질량 분석법(MS) 스펙트럼 기술에 의해 분석되었다. 간단히 말해서, PNGase F는 정제된 단백질에서 N-올리고사카라이드 방출에 사용되었다. 그 다음, N-연계된 글리칸의 일부분은 질량 분석에서 글리칸 신호를 향상시키기 위해, 2-아미노벤즈아미드(2-AB)로 추가로 라벨되었다. 마지막으로, 콘쥬게이트된 올리고사카라이드는 매핑을 위한 형광 검출기가 있는 정상적인-상(phase) HPLC와 구조적 식별을 위한 질량 분석기에 의해 조사되었다. 도 13은 10개의 N-연계된 글리칸이 S-RBD-sFc 단백질에서 확인되었음을 보여주며, 주요 N-글리칸은 G0F 및 G0F+N임을 보여준다. S-RBD-sFc의 N-연계된 글리칸의 탄수화물 구조는 표 14에 요약된다.
iii. O-당화
S-RBD-sFc의 O-연계된 글리칸은 트립신 절단에 이어, 질량 분석 스펙트럼 기술에 의해 조사되었다. 트립신 분해 후, O-연계된 글리칸을 함유하는 피크를 수집하고, 질량 분석에 의해 분자량을 결정하였다. 도 13에서는 상기 S-RBD-sFc 단백질 상에서 6개의 O-연계된 글리칸이 확인되었음을 보여준다. S-RBD-sFc의 O-연계된 글리칸의 탄수화물 구조는 표 15에 요약된다.
iv. LC 질량 분광 분석
상기 정제된 S1-RBD-sFc 단백질은 LC 질량 분광 분석에 의해 특징화되었다. S1-RBD-sFc 단백질의 아미노산 서열에 기초하여, 이 단백질의 이론적 분자량은 48,347.04 Da이다. 도 14는 S1-RBD-sFc 단백질의 질량 분석 프로파일을 보여주며, 주요 피크는 49,984.51 Da에 있다. 이론 분자량과 LC 질량분석기로 관찰한 중량의 차이는 1,637.47 Da이며, 이는 이 도면에 나타낸 것과 같이, 정제된 S-RBD-sFc 단백질이 N- 및/또는 O-글리칸을 함유하고 있음을 암시한다.
c. ACE2-ECD-sFc - LC 질량 분석 및 당화 분석
i. 당화
ACE2-ECD-sFc의 당화 부위는 트립신 분해 후 LC-MS 및 MS/MS로 조사되었다. 도 15에서는 상기 ACE2-ECD-sFc 단백질은 7개의 N-연계된 당화 부위 (N53, N90, N103, N322, N432, N546, N690), 그리고 7개의 O-연계된 당화 부위 (S721, T730, S740, S744, T748, S751, S764)를 보유한다는 것을 보여준다.
ii. N-당화
ACE2-ECD-sFc의 N-연계된 글리칸 구조는 질량 분석법(MS) 스펙트럼 기술에 의해 분석되었다. 간단히 말해서, PNGase F는 단백질로부터 N-올리고사카라이드 방출에 사용되었다. 그 다음, N-연계된 글리칸의 일부분은 질량 분석에서 글리칸 신호를 향상시키기 위해, 2-아미노벤즈아미드(2-AB)로 추가로 라벨되었다. 마지막으로, 콘쥬게이트된 올리고사카라이드는 매핑을 위한 형광 검출기가 있는 정상적인-상(phase) HPLC와 구조적 식별을 위한 질량 분석기에 의해 조사되었다. 도 15는 17개의 N-연계된 글리칸이 ACE2-ECD-sFc 단백질에서 확인되었음을 보여주며, 주요 N-글리칸은 G0F 및 G0F+N임을 보여준다. ACE2-ECD-sFc의 N-연계된 글리칸의 탄수화물 구조는 표 16 요약된다.
iii. O-당화
ACE2-ECD-sFc의 O-연계된 글리칸 구조는 트립신 절단에 이어, 질량 분석 스펙트럼 기술에 의해 조사되었다. 트립신 분해 후, O-연계된 글리칸을 함유하는 피크를 수집하고, 질량 분석에 의해 분자량을 결정하였다. 도 15에서는 8개의 O-연계된 글리칸이 확인되었음을 보여준다. ACE2-ECD-sFc의 O-연계된 글리칸의 탄수화물 구조는 표 17에 요약된다.
iv. LC 질량 분광 분석
상기 정제된 ACE2-ECD-sFc 단백질은 LC 질량 분광 분석에 의해 특징화되었다. ACE2-ECD-sFc 단백질의 아미노산 서열에 기초하여, 이 단백질의 이론적 분자량은 111,234.70 Da이다. 도 16은 ACE2-ECD-sFc 단백질의 질량 분석 프로파일을 보여주며, 주요 피크는 117,748.534 Da에 있다. 이론 분자량과 LC 질량분석기로 관찰한 중량의 차이는 1,637.47 Da이며, 이는 이 도면에 나타낸 것과 같이, 정제된 ACE2-ECD-sFc 단백질이 N- 및/또는 O-글리칸을 함유하고 있음을 암시한다.
d. S1-RBD-sFc의 서열 및 구조
S1-RBD-sFc 융합 단백질 (서열 식별 번호: 235)의 서열 및 구조는 도 52A에 나타낸다. S1-RBD-sFc 단백질은 1개의 N-연계된 글리칸 (Asn13)과 2개의 O-연계된 글리칸 (Ser211 및 Ser224)으로 구성된 당단백질이다. 음영화된 일부분 (aa1 - aa200)은 SARS-CoV-2의 S1-RBD 일부분 (서열 식별 번호: 226)을 나타내고, 상자로 표시된 부분 (aa201 - aa215)은 돌연변이된 힌지 영역 (서열 식별 번호: 188)을 나타내고, 그리고 음영화안된/상자로 표시안된 일부분 (aa216 - aa431)은 IgG1의 sFc 단편 (서열 식별 번호: 232)을 나타낸다. IgG1의 단일 쇄 Fc(즉, 도 52A에 나타낸 서열 번호: 235의 His282)에서 Asn297(EU-색인 번호매김)에 대한 His297의 치환은 밑줄로 표시된다. S1-RBD-sFc 단백질의 분자량은 약 50 kDa이며, 12개 시스테인 잔기 (Cys6, Cys31, Cys49, Cys61, Cys102, Cys150, Cys158, Cys195, Cys246, Cys306, Cys352 및 Cys410)를 함유하여, 6 쌍의 이황화결합 (Cys6-Cys31, Cys49-Cys102, Cys61-Cys195, Cys150-Cys158, Cys246-Cys306 및 Cys352- Cys410) 형성하는(도 52A에서 연결 선으로 나타냄) 것을 비롯하여, 431개 아미노산 잔기를 함유한다. S1-RBD-sFc의 이황화결합 요약은 도 52B에 나타낸다.
상기 RBD 도메인 상에 1개의 N-당화 부위 Asn13이 있고, 그리고 sFc 단편 상에 2개의 O-당화 부위 Ser211 및 Ser224가 있다. 상기 N-당화 부위는 도 52A에 도시된 잔기 위에 별표 (*)로 표시되며, 2개의 O-당화 부위는 더하기 (+)로 표시된다. IgG Fc 단편의 보존된 아스파라긴 잔기, Asn297 (EU-색인 번호매김)에서 당화는 상기 Fc-매개된 작동체 기능, 이를 테면, 보체 의존적 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC)에 필수적인 인자다. S1-RBD-sFc에서 상기 Fc 단편은 단백질 A 친화력 크로마토그래피에 의한 정제를 위해 기획된다. 또한, 중쇄의 Asn297에서 당화 부위는 Fc-매개된 작동체 기능을 통하여 표적 hACE2의 결손을 방지하기 위해, His에 대한 돌연변이 (N297H - EU 번호매김, S1-RBD-sFc 단백질에서 N282H)를 통하여 제거되었다.
e. hACE2에 S1-RBD-sFc의 결합 활성
SARS-CoV-2의 RBD는 hACE2에 결합하기 때문에, hACE2에 대한 결합 측정은 S1-RBD-Fc가 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 구조를 나타내는 구조임을 입증하는 적절한 방법이다. 상기 백신의 결합 활성은 hACE2 ELISA에서 테스트되었으며, 높은 친화성을 나타내는 8.477ng/mL의 EC50에 의해 hACE2에 결합하는 것으로 입증되었다 (도 52C).
실시예 10
면역분석에서 면역흡착제로 사용을 위한 SARS-CoV-2 뉴클레오켑시드 (N), 스파이크(S), 막 (M), 외피 (E) 및 오픈 리딩 프레임 9b (ORF9b)로부터 항원성 펩티드의 기획 및 확인
1. N, S, M, E, 그리고 ORF9b 단백질들로부터 펩티드 항원
SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 (N) 단백질 (서열 식별 번호: 6, 표 2)에서 유래된 25개 이상의 신중하게 기획된 펩티드들은 감염된 개인의 항체 검출을 위한 다양한 면역분석에서 면역흡착제로써 SARS-CoV-2 항원 혼합물의 제조에 사용하기에 적합한 항원성 펩티드의 확인을 위해 합성되었다. 상기 항원성 펩티드의 아미노산 서열들은 표 13 (서열 식별 번호: 253 ~ 278)에 나타내고, 전장의 N 단백질 내의 이들 펩티드의 상대적 위치는 도 17에 나타낸다.
SARS-CoV-2 스파이크 (S) 단백질 (서열 식별 번호: 20, 표 3)에서 유래된 서열을 갖는, 50개 이상의 신중하게 기획된 펩티드들은 감염된 개인의 항체 검출을 위한 다양한 면역분석에서 면역흡착제로써 SARS-CoV-2 항원 혼합물의 제조에 사용하기에 적합한 항원성 펩티드의 확인을 위해 합성되었다. 상기 항원성 펩티드의 아미노산 서열들은 표 13 (서열 식별 번호: 279 ~ 327)에 나타내고, 전장의 S 단백질 내의 이들 펩티드의 상대적 위치는 도 18에 나타낸다.
SARS-CoV-2 막 (M) 단백질 (서열 식별 번호: 1, 표 1)의 노출된 영역으로부터 유래된 서열을 갖는, 3개 이상의 신중하게 기획된 펩티드들은 감염된 개인의 항체 검출을 위한 다양한 면역분석에서 면역흡착제로써 SARS-CoV-2 항원 혼합물의 제조에 사용하기에 적합한 항원성 펩티드의 확인을 위해 합성되었다. 상기 항원성 펩티드의 아미노산 서열들은 표 1 및 표 13 (서열 식별 번호: 4, 5, 250, 그리고 251)에 나타내고, 전장의 M 단백질 내의 이들 펩티드의 상대적 위치는 도 19에 나타낸다.
2개의 작은 SARS-CoV-2 단백질, 외피 (E) 및 ORF9b로부터 유래된 서열을 갖는, 8개의 신중하게 기획된 펩티드들은 감염된 개인의 항체 검출을 위한 다양한 면역분석에서 면역흡착제로써 SARS-CoV-2 항원 혼합물의 제조에 사용하기에 적합한 항원성 펩티드의 확인을 위해 합성되었다. 상기 항원성 펩티드의 아미노산 서열들은 표 13 (E 단백질의 경우 서열 식별 번호: 252, ORF9b 단백질의 경우 서열 식별 번호: 328-334)에 나타낸다. 전장의 E 단백질 및 ORF9b 단백질에서 이들 펩티드의 상대적 위치는 차례로, 도 20 및 도 21에 나타낸다.
2. ELISA에서 면역흡착제로써 펩티드 항원 평가
임상 진단과 PCR 검사 모두에서 확인된 COVID-19 환자들의 대표적인 10개 혈청으로 구성된 패널을 사용하여, 펩티드 항원의 상대적 항원성을 평가했다.
도 22에서는 N 단백질 안에 높은 항원성 영역이 확인되었는데, 여기에는 (a) N-말단 도메인 (NTD)의 일부분을 차지하고, SR 풍부한 모티프를 갖는 링커 영역까지 연장된 아미노산 109~195 (서열 식별 번호: 259, 261, 263, 그리고 265); (b) 아미노산 213 ~ 266 (서열 식별 번호: 269 및 270); 그리고 (c) C-말단에 위치한 NLS 영역 및 IDR 영역을 차지하는 아미노산 355-419 (서열 식별 번호: 18)이 내포된다.
도 23에서는 S 단백질 안에 높은 항원성 영역이 확인되었는데, 여기에는 (a) RBM의 우측 옆에 있는 영역을 차지하는 아미노산 534 ~ 588 (서열 식별 번호: 281) ; (b) S2 하위단위의 FP 영역을 차지하는 아미노산 785 ~ 839 (서열 식별 번호: 37 및 38); (c) S2 하위단위의 HR1 영역을 차지하는 아미노산 928 ~ 1015 (서열 식별 번호: 308) ; 그리고 (d) S2 하위단위의 HR2 영역의 일부분을 차지하는 아미노산 1104 ~ 1183 (서열 식별 번호: 321- 324)이 내포된다. 도 24는 S 단백질의 3D 구조에서 4개 항원성 부위 (서열 식별 번호: 38, 281, 308, 그리고 322)의 위치를 나타낸다. 2개의 항원성 펩티드 (서열 식별 번호: 288 및 38)는 좌측 패널에 나타낸 것과 같이, S 단백질의 표면 상에 구형(globular) 도메인으로 노출된다. 1개의 항원성 부위 (서열 식별 번호: 308)은 우측 패널에 나타낸 것과 같이 신장된 나선 루프 안에 있다. 네번째 항원성 펩티드 (서열 식별 번호: 322)는 좌측 패널과 우측 패널에 나타낸 것과 같이 C-말단 도메인 주변에 있다.
도 25-27에서는 E 단백질 (서열 식별 번호: 251), M 단백질 (서열 식별 번호: 5), 그리고 ORF9b 단백질 (서열 식별 번호: 27)로부터 차례로 확인된 약한 항원성 영역을 보여준다.
N 영역, S 영역, 그리고 M 영역으로부터 항원성 펩티드 혼합물은 SARS-CoV-2에 감염된 개체들로부터 항체에 의해 최적으로 결합하는 고형 상 면역흡착제로 제형화될 수 있다. N 단백질, S 단백질, 그리고 M 단백질로부터 항원성 펩티드 혼합물은 SARS-CoV-2에 대한 항체 검출용, 그리고 SARS-CoV-2 감염에 대한 혈청-감시용 감도 있는, 특이적 면역 분석에 이용될 수 있다.
도 28은 4개의 대표적인 PCR 양성 COVID-19 환자 혈청 (LDB, SR25, DB20, 그리고 A29)로부터 수득된 샘플을 이용한 SARS-CoV-2 ELISA의 분석학적 민감도를 보여준다. 이 도면에서는 높은 분석학적 민감도를 보여주는데, M 단백질, N 단백질, 그리고 S 단백질로부터 유래된 서열 식별 번호: 5, 18, 38, 261, 266, 281, 그리고 322의 항원성 펩티드의 혼합물로 제형화된 대표적인 SARS-CoV-2 ELISA에 의해 1:640의 희석에서 부터 >1:2560까지 높은 희석에 대한 양성 신호를 나타냄을 실증한다.
SARS-CoV-2 감염 후, 개체별 특징적인 항체를 결정하기 위해, ELISA에서 개별 펩티드 항원을 면역 흡착제로 사용하여, 각 환자에 대한 특정 혈청 반응성 패턴을 얻을 수 있다(도 29 및 도 30에 나타냄). 각 개별 환자에 의해 생성된 항체에 대한 이러한 상세한 평가는 혈청양성을 보장하기 위한 추가 확인 프로필 없이, 단순히 양성 또는 음성 결정만을 제공할 수 있는 기존의 분석 (이는 종종 숙주 세포 항원 또는 기타 간섭 요인과 함께, 단백질과의 항체 교차 반응성으로 인한 가짜 양성 반응성을 빈번하게 나타낼 수 있다)과 극명한 대조를 이룬다.
실시예 11
SARS-CoV-2 ELISA는 인간 혈청 또는 혈장에서 SARS-CoV-2에 대한 항체 검출을 위해, SARS-CoV-2 에피토프에서 파생된 합성 펩티드 항원을 사용한다.
COVID-19의 세계적 대유행에 대응하여, SARS-CoV2 항원성 펩티드를 이용한 신종 코로나바이러스 SARS-CoV-2에 대한 항체 검출을 위한 혈액 검진 키트가 개발되었다.
컷-오프 값에 대등하거나, 이보다 큰 흡광도 값을 가진 표본은 "초기 반응성"으로 정의된다. 초기에 반응성 표본은 2회 재-시험해야 한다. 중복 반복 검사에서 반응하지 않는 표본은 SARS-CoV-2에 대한 항체에 대해 "비-반응성"으로 간주된다. 반복 테스트 중 하나 또는 둘 모두에서 반응성인 초기 반응성 표본은 SARS-CoV-2에 대한 항체에 대해 "반복적으로 반응성"으로 간주된다.
SARS-CoV-2 ELISA는 SARS-CoV-2의 스파이크 (S) 단백질, 막 (M) 단백질 및 뉴클레오켑시드 (N) 단백질의 항원성이 높은 세그먼트에 대해 특이성을 가진 항체를 포획하는 합성 펩티드로 구성된 반응 마이크로플레이트의 웰에 결합된 면역흡착제를 사용한다. 분석 과정에서, 희석된 음성 대조군과 표본을 반응 마이크로플레이트 웰에 추가하고, 항온처리한다. SARS-CoV-2-특이적 항체들 (존재한다면)은 상기 면역흡착제에 결합할 것이다. 결합되지 않은 항체 및 기타 혈청 성분들을 제거하기 위해, 반응 마이크로플레이트 웰을 철저히 세척한 후, 인간 IgG에 특이적인 양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG 항체의 표준화된 조제물을 각 웰에 첨가한다. 그 다음, 이러한 콘쥬게이트 조제물은 포획된 항체들과 반응할 수 있다. 결합되지 않은 양고추냉이 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 항체를 제거하기 위해, 웰을 다시 완전히 세척한 후, 과산화수소 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 함유하는 기질 용액을 첨가한다. 대부분의 설정에서 존재하는 SARS-CoV-2-특이적 IgG 항체 (만약 있다면)의 양에 비례하여, 청색이 나타나며, IFA와 같은 추가적인 면역분석법과 SARS-CoV-2의 특정 유전자 산물에 대한 항원을 식별할 수 있는 PCR과 같은 보다 구체적인 검사를 통해 반복적으로 반응성이 있는 표본을 조사하는 것이 적합하다. SARS-CoV-2 전염병이 발생하기 몇 년 전부터 수집된 혈청 및 혈장 샘플에서 U.S. 헌혈자 사이에 검출가능한 반응성이 없다는 것은 다른 인간 코로나바이러스에 의한 감염으로부터 SARS-CoV-2 감염을 구별하기 위한 분석의 특이성을 나타내었다. 다른 테스트들과 비교하여, 본 명세서의 합성 항원은 높은 표준화, 생물학적 위험 시약들로부터의 자유 및 생산 규모의 용이한 확대의 이점을 제공한다. 나아가, ELISA 형식에 의한 테스트는 대규모 스크리닝을 위해 쉽게 자동화될 수 있다. 고도로 특이적인 펩티드-기반 SARS-CoV2 항체 검사는 광범위한 소급적 감시를 수행하는 편리한 수단이다. PCR로 확인된 COVID-19 환자(NTUH, 대만)들로부터 3일차, 8일차, 10일차에 3회의 혈청전환 출혈을 테스트했다. 증상이 시작된 후, 10일차가 SARS-CoV-2 ELISA에서 양성 신호를 얻은 가장 빠른 시점이었다. 몇 가지 추가 혈청전환 출혈이 발병 증상으로 인한 감염 초기의 민감도와 함께 테스트되었으며, 하기 연구 1 및 연구 2에서 보고되었다.
1. 분석 특이성 및 민감도의 평가
연구 1에서, SARS-CoV-2 ELISA는 (1) SARS-CoV-2와 무관한 기타 바이러스 감염 (대만 및 US)으로 알려진 자들로부터 수집된 혈청 샘플/혈장 샘플; 그리고 (2) 2007년에 수집된 정기적인 건강-검진을 받는 직원 코호트와 정상 인간 혈장(NHP)으로부터 수집된 혈청 샘플/혈장 샘플에서 우선 테스트되었다. 이들 샘플은 분석에 대한 적절한 컷-오프 값을 결정하기 위한 이론적 근거를 확립하기 위해, 다수(n=922)의 비-COVID-19 샘플을 사용하여 분석 특이성을 평가하기 위해 테스트되었다. 도 31에 나타낸 것과 같이, SARS-CoV-2 감염과 무관한 922개 표본 모두 이 분석에서 매우 낮은 OD 판독값을 가졌다.
a. 연구 1: 수행 특징: 다른 바이러스 감염에 대한 교차-반응성 결여:
HIV (51개 샘플), HBV (360개 샘플), HCV (92개 샘플)의 다른 바이러스 감염에 양성인 환자들과 NL63 (2개 샘플) 및 HKU1 (1개 샘플) 균주와 함께 이전 코로나바이러스 감염된 환자들의 혈청 샘플로부터 SARS-CoV-2 ELISA 테스트 결과는 표 18에 나타낸다. 이들 샘플중 임의의 샘플이 블랭크의 OD 판독값에 가까운 OD 판독값으로 테스트되었기 때문에 이들 샘플 중 어느 것에서도 교차 반응성이 관찰되지 않았다. 2007년, 일상적인 건강-검진을 받는 직원 코호트와 정상적인 인간 혈장(NHP)의 모든 샘플에 대해 거의 공백에 가까운 OD 판독값을 얻었다.
b. NRC+0.2에 근거하여 SARS-CoV-2 ELISA의 컷-오프 값 결정
SARS-CoV-2 ELISA로 테스트한 922개 샘플의 OD 판독값과 아래 논의된 근거를 기반으로, 공개된 SARS-CoV-2 ELISA의 컷-오프 값은 NRC +0.2로 설정되었다 (즉, 면역분석의 각 실행에 대해 키트에 포함된 비-반응성 대조군(NRC)의 3개의 OD450nm 판독 값에 0.2 단위를 더한 값의 평균). NRC + 0.2의 컷-오프 값은 SARS-CoV-2 ELISA가 PCR- 양성으로 확진된 COVID-19 환자들 검출을 위한 최대 민감도와 일반 인구에서 100% 특이성을 갖는 최적의 결과를 허용한다. 표 19는 정상적인 인간 혈장, 정상적인 인간 혈청 그리고 다른 바이러스 (즉, SARS-CoV-2가 아닌) 감염된 개체의 혈청 샘플 또는 혈장 샘플 테스트를 위해 수집된 모든 테스트 실행에서 NRCs의 평균 OD450nm 판독값을 보고한다. 플레이트 실행에 의한 NRC의 평균 값은 도 31에 나타난 것과 일관되게, 정상적인 인간 혈장의 평균에 가까웠다. 다른 바이러스 (즉, SARS-CoV-2가 아닌) 감염된 개체로부터 혈청/혈장 샘플과 정상적인 인간 혈장/혈청 샘플의 표준 편차(SD)를 검사할 때, 이 표준 편차(SD)는 0.006~0.020였다 (표 19). 컷-오프 값을 NRC의 평균 +0.2 단위로 설정하면, NRC의 평균 +4SD(0.020 x 4 = 0.080)보다 높은 막대가 제공되며, 이는 음성 예측 값에 대해 99.99% 신뢰 수준(z-값 = 3.981)을 허용한다. 또한, NRC +2 단위의 컷-오프 값은 양성으로의 혈청 전환 과정에 있을 확률이 더 높은 SARS-CoV-2 감염 위험이 더 높은 개체(가령, 병원 의료 종사자 및 공공 서비스 제공자)에 대해 "평균 NRC +0.12"에서 "평균 NRC +0.2" 사이의 회색 영역을 설정할 여지를 제공한다.
c. 연구 1: 수행 특징: COVID-19 입원한 환자들 모두에서 혈청전환를 검출하는 100% 민감도
SARS-CoV-2 ELISA(혈청/혈장) 검사 결과는 다음을 기반으로 평가되었다: (1) 대부분 증상 발병 후 <10일차 시점에서 환자들이 병원에 등록할 때 채취한 샘플; (2) 병원에서 치료하는 동안 증상 발생 후 >10일차의 환자들, (3) 병원 퇴원일자의 환자들, 그리고 (4) 퇴원후 14일차 병원을 재방문한 환자들 (표 20 및 도 32에 나타낸 것과 같이).
이 연구 1의 결과에서는 다음을 나타낸다: (1) 입원 등록시 수집된 샘플(n=10)의 민감도는 0%임, (2) 입원하는 동안 모두 양성으로 혈청전환 (23명중 23명)되어 테스트 민감도는 100%로 상승되며, (3) 모두 퇴원 당일 양성 반응 (5명중 5명)을 나타내어 민감도 100% 증가되고, 그리고 (4) 모두 퇴원-후 14일차 재방문 시 양성 반응을 보여, 민감도 100%를 나타냈다. 연구 1에 대한 테스트의 전반적인 민감도는 78.2% (36/46) (또는 37/47=78.7%, 한 개 샘플은 환자로부터 상이한 시점에서 두 번 채취한다)였다.
요약하면, 도 33에서 나타낸 것과 같이, S/C 비율 분포는 NRC+0.2 컷-오프 값을 기반으로 하여 산출하였고, 연구 1에서 테스트된 모든 샘플에 대해 플롯팅하였다. SARS-CoV-2 감염과 관련이 없는 개체으로부터 수집된 922개의 샘플 중 어느 것도 이 ELISA에 의해 양성 반응을 나타내지 않았다. 표 21은 SARS-CoV-2 감염과 관련이 없는 모든 샘플과 COVID-19 확진된 46명의 환자의 결과를 요약한 것이며, 이때 샘플은 증상 발현-후 10일차 시점에 수집되었다.
상기 기술된 SARS-CoV-2 ELISA는 증상 발병-후 10일차 시점의 입원한 COVID-19 환자에 대해 100%의 민감도와 100%의 전반적인 특이성을 제공했다. 증상 시작 초기에 채취한 샘플을 비롯하여, COVID-19 확진자 46명을 모두 포함했을 때, 전체 민감도는 78.2%이었다. 이러한 양성 샘플은 양성 확인 및 SARS-CoV-2에 대한 중화 활성을 탑재할 수 있는 항체의 양을 비롯한, 면역 상태의 추가 평가를 위하여 관련 실시예에 설명된 바와 같은 기타 다른 혈청학적 분석에 의해, SARS-CoV-2 반응성 항체의 항원 프로필에 대해 추가로 특성화될 수 있다.
d. 연구 2: 수행 특징: COVID-19 환자들의 혈청전환에서 민감도
공개된 SARS-CoV-2 ELISA를 이용하여, PCR 확진되고, 입원한 COVID-19 환자 17명의 총 37개 샘플을 검사했다. 치료 동안 혈청 수집 날짜에 대한 자세한 정보는 표 22와 같이 증상 발병과 관련하여 제공되었다.
SARS-CoV-2 ELISA(혈청/혈장) 검사 결과는 (1) 입원 후 <7일, (2) 입원-후 7-14일차 시점, (3) 입원-후 >14일차를 기준으로 평가되었다 (표 23에 나와 있음). 이들 결과에서 증상 개시-후, <7일에서 샘플의 상대적 특이도가 25%이었으며; 증상 개시-후 7-14일차 시점에서는 상대적 특이도가 63.6%이었으며; 그리고 입원-후 >14일에서 상대적 특이도는 100%였다. 37개 샘플 모두의 전반적인 민감도는 81.1% (30/37)였으며, 이 코호트에서 증상 개시-후 >14일 시점에서 양성 예측값의 정확도는 100%이었다.
e. 결론
공개된 SARS-CoV-2 ELISA 스크리닝 분석은 인간 혈청 또는 혈장에서 낮은 수준의 항체를 검출할 수 있는 매우 민감하고, 특이적인 테스트이다. 상기 분석은 다음을 특징으로 한다:
ㆍ 증상 개시-후 2일 이내와 같이 조기에(연구 2에서 ID 번호 11을 가진 1명의 환자, 표 22), 일반적으로, 증상 개시-후 7~10일차 시점에서 인간 혈청전환 샘플에서 SARS-CoV-2 항체를 검출하는 능력, 그리고 연구 1 및 연구 2의 경우 각각 차례로, 증상 개시-후 10일차 시점과 14일차 시점에 100%의 양성 예측값을 갖는다. 연구 1과 연구 2의 전반적인 민감도는 각각 78.2%와 81.1%이었다.
ㆍ 2020년 이전에 수집된 정상적인 혈장 기증자와 건강 검진을 받는 직원 코호트에서 수집된 혈청/혈장 샘플에서 SARS-CoV-2에 대한 특이성 100%.
ㆍ 2020년 이전에 수집된 다른 코로나바이러스, N-63, HKU를 비롯한, HCV, HBV, HIV에 감염된 개체들로부터 얻은 샘플에서는 교차-반응성이 발견되지 않았다.
2. 특별 주의 사항
상기 기술된 SARS-CoV-2 ELISA 절차 및 결과 해석 섹션(위에 설명됨)은 개별 대상체들의 혈장 또는 혈청에서 SARS-CoV-2에 대한 항체의 존재를 테스트할 때 밀접하게 준수되어야 한다. SARS-CoV-2 ELISA는 혈청 또는 혈장의 개별 단위를 테스트하도록 설계되었기 때문에, 해석에 관한 데이터는 개별 샘플을 테스트하여 얻었다. 이 시점에서, 다른 체액에서 수행된 테스트 해석에 사용할 수 있는 데이터가 충분하지 않으며, 이러한 표본에 대한 테스트는 권장되지 않는다.
기술된 SARS-CoV-2 ELISA를 통해 혈청 또는 혈장이 양성으로 판명된 사람은 바이러스에 감염된 것으로 추정한다. 상기 기술된 SARS-CoV-2 ELISA에서 양성 반응을 보인 개체들은 다른 분자 검사(가령, RT-PCR)를 사용하여 이 개체가 다른 개체들에게 전염시킬 수 있는 활성 감염이 있는 지 확인해야만 한다. 적절한 상담과 의학적 평가도 제공되어야 한다. 이러한 평가는 SARS-CoV-2 항체 검사의 중요한 부분으로 간주되어야 하며, 새로 추출한 샘플의 검사 결과 확인도 내포되어야 한다.
SARS-CoV-2에 의한 COVID-19는 임상 증후군이며, 이의 진단은 임상적으로만 이루어질 수 있다. 권장되는 반응성 검체 조사 결과에서 SARS-CoV-2 항체의 존재가 확인되었다 치더라도, 상기 기술된 SARS-CoV-2 ELISA 테스트만으로는 활성 SARS-CoV-2 감염을 진단할 수 없다. 혈청학적 조사의 어느 시점에서든 음성 검사 결과는 향후 SARS-CoV-2에 노출되거나 또는 감염될 가능성을 배제하지 않는다.
3. UBI® SARS-CoV-2 ELISA의 수행능 평가
a. 교차-반응성
UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 임상 동의 연구(아래 설명)에서 평가되었으며, 100%(154/154)의 음성 일치 비율을 보여주었다. 또한, 비-SARS-CoV-2 특이적 항체의 교차 반응성은 호흡기 세포융합 바이러스 (10) 및 ANA (6)에 대한 알려진 항체가 있는 혈청을 사용하여 조사되었다. 간섭이 관찰되지 않았다.
b. 임상적 일치 연구
UBI® SARS-CoV-2 ELISA 분석의 임상적 수행능을 결정하기 위한 연구가 수행되었다.
UBI® SARS-CoV-2 ELISA와 PCR 비교자 간의 양성 일치 퍼센트 (PPA)를 추정하기 위해, 중합효소 쇄 반응(PCR) 방법으로 SARS-CoV-2에 양성 반응을 보였으며, COVID-19 증상 또한 함께 보인 95명의 대상체로부터 혈청 100개와 EDTA 혈장 표본 5개를 채취했다. 각 표본은 UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 사용하여 테스트되었다.
