KR20220109996A - 사스-코로나바이러스-2 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사스-코로나바이러스-2 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein) 및 면역글로불린 분자의 불변부를 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 사스-코로나바이러스-2 특이적 중화 항체를 유도할 뿐만 아니라 세포-매개 면역 반응을 현저히 증가시킬 수 있다. 이에, 본 발명은 변이 바이러스에 대한 대응 면역 반응이 일어날 수 있을 뿐만 아니라, 장기간 지속 가능한 효과를 나타낼 수 있으므로, 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 사스-코로나바이러스-2 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein) 및 면역글로불린 분자의 불변부를 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
코로나바이러스는 계통적으로 Nidovirales 목 (order) Coronaviridae 과(family)에 속하며 알파, 베타, 감마 및 델타의 4개의 속 (genus)로 구분된다. 인간에 감염을 일으키는 인간 코로나바이러스 (human coronavirus, HCoV) 중 HCoV-229E와 HCoV-NL63는 알파 코로나바이러스 (alphaCoV) 에 속하며, 일반적인 호흡기 감염을 일으킨다. HCoV-OC43, SARS-CoV, 그리고 MERS-CoV는 베타코로나바이러스 (betaCoV)에 속하며, 감기와 같은 상부 호흡기 감염 및 소화기 질환을 유도하기도 한다. 또한 betaCoV에 속하는 SARS-CoV와 MERS-CoV는 급성 호흡기 증상을 특징으로 하는 심각한 호흡기 전염병을 유발한다. SARS및 MERS-CoV와 관련한 사망률은 각각 최대 10%와 35%이다. 사스-코로나바이러스-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2, SARS-CoV-2)는 중국 우한의 비정형 폐렴 환자로부터 분리된 바이러스의 상동성 분석 결과, 제2의 사스-코로나바이스이며 betaCoV에 속하는 것으로 밝혀졌고, 또한 감염력 및 전파력이 높고 급성 호흡기 증상을 유발하여 사망에 이르게 한다. 전세계적으로 약 9000만명 감염자가 발생하였고 약190만명이 사망자가 발생하였다. 비록 렘데시비어 (remdesivir) 및 밤라니비맙 (bamlanivimab) 등 치료제 그리고 mRNA 백신이 단기간에 개발 및 승인되어 보급되기 시작되었으나, 팬데믹을 종식시키기 위해 보다 안전하고 저렴한 백신 개발 및 보급이 필요한 실정이다.
사스-코로나바이러스-2의 유전체(genome)는 약3만개의 RNA로 구성되어 있으며, 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질이 세포의 ACE2 수용체 (angiotensin converting enzyme 2)에 결합하여 사스-코로나바이러스-2가 세포에 진입하고 바이러스 복제를 일으킨다. 코로나바이러스 표면에는 왕관 모양의 돌기 (스파이크, spike)가 특징적으로 발현된다. 스파이크 단백질은 약 1,200개 아미노산으로 되어 있고, 스파이크1 (S1)과 스파이크2 도메인 (S2 domain)으로 구성되어 있다. 기능적으로 S1은 세포 수용체 결합 그리고 S2는 퓨전 (fusion)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 사스-코로나바이러스-2 유전체는 스파이크 단백질 등 구조단백질뿐만 아니라 바이러스 중합효소, 단백질 분해 효소 등 바이러스 복제 및 감염에 관여하는 단백질을 코딩하는 알려져 있다.
현재 코로나19 예방에 사용되고 있는 백신은 크게 mRNA 백신이 있고, 바이러스벡터백신 (virus vectored vaccine)이 긴급사용승인을 받아 사용되고 있다. mRNA 백신은 스파이크단백질을 코딩하는 mRNA와 지질 등이 혼합된 형태의 백신으로 근육투여하여 인체에서 스파이크 단백질을 발현시켜 면역반응을 유도하는 백신이다. 바이러스벡터 백신은 아데노바이러스 (adenovirus) 표면의 돌기를 사스-코로나바이러스-2의 스파이크 단백질로 대체한 형태의 백신이다. 그러나 이 두 백신은 신규 형태의 백신으로 임상시험을 통해 그 효력 및 안정성이 검증되었으나 대규모 백신접종에 따른 안정성 문제와 백신 효력의 지속성 문제가 제기되고 있는 상황이다. 한편 바이러스 변이에 따른 백신 무용론 또한 대두되고 있다.
따라서, 이러한 신규 형태의 백신의 단점을 갖지 않고 보다 안전성이 확인된 기존 백신 형태이며, 세포 매개 면역원성을 선택적으로 증가시켜 바이러스 변이에 대한 대응 및 백신 효력의 지속성을 갖는 새로운 사스-코로나바이러스-2 백신 조성물의 개발이 필요하다. 또한 mRNA 백신의 경우, 낮은 온도로 유통되어야 하는 단점이 있어 2-8ºC에서 유통 가능한 백신의 필요성이 있다.
