JP3940676B2 - 日本脳炎ウイルスに対するキメラｔヘルパー細胞−ｂ細胞ペプチドワクチン - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、日本脳炎ウイルスに対するワクチンとしてのキメラＴヘルパー細胞−Ｂ細胞ペプチドに関する。

（発明の背景）
昆虫がもたらすウイルス疾病の中でも、日本脳炎およびテング熱は、南東アジアの全領域に亘ってよく知られている。そのエンベロープ糖タンパク質は、赤血球凝集および中和という重要な生物学的特性に関連すると思われる、少なくとも５種の決定基を含んでいる。エンベロープ糖タンパク質は、ウイルスの付着を担うため、感染に関与する。日本脳炎に対する現存のワクチンは、主としてウイルスのエンベロープ糖タンパク質からなる、感染マウス脳から調製された不活化ウイルスワクチンを精製したものである。１２〜１８ヶ月後に引き続き追加免疫がなされる、マウス脳由来の不活化精製ワクチンの３回の注射は、中和性抗体の誘発によって判断されるような、効果的な免疫化を付与することができる。マウス脳ワクチンはまた、インド株に対する中和抗体を与える。このワクチンの効能は、３回の投与がなされた場合にのみ示される。

Ｃｈａｎ等による米国特許第５，８２４，５０６号（１９９８年１０月２０日）は、糖タンパク質ＮＳ１を備えるテング熱ウイルス２型由来のペプチド抗原を開示している。このペプチド抗原は、テング熱に感染している個体からの血清と特異的な免疫反応を示す。この抗原は、個体がテング熱ウイルスに感染したことがあるか、または感染しているかを測定する際の、並びにテング熱ウイルスによる感染と関連フラビウイルスによる感染とを識別するための診断手段として有用である。この抗原はまた、テング熱の感染に対し個体を免疫するためのワクチン組成物において有用である。

Ｌａｉ等による米国特許第５，４９４，６７１号は、対応完全長タンパク質に比較してさらに免疫原性である、８０〜８１％サイズのＣ−末端切断フラビウイルスエンベロープタンパク質を開示している。この特許はまた、この切断タンパク質をコードする組換えウイルスおよびそれにより感染させた宿主細胞を開示する。宿主細胞は、その外膜上で切断タンパク質を発現し、これをその環境中に分泌する。この特許は、フラビウイルス感染に対して用いられるワクチンを開示する。このワクチンは、切断エンベロープタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス、および組換えバクロウイルスにより産生される切断エンベロープタンパク質の何れも含んでいる。

中国において、日本脳炎ウイルス株ＳＡ １４−１４−２からなる弱毒化日本脳炎ウイルスワクチンが使用されている。この弱毒化は、ハムスター腎臓細胞で行われ、未知の経過履歴を有する。ＳＡ１４−１４−２ワクチン株を脳内に接種されたマウスは、中枢神経系（CNS）への影響を何ら示すことなく生き残った。脳におけるウイルス力価は、低レベルで数日間にわたり持続したが、１０日後には検出できなくなった［Ｈａｓｅ，Ｔ．，Ｄｕｂｏｉｓ，Ｄｒ．Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＰＬ，Ｄｏｗｎｓ，ＭＢおよびＵｓｓｅｒｙ，ＭＡ（１９９３）、「マウス脳ニューロンにおける日本脳炎ウイルスのＳＡ１４親株とＳＡ１４−１４−２ワクチン株との間の複製率および病原性の比較」、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３０、１３１−４３。Ｄｕｂｏｉｓ Ｔ．，Ｄｒ．Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＰＬ，Ｄｏｗｎｓ，ＭＢおよびＵｓｓｅｒｙ，ＭＡ（１９９３）、「マウス脳ニューロンにおける日本脳炎ウイルスのＳＡ１４親株とＳＡ１４−１４−２ワクチン株との間の複製率および病原性の比較」、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３０、１３１−４３］。

このワクチンの安全性および免疫原性は試験されている。年齢５〜１２才の子供１０２６人に、生弱毒化日本脳炎ウイルスワクチンを接種した。ワクチン接種した子供４７人のグループの中で３７．４℃を超える体温を示した子供はいなかった。血清反応陰性の子供における血清転換率は１００％であった（ＧＭＴ３５．３）［Ｘｉｎ ＹＹ，Ｍｉｎｇ，ＺＧ，Ｐｅｎｇ，ＧＹ，Ｊａｉｎ，ＡおよびＭｉｎ，ＬＨ（１９９８年）、「子供に対する生弱毒化日本脳炎ウイルスワクチン（ＳＡ１４−１４−２）の安全性」、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．３９，２１４−７］。

日本脳炎ウイルスに対する組換えワクチンを開発するために多くの研究が行われている。これらには、種々のタンパク質の発現、それ続くこの生成物による動物の免疫化が包含される。極めて初期の段階で、エンベロープ糖タンパク質単独による発現および免疫が、あまり有用でないことが明らかにされていた［Ｍａｓｏｎ，ＰＷ，ＭｃＡｄａ，ＰＣ，Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ，ＪＭ，Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，ＭＪ，およびＭａｓｏｎ，ＴＬ（１９８７年）、「大腸菌における日本脳炎ウイルス抗原の発現」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５８，３６１−７２］。エンベロープ糖タンパク質およびＮＳ−１遺伝子を含有する組換えバクロウイルス感染細胞で免疫させたマウスの免疫性を、日本脳炎ウイルスで調べた。生存率は、未免疫マウスが約３０％であったのに対し、エンベロープ糖タンパク質およびポリプロテインによる免疫マウス（ＮＳ−１による免疫マウスではない）では７０％にまで増加した［ＭｃＣｏｗｎ，Ｊ，Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｍ，Ｐｕｔｎａｋ，Ｒ，Ｆｅｉｇｈｎｙ，Ｒ，Ｂｕｒｒｏｕｓ，Ｊ，Ｈｅｎｃｈａｌ，ＥおよびＨｏｋｅ，Ｃ（１９９０年）、「組換えバクロウイルスワクチンによる致死日本脳炎に対するマウスの防護」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．４２，４９１−９］。