음성 일치 퍼센트(NPA)를 추정하기 위해, SARS-CoV-2에 대해 음성으로 추정되는 154명의 대상체로부터 62개의 혈청과 92개의 EDTA 혈장 표본을 수집했다. 154개 표본은 모두 COVID 발생 이전에 수집되었다. 각 표본은 UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 사용하여 테스트되었다. 두 그룹의 결과는 표 24 및 표 25에 나와 있다.
c. 독립적 임상 일치 검증 연구
UBI® SARS-CoV-2 ELISA는 National Cancer Institute(NCI)가 후원하는 Frederick National Laboratory for Cancer Research(FNLCR)에서 2020년 6월 17일과 9월 1일에 테스트되었다. 이 테스트는 58개의 SARS-CoV-2 항체 양성 혈청 샘플과 97개의 항체 음성 혈청, 그리고 혈장 샘플로 구성된, 이전에 동결된 샘플 패널에 대해 검증되었다. 58개의 항체-양성 샘플은 각각 핵산 증폭 검사(NAAT)로 확인되었고, IgM과 IgG 항체는 58개의 모든 샘플 모두에서 존재하는 것으로 확인되었다. 샘플에서 항체의 존재는 UBI SARS-CoV-2 ELISA로 테스트하기 전, 몇가지 직교 방법(orthogonal methods)에 의해 확인되었다. IgM 항체 및 IgG 항체의 존재는 하나 또는 그 이상의 비교자 방법에 의해 구체적으로 확인되었다. 항체-양성 샘플들은 상이한 항체 역가에서 선별되었다.
모든 항체-음성 샘플은 2020년 이전에 수집되었으며, 여기에는 다음의 것들이 내포된다: i) 임상 상태와 관계없이 선별된 87개 샘플, "음성", 그리고 ii) HIV+ 환자들의 혈청 은행에서 선별된 10개 샘플, "HIV+". UBI SARS-CoV-2 ELISA중 하나의 로트를 사용하여 한 명의 작업자에 의해 테스트가 수행되었다. 민감도와 특이도에 대한 신뢰 구간은 CLSI EP12-A2(2008)에 설명된 득점법에 따라 산출되었다.
HIV+와의 교차-반응성 평가를 위해, HIV가 있는 항체-음성 샘플들중에 거짓 양성률 증가가 HIV가 없는 항체-음성 샘플들의 거짓 양성률보다 통계적으로 더 높은지 여부를 평가했다(이를 위해, Altman이 설명한 득점법에 따른 거짓 양성 비율의 차이에 대한 신뢰 구간을 산출했다). 연구 결과 및 요약된 통계는 표 26 및 표 27에 제시된다.
이 연구에는 다음과 같은 제한 사항이 있다:
ㆍ 샘플은 무작위로 선택되지 않았으며, 민감도 및 특이도 추정치는 해당 기기의 실제-성능을 나타내지 않을 수 있다.
ㆍ 이들 결과는 혈청 샘플 및 혈장 샘플만을 기반으로 하며, 기타 다른 샘플 유형, 이를 테면, 손가락 채혈이 내포된, 샘플 유형의 성능을 나타내지 않을 수 있다.
ㆍ 패널의 샘플 수는 테스트 성능에 대한 합리적인 추정치와 신뢰 구간을 제공하는 최소 실행 가능한 샘플 크기이며, 사용된 샘플은 환자 집단에서 관찰된 항체 프로파일을 대표하지 않을 수 있다.
d. 매트릭스 동등성(Matrix Equivalency)
매트릭스 동등성 연구는 환자-일치된 5명의 건강한 기증자의 혈청 샘플 및 혈장 샘플로 수행되었다. 혈장 샘플은 항응고제로써 헤파린 나트륨, 또는 K2 EDTA를 함유하는 바이알에서 뽑아내었다. 상기 일치하는 샘플은 UBI SARS-CoV-2 ELISA로 테스트했을 때 음성이었다. 그 다음, 샘플 쌍에 SARS-CoV-2 IgG에 대해 양성인 샘플을 스파이킹하여 3가지 농도를 얻었고, 이중으로 테스트했다. 이 결과는 각 매트릭스에 대해 양성 신호 및 음성 신호의 100% 일치를 보여주었으며, 이는 UBI® SARS-CoV2 ELISA를 사용한 혈청 샘플 또는 혈장 샘플에서 SARS-CoV-2 IgG 검출에 대한 매트릭스-반응성의 영향이 없음을 나타낸다.
이 연구는 UBI® SARS-CoV-2 ELISA의 성능이 혈청 샘플, 헤파린 나트륨 혈장 샘플 및 K2 EDTA 혈장 샘플과의 동등성을 보여준다.
e. 클라스 특이성
SARS-CoV-2에 대한 IgG 항체 및 IgM 항체에 대해 양성인 8개의 혈청 샘플을 UBI® SARS-CoV-2 ELISA로 테스트했다. 그런 다음, 이들 샘플을 DTT로 처리하여, IgM 항체를 파괴시키고, UBI® SARS-CoV-2 ELISA로 다시-테스트했다. 8개 샘플 모두에 대한 결과는 DTT 처리-전 및 처리-후 모두에서 양성이었고, 이것으로 인간 IgG 이소타입에 대한 클래스-특이적 반응성이 입증되었다. UBI® SARS-CoV-2 ELISA 분석은 인간 IgG 아이소형에만 클래스-특이적 반응성을 실증한다. 인간 IgM에서는 결합 상호작용이 관찰되지 않았다.
실시예 12
ACE2에 S1의 결합 억제를 통한 중화항체 측정을 위한 ELISA 개발
ELISA-기반 S1-RBD 및 ACE2 결합 분석의 자세한 절차는 도 34의 하단 부분에 설명되어 있다. 구체적으로, ELISA 플레이트를 ACE2 ECD-sFc로 코팅하시키고, 다양한 S1-RBD 단백질을 추적자로 사용하고, HRP 단독은 대조군 추적자로 사용하였다. 이 연구에서, ELISA 플레이트 상에 피복된 ACE2 ECD-sFc에 결합하는 S1-RBD-His, S1-RBD-His-HRP, S1-RBD-sFc-HRP, 그리고 오로지 HRP의 능력에 대해 평가되었다. 도 34에서는 S1-RBD-His, S1-RBD-His-HRP, 그리고 S1-RBD-sFc-HRP가 ELISA 플레이트 상에 피복된 ACE2 ECD-sFc에 결합할 수 있음을 보여주었고, 차례로 이들의 EC50 값은 0.40μg/mL, 0.19μg/mL, 그리고 0.27μg/mL이었다. HPR 단독은 ACE2 ECD-sFc에 결합할 수 없었다.
그 다음, 도 34에 기술된 결합 분석은 도 35의 하부에서 나타낸 바와 같이, 결합 단계 전의 단계에서 변형되었다. 구체적으로, S1-RBD-His-HRP 단백질은 ACE2 ECD-sFc로 피복된 ELISA 플레이트에 S1-RBD-His-HRP 단백질을 추가하기 전, S1-RBD-sFc를 지향하는 항체들을 함유하는 희석된 면역 혈청 (5 wpi)과 혼합하고, 항온처리하였다. 이러한 추가 단계는 S1-RBD-sFc를 지향하여 생성된 항체들이 ACE2 ECD-sFc에 S1-RBD-His-HRP 단백질의 결합을 억제시킬 수 있는 지를 결정하기 위해 추가되었다.
도 35는 1:10 희석에서 >95% 내지 약 <10% 범위의 S1-RBD-sFc로 면역접종받은 기니아 피그로부터의 면역 혈청에 의한 ACE2 ECD-sFc에 대한 S1-RBD-His-HRP 결합 억제의 희석 의존적 감소를 보여주며, EC50은 약 3.5 Log10이다. 상기 결합의 전체 신호는 ACE2 수용체에 S1-RBD의 결합을 방해하며, 억제시킬 수 있는 항체의 양을 민감하게 검출할 수 있도록 조정될 수 있다. 이러한 단순화된 형태의 ELISA에 대해 표준화된 분석을 확립하여, COVID-19 환자, 감염되고 회복된 개체, 또는 S1-RBD를 포함하는 백신을 투여받는 개체들에 존재하는 혈청 중화 항체의 정도를 측정할 수 있다.
항체 검출 분석에 의해 SARS-CoV-2에 대항하는 항체에 대해 양성으로 밝혀진 임의의 환자 샘플은 이러한 "중화" ELISA를 사용하여 추가로 테스트함으로써, 해당 환자에서 ACE2에 S1-RBD의 결합을 억제시킬 수 있는 항체가 발달되었는 지를 확인할 수 있다. 이러한 중화 ELISA는 SARS-CoV-2에 의한 재-감염을 예방하는 환자의 능력에 대한 예측 변수로 사용될 수 있다.
실시예 13
SARS-CoV-2 감염에 대항하여, S1-RBD 융합 단백질을 함유하는 고-정밀의 기획 백신
1. 전반적인 디자인
바이러스 감염에 대한 효과적인 면역 반응은 체액성 면역 및 세포성 면역 모두에 의존적이다. 더 구체적으로, 고-정밀 기획 예방 백신의 잠재력은 활성 약제학적 성분으로써 기획 면역원 (펩티드 또는 단백질이던 간에)을 다음의 용도로 사용할 것이다: (1) 표적 세포 상에 바이러스의 수용체에 이 바이러스의 결합에 관여하는 바이러스 단백질에 대한 B 세포 에피토프의 사용을 통한 중화 항체를 유도하기 위해; (2) 내인성 Th 에피토프 및 CTL 에피토프를 사용하여, 침입하는 바이러스 항원에 대항한 일차의, 그리고 기억 B 세포 반응 및 CD8+ T 세포 반응을 비롯한, 세포 반응을 유도하기 위해. 이러한 백신은 고-정밀 기획 면역원의 면역원성을 향상시키기 위해, 어쥬번트, 이를 테면, ADJUPHOS, MONTANIDE ISA, CpG 등, 그리고 기타 부형제와 함께 제형화될 수 있다.
대표적인 기획된 COVID-19 백신은 CHO 세포 발현된 S-RBD-sFc 단백질 (서열 식별 번호: 235의 아미노산 서열, 서열 식별 번호: 246의 핵산 서열)을 이용한다. 이 단백질은 SARS CoV-2 스파이크 (S) 단백질 상에 수용체 결합 도메인 (RBD)을 제시하도록 기획되었고, 준비되었으며, 상기 RBD 안에 그 탄수화물 구조가 면역화될 때 높은 친화력 중화 항체들을 유도하는 것이다. 상기 백신은 SARS-CoV-2 감염을 예방하기 위해, SARS-CoV-2를 지향하는 바이러스-특이적 일차의, 그리고 기억 B 세포 반응과 CTL 반응을 가능하게 하기 위해 숙주 특이적 Th 세포 매개된 면역성을 촉진시킬 수 있는 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 및 CTL 에피토프를 통합하는 기획 펩티드 혼합물을 또한 이용할 수 있다. 효과적인 백신은 바이러스 감염/공격 시, 신속한 기억 소환을 하도록, 기억 T 세포와 B 세포를 프라이밍해야 한다.
상기 기술된 기획 면역원의 효과를 개선시키기 위해, 최적의 항-SARS-CoV-2 면역 반응 유도를 위해, 두 가지 대표적인 어쥬번트 제형 (ADJU-PHOS®/CpG 및 MONTANIDE™ ISA/CpG)이 이용된다.
ADJUPHOS는 일반적으로 인간 백신용 어쥬번트로 사용된다. 이 어쥬번트는 기획된 면역원을 항원 제시 세포(APCs)가 유인 및 흡수하는 것을 개선함으로써, Th2 반응을 유도한다. MONTANIDE™ ISA 51은 SARS-CoV-2에 대한 강력한 면역 반응을 이끌어내기 위해, 수상(water phase) 기획 펩티드/단백질 면역원과 혼합될 때, 에멀젼을 형성하는 오일이다. CpGs 올리고뉴클레오티드는 항원 제시를 개선시키고, 백신 특이적 세포 반응 및 체액 반응의 유도를 개선시키는 TLR9 작용제다. 일반적으로, 음으로 하전된 CpG 분자는 양으로 하전된 기획 면역원과 결합되어 면역 반응을 더욱 향상시키기 위해, 항원 제시를 잘 하는 면역자극 복합체를 형성한다.
상기 기술된 고-정밀 기획 백신은 불활성화된 바이러스 용해물 또는 덜 특성화된 다른 면역원을 사용하는 보다 복잡한 면역원 함량을 갖는 백신의 약하거나 또는 부적절한 항체 제시와 비교하여, 매우 특이적 면역 반응을 생성하는 이점을 갖는다. 또한, COVID-19 백신 개발에 잠재적인 함정이 있는데, 이것은 항체-의존적 강화(ADE)라는 메커니즘과 관련된다. 구체적으로, ADE는 비-중화 항체에 바이러스의 결합으로 숙주 세포로의 진입이 강화되며, 때로는 이의 복제를 또한 강화시키는 현상이다. 이 메커니즘은 감염력을 증가시키며, 모기-매개된 플라비바이러스, HIV 및 코로나바이러스에서 독성이 관찰되었다. 상기 기술된 고-정밀 백신은 기능적 결과를 말하는 항체 반응의 질과 양을 모니터링함으로써, 해당 백신에 의해 유발된 질환 증가를 회피하도록 기획된다.
하기에서 논의된 대표적인 연구들은 상기 기술된, 다음과 같은 능력을 갖는 항체 유도를 촉진시킬 수 있는, 고-정밀 SARS-CoV-2 백신을 기획함에 있어서 방식을 제시한다: (1) CHO-발현된 S1-RBD-sFc 단백질에 결합할 수 있고; (2) ACE2 수용체 단백질을 과도하게 발현시키는 마이크로웰 표면 또는 세포 표면에 고정시킨 ACE2 수용체에 S1 단백질의 결합을 억제시킬 수 있고, 그리고 (3) 세포 매개된 중화 분석에서 바이러스 매개된 세포병인적 영향을 중화시킬 수 있는 항체
기니아 피그에서 다양한 형태의 S1-RBD-sFc 기획 단백질 (서열번호: 235, 236, 그리고 355)의 면역화 일정은 S 단백질 항체 결합 분석을 통한 S 단백질에 대한 항체의 평가를 위해 표 28에 제시되어 있다.
2. S1 단백질 항체 결합 분석 (면역원성)
S1-RBD-sFc, S1-RBDa-sFc, S1-RBD-Fc를 비롯한, 다양한 형태의 S1-RBD 단백질을 각 군에 대해 100μg의 양으로 ISA51과 혼합하여, w/o 에멀젼을 제조하였다. 이들 제형을 표 28에 나타낸 면역화 스케줄을 사용하여, 기니피그(그룹당 n=5)의 근육내로 면역화시켰다. 간략하게 설명하자면, 기니아 피그는 투여분량당 100μg의 일차 면역을 제공한 후, 3주차 시점에 투여분량당 50μg의 부스터 면역을 제공했고, 초기 면역화(WPI)-후 0주차, 3주차, 5주차 시점에 개체 혈청을 수집했다. 수집된 혈청 샘플은 도 36에 예시된 상세한 절차를 사용하여, S1-피복된 ELISA에 의해 면역원성에 대해 테스트되었다.
도 37A는 단일 투여 (3 WPI)만으로 고-역가의 S 결합 항체들이 생성되었으며, S1-RBD-sFc, S1-RBDa-sFc 및 S1-RBD-Fc에 대한 역가의 GeoMeans은 차례로, 94,101, 40,960, 그리고 31,042이었음을 보여준다. 상기 역가는 컷-오프 값 이상으로 여전히 양성을 나타낼 수 있는 최대 희석 배수의 역수로 결정되었으며, 여기서 컷-오프는 OD450 판독값 (평균+ 3XSD) 0.050로 설정되었다. 이들 역가는 단일 쇄 Fc 융합 단백질 S1-RBD-sFc 단백질 (서열 식별 번호: 235)이 최고의 면역원성이었으며, 그 다음이 S-RBDa-sFc(서열 식별 번호: 236)임을 나타내고, 여기서 RBD 도메인은 이 도메인이 폴딩이 더 잘 되도록 Cys-이황화 결합을 감소시키도록 변형되었으며, 이중 쇄 Fc 융합 단백질 S-RBD의 면역원성이 가장 낮았다. 3 WPI에서 S1-RBD-sFc와 S1-RBDa-sFc의 차이는 통계적으로 유의미했고 (p
Figure pct00009
0.05), 모든 구조체들은 S1-RBD-sFc가 결합 항체 반응의 측면에서 약간의 이점을 분명히 보유하고 있는, 상당한 면역원성이었음을 나타낸다. 그러나, 5 WPI에서는 S1-RBDa-sFc 대비 S1-RBD-Fc (p > 0.99), 그리고 S1-RBD-sFc 대비 S1-RBD-Fc (p = 0.20)에서 유의미한 차이가 없었다.
도 37B는 5 WPI에서 기니아 피그 면역 혈청의 ELISA에서 ACE2에 대한 S1 단백질 결합에 있어서 중화 및 억제성 희석 ID50 (Geometric Mean Titer; GMT)를 보여준다. 그룹에서 각 백신 접종된 동물들의 5 WPI의 혈청 샘플을 연속 희석하고, ELISA-기반 방법으로 억제 활성에 대해 분석했다. 혈청의 억제 활성은 다음 공식을 사용하여 결정되었다: 억제성 활성 = {1 - (OD450실험 - OD450배경)/(OD450최대 - OD450배경)} x 100%. 결과적인 억제 곡선(좌측 패널)은 평균 ± SE로 표시되었다. 50% 억제가 있는 각 동물의 항체 역가(우측 패널)는 4-매개변수 로지스틱 회귀에 의해 생성된 억제 곡선을 기반으로 결정되었다.
도 38은 3 WPI에서 투여분량당 50μg의 약간의 부스터에 의해 각 단백질 면역원에 대한 항체 역가가 4-배 ~ 10-배까지 향상되었음을 보여준다. 세 가지 기획 융합 단백질을 비교하면, S-RBD-sFc 융합 단백질은 부스터-후 GeoMean S1 결합 역가가 106 증가했고, 초기 면역화보다 10-배 증가되었다.
이들 3가지 단백질 면역원에 의해 유도된 항체의 기능적 속성은 표적 세포로의 바이러스 진입을 방지하기 위해, S1-RBD의 표면 수용체 ACE-2에 대한 이의 결합을 억제하는 능력에 대해 평가되었다. 두 가지 기능 분석이 확립되었는데, 여기에서 두 가지는 다음의 것들이 내포된다: (1) 이러한 S1 결합 항체에 의한 ACE-2 ECD-sFc 피복된 플레이트에 대한 S1-RBD 결합의 직접적인 억제를 평가하기 위한 ELISA; 그리고 (2) 세포-기반 S1-RBD-ACE2 결합 억제 분석. 이들 기능성 분석은 하기에서 추가 설명된다.
3. ACE2에 대한 S1-RBD 결합 억제를 결정하기 위한 ELISA 기반 분석
2개의 개별 ELISA-기반 S1-RBD/ACE2 결합 억제 분석에 대한 자세한 절차는 도 39에 예시되어 있다.
방법 A에서, ELISA 플레이트를 ACE2(가령, ACE2 ECD-sFc)로 피복시키고, S-RBDa-sFc로 면역화된 동물의 항혈청 100μL를 혼합하고, 이 혼합물을 추가하기 전에 S1-RBD-His와 항온처리한다. S1-RBD-His 결합/억제 양은 HRP 콘쥬게이트된 항-His 항체를 이용하여 검출할 수 있다.
방법 B에서, ELISA 플레이트를 ACE2(가령, ACE2 ECD-sFc)로 피복시키고, S-RBDa-sFc로 면역화된 동물의 항혈청 100μL를 혼합하고, 이 혼합물을 추가하기 전에 S1-RBD-His-HRP와 항온처리한다. S1-RBD-His-HRP 결합/억제 양은 직접적으로 검출할 수 있다.
4. ACE2에 대한 S1-RBD 결합 억제를 결정하기 위한 ELISA 기반 분석 결과
방법 A 및 방법 B의 S1-RBD/ACE2 결합 억제 분석을 이용하여 S1-RBD-sFc, S1-RBDa-sFc, 그리고 S1-RBD-Fc에 대항하는 항체들이 ACE2 ECD-sFc에 S1-RBD-His 결합을 억제하는 능력을 ELISA에 의해 결정하였다.
도 40은 방법 A의 억제 분석을 이용하여 얻은 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 40에서 1:10 희석된 혈청으로 테스트하였을 때, ELISA 플레이트에 결합된 ACE2 ECD-sFc에 결합 전, S1-RBD-His 단백질과 혼합하고, 항온처리된 sFc 또는 Fc 융합 단백질로 면역접종된 기니아 피그에 프라임 투여 후, 3 wpi에서 수집된 모든 면역 혈청에서 95% 이상의 결합 억제가 이 분석에서 관찰되었음을 보여준다. ACE2 ECD-sFc에 대한 S1-RBD-His 결합 억제에 있어서 혈청의 1:10 희석에서 >95%, 혈청의 1:100 희석에서 약 60% 억제, 그리고 혈청의 1:1,000 희석에서 약 20% 억제되어, 희석 의존적 감소가 발견되었다.
도 41은 방법 B의 억제 분석을 이용하여 얻은 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 41에서 1:250 희석된 혈청으로 테스트하였을 때, ELISA 플레이트에 결합된 ACE2 ECD-sFc에 결합 전, S1-RBD-His-HRP 단백질과 혼합하고, 항온처리된 sFc 또는 Fc 융합 단백질로 면역접종된 기니아 피그에 프라임 투여 및 부스터 투여 후, 5 wpi에서 수집된 모든 면역 혈청에서 95% 이상의 결합 억제가 이 분석에서 관찰되었음을 보여준다. ACE2 ECD-sFc에 대한 S1-RBD-His-HRP 결합 억제에 있어서 1:250 희석 ~ 1:32,000 희석에서 희석 의존적 감소가 발견되었다.
방법 A (도 40)와 방법 B (도 41)의 결과에서 관찰된 차이점은 방법 B가 방법 A에 비교하여, 결합 억제 감지에 더 민감하다는 것을 보여준다.
5. ACE2에 대한 S1-RBD 결합 억제를 결정하기 위한 세포-기반 분석
세포-기반 S1-RBD 및 ACE2 결합 억제 분석의 자세한 절차는 도 42에 설명되어 있다. 구체적으로, 이러한 결합을 위한 표적 세포로서 ACE-2 과발현시킨 HEK293 세포를 사용하였다. 다양한 형태의 S1-RBD 융합 단백질 (S1-RBD-sFc, S1-RBDa-sFc 및 S-RBD-Fc)로 면역화된 기니아 피그로부터 얻은 면역 혈청을 S1-RBD-His 단백질과 혼합하고, 항온처리한 다음, 항-His-FITC인 FITC 콘쥬게이트된 검출 항체와 항온처리하였다. 이러한 FITC 추적된 ACE2/S1-RBD 결합 시스템에서, 다양한 형태의 S-RBD-sFc, S-RBDa-sFc 또는 S-RBD-Fc로 면역화된 기니아 피그에서 수집한 면역 혈청의 존재를 각각의 결합 억제 능력에 대해 테스트했다. 도 43에 도시된 바와 같이, 약 100% 억제로부터 약 10% 억제 범위로 낮아진, 각각의 기획 단백질 면역원에 대한 프라임 면역화 및 부스터 면역화 후, 5 wpi에서 수집된 면역 혈청의 각 연속 희석에 대해 투여분량 의존적 곡선을 얻었고, S-RBD-sFc, S-RBDa-Fc, 그리고 S-RBD-Fc의 기획 단백질 면역원에 대한 특징적인 IC50 값은 차례로 1:1024, 1:180, 그리고 1:300에서 있었다. S-RBD-sFc, S-RBDa-Fc 및 S-RBD-Fc의 기획 단백질 면역원에 대한 야기된 항체에 대한 기하 평균 역가(GMT) ID50 값은 차례로, 각각 202, 69.2 및 108이었다. 도 44에 나타낸 바와 같이, 이러한 세포-기반 차단 분석에 의해 생성된 상대적인 S1-ACE2 결합 억제를 평가하기 위해, 1:625 희석에서 고정된 0, 3, 5주차 시점에 수집된 혈청에 대해 세 가지 설계 단백질 면역원 모두에 대한 억제 프로파일의 대표적인 플롯이 제시되었다. 이러한 비교 결합 억제 연구에서 S-RBDa-sFc의 억제 (약 21%) 및 S-RBD-Fc (약 33%)의 21 및 33% 억제 비교하였을 때, S-RBD-sFc는 이의 높은 결합 억제 (약 75%)를 나타내여, 최고의 기능성 면역원성을 생성한다는 것을 보여준다.
모든 결합 억제 결과를 고려할 때, 본 발명의 S-RBD-sFc 단백질은 S1 결합 및 ACE2 결합 (SARS-CoV-2 바이러스 진입을 위한 중요한 경로)을 억제할 수 있는 기능성 항체의 유도를 위한 B 세포 성분을 대표하는 가장 효과적인 고-정밀 기획 면역원인 것으로 보인다.
6. 시험관내 중화 분석
S-RBD-sFc, S-RBDa-Fc 및 S-RBD-Fc로 면역화된 동물로부터 수집된 혈청 샘플을 56℃에서 0.5h 동안 불활성화시키고, 2-배 단계로 세포 배양 배지로 연속 희석하였다. 상기 희석된 혈청을 북경의 KeXin 연구소에서 수행된 CNI 균주 바이러스, 또는 대만에서 독립적으로 수행된 대만 균주 바이러스와 1:1의 비율로 96-웰 플레이트에 100 TCID50 현탁액에서 혼합시킨 후, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 36.5℃에서 항온처리했다. 그런 다음, Vero 세포(1-2x 104 세포)를 혈청-바이러스 혼합물에 첨가하였고, 이 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 36.5℃에서 5일 동안 항온처리했다. 각 웰의 세포변성 효과(CPE)를 현미경 하에서 기록하였고, 50% 보호 상태의 희석수로 중화 역가를 산출하였다.
표 29에 나타난 바와 같이, 단일 면역-후, 기니아 피그의 면역 혈청을 3 wpi로 수집하였고, 이 시험관 내 중화 테스트를 위해, 북경에 있는 KeXin 연구소에 제출했다. 사전-출혈(0 wpi) 및 기타 대조군 혈청은 역가가 8 미만인 것으로 밝혀졌다.. 기획 단백질 S-RBD-sFc 면역원의 면역 혈청은 최고의 역가(1:>256)를 나타내는 반면, S1-RBDa-sFc 및 S1-RBD-Fc의 면역 혈청은 차례로, 각각 128 및 192의 범위에 있었다. 바이러스 유도 CPE를 억제하는 능력을 검출하는 이러한 시험관 내 중화 분석은 SARS-CoV-2 감염을 예방하기 위해 테스트된 면역 혈청의 기능적 효능을 추가로 설명했다.
이러한 면역 혈청에 대한 또 다른 독립적인 테스트는 표 29에 표시된 대로 대만의 Nangang에서 수행되었다. 0, 3 및 5 wpi에서 수집된 혈액으로 프라임 주사 및 부스터 주사-후, 기니아 피그에서 수집된 면역 혈청을 이 CPE-기반 시험관 내 중화 분석을 수행했다. 이러한 제 2 사이트 테스트에서, 0 및 3 wpi의 면역 혈청에 대해 재현성이 높은 결과를 얻었고, 중화 역가는 128와 256 사이에서 측정되였으며, 한편 이들 기획 단백질로부터의 면역 혈청의 역가는 약 4,096 및 8,192였으며, 이는 단일 투여 시 면역 혈청보다 약 15-배 내지 30-배 더 높았다. 사전 출혈 및 기타 대조군 혈청은 각각의 실험실 득점 체계에 따라, 8 또는 4 미만인 것으로 밝혀졌다. 기획 단백질 S1-RBD-sFc가 있는 구조체의 면역 혈청은 최고의 역가(1:>256)를 나타내는 반면, 다른 면역 혈청은 북경 실험실에서 관찰된 바와 같이, 128 및 192 범위에 있었다. 따라서, S1-RBD-sFc를 기획 면역원으로 사용할 때, 다른 두가지 기획 단백질 S1-RBD-Fc 또는 S1-RBDa-sFc보다 중화 역가에서 적어도 2-배 이상인 것으로 밝혀졌다. 두 군데 별개 실험실에서 바이러스 유도된 CPE를 억제하는 이러한 기획 단백질 유도된 항체의 능력에 대한 이 시험관내 중화 분석을 통한 확인은 이러한 면역 혈청의 기능적 효능을 추가로 설명했고, 따라서 SARS-CoV-2 감염 예방을 위한 백신 제형에서 면역원으로서 이러한 고-정밀 기획 단백질의 유용성이 입증되었다.
S1-RBD-sFc로 면역화된 기니아 피그의 혈청 중화 역가를 COVID-19 환자의 회복기 혈청의 중화 역가와 비교했다. S1-RBD:ACE2 결합 억제 ELISA (qNeu ELISA라고도 함)를 사용하여, 퇴원 후 대만 COVID-19 환자들의 회복기 혈청 반응과 기니아 피그의 반응을 비교했다. 이들 결과 (도 53에 나타냄)에서 1,000-배(3 WPI) 또는 8,000-배(5 WPI) 희석된 기니아 피그 면역 혈청은 20-배로 희석된 10명의 환자의 회복기 혈청에 비해 S1-RBD:ACE2 결합에 대해 필적하는 억제 또는 더 높은 억제를 나타냈음을 설명하고, 기니아 피그의 혈청은 인간의 회복기 혈청보다 ≥50-배의 항체 역가를 함유했다.
항-SARS-CoV-2 N 단백질 항체 및 면역형광 시각화를 사용한 별도의 CPE 연구에 의해 이들 항체의 중화 효능이 추가 확인되었다. 다시 말하지만, SARS-CoV-2 (VNT100)의 완전한 중화는 5 WPI에서 S1-RBD-sFc 융합 단백질로 면역화된 동물의 샘플에서 동물의 샘플에서 동물 혈청의 1:32,768-배 희석에서 관찰되었다 (도 54). 0 및 3 WPI에서 S1-RBD-sFc, S1-RBDa-sFc, 그리고 MONTANIDE™ ISA 50V2와 함께 S1-RBD-Fc로 백신접종맞은 기니아 피그로부터 5 WPI에서 수거된 면역 혈청을 분석하였다. 바이러스-혈청 혼합물로 감염된 Vero-E6 세포의 단층을 면역형광법 (IFA)으로 평가했다. 세포를 인간 항-SARS-CoV-2 N 단백질 항체로 착색시키고, 항-인간 IgG-488(밝은 색)으로 검출했다. 핵은 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)으로 대조착색되었다 (짙은 색).
CPE 분석 및 IFA에 의해 얻은 중화 역가를 추가로 확인하기 위해, 10개의 샘플 (양성 및 음성)을 블라인드로 피복시키고, Galveston, TX에 있는 University of Texas Medical Branch (UTMB)의 Alexander Bukreyev 박사의 실험실로 보냈다. 이들은 복제 바이러스 중화 분석에서 테스트되었고, 각 샘플에 대한 VNT50 역가가 산출되었다. 이들 결과는 UTMB와 Academia Sinica에서 수행된 두 분석 사이에 강력한 상관관계(r=0.9400)를 보여주었다(도 55).
요약하면, 면역원성 테스트의 결과는 세 가지 백신 제형 모두가 면역원성임을 나타내었고, S1-RBD 결합 항체 역가 측면에서, ACE2에 SARS-CoV-2 S1-RBD 단백질의 결합 억제, 그리고 살아있는 SARS-CoV-2 중화 측면에서 S1-RBD-sFc는 명백한 이점을 가지고 있다.
실시예 14
SARS-CoV-2에 의한 감염 예방용 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물의 제작
백신 조성물의 상이한 제형을 제조하고, 백신 투여에 대한 적합성을 시험하기 위해, 제형화-전 특성화 연구에서 평가하였다. 강제 분해 연구에서, S-RBD-sFc는 열, 빛 노출 및 교반에 민감한 것으로 나타났지만, 동결 및 해동 주기에는 민감하지 않았다. S-RBD-sFc에 민감한 것으로 간주되는 조건을 사용하여 백신 투여에 적합한 적절한 pH 및 부형제를 선택하였다.
1. pH - 열 및 UV 노출
S-RBD-sFc의 등전점(pI) 값은 7.3 ~ 8.4이므로, 제형은 pH 5.7 ~ 7.0 범위에서 제조되었다. 일반적으로, 제형 pH가 등전점(pI)에서 멀어질수록 단백질 용해도는 그에 따라 증가하기 때문에, 용액이 더 맑아진다.