상기와 같은 백신들의 안전성 및 효력의 지속성 검증이 좀 더 이루어져야 하며, 변이 대응 및 유통의 문제가 있으므로 팬데믹 상황에서 예방의 효과가 다소 제한적일 수 있으며, 일부 환자에서 아나필락시스 반응 등 유발하는 등의 문제점이 발견되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein) 및 면역글로불린 분자의 불변부를 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기의 발현 벡터가 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기의 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기의 융합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기의 면역원성 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기의 면역원성 조성물을 투여하여 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 상기의 면역원성 조성물을 투여하여 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하고자, 본 발명은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein) 및 면역글로불린 분자의 불변부를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 스파이크 단백질은 i) 전장(full length) S 단백질 또는 이의 단편; ii) S1 단백질 또는 이의 단편; iii) S2 단백질 또는 이의 단편; 또는 iv) RBD(Receptor binding domain) 영역 또는 이의 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여기서, 상기 전장(full length) S 단백질 또는 S1 단백질은 RBD(Receptor binding domain) 영역을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 스파이크 단백질은 i) a) S1 단백질 또는 이의 단편과 b) S2 단백질 또는 이의 단편의 융합 단백질; 또는 ii) a) RBD(Receptor binding domain) 영역 또는 이의 단편과 b) S2 단백질 또는 이의 단편의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 스파이크 단백질은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있으나, 이 서열에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 면역글로불린 분자의 불변부(예, Fc 부위)는 Fc 수용체와 결합하여 면역원성을 증진시키는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질의 상기 면역글로불린 분자의 불변부는 면역글로불린 중쇄 불변 부위일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgA으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린은 IgG일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린 분자의 불변부는 IgG1 중쇄의 불변부일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린 분자의 불변부는 IgG1의 힌지(hinge) 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있으며, 다른 일 구체예에서, 상기 면역글로불린 분자의 불변부는 IgG1의 CH1 도메인을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린 분자의 불변부는 Fc 부위를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 Fc 부위는 Fc 수용체와 결합하여 면역원성을 증진시킬 수 있다.
일 구체예에서, 상기 Fc 부위는 Fc 변이체를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 Fc 변이체는 Fc 수용체와의 결합력을 증진시킬 수 있는, 하나 이상의 Fc 변이를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 Fc 변이체는 Fc 수용체와의 결합력을 증진시켜 면역원성을 증진시킬 수 있는, 하나 이상의 Fc 변이를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 Fc 변이체는 G236A, S239D, A330L, 및 I332E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변이를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 Fc 변이체는 G236A/S239D/A330L/I332E 변이를 모두 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 Fc 부위는 서열번호 5의 서열을 포함할 수 있으나, 이 서열에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 Fc 변이체는 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있으나, 이 서열에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 7 내지 18 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있으나, 이 서열에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein) 및 면역글로불린 분자의 불변부를 포함하는 융합 단백질에서, 상기 스파이크 단백질이 a) S1 단백질 또는 이의 단편과 b) S2 단백질 또는 이의 단편의 융합 단백질인 경우, 상기 S1 단백질과 S2 단백질 사이에 서열번호 19의 서열을 포할 수 있으나, 이 서열에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은,
i)
상기 발현 벡터를 동물세포 발현 시스템에 도입하는 단계; 및
ii)
융합 단백질의 발현을 수행하는 단계
를 포함하는, 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 과제를 해결하고자, 본 발명은 상기의 융합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 모노머(monomer)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 다이머(dimer)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여기서, 상기 다이머는 두 융합 단백질의 힌지(hinge) 영역에서 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물은 애주번트를 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 애주번트는 TLR4(Toll-like receptor 4) 작용제, 알루미늄염, 사포닌(saponin) 및 리포좀(liposome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 TLR4(Toll-like receptor 4) 작용제는 MPL(Monophosphoryl Lipid A) 및 3D-MPL로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 알루미늄염은 알루미늄 히드록시드(Aluminium hydroxide), 알루미늄 포스페이트(phosphate) 및 알루미늄 설페이트(sulphate)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 사포닌(saponin)은 QS21, QS17 및 QuilA으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 또 다른 과제를 해결하고자, 본 발명은 상기의 면역원성 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 과제를 해결하고자, 본 발명은 상기의 면역원성 조성물을 투여하여 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명의 또 다른 과제를 해결하고자, 본 발명은 상기의 면역원성 조성물을 투여하여 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein) 및 면역글로불린 분자의 불변부를 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물은 사스-코로나바이러스-2 특이적 중화 항체를 유도할 뿐만 아니라 세포-매개 면역 반응을 현저히 증가시킬 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물은 변이 바이러스에 대한 대응 면역 반응이 일어날 수 있을 뿐만 아니라, 장기간 지속 가능한 효과를 나타낼 수 있으므로, 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 사스-코로나바이러스-2 특이적인 중화 항체 생성량을 나타낸다.
도 2는 사스-코로나바이러스-2 특이적인 총 IgG 항체의 생성량을 나타낸다.
도 3는 사스-코로나바이러스-2 특이적인 IgG1 항체의 생성량을 나타낸다.
도 4는 사스-코로나바이러스-2 특이적인 IgG2a 항체의 생성량을 나타낸다.
도 2는 사스-코로나바이러스-2 특이적인 총 IgG 항체의 생성량을 나타낸다.
