KR20040004449A - 변형된 아르기닌 데이미나제 - Google Patents

변형된 아르기닌 데이미나제 Download PDF

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KR20040004449A
KR20040004449A KR10-2003-7007054A KR20037007054A KR20040004449A KR 20040004449 A KR20040004449 A KR 20040004449A KR 20037007054 A KR20037007054 A KR 20037007054A KR 20040004449 A KR20040004449 A KR 20040004449A
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휘닉스 파머컬러직스, 인크.
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Abstract

본 발명은 폴리에틸렌글리콜로 변형된 아르기닌 데이미나제, 암의 치료 방법, 및 전이 (metastasis)의 치료 및(또는) 억제 방법에 관한 것이다.

Description

변형된 아르기닌 데이미나제 {MODIFIED ARGININE DEIMINASE}
<관련 출원>
본 출원은 1997년 5월 12일 출원된 미국 가출원 제60/046,200호를 우선권으로 주장하는 미국 특허 출원 제09/023,809호의 일부 계속 출원이다.
악성 흑색종 (단계 3) 및 간종양은 진단 1년 이내에 이 질환에 걸린 대상의 대부분을 사망시키는 치명적인 질병이다. 미국에서는 연간 대략 16,000명의 사람들이 이 질병으로 인해 사망에 이른다. 흑색종의 발생율은 미국에서 급속하게 증가하고 있으며, 이는 오스트레일리아와 같은 다른 국가들에서보다 훨씬 더 높다. 간종양의 발생율은 전세계적으로 간염이 풍토성인 지역에서 훨씬 더 높다. 예를 들어, 간종양은 일본 및 대만에서 암의 주된 형태 중 하나이다. 이러한 질병에 대한 효과적인 치료법이 긴급하게 요구되고 있는 실정이다.
필수 아미노산을 선택적으로 고갈시키는 방법이 일부 형태의 암을 치료하는데 이용되어 왔다. 가장 잘 알려진 예는 급성 림프구성 백혈병에 대한 처치로서 L-아스파라기나제를 사용하여 아스파라긴의 수준을 저하시키는 것이다. 가장 흔하게 사용되는 L-아스파라기나제는 이. 콜라이 (E. coli)로부터 단리된다. 그러나, 이 효소를 임상에서 사용하는 것은 문헌 (Y.K. Park, et al, Anticancer Res., 1: 373-376 (1981))에 기술된 바와 같이 그의 고유한 항원성 및 짧은 순환 반감기에 의한 제한을 받는다. 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 이. 콜라이 L-아스파라기나제를 공유적으로 변형시키게 되면, 예를 들어 문헌 (Park, Anticancer Res., supra; Y. Kamisaki et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 216: 410-414 (1981); and Y. Kamisaki et al, Gann., 73: 47-474 (1982))에 기술된 바와 같이 그의 항원성이 감소되고 그의 순환 반감기가 연장된다. 암의 치료를 위해 다른 필수 아미노산 분해 효소를 찾아내기 위한 수많은 노력이 있어왔지만, 주된 이유로는 필수 아미노산의 고갈이 당연히 많은 심각한 부작용을 일으키기 때문에 어떠한 것도 입증하지 못하였다.
비-필수 아미노산, 예를 들어 아르기닌을 분해하는 효소가 일부 형태의 암을 억제하는 효과적인 수단일 수 있음이 보고된 바 있다. 예를 들어, 슈도모나스 푸디타 (Pseudomonas pudita)로부터 단리된 아르기닌 데이미나제 (ADI)가 문헌 (J.B. Jones, "The Effect of Arginine Deiminase on Murine Leukemic Lymphoblasts," Ph.D. Dissertation, The University of Oklahoma, pages 1-165 (1981))에 기재되어 있다. 슈도모나스 푸디타로부터 단리된 ADI는 시험관내에서 종양 세포를 사멸시키는데는 효과적이지만, 중성 pH에서 효소 활성이 거의 없었으며 실험 동물의 순환류로부터 빠르게 제거되었기 때문에 생체내에서 효능을 나타내지 못하였다. 미코플라스마 아르기니니 (Mycoplasma arginini)로부터 유도된 아르기닌 데이미나제는 예를 들어, 전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌 (Takaku et al, Int. J. Cancer, 51: 244-249 (1992)) 및 미국 특허 제5,474,928호에 기재되어 있다. 그러나, 상기 이종 단백질의 치료적 사용과 관련된 문제는 그의 항원성이다. 미코플라스마 아르기니니 유래의 아르기닌 데이미나제를 염화시아누르산 연결기를 통해 폴리에틸렌글리콜로 화학적으로 변형시키는 것에 대하여는 문헌 (Takaku et al., Jpn. J. Cancer Res., 84: 1195-1200 (1993))에 기술되어 있다. 그러나, 변형된 단백질이 대사되는 경우 염화시아누르산 연결기로부터 시아니드가 방출됨으로 인해 독성을 띠게 되었다.
비-필수 아미노산을 분해하며 선행 기술과 연관된 문제점을 갖지 않는 조성물이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 목적뿐 아니라, 다른 중요한 목적에 관한 것이다.
<발명의 개요>
본 발명은 폴리에틸렌글리콜로 변형된 아르기닌 데이미나제에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 아르기닌 데이미나제는 총 중량 평균 분자량 약 1,000 내지 약 50,000의 폴리에틸렌글리콜로 직접 변형되거나, 생적합성 연결기를 통해 변형된다.
본 발명의 다른 실시양태는 예를 들어 육종, 간종양 및 흑색종을 비롯한 암의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양 세포의 전이를 치료하고(하거나) 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면은 하기 발명의 상세한 설명에서 설명될것이다.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜로 변형된 아르기닌 데이미나제, 암의 치료 방법, 및 전이 (metastasis)의 치료 및(또는) 억제 방법에 관한 것이다.
도 1은 미코플라스마 아르기니니 (위쪽 아미노산 서열, 서열 1, ADIPROT로 확인됨), 미코플라스마 아르쓰리티데스 (Mycoplasma arthritides)(중간의 아미노산 서열, 서열 2, ARTADIPRO로 확인됨) 및 미코플라스마 호미누스 (Mycoplasma hominus)(아래쪽 아미노산 서열, 서열 3, HOMADIPRO로 확인됨)로부터 클로닝된 아르기닌 데이미나제의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2A 및 2B는 마우스에서 혈청 아르기닌 수준 및 혈청 시트룰린 수준에 대하여 단일 투여량의 천연 아르기닌 데이미나제 및 폴리에틸렌글리콜 (예, 분자량 5,000)로 변형된 아르기닌 데이미나제의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 PEG10,000이 다양한 연결기를 통해 ADI에 공유 결합되는 경우 혈청 아르기닌 수준에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 단일 투여량의 PEG-ADI를 주입받은 마우스에서 폴리에틸렌글리콜의 연결기 및 분자량이 시트룰린 생산에 영향을 준 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5A 및 5B는 ADI-SS-PEG5,000이 혈청 아르기닌 및 시트룰린 수준에 영향을 준 투여 반응을 나타내는 그래프이다. 도 5C 및 5D는 ADI-SS-PEG20,000이 혈청 아르기닌 및 시트룰린 수준에 영향을 준 투여 반응을 나타내는 그래프이다.