크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 제형의 pH가 열- 유도된 단백질 응집 또는 UV-유도된 불순물에 영향을 미치는지 여부를 결정했다. 이 연구에서, 히스티딘 완충액을 사용하여 pH 5.7~ 7.0 범위의 S-RBD-sFc를 함유하는 용액을 준비하였고, 35℃에서 24시간 동안 항온처리하거나, 또는 24시간 동안 자외선을 노출되도록 하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 존재하는 S-RBD-sFc의 양, 뿐만 아니라 몇 가지 고-분자량(HMW) 불순물의 양을 결정했다. 이 연구 결과는 표 30에 나타낸다. 구체적으로, 결과에서 pH가 열-유도된 단백질 응집에 명백한 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다. 이 결과는 또한 24시간 동안 UV 노출-후 pH가 감소됨에 따라, 특히 pH 5.7에서 6.4로 감소함에 따라, S-RBD-sFc는 고-분자량 불순물을 더 적게 형성함을 보여주었다.
이 연구를 기반으로 하여, 10mM 히스티딘과 pH 5.4 및 pH 6.4의 제형 pH 사양 한계를 사용하여, 표적 pH 5.9 스트레스 조건에서 프로토타입(prototype) 제형의 평가에 따라, 최종 제형이 선택되었다.
2. 계면활성제 - 교반
강제 분해 연구에 따르면, S-RBD-sFc는 교반 스트레스에 민감하고, 교반 중에 눈에 보이는 입자들을 형성하는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다. 계면활성제는 종종 고체-액체 계면 및 액체-공기 계면에서 단백질 흡착을 줄이는 데 사용되며, 이것은 단백질 불안정화로 이어질 수 있다. 따라서, 폴리소르베이트 80이 교반-후 S-RBD-sFc의 침전을 감소시킬 수 있는지, 또는 방지할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 연구가 수행되었다.
이 연구에서, 대략적으로 2mg/mL의 S-RBD-sFc를 함유하는 3개의 개별 용액을 67시간 동안 25℃에서 1,200 RPM에서 교반시켰다. 첫번째 용액은 0.03% (w/v)의 폴리소르베이트 80을 함유하였고, 두번째 2 용액은 0.06% (w/v)의 폴리소르베이트 80을 함유하였고, 세번째 용액은 임의의 폴리소르베이트 80을 함유하지 않았으며, 이는 대조군이었다. 이 연구에서, 결과는 0.06% (w/v)의 폴리소르베이트 80이 교반-후, S-RBD-sFc를 효과적으로 완화시켰음을 보여주었다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 0.06%(w/v)의 폴리소르베이트 80의 존재로 제형에서 안정성이 개선되었고, S-RBD-sFc의 침전이 감소된 것으로 확인되었다.
3. 단백질 완충제
부가제, 이를 테면, 아르기닌-HCl, 수크로스, 그리고 글리세롤은 단백질 제형 개발에서 보호제로 빈번하게 이용된다.
이 연구에서, 다양한 양의 아르기닌-HCl(25mM~100mM), 수크로스 (25mM~100mM) 또는 글리세롤 (5%~15%)과 함께, S-RBD-sFc를 함유하는 용액을 50℃에서 1 시간 동안 항온처리했다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 존재하는 S-RBD-sFc의 양, 뿐만 아니라 몇 가지 고-분자량(HMW) 불순물의 양을 결정했다. 이 연구 결과는 표 30에 나타낸다. 구체적으로, 상기 결과에서 아르기닌-HCl, 수크로스 또는 글리세롤의 첨가가 열-유도된 응집을 낮출 수 있음이 드러났다. 이러한 결과는 40℃에서 45분 동안 항온처리된 샘플의 탁도(OD600)를 측정하여, 추가로 확인되었다. 크기 배제 크로마토그래피 결과와 일치하게, 아르기닌-HCl, 수크로스 또는 글리세롤의 첨가로 샘플의 탁도는 효율적으로 감소되었다 (데이터는 표시되지 않음).
pH 5.9에서 S-RBD-sFc 용액에 대한 UV 스트레스 하에서 아르기닌-HCl, 수크로스 또는 글리세롤의 효과도 평가되었다. 크기 배제 크로마토그래피 결과는 아르기닌-HCl의 첨가가 광-유도 응집을 약간 증가시켰지만, 그러나, 수크로스 및 글리세롤은 응집에 어떠한 유의미한 영향을 미치지 않았다는 것을 나타내었다 (표 30).
4. 요약
제형 스크리닝 연구에서 얻은 결과의 요약은 표 31에 제공된다.
실시예 15
SARS-CoV-2에 의한 감염 예방을 위한 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물에 사용을 위한 S1-RBD-sFc 단백질 생산
소규모 파일럿 규모 배취(batch) (15L) 및 대규모 배취(100L)에 대한 유가식 생산 개발은 다음과 같이 수행되었다.
1. 파일럿 배취 (15L)
a. 유가식 세포 배양 상류 공정
파일럿 규모의 유가식 생산 개발은 초기 작업 부피가 9L인 15L Finesse 바이오리액터에서 수행되었다. HYPERFORMA™ 15L 바이오리액터는 HYPERFORMA™ G3Lab 컨트롤러 및 TruFlow 가스 질량 유량 컨트롤러(MFC)가 구비된 유리 용기 바이오리액터다. 장착된 임펠러는 경사진(pitched) 블레이드 임펠러이고, 분산관(sparger)은 환기용 직경 0.8mm 구멍이 있는 드릴 파이프 분산관이다. 15-L 바이오리액터 매개변수는 다음과 같다:
a. 배지: DYNAMIS + 1 g/kg 덱스트란 술페이트 + 1.17 g/kg 글루타민
b. 초기 세포 밀도: 0.3E6 vc/mL
c. 온도: 37 ℃; D5에서 TS ~ 32 ℃
d. pH: pH 7.0 ± 0.3; 염기: 1 M Na2CO3; 산: CO2
e. 용존 산소: 설정값 50%
f. 공급 전략: 83% EX-CELL® ACF CHO 배지 + 17% EX-CELL® 325 PF CHO 배지, 여기에 50 g/kg 포도당 및 20 g/kg 효모 추출물이 보충됨,
D3 - D7: 매일 3%; D8 - D12: 매일 4% (전체 공급 비율: 35% w/w)
g. 포도당 제어: D3 - D13: [Gluc] ≤ 2 g/L일 때, 2 g/kg 포도당 (스톡 300 g/kg)을 추가
h. 수거 기준: 세포 생존력 ≤ 60% 또는 D14 시점
간단히 말해서, L-글루타민 및 덱스트란 설페이트가 보충된 DYNAMIS™ AGT™ 배지(Thermo Fisher Scientific, A2617502)는 종자 트레인 확장(seed train expansion) 및 생산 공정 모두에 사용되었다. 생물반응기에 대한 일시 (bolus) 영양 공급은 실행 3일차(D3)에 시작되었다. 영양 공급물은 83% EX-CELL® ACF CHO 배지 (Merck, C9098)에 17% EX-CELL® 325 PF CHO 배지 (Merck, 24340C)를 블랜딩하여 제형화되었다. BioProfile FLEX Analyzer (Nova Biomedical)에서 세포 수, 세포 생존력, 대사 산물(포도당, 젖산, 글루타민, 글루타메이트 및 암모니아), 삼투질 농도, pH, pCO2 및 pO2를 매일 모니터링했다. 수거 기준은 세포 생존율이 60% 미만, 또는 생산 14일차(D14)이었다.
수확 당일, 세포 배양액을 C0HC 심층 필터(Merck, MC0HC05FS1)로 정화시킨 후, 0.22μm 캡슐 여과시켰다. 수확된 세포 배양액 (HCCF)은 하류 처리를 위해 즉시 단백질 정제 연구소로 옮겨졌다.
이 과정에서, 피크 VCD는 7일째에 대략 14E+06 vc/mL이었고, 세포 생존율은 생산이 끝날 때까지 ≥90%을 유지할 수 있었다. S1-RBD-sFc의 생산성은 14일차 시점에 1.6g/L이었다.
b. 수거
Millistak+ POD C0HC 0.55 m2 및 Opticap XL 5 Capsule을 수확 재료에 적용했다. 600 LMH의 유속으로 100 L/m2의 정제수를 필터에 플러싱했다. 플러싱 속도는 5L/분이었고, 플러싱 시간은 적어도 10분이었다. 블로우 다운(Blow down)을 수행하여 POD 필터로부터 정제수를 배출시킨 후, 여과액(최소 10분 동안 10psi)을 흐르게 하였다. 54.5 LMH에 등가인, 500 L/분으로 수확 세포 배양액(HCCF)을 흐르게 하였다. 첫 1.4L의 농축물(retentate)을 버리고, 나머지 농축물을 수집했다. 전체 운용 동안, 압력을 모니터링했고, 압력은 30psi를 초과하지 않아야 한다. 정화-전 탁도와 정화-후 탁도는 차례로, 각각 1343 NTU 및 12.9 NTU이었고, 정화-전 탁도와 정화-후 역가는 차례로, 각각 1.66 g/L 및 1.50 g/L이었다. 상류 산물 수율은 높았다(1.5g/L).
c. 하류 정제 공정 개발
간략하게 설명하자면, 수확된 세포 배양액(HCCF)을 먼저, 1% TWEEN 80(Merck, 8.17061) 및 0.3% TNBP(Merck, 1.00002)로 처리하였고, 용매/세제 바이러스 비활성화를 위해 주위 온도(23±4℃)에서 교반 없이, 1시간 동안 유지시켰다. 상기 용매/세제 처리된 HCCF는 단백질 A 친화력 크로마토그래피 컬럼 (MabSelectSuRe LX 수지, Cytiva Life Sciences, 17-5474-03)을 이용하여 정제시켰다. 상기 단백질 A 컬럼으로부터 용출액은 1M Tris 염기 용액(Merck, 1.08386)으로 즉시 pH 6.0으로 중화되었다. 중화된 단백질 용액을 C0HC(23 cm2, Merck Millipore, MC0HC23CL3) 및 X0SP(23 cm2, Merck Millipore, MX0SP23CL3)의 두 가지 유형의 심부(depth) 필터로 여과시켜, 침전물 및 불순물을 제거하였다. 정화된 단백질 용액은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 (NUVIA™ HR-S media, Bio-Rad, 156-0515)에 의해 추가로 정제되었다. 이 단백질 농도를 5mg/ml로 조정하였고, 단백질 용액을 바이러스 여과(PLANOVATM 20N 나노 필터, Asahi Kasei, 20NZ-001)하였다. 나노 여과의 여과액은 접선 유동 여과(TANGENX™ SIUS™ PDn TFF Cassette, Repligen, PP030MP1L)를 사용하여 완충액을 제형 완충액으로 교환했다. 상기 완충액 교환 후, TWEEN 80을 최종 농도 0.06%(w/v)로 제형화된 단백질 용액에 첨가한 후 0.22μm 여과시켰고, 제형화된 제품은 2-8℃에서 보관하고, 빛에 노출되지 않도록 보호했다.
d. 공정 수율, 15L 파일럿 로트
각 단계의 수율은 다음과 같다:
a. 용매 세제 바이러스 비활성화, 단백질 A 크로마토그래피, 중화 및 심부 여과: 11.30 g (83.1% 수율).
b. 양이온 교환 크로마토그래피: 10.96 g (96.7% 수율).
c. 나노-여과, 정용여과 및 0.2μg 여과에 의한 제형: 10.50 g (99.7% 수율).
전체 회수는 수율 80.3%이었다.
2. 대규모 배취 (100L)
S-RBD-sFc (100L)의 임상 배취는 clonal Research Cell Bank에서 제조되었다. 최종 조성에서 변경 없이, 약물 원료 수준에서만 변경이 이루어졌다. 원료 및 공정 매개변수는 변경되지 않고, 다만 배취 크기만 확장된다. 두 로트 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았다.
파일럿 배취와 대규모 배취 간의 S-RBD-sFc 의약품 원료 제조 공정 변경의 영향은 비교성 연구를 통해 평가되었다.
15L 규모 공정의 원료 의약품 배취와 100L 규모 공정의 원료 의약품 사이의 비교성을 평가하기 위해, 특성화에 의해 생성된 방출 데이터의 분석 데이터와 강제 분해 연구 데이터를 비교하고, 평가하였다.
15L 스케일 및 100L 스케일 제조 공정으로 생산된 S-RBD-sFc 로트는 모두 해당 사양에 설정된 출시 사양을 충족했다. 테스트된 모든 로트는 유사한 수준의 크기 변형 및 불순물, 유사한 전하 변형 분포 및 유사한 역가로 로트-대-로트 간 일관성을 보여주었다.
특성화 연구의 결과는 15L 규모 또는 100L 규모 제조 공정에 의해 생산된 S-RBD-sFc 로트의 단백질 및 탄수화물 구조, 해독-후 변형, 순도/불순도, 이질성 및 생물학적 활성의 비교 가능성 및 일관성을 입증했다. 또한, 강제 분해 연구에서 분해 경로와 특정 분해 조건에 대한 민감도는 상이한 공정으로 제조된 테스트 로트와 유사하였고, 필적함을 보여주었다.
전반적으로, 이들 결과에서 방출 테스트, 강제 분해 연구 및 추가 특성화에서 얻은 결과에 대해 15L 규모와 100L 규모로 생산된 S-RBD-sFc 로트의 비교성을 보여주었다.
실시예 16
SARS-CoV-2에 의한 감염 예방용 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물
기니아 피그에 대한 초기 면역원성 평가는 우리 RBD 기반 단백질의 체액성 면역원성을 확립하였고, SARS-CoV-2에 대항하는 백신을 위한 주요 면역원성 B 세포 성분으로 S1-RBD-sFc(서열 번호:235)를 선별할 수 있었다.
T 세포 에피토프의 존재는 바이러스 항원에 대항하는 B 세포 기억 반응의 유도에 중요하다. MHC 결합 및 T 세포 기능 분석에 의해 검증된 바와 같이, SARS-CoV-2와 SARS-CoV-1(2003) 바이러스 사이에 보존되었던 SARS-CoV-2 CTL 에피토프와 Th 에피토프는 COVID-19에 대항한 고-정밀 SARS-CoV-2 백신 기획에 이용된다. MHC-결합 분석을 사용하여 결정된, SARS-CoV-1(2003) 상의 T 세포 에피토프 식별은 서열 정렬에 의해 SARS-CoV-2(2019)에서 대응하는 T 세포 에피토프 결정에 사용되었다 (도 3, 도 4, 그리고 도 5A-5C 그리고 표 32 참고). 기술된 고-정밀 기획 SARS-CoV-2 백신의 설계에 편입된 CTL 에피토프는 유사한 방식으로 확인되었다. SARS-CoV-2 백신 기획에 통합된 Th 에피토프 및 CTL 에피토프는 표 32에 나타난 바와 같이, MHC 클래스 II 결합 및 T 세포 자극에 의해 검증되었다. SARS-CoV-2에 의한 감염 예방용으로, 20μg/mL, 60μg/mL, 그리고 200μg/mL (S1-RBD-sFc 융합 단백질과 Th/CTL 펩티드의 조합 중량)을 함유하는 특이적 멀티토프 단백질/펩티드 백신 조성물들이 표 33 ~표 35에 제시된다.
1. 렛(rats)에서 면역원성 연구
렛에서 시행된 일련의 실험에서, 최적 제형 및 어쥬번트들의 추가 평가, 그리고 상기 백신의 세포 면역성 구성요소들의 추가 평가를 위해, Th/CTL 펩티드 (서열 식별 번호: 345, 346, 348, 348, 361, 그리고 66)의 특허 혼합물을 S1-RBS-sFc (서열 식별 번호: 235) B 세포 구성요소에 추가하였다 (가령, 도 56). 이 백신 조성물은 다음 연구에서 사용되었다.
a. 렛에서 체액성 면역원성 테스트
실시예 13에 기술된 기니아 피그 실험은 ISA 50을 어쥬번트로 사용하여, 프라임(100μg 또는 200μg) 및 부스트(50μg 또는 100μg)를 사용한 단일 투여 요법으로 3개의 단백질 후보로 테스트하여, 각 후보 구조체들의 철저한 비교가 가능했다. 렛에서 수행된 이러한 일련의 실험에서, 면역원 및 어쥬번트의 다양한 투여분량을 평가하여, S1-RBD 결합 항체 역가 및 균형 잡힌 Th1/Th2 반응에 기초하여 최적의 어쥬번트를 선택할 수 있었다.
상기 Th/CTL 펩티드와 함께, S1-RBD-sFc 단백질을 함유하는 백신 조성물을 두 가지 상이한 어쥬번트 시스템을 갖는 후보 백신과 복합시켰다: (a) CpG3 (서열 식별 번호: 106)와 복합된 ISA51, 그리고 (b) CpG1 (서열 식별 번호: 104)과 복합된 ADJU-PHOS®. 이들 백신-어쥬번트 조합은 주사 당 10 내지 300μg의 광역의 투여분량 범위로, 0 WPI(프라임) 및 2 WPI(부스트)에서 랫에게 IM으로 투여되었다. 항체 역가 분석을 위해, 동물을 0, 2(즉, 1 투여분량 투여 후), 3 및 4 WPI(즉, 2차 투여-후 1주차 및 2주차 시점)에 채혈했다.
모든 시점에서 테스트된 결합 항체(BAb)의 테스트 결과는 두 가지 어쥬번트 시스템과 함께 제형화된 백신이 10~300μg 범위의 모든 투여분량에 걸쳐 유사한 수준의 항-S1-RBD ELISA 역가를 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 심지어 적은 양의 1차 단백질 면역원을 사용할 때에도 백신 제형의 우수한 면역원성을 나타낸다 (도 57A). 또한, 합성 펩티드 성분이 없는, 100-μg 투여분량의 S1-RBD-sFc는 기존 기니아 피그 연구와 유사하게, 높은 S1-RBD 결합 활성을 자극했다 (데이터는 제시되지 않음).
S1-RBD:ACE2 결합 억제 ELISA 테스트에서, 10 및 30μg의 투여분량은 4 WPI에서 100 및 300μg의 높은 투여분량 만큼 강력한 억제성 활성을 유도했다 (도 57B, 좌측 패널). 가장 강력한 억제 활성은 합리적으로 기획된 펩티드와 ADJU-PHOS®/CpG1 어쥬번트로 제형화된 가장 낮은 투여분량의 S1-RBD-sFc 단백질 (10μg)에서 나타났다. 대만 SARS-CoV-2 분리주에 대한 복제 바이러스 중화 분석에서 (상기 기니아 피그 연구에서 논의된 바와 같이), 상기 백신 조성물에 의해 유도된 4 WPI 면역 혈청은 유의미한 투여분량-의존적 효과를 나타내지 않았다. 그러나, 낮은 투여분량의 어쥬번트화된 단백질 (10 및 30μg)은 >10,240 희석 배수의 VNT50에서 바이러스 감염을 중화할 수 있다 (도 57B, 우측 패널). 각각의 백신접종된 투여분량 그룹으로부터 6 WPI에서 렛 면역 혈청을 분석하였고, (a) S1-RBD:ACE2 결합 억제 ELISA에서 역가에 대한 COVID-19 환자의 회복기 혈청 세트와 비교, 차단 수준은 μg/mL으로 나타냄; 그리고 (도 57C, 좌측 패널); 그리고 (b) Vero-E6 세포에서 SARS-CoV-2 CPE 분석, VNT50으로 나타냄 (도 57C, 우측 패널). 도 57C에 나타낸 바와 같이, 백신 제형의 모든 투여분량은 S1-RBD:ACE2 결합 ELISA에 의해, 회복기 환자의 것보다 래트에서 유의적으로 더 높은 중화 역가를 유도하였고, VNT50도 더 높다 (그러나, 환자 데이터 스프레드 및 동물 숫자가 적음으로 인해 통계적 유의성을 달성하지 못했다).
b. 렛에서 세포 면역원성 테스트
Th1/Th2 반응 균형과 관련된 문제를 해결하기 위해, 백신접종된 렛의 세포 반응을 ELISpot을 사용하여 평가했다.
i. 렛 Th1/Th2 균형 연구를 위한 절차
8-10주령(300-350gm/BW)의 총 12마리의 수컷 Sprague Dawley 쥐를 BioLASCO Taiwan Co., Ltd.에서 구입했고, 3-일간의 순응 후, 동물을 무작위로 4개 그룹으로 할당했다. 동물에 대한 모든 절차는 UBIAsia의 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에서 검토 및 승인한 규정 및 지침에 따라 수행되었다. IACUC 번호는 AT-2028이다. 이들 렛에게 S1-RBD-sFc (서열 식별 번호: 235), 그리고 ADJU-PHOS®/CpG1 어쥬번트에서 제형화된 SARS-CoV-2의 S 단백질, M 단백질 및 N 단백질로부터 선별된 5개 Th/CTL 펩티드 (서열 식별 번호: 345, 346, 348, 348, 그리고 361) 및 특허된 범용 Th 펩티드 UBITh®1a (서열 식별 번호: 66)를 함유하는 백신 조성물을 1 ~ 100μg의 상이한 투여분량 범위로 0주차(프라임) 및 2주차 (부스터)에 근육으로 백신접종하였다. 항원성 활성 평가를 위해, 렛 (각 투여분량 그룹에서 n = 3)의 면역 혈청은 0주차, 2주차, 3주차, 그리고 4주차에 수집되었다. 비장세포를 4 WPI에서 수집하였고, Th/CTL 펩티드 풀(pool) + S1-RBD 또는 Th/CTL 펩티드 풀 단독으로 2μg/웰로 시험관내 재-자극하였다. IFN-γ, IL-2 및 IL-4-방출 비장세포는 ELISpot 분석에 의해 결정되었다. 백만개 세포당 사이토킨-방출 세포(SC)는 음성 대조군 웰로부터 차감시킴으로써 산출된다.
ii. 세포 반응 측정을 위한 ELISpot
4 WPI에서 백신접종된 렛의 비장을 림프구-조건화 배지(LCM, 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지)에서 수집하였고, 단일 세포 현탁액으로 처리했다. 세포 펠렛을 실온 (RT)에서 3분 동안 5mL의 RBC 용해 완충액에 재현탁시키고, 이어서 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 원심분리 후, LCM에 재현탁된 세포 펠릿을 ELISpot 분석에 사용했다. ELISpot 분석은 렛 IFN-γ ELISpotPLUS 키트 (MABTECH, 카탈로그 번호: 3220-4APW), 렛 IL-4 T 세포 ELISpot 키트 (U-CyTech, 카탈로그 번호: CT081) 및 렛 IL-2 ELISpot 키트 (R&D Systems, 카탈로그 번호: XEL502)를 사용하여 수행하였다. 포획 항체로 사전-피복된 ELISpot 플레이트는 RT에서 최소 30분 동안 LCM으로 차단시켰다. 250,000개의 렛 비장세포를 각 웰에 플레이팅하였고, S1-RBD-His 단백질 + Th/CTL 펩티드 풀, S1-RBD-His 단백질, Th/CTL 펩티드 풀 또는 각각의 단일 Th/CTL 펩티드로 18-24시간 동안 37℃에서 자극했다. LCM에서 웰당 1μg의 각 단백질/펩티드의 최종 농도로 세포를 자극시켰다. 제조업체의 지침에 따라 스팟(spots)을 발달시켰다. LCM 및 ConA는 차례로, 각각 음성 대조군 및 양성 대조군에 사용되었다. AID iSpot 판독기로 스팟을 스캔하고, 정량화했다. 백만 세포당 스폿 형성 단위(SFU)는 음성 대조군 웰을 차감시켜 산출했다.
IFN-γ 분비의 투여분량-의존적 경향은 비장세포에서 관찰되었지만, IL-4의 분비는 거의 관찰되지 않았다 (도 58A). 이들 결과는 백신 조성물이 높은 면역원성을 갖고, IFN-γ/IL-4 또는 IL-2/IL-4의 높은 비율에 의해 나타난 바와 같이, Th1-경향의 세포 면역 반응을 유도함을 나타내었다. Th/CTL 펩티드 풀(도 58B)의 존재 및 개별 펩티드를 사용한 재자극에 대해 높은 비율의 IL-2/IL-4가 또한 관찰되었으며, 이는 IL-4 분비를 거의 유도하지 않았다 (도 58C). 막대는 평균 SD를 나타낸다. (n = 3). IFN-γ 또는 IL-2의 분비는 30 및 100μg 그룹에서 IL-4보다 유의미하게 높은 것으로 관찰되었지만 (최소 제곱 평균 및 쌍을 이루는 현명한 비교 사용 *** p < 0.005) 그러나, 이들은 1 또는 3μg 용량 그룹에서 통계적으로 상이하지 않았다.
2. 유전자삽입된 마우스에서 공격 연구
백신 조성물의 초기 공격 연구는 대만의 Academia Sinica에서 Mi-Hua 박사가 구축한 AAV/hACE2 형질도입된 BALB/c 마우스 모델에서 수행되었고; 이 모델의 순응은 또한 다른 조사자들에 의해 또한 보고되었다.
a. BALB/C 공격 연구를 위한 동물 절자
8-10주령의 총 12마리의 수컷 BALB/C를 BioLASCO Taiwan Co., Ltd.에서 구입했고, 3-일간의 순응 후, 동물을 무작위로 4개 그룹으로 할당했다. 동물에 대한 모든 절차는 UBI Asia의 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에서 검토 및 승인한 규정 및 지침에 따라 수행되었다. IACUC 번호는 AT2032 및 AT2033이다.
ADJU-PHOS®/CpG1 어쥬번트에서 제형화된 Th/CTL 펩티드 (서열 식별 번호: 345, 346, 348, 348, 361, 그리고 66)와 함께, S1-RBD-sFc (서열 식별 번호: 235)를 함유하는 백신 조성물 3, 9, 또는 30μg로 0주차 (프라임) 및 2주차 (부스터) 시점에서 IM 경로를 통하여 이들 마우스에게 백신접종했다. 하기에 기술된 분석 방법으로 면역원성 및 기능적 활성의 평가를 위해, 마우스로부터의 면역 혈청을 0주, 3주차차 및 4주 시점에 수집하였다.
AAV6/CB-hACE2 및 AAV9/CB-hACE2는 Academia Sinica의 AAV 핵심 시설에서 생산되었다. BALB/C 마우스 (8-10주령)를 아트로핀(0.4mg/ml)/케타민(20mg/ml)/자일라진(0.4%) 혼합물의 복강내 주사로 마취시켰다. 그런 다음, 이들 마우스에게 100μL 염수 중 3 x 1011 vg의 AAV6/hACE2를 기관내(IT) 주사했다. 폐외 기관을 형질도입하기 위해, 100μL 염수 중 1 x 1012 vg의 AAV9/hACE2를 마우스의 복강내 주사하였다.
AAV6/CB-hACE2 및 AAV9/CB-hACE2 형질도입-후 2주차 시점에서, 이들 마우스를 마취시키고, 100μL 부피에서 SARS-CoV-2 바이러스(hCoV-19/Taiwan/4/2020 TCDC#4, National Taiwan University, Taipei, Taiwan에서 입수)의 1x104 PFU를 마우스의 비강 내로 공격했다. 이들 마우스 공격 실험은 Academia Sinica의 IACUC에 의해 평가되었고, 승인되었다. 실험에서 살아남은 마우스들은 ISCIII IACUC 지침에 따라 이산화탄소를 사용하여 희생시켰다. SARS-CoV-2 공격-후, 모든 동물의 체중을 하루에 한 번 측정했다.
b. SARS-CoV-2 RNA 정량을 위한 RT-PCR
SARS-CoV-2의 RNA 수준을 측정하기 위해, SARS-CoV-2 게놈의 외피 (E) 유전자에서 26,141~26,253개 영역을 표적으로 하는 특이적 프라이머를 기존 연구에서 기술된 Taqman 실시간 RT-PCR 방법 (Corman, et al. 2020)에서 사용하였다. 프로브 E-Sarbeco-P1 (5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3'; 서열 식별 번호: 370)에 추가적으로, 포워드 프라이머 E-Sarbeco-F1 (5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3'; 서열 식별 번호: 368) 및 리버스 프라이머 E-Sarbeco-R2 (5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3'; 서열 식별 번호: 369)를 또한 이용하였다. 제조업체의 지침에 따라 RNeasy Mini Kit(QIAGEN, Germany)를 사용하여 각 샘플에서 총 30μL RNA 용액을 수집했다. 백금 Taq 중합효소 (Thermo Fisher Scientific, USA)와 함께, Superscript III 일-단계 RT-PCR 시스템을 사용하여, 총 25μL 혼합물에 5μL의 RNA 샘플을 추가했다. 최종 반응 혼합물은 400nM 포워드 프라이머, 역방향 프라이머, 200nM 프로브, 1.6mM의 데옥시-리보뉴클레오시드 삼인산염(dNTP), 4mM 황산 마그네슘염, 50nM ROX 참조 염료 및 상기 키트의 효소 혼합물 1μL을 함유한다. 사이클링 조건은 일-단계 PCR 프로토콜로 수행되었다: cDNA 합성을 위해 55℃에서 10분, 94℃에서 3분, 그리고 94℃에서 15초와 58℃에서 30초의 증폭 주기를 45회. Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific, USA)에 의해 데이터를 수집하고, 산출했다. 합성된 113-bp 올리고뉴클레오티드 단편을 qPCR 표준으로 사용하여, 바이러스 게놈의 카피 수를 추정했다. 상기 올리고뉴클레오티드는 Genomics BioSci and Tech Co. Ltd. (Taipei, Taiwan)에 의해 합성되었다.
c. 공격 연구
3마리의 마우스 그룹에게 연구 0일차 및 2일차 WPI에서 상기 기재된 백신 조성물 (이 조성물은 3, 9, 또는 30μg의 단백질을 함유하고, ADJU-PHOS®/CpG1으로 제형화된)로 백신접종하였다. 이들 마우스에게 4 WPI에서 hACE2를 발현시키는 아데노-연합된 바이러스(AAV)를 감염시키고, 2주 후 비강(IN) 경로를 통해 106 TCID50의 SARS-CoV-2로 공격했다 (도 59A). 상기 백신의 효능은 폐 바이러스 부하 및 체중 측정을 사용하여 측정되었다. 도 59B에 나타낸 것과 같이, 30μg의 상기 백신 조성물로 백신접종하면, 염 그룹과 비교하였을 때, 폐 바이러스 로드 (~3.5 log10 바이러스 게놈 복사체/μg RNA 또는 ~ 5-배 TCID50/mL의 감염성 바이러스)가 상당히 감소되었다 (대응표본 t 테스트를 이용하여 측정하였을 때, p <0.05). 도 59C에 나타낸 바와 같이, 중간 투여분량 및 높은 투여분량의 백신 접종으로 폐 병리가 명확하게 감소되었다. 3 또는 9μg의 백신 조성물을 사용한 백신접종으로 세포 배양법(TCID50)을 통한 살아있는 바이러스 검출은 검출 수준 이하로 감소되었지만 (LOD, 도 59B, 우측 패널), 그러나 RT-PCR로 측정했을 때, 바이러스 부하를 유의미하게 감소시키는 것으로 보이지 않았다(도 59B, 좌측 패널). 유사하게, 체중 측정은 높은 투여분량 그룹과 대조군 사이에 유의한 차이를 보였다 (데이터는 제시되지 않음). 요약하면, 이 연구에서 통계적 검정력(N=3마리 마우스)이 결여됨에도 불구하고, 살아있는 바이러스 검출의 부족과 염증 세포 침윤의 부족, 폐의 면역 병리의 결여를 조합할 경우, 투여당 30μg의 최고 투여분량에서 최대 보호 효능을 가질 수 있었던 것으로 보인다.
3. 히말라야 원숭이에서 면역원성 및 공격 연구
히말라야 원숭이(RM)를 사용하는 확립된 모델에 기초하여, Th/CTL 펩티드(서열 번호: 345, 346, 348, 348, 361 및 66)와 함께 S1-RBD-sFc(서열 번호: 235)를 함유하는 백신 조성물의 면역화 연구를 아래와 같이 수행하였다.
a. 비-인간 영장류에서 면역원성 연구
이 연구는 JOINN Laboratories(북경)에서 대략 3-6년령의 히말라야 원숭이를 대상으로 수행되었다. 동물을 18-26℃의 온도와 40-70%의 상대 습도에서 유지되는 환경적으로 모니터링되고, 환기가 잘 되는 방(일반 등급)인 스테인리스 스틸 케이지에 개별적으로 수용했다. 동물을 적어도 14일 동안 격리시켜, 순응시켰다. 동물 도착 후 3일 이내에 수의사가 동물의 전반적인 건강을 평가하고, 기록했다. 이들 원숭이에 대해 자세한 임상 관찰, 체중, 체온, 심전도(ECG), 혈액, 응고 및 임상 화학을 수행했다. 데이터는 유지 집단으로부터 이동 전, 수의사가 검토했다. -1일차에 얻은 실험-전 체중에 기초하여, 컴퓨터에 의해 생성된 무작위화 절차를 사용하여, 모든 동물을 각 투여분량 그룹으로 무작위로 배정했다. 그룹 1 ~ 그룹 4의 모든 동물에게 근육내(IM) 주사를 통해 대조군 또는 테스트 물품을 제공하였다. 한 쪽 뒷다리의 대퇴사두근 주사에 투여분량을 투여했다. 사망률, 이환율, 대변, 구토, 물과 음식 섭취의 변화를 비롯한, 그러나, 이에 국한되지 않는 임상 징후에 대해 원숭이들을 연구 기간 동안 하루에 두 번 이상(AM 및 PM) 관찰했다. 아래에 설명된 면역원성 연구를 위해, 일정 시격을 두고 동물로부터 채혈했다.