도 3는 사스-코로나바이러스-2 특이적인 IgG1 항체의 생성량을 나타낸다.
도 4는 사스-코로나바이러스-2 특이적인 IgG2a 항체의 생성량을 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 기재는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 상세한 설명에 기재된 사항들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 범위는, 이하 설명되는 내용에 의해 제한되지 않으며, 특히, 이하의 실시예 등에 기재된 실험 조건 등에 따라 가변될 수 있는 일체의 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 제한될 것이므로, 오직 추가의 이해를 위해 본 명세서에서 사용된 용어는, 본 발명의 상세한 실시예를 설명하는 목적을 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 제한하여서는 안된다.
본 명세서에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 그리고 과학 용어는 당업계에서 통상적인 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 용어와 동일한 의미로 해석된다. 본 명세서에 언급된 모든 참조 문헌은, 이들의 공개된 전체의 내용이 본 명세서의 발명을 설명하기 위한 참조된 내용으로 본 발명의 명세서의 내용으로써 통합된다.
본 발명은 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein) 및 면역글로불린 분자의 불변부를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로서, 좀 더 구체적인 예로서, 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 표면의 스파이크 단백질의 카르복시 말단(Carboxyl terminus)에 면역글로불린 중쇄불변부 부분(fragment crystalizable, Fc)의 아미노 말단(Amino terminus)이 펩티드 결합을 통해 연결된 Fc-융합단백질을 제공한다.
상기 스파이크 단백질은 상기 스파이크 단백질은
i)
전장(full length) S 단백질 또는 이의 단편;
ii)
S1 단백질 또는 이의 단편;
iii)
S2 단백질 또는 이의 단편; 또는
iv)
RBD(Receptor binding domain) 영역 또는 이의 단편
을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
여기서, 상기 전장(full length) S 단백질 또는 S1 단백질은 RBD(Receptor binding domain) 영역을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 스파이크 단백질은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있으나, 이 서열에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역글로불린은 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgA으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린은 IgG일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린 분자의 불변부는 IgG1 중쇄의 불변부일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린 분자의 불변부는 IgG1의 힌지(hinge) 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있으면, 상기 면역글로불린 분자의 불변부는 IgG1의 CH1 도메인을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 면역글로불린 분자의 불변부는 Fc 부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 Fc 부위는 Fc 수용체와 결합하여 면역원성을 증진시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 Fc 부위는 서열번호 5 서열을 포함할 수 있으나, 이 서열에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 Fc 부위는 Fc 변이체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 Fc 변이체는 G236A, S239D, A330L, 및 I332E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변이를 포함할 수 있다. 상기 Fc 변이체는 G236A/S239D/A330L/I332E 변이를 모두 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 Fc 변이 위치의 넘버링은 EU 넘버링에 따르나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 Fc 변이체는 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있으나, 이 서열에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 7 내지 18 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있으나, 이 서열에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은,
i)
상기 발현 벡터를 동물세포 발현 시스템에 도입하는 단계; 및
ii)
융합 단백질의 발현을 수행하는 단계
를 포함하는, 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 융합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 모노머(monomer)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 다이머(dimer)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여기서, 상기 다이머는 두 융합 단백질의 힌지(hinge) 영역에서 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물은 애주번트를 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 애주번트는 TLR4(Toll-like receptor 4) 작용제, 알루미늄염, 사포닌(saponin) 및 리포좀(liposome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 TLR4(Toll-like receptor 4) 작용제는 MPL(Monophosphoryl Lipid A) 및 3D-MPL로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 알루미늄염은 알루미늄 히드록시드(Aluminium hydroxide), 알루미늄 포스페이트(phosphate) 및 알루미늄 설페이트(sulphate)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 사포닌(saponin)은 식물 및 해양 동물계에 널리 분포된 트리페르텐 글리코시드 물질로서, 당업계에서 주로 용인되는 애주번트이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 사포닌은 QS21, QS17 및 QuilA로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 바람직하게는 QS21일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. QS21은 퀴라자 사포나리아(Quillaja saponaria)의 껍질로부터 유래한 추출물을 HPLC 정제하여 사용하며, 아실화된 3, 28-bisdesmodic triterpene glycosides (1,3)으로도 표기된다.
상기 리포좀(Liposome)은 인지질 이중층으로 형성된 지질 기반의 타원형 구조체로서, 통상적으로 백신 조성물 또는 약학적 조성물 등에 포함되어 약물전달운반체로서 역할을 수행한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 리포좀은 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDA), 1,2-디올레오일-3-트리메틸 암모늄프로페인(DOTAP), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤(3β-[N-(N,N-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸암모늄프로페인(DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethyl phosphocholine, 14:1 Etyle PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine , 16:0-18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dioleoyl-snglycero- 3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸 포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl) amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane, 14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-dimethyl ammonium-propane, 16:0 DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인(1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TA), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인(1,2-dimyristoyl-3-trimethyl ammonium-propane, 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민(N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 리포좀은 추가적으로 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린([0020] 1,2-Dimyristoyl-snglycero-3-phosphorylcholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 포스파티딜세린(PS), 포스포에탄올라민(PE), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스포릭액시드(PA) 및 포스파티딜콜린(PC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 중성 지질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기의 면역원성 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 과제를 해결하고자, 본 발명은 상기의 면역원성 조성물을 투여하여 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명의 또 다른 과제를 해결하고자, 본 발명은 상기의 면역원성 조성물을 투여하여 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 예방하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 상기 각 특징들은 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 각 특징들이 특허청구범위의 서로 다른 종속항에 기재된다는 사실은 이들이 조합되어 사용될 수 없음을 나타내는 것은 아니다.