도 6은 천연 ADI, ADI-SS-PEG5,000 및 ADI-SS-PEG20,000의 항원성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 SK-mel 2 인간 흑색종 세포를 주입받은 마우스에서 ADI-SS-PEG5,000,ADI-SS-PEG12,000 또는 ADI-SS-PEG20,000을 사용한 처리가 종양 크기를 감소시킨 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 SK-mel 28, SK-mel 2 또는 M24-met 인간 흑색종 세포를 주입받은 마우스에서 ADI-PEG20,000을 사용한 처리가 종양 크기에 영향을 준 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 인간 간종양 SK-Hep1 세포를 주입받은 마우스에서 ADI-PEG5,000, ADI-PEG12,000 또는 ADI-PEG20,000을 사용한 처리가 생존율에 영향을 준 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 스트렙토코커스 피오제네스 (Streptococcus pyogenes)로부터 클로닝된 아르기닌 데이미나제의 아미노산 서열 (위쪽 아미노산 서열, 서열 6, STRADIPYR로 확인됨) 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 클로닝된 아르기닌 데이미나제의 아미노산 서열 (아래쪽 아미노산 서열, 서열 7, STRADIPNE로 확인됨)을 나타낸다.
도 11은 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi)로부터 클로닝된 아르기닌 데이미나제의 아미노산 서열 (위쪽 아미노산 서열, 서열 8, BORADIBUR로 확인됨) 및 보렐리아 아프젤리 (Borrelia afzelii)로부터 클로닝된 아르기닌 데이미나제의 아미노산 서열 (아래쪽 아미노산 서열, 서열 9, BORADIAFZ로 확인됨)을 나타낸다.
도 12는 퀴아르디아 인테스티날리스 (Qiardia intestinalis)의 아미노산 서열 (위쪽 아미노산 서열, 서열 10, QIAADIINT로 확인됨), 클로스트리디움 페르프린젠스 (Clostridium perfringens)의 아미노산 서열 (중간의 아미노산 서열, 서열 11, CLOADIPER로 확인됨) 및 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis)의 아미노산 서열 (아래쪽 아미노산 서열, 서열 12, BACADILIC로 확인됨)을 나타낸다.
도 13은 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis)의 아미노산 서열 (위쪽 아미노산 서열, 서열 13, ENTADIFAE로 확인됨) 및 락토바실러스 세이크 (Lactobacillus sake)의 아미노산 서열 (아래쪽 아미노산 서열, 서열 14, LACADISAK로 확인됨)을 나타낸다.
정상 세포는 아르기니노숙시네이트 신타제 및 아르기니노숙시네이트 리아제에 의해 촉매되는 2단계 과정으로 시트룰린으로부터 아르기닌을 합성할 수 있기 때문에 성장을 위해 아르기닌을 필요로 하지 않는다. 이와는 달리, 흑색종, 간종양 및 여러 육종은 아르기노숙시네이트 신타제를 발현시키지 않으며, 따라서 이들은 아르기닌 영양요구성 (auxotrophic)이다. 이러한 대사적 차이는 상기 형태의 암을 치료하기 위한 안전하고 효과적인 요법을 개발하는데 있어서 이용될 수 있다. 아르기닌 데이미나제는 아르기닌의 시트룰린으로의 전환을 촉매하며, 아르기닌을 제거하는데 사용될 수 있다. 따라서, 아르기닌 데이미나제는 흑색종, 간종양 및 여러 육종의 치료에 사용될 수 있다.
천연 아르기닌 데이미나제는 미생물에서 발견될 수 있으며, 항원성으로 대상의 순환계로부터 빠르게 제거된다. 이러한 문제는 아르기닌 데이미나제를 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 공유적으로 변형시켜 극복할 수 있다. (연결기의 존재 또는부재하에) 폴리에틸렌글리콜로 공유적으로 변형된 아르기닌 데이미나제를 하기에서는 "ADI-PEG"라고 부른다. 천연 아르기닌 데이미나제와 비교하는 경우, ADI-PEG는 그의 효소 활성의 대부분을 보유하고, 항원성이 훨씬 적고, 크게 연장된 순환 반감기를 가지며, 종양의 치료에 있어서 훨씬 더 효과적이다.
"폴리에틸렌글리콜" 또는 "PEG"는 일반식 H(OCH2CH2)nOH (n은 4 이상임)로 표시되는 분지쇄 또는 직쇄로서, 에틸렌옥시드와 물의 축합 중합체 혼합물을 의미한다. "폴리에틸렌글리콜" 또는 "PEG"는 그의 대략적인 중량 평균 분자량을 나타내는 숫자 접미어와 함께 사용된다. 예를 들어, PEG5,000은 총 중량 평균 분자량이 약 5,000인 폴리에틸렌글리콜을 의미하고, PEG12,000은 총 중량 평균 분자량이 약 12,000인 폴리에틸렌글리콜을 의미하며, PEG20,000은 총 중량 평균 분자량이 약 20,000인 폴리에틸렌글리콜을 의미한다.
"흑색종"은 피부, 및 구강, 식도, 항문관, 질, 연수막 및(또는) 결막 또는 눈을 비롯한 다른 기관의 멜라닌세포계로부터 발생하는 악성 또는 양성 종양일 수 있다. "흑색종"이라는 용어는 예를 들어 말단흑자성 흑색종, 멜라닌결핍성 흑색종, 양성연소성 흑색종, 악성흑점자 흑색종, 악성 흑색종, 결절성 흑색종, 손발톱밑 흑색종 및 얕은 확산성 흑색종을 포함한다.
"간종양"은 간의 악성 또는 양성 종양일 수 있으며, 예를 들어 간세포 암종을 포함한다.
"대상"은 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
"생적합성"이란 일반적으로 생물학적 기능에 해롭지 않으면서, 알러지 및 질병 증상을 비롯한 어떤 정도의 허용되지 않는 독성을 나타내지 않는 물질 또는 화합물을 의미한다.
본원의 개시내용을 통해, 하기 약어들이 사용될 수 있다: PEG, 폴리에틸렌글리콜; ADI, 아르기닌 데이미나제; SS, 숙신이미딜 숙시네이트; SSA, 숙신이미딜 숙신아미드; SPA, 숙신이미딜 프로피오네이트; 및 NHS, N-히드록시숙신이미드.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜로 변형된 ADI가 여러 유형의 암을 치료하고 암의 전이를 억제하는데 있어서 우수한 결과를 제공한다는 예상치 못한 발견에 기초한다. ADI는 연결기의 존재 또는 부재하에 폴리에틸렌글리콜에 공유 결합될 수 있지만, 바람직한 실시양태에서는 연결기를 사용한다.
본 발명에서, 아르기닌 데이미나제 유전자는 예를 들어 미생물, 재조합 생물공학 또는 이들의 임의의 조합을 비롯한 임의의 공급원으로부터 유도되거나, 클로닝되거나 또는 생산될 수 있다. 예를 들어, 아르기닌 데이미나제는 미코플라스마 속, 클로스트리디움 속, 바실러스 속, 보렐리아 속, 엔테로코커스 속, 스트렙토코커스 속, 락토바실러스 속, 퀴아르디아 속의 미생물로부터 클로닝될 수 있다. 아르기닌 데이미나제는 미코플라스마 뉴모니애, 미코플라스마 호미누스, 미코플라스마 아르기니니, 스트렙토코커스 피오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 보렐리아 부르그도르페리, 보렐리아 아프젤리, 퀴아르디아 인테스티날리스, 클로스트리디움 페르프린젠스, 바실러스 리체니포르미스, 엔테로코커스 패칼리스, 락토바실러스 세이크, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 클로닝될 수 있다. 특히, 본 발명에 사용되는 아르기닌 데이미나제는 도 1 및 도 10 내지 13에 나타낸 아미노산 서열들 중 하나 이상을 가질 수 있다.
본 발명의 어떤 실시양태에서, 아르기닌 데이미나제는 미코플라스마 속의 미생물로부터 클로닝되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게, 아르기닌 데이미나제는 미코플라스마 아르기니니, 미코플라스마 호미누스, 미코플라스마 아르쓰리티데스, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 클로닝된다. 특히, 본 발명에 사용되는 아르기닌 데이미나제는 도 1에 나타낸 아미노산 서열들 중 하나 이상을 가질 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)의 총 중량 평균 분자량은 약 1,000 내지 약 50,000; 바람직하게는 약 3,000 내지 약 40,000, 보다 바람직하게는 약 5,000 내지 약 30,000; 보다 더 바람직하게는 약 8,000 내지 약 30,000; 보다 더 바람직하게는 약 11,000 내지 약 30,000; 보다 더 바람직하게는 약 12,000 내지 약 28,000; 보다 더 바람직하게는 약 16,000 내지 약 24,000; 훨씬 바람직하게는 약 18,000 내지 약 22,000; 훨씬 더 바람직하게는 약 19,000 내지 약 21,000, 가장 바람직하게는 약 20,000이다. 일반적으로, 30,000 이상의 분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜은 용해되기 어려우며, 조직된 생성물의 수율은 크게 감소한다. 폴리에틸렌글리콜은 분지쇄 또는 직쇄일 수 있으며, 바람직하게는 직쇄이다. 일반적으로, 폴리에틸렌글리콜의 분자량을 증가시키면 ADI의 면역원성은 감소한다. 이 실시양태에 기재된 분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜을 ADI, 임의로는 생적합성 연결기와 함께 사용하여, 예를 들어 흑색종, 간종양 및 육종, 바람직하게는 흑색종을 비롯한 암을 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 폴리에틸렌글리콜의 총 중량 평균 분자량은 약 1,000 내지 약 50,000; 바람직하게는 약 3,000 내지 약 30,000; 보다 바람직하게는 약 3,000 내지 약 20,000; 보다 더 바람직하게는 약 4,000 내지 약 12,000; 보다 더 바람직하게는 약 4,000 내지 약 10,000; 훨씬 바람직하게는 약 4,000 내지 약 8,000; 훨씬 더 바람직하게는 약 4,000 내지 약 6,000이며; 약 5,000인 것이 가장 바람직하다. 폴리에틸렌글리콜은 분지쇄 또는 직쇄일 수 있으며, 바람직하게는 직쇄이다. 이 실시양태에 기재된 분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜을 ADI, 임의로는 생적합성 연결기와 함께 사용하여, 예를 들어 흑색종, 간종양 및 육종, 바람직하게는 간종양을 비롯한 암을 치료할 수 있다.
ADI를 PEG에 공유적으로 부착시키는데 사용되는 연결기는 임의의 생적합성 연결기일 수 있다. 상기에서 논하고 있는 바와 같이, "생적합성"이란 화합물 또는 기가 비독성이며, 손상, 병증, 질병 또는 사망을 유발하지 않으면서 시험관내 또는 생체내에서 이용될 수 있음을 의미한다. PEG는 예를 들어 에테르 결합, 에스테르 결합, 티올 결합 또는 아미드 결합을 통해 연결기에 결합될 수 있다. 적합한 생적합성 연결기로는 예를 들어 에스테르기, 아미드기, 이미드기, 카르바메이트기, 카르복실기, 히드록실기, 탄수화물, 숙신이미드기 (예를 들어, 숙신이미딜 숙시네이트 (SS), 숙신이미딜 프로피오네이트 (SPA), 숙신이미딜 카르복시메틸레이트 (SCM), 숙신이미딜 숙신아미드 (SSA) 또는 N-히드록시 숙신이미드 (NHS) 포함), 에폭시기, 옥시카르보닐이미다졸기 (예를 들어, 카르보닐디이미다졸 (CDI) 포함), 니트로페닐기 (예를 들어, 니트로페닐 카르보네이트 (NPC) 또는 트리클로로페닐 카르보네이트 (TPC) 포함), 트리실레이트기, 알데히드기, 이소시아네이트기, 비닐술폰기, 티로신기, 시스테인기, 히스티딘기 또는 1급 아민이 포함된다. 바람직하게, 생적합성 연결기는 에스테르기 및(또는) 숙신이미드기이다. 보다 바람직하게, 연결기는 SS, SPA, SCM, SSA 또는 NHS이고, SS, SPA 또는 NHS가 보다 바람직하며, SS 또는 SPA가 가장 바람직하다.
또는, ADI는 아미노기, 술프히드랄기, 히드록실기 또는 카르복실기를 통해 PEG (즉, 연결기 없음)에 직접 연결시킬 수 있다.
ADI는 예를 들어 전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌 (Park et al, Anticancer Res., 1: 373-376 (1981); and Zaplipsky and Lee, Polyethylene Glycol Chemisty: Biotechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris, ed., Plenum Press, NY, Chapter 21 (1992))에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생적합성 연결기를 통해 PEG에 공유 결합시킬 수 있다.
PEG의 ADI로의 부착은 ADI의 순환 반감기를 증가시킨다. 일반적으로, PEG를 ADI의 1급 아민에 부착시킨다. 아르기닌 데이미나제상의 폴리에틸렌글리콜 부착 부위의 선택은 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 단백질의 활성 도메인내의 각 부위의 역할에 의해 결정된다. PEG를 효소 활성의 실질적인 손실 없이 아르기닌 데이미나제의 1급 아민에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 미코플라스마 아르기니니, 미코플라스마 아르쓰리티데스 및 미코플라스마 호미누스로부터 클로닝된 ADI는 상기 방법에 의해 변형될 수 있는 약 17개의 라이신을 갖는다. 즉, 17개의 라이신은 SS, SPA, SCM, SSA 및(또는) NHS와 같은 생적합성 연결기를 통해 ADI가 PEG에 부착될 수 있는 모든 가능한 부위이다. PEG는 또한 ADI상의 다른 부위에 부착될 수도 있으며, 이는 본원의 개시내용 측면에서 당업자에게 자명한 것이다.
1개 내지 약 30개의 PEG 분자를 ADI에 공유 결합시킬 수 있다. 바람직하게, ADI를 약 7개 내지 약 15개의 PEG 분자, 보다 바람직하게는 약 9개 내지 약 12개의 PEG 분자로 변형시킨다. 달리 말하면, 아르기닌 데이미나제내의 1급 아미노기의 약 30％ 내지 약 70％를 PEG로 변형시키며, 아르기닌 데이미나제내의 1급 아미노기 중 바람직하게는 약 40％ 내지 약 60％, 보다 바람직하게는 약 45％ 내지 약 55％, 가장 바람직하게는 약 50％를 PEG로 변형시킨다. PEG를 ADI의 말단에 공유 결합시키는 경우, 바람직하게는 단지 1개의 PEG 분자만을 사용한다. ADI상의 PEG 단위의 수를 증가시키면 효소의 순환 반감기가 증가한다. 그러나, ADI상의 PEG 단위의 수를 증가시키면 효소의 특이적 활성은 감소한다. 따라서, 이들 둘 사이에서 균형을 이룰 필요가 있으며, 이는 본원의 개시내용 측면에서 당업자에게 자명한 것이다.
본 발명에서, 가장 바람직한 생적합성 연결기의 공통적인 특징은 이들이 말레이미드기를 통해 아르기닌 데이미나제의 1급 아민에 부착된다는 것이다. 아르기닌 데이미나제와 연결되면, SS-PEG는 PEG에 연결된 에스테르 결합을 가지며, 이로서 이 부위가 혈청 에스테라제에 대해 민감해져 체내에서 ADI로부터 PEG를 방출시킬 수 있게 된다. SPA-PEG 및 PEG2-NHS는 에스테르 결합을 갖지 않기 때문에, 이들은 혈청 에스테라제에 대해 민감하지 않다.
본 발명에서, 특정 연결기는 PEG-ADI의 순환 반감기 또는 그의 특이적 효소 활성에 영향을 주는 것으로 보이지 않는다. 그러나, 본 발명에서 생적합성 연결기를 사용하는 것은 중요하다. 단백질에 부착되는 PEG는 SS-PEG, SPA-PEG 및 SC-PEG와 같이 단쇄이거나, PEG2-NHS와 같이 분지쇄 PEG가 사용될 수 있다. 본 발명에서 바람직한 연결기의 구조식은 다음과 같다:
SS-PEG:
SPA-PEG:
PEG2-NHS:
본 발명의 화합물들 중 하나의 치료 유효량이란 종양 성장을 억제하는데 효과적인 양이다. 일반적으로, 치료는 적은 투여량으로 개시하여, 그 상황에서 최적의 효과가 달성될 때까지 투여량을 조금씩 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 치료 투여량은 2주마다 내지는 2주에 대략 1번씩 약 1 내지 약 200 mg/kg일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 2 ml 정맥 주사로서 1주마다 약 1 mg/kg, 내지는 3일마다 약 20 mg/kg일 수 있다. ADI-SS-PEG5,000으로의 최적 투여량은 2주에 1번일 수 있으며, ADI-SS-PEG20,000으로의 최적 투여량은 1주에 대략 한번 내지는 2주에 대략 1번일 수 있다. PEG-ADI를 주사에 앞서서 인산염 완충 염용액과 함께, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 용액과 함께 혼합할 수 있다. PEG-ADI 제제는 원한다면 고상 (동결건조물) 또는 액상 제제로서 투여할 수 있다.
본 발명의 방법은 시험관내 또는 생체내 용도를 포함할 수 있다. 세포 배양물 용도를 비롯한 시험관내 용도의 경우, 본원에 기재된 화합물을 배양중의 세포에 가한 다음 인큐베이션할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 사용하여 모노클로날 및(또는) 폴리클로날 항체의 생산을 촉진시킬 수 있으며, 여기에는 당업계에 잘 알려진 항체 생산 기술을 이용한다. 이후, 모노클로날 및(또는) 폴리클로날 항체를 폭넓은 다양한 진단 용도로 사용할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 것이다.
본 발명의 화합물의 생체내 투여 수단은 목적하는 용도에 따라 달라질 것이다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 PEG-ADI 조성물의 투여는 예를 들어 경구, 비내, 복강내, 비경구, 정맥내, 림프내, 종양내, 근육내, 간질, 동맥내, 피하, 안내, 활막내, 경상피 및 경피로 수행할 수 있다.
설명을 위해 하기 실시예에서 본 발명을 추가로 설명하지만, 이는 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: 재조합 AD의 제조
미코플라스마 아르기니니 (ATCC 23243), 미코플라스마 호미누스 (ATCC 23114) 및 미코플라스마 아르쓰리티데스 (ATCC 23192)의 배양물을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland)으로부터 입수하였다.
전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌 (S. Misawa et al, J. Biotechnology, 36: 145-155 (1994))에 이미 기술된 바와 같이, 아르기닌 데이미나제를 미코플라스마 아르기니니, 미코플라스마 호미누스 및 미코플라스마 아르쓰리티데스로부터 클로닝하여, 이. 콜라이에서 발현시켰다. 상기 각 종으로부터의 아르기닌 데이미나제의 아미노산 서열은 도 1에 기재되어 있다. ADIPROT로 확인되는 위쪽 아미노산 서열은 미코플라스마 아르기니니 유래의 것이고, ARTADIPRO로 확인되는 중간의 아미노산 서열은 미코플라스마 아르쓰리티데스 유래의 것이며, HOMADIPRO로 확인되는 아래쪽 아미노산 서열은 미코플라스마 호미누스 유래의 것이다. 각 아미노산 서열은 96％ 넘게 보존된다. 특이적 효소 활성, Km, Vmax및 pH 최적값에 대하여 당업자에게 공지된 방법에 의해 각 단백질을 특성화한 결과, 이들이 생화학적으로 서로 구별될 수 없었음이 밝혀졌다. 시트레이트 완충액 (pH 5-6.5), 포스페이트 완충액 (pH 6.5-7.5) 및 보레이트 완충액 (pH 7.5-8.5)을 사용하여 최적 pH 값을 결정하였다. 효소를 다양한 농도의 아르기닌과 함께 인큐베이션하고, 시트룰린 생산을 정량하여 Km및 Vmax를 결정하였다. 다양한 효소에 대한 Km은 0.02 내지 0.06 μM이었고, Vmax는 약 15 내지 20 μmol/분/mg이었으며, 이들 수치는 서로 표준 오차범위내에 있다.
예를 들어 전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌 (T. Ohno et al, Infect. Immun., 58: 3788-3795 (1990))에 기재된 바와 같이, 엠. 아르기니니의 공개된 서열로부터 유도된 하기 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 아르기닌 데이미나제 유전자를 증폭시켰다.
서열 4: 5'-GGGATCCATGTCTGTATTTGACAGT-3'
서열 5: 5'-TGAAAGCTTTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3'
중합효소 연쇄 반응 생성물을 BamH1-HindIII 단편으로 발현 플라스미드 pQE16내에 클로닝하였다. DNA 서열 분석 결과, PCR에 의해 엠. 아르기니니로부터 유도된 단편이 문헌 (Ohno et al, Infect. Immun., supra)에 기재된 바와 같은 아르기닌 데이미나제 유전자에 대하여 동일한 서열을 가졌음을 알 수 있었다. 미코플라스마에서 트립토판을 코딩하는 ADI 유전자내의 5개의 TGA 코돈을, 예를 들어 문헌 (J.R. Sayers et al, Biotechniques, 13: 592-596 (1992))에 교시된 바와 같이, 이. 콜라이에서 유전자 발현에 앞서 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발법에 의해 TGG 코돈으로 전환시켰다. 재조합 ADI를 봉입체내에서 총 세포 단백질의 10％ 수준으로 발현시켰다.
상기 3가지 미코플라스마 종 각각으로부터의 단백질은 대략 95％의 상동성을 가지며, 컬럼 크로마토그래피에 의해 쉽게 정제된다. 순수한 단백질 약 200 mg을 발효 브로쓰 1 리터로부터 단리할 수 있다. 재조합 ADI는 37 ℃에서 약 2주 동안 안정하고, 4 ℃에서 저장하는 경우에는 8개월 이상 동안 안정하다. 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정한 바에 의하면, 단백질은 아르기닌에 대하여 높은 친화성 (0.04 μM)을 가지며, 약 7.2 내지 약 7.4의 생리학적 최적 pH 값을 나타냈다.
실시예 2: 재조합 ADI의 재변성 및 정제
전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌 (Misawa et al, J. Biotechnology, 36: 145-155 (1994))에 기재된 바와 같이, ADI 단백질을 재변성시키고 약간 변형시켰다. 세포 플레이트 100 g을 10 mM K2P04pH 7.0, 1 mM EDTA (완충액 1) 800 ml 중에 재현탁시키고, 세포를 미세유동화기 (Microfluidizer) (Microfluidics Corporation, Newton, MA)에 2번 통과시켜 파열시켰다. 트리톤 (Triton) X-100을 첨가하여 최종 농도를 4％ (v/v)로 하였다. 균질물을 4 ℃에서 30분 동안 교반한 다음, 13,000 g로 30분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 모아서, 0.5％ 트리톤 X-100을 포함하는 1 리터의 완충액 1 중에 재현탁시켰다. 100 kD의 보유도를 갖는 속이 빈 섬유 카트리지 (Microgon Inc., Laguna Hills, CA)를 사용하여 용액을 5배 부피의 변성 완충액 (50 mM Tris HCl, pH 8.5, 10 mM DTT)에 대하여 투석여과하였다. 구아니딘 HCl을 첨가하여 최종 농도를 6 M로 하고, 용액을 4 ℃에서 15분 동안 교반하였다. 용액을 리폴딩 완충액 1 (10 mm K2PO4, pH 7.0) 중 100배로 희석시키고, 15 ℃에서 48시간 동안 교반하고, 15,000 x g로 원심분리시켜 미립자를 제거하였다.
생성된 상청액을 리폴딩 완충액 중에서 미리 평형화된 Q 세파로스 패스트 플로우 (Sepharose Fast Flow) (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) 컬럼상에 농축시켰다. 0.2 M NaCl을 포함하는 리폴딩 완충액을 사용하여 ADI를 용출시켰다. 정제 과정에 의해 ADI 단백질을 얻었으며, 이는 SDS-PAGE 분석에 의해 평가한 바로는 순도가 95％를 초과하였다. 순수한 재변성된 ADI 단백질 8 g을 세포 플레이트 1 kg으로부터 제조하였으며, 이는 발효물 리터 당 정제된 ADI 200 mg에 상응한다.
문헌 (Oginsky et al, Meth. Enzymol., (1957) 3:639-642)에 기술된 방법을 미세변형시켜 ADI 활성을 측정하였다. 0.1 m Na2PO4, pH 7.0 (BUN 분석 완충액) 중 샘플 10 ㎕를 96 웰 마이크로타이터 플레이트내에 넣고, BUN 분석 완충액 중 0.5 mM 아르기닌 40 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 덮고, 37 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 완전한 BUN 시약 (Sigma Diagnostics) 20 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 100 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 22 ℃로 냉각시키고, 마이크로타이터 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Inc)로 490 nm에서 분석하였다. 1.0 IU란 1분당 L-아르기닌 1 μmole을 L-시트룰린으로 전환시키는 효소의 양이다. 표준물로서 소 혈청 알부민을 포함하는 피어스 쿠마지 블루 (Pierce CoomassieBlue) 단백질 분석 시약 (Pierce Co., Rockford, IL)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
정제된 ADI 시료의 효소 활성은 17 내지 25 IU/mg이었다.
실시예 3: PEG의 ADI로의 부착
PEG를 100 mM 인산염 완충액 (pH 7.4)에서 ADI에 공유 결합시켰다. 요컨대, 인산염 완충액 중 ADI를 100 몰 과량의 PEG와 함께 혼합하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 혼합물을 전체적으로 투석하여 혼입되지 않은 PEG를 제거하였다.
제1 실험을 수행하여 PEG-ADI 조성물에 사용된 연결기의 효과를 평가하였다. PEG와 ADI를 4가지 다른 연결기, 즉 에스테르기 또는 말레이미드기 (SS, SSA, SPA 및 SSPA 포함하며, 여기서 PEG의 총 중량 평균 분자량은 5,000, 10,000, 12,000, 20,000, 30,000 및 40,000임); 에폭시기인 PEG-에폭시 (여기서 PEG의 총 중량 평균 분자량은 5,000임); 및 분지쇄 PEG기인 PEG2-NHS (여기서 PEG의 총 중량 평균 분자량은 10,000, 20,000 및 40,000임)를 통해 공유 결합시켰다.
생성된 조성물 5.0 IU를 마우스내에 주사하였다 (각 그룹에서 마우스 개체수는 5임). 혈청 아르기닌 수준을 측정하기 위해, 마우스를 후방 안와 총에서 채혈하였다 (100 ㎕). 채혈 직후, 같은 부피의 50％ (w/v) 트리클로로아세트산을 가하였다. 침전물을 원심분리 (13,000 x g, 30분 동안)하여 제거하고, 상청액을 제거하여 -70 ℃에서 동결 보관하였다. 이후, 제조자에 의해 공급된 프로토콜을 이용하는 베크만 인스트루멘츠 (Beckman Instruments)로부터의 자동화 아미노산 분석기및 시약을 사용하여 샘플을 분석하였다. 상기 방법에 의한 아르기닌의 민감도 한계는 대략 2 내지 6 μM이었으며, 측정 재현성은 약 8％ 이내였다. 혈청 아르기닌의 양을 아미노산 분석에 의해 측정하였다. 도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, PEG와 ADI를 공유 결합시키는 연결기는 생체내 혈청 아르기닌을 감소시키는 ADI의 능력에 대하여 뚜렷한 효과를 나타내지 않았다. 달리 말하면, 연결기는 이를 생체내에서 이용하는 경우 비독성이어야 한다는 점을 제외하고는 실험 결과에 있어서 중요하지 않을 수 있다.
제2 실험을 수행하여 생체내 혈청 시트룰린 수준에 대한 PEG의 연결기 및 분자량의 효과를 평가하였다. 마우스 (각 그룹에서 개체수는 5임)에게 ADI와 PEG-ADI의 여러 조성물을 5.0 IU의 양으로 제공하였다. 혈청 시트룰린 수준을 측정하기 위해, 마우스를 후방 안와총에서 채혈하였다 (100 ㎕). 채혈 직후, 같은 부피의 50％ (w/v) 트리클로로아세트산을 가하였다. 침전물을 원심분리 (13,000 x g, 30분 동안)하여 제거하고, 상청액을 제거하여 -70 ℃에서 동결 보관하였다. 이후, 제조자에 의해 공급된 프로토콜을 이용하는 베크만 인스트루멘츠로부터의 자동화 아미노산 분석기 및 시약을 사용하여 샘플을 분석하였다. 상기 방법에 의한 시트룰린의 민감도 한계는 대략 2 내지 6 μM이었으며, 측정 재현성은 약 8％ 이내였다. 시트룰린의 양을 측정하고, 그래프에서 면적을 어림잡아 계산하고, μmol 일로서 표현하였다.
도 4에서, 속이 빈 원은 천연 ADI에 의해 생성된 시트룰린의 양을 나타내고, 속이 채워진 원은 ADI-SC-PEG이고, 속이 빈 사각형은 ADI-SS-PEG이고, 속이 빈 삼각형은 ADI-SPA-PEG이며, 속이 채워진 삼각형은 분지쇄 PEG-NHS-PEG2이다. 도 4의 결과는 PEG 분자량이 PEG-ADI 조성물의 효과를 결정한다는 사실을 입증한다. PEG-ADI 조성물의 효과는 생체내 용도를 위해 생적합성 연결기를 사용해야 한다는 점을 제외하면 반드시 PEG의 ADI로의 부착 방법 또는 수단을 기초로 하는 것은 아니다.
또한 도 4의 결과는 PEG의 최적 분자량이 20,000임을 입증한다. PEG30,000은 그의 약동학 측면에서 PEG20,000보다 우수한 것으로 보이기는 하지만, PEG30,000은 덜 가용성이어서 사용하기가 곤란하다. 효소 활성의 회복을 기초로 한 수율은 PEG5,000 및 PEG12,000에 대하여 약 90％, PEG20,000에 대하여 약 85％, PEG30,000에 대하여는 약 40％이었다. 따라서, PEG20,000은 시트룰린 생산에 의해 결정된 바로는 수율 및 순환 반감기의 측면에서 가장 좋은 절충안이 된다.
제3 실험에서 ADI-SS-PEG5,000 및 ADI-SS-PEG20,000에 의해 혈청 아르기닌 고갈 및 시트룰린 생산의 투여 반응을 측정하였다. 마우스 (각 그룹에서 개체수는 5임)에게 0.05 IU, 0.5 IU 또는 5.0 IU의 ADI-SS-PEG5,000 또는 ADI-SS-PEG20,000을 1회 주사로 제공하였다. 지시된 시간에서, 혈청을 상기 기재된 바와 같이 모으고, 아미노산 분석을 수행하여 혈청 아르기닌 (도 5A 및 5C) 및 혈청 시트룰린 (도 5B 및 5D)을 정량하였다. 두 제제 모두 혈청 아르기닌의 투여량 의존적 감소 및 혈청 시트룰린의 증가를 유도하였다. 그러나, ADI-SS-PEG20,000에 의해 유도된 효과는 ADI-SS-PEG5,000에 의해 유도된 효과보다 현저하게 더 높았으며, 더 오랫 동안 지속되었다.
실시예 4: ADI 매개 세포독성의 선택성
다수의 인간 종양을 이용하여 아르기닌 데이미나제 매개 세포독성의 선택성을 입증하였다. 특히, 인간 종양을 시험관내에서 ADI-SS-PEG5,000 (50 ng/ml)에 대한 민감성에 대하여 시험하였다. 7일 후, 배양물의 생존성을 측정하였다. "억제된" 것으로 정의된 배양물의 경우, 95％를 초과하는 세포가 트립판 (Trypan) 블루 염료를 수용해야 한다. 또한 내피 세포, 평활근 세포, 상피 세포 및 섬유아세포를 비롯한 정상 숙주 세포를 시험하였으며, 이 중 어떤 것도 ADI-SS-PEG5,000에 의해 억제되지 않았다. 아르기닌 데이미나제가 정상 세포 및 대부분의 종양 세포에 대하여 뚜렷한 독성을 나타내지는 않았지만, ADI-SS-PEG5,000은 ATCC, MSKCC 및 유럽으로부터 상업적으로 이용할 수 있는 모든 인간 흑색종 및 간종양을 크게 억제하였다.
아르기닌 데이미나제 세포독성에 대한 특이성
종양 유형 시험된 종양의 수 종양 억제율 (％)
뇌 16 0
결장 34 0
방광 3 0
유방 12 0
신장 5 0
육종 11 64
간종양 17 100
흑색종 37 100
유사한 실험 세트에서, mRNA를 종양으로부터 단리하였다. 인간 아르기니노숙시네이트 신타제 cDNA 프로브를 사용하는 노던 블롯 분석에 의해 아르기닌 데이미나제 처리에 대한 민감성과 아르기니노숙시네이트 신타제 발현능의 부재가 완전히 일치하는 관계에 있음을 알 수 있었다. 상기 데이타는 ADI 독성이 아르기니노숙시네이트 신타제를 유도하는 능력의 부재로 인해 유발됨을 시사한다. 따라서, 이들 세포는 시트룰린으로부터 아르기닌을 합성할 수 없으며, 성장에 필요한 단백질을 합성할 수 없다.
실시예 5: 순환 반감기
도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이, Balb C 마우스 (각 그룹에서 개체수는 5임)에게 단일 5.0 IU 투여량의 천연 아르기닌 데이미나제 또는 폴리에틸렌글리콜로 변형된 다양한 아르기닌 데이미나제 제제를 정맥내 주사하였다. 혈청 아르기닌 및 시트룰린 수준을 측정하기 위해, 마우스를 후방 안와총에서 채혈하였다 (100 ㎕). 채혈 직후, 같은 부피의 50％ (w/v) 트리클로로아세트산을 가하였다. 침전물을 원심분리 (13,000 x g, 30분 동안)하여 제거하고, 상청액을 제거하여 -70 ℃에서 동결 보관하였다. 이후, 제조자에 의해 공급된 프로토콜을 이용하는 베크만 인스트루멘츠로부터의 자동화 아미노산 분석기 및 시약을 사용하여 샘플을 분석하였다. 상기 방법에 의한 아르기닌의 민감도 한계는 대략 6 pM이었으며, 측정 재현성은 약 8％ 이내였다.
도 2A에서 속이 채워진 원으로 나타낸, 혈청 아르기닌 수준의 투여량 의존적 감소 및 도 2B에서 속이 빈 삼각형으로 나타낸, 혈청 시트룰린의 증가는 천연 ADI (속이 채워진 원) 또는 ADI-SS-PEG (속이 빈 삼각형)의 단일 투여량 투여로부터 검출되었다. 그러나, 혈청 아르기닌의 감소 및 혈청 시트룰린의 증가는 반감기가 짧았으며, 이내 정상으로 회복되었다. 아르기닌 고갈의 반감기는 하기 표 2에 요약되어 있다.