히말라야 원숭이 (3-6 년령)를 4개 그룹으로 나누어, 고-투여분량(100μg/투여), 중간-투여분량(30μg/투여), 낮은-투여분량(10μg/투여)의 백신 및 생리식염수를 각각 근육주사하였다. 모든 그룹의 동물을 3회(0일차, 28일차 및 70일차)에 면역화시키고, 기관내 경로 (82일에 수행)를 통하여 106 TCID50/ml SARS-CoV-2 바이러스로 공격했다. 항원공격-후 7일차 시점에 원숭이를 안락사시키고, 폐 조직을 수집하였다. 3, 5, 7 dpi에서 인후 면봉으로 수집했다. SARS-CoV-2의 중화 항체 테스트를 위해, 면역화-후 0, 14, 28, 35, 42, 70 및 76일차, 그리고 공격-후 0, 3, 5, 7일차 시점에 혈액 샘플을 수집했다. 공격-후 7일차 시점에 폐 조직을 수집하였고, RT-PCR 분석 및 조직병리학적 분석에 사용했다. 접종 후 0일 및 3일차 시점에 수집된 혈액 샘플에서 차례로, 림프구 하위집합 백분율(CD3+, CD4+ 및 CD8+) 및 주요 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6)의 분석도 수행했다.
b. 히말라야 원숭이에서 면역원성 및 공격 연구
히말라야 원숭이 (RM)를 사용한 확립된 모델에 기초하여, IM 주사에 의한 백신 조성물의 면역화 연구는 0 및 4WPI에서 0, 10, 30 또는 100μg의 조성물을 제공받은 RM(N = 4/그룹)에서 시작되었다. 면역원성 측정은 S1-RBD에 대한 혈청 IgG 결합이 5 및 7 WPI에서 약 3 로그에 도달하는 결합 역가로 모든 동물에서 기준선보다 증가되었음을 나타낸다(도 60A). 강력한 중화 항체 반응이 유도되었으며, 30μg 투여분량이 가장 강력했다 (도 60B). ELISpot 분석에서 백신 조성물은 투여분량-의존적 방식으로 항원-특이적 IFN-γ-분비 T 세포를 활성화시켰다는 것이 나타났고, T 세포 반응은 100μg 투여분량 수준에서 가장 높았다 (도 60C).
4. 임상 시험 준비를 위한 독성 연구
임상 시험을 가능하게 하기 위해, S1-RBD-sFc (서열 식별 번호: 235) 및 Th/CTL 펩티드 (서열 식별 번호: 345, 346, 348, 348, 361, 그리고 66)를 함유하는 백신 조성물은 아래에 설명된 대로 Sprague-Dawley 쥐에 대한 GLP-순응 반복-투여분량 독성 연구에서 테스트되었다.
a. 독성 연구를 위한 프로토콜
총 160마리의 렛(rat)(성별 80마리)를 -1일(첫 번째 투여 1일 전, 첫 번째 투여일을 1일로 정의함)에 측정된 체중을 기준으로 8개 그룹에 무작위로 할당했으며, 그 중 120마리의 렛은 연구를 위해 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 그룹 4(성별 및 그룹 당 15마리)에 할당되었고, 부수적(satellite) 연구를 위해 그룹 5, 그룹 6, 그룹 7 및 그룹 8(성별 및 그룹 당 5마리)에 40마리의 렛이 할당되었다. 그룹 1과 그룹 5의 경우 염수 주사를 음성 대조군으로 하고, 그룹 2와 그룹 6의 경우 백신 조성물 플라시보를 어쥬번트 대조군으로, 그룹 3과 7 뿐만 아니라 그룹 4와 그룹 8의 경우 동물당 백신 조성물 100, 300μg의 투여분량으로 렛을 처리하였다. 렛에게 한쪽 뒷다리 근육(대퇴사두근과 비복근, 첫 번째 투여분량은 왼쪽, 두 번째 투여분량은 오른쪽)에 2주에 한 번씩, 연속 2주 동안 다수 부위에, 총 2회(1일차와 15일차 시점) 근육주사 투여했다. 투여 부피는 동물당 0.5mL이었다. 임상 관찰 (주사 부위 관찰 포함), 체중, 음식 섭취, 체온, 검안경 검사, 혈액학, 응고, 임상 화학, 소변 검사, T 림프구 하위집단, 말초혈액 단핵 세포(PBMCs)에 의해 IFN-γ를 분비하는 T 림프구 반점 수), 사이토킨 및 면역원성, 중화 항체 역가 및 IgG2b/IgG1 비율 분석이 연구 동안 수행되었다. 그룹 1 ~ 그룹 4의 처음 10마리 동물(성별/그룹)은 투여분량 투여-후 2주차 시점 (18일차) 말기 부검으로 대상으로 지정되었고, 나머지 5마리 동물(성별/그룹)은 마지막 투여분량 투여-후(44일차) 4-주 회복 부검 대상으로 지정되었다. 그룹 1 ~ 그룹 4의 모든 동물은 완전한 부검 검사를 받은 후, 장기 무게, 육안 및 현미경 검사로 평가했다.
b. 임상 시험 준비를 위한 독성 연구
임상 시험을 가능하게 하기 위해, 백신 조성물은 아래에 설명된 대로 Sprague-Dawley 쥐에 대한 GLP-순응 반복 용량 독성 연구에서 테스트되었다. 이 연구에는 300ug 투여분량이 내포되었으며, 이는 임상용으로 의도된 최고 용량보다 3배 더 높다. 2회 주사 일정이 임상 용도를 초과하지는 않았지만, WHO 가이드라인 46에 따르면 허용 가능한 수준이다. 이 연구는 또한 백신 조성물의 면역원성을 평가하도록 기획되었다. 160마리의 렛을 무작위로 8개 그룹(수컷 80마리, 암컷 80마리)으로 나누었고, 그 중 40마리는 부수적 면역원성 연구에 내포되었다. 낮은-투여분량 그룹 및 높은-투여분량 그룹에 각각 동물당 각각 100μg(0.5mL) 및 300μg(0.5mL)의 백신 조성물을 접종하였고; 대주군에게는 동일한 투여분량 부피로 염 (0.9% 염) 또는 어쥬번트 (백신 조성물 플라시보)를 주사하였다. 처음 10마리 동물(성별/그룹)은 투여분량 투여-후 2 WPI (18일차)에서 말기 부검으로 대상으로 지정되었고, 나머지 20마리 동물(성별/그룹)은 마지막 투여분량 투여-후 4WPI에서(44일차) 4-주 회복 부검 대상으로 지정되었다. 상기 실험 조건 하에서, 렛에게 한쪽 뒷다리 근육(대퇴사두근과 비복근, 첫 번째 투여분량은 왼쪽, 두 번째 투여분량은 오른쪽)에 2주에 한 번씩, 연속 2주 동안 다수 부위에, 0 및 2 WPI (1일차와 15일차 시점)에서 총 2회 투여분량을 IM 주사 투여했다.
1주 및 3주 시점에 동물당 최대 300μg의 투여분량 수준에서 백신 조성물을 사용한 치료는 내약성이 우수하였고, 전신 독성의 징후도 없었다. 테스트 물품-관련된 사망률이나 빈사 상태는 연구 전반에 걸쳐 언급되지 않았다. 연구 전반에 걸쳐, 임상 관찰(주사 부위 관찰 포함)에서 백신-관련 이상 소견은 관찰되지 않았다. 주사 부위에서는 홍반 또는 부종은 관찰되지 않았으며, 모든 관찰 시점에서 Draize 점수는 0이었다. 유사하게, 체중, 음식 섭취, 체온, 혈액학, 화학(AG 비율 제외), 검안경 검사 또는 소변 검사에서 백신-관련 변화는 관찰되지 않았고, CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, 그리고 CD3+CD4+/CD3+CD8의 비율에서 통계학적으로 유의적인 변화는 없었다. 피브리노겐, IFN-γ 및 IL-6에서 통계적으로 유의한 증가가 관찰된 반면, 알부민/글로불린 비율의 감소가 관찰되었고; 이 결과는 백신에 대한 급성 단계 반응과 일치하며, 회복 기간이 끝날 때 모두 해소된다. 부고환, 피부, 간, 전립선 및 유선의 조직병리학적 검사에서 눈에 띄는 병변 또는 이상 없이, 최소한의 염증 세포 침윤이 나타났다.
부수적인 그룹에서 측정된 백신 조성물의 면역원성은 2 및 4 WPI (14-일 간격)에서 동물당 100μg 또는 동물당 300μg의 2회 투여분량을 투여받았던 동물들에서 상기 백신은 항-SARS-CoV-2 S1-RBD IgG를 상당한 수준으로 유도할 수 있음을 보여주었다 (데이터는 제시되지 않음). S1-RBD 결합 IgG 역가는 2 WPI(15일차 시점)에서 부스트-후 시간 경과에 따라 완만하게 상승했으며, 이는 각각 동물당 100μg 및 동물당 300μg의 백신 조성물로 면역접종받았던 렛에서 6 WPI (44일차)의 시점에 대략 2.6 log10 및 3.3 log10에 도달했다. 이 연구에서 관찰된 결과는 면역 반응을 자극하여, 높은 역가의 항체를 생성하도록 기획된 백신에 대해 예상한 것과 같다. Th1/Th2 반응을 결정하기 위해, ELISA에 의한 항-SARS-CoV-2 S1-RBD IgG 역가, 하위유형 IgG 및 혈청 사이토킨 생산을 수행했다. S1-RBD-특이적 IgG 하위클라스 분석에서, Th2-관련 하위클라스 IgG1 항-SARS-CoV-2 S1-RBD의 패턴 및 유도 수준은 전체 IgG 항-SARS-CoV-2 S1-RBD에서 관찰된 것과 유사했다. 6 WPI(43일차 시점)에 백신 조성물로 백신접종된 랫트에서 Th1-관련 하위클라 IgG2b 항-SARS-CoV-2 S1-RBD가 약간 유도된 것이 검출되었다. 그러나, ELISA에 의해 측정된 혈청 사이토킨 패턴은 Th1/Th2 균형 반응을 나타냈다 (데이터는 제시되지 않음).
대만에서 상기 백신 조성물의 임상 시험이 시작되었다. 첫 번째 연구는 "건강한 성인 자원자를 대상으로 한 UB-612 백신의 안전성, 내약성 및 면역원성을 평가하기 위한 1상, 공개 라벨 연구"라는 제목으로, 2020년 9월 대만에서 시작되었다. 이 시험에는 1일차와 29일차 시점에 제공된 UB-612(10, 30 또는 100μg)의 3가지 투여분량 그룹(그룹당 N=20)이 내포된다 (2회 투여분량 요법). 일차 종점은 백신접종-후 7일 이내에 이상반응 발생이고; 이차 종점에는 6-개월 추적-관찰 기간 동안의 이상반응, 표준 실험실 안전 조치, 항원-특이적 항체 역가, 혈청전환율, T 세포 반응 및 중화 항체 역가의 증가가 내포된다.
실시예 17
건강한 성인 자원자를 대상으로 한, 고-정밀 기획 백신의 안전성, 내약성 및 면역원성을 평가하기 위한, I 상 공개 레이블 연구
1. 목적
일차 목적은 건강한 성인 지원자들에게서 상기 기술된 높은 정확성 기획 백신의 안전성, 내약성 및 면역원성 평가다.
2. 방법론
상기 기술된 고-정밀 기획 백신의 낮은-투여분량 및 높은-투여분량을 사용하여, 0일 및 4주차 시점에 오픈-라벨, 2-투여분량 근육내 투여.
3. 대상체 수
총 40명의 참가자.
a. 연구 부문, 중재, 일차 종점 이차 종점은 도 45에 기술되며, 도 46에는 포함 기준및 제외 기준에 대해 자세히 설명되어 있다.
b. 건강한 성인을 대상으로 한, SARS-CoV-2에 대항한 기획 백신의 안전성, 내약성 및 면역원성을 평가하기 위한 I 상 오픈-라벨 연구의 임상 설계는 다음과 같이 설명된다 (도 47).
c. 건강한 성인 지원자를 대상으로 한, SARS-CoV-2에 대항하는 기획 백신의 안전성, 내약성 및 면역원성을 평가하기 위한 I 상, 오픈-라벨 연구와 관련된 임상 활동이 자세히 설명되어 있다(도 48).
d. 4개 코호트로, 두 단계에서 건강한 성인 지원자들에서 SARS-CoV-2에 대항하는 기획 백신의 안전성, 내성, 그리고 면역원성을 평가하기 위한, I 상, 오픈-라벨 연구의 임상기획안을 도시한다 (도 49).
실시예 18
오래-작용하는 기획 단백질 약물 ACE2-ECD-sFc는 VERO 세포에서 SARS-COV-2 유도된 CPE의 억제를 위한 중화 분석에서 높은 항-바이러스 효과는 만들었다.
코로나바이러스 SARS-CoV-1(2003) 및 SARS-CoV-2(2019)는 바이러스 외피-고정된 스파이크 (S) 단백질이 수용체 안지오텐신-전환 효소 2(ACE2)에 결합을 통하여 숙주 세포로 진입한다. S 단백질의 다른 독특한 특징 중에서, SARS-CoV-2는 SARS-CoV-1에 비해 더 높은 친화력으로 ACE2에 결합하고 (최대 20-배), 이것은 SARS-CoV-2에서 관찰된 새로운 감염의 인간-대-인간으로의 신속한 전염에 해당한다. ACE2가 SARS-CoV-2의 확산에 중요한 역할을 하기 때문에, 공작된 가용성 ACE2-유사 단백질은 잠재적으로 바이러스 침입을 차단하는 효과적인 공격자로 작동할 수 있고, 이로써 치료 목적을 달성함과 동시에 막-결합된 ACE2의 정상적인 생리 기능이 더 이상 감소되고, 손상되지 않도록 보호하게 된다.
특허된 기술 플랫폼을 사용하여, 독특한 ACE 수용체-기반, GMP 등급의 오래-지속되는 융합 단백질 제품은 증상이 있는 환자와 무증상 환자 모두에게서 COVID-19 치료에 사용할 수 있다. 상기 기술 플렛폼은 단일 쇄 면역글로불린 Fc 단편 (sFc)에 연계된 ACE2의 세포외 도메인 (ACE2-ECD)의 플라스미드 구축, CHO-S 세포주에서 ACE2-sFc 융합 단백질의 발현 및 생산, 그리고 이들 단백질 종의 정제 및 생물학적 특성화를 통합한다. ACE2-sFc 제품은 전-임상 시험 중이며, 임상 진단 및 PCR 확인 시 경증-내지-중증 SARS-CoV-2 감염이 확인된 환자들을 대상으로 병행 가속화된 임상-I상 안전성 연구를 계획하고 있다.
다양한 시험관 내 생물학적 검정이 수행되어, 상기 융합 단백질 ACE2-sFc가 기능적으로 활성임을 입증했다. 이러한 분석에는 SPR-기반 결합 친화도 분석, SARS-CoV-2 스파이크 (S) 단백질에 의한 분자 및 세포 인지, ACE2-sFc에 의한 S 단백질-ACE 상호작용의 중화가 내포된다. SARS-CoV-2 감염의 개념-증명-억제가 세포 수준에서 확인되었다. ACE2-sFc는 단독으로, 또는 항-IL6R mAb와 공조적 조합으로, 또는 현재 승인된 렘데시비르(Remdesivir)와 공조적 조합으로, COVID-19 치료에 상당히 임상적으로 유용할 수 있다.
"단일 쇄 Fc 플랫폼"을 사용하여, 강력하고, 오래-작용하는 중화 단백질 제품 ACE2-ECD-sFc(서열 번호 237)를 생산했다. 수용체 결합 억제 속성으로 인해, ACE2-ECD-sFc 단백질은 만약 코로나바이러스가 돌연변이되면, 약물 내성이 거의 충족되지 않을 것으로 예상된다. 도 50에 나타낸 것과 같이, 이가(bivalent) Fc 융합 속성의 벌크 형태로 인하여, ACE-ECD-Fc는 단일 쇄 (ACE ECD-sFc 단백질)에 결합하는 것과 비교하였을 때, S1 단백질에 결합할 때, 더 빠른 출발 속도(약 10X)를 가지며, 이것으로 상기 Fc 단백질은 단일 쇄(sFc) 융합 단백질과 비교할 때, 결합 친화도가 10X 더 낮음을 나타낸다. 도 51에 나타낸 것과 같이, 세 가지 유형의 ACE-ECD 융합 단백질 (ACE2 ECD-sFc, ACE2 ECD-Fc 및 ACE2 ECD-sFc)은 모두 ELISA 플레이트에 피복된 ACE-2에 S1의 결합을 차단시키는 상당한 능력을 가지고 있다. ACE2-ECD-sFc는 다른 두 유형에 비해, 차단 억제율 %이 더 높다. 이 결과는 두 개의 별개 실험실(북경의 KeXin Lab 및 타이페이의 Sinica Lab)에서 테스트했을 때, Vero 세포에 대한 바이러스 유도 세포변성 효과 (CPE)의 상대적 억제를 나타내고(표 36에 나타냄), 여기에서 분석에서 2.4mg/mL의 ACE2-ECD-sFc에 의해 8,192의 등가 역가를 얻었고, 영장류 공격 연구에서 완전한 보호를 얻을 수 있다는 관찰을 기반으로, SARS-CoV-2 감염에 의한 급성 공격에 직면한 환자에게 매우 효과적인 치료법을 제공할 것이며, 혈청 역가 중화 항체는 약 50 범위이다. 이러한 오래-작용하는 단백질 약물의 안전성과 효능을 관찰하기 위해, 경증-내지-중증의 COVID-19 환자를 대상으로 I/II상 시험을 실시할 예정이다.
표 1
SARS-CoV-2, SARS-CoV, 그리고 MERS-CoV의 막 당단백질 M의 아미노산 서열들
Figure pct00010
표 2
SARS-CoV-2, SARS-CoV, 그리고 MERS-CoV의 뉴클레오켑시드 인단백질 N의 아미노산 서열들
Figure pct00011
표 3
SARS-CoV-2, SARS, 그리고 MERS의 표면 당단백질 S의 아미노산 서열들
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
* 펩티드는 밑줄 친 시스테인과 시스테인 이황화 결합에 의해 고리화된다. SARS-CoV-2 단편들의 아미노산을 대체하는 시스테인/세린은 기울임꼴로 표시된다.
표 4
백신 기획에 사용을 위한 SARS-CoV-2 CTL 에피토프(기존 SARS-CoV 연구를 통한 PBMC 결합 및 자극 분석으로 검증됨)
Figure pct00015
표 5
백신 기획에 사용을 위한 SARS-CoV-2 Th 에피토프(기존 SARS-CoV 연구를 통한 PBMC 결합 및 자극 분석으로 검증됨)
Figure pct00016
표 6
SARS-CoV-2 펩티드 면역원 구조체들 기획에 시용을 위한 이상적인 인공 Th 에피토프를 비롯한, 병원체 단백질 유래된 Th 에피토프의 아미노산 서열들
Figure pct00017
Figure pct00018
표 7
선택적 이질성 스페이서, CpG 올리고뉴클레오티드, 그리고 RT-PCR 프라이머/프로브의 예시
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
표 9
IgG1, IgG2, IgG3, 그리고 IgG4의 야생형 힌지 영역 및 돌연변이된 힌지 영역
Figure pct00023
표 10
IgG1로부터 유래된 돌연변이된 힌지 영역의 아미노산 서열의 예시
Figure pct00024
표 11
sFC 및 Fc 융합 단백질들의 아미노산 서열들
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
표 12
sFC 및 Fc 융합 단백질들의 핵산 서열들
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
표 14
S-RBD-sFc의 N-연계된 글리칸 구조
Figure pct00039
표 15
S-RBD-sFc의 O-연계된 글리칸 구조
Figure pct00040
표 16
ACE2-ECD-sFc의 N-연계된 글리칸 구조
Figure pct00041
표 17
ACE2-ECD-sFc의 O-연계된 글리칸 구조
Figure pct00042
표 18
UBI SARS-CoV-2 ELISA의 특이성 평가
수행 특징: 다른 바이러스 감염에 대한 교차-반응성 결여
Figure pct00043
표 19
US, 대만 및 중국에서 "Non-COVID-19" 개체들로부터 수집된 데이터에 기반한 특이성 평가
Figure pct00044
Figure pct00045
표 20
UBI SARS-CoV-2 ELISA에 의해 항-SARS-CoV-2 IgG 검출의 민감도 평가
Figure pct00046
수행 특징: PCR-확인된 COVID-19 입원한 환자들에서 민감도:
상대적 민감도 (증상 발병-후 <10일) = 0/10 = 0%
상대적 민감도 (증상 발병-후 >10일) = 23/23 = 100%
상대적 민감도 (병원 퇴원 당일) = 5/5 = 100%
전반적인 민감도 (All 46 샘플) = 36/46 = 78.2%
양성 예측 값의 정확도 (증상 발병-후 >10일인 자들의 경우) = 36/36 = 100%
표 21
연구 1: 수행 특징: 증상 발병-후 10일차 시점에서 채취한 COVID-19 샘플의 민감도 및 특이성
Figure pct00047
상대적 민감도 (증상 발병후 >10일): 100%
증상 발병시점의 자들(46명의 상이한 개체들로부터)이 내포된 전반적인 민감도: 78.2%
상대적 특이성: 100%
병원에 등록된 환자 및 증상 발병-후 10일차 시점의 양성 예측값 정확도 = 36/(36+0) = 100%
음성 예측 값의 정확도 = 922/(0+922) = 100%
표 22
연구 2: 대만의 COVID-19 환자들로부터 취한 혈청/혈장 샘플로부터 UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 이용한 항-SARS-CoV-2 IgG 검출
Figure pct00048
Figure pct00049
표 23
연구 2: UBI® SARS-CoV-2 ELISA를 이용한 민감도 평가
Figure pct00050
수행 특징: PCR-확진된 COVID-19 입원한 환자들에서 민감도:
상대적 민감도 (증상 발병-후 <7일) = 1/4 = 25%
상대적 민감도 (증상 발병-후 7-14 일) = 7/11 = 63.6%
상대적 민감도 (증상 발병-후 >14 일) = 22/22 = 100%
전반적인 민감도 (37개 샘플 모두) = 30/37 = 81.1%
양성 예측 값에 대한 정확도 (증상 발병-후 >14 일) = 22/ 22 = 100%
표 24
증상 발병-후 일차에 의한 양성 일치
Figure pct00051
표 25
음성 백분율 일치
Figure pct00052
표 26
독립적 평가의 결과 요약
Figure pct00053
표 27
독립적 평가의 통계 요약
Figure pct00054
표 28
기니아 피그에게 RBD-sFc 기획 단백질들의 면역화 일정
Figure pct00055
표 29
CPE 분석에 의해 평가된 면역 혈청내 중화 항체들의 역가
Figure pct00056
*CPE 분석은 북경 Kexin 연구소와 대만 Sinica 연구소에서 독립적으로 수행됨
표 30
S-RBD-sFc (pH 5.7 ~ 7.0)의 크기 배제 크로마토그래피, 37 ℃에서 24 시간 동안
Figure pct00057
Figure pct00058
표 31
S1-RBD-sFc의 pH 선택 및 부형제 선별 요약
Figure pct00059
Figure pct00060
표 33
UB-612 20μg/mL의 조성물
Figure pct00061
1 임상 2상, 임상 2/3상 재료는 cGMP로 제조될 것이다.
표 34
UB-612 60μg/mL의 조성물
Figure pct00062
1 임상 2상, 임상 2/3상 재료는 cGMP로 제조될 것이다.
표 35
UB-612 200μg/mL의 조성물
Figure pct00063
1 임상 2상, 임상 2/3상 재료는 cGMP로 제조될 것이다.