組換えワクシニアウイルスのｐｒＭおよびＥタンパク質からなる精製細胞外ウイルス構成要素粒子によるマウスの免疫化は、４．９ｘ１０⁵の半致死量（ＬＤ５０）の日本脳炎ウイルスからマウスを防護することができた［Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｅ，Ｐｉｎｃｕｓ，Ｓ，Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｅ，Ｓｈｏｐｅ，ＲＥ，Ｂｕｒｒａｇｅ，ＴおよびＭａｓｏｎ，ＰＷ（１９９２年）、「日本脳炎ウイルスｐｒＭ／ＭおよびＥタンパク質を含有するサブウイルス粒子によるマウスの免疫化は致死的ＪＥＶ感染を防護した」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８８，７１４−２０］。これらの粒子状抗原はまた、マウスにおいて、日本脳炎ウイルスに特異的なキラーＴ細胞（ＣＴＬ）応答を誘発することが示されている［Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｅ，Ｗｉｎ，ＫＳ，Ｋｕｒｎｅ，Ｉ，Ｍａｓｏｎ，ＰＷ，Ｓｈｏｐｅ，ＲＥおよびＥｎｎｉｓ，ＦＡ（１９９７年）「マウスにおいて、日本脳炎にかかわる粒子状ワクチン候補者は長期間持続性メモリイＴリンパ細胞を誘発させる」、Ｖａｃｃｉｎｅ，１５，２０１−６］。

前細胞膜（premembrane）およびエンベロープ糖タンパク質にかかわる遺伝子を共に発現するワクチン組換え体は、マウスにおいて、高レベルで中和抗体および赤血球凝集阻害（ＨＩ）抗体を誘発し、マウスを日本脳炎ウイルスによる致死的な攻撃から防護した。ＮＳＩにかかわる遺伝子のみを発現する組換え体は、ＮＳＩに対する抗体を誘発するが、同様の投与量の日本脳炎ウイルスに対して、低レベルの防護を付与した。ＮＳ−１およびエンベロープ糖タンパク質とともにＰｒＭ遺伝子を含有するワクシニア組換えウイルスによるマウスの免疫は、日本脳炎ウイルスによる攻撃からマウスを防護した。痘疹ウイルス［カナリイ痘疹（Canary pox）およびビシニア（viccinia）］を基礎とする、日本脳炎組換えワクチンが調製され、これらが、マウスにおいて、日本脳炎ウイルスに対し特異的なキラーＴ細胞（ＣＴＬ）を生成することが示された［Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｅ，Ｋｕｒａｎｅ，Ｉ，Ｍａｓｏｎ，ＰＷ，Ｓｈｏｐｅ，ＲＥおよびＥｎｎｉｓ，ＦＡ（１９９７年）、「ポックスウイルス−ベース日本脳炎ワクチン候補物質が、マウスにおいてＪＥウイルス特異性ＣＤ８+細胞毒性Ｔリンパ細胞を誘発させた」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２７，３５３］。

日本脳炎ウイルスｐｒＭ、ＥおよびＮＳ１タンパク質をコードする、ポックスウイルス−ベース組換え日本脳炎ワクチン候補物質である、ＮＹＶＡＣ−ＪＥＶおよびＡＬＶＡＣ−ＪＥＶが、日本脳炎ウイルスに特異的なキラーＴ細胞（ＣＴＬ）の誘発能力について試験された。協力者は、０日目および２８日目に、これら候補物質のそれぞれによる皮下接種を受けた。ＮＹＶＡＣ−ＪＥウイルスを接種された大部分の受容者およびＡＬＶＡＣ−ＪＥＶを接種された受容者の幾人において、抗−Ｅ抗体および抗−ＮＳ１抗体が誘発され、これらのワクチン接種者のほぼ半分から得られたＰＢＭＣは、生日本脳炎ウイルスによる刺激に応じて明確な増殖を示した。２人のＮＹＶＡＣ−日本脳炎ウイルス接種を受けた者および２種のＡＬＶＡＣ−日本脳炎ウイルスを受けた者から得られた、インビトロ刺激末梢血液単核細胞における日本脳炎ウイルス特異性ＣＤ８＋ＣＤ４−細胞毒性Ｔ細胞の存在は証明されている［Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｅ，Ｋｕｒａｎｅ，Ｉ，Ｍａｓｏｎ，ＰＭ，Ｓｈｏｐｅ，ＲＥ，Ｋａｎｅｓａ−Ｔｈａｓａｎ，Ｎ，Ｓｍｕｃｎｙ，ＪＪ，Ｈｏｋｅ，ＣＨ．ＪｒおよびＥｎｎｉｓ，ＦＡ（１９９８年）、「ヒトにおけるポックスウイルス−ベース日本脳炎ウイルス候補物質による日本脳炎ウイルス特異性細胞毒性Ｔリンパ細胞の誘発」、Ｖａｃｃｉｎｅ，１６，８２４−９］。

ＹＦ１７Ｄ感染性クローンのＣ遺伝子とＮＳ遺伝子との間に、日本脳炎ウイルスの弱毒化ヒトワクチン株（ＳＡ−１４−１４−２）のｐｒＭおよびエンベロープ糖タンパク質遺伝子を挿入することによって、キメラ黄熱病（ＹＦ）／日本脳炎ウイルス（キメラＶａｘ−ＪＥウイルス）を構築した。一回の投与で＞／＝１０³ｐｆｕのキメラＶａｘ−ＪＥウイルスを皮下接種されたマウスは、病原性日本脳炎ウイルスによるＩＰ攻撃に対し防護された。

近年において、合成ペプチドの形態のタンパク質断片を使用し、Ｔヘルパーおよび抗体応答を誘発させることができることが示された。日本脳炎ウイルスからのＢ細胞エピトープを明らかにしようとする試みは、１０ ＭＡｂｓと反応することができる最短配列としてＭｅｔ３０３〜Ｔｒｐ３９６の開示をもたらした。Ｃｙｃ３０４と３３５との間のジスルフィド結合が、これらのＭＡｂｓの結合部位（１個または２個以上）の提供に必要であった。しかしながら、これは、マウスにおける中和抗体または防護抗体の誘発に有効な免疫原ではなかった［Ｍａｓｏｎ，ＰＷ，Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ，ＪＭ，Ｇｅｎｔｒｙ，ＭＫ，ＭｃＣｏｗｎ，ＪＭ，Ｈｏｋｅ，ＣＨ，Ｂｕｒｋｅ，ＤＳ，Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，ＭＪおよびＭａｓｏｎ，ＴＬ（１９８９）、「日本脳炎ウイルス構造糖タンパク質の中和ドメインの分子特徴」、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，２０３７−４９］。