실시예 1. 바이러스 항원 및 Fc 부위 융합 단백질 제조
하기와 같은 방법으로 S1-Fc, S1-Fc', S2-Fc' 융합 단백질을 제조하였다.
사스-코로나바이러스-2의 S 단백질과 인간 IgG의 Fc 부위가 결합된 융합 단백질의 DNA를 합성하여 동물세포 발현 벡터(expression vector)인 pCT146 벡터에 클로닝하였다. 합성한 S1-Fc는 wild type의 인간 IgG Fc를 포함하고 있으며, S1-Fc', S2-Fc' 는 인간 IgG Fc 부분의 아미노산이 mutation (G236A/S239D/A330L/I332E)된 mutant Fc를 포함하고 있다. 합성된 S1-Fc, S1-Fc', S2-Fc' DNA를 2종의 제한효소(restriction enzyme), 즉 NheI과 PmeI으로 절단하고, pCT146 벡터도 동일한 제한효소로 절단하였다. 절단된 S1-Fc, S1-Fc', S2-Fc' DNA와 벡터 DNA를 T4 연결효소(ligase)를 이용하여 연결하였다. 클로닝된 pCT146 DNA를 대장균(E.coli)에 형질전환(transformation) 하고, 콜로니(colony)를 분석하여 pCT146 벡터에 S1-Fc, S1-Fc', S2-Fc' 유전자가 삽입된 박테리아 클론(bacteria clone)을 선별하였다. 이 벡터를 각각 pCT665, pCT666, pCT667로 명명하였다.
다음으로, 선별된 콜로니를 배양하여 DNA를 정제하였다. 중국 햄스터 난소 세포주(Chinese hamster ovary cell line, CHO) 중 하나인 ExpiCHO-S 동물세포에 정제된 고순도의 DNA를 이용하여 Transient Transfection을 진행하였다. 이 ExpiCHO-S 세포를 유가식 배양 (fed-batch culture) 하여 S1-Fc, S1-Fc', S2-Fc' 융합단백질을 생산 하였다. 세포 밖으로 배출되는 S1-Fc, S1-Fc', S2-Fc' 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (Protein A affinity chromatography)를 이용하여 정제하였다.
실시예 2. MPL 및 알루미늄 히드록시드의 준비 및 면역원성 조성물 제조
다음으로, 본 발명의 면역원성 조성물 실험을 위해, 애주번트(면역증강제)로서 MPL 및 알루미늄 히드록시드를 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
MPL 또는 MPLA 로도 알려져 있는 모노포스포릴 지질A(Monophosphoryl Lipid A)는 인비보젠(InvivoGen) 사의 MPLA-SM VacciGradeTM(Catalog code: vac-mpla) 제품을 제조사의 방법에 따라 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 분주한 뒤, 영하 20℃에서 냉동 보관하여 사용하였다.
MPL은 살모넬라 미네소타(Salmonella Minnesota) R595 균주의 Re 돌연변이 (Re mutant)로부터 생산된 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)로부터 추출되는데, 지질 A(lipid A)는 LPS의 내독소 활성(endotoxic activity)에 주로 관여하며, 지질 A에서 phosphate group 하나가 제거된 것이 MPL 로서, 독성은 줄고, 면역증강 효과는 그대로 유지된 물질을 일컫는다(Infect Immun. 71 (5): 2498-507, Int Immunol. 14(11):1325-32, J. Biol. Chem. 257(19): 11808-15, Infect Immun. 79(9): 3576-3587). LPS와 마찬가지로 MPL은 톨유사수용체 4의 작용제(Toll-like receptor 4, TLR4 agonist)로 기능하여, Th1 면역 반응을 강하게 유도한다고도 알려져 있다 (Science 316(5831):1628-32, Infect Immun. 75(12): 5939-46).
다음으로, 알루미늄 히드록시드로서 인비보젠(InvivoGen)사의 알하이드로겔 애주번트 2%(Alhydrogel® adjuvant 2%, catlog# vac-alu-250) 제품을 분주하여 사용하였다.
알루미늄계열의 애주번트는 항원제시세포(antigen presenting cells, APCs)의 항원 흡수를 증가시키고, Th2 면역 반응을 유도하고 Th1 면역 반응은 유도하지 않는 것으로 알려져 있다(Immunity 33(4): 492-503).
상기 실시예 1에서 준비한 항원 및 융합 단백질에 MPL 및 알루미늄 히드록시드를 PBS 용액(phosphate-buffered saline)을 사용하여 특정 농도로 혼합하여 본 발명의 면역원성 조성물을 제조하였다.
실험예 1. 중화 항체 실험
상기 실시예 2에서 제조된 면역원성 조성물의 효능을 평가하기 위해, 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였다.
사스-코로나바이러스-2 표면 스파이크 (Spike, S) 단백질 도메인 (S1 또는 S2 domain)와 인간 IgG1 항체의 Fc 부위가 결합된 융합 단백질 항원과 애주번트가 포함된 다양한 조건의 조성물을 2회 2주 간격으로 근육주사(intramuscular injection) 하여 면역접종하였다. 백신조성물에 의한 사스-코로나바이러스-2 특이적 체액성 및 세포성 면역원성(humoral and cellular immunity)을 측정하기 위해 2차 면역접종으로부터 2주(14일)후에 마우스로부터 혈청 분리를 위해 안와채혈하였다.
조성물의 중화면역 반응(neutralization response) 및 체액성/세포성 면역 반응(humoral and cellular immune response)을 평가하기 위한 실험디자인을 하기 표 1에 나타내었다. 표 1의 S1-Fc는 사스-코로나바이러스-2의 표면 단백질 S1 도메인과 인간 IgG1 항체의 Fc가 융합된 항원, MPL은 애주번트(면역증강제)로써의 모노포스포릴 지질A, alum은 알루미늄 히드록시드를 의미한다(실시예 1 및 2 참조). 또한, S1-Fc'는 사스-코로나바이러스-2의 표면 당단백질 S1 도메인과 엔지니어링 (engineering) 된 인간 IgG1 항체의 Fc가 융합된 항원, MPL은 애주번트(면역증강제)로써의 모노포스포릴 지질A, alum은 알루미늄 히드록시드를 의미한다. 또한, S2-Fc'는 사스-코로나바이러스-2의 표면 단백질 S2 도메인과 엔지니어링된(engineering) 인간 IgG1 항체의 Fc가 융합된 항원, MPL은 애주번트(면역증강제)로써의 모노포스포릴 지질A, alum은 알루미늄 히드록시드를 의미한다. 또한, 그룹 1 내지 9내 각 조성물의 최종 볼륨은 100㎕씩 맞추어 투여하였다.
| 그룹 | 백신조성물 | 1차 면역접종 (2주) | 2차 면역접종 (4주) | 샘플채취 (6주) |
| 1 | PBS | IM | IM | Serum |
| 2 | S1 (5 μg) + alum | IM | IM | Serum |
| 3 | S1-Fc (5 μg) + alum | IM | IM | Serum |
| 4 | S1-Fc' (5 μg) + alum | IM | IM | Serum |
| 5 | S2-Fc' (5 μg) + alum | IM | IM | Serum |
| 6 | S1 (5 μg) + MPL + alum | IM | IM | Serum |
| 7 | S1-Fc (5 μg) + MPL + alum | IM | IM | Serum |
| 8 | S1-Fc' (5 μg) + MPL + alum | IM | IM | Serum |
| 9 | S2-Fc' (5 μg) + MPL + alum | IM | IM | Serum |
본 조성물의 중화 면역 반응을 평가하기 위해 5주령 C57BL/6 female mouse (Koatech)에 2차 면역접종으로부터 2주후, 분리한 혈청을 이용하여 FRNT (Focus Reduction Neutralization Test) 분석을 수행하였다. 이를 위해, 마우스의 혈액 샘플을 원심분리 (40분, 4ºC) 하여 혈액으로부터 혈청을 분리하여 -80ºC 에 보관하였다.
Vero 세포 (Vero cell)를 96웰 플레이트 (plate)에 분주하여 16-18시간 세포배양을 하였다. 2% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 마우스 혈청을 2배씩 계단 희석하여 준비하였고, 사스-코로나바이스-2 (3.51 x 106 PFU/ml, BetaCoV/Korea/KCDC03/2020, 국가자원체은행)을 같은 배지를 사용하여 300 PFU가 되도록 희석하여 준비하였다. 희석하여 준비한 혈청 시료와 바이러스를 혼합하여 CO2세포배양기에서 37℃ 조건으로 30분간 반응시켰다. 이와 같이 반응시킨 혈청-바이러스 혼합물을 96웰 플레이트에 배양된 Vero 세포에 첨가하여 CO2 세포배양기에서 37℃ 조건으로 4시간 반응시켰다. 반응 후 PBS 세척을 하고 포름알데히드를 첨가하여 4ºC 에서 16-18시간 동안 세포를 고정하였다.
PBS 세척 후, blocking buffer (1% BSA, 0.5% goat serum, 0.5% tween-20 in PBS) 를 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 1:3000으로 희석한 SARS-CoV-2 NP rabbit mAb(Sino Biological, 40143-R001) 를 플레이트에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% tween-20 가 포함된 PBS 세척액으로 3회 세척한 후, 1:2000으로 희석한 goat anti rabbit IgG-HRP(Bio-Rad, 1721019)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% tween-20 가 포함된 PBS 세척액으로 3회 세척한 후, PBS로 1회 세척하였다. KPL TrueBlue Peroxidase Substrate (Seracare, Cat:5510-0030)) 를 플레이트에 첨가한 후, 암조건 및 상온에서 30분간 반응시키고, 증류수로 세척 후 건조하였다. TrueBlue 시액으로 염색된 포커스 (foci)는 면역물질광학분석기 (immunospot reader, C.T.L.)를 사용하여 측정하였다. 혈청없이 바이러스 감염을 기준으로 하여 백분율을 구하여 평가하였다.
그 결과, PBS 군 및 alum 면역증강제 군에 비해 S1, S1-Fc, 및 S1-Fc' 항원과 MPL/alum 애주번트가 포함된 조성물이 현저한 중화면역 반응을 보였다 (표 2, 도 1). S1 단백질과 MPL/alum 애주번트가 포함된 조성물이 가장 높은 중화항체가를 보였으나, S1-Fc 또는 S1-Fc' 융합 단백질과 MPL/alum 애주번트가 포함된 조성물들과 약 2-3배 차이로 유의미한 차이를 보이지 않았다.
실험예 2. ELISA 실험
상기 실험예 1 조합(그룹 1 내지 9)의 조성물 효능을 평가하기 위해, 하기와 같은 방법으로 추가 실험을 진행하였다.
2차 면역접종으로부터 약 4주 후, 마우스의 혈액으로부터 분리한 혈청을 이용하여 백신 조성물에 의해 유도된, 총 IgG 생성량, IgG1 항체와 IgG2a 항체생성량을 ELISA 분석법으로 측정하였다.
0.5 μg/ml 농도의 SARS-CoV-2 S 단백질 (Acro Biosystem, SPN-C52H8), 0.5 μg/ml 농도의 SARS S1 단백질 (Acro Biosystem, S1N-852H5)을 코팅 용액(coating buffer, carbonate/bicarbonate buffer, Sigma, catalog number C3041-100CAP)을 이용하여 96웰 플레이트(96-well plate)에 4℃조건에서 16 내지 18시간 동안 코팅(coating)하였다. 세척 용액 (0.05 % tween 20 in 1x PBS, PBS-Tween tablet;Calbiochem, catalog# 524653 with 1L PW)을 이용하여 3회 세척하고, 희석액(Diluent, Teknova, catalog# 2D5120-1L; 1% BSA, 0.05% Tween-20, 1X PBS로 구성됨) 희석액을 이용하여 플레이트를 1시간 동안 상온에서 블로킹(blocking)하였다. 3회 세척 후, S1 단백질이 코팅된 플레이트에 1,2,3,4,6,7,8 군의 혈청 샘플을 넣고 1시간 30분에서 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 또한 SARS-CoV-2 S 단백질이 코팅된 플레이트에 1, 5, 9 군의 혈청 샘플을 넣고 1시간 30분에서 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 3회 세척 후, 검출 항체: i) Goat anti-mouse IgG conjugated to HRP (SOUTHERN BIOTECH, Catalog# 1030-05, ii) horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG1 (BioRad, Catalog# STAR132P) 또는 iii) horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG2a (BioRad, Catalog# STAR133P)을 넣고 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 6회 세척한 후, TMB(3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, Sigma, Catalog# T0440)을 플레이트에 넣고 5분간 반응하였고, 황산 용액(H2SO4, Merck, Catalog# 109072) 넣어 반응을 중지하였다. 플레이트 리더(plate reader)을 이용하여 각 샘플의 흡광도(optical density)를 측정하였다. 그리고 해당 시험의 결과인 사스-코로나바이러스-2 융합 단백질 즉, 코로나 바이러스 특이적인 총 IgG, 그리고 IgG1과 IgG2a 항체의 생성량을 측정하였다. IgG1 생성량은 체액성 면역 반응의 산물을 의미하며, 반면 IgG2a 생성량은 세포성 면역 반응의 산물을 의미한다. 총 IgG는 이 IgG1, IgG2a 등 모든 IgG 항체를 의미한다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 총 IgG 생성량은 PBS 대비 모든 군에서 현저하게 증가되었다. S2-Fc'+alum과 S2-Fc'+MPL+alum 조합이 IgG 항체를 생성시키는 효과가 뛰어남을 확인하였고, 이는 체액성 면역 반응의 증가를 나타낸다. 이러한 경향은 IgG1 ELISA 실험에서도 유사하게 확인되었다 (도 3). 반면에 세포성 면역원성의 지표인 IgG2a 생성량은 S1-Fc'+MPL+alum 군에서만 관찰 되었다. 이는 Fc 엔지니어링(engineering)의 효과에 의한 세포성 면역원성 증가를 의미한다 (도 4).
결과를 종합하면, PBS군 (음성대조군) 대비 모든 실험군에서 IgG1 항체가 생성되었고, S1 도메인을 포함하고 MPL/alum 면역증강제가 포함된 조성물에서 현저한 중화항체가 생성되었으며, 특히 엔지니어링된 Fc을 포함한 S1-Fc'과 MPL/alum 혼합 조성물이 세포성 면역반응을 상당하게 유도하였다.
하기 표 3, 표 4, 표 5는 각각 도 2, 도 3, 도 4에 대응된다.
| 그룹 | 백신조성물 | Total IgG 항체가 | 평균 |
log2
평균 |
log2
표준편차 |
||||
| 1 | PBS | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | n/a | n/a | n/a |
| 2 | S1 (5 μg) + alum |
0.00 | 2500.00 | 500.00 | 0.00 | 0.00 | 600.0 | 9.2 | 5.6 |
| 3 | S1-Fc (5 μg) + alum |
500 | 2500 | 500 | 2500 | 500 | 1300.0 | 10.3 | 1.3 |
| 4 | S1-Fc' (5 μg) + alum |
0 | 500 | 2500 | 0 | 500 | 700.0 | 9.5 | 5.4 |
| 5 | S2-Fc' (5 μg) + alum |
62500 | 62500 | 62500 | 62500 | 62500 | 62500.0 | 15.9 | 0.0 |
| 6 | S1 (5 μg) + MPL + alum |
12500 | 2500 | 2500 | 2500 | 0 | 4000.0 | 12.0 | 5.4 |
| 7 | S1-Fc (5 μg) + MPL + alum |
500 | 2500 | 0 | 0 | 2500 | 1100.0 | 10.1 | 5.8 |
| 8 | S1-Fc' (5 μg) + MPL + alum |
500 | 500 | 2500 | 12500 | 500 | 3300.0 | 11.7 | 2.1 |
| 9 | S2-Fc' (5 μg) + MPL + alum |
1,562,500 | 62,500 | 312500 | 62,500 | 62,500 | 412500.0 | 18.7 | 2.1 |
| 그룹 | 백신조성물 | IgG1 항체가 | 평균 |
log2
평균 |
log2
표준편차 |
||||
| 1 | PBS | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | n/a | n/a | n/a |
| 2 | S1 (5 μg) + alum |
0.00 | 2500.00 | 500.00 | 0.00 | 0.00 | 600.0 | 9.2 | 5.6 |
| 3 | S1-Fc (5 μg) + alum |
12500 | 12500 | 2500 | 12500 | 12500 | 10500.0 | 13.4 | 1.0 |
| 4 | S1-Fc' (5 μg) + alum |
0 | 500 | 12500 | 500 | 2500 | 3200.0 | 11.6 | 5.2 |
| 5 | S2-Fc' (5 μg) + alum |
62500 | 62500 | 62500 | 62500 | 62500 | 62500.0 | 15.9 | 7.1 |
| 6 | S1 (5 μg) + MPL + alum |
12500 | 12500 | 2500 | 12500 | 0 | 8000.0 | 13.0 | 7.1 |
| 7 | S1-Fc (5 μg) + MPL + alum |
500 | 2500 | 0 | 0 | 2500 | 1100.0 | 10.1 | 5.8 |
| 8 | S1-Fc' (5 μg) + MPL + alum |
500 | 500 | 2500 | 12500 | 500 | 3300.0 | 11.7 | 2.1 |
| 9 | S2-Fc' (5 μg) + MPL + alum |
1,562,500 | 62,500 | 62500 | 12,500 | 62,500 | 352500.0 | 18.4 | 2.5 |
| 그룹 | 백신조성물 | IgG2a 항체가 | 평균 |
log2
평균 |
log2
표준편차 |
||||
| 1 | PBS | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | n/a | n/a | n/a |
| 2 | S1 (5 μg) + alum |
0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.0 | 0 | 0 |
| 3 | S1-Fc (5 μg) + alum |
0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.0 | 0 | 0 |
| 4 | S1-Fc' (5 μg) + alum |
0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.0 | 0 | 0 |
| 5 | S2-Fc' (5 μg) + alum |
0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.0 | 0 | 0 |
| 6 | S1 (5 μg) + MPL + alum |
0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.0 | 0 | 0 |
| 7 | S1-Fc (5 μg) + MPL + alum |
0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.0 | 0 | 0 |
| 8 | S1-Fc' (5 μg) + MPL + alum |
0 | 0 | 500 | 0 | 0 | 100.0 | 6.6 | 4.0 |
| 9 | S2-Fc' (5 μg) + MPL + alum |
0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.0 | 0 | 0 |
<110> CELLTRION, INC.
<120> Fusion Protein of SARS-CoV-2 and Immunogenic Composition
Comprising the Same
<130> CPD2021003KR
<160> 19
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1258
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S protein full length
<400> 1
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val
660 665 670
Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn
675 680 685
Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr
690 695 700
Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser
705 710 715 720
Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn
725 730 735
Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu
740 745 750
Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala
755 760 765
Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly
770 775 780
Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg
785 790 795 800
Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala
805 810 815
Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg
820 825 830
Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro
835 840 845
Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala
850 855 860
Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln
865 870 875 880
Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val
885 890 895
Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe
900 905 910
Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser
915 920 925
Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu
930 935 940
Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser
945 950 955 960
Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val
965 970 975
Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr
980 985 990
Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
995 1000 1005
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg
1010 1015 1020
Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser
1025 1030 1035 1040
Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln
1045 1050 1055
Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala
1060 1065 1070
His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe
1075 1080 1085
Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn
1090 1095 1100
Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn
1105 1110 1115 1120
Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu
1125 1130 1135
Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly
1140 1145 1150
Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile
1155 1160 1165
Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp
1170 1175 1180
Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr
1185 1190 1195 1200
Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr
1205 1210 1215
Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys
1220 1225 1230
Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1235 1240 1245
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1250 1255
<210> 2
<211> 666
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S1 protein
<400> 2
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro
660 665
<210> 3
<211> 528
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S2 protein
<400> 3
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn
20 25 30
Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys
35 40 45
Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys
50 55 60
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
65 70 75 80
Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val
85 90 95
Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
100 105 110
Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser
115 120 125
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
130 135 140
Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
165 170 175
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
195 200 205
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
210 215 220
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
225 230 235 240
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
245 250 255
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
260 265 270
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
275 280 285
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
290 295 300
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
305 310 315 320
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
325 330 335
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
340 345 350
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
355 360 365
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
370 375 380
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
385 390 395 400
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
405 410 415
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
420 425 430
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
435 440 445
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
450 455 460
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
465 470 475 480
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
485 490 495
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
500 505 510
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro
515 520 525
<210> 4
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD
<400> 4
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 5
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc wild type
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 6
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc variant
<400> 6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 7
<211> 1485
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S-Fc fusion protein
<400> 7
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
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705 710 715 720
Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile
725 730 735
Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Asp
740 745 750
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly
755 760 765
Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
770 775 780
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
785 790 795 800
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
805 810 815
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
820 825 830
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
835 840 845
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu
850 855 860
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
865 870 875 880
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
885 890 895
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
900 905 910
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
915 920 925
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
930 935 940
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
945 950 955 960
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
965 970 975
Gly Lys
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> added sequences between S1 and S2 in S1-S2-Fc fusion protein
structure
<400> 19
Arg Arg Ala Arg
1
Claims (35)
- 사스-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질(Spike protein, S protein) 및 면역글로불린 분자의 불변부를 포함하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 스파이크 단백질은
i) 전장(full length) S 단백질 또는 이의 단편;
ii) S1 단백질 또는 이의 단편;
iii) S2 단백질 또는 이의 단편; 또는
iv) RBD(Receptor binding domain) 영역 또는 이의 단편
을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 스파이크 단백질은
i) a) S1 단백질 또는 이의 단편과 b) S2 단백질 또는 이의 단편의 융합 단백질; 또는
ii) a) RBD(Receptor binding domain) 영역 또는 이의 단편과 b) S2 단백질 또는 이의 단편의 융합 단백질
을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 스파이크 단백질은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 면역글로불린은 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgA으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 면역글로불린은 IgG임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 면역글로불린 분자의 불변부는 IgG1 중쇄의 불변부임을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 면역글로불린 분자의 불변부는 IgG1의 힌지(hinge) 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 면역글로불린 분자의 불변부는 IgG1의 CH1 도메인을 추가로 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 면역글로불린 분자의 불변부는 Fc 부위를 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제11항에 있어서,
상기 Fc 부위는 Fc 수용체와 결합하여 면역원성을 증진시킴을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제11항에 있어서,
상기 Fc 부위는 Fc 변이체를 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제13항에 있어서,
상기 Fc 변이체는 G236A, S239D, A330L, 및 I332E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변이를 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제13항에 있어서,
상기 Fc 변이체는 G236A/S239D/A330L/I332E 변이를 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제11항에 있어서,
상기 Fc 부위는 서열번호 5의 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제13항에 있어서,
상기 Fc 변이체는 서열번호 6의 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 7 내지 18 중 어느 하나의 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제3항에 있어서,
상기 S1 단백질과 S2 단백질 사이에 서열번호 19의 서열을 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
- 제20항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제21항의 발현 벡터가 형질전환된 숙주 세포.
- i) 제21항의 발현 벡터를 동물세포 발현 시스템에 도입하는 단계; 및
ii) 융합 단백질의 발현을 수행하는 단계
를 포함하는, 융합 단백질을 제조하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
- 제24항에 있어서,
상기 융합 단백질은 모노머(monomer)임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제24항에 있어서,
상기 융합 단백질은 다이머(dimer)임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제26항에 있어서,
상기 다이머는 두 융합 단백질의 힌지(hinge) 영역에서 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 이루어짐을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제24항에 있어서,
애주번트를 추가로 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제28항에 있어서,
상기 애주번트는 TLR4(Toll-like receptor 4) 작용제, 알루미늄염, 사포닌(saponin) 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제29항에 있어서,
상기 TLR4(Toll-like receptor 4) 작용제는 MPL(Monophosphoryl Lipid A) 및 3D-MPL로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제29항에 있어서,
상기 알루미늄염은 알루미늄 히드록시드(Aluminium hydroxide), 알루미늄 포스페이트(phosphate) 및 알루미늄 설페이트(sulphate)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제29항에 있어서,
상기 사포닌(saponin)은 QS21, QS17 및 QuilA으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 포함하는 키트.
- 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하여 면역 반응을 유도하는 방법.
- 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하여 사스-코로나바이러스 감염증(COVID-19)을 예방하는 방법.
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