표 36
CPE 분석에 의해 정제된 ACE2-ECD-sFc에서 중화 항체들의 역가에 동등
Figure pct00064
SEQUENCE LISTING <110> UBI IP Holdings UBI US Holdings, LLC Wang, Chang Yi Lin, Feng Ding, Shuang Peng, Wen-Jiun <120> DESIGNER PEPTIDES AND PROTEINS FOR THE DETECTION, PREVENTION AND TREATMENT OF CORONAVIRUS DISEASE, 2019 (COVID-19) <130> 1004263.226WO2 (2044-WO) <140> TBD <141> 2021-02-19 <150> US 62/978,596 <151> 2020-02-19 <150> US 62/990,382 <151> 2020-03-16 <150> US 63/027,290 <151> 2020-05-19 <150> US 63/118,596 <151> 2020-11-25 <160> 370 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(222) <223> SARS-CoV-2 membrane glycoprotein (M) <400> 1 Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile 20 25 30 Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile 35 40 45 Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys 50 55 60 Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile 65 70 75 80 Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe 85 90 95 Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe 100 105 110 Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile 115 120 125 Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile 130 135 140 Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp 145 150 155 160 Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu 165 170 175 Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly 180 185 190 Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr 195 200 205 Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln 210 215 220 <210> 2 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(221) <223> SARS-CoV membrane glycoprotein M <400> 2 Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu 1 5 10 15 Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp Ile Met 20 25 30 Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile 35 40 45 Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe 50 55 60 Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala 65 70 75 80 Ile Ala Met Ala Cys Ile Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Val 85 90 95 Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe Asn 100 105 110 Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu Arg Gly Thr Ile Val 115 120 125 Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Ile 130 135 140 Arg Gly His Leu Arg Met Ala Gly His Ser Leu Gly Arg Cys Asp Ile 145 150 155 160 Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser 165 170 175 Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Gly Thr Asp Ser Gly Phe 180 185 190 Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr Asp 195 200 205 His Ala Gly Ser Asn Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln 210 215 220 <210> 3 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Middle East respiratory syndrome-related coronavirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(219) <223> MERS-CoV M protein <400> 3 Met Ser Asn Met Thr Gln Leu Thr Glu Ala Gln Ile Ile Ala Ile Ile 1 5 10 15 Lys Asp Trp Asn Phe Ala Trp Ser Leu Ile Phe Leu Leu Ile Thr Ile 20 25 30 Val Leu Gln Tyr Gly Tyr Pro Ser Arg Ser Met Thr Val Tyr Val Phe 35 40 45 Lys Met Phe Val Leu Trp Leu Leu Trp Pro Ser Ser Met Ala Leu Ser 50 55 60 Ile Phe Ser Ala Ile Tyr Pro Ile Asp Leu Ala Ser Gln Ile Ile Ser 65 70 75 80 Gly Ile Val Ala Ala Val Ser Ala Met Met Trp Ile Ser Tyr Phe Val 85 90 95 Gln Ser Ile Arg Leu Phe Met Arg Thr Gly Ser Trp Trp Ser Phe Asn 100 105 110 Pro Glu Thr Asn Cys Leu Leu Asn Val Pro Phe Gly Gly Thr Thr Val 115 120 125 Val Arg Pro Leu Val Glu Asp Ser Thr Ser Val Thr Ala Val Val Thr 130 135 140 Asn Gly His Leu Lys Met Ala Gly Met His Phe Gly Ala Cys Asp Tyr 145 150 155 160 Asp Arg Leu Pro Asn Glu Val Thr Val Ala Lys Pro Asn Val Leu Ile 165 170 175 Ala Leu Lys Met Val Lys Arg Gln Ser Tyr Gly Thr Asn Ser Gly Val 180 185 190 Ala Ile Tyr His Arg Tyr Lys Ala Gly Asn Tyr Arg Ser Pro Pro Ile 195 200 205 Thr Ala Asp Ile Glu Leu Ala Leu Leu Arg Ala 210 215 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> 2019-nCoV membrane glycoprotein (M) 1-23 <400> 4 Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val 20 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> KKK-SARS-CoV-2 membrane glycoprotein (M) 1-23 <400> 5 Lys Lys Lys Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu 1 5 10 15 Lys Lys Leu Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val 20 25 <210> 6 <211> 419 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(419) <223> SARS-CoV-2 nucleocapsid phosphoprotein (N) <400> 6 Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr 1 5 10 15 Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg 20 25 30 Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn 35 40 45 Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu 50 55 60 Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro 65 70 75 80 Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly 85 90 95 Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp 115 120 125 Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp 130 135 140 His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln 145 150 155 160 Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser 165 170 175 Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn 180 185 190 Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala 195 200 205 Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu 210 215 220 Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln 225 230 235 240 Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys 245 250 255 Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln 260 265 270 Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp 275 280 285 Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile 290 295 300 Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile 305 310 315 320 Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala 325 330 335 Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu 340 345 350 Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro 355 360 365 Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu 385 390 395 400 Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser 405 410 415 Thr Gln Ala <210> 7 <211> 422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(422) <223> SARS-CoV nucleocapsid protein (N) <400> 7 Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile 1 5 10 15 Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly 20 25 30 Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn 35 40 45 Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu 50 55 60 Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly 65 70 75 80 Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg 85 90 95 Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr 100 105 110 Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys 115 120 125 Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys 130 135 140 Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu 145 150 155 160 Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly 165 170 175 Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg 180 185 190 Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro 195 200 205 Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 210 215 220 Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln 225 230 235 240 Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser 245 250 255 Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr 260 265 270 Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly 275 280 285 Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln 290 295 300 Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg 305 310 315 320 Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly 325 330 335 Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile 340 345 350 Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu 355 360 365 Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro 370 375 380 Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp 385 390 395 400 Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser 405 410 415 Ala Asp Ser Thr Gln Ala 420 <210> 8 <211> 413 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Middle East respiratory syndrome-related coronavirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(413) <223> MERS-CoV N protein <400> 8 Met Ala Ser Pro Ala Ala Pro Arg Ala Val Ser Phe Ala Asp Asn Asn 1 5 10 15 Asp Ile Thr Asn Thr Asn Leu Ser Arg Gly Arg Gly Arg Asn Pro Lys 20 25 30 Pro Arg Ala Ala Pro Asn Asn Thr Val Ser Trp Tyr Thr Gly Leu Thr 35 40 45 Gln His Gly Lys Val Pro Leu Thr Phe Pro Pro Gly Gln Gly Val Pro 50 55 60 Leu Asn Ala Asn Ser Thr Pro Ala Gln Asn Ala Gly Tyr Trp Arg Arg 65 70 75 80 Gln Asp Arg Lys Ile Asn Thr Gly Asn Gly Ile Lys Gln Leu Ala Pro 85 90 95 Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ala Leu Pro 100 105 110 Phe Arg Ala Val Lys Asp Gly Ile Val Trp Val His Glu Asp Gly Ala 115 120 125 Thr Asp Ala Pro Ser Thr Phe Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asp Ser 130 135 140 Ala Ile Val Thr Gln Phe Ala Pro Gly Thr Lys Leu Pro Lys Asn Phe 145 150 155 160 His Ile Glu Gly Thr Gly Gly Asn Ser Gln Ser Ser Ser Arg Ala Ser 165 170 175 Ser Val Ser Arg Asn Ser Ser Arg Ser Ser Ser Gln Gly Ser Arg Ser 180 185 190 Gly Asn Ser Thr Arg Gly Thr Ser Pro Gly Pro Ser Gly Ile Gly Ala 195 200 205 Val Gly Gly Asp Leu Leu Tyr Leu Asp Leu Leu Asn Arg Leu Gln Ala 210 215 220 Leu Glu Ser Gly Lys Val Lys Gln Ser Gln Pro Lys Val Ile Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Ala Ala Ala Ala Lys Asn Lys Met Arg His Lys Arg Thr Ser 245 250 255 Thr Lys Ser Phe Asn Met Val Gln Ala Phe Gly Leu Arg Gly Pro Gly 260 265 270 Asp Leu Gln Gly Asn Phe Gly Asp Leu Gln Leu Asn Lys Leu Gly Thr 275 280 285 Glu Asp Pro Arg Trp Pro Gln Ile Ala Glu Leu Ala Pro Thr Ala Ser 290 295 300 Ala Phe Met Gly Met Ser Gln Phe Lys Leu Thr His Gln Asn Asn Asp 305 310 315 320 Asp His Gly Asn Pro Val Tyr Phe Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Ile Lys 325 330 335 Leu Asp Pro Lys Asn Pro Asn Tyr Asn Lys Trp Leu Glu Leu Leu Glu 340 345 350 Gln Asn Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Lys Lys Glu Lys Lys Gln 355 360 365 Lys Ala Pro Lys Glu Glu Ser Thr Asp Gln Met Ser Glu Pro Pro Lys 370 375 380 Glu Gln Arg Val Gln Gly Ser Ile Thr Gln Arg Thr Arg Thr Arg Pro 385 390 395 400 Ser Val Gln Pro Gly Pro Met Ile Asp Val Asn Thr Asp 405 410 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 N protein CTL epitope 138-146 <400> 9 Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 N protein CTL epitope 159-167 <400> 10 Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 N protein CTL epitope 219-227 <400> 11 Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 N protein CTL epitope 222-230 <400> 12 Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu 1 5 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> SARS-CoV-2 N protein Th epitope 305-319 <400> 13 Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg 1 5 10 15 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 N protein CTL epitope 316-324 <400> 14 Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val 1 5 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> SARS-CoV-2 N protein CTL epitope 322-331 <400> 15 Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 N protein CTL epitope 351-359 <400> 16 Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala 1 5 <210> 17 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(65) <223> SARS-CoV-2 nucleocapsid phosphoprotein (N) 355-419 <400> 17 Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys 1 5 10 15 Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln 20 25 30 Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp 35 40 45 Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln 50 55 60 Ala 65 <210> 18 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(68) <223> KKK-SARS-CoV-2 nucleocapsid phosphoprotein (N) 355-419 <400> 18 Lys Lys Lys Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu 1 5 10 15 Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro 20 25 30 Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp 35 40 45 Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp 50 55 60 Ser Thr Gln Ala 65 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 N protein CTL epitope 361-369 <400> 19 Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys 1 5 <210> 20 <211> 1273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1273) <223> SARS-CoV-2 surface glycoprotein (S) <400> 20 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn 1010 1015 1020 Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys 1025 1030 1035 Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro 1040 1045 1050 Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val 1055 1060 1065 Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His 1070 1075 1080 Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn 1085 1090 1095 Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln 1100 1105 1110 Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val 1115 1120 1125 Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro 1130 1135 1140 Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn 1145 1150 1155 His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn 1160 1165 1170 Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu 1175 1180 1185 Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu 1190 1195 1200 Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu 1205 1210 1215 Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met 1220 1225 1230 Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro 1250 1255 1260 Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 21 <211> 1255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1255) <223> SARS-CoV spike glycoprotein (S) <400> 21 Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu 1 5 10 15 Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln 20 25 30 His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg 35 40 45 Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser 50 55 60 Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val 65 70 75 80 Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn 85 90 95 Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln 100 105 110 Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys 115 120 125 Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met 130 135 140 Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr 145 150 155 160 Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser 165 170 175 Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly 180 185 190 Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp 195 200 205 Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu 210 215 220 Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro 225 230 235 240 Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr 245 250 255 Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile 260 265 270 Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys 275 280 285 Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn 290 295 300 Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr 305 310 315 320 Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser 325 330 335 Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr 340 345 350 Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly 355 360 365 Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala 370 375 380 Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly 385 390 395 400 Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe 405 410 415 Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser 420 425 430 Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu 435 440 445 Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly 450 455 460 Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp 465 470 475 480 Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 485 490 495 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 500 505 510 Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn 515 520 525 Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg 530 535 540 Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp 545 550 555 560 Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys 565 570 575 Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser 580 585 590 Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr 595 600 605 Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr 610 615 620 Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu 625 630 635 640 His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile 645 650 655 Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys 660 665 670 Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala 675 680 685 Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile 690 695 700 Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys 705 710 715 720 Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu 725 730 735 Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile 740 745 750 Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys 755 760 765 Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe 770 775 780 Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile 785 790 795 800 Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met 805 810 815 Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile 820 825 830 Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr 835 840 845 Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala 850 855 860 Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe 865 870 875 880 Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn 885 890 895 Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala 900 905 910 Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly 915 920 925 Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu 930 935 940 Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn 945 950 955 960 Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp 965 970 975 Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln 980 985 990 Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala 995 1000 1005 Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp 1010 1015 1020 Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala 1025 1030 1035 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln 1040 1045 1050 Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys 1055 1060 1065 Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser 1070 1075 1080 Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr 1085 1090 1095 Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly 1100 1105 1110 Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp 1115 1120 1125 Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser 1130 1135 1140 Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val 1145 1150 1155 Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys 1160 1165 1170 Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr 1175 1180 1185 Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile 1190 1195 1200 Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys 1205 1210 1215 Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys Gly 1220 1225 1230 Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys 1235 1240 1245 Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1250 1255 <210> 22 <211> 1353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Middle East respiratory syndrome-related coronavirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1353) <223> MERS-CoV S Protein <400> 22 Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys Ile Glu 20 25 30 Val Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg Pro Ile 35 40 45 Asp Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg Thr Tyr 50 55 60 Ser Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln Gly Asp 65 70 75 80 His Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly Thr Thr 85 90 95 Pro Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys Gln Phe 100 105 110 Ala Asn Gly Phe Val Val Arg Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ser Thr Gly 115 120 125 Thr Val Ile Ile Ser Pro Ser Thr Ser Ala Thr Ile Arg Lys Ile Tyr 130 135 140 Pro Ala Phe Met Leu Gly Ser Ser Val Gly Asn Phe Ser Asp Gly Lys 145 150 155 160 Met Gly Arg Phe Phe Asn His Thr Leu Val Leu Leu Pro Asp Gly Cys 165 170 175 Gly Thr Leu Leu Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Leu Glu Pro Arg Ser Gly 180 185 190 Asn His Cys Pro Ala Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Phe Ala Thr Tyr His 195 200 205 Thr Pro Ala Thr Asp Cys Ser Asp Gly Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Ser 210 215 220 Leu Asn Ser Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Arg Asn Cys Thr Phe Met 225 230 235 240 Tyr Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asp Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Ile 245 250 255 Thr Gln Thr Ala Gln Gly Val His Leu Phe Ser Ser Arg Tyr Val Asp 260 265 270 Leu Tyr Gly Gly Asn Met Phe Gln Phe Ala Thr Leu Pro Val Tyr Asp 275 280 285 Thr Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln 290 295 300 Ser Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro 305 310 315 320 Leu Thr Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Ala 325 330 335 Ile Asp Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser Tyr Glu 340 345 350 Ser Phe Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala 355 360 365 Lys Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp 370 375 380 Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys 385 390 395 400 Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser 405 410 415 Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala 420 425 430 Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr 435 440 445 Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile 450 455 460 Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile 465 470 475 480 Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys 485 490 495 Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr 500 505 510 Glu Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser 515 520 525 Ile Val Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln 530 535 540 Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr 545 550 555 560 Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn 580 585 590 Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr Ser Leu 595 600 605 Tyr Gly Val Ser Gly Arg Gly Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala Val Gly 610 615 620 Val Arg Gln Gln Arg Phe Val Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Val Gly 625 630 635 640 Tyr Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Arg Ala Cys Val Ser 645 650 655 Val Pro Val Ser Val Ile Tyr Asp Lys Glu Thr Lys Thr His Ala Thr 660 665 670 Leu Phe Gly Ser Val Ala Cys Glu His Ile Ser Ser Thr Met Ser Gln 675 680 685 Tyr Ser Arg Ser Thr Arg Ser Met Leu Lys Arg Arg Asp Ser Thr Tyr 690 695 700 Gly Pro Leu Gln Thr Pro Val Gly Cys Val Leu Gly Leu Val Asn Ser 705 710 715 720 Ser Leu Phe Val Glu Asp Cys Lys Leu Pro Leu Gly Gln Ser Leu Cys 725 730 735 Ala Leu Pro Asp Thr Pro Ser Thr Leu Thr Pro Arg Ser Val Arg Ser 740 745 750 Val Pro Gly Glu Met Arg Leu Ala Ser Ile Ala Phe Asn His Pro Ile 755 760 765 Gln Val Asp Gln Leu Asn Ser Ser Tyr Phe Lys Leu Ser Ile Pro Thr 770 775 780 Asn Phe Ser Phe Gly Val Thr Gln Glu Tyr Ile Gln Thr Thr Ile Gln 785 790 795 800 Lys Val Thr Val Asp Cys Lys Gln Tyr Val Cys Asn Gly Phe Gln Lys 805 810 815 Cys Glu Gln Leu Leu Arg Glu Tyr Gly Gln Phe Cys Ser Lys Ile Asn 820 825 830 Gln Ala Leu His Gly Ala Asn Leu Arg Gln Asp Asp Ser Val Arg Asn 835 840 845 Leu Phe Ala Ser Val Lys Ser Ser Gln Ser Ser Pro Ile Ile Pro Gly 850 855 860 Phe Gly Gly Asp Phe Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Val Ser Ile Ser 865 870 875 880 Thr Gly Ser Arg Ser Ala Arg Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asp 885 890 895 Lys Val Thr Ile Ala Asp Pro Gly Tyr Met Gln Gly Tyr Asp Asp Cys 900 905 910 Met Gln Gln Gly Pro Ala Ser Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Tyr 915 920 925 Val Ala Gly Tyr Lys Val Leu Pro Pro Leu Met Asp Val Asn Met Glu 930 935 940 Ala Ala Tyr Thr Ser Ser Leu Leu Gly Ser Ile Ala Gly Val Gly Trp 945 950 955 960 Thr Ala Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ile Pro Phe Ala Gln Ser Ile 965 970 975 Phe Tyr Arg Leu Asn Gly Val Gly Ile Thr Gln Gln Val Leu Ser Glu 980 985 990 Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Lys Phe Asn Gln Ala Leu Gly Ala Met 995 1000 1005 Gln Thr Gly Phe Thr Thr Thr Asn Glu Ala Phe His Lys Val Gln 1010 1015 1020 Asp Ala Val Asn Asn Asn Ala Gln Ala Leu Ser Lys Leu Ala Ser 1025 1030 1035 Glu Leu Ser Asn Thr Phe Gly Ala Ile Ser Ala Ser Ile Gly Asp 1040 1045 1050 Ile Ile Gln Arg Leu Asp Val Leu Glu Gln Asp Ala Gln Ile Asp 1055 1060 1065 Arg Leu Ile Asn Gly Arg Leu Thr Thr Leu Asn Ala Phe Val Ala 1070 1075 1080 Gln Gln Leu Val Arg Ser Glu Ser Ala Ala Leu Ser Ala Gln Leu 1085 1090 1095 Ala Lys Asp Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ala Gln Ser Lys Arg 1100 1105 1110 Ser Gly Phe Cys Gly Gln Gly Thr His Ile Val Ser Phe Val Val 1115 1120 1125 Asn Ala Pro Asn Gly Leu Tyr Phe Met His Val Gly Tyr Tyr Pro 1130 1135 1140 Ser Asn His Ile Glu Val Val Ser Ala Tyr Gly Leu Cys Asp Ala 1145 1150 1155 Ala Asn Pro Thr Asn Cys Ile Ala Pro Val Asn Gly Tyr Phe Ile 1160 1165 1170 Lys Thr Asn Asn Thr Arg Ile Val Asp Glu Trp Ser Tyr Thr Gly 1175 1180 1185 Ser Ser Phe Tyr Ala Pro Glu Pro Ile Thr Ser Leu Asn Thr Lys 1190 1195 1200 Tyr Val Ala Pro Gln Val Thr Tyr Gln Asn Ile Ser Thr Asn Leu 1205 1210 1215 Pro Pro Pro Leu Leu Gly Asn Ser Thr Gly Ile Asp Phe Gln Asp 1220 1225 1230 Glu Leu Asp Glu Phe Phe Lys Asn Val Ser Thr Ser Ile Pro Asn 1235 1240 1245 Phe Gly Ser Leu Thr Gln Ile Asn Thr Thr Leu Leu Asp Leu Thr 1250 1255 1260 Tyr Glu Met Leu Ser Leu Gln Gln Val Val Lys Ala Leu Asn Glu 1265 1270 1275 Ser Tyr Ile Asp Leu Lys Glu Leu Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Asn 1280 1285 1290 Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Val 1295 1300 1305 Ala Leu Ala Leu Cys Val Phe Phe Ile Leu Cys Cys Thr Gly Cys 1310 1315 1320 Gly Thr Asn Cys Met Gly Lys Leu Lys Cys Asn Arg Cys Cys Asp 1325 1330 1335 Arg Tyr Glu Glu Tyr Asp Leu Glu Pro His Lys Val His Val His 1340 1345 1350 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> SARS-CoV-2 S443-448 <400> 23 Ser Lys Val Gly Gly Asn 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> SARS-CoV-2 S443-448_mod (S443 to C443, N448 to C448) <400> 24 Cys Lys Val Gly Gly Cys 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> SARS-CoV S430-435 <400> 25 Ala Thr Ser Thr Gly Asn 1 5 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(30) <223> SARS-CoV-2 S480-509 <400> 26 Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg 20 25 30 <210> 27 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(33) <223> KKK-SARS-CoV-2 S480-509 <400> 27 Lys Lys Lys Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu 1 5 10 15 Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr 20 25 30 Arg <210> 28 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(29) <223> SARS S468-495 <400> 28 Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly 1 5 10 15 Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg 20 25 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> SARS-CoV-2 S480-490 <400> 29 Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 1 5 10 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 S480-488 <400> 30 Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys 1 5 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> SARS-CoV-2 S496-508 <400> 31 Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> SITE <222> (1)..(13) <223> SARS-CoV-2 S496-508_mod (G496 to C496, Y508 to C508) <400> 32 Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Cys 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> SARS-CoV-2 S496-505 <400> 33 Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> 2019-nCoV S496-505_mod (G496 to C496, Y505 to C505) <400> 34 Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> SARS-CoV-2 S protein CTL epitope 504-515 <400> 35 Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe 1 5 10 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> SARS-CoV-2 S protein CTL epitope 539-546 <400> 36 Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu 1 5 <210> 37 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(55) <223> SARS-CoV-2 surface glycoprotein (S) 785-839 <400> 37 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 1 5 10 15 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 20 25 30 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 35 40 45 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp 50 55 <210> 38 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(58) <223> KKK-SARS-CoV-2 surface glycoprotein (S) 785-839 <400> 38 Lys Lys Lys Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe 1 5 10 15 Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser 20 25 30 Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala 35 40 45 Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp 50 55 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> SARS-CoV-2 S protein Th epitope 891-906 <400> 39 Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe 1 5 10 15 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> SARS-CoV-2 S protein Th epitope 902-917 <400> 40 Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> SARS-CoV-2 S protein Th epitope 957-973 <400> 41 Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala 1 5 10 15 Ile <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 S protein CTL epitope 976-984 <400> 42 Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 S protein CTL epitope 996-1004 <400> 43 Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu 1 5 <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> SARS-CoV-2 S protein Th epitope 1011-1028 <400> 44 Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala 1 5 10 15 Thr Lys <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 S protein CTL epitope 1060-1068 <400> 45 Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 S protein CTL epitope 1185-1193 <400> 46 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 S protein CTL epitope 1192-1200 <400> 47 Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 S protein CTL epitope 1220-1228 <400> 48 Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val 1 5 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <400> 49 Asp Leu Ser Asp Leu Lys Gly Leu Leu Leu His Lys Leu Asp Gly Leu 1 5 10 15 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <400> 50 Glu Ile Ser Asp Glu Ile Arg Leu Ile Ile Ile Lys Arg Ile Glu Ile 1 5 10 15 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <400> 51 Asp Val Ser Asp Val Lys Gly Val Val Val His Lys Val Asp Gly Val 1 5 10 15 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <400> 52 Asp Phe Ser Asp Phe Lys Gly Phe Phe Phe His Lys Phe Asp Gly Phe 1 5 10 15 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> MvF Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> D or E <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> D or E <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> D or E <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> L or I or V or F <400> 53 Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF1 Th <400> 54 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF 2 Th <400> 55 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile 1 5 10 15 <210> 56 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF3 Th <400> 56 Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 57 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 3Th <400> 57 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 58 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF3 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> G or T <400> 58 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF3 Th <400> 59 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys 1 5 10 15 Ile Glu Gly Ile Leu Phe 20 <210> 60 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF3 Th <400> 60 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg 1 5 10 15 Ile Glu Thr Ile Leu Phe 20 <210> 61 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF 3 Th <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> G or T <400> 61 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe 20 <210> 62 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF4 Th <400> 62 Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 63 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF4 Th <400> 63 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 64 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <400> 64 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 65 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 65 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 66 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF5 Th (UBITh1a) <400> 66 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg 1 5 10 15 Ile Glu Thr Ile Leu Phe 20 <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 67 Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Gln Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 68 Arg Arg Arg Ile Lys Ile Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Pro Leu Ser 1 5 10 15 Ile Arg <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 69 Lys Lys Lys Val Arg Val Val Thr Lys Val Val Thr Val Pro Ile Ser 1 5 10 15 Val Asp <210> 70 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 70 Lys Lys Lys Phe Phe Phe Phe Thr Lys Phe Phe Thr Phe Pro Val Ser 1 5 10 15 Phe Asp <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg1 Th <400> 71 Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Phe Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 72 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> D or R <400> 72 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 73 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg2 Th <400> 73 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Pro Gln Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 74 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg2 Th <400> 74 Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp <210> 75 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I <400> 75 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Asp <210> 76 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 3 Th <400> 76 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> HBsAg4 Th (UBITh4) <400> 77 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp 1 5 10 15 <210> 78 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> KKK-HBsAg Th <400> 78 Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 79 <211> 14 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> HBsAg Th <400> 79 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 1 5 10 <210> 80 <211> 24 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Bordetella pertussis Th <400> 80 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 20 <210> 81 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cholera Toxin <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <400> 81 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser 20 25 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Clostridium tetani TT1 Th <400> 82 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 1 Th <400> 83 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu <210> 84 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Clostridium tetani TT2 Th <400> 84 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT3 Th <400> 85 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 <210> 86 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT4 Th <400> 86 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys 1 5 10 15 <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 2 Th <400> 87 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr <210> 88 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Diphtheria bacilli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Diphtheria Th <400> 88 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys 20 <210> 89 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> EBV BHRF1 Th <400> 89 Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 90 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> EBV EBNA-1 Th <400> 90 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr His Ile 20 <210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> EBV CP Th <400> 91 Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> EBV GP340 Th <400> 92 Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 93 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> EBV BPLF1 Th <400> 93 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln 1 5 10 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> EBV EBNA-2 Th <400> 94 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu 1 5 10 <210> 95 <211> 14 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> HCMV IE1 Th <400> 95 Asp Lys Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His 1 5 10 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza Matrix protein 1_1 Th <400> 96 Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg 1 5 10 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Influenza Matrix protein 1_2 Th <400> 97 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val 1 5 10 15 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Influenza Non-structural protein 1 Th <400> 98 Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser 1 5 <210> 99 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Plasmodium falciparum Th <400> 99 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 100 <211> 17 <212> PRT <213> Schistosoma mansoni <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Schistosoma mansoni Th <400> 100 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His <210> 101 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> epsilon-K-KKK as a spacer <400> 101 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 102 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> KKK-epsilon-K as a spacer <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> epsilon-K <400> 102 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 103 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> Flexible Hinge Spacer <400> 103 Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro 1 5 <210> 104 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG1 oligonucleotide ODN <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> CpG1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <400> 104 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgttttgtcg tt 32 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG2 oligonucleotide ODN <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> CpG2 <400> 105 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 106 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG3 Oligonucleotide ODN <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> CpG3 <400> 106 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 107 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> SARS-CoV-2 S480-490 <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(15) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(34) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 107 Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Lys Lys Lys Lys Ile 1 5 10 15 Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile 20 25 30 Leu Phe <210> 108 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> SARS-CoV-2 S480-490 <400> 108 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys 20 25 30 Tyr Phe <210> 109 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(36) <223> SARS-CoV-2 S496-508_mod <400> 109 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly 20 25 30 Tyr Gln Pro Cys 35 <210> 110 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> SARS-CoV-2 S496-508_mod <220> <221> PEPTIDE <222> (14)..(17) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(36) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 110 Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Cys Lys Lys Lys 1 5 10 15 Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu 20 25 30 Thr Ile Leu Phe 35 <210> 111 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(33) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 111 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly 20 25 30 Cys <210> 112 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <220> <221> PEPTIDE <222> (11)..(14) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(33) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 112 Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser 1 5 10 15 Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu 20 25 30 Phe <210> 113 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(30) <223> SARS-CoV-2 S480-509 <220> <221> PEPTIDE <222> (31)..(34) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (34)..(34) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (35)..(53) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 113 Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile 35 40 45 Glu Thr Ile Leu Phe 50 <210> 114 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(53) <223> SARS-CoV-2 S480-509_mod <400> 114 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys 20 25 30 Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly 35 40 45 Tyr Gln Pro Tyr Arg 50 <210> 115 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(29) <223> SARS-CoV-2 S443-448_mod <400> 115 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Lys Val Gly Gly Cys 20 25 <210> 116 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> SARS-CoV-2 S443-448_mod <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(10) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (11)..(29) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 116 Cys Lys Val Gly Gly Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile 1 5 10 15 Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 20 25 <210> 117 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(21) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(31) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 117 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 30 <210> 118 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-Synuclein (G111-G132) <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(29) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 118 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 <210> 119 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Bordetella pertussis Th <220> <221> PEPTIDE <222> (25)..(28) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (25)..(25) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (29)..(38) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 119 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro 20 25 30 Thr Asn Gly Val Gly Cys 35 <210> 120 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(21) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(31) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 120 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 30 <210> 121 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Diphtheria Th <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(27) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (24)..(24) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (28)..(37) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 121 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr 20 25 30 Asn Gly Val Gly Cys 35 <210> 122 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Plasmodium falciparum Th <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(25) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(35) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 122 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Val Gly Cys 35 <210> 123 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Schistosoma mansoni Th <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(21) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(31) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 123 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 30 <210> 124 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(29) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (26)..(26) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (30)..(39) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 124 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln 20 25 30 Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 35 <210> 125 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(29) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 125 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 <210> 126 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF3 Th <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (23)..(23) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(26) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (27)..(36) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 126 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn 20 25 30 Gly Val Gly Cys 35 <210> 127 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> D or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(32) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 127 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 30 <210> 128 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(33) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 128 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly 20 25 30 Cys <210> 129 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(31) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 129 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Asp Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 30 <210> 130 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg3 Th (UBITh2) <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(32) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 130 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 30 <210> 131 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza MP1_1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(15) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(25) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 131 Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Lys Lys Lys Lys Cys 1 5 10 15 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 <210> 132 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Influenza MP1_2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(29) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 132 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 <210> 133 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Influenza NSP1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (10)..(13) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (14)..(23) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 133 Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln 1 5 10 15 Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 <210> 134 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> EBV BHRF1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(33) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 134 Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gly Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly 20 25 30 Cys <210> 135 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Clostridium tetani TT1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(29) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 135 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 <210> 136 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> EBV EBNA-1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(24) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (21)..(21) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (25)..(34) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 136 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr His Ile Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30 Gly Cys <210> 137 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Clostridium tetani TT2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (22)..(25) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (22)..(22) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (26)..(35) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 137 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Val Gly Cys 35 <210> 138 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT3 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(20) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(30) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 138 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 30 <210> 139 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT4 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (17)..(20) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(30) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 139 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 30 <210> 140 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> EBV CP Th <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(22) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(32) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 140 Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Lys Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 30 <210> 141 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> HCMV IE1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(18) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(28) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 141 Asp Lys Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 <210> 142 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> EBV GP340 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(19) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(29) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 142 Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 <210> 143 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> EBV BPLF1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (14)..(17) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (18)..