エンベロープ糖タンパク質のアミノ酸３７３−３９９のコード配列を担持する断片は、最も高い中和抗体力価を誘発した（１：７５）。赤血球凝集阻害（ＨＩ）抗体は、この融合タンパク質によっては誘発されなかった［Ｓｅｉｆ，ＳＡ，Ｍｏｒｉｔａ，ＫおよびＩｇａｒａｓｈｉ，Ａ（１９９６）、「グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌において発現されたＪＥウイルスＥタンパク質の２７アミノ酸コード領域は、マウスにおける中和抗体を誘発する。」、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．４３，９１−６］

中和抗体誘発エピトープは、エンベロープ糖タンパク質のＣ末端領域で検出されている［Ｓｅｉｆ，ＳＡ，Ｍｏｒｉｔａ，Ｋ，Ｍａｔｓｕｏ，Ｓ，ｈａｓｅｂｅ，ＦおよびＩｇａｒａｓｈｉ，Ａ（１９９５）、「組換え大腸菌系で発現された日本脳炎ウイルスＥ−タンパク質のＣ−末端の中和エピトープ（１個または２個以上）の精密なマッピング」、Ｖａｃｃｉｎｅ，１３，１５１５−２１およびＪａｎ，ＬＲ，Ｙａｎｇ，ＣＳ，Ｈｅｎｃｈａｌ，ＬＳ，Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉ，Ｈ，Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＰＬ，Ｄｕｂｏｉｓ，ＤＲおよびＬａｉ，ＣＪ（１９９３）、「日本脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質の戦略的カルボキシル末端切断による異種交配および同系交配マウスにおける免疫原性および防護能力の増加」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．４８，４１２−２３］。

Ｃタンパク質からのペプチドはまた、日本脳炎患者およびテング熱患者から得た血清との反応性について詳述されている。ペプチド９１−１０５および８−２２は、日本脳炎およびテング熱−１型患者の両方の血清と反応する類族特異性エピトープに属していた。Ｐｅｐ１−１５および３４−４８は、日本脳炎患者の血清とのみ反応し、テング熱患者の血清とは反応しないサブコンプレックス（subcomplex）特異性エピトープに属していた［Ｈｕａｎｇ，ＪＨ，Ｌｅｅ，ＨＦ，Ｔｓｏｕ，ＴＬ，Ｗｕ，ＣＳ，Ｗｕ，ＪＲ，Ｃｈｅｎ，ＨＭ，Ｃｈｉｎ，Ｃ，Ｃｈｉｅｎ，ＬＪ，Ｃｈｅｎ，ＬＫ，Ｗｕ，ＹＣ，Ｐｎａ，ＭＪおよびＷａｎｇ，ＴＭ（１９９６）、「合成ペプチドを用いる日本脳炎ウイルスのコア領域中の免疫優性、類族特異的およびサブコンプレックス特異的連続エピトープの同定」（Identification of immunodominant,group-specific and subcomplex-specific,continuous epitopes in core regions Japanes encephalitis virus using synthetic peptides）、Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ．４１，４３−５３］。

（従来技術の欠点）
マウス脳に由来する不活化精製ワクチンの場合、注射可能なワクチンを３回投与しなければならない。日本国で製造されたワクチンを用いる試験が、インド国タミルナデュ（Tamil Nadu）の南アルコット（South Arcot）地域で行われた。全部で１１３人の学生中、７２％が抗体応答を示し、そして、抗体応答者は、１年後のビケン（Biken）日本脳炎ワクチンの追加投与後において、８７．８％まで増加した。学生の約２０％のみが、１回目のワクチン投与後の１年間、抗体の持続を示した［Ｍｏｈａｎ，Ｒａｏ ＣＶＲ，Ｒｉｓｂｕｄ，ＡＲ，Ｄａｎｄａｗａｔｅ，ＣＮ，Ｕｍａｒａｎｉ，ＵＢ，Ａｙａｃｈｉｔ，ＶＭ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，ＦＭおよびＰａｖｒｉ，ＫＭ（１９９３）、「インド国タミルナデュの南アルコット地域の学生群における日本脳炎ワクチンに対する血清学的応答」、Ｊ．Ｍｅｄ．Res.．９７，５３−５９］。株変異の問題およびナカヤマ（Nakayama）に基づき不活化されたワクチンにより提供される防護の問題は、既に知られている。

中国で用いられた弱毒性日本脳炎ワクチンの場合、このワクチンの効果は、現在までのかなりの研究で証明されているが、全世界的には、このワクチンのライセンスに伴ういくつかの問題が存在する。このワクチンの生産で用いられる実験的実施および経過履歴が完全には知られていない。このため、同一のＳＡ１４−１４−２株からの弱毒株を再創作する研究が行われている。日本国における研究では、エンベロープ糖タンパク質およびＮＳ−１の両方に対する抗体が、生日本脳炎ワクチン株ＳＡ−１４−１４−２に由来する弱毒化日本脳炎ウイルス株ＳＡ（Ａ）に感染したマウスで見出された［Ｌｅｅ，Ｔ，Ｋｏｍｉｙａ，Ｔ，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ，Ａｉｚａｗａ，ＣおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｈ（１９９５）、「弱毒化日本脳炎ワクチン株ＳＡ１４−１４−２に感染したマウスにおける免疫応答」、Ａｃｔａ．Ｖｉｒｏｌ．３９，１６１−４］。

日本脳炎ワクチンに付随する問題には、例えば日本脳炎ワクチンが投与される年齢における相違がある。現時点で利用することができるワクチンの価格は非常に高い。３回の投与にかかわる追加の費用もまた、考慮されなければならない。３回の投与後、日本脳炎ウイルスへの曝露を欠いて、日本脳炎ワクチンの効能が長期間持続するか否かは、知られていない。自然の日本脳炎感染によって自然の免疫ができるまで、年単位の追加免疫が必要であるか否かは未知である。第三に、日本脳炎ウイルスに対する免疫応答は非常に低い［Ｐａｖｒｉ，ＫＭ（１９８４）、「インド国における日本脳炎ウイルス免疫の問題」、Ｐｒｏｃ．Ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ．Ｉｎｄ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．８１−８４頁］。さらに、ワクチンに用いられるウイルスである、ナカヤマによる地域特有の株またはベイジング（Beijing）株に対する免疫性の問題を考慮しなければならない。このワクチンがマウス脳由来ワクチンであることから、ワクチンに対するアレルギー反応が存在し、このアレルギー性粘膜反応の頻度は、１９８３年〜１９９５年間で１〜１７／１０，０００で変化している［Ｐｌｅｓｎｅｒ，ＡＭおよびＲｏｎｎｅ，Ｔ（１９９７）、「日本脳炎ワクチンに対するアレルギー性粘膜反応」、Ｖａｃｃｉｎｅ，１５，１２３９−４３］。