혈청 아르기닌 고갈의 반감기
화합물 반감기 (일)
천연 ADI 1
ADI-SS-PEG5,000 5
ADI-SS-PEG12,000 15
ADI-SS-PEG20,000 20
ADI-SS-PEG30,000 22
상기 실험은 정상 세포 및 조직의 경우 시트룰린을 세포내에서 아르기닌으로 다시 전환시킬 수 있지만, 흑색종 및 간종양은 아르기니노숙시네이트 신테타제가 결여되어 있기 때문에 상기 전환을 수행할 수 없음을 입증한다.
실시예 6: PEG로 변형된 ADI의 항원성
천연 ADI, ADI-SS-PEG5,000 및 ADI-SS-PEG20,000의 항원성을 측정하기 위해, 예를 들어 문헌 (Park, Anticancer Res., supra, and Kamisaki, J. Pharmacol. Exp. Ther., supra)에 기재된 방법을 수행하였다. 요컨대, Balb C 마우스 (각 군에서 개체수는 5임)에게 12주 동안 매주마다 천연 ADI, ADI-SS-PEG5,000 또는 ADI-SS-PEG20,000 약 0.5 IU (단백질 100 ㎍)를 정맥내 주사하였다. 실험 시작 시점과 4주, 8주 및 12주 경과후 마우스를 후방 안와총에서 채혈하였다 (0.05 ml). 혈청을 단리하여 -70 ℃에서 저장하였다. ELISA에 의해 항-ADI IgG의 역가를 결정하였다. ADI 50 ㎍을 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 가하고, 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 씻어낸 다음, 소 혈청 알부민 (1 mg/ml)으로 코팅하여 비특이적 단백질 결합 부위를 차단시키고, 4 ℃에서 밤새 저장하였다. 다음날, 마우스의 혈청을 희석시켜 웰에 가하였다. 1시간 후, 플레이트를 PBS로 씻어내고, 퍼옥시다제에 연결된 토끼 항-마우스 IgG를 웰에 가하였다. 플레이트를 30분 동안 인큐베이션한 다음, UV 흡광도 결과치를 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 역가는 배경 흡광도 (약 0.50 OD)로부터 2배 증가를 나타낸 혈청의 가장 높은 희석율로 정의되었다.
결과는 도 6에 나타나 있다. 속이 빈 원은 매우 항원성이었던 천연 ADI를 주입받은 동물로부터 얻어진 데이타를 나타낸다. 속이 채워진 원은 ADI-SS-PEG5,000을 주입받은 동물로부터 얻어진 데이타를 나타내며, 속이 빈 삼각형은 ADISS-PEG20,000을 주입받은 동물로부터 얻어진 데이타를 나타낸다. 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, ADI-SS-PEG5,000 및 ADI-SS-PEG20,000은 천연 ADI보다 항원성이 상당히 덜하다. 예를 들어, 천연 ADI를 4회 만큼 적은 빈도로 주사하자 역가는 약 106으로 나타났지만, PEG-ADI 제제 중 어떤 것을 4회 주사했을 때 임의의 측정가능한 항체가 생성되지 않았다. 그러나, 8회 주사한 후, ADI-PEG5,000은 약 102의 역가를 나타냈지만, ADI-PEG20,000은 12회 주사한 다음에도 상기와 같은 높은 면역 반응을 유도하지 않았다. 이러한 결과는 PEG를 ADI에 부착시키는 것이 단백질에 대한 면역 반응을 무디게 만든다는 사실을 입증한다.
실시예 7: 인간 흑색종의 종양 억제
누드 마우스에서 인간 흑색종 (SK-Mel 28)의 성장에 대한 PEG-ADI의 효과를 측정하였다. 누드 마우스 (각 그룹에서 개체수는 5임)에게 종양의 직경이 약 3 내지 5 mm에 도달할 때까지 증식하도록 허용된 106개의 SK-mel 2 인간 흑색종 세포를 주입하였다. 마우스를 처리하지 않은 채로 두거나 (속이 빈 원) 또는 8주 동안 매주 5.0 IU의 ADI-SS-PEG5,000 (속이 채워진 삼각형), ADI-SS-PEG12,000 (속이 빈 삼각형) 또는 ADI-SS-PEG20,000 (속이 채워진 원)으로 처리하였다. 종양 크기를 매주 측정하였으며, 종양의 평균 직경은 도 7에 나타나 있다.
도 8은 누드 마우스 생체내에서 증식하는 3가지 인간 흑색종 (SK-mel 2, SK-mel 28, M24-met)에 대한 ADI-SS-PEG20,000의 효과를 나타낸다. 누드 마우스 (각 그룹에서 개체수는 5임)에게 106개의 SK-mel 2, SK-mel 28 또는 M24-met 인간 흑색종 세포를 주입하였다. 직경이 약 3 내지 5 mm에 도달할 때까지 종양이 증식하도록 허용하였다. 이후, 동물에게 매주 5.0 IU의 ADI-SS-PEG20,000을 주입하였다. 결과는 도 8에 나타나 있으며, 이는 PEG-ADI가 종양 증식을 억제하여 결국 종양이 퇴화하여 소멸되기 시작했음을 보여준다. 종양은 아르기니노숙시네이트 신테타제를 갖지 않았기 때문에, 이들은 단백질을 합성할 수 없었으며 (ADI는 아르기닌을 제거하였으며 종양은 이를 만들어낼 수 없었기 때문임), 세포는 "양분결핍으로 사멸되었다."
M24-met 인간 흑색종은 매우 전이성이기 때문에, M24-met 인간 흑색종 세포를 주입받은 동물을 처리 4주 후 희생시켰으며, 동물의 폐에서 전이의 수를 결정하였다. 대조군 동물은 평균 전이수 32를 나타냈지만, ADI-SS-PEG20,000으로 처리된 동물은 어떠한 전이도 나타내지 않았다. 이러한 결과는 ADI-SS-PEG20,000이 주요흑색종 종양의 증식을 억제하였을뿐 아니라, 전이의 형성도 억제하였음을 암시하는 것으로 보인다.
시험된 200 마리를 넘는 동물에서 대조군내 평균 전이수는 49 ±18이었지만 처리된 동물 1마리에서는 단지 하나의 전이만이 관찰되었다는 것은 주목할만한 사실이다.
실시예 8: 인간 간종양의 종양 억제
생체내에서 인간 간종양의 증식을 억제하는 PEG-ADI의 능력을 시험하였다. 누드 마우스 (각 군에서 개체수는 5임)에게 106개의 인간 흑색종 SK-Hep1 세포를 주입하였다. 종양이 2주 동안 증식하도록 허용한 다음, 동물에게 매주 5.0 IU의 SS-PEG5,000-ADI (속이 채워진 원), SS-PEG12,000-ADI (속이 채워진 삼각형) 또는 SS-PEG20,000-ADI (속이 빈 삼각형)를 처리하였다. 이러한 결과는 도 9에 기재되어 있다. 비처리된 동물 (속이 빈 원)은 3주 이내에 모두 사망하였다. 이와는 달리, ADI로 처리된 동물은 도 9로부터 알 수 있는 바와 같이 훨씬 더 긴 예상 수명을 나타냈다. 모든 생존 마우스를 6개월 후 안락사시켰으며, 부검 결과, 이들에게서 종양이 없는 것으로 나타났다.
놀랍게도, PEG5,000-ADI는 생체내 간종양 증식을 억제하는데 있어서 가장 효과적이다. 이러한 억제가 일어나는 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않다. 본 발명을 특정 이론에 얽매고자 하는 것은 아니지만, SS-PEG5,000-ADI로 조직된 단백질은 간에 격리되는 것으로 보인다. 큰 분자량의 PEG는 그렇지 않은데 이는 간의 내피에 특이적이기 때문일 수 있으며, 공간 (창문 모양의 구멍)은 더 큰 분자량의 PEG-ADI 결합물이 배제되도록 하는 크기이다.
실시예 9: 인간에 대한 이용
PEG5,000-ADI 및 PEG20,000-ADI를 생체외에서 정상의 인간 혈청과 함께 인큐베이션하고, 아르기닌 농도에 대한 효과를 아미노산 분석에 의해 결정하였으며, 여기서 효소는 완전히 활성으로서 마우스를 포함하는 실험에서와 동일한 동태를 갖는 모든 검출가능한 아르기닌을 분해할 수 있는 것으로 나타났다. 반응을 37 ℃에서 1시간으로 0.1 ml의 부피에서 수행하였다. 또한, 인간 혈청내 아르기닌 및 시트룰린의 수준은 마우스에서 관찰되는 수준과 동일하다. PEG-단백질은 마우스에서보다 인간에서 더 오랫 동안 순환한다. 예를 들어, PEG 결합된 아데노신 데이미나제, 아스파라기나제, 글루코세르브로시다제, 우리카제, 헤모글로빈 및 수퍼옥시드 디스뮤타제의 순환 반감기는 모두 마우스에서의 동일한 제제보다 5배 내지 10배 더 긴 순환 반감기를 갖는다. 상기 사실이 의미하는 바는, 인간 투여량이 매우 흔하게 마우스에서 사용된 투여량의 1/5 내지 1/10이라는 것이다. 따라서, PEG-ADI는 마우스에서보다 인간에서 훨씬 더 오랫 동안 순환한다.
본원에 기재된 각 특허문헌, 특허출원 및 간행물은 그의 전체 내용이 본원에 참고로 도입된다.
당업자라면 본원에 기재된 것 이외에도 상기 기술내용 측면에서 본 발명을 다양하게 변형시킬 수 있을 것이다. 이러한 변형은 또한 하기 첨부된 청구의 범위내에 해당하는 것으로 의도된다.

Claims (37)

  1. 숙신이미드기, 아미드기, 이미드기, 카르바메이트기, 에스테르기, 에폭시기, 카르복실기, 히드록실기, 탄수화물, 티로신기, 시스테인기, 히스티딘기 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결기를 통해 총 중량 평균 분자량 약 1,000 내지 약 40,000의 폴리에틸렌글리콜에 공유 결합된 아르기닌 데이미나제를 포함하는 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 연결기가 숙신이미드기인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 숙신이미드기가 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 카르복시메틸레이트, 숙신이미딜 숙신아미드, N-히드록시 숙신이미드 또는 이들의 조합인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 숙신이미드기가 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 프로피오네이트 또는 이들의 조합인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 미코플라스마 (Mycoplasma) 속의 미생물로부터 유래하는 것인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물이 미코플라스마 아르기니니 (Mycoplasma arginini), 미코플라스마 호미누스 (Mycoplasma hominus), 미코플라스마 아르쓰리티데스 (Mycoplasma arthritides) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 스트렙토코커스 (Streptococcus) 속의 미생물로부터 유래하는 것인 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 미생물이 스트렙토코커스 피오제네스 (Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 보렐리아 (Borrelia) 속의 미생물로부터 유래하는 것인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 미생물이 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 보렐리아 아프젤리 (Borrelia afzelii) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 퀴아르디아 (Qiardia) 속의 미생물로부터 유래하는 것인 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 미생물이 퀴아르디아 인테스티날리스 (Qiardia intestinalis)인 화합물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 클로스트리디움 (Clostridium) 속의 미생물로부터 유래하는 것인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 미생물이 클로스트리디움 페르프린젠스 (Clostridium perfringens)인 화합물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 엔테로코커스 (Enterococcus) 속의 미생물로부터 유래하는 것인 화합물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 미생물이 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis)인 화합물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 락토바실러스 (Lactobacillus) 속의 미생물로부터 유래하는 것인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 미생물이 락토바실러스 세이크 (Lactobacillus sake)인 화합물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 바실러스 (Bacillus) 속의 미생물로부터 유래하는 것인 화합물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 미생물이 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis)인 화합물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 미코플라스마 뉴모니애, 미코플라스마 호미누스, 미코플라스마 아르기니니, 스트렙토코커스 피오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 보렐리아 부르그도르페리, 보렐리아 아프젤리, 퀴아르디아 인테스티날리스, 클로스트리디움 페르프린젠스, 바실러스 리체니포르미스, 엔테로코커스 패칼리스, 락토바실러스 세이크 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  22. 제1항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 약 7개 내지 약 15개의 폴리에틸렌글리콜 분자에 공유 결합된 것인 화합물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 아르기닌 데이미나제가 약 9개 내지 약 12개의 폴리에틸렌글리콜 분자에 공유 결합된 것인 화합물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜의 총 중량 평균 분자량이 약 10,000 내지 약 30,000인 화합물.
  25. 아르기닌 데이미나제를 숙신이미드기, 아미드기, 이미드기, 카르바메이트기, 에스테르기, 에폭시기, 카르복실기, 히드록실기, 탄수화물, 티로신기, 시스테인기, 히스티딘기 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결기를 통해 총 중량 평균 분자량 약 1,000 내지 약 40,000의 폴리에틸렌글리콜에 공유 결합시켜 변형시키는 것을 포함하는, 아르기닌 데이미나제의 순환 반감기를 증가시키는 방법.
  26. 아르기닌 데이미나제를 숙신이미드기, 아미드기, 이미드기, 카르바메이트기, 에스테르기, 에폭시기, 카르복실기, 히드록실기, 탄수화물, 티로신기, 시스테인기, 히스티딘기 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결기를 통해 총 중량 평균 분자량 약 1,000 내지 약 40,000의 폴리에틸렌글리콜에 공유 결합시켜 변형시키는 것을 포함하는, 아르기닌 데이미나제의 종양제거 활성을 증가시키는 방법.
  27. 제1항의 화합물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 종양을치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 종양이 흑색종인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜의 총 중량 평균 분자량이 약 20,000인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 연결기가 숙신이미드기인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 숙신이미드기가 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 카르복시메틸레이트, 숙신이미딜 숙신아미드, N-히드록시 숙신이미드 또는 이들의 조합인 방법.
  32. 제27항에 있어서, 상기 종양이 간종양인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 총 중량 평균 분자량이 약 5,000인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 연결기가 숙신이미드기인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 숙신이미드기가 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 카르복시메틸레이트, 숙신이미딜 숙신아미드, N-히드록시 숙신이미드 또는 이들의 조합인 방법.
  36. 제27항에 있어서, 상기 종양이 육종인 방법.
  37. 제1항의 화합물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상에서 전이를 치료 및 억제하는 방법.
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