(27) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 143 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln Lys Lys Lys 1 5 10 15 Lys Cys Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 <210> 144 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-Synuclein peptide immunogen construct <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> EBV EBNA-2 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(15) <223> epsilon-K-KKK spacer <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(25) <223> SARS-CoV-2 S496-505_mod <400> 144 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu Lys Lys Lys Lys Cys 1 5 10 15 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Cys 20 25 <210> 145 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> SARS-CoV-2 S protein CTL epitope 1060-1068 <400> 145 Lys Lys Lys Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val 1 5 10 <210> 146 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV S protein CTL epitope 976-984 <400> 146 Lys Lys Lys Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu 1 5 10 <210> 147 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV S protein CTL epitope 1185-1193 <400> 147 Lys Lys Lys Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu 1 5 10 <210> 148 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(11) <223> 2019-nCoV S protein CTL epitope 539-546 <400> 148 Lys Lys Lys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu 1 5 10 <210> 149 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV S protein CTL epitope 1220-1228 <400> 149 Lys Lys Lys Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val 1 5 10 <210> 150 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV S protein CTL epitope 996-1004 <400> 150 Lys Lys Lys Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu 1 5 10 <210> 151 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV S protein CTL epitope 1192-1200 <400> 151 Lys Lys Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1 5 10 <210> 152 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(15) <223> 2019-nCoV S protein CTL epitope 504-515 <400> 152 Lys Lys Lys Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe 1 5 10 15 <210> 153 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV N protein CTL epitope 222-230 <400> 153 Lys Lys Lys Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu 1 5 10 <210> 154 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV N protein CTL epitope 219-227 <400> 154 Lys Lys Lys Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu 1 5 10 <210> 155 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV N protein CTL epitope 159-167 <400> 155 Lys Lys Lys Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu 1 5 10 <210> 156 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV N protein CTL epitope 316-324 <400> 156 Lys Lys Lys Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val 1 5 10 <210> 157 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV N protein CTL epitope 361-369 <400> 157 Lys Lys Lys Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys 1 5 10 <210> 158 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV N protein CTL epitope 138-146 <400> 158 Lys Lys Lys Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile 1 5 10 <210> 159 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(12) <223> 2019-nCoV N protein CTL epitope 351-359 <400> 159 Lys Lys Lys Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 160 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(13) <223> 2019-nCoV N protein CTL epitope 322-331 <400> 160 Lys Lys Lys Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu 1 5 10 <210> 161 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(19) <223> 2019-nCoV S protein Th epitope 891-906 <400> 161 Lys Lys Lys Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala 1 5 10 15 Tyr Arg Phe <210> 162 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(19) <223> 2019-nCoV S protein Th epitope 902-917 <400> 162 Lys Lys Lys Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn 1 5 10 15 Val Leu Tyr <210> 163 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(21) <223> 2019-nCoV S protein Th epitope 1011-1028 <400> 163 Lys Lys Lys Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Thr Lys 20 <210> 164 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(20) <223> 2019-nCoV S protein Th epitope 957-973 <400> 164 Lys Lys Lys Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn 1 5 10 15 Phe Gly Ala Ile 20 <210> 165 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(18) <223> 2019-nCoV N protein Th epitope 305-319 <400> 165 Lys Lys Lys Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met 1 5 10 15 Ser Arg <210> 166 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Wild-type IgG1 <400> 166 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 167 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated IgG1 <400> 167 Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Lys Thr His Thr Xaa Pro Pro Xaa Pro 1 5 10 15 <210> 168 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated IgG1 <400> 168 Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Lys Thr His Thr Xaa Pro Pro 1 5 10 <210> 169 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated IgG1 <400> 169 Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 170 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated IgG1 <400> 170 Asp Lys Thr His Thr Xaa Pro Pro Xaa Pro 1 5 10 <210> 171 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Wild-type IgG2 <400> 171 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 172 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Mutated IgG2 <400> 172 Glu Arg Lys Xaa Xaa Val Glu Xaa Pro Pro Xaa Pro 1 5 10 <210> 173 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated IgG2 <400> 173 Glu Arg Lys Xaa Xaa Val Glu Xaa Pro Pro 1 5 10 <210> 174 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> Mutated IgG2 <400> 174 Val Glu Xaa Pro Pro Xaa Pro 1 5 <210> 175 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Wild-type IgG3 <400> 175 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro <210> 176 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Mutated IgG3 <400> 176 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Xaa Pro Arg Xaa 1 5 10 15 Pro <210> 177 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated IgG3 <400> 177 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Xaa Pro Arg 1 5 10 15 <210> 178 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Mutated IgG3 <400> 178 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr 1 5 10 <210> 179 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Wild-type IgG3 <400> 179 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 10 15 <210> 180 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated IgG3 <400> 180 Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Thr Pro Pro Pro Xaa Pro Arg Xaa Pro 1 5 10 15 <210> 181 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated IgG3 <400> 181 Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Thr Pro Pro Pro Xaa Pro Arg 1 5 10 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated IgG3 <400> 182 Glu Pro Lys Ser Xaa Asp Thr Pro Pro Pro 1 5 10 <210> 183 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated IgG3 <400> 183 Asp Thr Pro Pro Pro Xaa Pro Arg Xaa Pro 1 5 10 <210> 184 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Wild-type IgG4 <400> 184 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 185 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Mutated IgG4 <400> 185 Glu Xaa Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Xaa Cys Pro 1 5 10 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Mutated IgG4 <400> 186 Glu Xaa Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated IgG4 <400> 187 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Xaa Cys Pro 1 5 10 <210> 188 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 188 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 189 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 189 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 190 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 190 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Pro 1 5 10 <210> 191 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 191 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 192 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 192 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 193 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 193 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro 1 5 <210> 194 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 194 Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Pro Pro Pro 1 5 10 <210> 195 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 195 Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 196 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 196 Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Gly Pro 1 5 10 15 <210> 197 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 197 Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro 1 5 10 <210> 198 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 198 Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Pro 1 5 10 <210> 199 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 199 Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 200 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 200 Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 201 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 201 Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro 1 5 <210> 202 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 202 Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 203 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 203 Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 204 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 204 Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 205 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 205 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Gly Pro 1 5 10 15 <210> 206 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 206 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 207 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 207 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Pro 1 5 10 <210> 208 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 208 Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 209 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 209 Glu Pro Lys Ser Thr Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 <210> 210 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 210 Glu Pro Lys Ser Thr Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro 1 5 10 <210> 211 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 211 Glu Pro Lys Ser Thr Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Pro 1 5 10 <210> 212 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 212 Glu Pro Lys Ser Thr Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 213 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 213 Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Thr Pro 1 5 10 <210> 214 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 214 Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro 1 5 <210> 215 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 215 Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Thr Pro 1 5 10 <210> 216 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 216 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Thr Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 <210> 217 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 217 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 <210> 218 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 218 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Leu Pro Pro Met Pro 1 5 10 15 <210> 219 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 219 Glu Pro Lys Ser Val Asp Lys Thr His Thr Leu Pro Pro Ile Pro 1 5 10 15 <210> 220 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 220 Glu Pro Lys Ser Leu Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Ala Pro 1 5 10 15 <210> 221 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 221 Glu Pro Lys Ser Val Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro 1 5 10 <210> 222 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 222 Glu Pro Lys Ser Met Asp Lys Thr His Thr Val Pro Pro 1 5 10 <210> 223 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 223 Glu Pro Lys Ser Ile Asp Lys Thr His Thr Leu Pro Pro 1 5 10 <210> 224 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 224 Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Leu Pro 1 5 10 <210> 225 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> Mutated Hinge Regions Derived from IgG1 <400> 225 Asp Lys Thr His Thr Val Pro Pro Leu Pro 1 5 10 <210> 226 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(200) <223> S protein RBD (SARS-CoV-2) <400> 226 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser 195 200 <210> 227 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(200) <223> S protein RBDa (SARS-CoV-2) <400> 227 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Ala Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val Ala Gly Pro Lys Lys Ser 195 200 <210> 228 <211> 805 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(805) <223> ACE2 (Homo sapiens) <400> 228 Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe 20 25 30 Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp 35 40 45 Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln 85 90 95 Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys 100 105 110 Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser 115 120 125 Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu 130 135 140 Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu 165 170 175 Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg 180 185 190 Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu 195 200 205 Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu 210 215 220 Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu 225 230 235 240 His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile 245 250 255 Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly 260 265 270 Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys 275 280 285 Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala 290 295 300 Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu 305 310 315 320 Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro 325 330 335 Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp 355 360 365 Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala 370 375 380 Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe 385 390 395 400 His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys 405 410 415 His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn 420 425 430 Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly 435 440 445 Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe 450 455 460 Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met 465 470 475 480 Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe 500 505 510 Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala 515 520 525 Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile 530 535 540 Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu 545 550 555 560 Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala 565 570 575 Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe 580 585 590 Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr 595 600 605 Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu 610 615 620 Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met 625 630 635 640 Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu 645 650 655 Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val 660 665 670 Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro 675 680 685 Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile 690 695 700 Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn 705 710 715 720 Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln 725 730 735 Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val 740 745 750 Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg 755 760 765 Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile 770 775 780 Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp 785 790 795 800 Val Gln Thr Ser Phe 805 <210> 229 <211> 740 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(740) <223> ACE2 extra-cellular domain (ECD) (Homo sapiens) <400> 229 Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe 20 25 30 Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp 35 40 45 Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln 85 90 95 Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys 100 105 110 Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser 115 120 125 Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu 130 135 140 Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu 165 170 175 Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg 180 185 190 Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu 195 200 205 Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu 210 215 220 Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu 225 230 235 240 His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile 245 250 255 Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly 260 265 270 Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys 275 280 285 Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala 290 295 300 Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu 305 310 315 320 Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro 325 330 335 Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp 355 360 365 Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala 370 375 380 Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe 385 390 395 400 His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys 405 410 415 His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn 420 425 430 Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly 435 440 445 Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe 450 455 460 Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met 465 470 475 480 Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe 500 505 510 Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala 515 520 525 Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile 530 535 540 Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu 545 550 555 560 Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala 565 570 575 Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe 580 585 590 Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr 595 600 605 Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu 610 615 620 Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met 625 630 635 640 Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu 645 650 655 Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val 660 665 670 Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro 675 680 685 Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile 690 695 700 Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn 705 710 715 720 Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln 725 730 735 Pro Pro Val Ser 740 <210> 230 <211> 740 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(740) <223> ACE2N extra-cellular domain (ECD) (Homo sapiens) <400> 230 Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe 20 25 30 Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp 35 40 45 Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln 85 90 95 Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys 100 105 110 Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser 115 120 125 Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu 130 135 140 Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu 165 170 175 Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg 180 185 190 Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu 195 200 205 Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu 210 215 220 Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu 225 230 235 240 His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile 245 250 255 Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly 260 265 270 Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys 275 280 285 Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala 290 295 300 Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu 305 310 315 320 Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro 325 330 335 Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp 355 360 365 Phe Leu Thr Ala His Asn Glu Met Gly Asn Ile Gln Tyr Asp Met Ala 370 375 380 Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe 385 390 395 400 His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys 405 410 415 His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn 420 425 430 Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly 435 440 445 Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe 450 455 460 Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met 465 470 475 480 Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe 500 505 510 Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala 515 520 525 Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile 530 535 540 Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu 545 550 555 560 Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala 565 570 575 Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe 580 585 590 Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr 595 600 605 Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu 610 615 620 Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met 625 630 635 640 Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu 645 650 655 Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val 660 665 670 Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro 675 680 685 Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile 690 695 700 Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn 705 710 715 720 Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln 725 730 735 Pro Pro Val Ser 740 <210> 231 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(216) <223> Fc peptide (Wild-Type) <400> 231 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 232 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(216) <223> Fc peptide Mut. Glycos. (N->H) <400> 232 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 233 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(216) <223> Fc peptide Mut. Glycos. (N->A) <400> 233 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 234 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(216) <223> Fc peptide Mut. Glycos. (N->X) X = N,H,A <400> 234 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 235 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(431) <223> S-RBD-sFc Fusion protein <400> 235 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 260 265 270 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val 275 280 285 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 290 295 300 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 305 310 315 320 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 325 330 335 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 340 345 350 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 355 360 365 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 370 375 380 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 385 390 395 400 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 405 410 415 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 420 425 430 <210> 236 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(431) <223> S-RBDa-sFc Fusion protein <400> 236 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Ala Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val Ala Gly Pro Lys Lys Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 260 265 270 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val 275 280 285 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 290 295 300 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 305 310 315 320 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 325 330 335 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 340 345 350 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 355 360 365 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 370 375 380 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 385 390 395 400 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 405 410 415 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 420 425 430 <210> 237 <211> 971 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(971) <223> ACE2-ECD-sFc Fusion protein <400> 237 Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe 20 25 30 Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp 35 40 45 Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln 85 90 95 Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys 100 105 110 Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser 115 120 125 Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu 130 135 140 Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu 165 170 175 Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg 180 185 190 Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu 195 200 205 Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu 210 215 220 Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu 225 230 235 240 His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile 245 250 255 Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly 260 265 270 Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys 275 280 285 Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala 290 295 300 Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu 305 310 315 320 Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro 325 330 335 Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp 355 360 365 Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala 370 375 380 Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe 385 390 395 400 His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys 405 410 415 His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn 420 425 430 Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly 435 440 445 Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe 450 455 460 Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met 465 470 475 480 Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe 500 505 510 Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala 515 520 525 Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile 530 535 540 Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu 545 550 555 560 Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala 565 570 575 Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe 580 585 590 Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr 595 600 605 Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu 610 615 620 Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met 625 630 635 640 Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu 645 650 655 Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val 660 665 670 Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro 675 680 685 Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile 690 695 700 Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn 705 710 715 720 Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln 725 730 735 Pro Pro Val Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro 740 745 750 Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 755 760 765 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 770 775 780 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 785 790 795 800 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 805 810 815 Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 820 825 830 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 835 840 845 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 850 855 860 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 865 870 875 880 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 885 890 895 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 900 905 910 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 915 920 925 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 930 935 940 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 945 950 955 960 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 965 970 <210> 238 <211> 971 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(971) <223> ACE2N-ECD-sFc Fusion protein <400> 238 Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe 20 25 30 Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp 35 40 45 Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln 85 90 95 Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys 100 105 110 Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser 115 120 125 Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu 130 135 140 Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu 165 170 175 Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg 180 185 190 Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu 195 200 205 Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu 210 215 220 Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu 225 230 235 240 His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile 245 250 255 Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly 260 265 270 Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys 275 280 285 Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala 290 295 300 Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu 305 310 315 320 Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro 325 330 335 Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp 355 360 365 Phe Leu Thr Ala His Asn Glu Met Gly Asn Ile Gln Tyr Asp Met Ala 370 375 380 Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe 385 390 395 400 His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys 405 410 415 His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn 420 425 430 Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly 435 440 445 Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe 450 455 460 Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met 465 470 475 480 Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe 500 505 510 Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala 515 520 525 Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile 530 535 540 Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu 545 550 555 560 Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala 565 570 575 Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe 580 585 590 Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr 595 600 605 Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu 610 615 620 Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met 625 630 635 640 Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu 645 650 655 Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val 660 665 670 Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro 675 680 685 Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile 690 695 700 Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn 705 710 715 720 Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln 725 730 735 Pro Pro Val Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro 740 745 750 Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 755 760 765 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 770 775 780 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 785 790 795 800 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 805 810 815 Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 820 825 830 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 835 840 845 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 850 855 860 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 865 870 875 880 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 885 890 895 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 900 905 910 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 915 920 925 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 930 935 940 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 945 950 955 960 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 965 970 <210> 239 <211> 3846 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3846) <223> S protein (SARS-CoV-2) <400> 239 atgttcctgc tgaccaccaa gaggaccatg ttcgtgttcc tggtgctgct gcccctggtg 60 tcctcccagt gcgtgaacct gaccaccagg acccagctgc cccccgccta caccaactcc 120 ttcaccaggg gcgtgtacta ccccgacaag gtgttcaggt cctccgtgct gcactccacc 180 caggacctgt tcctgccctt cttctccaac gtgacctggt tccacgccat ccacgtgtcc 240 ggcaccaacg gcaccaagag gttcgacaac cccgtgctgc ccttcaacga cggcgtgtac 300 ttcgcctcca ccgagaagtc caacatcatc aggggctgga tcttcggcac caccctggac 360 tccaagaccc agtccctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtggtgat caaggtgtgc 420 gagttccagt tctgcaacga ccccttcctg ggcgtgtact accacaagaa caacaagtcc 480 tggatggagt ccgagttcag ggtgtactcc tccgccaaca actgcacctt cgagtacgtg 540 tcccagccct tcctgatgga cctggagggc aagcagggca acttcaagaa cctgagggag 600 ttcgtgttca agaacatcga cggctacttc aagatctact ccaagcacac ccccatcaac 660 ctggtgaggg acctgcccca gggcttctcc gccctggagc ccctggtgga cctgcccatc 720 ggcatcaaca tcaccaggtt ccagaccctg ctggccctgc acaggtccta cctgaccccc 780 ggcgactcct cctccggctg gaccgccggc gccgccgcct actacgtggg ctacctgcag 840 cccaggacct tcctgctgaa gtacaacgag aacggcacca tcaccgacgc cgtggactgc 900 gccctggacc ccctgtccga gaccaagtgc accctgaagt ccttcaccgt ggagaagggc 960 atctaccaga cctccaactt cagggtgcag cccaccgagt ccatcgtgag gttccccaac 1020 atcaccaacc tgtgcccctt cggcgaggtg ttcaacgcca ccaggttcgc ctccgtgtac 1080 gcctggaaca ggaagaggat ctccaactgc gtggccgact actccgtgct gtacaactcc 1140 gcctccttct ccaccttcaa gtgctacggc gtgtccccca ccaagctgaa cgacctgtgc 1200 ttcaccaacg tgtacgccga ctccttcgtg atcaggggcg acgaggtgag gcagatcgcc 1260 cccggccaga ccggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgacga cttcaccggc 1320 tgcgtgatcg cctggaactc caacaacctg gactccaagg tgggcggcaa ctacaactac 1380 ctgtacaggc tgttcaggaa gtccaacctg aagcccttcg agagggacat ctccaccgag 1440 atctaccagg ccggctccac cccctgcaac ggcgtggagg gcttcaactg ctacttcccc 1500 ctgcagtcct acggcttcca gcccaccaac ggcgtgggct accagcccta cagggtggtg 1560 gtgctgtcct tcgagctgct gcacgccccc gccaccgtgt gcggccccaa gaagtccacc 1620 aacctggtga agaacaagtg cgtgaacttc aacttcaacg gcctgaccgg caccggcgtg 1680 ctgaccgagt ccaacaagaa gttcctgccc ttccagcagt tcggcaggga catcgccgac 1740 accaccgacg ccgtgaggga cccccagacc ctggagatcc tggacatcac cccctgctcc 1800 ttcggcggcg tgtccgtgat cacccccggc accaacacct ccaaccaggt ggccgtgctg 1860 taccaggacg tgaactgcac cgaggtgccc gtggccatcc acgccgacca gctgaccccc 1920 acctggaggg tgtactccac cggctccaac gtgttccaga ccagggccgg ctgcctgatc 1980 ggcgccgagc acgtgaacaa ctcctacgag tgcgacatcc ccatcggcgc cggcatctgc 2040 gcctcctacc agacccagac caactccccc aggagggcca ggtccgtggc ctcccagtcc 2100 atcatcgcct acaccatgtc cctgggcgcc gagaactccg tggcctactc caacaactcc 2160 atcgccatcc ccaccaactt caccatctcc gtgaccaccg agatcctgcc cgtgtccatg 2220 accaagacct ccgtggactg caccatgtac atctgcggcg actccaccga gtgctccaac 2280 ctgctgctgc agtacggctc cttctgcacc cagctgaaca gggccctgac cggcatcgcc 2340 gtggagcagg acaagaacac ccaggaggtg ttcgcccagg tgaagcagat ctacaagacc 2400 ccccccatca aggacttcgg cggcttcaac ttctcccaga tcctgcccga cccctccaag 2460 ccctccaaga ggtccttcat cgaggacctg ctgttcaaca aggtgaccct ggccgacgcc 2520 ggcttcatca agcagtacgg cgactgcctg ggcgacatcg ccgccaggga cctgatctgc 2580 gcccagaagt tcaacggcct gaccgtgctg ccccccctgc tgaccgacga gatgatcgcc 2640 cagtacacct ccgccctgct ggccggcacc atcacctccg gctggacctt cggcgccggc 2700 gccgccctgc agatcccctt cgccatgcag atggcctaca ggttcaacgg catcggcgtg 2760 acccagaacg tgctgtacga gaaccagaag ctgatcgcca accagttcaa ctccgccatc 2820 ggcaagatcc aggactccct gtcctccacc gcctccgccc tgggcaagct gcaggacgtg 2880 gtgaaccaga acgcccaggc cctgaacacc ctggtgaagc agctgtcctc caacttcggc 2940 gccatctcct ccgtgctgaa cgacatcctg tccaggctgg acaaggtgga ggccgaggtg 3000 cagatcgaca ggctgatcac cggcaggctg cagtccctgc agacctacgt gacccagcag 3060 ctgatcaggg ccgccgagat cagggcctcc gccaacctgg ccgccaccaa gatgtccgag 3120 tgcgtgctgg gccagtccaa gagggtggac ttctgcggca agggctacca cctgatgtcc 3180 ttcccccagt ccgcccccca cggcgtggtg ttcctgcacg tgacctacgt gcccgcccag 3240 gagaagaact tcaccaccgc ccccgccatc tgccacgacg gcaaggccca cttccccagg 3300 gagggcgtgt tcgtgtccaa cggcacccac tggttcgtga cccagaggaa cttctacgag 3360 ccccagatca tcaccaccga caacaccttc gtgtccggca actgcgacgt ggtgatcggc 3420 atcgtgaaca acaccgtgta cgaccccctg cagcccgagc tggactcctt caaggaggag 3480 ctggacaagt acttcaagaa ccacacctcc cccgacgtgg acctgggcga catctccggc 3540 atcaacgcct ccgtggtgaa catccagaag gagatcgaca ggctgaacga ggtggccaag 3600 aacctgaacg agtccctgat cgacctgcag gagctgggca agtacgagca gtacatcaag 3660 tggccctggt acatctggct gggcttcatc gccggcctga tcgccatcgt gatggtgacc 3720 atcatgctgt gctgcatgac ctcctgctgc tcctgcctga agggctgctg ctcctgcggc 3780 tcctgctgca agttcgacga ggacgactcc gagcccgtgc tgaagggcgt gaagctgcac 3840 tacacc 3846 <210> 240 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(600) <223> S protein RBD (SARS-CoV-2) <400> 240 aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccaccaggtt cgcctccgtg 60 tacgcctgga acaggaagag gatctccaac tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac 120 tccgcctcct tctccacctt caagtgctac ggcgtgtccc ccaccaagct gaacgacctg 180 tgcttcacca acgtgtacgc cgactccttc gtgatcaggg gcgacgaggt gaggcagatc 240 gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcacc 300 ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac ctggactcca aggtgggcgg caactacaac 360 tacctgtaca ggctgttcag gaagtccaac ctgaagccct tcgagaggga catctccacc 420 gagatctacc aggccggctc caccccctgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc 480 cccctgcagt cctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gctaccagcc ctacagggtg 540 gtggtgctgt ccttcgagct gctgcacgcc cccgccaccg tgtgcggccc caagaagtcc 600 <210> 241 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(600) <223> S protein RBDa (SARS-CoV-2) <400> 241 aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccaccaggtt cgcctccgtg 60 tacgcctgga acaggaagag gatctccaac tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac 120 tccgcctcct tctccacctt caagtgctac ggcgtgtccc ccaccaagct gaacgacctg 180 gccttcacca acgtgtacgc cgactccttc gtgatcaggg gcgacgaggt gaggcagatc 240 gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcacc 300 ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac ctggactcca aggtgggcgg caactacaac 360 tacctgtaca ggctgttcag gaagtccaac ctgaagccct tcgagaggga catctccacc 420 gagatctacc aggccggctc caccccctgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc 480 cccctgcagt cctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gctaccagcc ctacagggtg 540 gtggtgctgt ccttcgagct gctgcacgcc cccgccaccg tggccggccc caagaagtcc 600 <210> 242 <211> 2415 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2415) <223> ACE2 (Homo sapiens) <400> 242 atgtcctcct cctcctggct gctgctgtcc ctggtggccg tgaccgccgc ccagtccacc 60 atcgaggagc aggccaagac cttcctggac aagttcaacc acgaggccga ggacctgttc 120 taccagtcct ccctggcctc ctggaactac aacaccaaca tcaccgagga gaacgtgcag 180 aacatgaaca acgccggcga caagtggtcc gccttcctga aggagcagtc caccctggcc 240 cagatgtacc ccctgcagga gatccagaac ctgaccgtga agctgcagct gcaggccctg 300 cagcagaacg gctcctccgt gctgtccgag gacaagtcca agaggctgaa caccatcctg 360 aacaccatgt ccaccatcta ctccaccggc aaggtgtgca accccgacaa cccccaggag 420 tgcctgctgc tggagcccgg cctgaacgag atcatggcca actccctgga ctacaacgag 480 aggctgtggg cctgggagtc ctggaggtcc gaggtgggca agcagctgag gcccctgtac 540 gaggagtacg tggtgctgaa gaacgagatg gccagggcca accactacga ggactacggc 600 gactactgga ggggcgacta cgaggtgaac ggcgtggacg gctacgacta ctccaggggc 660 cagctgatcg aggacgtgga gcacaccttc gaggagatca agcccctgta cgagcacctg 720 cacgcctacg tgagggccaa gctgatgaac gcctacccct cctacatctc ccccatcggc 780 tgcctgcccg cccacctgct gggcgacatg tggggcaggt tctggaccaa cctgtactcc 840 ctgaccgtgc ccttcggcca gaagcccaac atcgacgtga ccgacgccat ggtggaccag 900 gcctgggacg cccagaggat cttcaaggag gccgagaagt tcttcgtgtc cgtgggcctg 960 cccaacatga cccagggctt ctgggagaac tccatgctga ccgaccccgg caacgtgcag 1020 aaggccgtgt gccaccccac cgcctgggac ctgggcaagg gcgacttcag gatcctgatg 1080 tgcaccaagg tgaccatgga cgacttcctg accgcccacc acgagatggg ccacatccag 1140 tacgacatgg cctacgccgc ccagcccttc ctgctgagga acggcgccaa cgagggcttc 1200 cacgaggccg tgggcgagat catgtccctg tccgccgcca cccccaagca cctgaagtcc 1260 atcggcctgc tgtcccccga cttccaggag gacaacgaga ccgagatcaa cttcctgctg 1320 aagcaggccc tgaccatcgt gggcaccctg cccttcacct acatgctgga gaagtggagg 1380 tggatggtgt tcaagggcga gatccccaag gaccagtgga tgaagaagtg gtgggagatg 1440 aagagggaga tcgtgggcgt ggtggagccc gtgccccacg acgagaccta ctgcgacccc 1500 gcctccctgt tccacgtgtc caacgactac tccttcatca ggtactacac caggaccctg 1560 taccagttcc agttccagga ggccctgtgc caggccgcca agcacgaggg ccccctgcac 1620 aagtgcgaca tctccaactc caccgaggcc ggccagaagc tgttcaacat gctgaggctg 1680 ggcaagtccg agccctggac cctggccctg gagaacgtgg tgggcgccaa gaacatgaac 1740 gtgaggcccc tgctgaacta cttcgagccc ctgttcacct ggctgaagga ccagaacaag 1800 aactccttcg tgggctggtc caccgactgg tccccctacg ccgaccagtc catcaaggtg 1860 aggatctccc tgaagtccgc cctgggcgac aaggcctacg agtggaacga caacgagatg 1920 tacctgttca ggtcctccgt ggcctacgcc atgaggcagt acttcctgaa ggtgaagaac 1980 cagatgatcc tgttcggcga ggaggacgtg agggtggcca acctgaagcc caggatctcc 2040 ttcaacttct tcgtgaccgc ccccaagaac gtgtccgaca tcatccccag gaccgaggtg 2100 gagaaggcca tcaggatgtc caggtccagg atcaacgacg ccttcaggct gaacgacaac 2160 tccctggagt tcctgggcat ccagcccacc ctgggccccc ccaaccagcc ccccgtgtcc 2220 atctggctga tcgtgttcgg cgtggtgatg ggcgtgatcg tggtgggcat cgtgatcctg 2280 atcttcaccg gcatcaggga caggaagaag aagaacaagg ccaggtccgg cgagaacccc 2340 tacgcctcca tcgacatctc caagggcgag aacaaccccg gcttccagaa caccgacgac 2400 gtgcagacct ccttc 2415 <210> 243 <211> 2220 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2220) <223> ACE2 extra-cellular domain (ECD) (Homo sapiens) <400> 243 atgtcctcct cctcctggct gctgctgtcc ctggtggccg tgaccgccgc ccagtccacc 60 atcgaggagc aggccaagac cttcctggac aagttcaacc acgaggccga ggacctgttc 120 taccagtcct ccctggcctc ctggaactac aacaccaaca tcaccgagga gaacgtgcag 180 aacatgaaca acgccggcga caagtggtcc gccttcctga aggagcagtc caccctggcc 240 cagatgtacc ccctgcagga gatccagaac ctgaccgtga agctgcagct gcaggccctg 300 cagcagaacg gctcctccgt gctgtccgag gacaagtcca agaggctgaa caccatcctg 360 aacaccatgt ccaccatcta ctccaccggc aaggtgtgca accccgacaa cccccaggag 420 tgcctgctgc tggagcccgg cctgaacgag atcatggcca actccctgga ctacaacgag 480 aggctgtggg cctgggagtc ctggaggtcc gaggtgggca agcagctgag gcccctgtac 540 gaggagtacg tggtgctgaa gaacgagatg gccagggcca accactacga ggactacggc 600 gactactgga ggggcgacta cgaggtgaac ggcgtggacg gctacgacta ctccaggggc 660 cagctgatcg aggacgtgga gcacaccttc gaggagatca agcccctgta cgagcacctg 720 cacgcctacg tgagggccaa gctgatgaac gcctacccct cctacatctc ccccatcggc 780 tgcctgcccg cccacctgct gggcgacatg tggggcaggt tctggaccaa cctgtactcc 840 ctgaccgtgc ccttcggcca gaagcccaac atcgacgtga ccgacgccat ggtggaccag 900 gcctgggacg cccagaggat cttcaaggag gccgagaagt tcttcgtgtc cgtgggcctg 960 cccaacatga cccagggctt ctgggagaac tccatgctga ccgaccccgg caacgtgcag 1020 aaggccgtgt gccaccccac cgcctgggac ctgggcaagg gcgacttcag gatcctgatg 1080 tgcaccaagg tgaccatgga cgacttcctg accgcccacc acgagatggg ccacatccag 1140 tacgacatgg cctacgccgc ccagcccttc ctgctgagga acggcgccaa cgagggcttc 1200 cacgaggccg tgggcgagat catgtccctg tccgccgcca cccccaagca cctgaagtcc 1260 atcggcctgc tgtcccccga cttccaggag gacaacgaga ccgagatcaa cttcctgctg 1320 aagcaggccc tgaccatcgt gggcaccctg cccttcacct acatgctgga gaagtggagg 1380 tggatggtgt tcaagggcga gatccccaag gaccagtgga tgaagaagtg gtgggagatg 1440 aagagggaga tcgtgggcgt ggtggagccc gtgccccacg acgagaccta ctgcgacccc 1500 gcctccctgt tccacgtgtc caacgactac tccttcatca ggtactacac caggaccctg 1560 taccagttcc agttccagga ggccctgtgc caggccgcca agcacgaggg ccccctgcac 1620 aagtgcgaca tctccaactc caccgaggcc ggccagaagc tgttcaacat gctgaggctg 1680 ggcaagtccg agccctggac cctggccctg gagaacgtgg tgggcgccaa gaacatgaac 1740 gtgaggcccc tgctgaacta cttcgagccc ctgttcacct ggctgaagga ccagaacaag 1800 aactccttcg tgggctggtc caccgactgg tccccctacg ccgaccagtc catcaaggtg 1860 aggatctccc tgaagtccgc cctgggcgac aaggcctacg agtggaacga caacgagatg 1920 tacctgttca ggtcctccgt ggcctacgcc atgaggcagt acttcctgaa ggtgaagaac 1980 cagatgatcc tgttcggcga ggaggacgtg agggtggcca acctgaagcc caggatctcc 2040 ttcaacttct tcgtgaccgc ccccaagaac gtgtccgaca tcatccccag gaccgaggtg 2100 gagaaggcca tcaggatgtc caggtccagg atcaacgacg ccttcaggct gaacgacaac 2160 tccctggagt tcctgggcat ccagcccacc ctgggccccc ccaaccagcc ccccgtgtcc 2220 <210> 244 <211> 2220 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2220) <223> ACE2N extra-cellular domain (ECD) (Homo sapiens) <400> 244 atgtcctcct cctcctggct gctgctgtcc ctggtggccg tgaccgccgc ccagtccacc 60 atcgaggagc aggccaagac cttcctggac aagttcaacc acgaggccga ggacctgttc 120 taccagtcct ccctggcctc ctggaactac aacaccaaca tcaccgagga gaacgtgcag 180 aacatgaaca acgccggcga caagtggtcc gccttcctga aggagcagtc caccctggcc 240 cagatgtacc ccctgcagga gatccagaac ctgaccgtga agctgcagct gcaggccctg 300 cagcagaacg gctcctccgt gctgtccgag gacaagtcca agaggctgaa caccatcctg 360 aacaccatgt ccaccatcta ctccaccggc aaggtgtgca accccgacaa cccccaggag 420 tgcctgctgc tggagcccgg cctgaacgag atcatggcca actccctgga ctacaacgag 480 aggctgtggg cctgggagtc ctggaggtcc gaggtgggca agcagctgag gcccctgtac 540 gaggagtacg tggtgctgaa gaacgagatg gccagggcca accactacga ggactacggc 600 gactactgga ggggcgacta cgaggtgaac ggcgtggacg gctacgacta ctccaggggc 660 cagctgatcg aggacgtgga gcacaccttc gaggagatca agcccctgta cgagcacctg 720 cacgcctacg tgagggccaa gctgatgaac gcctacccct cctacatctc ccccatcggc 780 tgcctgcccg cccacctgct gggcgacatg tggggcaggt tctggaccaa cctgtactcc 840 ctgaccgtgc ccttcggcca gaagcccaac atcgacgtga ccgacgccat ggtggaccag 900 gcctgggacg cccagaggat cttcaaggag gccgagaagt tcttcgtgtc cgtgggcctg 960 cccaacatga cccagggctt ctgggagaac tccatgctga ccgaccccgg caacgtgcag 1020 aaggccgtgt gccaccccac cgcctgggac ctgggcaagg gcgacttcag gatcctgatg 1080 tgcaccaagg tgaccatgga cgacttcctg accgcccaca acgagatggg caacatccag 1140 tacgacatgg cctacgccgc ccagcccttc ctgctgagga acggcgccaa cgagggcttc 1200 cacgaggccg tgggcgagat catgtccctg tccgccgcca cccccaagca cctgaagtcc 1260 atcggcctgc tgtcccccga cttccaggag gacaacgaga ccgagatcaa cttcctgctg 1320 aagcaggccc tgaccatcgt gggcaccctg cccttcacct acatgctgga gaagtggagg 1380 tggatggtgt tcaagggcga gatccccaag gaccagtgga tgaagaagtg gtgggagatg 1440 aagagggaga tcgtgggcgt ggtggagccc gtgccccacg acgagaccta ctgcgacccc 1500 gcctccctgt tccacgtgtc caacgactac tccttcatca ggtactacac caggaccctg 1560 taccagttcc agttccagga ggccctgtgc caggccgcca agcacgaggg ccccctgcac 1620 aagtgcgaca tctccaactc caccgaggcc ggccagaagc tgttcaacat gctgaggctg 1680 ggcaagtccg agccctggac cctggccctg gagaacgtgg tgggcgccaa gaacatgaac 1740 gtgaggcccc tgctgaacta cttcgagccc ctgttcacct ggctgaagga ccagaacaag 1800 aactccttcg tgggctggtc caccgactgg tccccctacg ccgaccagtc catcaaggtg 1860 aggatctccc tgaagtccgc cctgggcgac aaggcctacg agtggaacga caacgagatg 1920 tacctgttca ggtcctccgt ggcctacgcc atgaggcagt acttcctgaa ggtgaagaac 1980 cagatgatcc tgttcggcga ggaggacgtg agggtggcca acctgaagcc caggatctcc 2040 ttcaacttct tcgtgaccgc ccccaagaac gtgtccgaca tcatccccag gaccgaggtg 2100 gagaaggcca tcaggatgtc caggtccagg atcaacgacg ccttcaggct gaacgacaac 2160 tccctggagt tcctgggcat ccagcccacc ctgggccccc ccaaccagcc ccccgtgtcc 2220 <210> 245 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc peptide Mut. Glyco. (N->H) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(648) <223> Fc peptide Mut. Glyco. (N->H) <400> 245 gcccccgagc tgctgggcgg cccctccgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 60 ctgatgatct ccaggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac 120 cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag 180 cccagggagg agcagtacca ctccacctac agggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 240 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcccgcc 300 cccatcgaga agaccatctc caaggccaag ggccagccca gggagcccca ggtgtacacc 360 ctgcccccct ccagggacga gctgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag 420 ggcttctacc cctccgacat cgccgtggag tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac 480 tacaagacca ccccccccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctgta ctccaagctg 540 accgtggaca agtccaggtg gcagcagggc aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag 600 gccctgcaca accactacac ccagaagtcc ctgtccctgt cccccggc 648 <210> 246 <211> 1293 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S-RBD-sFc Fusion protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1293) <223> S-RBD-sFc Fusion protein <400> 246 aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccaccaggtt cgcctccgtg 60 tacgcctgga acaggaagag gatctccaac tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac 120 tccgcctcct tctccacctt caagtgctac ggcgtgtccc ccaccaagct gaacgacctg 180 tgcttcacca acgtgtacgc cgactccttc gtgatcaggg gcgacgaggt gaggcagatc 240 gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcacc 300 ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac ctggactcca aggtgggcgg caactacaac 360 tacctgtaca ggctgttcag gaagtccaac ctgaagccct tcgagaggga catctccacc 420 gagatctacc aggccggctc caccccctgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc 480 cccctgcagt cctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gctaccagcc ctacagggtg 540 gtggtgctgt ccttcgagct gctgcacgcc cccgccaccg tgtgcggccc caagaagtcc 600 gagcccaagt cctccgacaa gacccacacc tcccccccct cccccgcccc cgagctgctg 660 ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatctccagg 720 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccccga ggtgaagttc 780 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 840 taccactcca cctacagggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 900 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 960 atctccaagg ccaagggcca gcccagggag ccccaggtgt acaccctgcc cccctccagg 1020 gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 1080 gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1140 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 1200 aggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1260 tacacccaga agtccctgtc cctgtccccc ggc 1293 <210> 247 <211> 1293 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S-RBDa-sFc Fusion protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1293) <223> S-RBDa-sFc Fusion protein <400> 247 aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccaccaggtt cgcctccgtg 60 tacgcctgga acaggaagag gatctccaac tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac 120 tccgcctcct tctccacctt caagtgctac ggcgtgtccc ccaccaagct gaacgacctg 180 gccttcacca acgtgtacgc cgactccttc gtgatcaggg gcgacgaggt gaggcagatc 240 gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcacc 300 ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac ctggactcca aggtgggcgg caactacaac 360 tacctgtaca ggctgttcag gaagtccaac ctgaagccct tcgagaggga catctccacc 420 gagatctacc aggccggctc caccccctgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc 480 cccctgcagt cctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gctaccagcc ctacagggtg 540 gtggtgctgt ccttcgagct gctgcacgcc cccgccaccg tggccggccc caagaagtcc 600 gagcccaagt cctccgacaa gacccacacc tcccccccct cccccgcccc cgagctgctg 660 ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatctccagg 720 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccccga ggtgaagttc 780 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 840 taccactcca cctacagggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 900 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 960 atctccaagg ccaagggcca gcccagggag ccccaggtgt acaccctgcc cccctccagg 1020 gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 1080 gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1140 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 1200 aggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1260 tacacccaga agtccctgtc cctgtccccc ggc 1293 <210> 248 <211> 2913 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE2-ECD-sFc Fusion protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2913) <223> ACE2-ECD-sFc Fusion protein <400> 248 atgtcctcct cctcctggct gctgctgtcc ctggtggccg tgaccgccgc ccagtccacc 60 atcgaggagc aggccaagac cttcctggac aagttcaacc acgaggccga ggacctgttc 120 taccagtcct ccctggcctc ctggaactac aacaccaaca tcaccgagga gaacgtgcag 180 aacatgaaca acgccggcga caagtggtcc gccttcctga aggagcagtc caccctggcc 240 cagatgtacc ccctgcagga gatccagaac ctgaccgtga agctgcagct gcaggccctg 300 cagcagaacg gctcctccgt gctgtccgag gacaagtcca agaggctgaa caccatcctg 360 aacaccatgt ccaccatcta ctccaccggc aaggtgtgca accccgacaa cccccaggag 420 tgcctgctgc tggagcccgg cctgaacgag atcatggcca actccctgga ctacaacgag 480 aggctgtggg cctgggagtc ctggaggtcc gaggtgggca agcagctgag gcccctgtac 540 gaggagtacg tggtgctgaa gaacgagatg gccagggcca accactacga ggactacggc 600 gactactgga ggggcgacta cgaggtgaac ggcgtggacg gctacgacta ctccaggggc 660 cagctgatcg aggacgtgga gcacaccttc gaggagatca agcccctgta cgagcacctg 720 cacgcctacg tgagggccaa gctgatgaac gcctacccct cctacatctc ccccatcggc 780 tgcctgcccg cccacctgct gggcgacatg tggggcaggt tctggaccaa cctgtactcc 840 ctgaccgtgc ccttcggcca gaagcccaac atcgacgtga ccgacgccat ggtggaccag 900 gcctgggacg cccagaggat cttcaaggag gccgagaagt tcttcgtgtc cgtgggcctg 960 cccaacatga cccagggctt ctgggagaac tccatgctga ccgaccccgg caacgtgcag 1020 aaggccgtgt gccaccccac cgcctgggac ctgggcaagg gcgacttcag gatcctgatg 1080 tgcaccaagg tgaccatgga cgacttcctg accgcccacc acgagatggg ccacatccag 1140 tacgacatgg cctacgccgc ccagcccttc ctgctgagga acggcgccaa cgagggcttc 1200 cacgaggccg tgggcgagat catgtccctg tccgccgcca cccccaagca cctgaagtcc 1260 atcggcctgc tgtcccccga cttccaggag gacaacgaga ccgagatcaa cttcctgctg 1320 aagcaggccc tgaccatcgt gggcaccctg cccttcacct acatgctgga gaagtggagg 1380 tggatggtgt tcaagggcga gatccccaag gaccagtgga tgaagaagtg gtgggagatg 1440 aagagggaga tcgtgggcgt ggtggagccc gtgccccacg acgagaccta ctgcgacccc 1500 gcctccctgt tccacgtgtc caacgactac tccttcatca ggtactacac caggaccctg 1560 taccagttcc agttccagga ggccctgtgc caggccgcca agcacgaggg ccccctgcac 1620 aagtgcgaca tctccaactc caccgaggcc ggccagaagc tgttcaacat gctgaggctg 1680 ggcaagtccg agccctggac cctggccctg gagaacgtgg tgggcgccaa gaacatgaac 1740 gtgaggcccc tgctgaacta cttcgagccc ctgttcacct ggctgaagga ccagaacaag 1800 aactccttcg tgggctggtc caccgactgg tccccctacg ccgaccagtc catcaaggtg 1860 aggatctccc tgaagtccgc cctgggcgac aaggcctacg agtggaacga caacgagatg 1920 tacctgttca ggtcctccgt ggcctacgcc atgaggcagt acttcctgaa ggtgaagaac 1980 cagatgatcc tgttcggcga ggaggacgtg agggtggcca acctgaagcc caggatctcc 2040 ttcaacttct tcgtgaccgc ccccaagaac gtgtccgaca tcatccccag gaccgaggtg 2100 gagaaggcca tcaggatgtc caggtccagg atcaacgacg ccttcaggct gaacgacaac 2160 tccctggagt tcctgggcat ccagcccacc ctgggccccc ccaaccagcc ccccgtgtcc 2220 gagcccaagt cctccgacaa gacccacacc tcccccccct cccccgcccc cgagctgctg 2280 ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatctccagg 2340 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccccga ggtgaagttc 2400 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 2460 taccactcca cctacagggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 2520 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 2580 atctccaagg ccaagggcca gcccagggag ccccaggtgt acaccctgcc cccctccagg 2640 gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 2700 gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 2760 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 2820 aggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 2880 tacacccaga agtccctgtc cctgtccccc ggc 2913 <210> 249 <211> 2913 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE2N-ECD-sFc Fusion protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2913) <223> ACE2N-ECD-sFc Fusion protein <400> 249 atgtcctcct cctcctggct gctgctgtcc ctggtggccg tgaccgccgc ccagtccacc 60 atcgaggagc aggccaagac cttcctggac aagttcaacc acgaggccga ggacctgttc 120 taccagtcct ccctggcctc ctggaactac aacaccaaca tcaccgagga gaacgtgcag 180 aacatgaaca acgccggcga caagtggtcc gccttcctga aggagcagtc caccctggcc 240 cagatgtacc ccctgcagga gatccagaac ctgaccgtga agctgcagct gcaggccctg 300 cagcagaacg gctcctccgt gctgtccgag gacaagtcca agaggctgaa caccatcctg 360 aacaccatgt ccaccatcta ctccaccggc aaggtgtgca accccgacaa cccccaggag 420 tgcctgctgc tggagcccgg cctgaacgag atcatggcca actccctgga ctacaacgag 480 aggctgtggg cctgggagtc ctggaggtcc gaggtgggca agcagctgag gcccctgtac 540 gaggagtacg tggtgctgaa gaacgagatg gccagggcca accactacga ggactacggc 600 gactactgga ggggcgacta cgaggtgaac ggcgtggacg gctacgacta ctccaggggc 660 cagctgatcg aggacgtgga gcacaccttc gaggagatca agcccctgta cgagcacctg 720 cacgcctacg tgagggccaa gctgatgaac gcctacccct cctacatctc ccccatcggc 780 tgcctgcccg cccacctgct gggcgacatg tggggcaggt tctggaccaa cctgtactcc 840 ctgaccgtgc ccttcggcca gaagcccaac atcgacgtga ccgacgccat ggtggaccag 900 gcctgggacg cccagaggat cttcaaggag gccgagaagt tcttcgtgtc cgtgggcctg 960 cccaacatga cccagggctt ctgggagaac tccatgctga ccgaccccgg caacgtgcag 1020 aaggccgtgt gccaccccac cgcctgggac ctgggcaagg gcgacttcag gatcctgatg 1080 tgcaccaagg tgaccatgga cgacttcctg accgcccaca acgagatggg caacatccag 1140 tacgacatgg cctacgccgc ccagcccttc ctgctgagga acggcgccaa cgagggcttc 1200 cacgaggccg tgggcgagat catgtccctg tccgccgcca cccccaagca cctgaagtcc 1260 atcggcctgc tgtcccccga cttccaggag gacaacgaga ccgagatcaa cttcctgctg 1320 aagcaggccc tgaccatcgt gggcaccctg cccttcacct acatgctgga gaagtggagg 1380 tggatggtgt tcaagggcga gatccccaag gaccagtgga tgaagaagtg gtgggagatg 1440 aagagggaga tcgtgggcgt ggtggagccc gtgccccacg acgagaccta ctgcgacccc 1500 gcctccctgt tccacgtgtc caacgactac tccttcatca ggtactacac caggaccctg 1560 taccagttcc agttccagga ggccctgtgc caggccgcca agcacgaggg ccccctgcac 1620 aagtgcgaca tctccaactc caccgaggcc ggccagaagc tgttcaacat gctgaggctg 1680 ggcaagtccg agccctggac cctggccctg gagaacgtgg tgggcgccaa gaacatgaac 1740 gtgaggcccc tgctgaacta cttcgagccc ctgttcacct ggctgaagga ccagaacaag 1800 aactccttcg tgggctggtc caccgactgg tccccctacg ccgaccagtc catcaaggtg 1860 aggatctccc tgaagtccgc cctgggcgac aaggcctacg agtggaacga caacgagatg 1920 tacctgttca ggtcctccgt ggcctacgcc atgaggcagt acttcctgaa ggtgaagaac 1980 cagatgatcc tgttcggcga ggaggacgtg agggtggcca acctgaagcc caggatctcc 2040 ttcaacttct tcgtgaccgc ccccaagaac gtgtccgaca tcatccccag gaccgaggtg 2100 gagaaggcca tcaggatgtc caggtccagg atcaacgacg ccttcaggct gaacgacaac 2160 tccctggagt tcctgggcat ccagcccacc ctgggccccc ccaaccagcc ccccgtgtcc 2220 gagcccaagt cctccgacaa gacccacacc tcccccccct cccccgcccc cgagctgctg 2280 ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatctccagg 2340 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccccga ggtgaagttc 2400 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 2460 taccactcca cctacagggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 2520 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 2580 atctccaagg ccaagggcca gcccagggag ccccaggtgt acaccctgcc cccctccagg 2640 gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 2700 gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 2760 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 2820 aggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 2880 tacacccaga agtccctgtc cctgtccccc ggc 2913 <210> 250 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(26) <223> SARS-CoV-2 M protein (64-86) <400> 250 Lys Lys Lys Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile 1 5 10 15 Thr Gly Gly Ile Ala Ile Ala Met Ala Cys 20 25 <210> 251 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(18) <223> SARS-CoV-2 M protein (69-83) <400> 251 Lys Lys Lys Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ala <210> 252 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(21) <223> SARS-CoV-2 E (1-18) <400> 252 Lys Lys Lys Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile 1 5 10 15 Val Asn Ser Val Leu 20 <210> 253 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> SARS-CoV-2 N 73-90 <400> 253 Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg 1 5 10 15 Arg Ala <210> 254 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 N 55-90 <400> 254 Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln 1 5 10 15 Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr 20 25 30 Tyr Arg Arg Ala 35 <210> 255 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(54) <223> SARS-CoV-2 N 37-90 <400> 255 Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp 1 5 10 15 Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg 20 25 30 Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile 35 40 45 Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala 50 <210> 256 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(72) <223> SARS-CoV-2 N 19-90 <400> 256 Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly 1 5 10 15 Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala 20 25 30 Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe 35 40 45 Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp 50 55 60 Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala 65 70 <210> 257 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(90) <223> SARS-CoV-2 N 1-90 <400> 257 Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr 1 5 10 15 Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg 20 25 30 Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn 35 40 45 Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu 50 55 60 Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro 65 70 75 80 Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala 85 90 <210> 258 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 N 73-108 <400> 258 Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg 1 5 10 15 Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu 20 25 30 Ser Pro Arg Trp 35 <210> 259 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> SARS-CoV-2 N 160-178 <400> 259 Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 260 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> SARS-CoV-2 N 142-178 <400> 260 Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile 1 5 10 15 Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala 20 25 30 Glu Gly Ser Arg Gly 35 <210> 261 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(54) <223> SARS-CoV-2 N 125-178 <400> 261 Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn 1 5 10 15 Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala 20 25 30 Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr 35 40 45 Ala Glu Gly Ser Arg Gly 50 <210> 262 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(57) <223> SARS-CoV-2 N 125-178 <400> 262 Lys Lys Lys Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly 1 5 10 15 Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn 20 25 30 Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys 35 40 45 Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly 50 55 <210> 263 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(70) <223> SARS-CoV-2 N 109-178 <400> 263 Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly 1 5 10 15 Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn 20 25 30 Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala 35 40 45 Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr 50 55 60 Ala Glu Gly Ser Arg Gly 65 70 <210> 264 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(88) <223> SARS-CoV-2 N 91-178 <400> 264 Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro 1 5 10 15 Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro 20 25 30 Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala 35 40 45 Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn 50 55 60 Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly 65 70 75 80 Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly 85 <210> 265 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 N 160-195 <400> 265 Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly 1 5 10 15 Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg 20 25 30 Asn Ser Ser Arg 35 <210> 266 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(39) <223> SARS-CoV-2 N 160-195 <400> 266 Lys Lys Lys Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr 1 5 10 15 Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser 20 25 30 Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg 35 <210> 267 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> SARS-CoV-2 N 249-266 <400> 267 Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala 1 5 10 15 Thr Lys <210> 268 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 N 231-266 <400> 268 Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val 1 5 10 15 Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg 20 25 30 Thr Ala Thr Lys 35 <210> 269 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(54) <223> SARS-CoV-2 N 213-266 <400> 269 Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn 1 5 10 15 Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln 20 25 30 Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln 35 40 45 Lys Arg Thr Ala Thr Lys 50 <210> 270 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(57) <223> SARS-CoV-2 N 213-266 <400> 270 Lys Lys Lys Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp 1 5 10 15 Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln 20 25 30 Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys 35 40 45 Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys 50 55 <210> 271 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(71) <223> SARS-CoV-2 N 196-266 <400> 271 Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala 1 5 10 15 Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu 20 25 30 Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly 35 40 45 Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg 50 55 60 Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys 65 70 <210> 272 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(88) <223> SARS-CoV-2 N 179-266 <400> 272 Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser 1 5 10 15 Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met 20 25 30 Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg 35 40 45 Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln 50 55 60 Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro 65 70 75 80 Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys 85 <210> 273 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(35) <223> SARS-CoV-2 N 249-283 <400> 273 Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala 1 5 10 15 Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu 20 25 30 Gln Thr Gln 35 <210> 274 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> SARS-CoV-2 N 337-354 <400> 274 Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu 1 5 10 15 Leu Asn <210> 275 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 N 319-354 <400> 275 Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr 1 5 10 15 Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val 20 25 30 Ile Leu Leu Asn 35 <210> 276 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(54) <223> SARS-CoV-2 N 301-354 <400> 276 Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly 1 5 10 15 Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr 20 25 30 Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp 35 40 45 Gln Val Ile Leu Leu Asn 50 <210> 277 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(71) <223> SARS-CoV-2 N 284-354 <400> 277 Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys 1 5 10 15 His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe 20 25 30 Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu 35 40 45 Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys 50 55 60 Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn 65 70 <210> 278 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(88) <223> SARS-CoV-2 N 267-354 <400> 278 Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr 1 5 10 15 Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe 35 40 45 Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp 50 55 60 Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe 65 70 75 80 Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn 85 <210> 279 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> SARS-CoV-2 S 570-588 <400> 279 Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu 1 5 10 15 Asp Ile Thr <210> 280 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> SARS-CoV-2 S 552-588 <400> 280 Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg 1 5 10 15 Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu 20 25 30 Ile Leu Asp Ile Thr 35 <210> 281 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(58) <223> SARS-CoV-2 S 534-588 <400> 281 Lys Lys Lys Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu 1 5 10 15 Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe 20 25 30 Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp 35 40 45 Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr 50 55 <210> 282 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(74) <223> SARS-CoV-2 S 518-588 <400> 282 Lys Lys Lys Leu His Ala Pro Ala Thr Val Ser Gly Pro Lys Lys Ser 1 5 10 15 Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu 20 25 30 Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe 35 40 45 Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp 50 55 60 Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr 65 70 <210> 283 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(92) <223> SARS-CoV-2 S 500-588 <400> 283 Lys Lys Lys Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 1 5 10 15 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Ser Gly Pro Lys 20 25 30 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Asn Phe Asn 35 40 45 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 50 55 60 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 65 70 75 80 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr 85 90 <210> 284 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> SARS-CoV-2 S 573-604 <400> 284 Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr 1 5 10 15 Pro Ser Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr 20 25 30 <210> 285 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> SARS-CoV-2 S 659-678 <400> 285 Ser Tyr Glu Ser Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Ser Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Gln Thr Gln Thr 20 <210> 286 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(38) <223> SARS-CoV-2 S 641-678 <400> 286 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Ser Leu Ile Gly Ala Glu His Val 1 5 10 15 Asn Asn Ser Tyr Glu Ser Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Ser Ala 20 25 30 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr 35 <210> 287 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(59) <223> SARS-CoV-2 S 623-678 <400> 287 Lys Lys Lys Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val 1 5 10 15 Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Ser Leu Ile 20 25 30 Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Ser Asp Ile Pro Ile Gly 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr 50 55 <210> 288 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(72) <223> SARS-CoV-2 S 607-678 <400> 288 Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Ser Thr Glu Val Pro Val 1 5 10 15 Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr 20 25 30 Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Ser Leu Ile Gly Ala Glu 35 40 45 His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Ser Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr 65 70 <210> 289 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(20) <223> SARS-CoV-2 S 589-678 <400> 289 Lys Lys Lys Pro Ser Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly 1 5 10 15 Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Ser 20 25 30 Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp 35 40 45 Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Ser 50 55 60 Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Ser Asp Ile Pro 65 70 75 80 Ile Gly Ala Gly Ile Ser Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr 85 90 <210> 290 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 S 661-696 <400> 290 Glu Ser Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Ser Ala Ser Tyr Gln Thr 1 5 10 15 Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile 20 25 30 Ile Ala Tyr Thr 35 <210> 291 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> SARS-CoV-2 S 750-766 <400> 291 Ser Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Ser Thr Gln Leu Asn 1 5 10 15 Arg Ala <210> 292 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 S 731-766 <400> 292 Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Ser Thr Met Tyr Ile Ser Gly Asp Ser 1 5 10 15 Thr Glu Ser Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Ser Thr Gln 20 25 30 Leu Asn Arg Ala 35 <210> 293 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(57) <223> SARS-CoV-2 S 713-766 <400> 293 Lys Lys Lys Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu 1 5 10 15 Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Ser Thr Met Tyr 20 25 30 Ile Ser Gly Asp Ser Thr Glu Ser Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly 35 40 45 Ser Phe Ser Thr Gln Leu Asn Arg Ala 50 55 <210> 294 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(70) <223> SARS-CoV-2 S 697-766 <400> 294 Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile 1 5 10 15 Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro 20 25 30 Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Ser Thr Met Tyr Ile Ser Gly 35 40 45 Asp Ser Thr Glu Ser Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Ser 50 55 60 Thr Gln Leu Asn Arg Ala 65 70 <210> 295 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(91) <223> SARS-CoV-2 S 679-766 <400> 295 Lys Lys Lys Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser 1 5 10 15 Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr 20 25 30 Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr 35 40 45 Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Ser Thr 50 55 60 Met Tyr Ile Ser Gly Asp Ser Thr Glu Ser Ser Asn Leu Leu Leu Gln 65 70 75 80 Tyr Gly Ser Phe Ser Thr Gln Leu Asn Arg Ala 85 90 <210> 296 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(38) <223> SARS-CoV-2 S 767-804 <400> 296 Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe 1 5 10 15 Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly 20 25 30 Gly Phe Asn Phe Ser Gln 35 <210> 297 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(38) <223> SARS-CoV-2 S 821-858 <400> 297 Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln 1 5 10 15 Tyr Gly Asp Ser Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Ser Ala 20 25 30 Gln Lys Phe Asn Gly Leu 35 <210> 298 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> SARS-CoV-2 S 910-927 <400> 298 Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn 1 5 10 15 Gln Phe <210> 299 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 S 892-927 <400> 299 Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn 1 5 10 15 Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile 20 25 30 Ala Asn Gln Phe 35 <210> 300 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(57) <223> SARS-CoV-2 S 875-927 <400> 300 Lys Lys Lys Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp 1 5 10 15 Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met 20 25 30 Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu 35 40 45 Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe 50 55 <210> 301 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(70) <223> SARS-CoV-2 S 858-927 <400> 301 Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly 20 25 30 Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg 35 40 45 Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ala Asn Gln Phe 65 70 <210> 302 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(91) <223> SARS-CoV-2 S 840-927 <400> 302 Lys Lys Lys Ser Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Ser Ala 1 5 10 15 Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu 20 25 30 Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser 35 40 45 Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met 50 55 60 Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu 65 70 75 80 Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe 85 90 <210> 303 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 S 910-945 <400> 303 Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn 1 5 10 15 Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Ser Ala Leu 35 <210> 304 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> SARS-CoV-2 S 998-1015 <400> 304 Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile 1 5 10 15 Arg Ala <210> 305 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 S 980-1015 <400> 305 Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg 1 5 10 15 Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln 20 25 30 Leu Ile Arg Ala 35 <210> 306 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(57) <223> SARS-CoV-2 S 962-1015 <400> 306 Lys Lys Lys Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser 1 5 10 15 Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu 20 25 30 Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr 35 40 45 Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala 50 55 <210> 307 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(70) <223> SARS-CoV-2 S 946-1015 <400> 307 Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr 1 5 10 15 Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu 20 25 30 Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile 35 40 45 Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr 50 55 60 Gln Gln Leu Ile Arg Ala 65 70 <210> 308 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(91) <223> SARS-CoV-2 S 928-1015 <400> 308 Lys Lys Lys Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala 20 25 30 Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala 35 40 45 Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu 50 55 60 Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu 65 70 75 80 Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala 85 90 <210> 309 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 S 998-1033 <400> 309 Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile 1 5 10 15 Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met 20 25 30 Ser Glu Ser Val 35 <210> 310 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> SARS-CoV-2 S 1086-1103 <400> 310 Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His 1 5 10 15 Trp Phe <210> 311 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 S 1068-1103 <400> 311 Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Ser His 1 5 10 15 Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly 20 25 30 Thr His Trp Phe 35 <210> 312 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(57) <223> SARS-CoV-2 S 1050-1103 <400> 312 Lys Lys Lys Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe 1 5 10 15 Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala 20 25 30 Pro Ala Ile Ser His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val 35 40 45 Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe 50 55 <210> 313 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(70) <223> SARS-CoV-2 S 1134-1103 <400> 313 Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Ser Gly Lys Gly Tyr His Leu 1 5 10 15 Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val 20 25 30 Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile 35 40 45 Ser His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser 50 55 60 Asn Gly Thr His Trp Phe 65 70 <210> 314 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(88) <223> SARS-CoV-2 S 1016-1103 <400> 314 Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Ser Gly Lys Gly Tyr 20 25 30 His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu 35 40 45 His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro 50 55 60 Ala Ile Ser His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe 65 70 75 80 Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe 85 <210> 315 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> SARS-CoV-2 S 498-514 <400> 315 Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu 1 5 10 15 Ser <210> 316 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(38) <223> SARS-CoV-2 S 480-514 <400> 316 Lys Lys Lys Ser Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Ser Tyr Phe Pro Leu 1 5 10 15 Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr 20 25 30 Arg Val Val Val Leu Ser 35 <210> 317 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(54) <223> SARS-CoV-2 S 464-514 <400> 317 Lys Lys Lys Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly 1 5 10 15 Ser Thr Pro Ser Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Ser Tyr Phe Pro Leu 20 25 30 Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr 35 40 45 Arg Val Val Val Leu Ser 50 <210> 318 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(70) <223> SARS-CoV-2 S 448-514 <400> 318 Lys Lys Lys Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn 1 5 10 15 Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly 20 25 30 Ser Thr Pro Ser Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Ser Tyr Phe Pro Leu 35 40 45 Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr 50 55 60 Arg Val Val Val Leu Ser 65 70 <210> 319 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(84) <223> SARS-CoV-2 S 434-514 <400> 319 Lys Lys Lys Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 20 25 30 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 35 40 45 Pro Ser Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Ser Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 50 55 60 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 65 70 75 80 Val Val Leu Ser <210> 320 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> SARS-CoV-2 S 1086-1121 <400> 320 Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His 1 5 10 15 Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr 20 25 30 Asp Asn Thr Phe 35 <210> 321 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> SARS-CoV-2 S 1164-1183 <400> 321 Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile 1 5 10 15 Gln Lys Glu Ile 20 <210> 322 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(43) <223> SARS-CoV-2 S 1144-1183 <400> 322 Lys Lys Lys Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe 1 5 10 15 Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile 20 25 30 Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile 35 40 <210> 323 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(63) <223> SARS-CoV-2 S 1124-1183 <400> 323 Lys Lys Lys Gly Asn Ser Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr 1 5 10 15 Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu 20 25 30 Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp 35 40 45 Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile 50 55 60 <210> 324 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(83) <223> SARS-CoV-2 S 1104-1183 <400> 324 Lys Lys Lys Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr 1 5 10 15 Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Ser Asp Val Val Ile Gly Ile 20 25 30 Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe 35 40 45 Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val 50 55 60 Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln 65 70 75 80 Lys Glu Ile <210> 325 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(38) <223> SARS-CoV-2 S 1166-1203 <400> 325 Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys 1 5 10 15 Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu 20 25 30 Ile Asp Leu Gln Glu Leu 35 <210> 326 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> SARS-CoV-2 S 1213-1233 <400> 326 Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val 1 5 10 15 Met Val Thr Ile Met 20 <210> 327 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(39) <223> SARS-CoV-2 S 1195-1233 <400> 327 Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile 1 5 10 15 Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala 20 25 30 Ile Val Met Val Thr Ile Met 35 <210> 328 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> SARS-CoV-2 Orf9b 34-50 <400> 328 Gln Asn Asn Val Gly Pro Lys Val Tyr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Gly 1 5 10 15 Ser <210> 329 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> SARS-CoV-2 Orf9b 17-50 <400> 329 Pro Gln Ile Gln Leu Ala Val Thr Arg Met Glu Asn Ala Val Gly Arg 1 5 10 15 Asp Gln Asn Asn Val Gly Pro Lys Val Tyr Pro Ile Ile Leu Arg Leu 20 25 30 Gly Ser <210> 330 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(53) <223> SARS-CoV-2 Orf9b 1-50 <400> 330 Lys Lys Lys Met Asp Pro Lys Ile Ser Glu Met His Pro Ala Leu Arg 1 5 10 15 Leu Val Asp Pro Gln Ile Gln Leu Ala Val Thr Arg Met Glu Asn Ala 20 25 30 Val Gly Arg Asp Gln Asn Asn Val Gly Pro Lys Val Tyr Pro Ile Ile 35 40 45 Leu Arg Leu Gly Ser 50 <210> 331 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(38) <223> SARS-CoV-2 Orf9b 34-68 <400> 331 Lys Lys Lys Gln Asn Asn Val Gly Pro Lys Val Tyr Pro Ile Ile Leu 1 5 10 15 Arg Leu Gly Ser Pro Leu Ser Leu Asn Met Ala Arg Lys Thr Leu Asn 20 25 30 Ser Leu Glu Asp Lys Ala 35 <210> 332 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> SARS-CoV-2 Orf9b 82-97 <400> 332 Ala Thr Thr Glu Glu Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Val Thr Val Lys 1 5 10 15 <210> 333 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> SARS-CoV-2 Orf9b 66-97 <400> 333 Asp Lys Ala Phe Gln Leu Thr Pro Ile Ala Val Gln Met Thr Lys Leu 1 5 10 15 Ala Thr Thr Glu Glu Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Val Thr Val Lys 20 25 30 <210> 334 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(50) <223> SARS-CoV-2 Orf9b 51-97 <400> 334 Lys Lys Lys Pro Leu Ser Leu Asn Met Ala Arg Lys Thr Leu Asn Ser 1 5 10 15 Leu Glu Asp Lys Ala Phe Gln Leu Thr Pro Ile Ala Val Gln Met Thr 20 25 30 Lys Leu Ala Thr Thr Glu Glu Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Val Thr 35 40 45 Val Lys 50 <210> 335 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(36) <223> SARS-CoV-2 S497-508_mod <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(36) <223> SARS-CoV-2 S497-509_mod <400> 335 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr 20 25 30 Gln Pro Cys Arg 35 <210> 336 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(53) <223> SARS-CoV-2 S480-508_mod <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(53) <223> SARS-CoV-2 S480-509_mod <400> 336 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ser Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Ser 20 25 30 Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Cys Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly 35 40 45 Tyr Gln Pro Cys Arg 50 <210> 337 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(54) <223> SARS-CoV-2 S361-391_mod <400> 337 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr 20 25 30 Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Ser Tyr Gly Val Ser Pro Thr 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Leu Cys 50 <210> 338 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> SARS-CoV-2 S361-391_mod <220> <221> PEPTIDE <222> (32)..(35) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (35)..(35) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (36)..(54) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 338 Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr 1 5 10 15 Phe Lys Ser Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg 35 40 45 Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 <210> 339 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(49) <223> SARS-CoV-2 S363-388_mod <400> 339 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser 20 25 30 Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Ser Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu 35 40 45 Cys <210> 340 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> SARS-CoV-2 S363-388_mod <220> <221> PEPTIDE <222> (27)..(30) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (30)..(30) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (31)..(49) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 340 Cys Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 1 5 10 15 Ser Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser 20 25 30 Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu 35 40 45 Phe <210> 341 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(88) <223> SARS-CoV-2 S443-507 <400> 341 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr 20 25 30 Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp 35 40 45 Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val 50 55 60 Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro 65 70 75 80 Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro 85 <210> 342 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(65) <223> SARS-CoV-2 S443-507 <220> <221> PEPTIDE <222> (66)..(69) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (69)..(69) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (70)..(88) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 342 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 1 5 10 15 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 20 25 30 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 35 40 45 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 50 55 60 Pro Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val 65 70 75 80 His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 85 <210> 343 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(88) <223> SARS-CoV-2 S443-507_mod <400> 343 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Cys Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr 20 25 30 Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp 35 40 45 Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Ser Asn Gly Val 50 55 60 Glu Gly Phe Asn Ser Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro 65 70 75 80 Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Cys 85 <210> 344 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(65) <223> SARS-CoV-2 S443-507_mod <220> <221> PEPTIDE <222> (66)..(69) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> SITE <222> (69)..(69) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (70)..(88) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 344 Cys Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 1 5 10 15 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 20 25 30 Ala Gly Ser Thr Pro Ser Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Ser Tyr Phe 35 40 45 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 50 55 60 Cys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val 65 70 75 80 His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 85 <210> 345 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(31) <223> SARS-CoV-2 S957-984 (Th/CTL epitope) <400> 345 Lys Lys Lys Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn 1 5 10 15 Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu 20 25 30 <210> 346 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(30) <223> SARS-CoV-2 S891-917 (Th epitope) <400> 346 Lys Lys Lys Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala 1 5 10 15 Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr 20 25 30 <210> 347 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(30) <223> SARS-CoV-2 N305-331 (Th/CTL epitope) <400> 347 Lys Lys Lys Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met 1 5 10 15 Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu 20 25 30 <210> 348 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(36) <223> SARS-CoV-2 S996-1028 (Th/CTL epitope) <400> 348 Lys Lys Lys Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 1 5 10 15 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu 20 25 30 Ala Ala Thr Lys 35 <210> 349 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(19) <223> SARS-CoV-2 S1185-1200 (CTL epitope) <400> 349 Lys Lys Lys Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu 1 5 10 15 Ile Asp Leu <210> 350 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(22) <223> SARS-CoV-2 N351-369 (CTL epitope) <400> 350 Lys Lys Lys Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe 1 5 10 15 Pro Pro Thr Glu Pro Lys 20 <210> 351 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(15) <223> SARS-CoV-2 N219-230 (CTL epitope) <400> 351 Lys Lys Lys Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu 1 5 10 15 <210> 352 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(2) <223> KK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(46) <223> SARS-CoV-2 S 1191-1234 <400> 352 Lys Lys Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe 20 25 30 Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu 35 40 45 <210> 353 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(26) <223> SARS-CoV-2 S 1251-1273 <400> 353 Lys Lys Lys Gly Ser Ser Ser Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro 1 5 10 15 Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 20 25 <210> 354 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(46) <223> SARS-CoV-2 S 1181-1223 <400> 354 Lys Lys Lys Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu 1 5 10 15 Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr 20 25 30 Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly 35 40 45 <210> 355 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(431) <223> S-RBD-Fc Fusion protein <400> 355 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 260 265 270 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val 275 280 285 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 290 295 300 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 305 310 315 320 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 325 330 335 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 340 345 350 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 355 360 365 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 370 375 380 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 385 390 395 400 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 405 410 415 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 420 425 430 <210> 356 <211> 971 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(971) <223> ACE2-ECD-Fc Fusion protein <400> 356 Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala 1 5 10 15 Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe 20 25 30 Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp 35 40 45 Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn 50 55 60 Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala 65 70 75 80 Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln 85 90 95 Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys 100 105 110 Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser 115 120 125 Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu 130 135 140 Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu 165 170 175 Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg 180 185 190 Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu 195 200 205 Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu 210 215 220 Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu 225 230 235 240 His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile 245 250 255 Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly 260 265 270 Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys 275 280 285 Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala 290 295 300 Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu 305 310 315 320 Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro 325 330 335 Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp 355 360 365 Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala 370 375 380 Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe 385 390 395 400 His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys 405 410 415 His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn 420 425 430 Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly 435 440 445 Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe 450 455 460 Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met 465 470 475 480 Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe 500 505 510 Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala 515 520 525 Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile 530 535 540 Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu 545 550 555 560 Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala 565 570 575 Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe 580 585 590 Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr 595 600 605 Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu 610 615 620 Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met 625 630 635 640 Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu 645 650 655 Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val 660 665 670 Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro 675 680 685 Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile 690 695 700 Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn 705 710 715 720 Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln 725 730 735 Pro Pro Val Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 740 745 750 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 755 760 765 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 770 775 780 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 785 790 795 800 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 805 810 815 Arg Glu Glu Gln Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 820 825 830 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 835 840 845 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 850 855 860 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 865 870 875 880 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 885 890 895 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 900 905 910 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 915 920 925 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 930 935 940 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 945 950 955 960 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 965 970 <210> 357 <211> 1293 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1293) <223> S-RBD-Fc Fusion protein <400> 357 aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccaccaggtt cgcctccgtg 60 tacgcctgga acaggaagag gatctccaac tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac 120 tccgcctcct tctccacctt caagtgctac ggcgtgtccc ccaccaagct gaacgacctg 180 tgcttcacca acgtgtacgc cgactccttc gtgatcaggg gcgacgaggt gaggcagatc 240 gcccccggcc agaccggcaa gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcacc 300 ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac ctggactcca aggtgggcgg caactacaac 360 tacctgtaca ggctgttcag gaagtccaac ctgaagccct tcgagaggga catctccacc 420 gagatctacc aggccggctc caccccctgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc 480 cccctgcagt cctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gctaccagcc ctacagggtg 540 gtggtgctgt ccttcgagct gctgcacgcc cccgccaccg tgtgcggccc caagaagtcc 600 gagcccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg 660 ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatctccagg 720 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccccga ggtgaagttc 780 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 840 taccactcca cctacagggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 900 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 960 atctccaagg ccaagggcca gcccagggag ccccaggtgt acaccctgcc cccctccagg 1020 gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 1080 gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1140 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 1200 aggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1260 tacacccaga agtccctgtc cctgtccccc ggc 1293 <210> 358 <211> 2913 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2913) <223> ACE2-ECD-Fc Fusion protein <400> 358 atgtcctcct cctcctggct gctgctgtcc ctggtggccg tgaccgccgc ccagtccacc 60 atcgaggagc aggccaagac cttcctggac aagttcaacc acgaggccga ggacctgttc 120 taccagtcct ccctggcctc ctggaactac aacaccaaca tcaccgagga gaacgtgcag 180 aacatgaaca acgccggcga caagtggtcc gccttcctga aggagcagtc caccctggcc 240 cagatgtacc ccctgcagga gatccagaac ctgaccgtga agctgcagct gcaggccctg 300 cagcagaacg gctcctccgt gctgtccgag gacaagtcca agaggctgaa caccatcctg 360 aacaccatgt ccaccatcta ctccaccggc aaggtgtgca accccgacaa cccccaggag 420 tgcctgctgc tggagcccgg cctgaacgag atcatggcca actccctgga ctacaacgag 480 aggctgtggg cctgggagtc ctggaggtcc gaggtgggca agcagctgag gcccctgtac 540 gaggagtacg tggtgctgaa gaacgagatg gccagggcca accactacga ggactacggc 600 gactactgga ggggcgacta cgaggtgaac ggcgtggacg gctacgacta ctccaggggc 660 cagctgatcg aggacgtgga gcacaccttc gaggagatca agcccctgta cgagcacctg 720 cacgcctacg tgagggccaa gctgatgaac gcctacccct cctacatctc ccccatcggc 780 tgcctgcccg cccacctgct gggcgacatg tggggcaggt tctggaccaa cctgtactcc 840 ctgaccgtgc ccttcggcca gaagcccaac atcgacgtga ccgacgccat ggtggaccag 900 gcctgggacg cccagaggat cttcaaggag gccgagaagt tcttcgtgtc cgtgggcctg 960 cccaacatga cccagggctt ctgggagaac tccatgctga ccgaccccgg caacgtgcag 1020 aaggccgtgt gccaccccac cgcctgggac ctgggcaagg gcgacttcag gatcctgatg 1080 tgcaccaagg tgaccatgga cgacttcctg accgcccacc acgagatggg ccacatccag 1140 tacgacatgg cctacgccgc ccagcccttc ctgctgagga acggcgccaa cgagggcttc 1200 cacgaggccg tgggcgagat catgtccctg tccgccgcca cccccaagca cctgaagtcc 1260 atcggcctgc tgtcccccga cttccaggag gacaacgaga ccgagatcaa cttcctgctg 1320 aagcaggccc tgaccatcgt gggcaccctg cccttcacct acatgctgga gaagtggagg 1380 tggatggtgt tcaagggcga gatccccaag gaccagtgga tgaagaagtg gtgggagatg 1440 aagagggaga tcgtgggcgt ggtggagccc gtgccccacg acgagaccta ctgcgacccc 1500 gcctccctgt tccacgtgtc caacgactac tccttcatca ggtactacac caggaccctg 1560 taccagttcc agttccagga ggccctgtgc caggccgcca agcacgaggg ccccctgcac 1620 aagtgcgaca tctccaactc caccgaggcc ggccagaagc tgttcaacat gctgaggctg 1680 ggcaagtccg agccctggac cctggccctg gagaacgtgg tgggcgccaa gaacatgaac 1740 gtgaggcccc tgctgaacta cttcgagccc ctgttcacct ggctgaagga ccagaacaag 1800 aactccttcg tgggctggtc caccgactgg tccccctacg ccgaccagtc catcaaggtg 1860 aggatctccc tgaagtccgc cctgggcgac aaggcctacg agtggaacga caacgagatg 1920 tacctgttca ggtcctccgt ggcctacgcc atgaggcagt acttcctgaa ggtgaagaac 1980 cagatgatcc tgttcggcga ggaggacgtg agggtggcca acctgaagcc caggatctcc 2040 ttcaacttct tcgtgaccgc ccccaagaac gtgtccgaca tcatccccag gaccgaggtg 2100 gagaaggcca tcaggatgtc caggtccagg atcaacgacg ccttcaggct gaacgacaac 2160 tccctggagt tcctgggcat ccagcccacc ctgggccccc ccaaccagcc ccccgtgtcc 2220 gagcccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg 2280 ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatctccagg 2340 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccccga ggtgaagttc 2400 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 2460 taccactcca cctacagggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 2520 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 2580 atctccaagg ccaagggcca gcccagggag ccccaggtgt acaccctgcc cccctccagg 2640 gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 2700 gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 2760 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 2820 aggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 2880 tacacccaga agtccctgtc cctgtccccc ggc 2913 <210> 359 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(213) <223> S-RBD-His Fusion protein <400> 359 His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asn Ile Thr 1 5 10 15 Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser 20 25 30 Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr 35 40 45 Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly 50 55 60 Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly 85 90 95 Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe 100 105 110 Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val 115 120 125 Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu 130 135 140 Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser 145 150 155 160 Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln 165 170 175 Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg 180 185 190 Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys 195 200 205 Gly Pro Lys Lys Ser 210 <210> 360 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <220> <221> misc_feature <222> (1)..(639) <223> S-RBD-His Fusion protein <400> 360 caccaccacc accaccacga gaacctgtac ttccagggca acatcaccaa cctgtgcccc 60 ttcggcgagg tgttcaacgc caccaggttc gcctccgtgt acgcctggaa caggaagagg 120 atctccaact gcgtggccga ctactccgtg ctgtacaact ccgcctcctt ctccaccttc 180 aagtgctacg gcgtgtcccc caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc 240 gactccttcg tgatcagggg cgacgaggtg aggcagatcg cccccggcca gaccggcaag 300 atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat cgcctggaac 360 tccaacaacc tggactccaa ggtgggcggc aactacaact acctgtacag gctgttcagg 420 aagtccaacc tgaagccctt cgagagggac atctccaccg agatctacca ggccggctcc 480 accccctgca acggcgtgga gggcttcaac tgctacttcc ccctgcagtc ctacggcttc 540 cagcccacca acggcgtggg ctaccagccc tacagggtgg tggtgctgtc cttcgagctg 600 ctgcacgccc ccgccaccgt gtgcggcccc aagaagtcc 639 <210> 361 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <223> KKK- linker <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(26) <223> SARS-CoV-2 M 89-111 (Th/CTL epitope) <400> 361 Lys Lys Lys Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Arg 1 5 10 15 Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser 20 25 <210> 362 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 S 975-983 <400> 362 Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg 1 5 <210> 363 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> SARS-CoV-2 N 305-322 <400> 363 Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile 1 5 10 15 Gly Met <210> 364 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 S 1000-1008 <400> 364 Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 1 5 <210> 365 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> SARS-CoV-2 S 991-1000 <400> 365 Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 366 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> SARS-CoV-2 M 89-97 <400> 366 Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe Ile 1 5 <210> 367 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> SARS-CoV-2 M 97-111 <400> 367 Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser 1 5 10 15 <210> 368 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer E-Sarbeco-F1 <400> 368 acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26 <210> 369 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer E-Sarbeco-R2 <400> 369 atattgcagc agtacgcaca ca 22 <210> 370 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe E-Sarbeco-P1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> FAM, 6-carboxyfluorescein <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> BBQ, blackberry quencher <400> 370 acactagcca tccttactgc gcttcg 26

Claims (73)

  1. 다음을 포함하는 융합 단백질:
    a) 서열 식별 번호: 225 및 서열 식별 번호: 226로 구성된 군에서 선택된 SARS-CoV-2의 스파이크 (S) 단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD)으로부터 유래된 아미노산 서열;
    b) 서열 식별 번호: 166-225로 구성된 군에서 선택된 IgG 분자로부터 유래된 선택적 힌지 영역; 그리고
    c) 서열 식별 번호: 231-234로 구성된 군에서 선택된 IgG 분자의 Fc 단편,
    이때 (a)의 아미노산 서열은 (c) Fc 단편에 직접적으로, 또는 (b)의 선택적 힌지 영역을 통하여 공유적으로 연계된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때
    (c)의 Fc 단편은 서열 식별 번호: 232의 아미노산 서열을 갖고,
    선택적 힌지 영역은 서열 식별 번호: 166 또는 서열 식별 번호: 188의 아미노산 서열을 갖는, 융합 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 융합 단백질은 서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc, 서열 식별 번호: 236의 S1-RBDa-sFc, 그리고 서열 식별 번호: 355의 S1-RBD-Fc로 구성된 군에서 선택되는, 융합 단백질.