これらの欠点が貴方の発明によって如何にして克服されるのであろうか。近年、合成ペプチドの形態のタンパク質断片が、Ｔヘルパー応答および抗体応答の誘発に使用できることが示された（参考刊行物）。かくして、エンベロープ糖タンパクからの中和化、抗体誘導エピトープが、詳述されている。これらのペプチドの配列は、防護的免疫の誘発にとって充分ではないことから、Ｔヘルパーエピトープをウイルス中和性抗体誘発Ｂ細胞エピトープと組み合わせることによって、キメラペプチドが調製された。このキメラペプチドは、日本脳炎ウイルスの攻撃から防護するために、ＴヘルパーおよびＢ細胞免疫の両方を生じさせることを確実にする。上記キメラワクチンはデザインすることができ、将来の要求により、１種以上のキメラペプチドを付加し、効果的なワクチンを調製することを可能にする。

（発明の目的）
本発明の課題は、ヒトおよび動物におけるフラビウイルスに対する安全で効果的なワクチンを提供することにある。本発明の種々の別の目的および利点は、下記説明から明白になるものと見なされる。

（発明の説明）
本発明によれば、日本脳炎ウイルス感染に対するヒトおよび動物用のワクチン組成物が提供される。このワクチン組成物はキメラ合成ペプチドを含有し、このキメラペプチドは、日本脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸Ｅｇｐ １４９−ＳＥＮＨＧＨＹＳＡＱＶＧＡＳＱ−１６３、およびＥｇｐ ４２７−ＧＳＩＧＧＶＥＦＮＳＩＧＫＡＶＨＱＶＦＧ−４４５からなるエンベロープ糖タンパク質から選択される。このワクチンにおいて、キメラタンパク質は、日本脳炎ウイルス感染に対する防護的免疫を誘発させるのに充分な量で存在させる。

一の態様において、本発明は、キメラ合成ペプチドを含有する、日本脳炎ウイルス感染に対するヒトおよび動物用のワクチン組成物に関する。このキメラペプチドは、日本脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸１４９−ＳＥＮＧＨＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦ−１６７および４２７−ＧＳＩＧＧＶＦＮＳＩＧＫＡＶＨＱＶＦＧ−４４５からなるエンベロープタンパク質から選択された。

他の態様において、本発明はまた、上記ペプチド１４９−ＳＥＮＨＧＨＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦ−１６７が、日本脳炎ウイルスに対する中和抗体を誘発させる、ワクチン組成物に関する。
更に他の態様において、本発明はまた、日本脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質からの中和抗体誘発ペプチド配列を含有する、日本脳炎ウイルス感染に対するヒトおよび動物用のワクチン組成物に関する。当該配列は、アミノ酸４６−ＰＴＬＤＶＲＭＩＮＩＥＡ−５５、２６６−ＥＹＳＳＳＶＫＬＴＳＧ−２７２である。

他の態様において、本発明はまた、免疫された動物のＴヘルパー細胞を刺激することができる、日本脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質、カプシドタンパク質、膜タンパク質、非構造タンパク質−１、および非構造タンパク質−３、のペプチド配列に関する。
他の態様において、本発明はまた、日本脳炎ウイルス感染に対する防護的免疫を誘発させることができる、キメラＴヘルパーＢ細胞ペプチドを生成する上記ペプチドの組合せに関する。

Ｂリンパ細胞またはＴリンパ細胞は、それらのレセプターで、認識されるタンパク質の一部の領域としてのエピトープを確定することができる。エピトープは、関与する細胞に基づき、それぞれＢ細胞、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）およびキラーＴ細胞（ＣＴＬｓ）を刺激する、Ｂ細胞エピトープ、Ｔヘルパー細胞エピトープまたはＣＴＬエピトープとして分類することができる。ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞上に存在するＴＣＲに対し、Ｔ細胞エピトープを提示する。Ｔ細胞エピトープに反し、Ｂ細胞エピトープは３次元構造による。Ｂ細胞エピトープは、数種の相違する方法を用いて予測することができる。バクラ（Bakura）インド株（７３３９１３）のエンベロープ糖タンパク質のＢ細胞抗原決定基は同定されている。簡単に言えば、実験的に確認されたＢ細胞抗原決定基において生じる頻度に基づき、２０個のアミノ酸残基のそれぞれに、抗原特性値を割り当てるものである。これらのパラメーターを、適当なカットオフ（cutoff）値とともに、開発されたコンピュータープログラムで使用した。表１は、日本脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質の予測Ｂ細胞決定基を示している。

表１は、日本脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質から予測されるアミノ酸配列を示している。得られたアミノ酸配列は、日本脳炎ウイルスバンクラ（Ｂａｎｋｕｒａ）株（７３３９１３）からのものである。
ワクチン開発に有用であることができる独特の配列に到達するために、別の関連フラボウイルス、すなわちＭＮＶ、ＭＶＥＶ、ＤＥＮＶおよびＹＦＶからのアミノ酸配列をタンパク質データバンクからダウンロードし、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用い、多重配列決定を行った。同様に、少数の日本脳炎ウイルス株からのアミノ酸配列を理解するために、多重配列決定をまた行った。
この多重配列決定は、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて行い、その結果を図１および図２に示した。

図１から見ることができるように、別種のフラボウイルスに対し非相同性であったエンベロープ糖タンパク質の領域は、下記のとおりであった：
１．１４９−ＳＥＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱ−１６３
２．４０−ＴＬＤＶＲＭＩＮＩＥＡ−５０
３．２７０−ＩＶＶＥＹＳＳＳＶＫＬＴＳ−２８２。
これらの配列は、異なる日本脳炎ウイルス株内で保存されていた（図２）。このことは、領域４０−５０、１５５−１６３および２７０−２９０が、日本脳炎ウイルスにとって特有であることを意味する。従って、エンベロープ糖タンパク質からのこれらのペプチドに対して誘発された抗体は、中和抗体であるという、非常に大きな可能性を持つ。ここで、日本脳炎ウイルスナカヤマ（NAKAYAMA）株のアミノ酸配列とバンクラ（Bankura）株のアミノ酸配列との間に殆ど相違点が存在しないことに留意されるべきである。

ペプチド合成
これらのペプチドは、標準的固体相合成方法によって合成された。この合成は、開裂によりペプチド酸を生成するノバシン（Novasyn）ＰＡ５００樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｌｔｄ．英国）上で、ＦＭＯＣ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ酸ペンタフルオロフェニル（Ｏ ＰＦＰ）エステルを用いて行われた。遊離アミノ基を検出するための固体相において、遊離末端アミノ基検出用のカプリング反応着色試験の定性的監視によって短鎖置換ペプチドを排除するため、アミノ酸のカプリングの完了を厳密に監視した。カプリングはまた、固体相において、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン溶液によって脱保護処理中に放出されるＦＭＣＣ基を２９０ｎｍで監視することによって検査した。これらのペプチドは当該配列により指定される適当なスカベンジャーを用い、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって樹脂から分離した。これらのペプチドをスーパードライジエチルエーテル中で沈殿させた。このエーテル沈殿させたペプチドをＨＰＬＣにより精製し、ピークを採取した。純度は、逆相１８カラムにおいて０．１％ＴＦＡ含有水中の８０％アセトニトリルの線状勾配溶出下にペプチドのシングルピーク溶出を評価することによって検出した。精製されたペプチドは凍結乾燥させ、−２０で保存した。

＞８５％の純度を有するペプチドの全部を結合目的に使用した。別法として、２７０−２９０の領域のペプチドを、Ｆｍｏｃアミノ酸を製造業社の指示に従い使用し、ピンヘッド（Pin head）ペプチド合成モジュールで合成した。これらのペプチドの側鎖をまた、ピンに結合したペプチドを保持しながらトリフルオロ酢酸によって分離した。

ペプチドのＪＥウイルスに対するモノクローナル抗体との反応性
相違する免疫学的性質を有する抗日本脳炎ウイルスモノクローナル抗体のパネル。インド株に対するモノクローナル抗体を使用する日本脳炎ウイルスエンベロープタンパク質のエピトープマッピングは、ＮＩＶで開発された。これらのモノクロナール抗体を、これらのペプチドの抗原性を証明するために使用した。
この研究の目的は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）により認識されるエピトープを決定することにあり、またエピトープとして最適のペプチド長さおよび配列を見出すことにあった。これはまた、存在する場合、抗体結合にかかわる構造的要件を明白にするものと見なされる。これらモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、日本脳炎ウイルス特異性で赤血球凝集阻害（ＨＩ）が陽性であるＨｓ−１、Ｈｓ−２、Ｈｓ−３を包含していた［インド株に対するモノクローナル抗体を用いる日本脳炎ウイルスエンベロープタンパク質のエピトープマッピング（Epitope mapping of Japanese encephalitis virus envelope protein using monoclonal antibodies against an Indian strain）、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．６９，２７１４−７］。

Ｎａ₂ＣＯ₃／ＨＣＯ₃緩衝液（ｐＨ９．６）を用いるＥＬＩＳＡウエル（Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ、Ｎｕｎｃ）に、ペプチド（１ｕｇ／ウエル）を受動的にコートした。ＰＢＳ中１％ＢＳＡによりブロッキングを行った。ペプチドとの反応および洗浄は、ＰＢＳ（０．０１Ｍホスフェート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中の１％ＢＳＡによって行なった。モノクローナル抗体は、この反応用に１：５０または１：１００のいずれかで稀釈した。ＰＢＳ中１％ＢＳＡで稀釈した抗体１００μｌを添加し、次いで３７℃で６０分間にわたりインキュベートした。０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳで洗浄した後、抗体（Ｓｉｇｍａ、米国）を結合させた。ピンヘッドにおけるＥＬＩＳＡの場合、ブロッキング後、ペプチド結合ピンを抗体結合ウエル中に浸した。色の発現は発色団としてＨ₂Ｏ₂およびＯ−フェニルジアミン（ＯＰＤ）を用いて行った。このＯＤ値は４９２ｎｍで追跡した。インド株に対するモノクローナル抗体を用いる日本脳炎ウイルスエンベロープタンパク質のエピトープマッピングを行った。陰性対照として、ＳＰ２／０ＡＦを使用した。表２中のデータは、明らかに、ペプチド３９−ＰＴＬＤＶＲＭＩＮＩ−４８および２６９−ＡＩＶＶＥＹＳＳＳＶＫＬＴ−２８１が、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈｓ−１と反応し、ペプチド１５１−ＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦ−１６７が、モノクローナル抗体（ＭＡｂ） Ｈｓ−２およびモノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｈｓ−３と反応することを示している。

日本脳炎ウイルスを用いるＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡウエル（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ）を、炭酸ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ９．８）中の精製日本脳炎ウイルス抗原で、一夜かけてコートした（１０ｇ／ウエル）。次いで、これらのウエルをＰＢＳ（０．０１Ｍ ホスフェート、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりブロックした。ＰＢＳの１％卵アルブミンで稀釈した抗体を１００μｌ添加し、次いで３７℃で６０分間にわたりインキュベートした。０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳにより洗浄した後、結合した抗体をヤギ抗マウスＩｇ−わさびペルオキシダーゼ結合抗体（Ｓｉｇｍａ、米国）で検出した。色の発現を、発色団としてＨ₂Ｏ₂およびＯ−フェニルジアミン（ＯＰＤ）を用いて行った。このＯＤ値を４９２ｎｍで追跡した（Ｃｅｃｉｌｉａ等による、１９８８）。日本脳炎ウイルスに対する抗体応答が、抗ペプチド抗体血清について試験された。これら全試験において、ＰＢＳ対照マウスからの血清および卵アルブミン免疫マウスからの血清を、陰性対照として使用した。ポリクローナル免疫ＡＦを陽性対照として使用し、未免疫マウスからの腹膜ＡＦを、陰性対照として使用した。モノクロナール抗体を用いる試験において、ＳＰ２／０接種マウスから得られたＡＦを、陰性対照として使用した。

マウスの免疫のためのペプチドのキャリヤとの結合
ペプチド４０−ＴＬＤＶＲＭＩＮＩＥＡＳＱ−５２および１４９−ＳＥＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡ−１６３を合成し、精製し、次いで担体分子に結合させた。これらの実験に用いられた担体分子は、卵アルブミン（ＯＡ）であった。ペプチドを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０Ｍｍ、ｐＨ８．５）中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、撹拌し続けた。撹拌しながら、等量の無水シトラコン酸溶液（水中１０ｍｇ／ｍｌ）をゆっくりと添加した。この反応中、ｐＨは８〜９に維持した。この反応混合物を、室温で１時間にわたりインキュベートした。ペプチドを１ｍｇ／ｍｌの濃度に稀釈した。ＥＤＣ（３−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミド）を、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度でそれに添加した。ｐＨは８．８に維持した。室温で５分間にわたりインキュベートした後、等量の卵アルブミンを１：２０（担体：ペプチド）のモル比で添加した。この反応混合物を室温で４時間にわたりインキュベートし、次いで酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）により最終濃度を１００ｍＭとした。１時間のインキュベート後、この溶液を酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）に対して透析し、次いで１２時間かけてＰＢＳ １２リッターに対して４回液を変えながら透析した。このペプチド−タンパク質接合体を凍結乾燥し、０℃で保存した。

免疫するために、フロイント完全アジュバント中で乳化されたペプチド−タンパク質接合体（１：１）を、マウスに、皮下経路で注入した。一群４匹のマウスは、ペプチド−タンパク質キャリヤ接合体によって使用された。同量のペプチド−キャリヤ接合体を含有する追加抗原を、フロイント完全アジュバント中に乳化して、一週間の間隔で２回投与した。対照群には、ペプチドおよびＰＢＳを含有しない担体ペプチドを、アジュバントにより乳化して投与した。マウスは、免疫化後の７日目、１４日目および２１日目に眼窩後部から採血し、抗体力価を評価した。血清を分離し、使用時まで−２０℃で保存した。抗日本脳炎ウイルス免疫応答を、ＥＬＩＳＡにより評価した。このＥＬＩＳＡにおいて、抗ペプチド血清を、上記方法によって自然の日本脳炎ウイルスビリオンと反応させた。図３は、ＥＬＩＳＡにおける種々の稀釈度での反応性を示している。

抗体誘発能および抗体結合能の点で、この領域を精密に一致させるために、一連の重複ペプチドを合成し、これを同一のものの証明に使用した。下記重複ペプチドを合成した。
１５５−１６３ ＹＳＡＱＶＧＡＳＱ
１５１−１６３ ＮＨＥＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱ
１４９−１６３ ＳＥＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱ
１５５−１６７ ＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦ
１５１−１６７ ＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦ

これら全ペプチドを、上記方法に基本的に従い、卵アルブミンに結合させた。４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをそれぞれ、フロイントアジュバントとともに、これらのペプチドＯＡ接合体４０ｕｇ／マウス／一回を用いて免疫した。これらのマウスには、一週間の間隔で追加抗原量を投与し、一週間の間隔で眼窩後部経路により採血した。抗日本脳炎ウイルス応答は、上記方法によりＥＬＩＳＡによって監視した。記載の数値は、得られた平均光学濃度の値である。

表３は、ＥＬＩＳＡによる日本脳炎ウイルスに対する抗ペプチド抗体の反応性を示している。日本脳炎ウイルスに対して反応性の抗ペプチド抗体応答は、７日目の第１期（Ｐ１）で、すなわち最初の投与後に、全部のペプチドで免疫されたマウスにおいて見出すことができた。全てのペプチドに対する抗血清は、ＥＬＩＳＡにおいて天然日本脳炎ウイルスとの反応性を示し、前記予測方法の正当性を確認した。

日本脳炎ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質からのＴヘルパーエピトープの説明
免疫応答におけるＴヘルパーの重要性はよく知られている。Ｂ細胞の発生および免疫応答の成熟の過程において、Ｂ細胞は、特定の局所的なコグネイトシグナルおよびＴ細胞が引き起こす細胞−細胞接触を要する。両親媒性を予測する方法の組合せを使用して、Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ結合モチーフを有する配列およびｈｅｌｉｘ ｐｒｅｆｅｒｅｒｓとともに、テトラマーおよびペンタマーモチーフが日本脳炎ウイルスの全部のタンパク質について予測された。Ｔｈエピトープの予測は、Ｍａｒｇａｌｉｔ等により開発されたＡＭＰＨＩプログラムにより予測される両親媒性螺旋部位を含むＥＰＩＰＬＯＴを用いて行った（Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｈ．、Ｓｐｏｎｇｅ，Ｊ．Ｌ．、Ｃｏｒｎｅｔｔｅ，Ｊ．Ｌ．、Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．、ＤｅＬｉｓｉ，Ｃ．およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．（１９８７）、「一次配列からの免疫優性ヘルパーＴ細胞抗原性部位の予測」（Prediction of immunodominant helper T cell antigenic site from the primary sequence）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３８，２２１３−２２２９）。

両親媒性部位の予測に、アミノ酸のホーチャー（Fauchere）およびプリスカ（Pliska）疎水性スケールを使用し、７種のブロック長さを選択した（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ｌ．およびＰｌｉｓｋａ，Ｖ．（１９８３）、「Ｎ−アセチルアミノ酸の分配からのアミノ酸側鎖の疎水性パラメーターＩＩ」（Hydrophobic parameters II of amino acid side chains from the partitioning of N-acetyl amino acid）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８，３６９−３７５頁）。ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｏｒによるテトラマーおよびペンタマーモチーフ［２−３個の疎水性残基、更に極性残基によって生じる帯電した残基またはグリシン］（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ．およびＴａｙｌｏｒ，Ｗ．Ｒ．（１９８８）、「Ｔ細胞エピトープにおける共通配列パターン」（A common sequence pattern in T cell epitopes）、ＥＭＢＯ Ｊ．７，９３−１００］。

高い親和性でＭＨＣ［Ｉａ／Ｉｅ］に結合することができる免疫優性二次構造の配列モチーフの予測を、Ｓｅｔｔｅ等による方法によって行った［Ｓｅｔｔｅ，Ａ．、Ｂｕｕｓ，Ｓ．、Ｃｏｌｏｎ，Ｓ．、Ｍｉｌｅｓ，Ｃ．およびＧｒｅｙ，Ｈ．Ｍ．（１９８９）、「１種以上のＩａ抗原と結合することができるペプチドの構造分析」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２，３５−４０］。フラビウイルス交差反応性を選択するためのＡＬＩＧＮプログラムを用いることによるフラビウイルスの多重配列。これらの予測プログラムのそれぞれにおける高いスコアーを有するＴヘルパーペプチドを選択した。交差反応性エピトープは、フラビウイルス中の相同性に基づき選択した。種々のフラボウイルス間の配列決定および相同性分析後、１４種のペプチド配列を選択した。

これらのペプチドを、製造者の方法のように、分裂可能な選択部位（cleavable option）を使用するシャロン ピン−ヘッドモジュール（Chiron Pin-head modules）に基づき合成した。ペプチドは、前記のように、トリフルオロ酢酸法により開裂させた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、マウス脳生日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルスの０．１ｍｌｘ１０^-2稀釈液を、腹腔内投与により感作した。感作されたマウスに、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、不活性化マウス脳抗原［１０ｕｇ］および正常抗原（Normal antigen）０．１ｍｌを、等量の完全フロイントアジュバントとともに皮下接種した。追加抗原用量の上記抗原を、不完全フロイントアジュバントとともに、４日間与えた後、採取した。

Ｔヘルパー細胞増殖分析は、免疫マウスおよび未免疫マウスからの脾臓細胞を用いて行った。９６−ウエルを有する平底プレートに、脾臓細胞を２ｘ１０⁵細胞／ウエル／０．１ｍｌの割合で添加した。培養物は日本脳炎ウイルス抗原［５、２．５および１ｕｇ／ｍｌ］およびペプチド［１０．５および２．５ｕｇ／ｍｌ］により刺激した。６日後、培養物に、１８時間にわたり１ｕＣｉ［³Ｈ］チミジンを適用した。細胞を採取し、次いで放射能を測定した。数値は、ウイルス免疫リンパ細胞−ｃｐｍにおいて、Ｎｅｔ ｃｐｍ ＝ｃｐｍとして表わした。図および表に示されているように、ＪＥウイルスの非構造タンパク質からのペプチドは、特に、良好な刺激を示した。
図４は、日本脳炎ウイルス免疫脾臓細胞のＴヘルパーペプチドによる刺激を示している。

図および表に示されている結果に基づき、下記ペプチドを候補Ｔヘルパー細胞ペプチドとして選択し、キメラＴヘルパーＢ細胞ワクチンに配合した。
ＪＥ Ｅｇｐ ３４６−ＨＶＬＧＲＬＴＴＶＮ−３５５
ＪＥ Ｍ １７−ＥＡＷＬＤＳＴＫＡＴ−２６
ＪＥ ＮＳ１ ２９７−ＳＶＲＴＴＴＤＳＧＫＬＩＴＤ−３１０
ＪＥ ＮＳ１ １５６−ＥＤＦＧＦＧＩＴＳＴＲＶ−１６７
ＪＥ ＮＳ１ ４０４−ＴＤＬＡＲＹＶＶＬ−４１２
ＪＥ Ｅｇｐ ４３９−ＳＩＧＧＶＦＮＳＩＧＫＡＶＨＱ−４５５

ＴヘルパーとＢ細胞ペプチドとのキメラの調整、免疫および防護試験
Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞を刺激する能力を付与ものとして、エンベロープ糖タンパク質から得、我々の実験室で予め検査された［Ｋｕｔｕｂｕｄｄｉｎ，Ｍ．、Ｋｏｌａｓｋａｒ，ＡＳ．、Ｇａｌａｎｄｅ，Ｓ．、Ｇｏｒｅ，ＭＭ．、Ｇｈｏｓｈ，ＳＮ．、Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｋ．（１９９１）、「日本脳炎西ナイルウイルスおよびテング熱ウイルスのエンベロープ（Ｅ）糖タンパク質中のヘルパーＴ細胞エピトープの認識」、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，１４９−５４］。それとともに、縦列にＴヘルパーおよびＢ細胞エピトープの両方を有する合成ペプチドを作製することが決定された。共直線的に合成されたペプチドは下記のとおりであった：
ＮＨ２−ＳＥＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱＧＳＩＧＧＶＦＮＳＩＧＫＡＶＨ
ＱＶＦＧ−ＣＯＯＨ

このペプチドは、２種の構成部分を有する：
Ｂ細胞エピトープ １４９−ＳＥＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱ−１６３
Ｔ細胞エピトープ ４２９−ＳＩＧＧＶＦＮＳＩＧＫＡＶＨＱＶＦＧ−４４５
このペプチドは、上記と同様にＦＭＯＣアミノ酸を使用する固体相合成法を用い共直線的に単一ペプチドとして合成された。
単一ピークとして採取される精製ペプチドを、凍結乾燥し、免疫化のために使用した。この免疫化は、同系および異系である相違する種の成熟マウス（ｎ＝８）で行った。同種種は、ＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）およびＣ３Ｈ（Ｈ＝２ｋ）であり、他方、異種種は、ＳＷＩＳＳ／アルビノであった。免疫に用いられた抗原は、キメラペプチド、Ｂ細胞ペプチド、市販日本脳炎ウイルスワクチン（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒｅｓｅｓｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋａｓａｕｌｉから入手）およびＰＢＳ（偽薬）であった。この免疫化は種々のスケジュールで行った。

この免疫化スケジュールは、皮下経路でペプチド５０ｕｇ／マウス／一回の投与量であり、投与はフロイントアジュバントとともに１４日毎に行った。第一回目の投与に際し、フロイント完全アジュバントを使用し、また引続く投与には不完全アジュバントを使用した。全部で２回のブースター投与を行った。全部のマウスから眼窩後部経路で−３日目（免疫化前血清）、第一回目の投与後の１０日目、２２日目、３４日目に採血した。３５日目に（これは、最後の投与後の一週間目に相当する）、これらのマウスに致死量の生きているウイルスを挑戦させた。この挑戦後の２１日間にわたり、発病および致死についてマウスを評価した。免疫応答をまた、ウイルス学的分析、例えばＥＬＩＳＡ、免疫蛍光分析、ならびに中和および挑戦試験などの常法を用いて特徴確認した。

抗日本脳炎ウイルス応答は、ＥＬＩＳＡにより評価した。図５ａ、５ｂ、５ｃに示されているように、これらのペプチドは、特に当該キメラペプチドが抗原である場合、ＪＥウイルスに対する免疫応答を誘発させることができることを見ることができる。免疫応答の点で、最良の応答は、日本脳炎ウイルスワクチン、次いで、キメラペプチド、Ｂ細胞ペプチドの順序で免疫化したマウスで見出された。

抗キメラペプチド血清によるインビトロウイルス中和
中和試験は、プラーク減少試験によって行った。抗キメラペプチド血清を培地中で１：５０に稀釈した。この稀釈血清５０μｌおよび４８プラーク形成単位を含有する等量のウイルスプールを混合し、次いで３７℃で１時間にわたりインキュベートした。２４個のウエル内に形成したブタ安定腎臓細胞に、このウイルス抗体混合物を添加した。１時間の吸着後、カルボキシメチルセルロースで覆い、プレートを３日間にわたりインキュベートした。プラーク抑制パーセンテージを、抗体を用いない場合のウイルスプラーク数を用いて計算した。図６は、抗ペプチド血清のウイルス中和効果を示している。この図から見られるように、Ｃ３Ｈマウスにおいて、キメラペプチドに対して生成された抗体のみが日本脳炎ウイルスを中和することができる。

日本脳炎ウイルスの致死的攻撃からのキメラペプチドにより免疫化されたマウスの防護
これらのペプチドは、有望なワクチン候補であることから、免疫されたマウスを、このウイルスの攻撃を阻止するそれらの能力について評価した。致死量の日本脳炎ウイルスを、ＹｅｏｌｅｋａｒおよびＢａｎｅｒｊｅｅによる方法（１９９６）に従い投与した［Ｙｅｏｌｅｋａｒ，ＬＲおよびＢａｎｅｒｊｅｅ，Ｋ．（１９９６）、「実験動物における日本脳炎ウイルスの免疫刺激性複合体の免疫原性」、Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ，４０，２４５−２５０］。キメラペプチド免疫マウスに、日本脳炎ウイルス懸濁液０．１ｍｌを腹腔内接種し、次いで直ちに、１％デンプン溶液０．０３ｍｌを脳内経路で接種した。マウスは、接種後の２１日間にわたり観察した。図７に示されている生存曲線によれば、当該キメラペプチドにより免疫化されたＣ３Ｈマウスは、ウイルス攻撃に耐えることができることを見ることができる。その他の種のマウス（ＢＡＬＢ／ｃまたはＳＷＩＳＳ）は、ウイルスを中和することができず、またこれらのマウスはウイルス挑戦に対し耐えることはできなかった。

図７は、２．３ ｌｏｇＬＤ５０のウイルス投与量による日本脳炎ウイルスの攻撃からのキメラペプチドＫＫ免疫マウスの生存率を示している。
本明細書に記載のデータは、日本脳炎ウイルスの致死的攻撃からマウスを防護することができることを明白に示している。これらのデータはまた、ペプチドエピトープ１４９−ＳＥＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦ−１６７に加えて、Ｂ細胞エピトープ３９−ＰＴＬＤＶＲＭＩＮＩ−４８および２６９−ＡＩＶＶＥＹＳＳＳＶＫＬＴ−２８１もまた、日本脳炎ウイルスに対する中和性抗体を誘発させることができ、従って特異であることを示している。

これらの提供されたデータはまた、ペプチドＪＥ Ｅｇｐ ３４６−ＨＶＬＧＲＬＴＴＶＮ−３５５、ＪＥ Ｍ １７−ＥＡＷＬＤＳＴＫＡＴ−２６、ＪＥ ＮＳＩ ２９７−ＳＶＲＴＴＴＤＳＧＫＬＩＴＤ−３１０、ＪＥ ＮＳＩ １５６−ＥＤＦＧＦＧＩＴＳＴＲＶ−１６７、ＪＥ ＮＳＩ ４０４−ＴＤＬＡＲＹＶＶＬ−４１２、ＪＥ Ｅｇｐ ４３９−ＳＩＧＧＶＦＮＳＩＧＫＡＶＨＱ−４５５がＴヘルパー細胞ペプチドとして使用することができることを示している。キメラＴヘルパーＢ細胞ペプチドは致死的挑戦からマウスを防護することが証明されたことから、Ｂ細胞およびＴヘルパーペプチドの組合せの全部がいずれも、日本脳炎ウイルスに対するワクチンの開発に有用であるものと主張する。

ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて行われた日本脳炎ウイルスバンクラ（Bankura）株のエンベロープ糖タンパク質とフラビウイルスのエンベロープ糖タンパク質との多重アミノ酸配列を示す。 ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて行われた日本脳炎ウイルスバンクラ（Bankura）株のエンベロープ糖タンパク質と別株の日本脳炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質との多重アミノ酸配列を示す。 ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗体を含有するペプチドのＪＥウイルスに対する反応性を種々の稀釈度に対して示すグラフである。 日本脳炎ウイルス免疫化脾臓細胞のＴヘルパーペプチドによる刺激を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにより評価した本発明によるキメラペプチドの抗日本脳炎ウイルス応答を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにより評価した本発明によるキメラペプチドの抗日本脳炎ウイルス応答を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにより評価した本発明によるキメラペプチドの抗日本脳炎ウイルス応答を示すグラフである。 抗ペプチド血清のウイルス中和効力を示すグラフである。 キメラペプチドにより免疫化されたマウスの生存曲線である。

Claims (3)

1. 日本脳炎ウイルスのＥｇｐ３９−ＰＴＬＤＶＲＭＩＮＩ−４８、Ｅｇｐ１４９−ＳＥＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱ−１６３、Ｅｇｐ１４９−ＳＥＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦ−１６７、Ｅｇｐ１５５−ＹＳＡＱＶＧＡＳＱ−１６３、Ｅｇｐ１５１−ＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱ−１６３、Ｅｇｐ１５５−ＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦ−１６７、Ｅｇｐ１５１−ＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱＡＡＫＦ−１６７、および２６９−ＡＩＶＶＥＹＳＳＳＶＫＬＴ−２８１からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つと、
   日本脳炎ウイルスのＥｇｐ ３４６−ＨＶＬＧＲＬＴＴＶＮ−３５５、Ｍ １７−ＥＡＷＬＤＳＴＫＡＴ−２６、ＮＳＩ ２９７−ＳＶＲＴＴＴＤＳＧＫＬＩＴＤ−３１０、ＮＳＩ １５６−ＥＤＦＧＦＧＩＴＳＴＲＶ−１６７、ＮＳＩ ４０４−ＴＤＬＡＲＹＶＶＬ−４１２、Ｅｇｐ ４２９−ＳＩＧＧＶＦＮＳＩＧＫＡＶＨＱＶＦ−４４５及びＥｇｐ ４３９−ＳＩＧＧＶＦＮＳＩＧＫＡＶＨＱ−４５５からなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つと
   を含有する、キメラペプチド。
2. 日本脳炎ウイルスのＥｇｐ１４９−ＳＥＮＨＧＮＹＳＡＱＶＧＡＳＱ−１６３のペプチドと、日本脳炎ウイルスのＥｇｐ ４２９−ＳＩＧＧＶＦＮＳＩＧＫＡＶＨＱＶＦ−４４５とを含有する、請求項１に記載のキメラペプチド。
3. 請求項１又は２に記載のキメラペプチドを含む、日本脳炎ウイルス感染に対する、ヒトおよび動物用ワクチン組成物。

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