  4. 다음을 포함하는 COVID-19 백신 조성물:
    a) 청구항 3에 따른 융합 단백질; 그리고
    b) 약제학적으로 수용가능한 부형제.
  5. 청구항 4에 있어서, 이때 상기 융합 단백질은 열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc인, COVID-19 백신 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서, Th/CTL 펩티드를 더 포함하는, COVID-19 백신 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 이때 상기 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 1의 SARS-CoV-2 M 단백질, 서열 식별 번호: 6의 SARS-CoV-2 N 단백질, 서열 식별 번호: 20의 SARS-CoV-2 S 단백질, 병원체 단백질, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된, COVID-19 백신 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 이때
    a. SARS-CoV-2 M 단백질로부터 유래된 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 361이며;
    b. SARS-CoV-2 N 단백질로부터 유래된 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 9-16, 19, 153-160, 165, 347, 350, 351, 그리고 363로 구성된 군에서 선택되며;
    c. SARS-CoV-2 S 단백질로부터 유래된 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 35-36, 39-48, 145-152, 161-164, 345-346, 348, 362, 364, 그리고 365로 구성된 군에서 선택되며;
    d. 병원체 단백질로부터 유래된 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 49-100로 구성된 군에서 선택된, COVID-19 백신 조성물.
  9. 청구항 4에 있어서, 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 Th/CTL 펩티드 혼합물을 더 포함하는, COVID-19 백신 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 이때 각 Th/CTL 펩티드는 등가-중량의 양으로 해당 혼합물에 존재하는, COVID-19 백신 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 이때 Th/CTL 펩티드 혼합물의 총 중량에 대해 S1-RBD-sFc 단백질의 비율(w:w)은 88:12인, COVID-19 백신 조성물.
  12. 청구항 4에 있어서, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 어쥬번트, 완충제, 계면활성제, 유화제, pH 조절제, 염 용액, 보존제, 용매, 또는 이의 임의의 조합인, COVID-19 백신 조성물.
  13. 청구항 4에 있어서, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 CpG 올리고뉴클레오티드, 인산 알루미늄, 히스티딘, 히스티딘 HCl·H2O, 아르기닌 HCl, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트, 염산, 염화나트륨, 2-페녹시에탄올, 물, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된, COVID-19 백신 조성물.
  14. 다음을 포함하는 COVID-19 백신 조성물:
    a. 서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc 단백질;
    b. 서열 식별 번호: 9-16, 19, 35-36, 39-100, 145-165, 345-348, 350, 351, 362-365, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 Th/CTL 펩티드;
    c. 약제학적으로 수용가능한 부형제.
  15. 청구항 14에 있어서, 이때 (b)에서 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 혼합물인, COVID-19 백신 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 이때 각 Th/CTL 펩티드는 등가-중량의 양으로 해당 혼합물에 존재하는, COVID-19 백신 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 이때 Th/CTL 펩티드 혼합물의 총 중량에 대해 S1-RBD-sFc 단백질의 비율(w:w)은 88:12인, COVID-19 백신 조성물.
  18. 청구항 14에 있어서, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 어쥬번트, 완충제, 계면활성제, 유화제, pH 조절제, 염 용액, 보존제, 용매, 또는 이의 임의의 조합인, COVID-19 백신 조성물.
  19. 청구항 14에 있어서, 이때 상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 CpG 올리고뉴클레오티드, 인산 알루미늄, 히스티딘, 히스티딘 HCl·H2O, 아르기닌 HCl, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트, 염산, 염화나트륨, 2-페녹시에탄올, 물, 그리고 이의 임의의 조합인, COVID-19 백신 조성물.
  20. 청구항 14에 있어서, 이때
    상기 Th/CTL 펩티드는 서열 식별 번호: 345, 346, 347, 348, 361, 그리고 66의 혼합물이며, 이때 각 펩티드는 등가-중량의 양으로 이 혼합물에 존재하고;
    상기 약제학적으로 수용가능한 부형제는 물에서 CpG1 올리고뉴클레오티드, 인산 알루미늄, 히스티딘, 히스티딘 HClㆍH2O, 아르기닌 HCl, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트, 염산, 염화나트륨, 그리고 2-페녹시에탄올의 조합인, COVID-19 백신 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 이때
    서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc 단백질의 총량은 약 10μg ~ 약 200μg이며; 그리고
    Th/CTL 펩티드의 총량은 약 2μg ~ 약 25μg인, COVID-19 백신 조성물.
  22. 청구항 20에 있어서, 이때
    서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc 단백질의 총량은 약 17.6μg이며; 그리고
    Th/CTL 펩티드의 총량은 약 2.4μg인, COVID-19 백신 조성물.
  23. 청구항 20에 있어서, 이때
    서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc 단백질의 총량은 약 52.8μg이며; 그리고
    Th/CTL 펩티드의 총량은 약 7.2μg인, COVID-19 백신 조성물.
  24. 청구항 20에 있어서, 이때
    서열 식별 번호: 235의 S1-RBD-sFc 단백질의 총량은 약 176μg이며; 그리고
    Th/CTL 펩티드의 총량은 약 24μg인, COVID-19 백신 조성물.
  25. 대상체에서 COVID-19를 예방하는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 12에 따른 COVID-19 백신 조성물의 약제학적으로 유효량을 해당 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 약제학적으로 유효량의 상기 백신 조성물은 해당 대상체에게 2회 투여분량으로 투여되는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 백신 조성물의 제 1 투여분량이 해당 대상체에게 투여되고, 상기 백신 조성물의 제 2 투여분량은 제 1 투여분량이 투여된 후, 약 4주차 시점에 해당 대상체에게 투여되는, 방법.
  28. SARS-CoV-2에 대항하는 항체를 생성시키는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 14에 따른 백신 조성물의 약제학적으로 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  29. SARS-CoV-2 S 단백질의 S1-RBD 일부분 (서열 식별 번호: 226)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  30. 청구항 29에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 조성물.
  31. 청구항 1에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열로 형질감염된 세포주.
  32. 청구항 31에 있어서, 중국 헴스터 난소(CHO) 세포주인, 세포주.
  33. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 cDNA 서열은 S1-RBD-sFc를 인코딩하는 서열 식별 번호: 246, S1-RBDa-sFc를 인코딩하는 서열 식별 번호: 247, 그리고 S1-RBD-Fc를 인코딩하는 서열 식별 번호: 357로 구성된 군에서 선택되는, 세포주.
  34. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 cDNA 서열은 S1-RBD-sFc를 인코딩하는 서열 식별 번호: 246인, 세포주.
  35. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 cDNA 서열은 S1-RBDa-sFc를 인코딩하는 서열 식별 번호: 247인, 세포주.
  36. 청구항 31에 있어서, 이때 상기 cDNA 서열은 S1-RBD-Fc를 인코딩하는 서열 식별 번호: 357인, 세포주.
  37. SARS-CoV-2의 M 단백질 (서열 식별 번호: 1), N 단백질 (서열 식별 번호: 6), 그리고 S 단백질 (서열 식별 번호: 20)로부터 항원성 펩티드를 포함하는, COVID-19 바이러스 감염 검출 및 역학적 감시를 위한 혈청학적 진단 분석.
  38. 청구항 37에 있어서, 이때 상기 항원성 펩티드는 서열 식별 번호: 4-5, 17-18, 37-38, 259, 261, 263, 265, 266, 270, 281, 308, 321, 322, 323, 324, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 혈청학적 진단 분석.
  39. 청구항 37에 있어서, 이때 상기 항원성 펩티드는 서열 식별 번호: 5, 18, 38, 261, 266, 281, 322, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된, 혈청학적 진단 분석.
  40. SARS-CoV-2에 의한 감염을 검출하는, 다음을 포함하는 방법:
    a) 서열 식별 번호: 4-5, 17-18, 23-24, 26, 29-34, 37-38, 259, 261, 263, 265, 266, 270, 281, 308, 321, 322, 323, 그리고 324 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 항원성 펩티드를 고형 서포트에 부착시키고,
    b) 해당 환자로부터의 항체를 함유하는 생물학적 샘플에 (a)의 고형 서포트에 부착된 항원성 펩티드를 이들 펩티드에 대한 항체의 결합을 유도하는 조건 하에서 노출시키고, 그리고
    c) (b)의 고형 서포트에 부착된 펩티드에 결합된 항체가 존재하는 지를 검출한다.
  41. 청구항 40에 있어서, 이때 (a)의 항원성 펩티드는 서열 식별 번호: 5, 18, 38, 261, 266, 281, 322, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된, 혈청학적 진단 분석.
  42. 청구항 41에 있어서, 이때 상기 고형 서포트에 부착된 펩티드에 결합된 항체의 존재는 ELISA에 의해 평가되는, 혈청학적 진단 분석.
  43. 약 20개 또는 그 이상의 아미노산을 갖고, 다음 식으로 나타내는 S-RBD 펩티드 면역원 구조체:
    (Th)m-(A)n-(S1-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-X
    또는
    (S1-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-(A)n-(Th)m-X
    또는
    (Th)m-(A)n-(S1-RBD B 세포 에피토프 펩티드)-(A)n-(Th)m-X
    이때
    Th는 이질성 T 헬퍼 에피토프이며;
    A는 이질성 스페이서이며;
    (S1-RBD B 세포 에피토프 펩티드)는 S1-RBD (서열 식별 번호: 226)의 6~약 35개 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프 펩티드, 또는 또는 이의 변이체이며;
    X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이며;
    m은 1 ~ 약 4이며; 그리고
    n은 0 ~ 약 10이다.
  44. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 S1-RBD B 세포 에피토프 펩티드는 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 그리고 29-34로 구성된 군에서 선택된 에피토프를 국소적으로 속박시키는 내부-이황화결합을 형성하는, S1-RBD 펩티드 면역원 구조체.
  45. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 이질성 T 헬퍼는 서열 식별 번호: 49-100로 구성된 군에서 선택되는, S1-RBD 펩티드 면역원 구조체.
  46. 청구항 43에 있어서, 이때 S1-RBD B 세포 에피토프 펩티드는 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319로 구성된 군에서 선택되며, 상기 Th 에피토프는 서열 식별 번호: 49-100로 구성된 군에서 선택되는, S1-RBD 펩티드 면역원 구조체.
  47. 청구항 43에 있어서, 이때 상기 펩티드 면역원 구조체는 서열 식별 번호: 107-144로 구성된 군에서 선택되는, S1-RBD 펩티드 면역원 구조체.
  48. 다음을 포함하는 S1-RBD 펩티드 면역원 구조체:
    a. 서열 식별 번호: 226의 S1-RBD 서열에서 약 6 ~ 약 35개 아미노산 잔기를 포함하는 B 세포 에피토프;
    b. 서열 식별 번호: 49-100으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열, 그리고 이의 임의의 조합을 포함하는 이질성 T 헬퍼 에피토프; 그리고
    c. 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α,ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102), 그리고 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 식별 번호: 103), 그리고 이의 임의의 조합로 구성된 군에서 선택된 선택적 이질성 스페이서,
    이때 상기 B 세포 에피토프는 T 헬퍼 에피토프에 직접적으로, 또는 선택적 이질성 스페이서를 경유하여 공유적으로 연계된다.
  49. 청구항 48에 있어서, 이때 상기 B 세포 에피토프는 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319로 구성된 군에서 선택되는, S1-RBD 펩티드 면역원 구조체.
  50. 청구항 48에 있어서, 이때 선택적 이질성 스페이서는 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102), 또는 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 식별 번호:103)이며, 여기에서 Xaa는 임의의 아미노산인, S1-RBD 펩티드 면역원 구조체.
  51. 청구항 48에 있어서, 이때 상기 T 헬퍼 에피토프는 상기 B 세포 에피토프의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 공유적으로 연계되는, S1-RBD 펩티드 면역원 구조체.
  52. 청구항 48에 있어서, 이때 T 헬퍼 에피토프는 상기 B 세포 에피토프의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 선택적 이질성 스페이서를 통하여 공유적으로 연계된, S1-RBD 펩티드 면역원 구조체.
  53. 청구항 43에 따른 S1-RBD 펩티드 면역원 구조체를 포함하는 조성물.
  54. 다음을 포함하는 약제학적 조성물:
    a. 청구항 43에 따른 펩티드 면역원 구조체; 그리고
    b. 약제학적으로 수용가능한 전달 비히클 및/또는 어쥬번트.
  55. 청구항 54에 있어서, 이때
    a. S1-RBD B 세포 에피토프 펩티드는 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 그리고 315-319로 구성된 군에서 선택되며;
    b. 상기 이질성 T 헬퍼 에피토프는 서열 식별 번호: 49-100으로 구성된 군에서 선택되며; 그리고
    c. 상기 이질성 스페이서는 아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 식별 번호: 101), Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (서열 식별 번호: 102), 그리고 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (서열 식별 번호: 103), 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되며; 그리고
    이때 S1-RBD 펩티드 면역원 구조체는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되어 안정화된 면역자극성 복합체를 형성하는, 약제학적 조성물.
  56. 청구항 54에 있어서, 이때
    a. 상기 S1-RBD 펩티드 면역원 구조체는 서열 식별 번호: 107-144로 구성된 군에서 선택되며; 그리고
    이때 S1-RBD 펩티드 면역원 구조체는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)와 혼합되어 안정화된 면역자극성 복합체를 형성하는, 약제학적 조성물.
  57. 청구항 56에 있어서, 이때 상기 약제학적 조성물은 서열 식별 번호: 13, 39-41, 44, 161-165의 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 서열, 또는 이의 임의의 조합을 함유하는 별개 펩티드를 더 함유하는, 약제학적 조성물.
  58. 청구항 56에 있어서, 이때 상기 약제학적 조성물은 서열 식별 번호: 9-12, 14-16, 19, 35-36, 42-43, 45-48, 145-160의 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 서열, 또는 이의 임의의 조합을 함유하는 별개 펩티드를 더 함유하는, 약제학적 조성물.
  59. 청구항 56에 있어서, 이때 상기 약제학적 조성물은 다음을 더 함유하는, 약제학적 조성물:
    a. 서열 식별 번호: 13, 39-41, 44, 161-165의 내생성 SARS-CoV-2 Th 에피토프 서열, 또는 이의 임의의 조합을 함유하는 별개 펩티드; 그리고
    b. 서열 식별 번호: 9-12, 14-16, 19, 35-36, 42-43, 45-48, 145-160의 내생성 SARS-CoV-2 CTL 에피토프 서열, 또는 이의 임의의 조합을 함유하는 별개 펩티드.
  60. 청구항 54에 따른 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 S1-RBD에 대항하는 항체를 생성시키는 방법.
  61. 청구항 57에 따른 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 S1-RBD에 대항하는 항체를 생성시키는 방법.
  62. 청구항 58에 따른 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 S1-RBD에 대항하는 항체를 생성시키는 방법.
  63. 청구항 59에 따른 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 S1-RBD에 대항하는 항체를 생성시키는 방법.
  64. 서열 식별 번호: 23-24, 26-27, 29-34, 또는 226의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  65. 청구항 64에 있어서, S1-RBD 펩티드 면역원 구조체에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  66. 청구항 64에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 함유하는 조성물.
  67. COVID-19를 예방 및/또는 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 54에 따른 약제학적 조성물을 이 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  68. COVID-19를 예방 및/또는 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 57에 따른 약제학적 조성물을 이 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  69. COVID-19를 예방 및/또는 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 58에 따른 약제학적 조성물을 이 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  70. COVID-19를 예방 및/또는 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 59에 따른 약제학적 조성물을 이 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  71. 다음을 포함하는 융합 단백질:
    a) 서열 식별 번호: 228 및 서열 식별 번호: 229로 구성된 군에서 선택된 인간 수용체 ACE2 (ECD-hACE2)의 세포외 도메인(ECD)로부터 유래된 아미노산 서열;
    b) 서열 식별 번호: 166-225로 구성된 군에서 선택된 IgG 분자로부터 유래된 선택적 힌지 영역; 그리고
    c) 서열 식별 번호: 231-234로 구성된 군에서 선택된 IgG 분자의 Fc 단편,
    이때 (a)의 아미노산 서열은 (c) Fc 단편에 직접적으로, 또는 (b)의 선택적 힌지 영역을 통하여 공유적으로 연계된다.
  72. 청구항 71에 있어서, 이때
    (c)의 Fc 단편은 서열 식별 번호: 232의 아미노산 서열을 갖고, 그리고
    선택적 힌지 영역은 서열 식별 번호: 166 또는 서열 식별 번호: 188의 아미노산 서열을 갖는, 융합 단백질.
  73. 청구항 71에 있어서, 이때 상기 융합 단백질은 서열 식별 번호: 237의 ACE2-ECD-sFc, 서열 식별 번호: 238의 ACE2-ECDN-sFc, 그리고 서열 식별 번호: 356의 ACE2-ECD-Fc로 구성된 군에서 선택되는, 융합 단백질.
KR1020227031724A 2020-02-19 2021-02-19 코로나바이러스 질환, 2019 (covid-19)의 검출, 예방 및 치료용 기획된 펩티드 및 단백질 KR20220144829A (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062978596P 2020-02-19 2020-02-19
US62/978,596 2020-02-19
US202062990382P 2020-03-16 2020-03-16
US62/990,382 2020-03-16
US202063027290P 2020-05-19 2020-05-19
US63/027,290 2020-05-19
US202063118596P 2020-11-25 2020-11-25
US63/118,596 2020-11-25
PCT/US2021/018855 WO2021168305A1 (en) 2020-02-19 2021-02-19 Designer peptides and proteins for the detection, prevention and treatment of coronavirus disease, 2019 (covid-19)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220144829A true KR20220144829A (ko) 2022-10-27

Family

ID=77392273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227031724A KR20220144829A (ko) 2020-02-19 2021-02-19 코로나바이러스 질환, 2019 (covid-19)의 검출, 예방 및 치료용 기획된 펩티드 및 단백질

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230109393A1 (ko)
EP (1) EP4107180A4 (ko)
JP (1) JP2023515800A (ko)
KR (1) KR20220144829A (ko)
AU (1) AU2021222039A1 (ko)
BR (1) BR112022016574A2 (ko)
CA (1) CA3172443A1 (ko)
MX (1) MX2022010118A (ko)
TW (1) TWI818236B (ko)
WO (1) WO2021168305A1 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113087777B (zh) * 2020-04-17 2023-05-05 成都威斯克生物医药有限公司 抗SARS-CoV-2感染的蛋白以及用该蛋白制备的疫苗
AU2021275499A1 (en) * 2020-05-22 2022-11-24 Formycon Ag Ace2-fc fusion proteins and uses thereof
WO2021254868A1 (en) * 2020-06-19 2021-12-23 Sciensano Multiplex sars-cov-2 immunoassay
WO2022013609A1 (en) * 2020-07-13 2022-01-20 Immunovaccine Technologies, Inc. Sars-cov-2 vaccine compositions and methods of preparation and use
AU2021362007A1 (en) 2020-10-16 2023-06-22 Invisishield Technologies Ltd. Compositions for preventing or treating viral and other microbial infections
EP4204091A2 (en) * 2020-10-29 2023-07-05 Formycon AG Ace2 fusion proteins and uses thereof
CN112852666A (zh) * 2021-01-19 2021-05-28 新疆河润水业有限责任公司 一种微生物菌剂的制备方法及采用微生物菌剂制备的微生物肥料
WO2023034933A1 (en) * 2021-09-02 2023-03-09 Nonigenex, Inc. Methods and systems for assessing adaptive immunity to coronavirus
CN113717258B (zh) * 2021-09-03 2023-09-29 郑州安图生物工程股份有限公司 一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物及其应用、试剂盒
WO2023044397A1 (en) * 2021-09-15 2023-03-23 The Board Of The Trustees Of The University Of Illinois Engineered receptors and monoclonal antibodies for coronaviruses and uses thereof
CN113769080B (zh) * 2021-09-17 2023-04-07 清华大学 多肽免疫偶联物及其应用
TW202334198A (zh) * 2021-10-12 2023-09-01 聯亞生技開發股份有限公司 用於避免感染與治療遠程新冠肺炎之針對SARS-CoV-2 OMICRON BA.4/BA.5的疫苗組成物
WO2023069461A2 (en) * 2021-10-19 2023-04-27 Vaxxinity, Inc. Method for the prevention and treatment of coronavirus disease
AU2022381515A1 (en) * 2021-11-03 2024-05-09 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunogenic constructs and vaccines for use in the prophylactic and therapeutic treatment of diseases caused by sars-cov-2
GB202117821D0 (en) * 2021-12-09 2022-01-26 Univ Edinburgh A method of providing peptides
WO2023154781A2 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Vaxxinity, Inc. Sars-cov-2 vaccine for the prevention and treatment of coronavirus disease (covid-19)
WO2024011163A1 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Georgia State University Research Foundation, Inc. Coronavirus vaccines and methods of use thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2004321500A1 (en) * 2003-09-29 2006-05-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunoglobulins with potent and broad antiviral activity
US20050214748A1 (en) * 2003-11-12 2005-09-29 Wang Chang Y Peptide-based diagnostic reagents for SARS
WO2005120565A2 (en) * 2004-06-02 2005-12-22 New York Blood Center Sars vaccines and methods to produce highly potent antibodies
CN101522208A (zh) * 2005-02-08 2009-09-02 纽约血库公司 抗严重急性呼吸综合征相关冠状病毒的中和单克隆抗体
WO2008060331A2 (en) * 2006-05-19 2008-05-22 Amgen Inc. Antibodies to sars coronavirus
WO2017037634A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 National Research Council Of Canada Tgf-β-receptor ectodomain fusion molecules and uses thereof
CN106380517B (zh) * 2016-10-28 2019-07-16 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种对中东呼吸综合征冠状病毒具有中和活性的小分子抗体及其应用
US11696948B2 (en) * 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
RU2709659C1 (ru) * 2018-09-06 2019-12-19 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета к вирусу ближневосточного респираторного синдрома (варианты)
WO2021156490A2 (en) * 2020-02-06 2021-08-12 Vib Vzw Corona virus binders

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022010118A (es) 2022-09-05
EP4107180A4 (en) 2024-05-08
WO2021168305A1 (en) 2021-08-26
TW202144384A (zh) 2021-12-01
US20230109393A1 (en) 2023-04-06
TWI818236B (zh) 2023-10-11
JP2023515800A (ja) 2023-04-14
EP4107180A1 (en) 2022-12-28
BR112022016574A2 (pt) 2023-02-14
CA3172443A1 (en) 2021-08-26
AU2021222039A1 (en) 2022-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI818236B (zh) 用於檢測、預防和治療新型冠狀病毒(covid-19)疾病的設計胜肽及蛋白質
US20200330587A1 (en) Epstein-barr virus vaccines
US20240165218A1 (en) Self-asssembling nanostructure vaccines
US20220089652A1 (en) Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins
CN113321739B (zh) 一种covid-19亚单位疫苗及其制备方法与应用
AU2022204267A1 (en) Vaccine compositions
KR102463632B1 (ko) 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
CN117957016A (zh) Sars-cov-2与流感联合疫苗
JP2023530434A (ja) コロナウイルスワクチン組成物、方法、及びその使用
KR100927221B1 (ko) Ｅ형 간염 바이러스의 폴리펩티드 단편, 그를 이용한 백신조성물 및 진단용 키트
EP3541419B1 (en) Immunogenic composition for mers coronavirus infection
US20190328865A1 (en) Immunogenic composition for mers coronavirus infection
CA2744663A1 (en) Vaccine
CA3016867A1 (en) Human cytomegalovirus gb polypeptide
WO2023023466A1 (en) Sars-cov-2 multitope peptide/protein vaccine for the prevention and treatment of coronavirus disease, 2019 (covid-19)
US20230321217A1 (en) Compositions comprising complexes displaying antigens and methods of using the compositions
JP3940676B2 (ja) 日本脳炎ウイルスに対するキメラｔヘルパー細胞−ｂ細胞ペプチドワクチン
WO2022207645A1 (en) Sars-cov-2 subunit vaccine
OA18879A (en) Stabilized soluble pre-fusion RSV F proteins
NZ785677A (en) Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins
Lucy Kuo et al. A Novel SARS-CoV-2 Multitope Protein/Peptide Vaccine Candidate is Highly

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination