PT981607E

PT981607E - A deiminase modificada

Info

Publication number: PT981607E
Application number: PT98922197T
Authority: PT
Inventors: Mike A Clark
Original assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-05-12
Filing date: 1998-05-12
Publication date: 2006-11-30
Also published as: CA2288948A1; JP2001524836A; AU7479898A; CN1255944A; DK0981607T3; ATE335814T1; AU724907B2; DE69835515T2; CY1105758T1; US20050129706A1; TW368504B; US6737259B1; EP0981607A1; US6183738B1; US7323167B2; EP0981607B1; CN1169951C; EP0981607A4; DE69835515D1; ES2270515T3

Description

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DESCRIÇÃO "ARGININA DEIMINASE MODIFICADA" A presente invenção é dirigida para arginina deiminase modificada com polietilenoglicol, para a sua utilização na preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento do cancro e ao tratamento e inibição de metástases.

Melanoma maligno (fase 3) e hepatoma são doenças fatais que matam a maioria dos pacientes no espaço de um ano após o diagnóstico. Nos Estados Unidos, aproximadamente 16.000 pessoas morrem anualmente destas doenças. A incidência do melanoma está a aumentar rapidamente nos Estados Unidos e é ainda maior em outros países tais como a Austrália. A incidência de hepatoma em partes do mundo em que a hepatite é endémica é ainda maior. Por exemplo, o hepatoma é uma das principais formas de cancro no Japão e no Taiwan. São urgentemente necessários tratamentos eficazes para estas doenças. A privação selectiva dos aminoácidos essenciais foi utilizada para tratar algumas formas de cancro. O exemplo melhor conhecido consiste na utilização de L-asparaginase para baixar os níveis de asparagina como tratamento da leucemia linfoblástica aguda. A L-asparaginase mais frequentemente utilizada é isolada a partir de E. coli. No entanto, a utilização clínica desta enzima é comprometida pela sua antigenicidade e curta semivida em circulação conforme descrito por Y.K. Park, et al, Anticancer Res., 1:313-316 (1981). A modificação covalente da L-asparaginase de E. coli com polietilenoglicol reduz a sua antigenicidade 2 e prolonga a sua semivida em circulação, conforme descrito, por exemplo por Park, Anticancer Res., supra; Y. Kamisaki et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 216:410-414 (1981); e Y. Kamisaki et al, Gann., 73_:47-474 (1982). PEG-hGH revelou um maior nivel de EC5o com uma taxa de depuração inversamente proporcional ao peso molecular (Clark R. et al, J. Biol. Chem., 1996, 271, 21969-77). Kita Y. et al. (Drug Design and Delivery, 1990, _6, 157-167) demonstraram que o interferão-γ humano recombinante conjugado com PEG tem uma maior semivida, não se tendo observado quase nenhuma depuração. Apesar de se ter desenvolvido um grande esforço para identificar outras enzimas que degradem aminoácidos para o tratamento do cancro nenhuma foi aprovada, em primeiro lugar porque a privação de aminoácidos essenciais, por definição, tem como consequência efeitos secundários numerosos e graves.

Foi relatado que enzimas que degradam aminoácidos não-essenciais, tais como arginina, podem ser meios eficazes de controlo de algumas formas de cancro. Por exemplo, a arginina deiminase (ADI) isolada de Pseudomonas pudita foi descrita por J.B. Jones, "The Effect of Arginine Deiminase on Murine Leukemic Lymphoblasts, " Dissertação de Doutoramento, The University of Oklahoma, páginas 1-165 (1981). Apesar de ser eficaz para matar células cancerosas in vitro, a ADI de P. pudita não conseguiu mostrar eficácia in vivo porque tinha fraca actividade enzimática a um pH neutro e foi rapidamente eliminada da circulação de animais experimentais. A arginina deiminase derivada de Mycoplasma arginini é descrita, por exemplo por Takaku et al., Int. J. Câncer, 51:244-249 (1992), e patente norte-americana US 5,474,928. 3

No entanto, um problema associado com o uso terapêutico de uma proteína heteróloga destas reside na sua antigenicidade. A modificação química da arginina deiminase de Mycoplasma arginini, através do grupo de ligação de cloreto cianúrico, com polietilenoglicol foi descrita por Takaku et al., Jpn. J. Câncer Res., 84:1195-1200 (1993). No entanto, a proteína modificada era tóxica quando metabolizada devido à libertação de cianeto do grupo de ligação de cloreto cianúrico.

Existe uma falta de composições que degradem aminoácidos não essenciais e que não levantem os problemas associados com a técnica anterior. A presente invenção é dirigida para estes, tal como outros, objectivos importantes. O assunto da presente invenção é um composto que inclui arginina deiminase com ligação covalente via um grupo de ligação a polietilenoglicol, em que o polietilenoglicol tem um peso total peso molecular médio entre 16.000 e 40.000.

Outra forma de realização da presente invenção consiste na utilização do composto mencionado para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento de um tumor, incluindo, por exemplo sarcomas, hepatomas e melanomas. A presente invenção é também dirigida para a utilização do composto mencionado, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento e inibição de metástases de células de tumor.

Este e outros aspectos da presente invenção serão esclarecidos na seguinte descrição pormenorizada da presente invenção. 4

Breve descrição das Figuras A Figura 1 descreve as sequências de aminoácidos da arginina deiminase clonados a partir de Mycoplasma arginini (a principal sequência de aminoácidos, SEQ ID NO: 1, identificada como ADIPROT), Mycoplasma arthritides (a sequência de aminoácidos do meio, SEQ ID NO: 2, identificada como ARTADIPRO) e Mycoplasma hominus (última sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, identificada como HOMADIPRO).

As Figuras 2A e 2B são gráficos que mostram o efeito de uma única dose de arginina deiminase nativa e arginina deiminase modificada com polietilenoglicol (por exemplo, peso molecular 5.000) em níveis de arginina no soro e níveis de citrulina no soro de ratinhos. A Figura 3 é um gráfico que mostra os efeitos em níveis de arginina no soro quando PEG10.000 é ligado covalentemente a ADI através de vários grupos de ligação A Figura 4 é um gráfico que mostra o efeito que o grupo de ligação e o peso molecular do polietilenoglicol têm na produção de citrulina em ratinhos injectados com uma única dose de PEG-ADI. A Figuras 5A e 5B são gráficos que mostram a resposta à dose de ADI-SS-PEG5.000 em níveis de arginina e citrulina no soro. As Figuras 5C e 5D são gráficos que mostram a resposta à dose de ADI-SS-PEG20.000 em níveis de arginina e citrulina no soro.

A Figura 6 é um gráfico que mostra a antigenicidade de ADI 5 nativo, ADI-SS-PEG5.000 e ADI-SS-PEG20.000. A Figura 7 é um gráfico que mostra o efeito dos tratamentos com ADI-SS-PEG5.000, ADI-SS-PEG12.000 ou ADI-SS-PEG20.000 no tamanho do tumor em ratinhos que foram injectados com células de melanoma humano SK-mel 2. A Figura 8 é um gráfico que mostra o efeito dos tratamentos com ADI-SS-PEG20.000 no tamanho do tumor em ratinhos que foram injectados com células de melanoma humano SK-mel 28, SK-mel 2 ou M24-met. A Figura 9 é um gráfico que mostra o efeito dos tratamentos com ADI-SS-PEG5.000, ADI-SS-PEG12.000 ou ADI-SS-PEG20.000 na sobrevivência em ratinhos que foram injectados com células de hepatoma humano SK-Hepl.

Descrição pormenorizada da presente invenção

As células normais não necessitam de arginina para o crescimento uma vez que podem sintetizar a arginina a partir de citrulina num processo em duas fases, catalizado pelo arginosuccinato sintase e arginosuccinato liase. Em contraste, melanomas, hepatomas e alguns sarcomas não expressam arginosuccinato sintase por conseguinte não são auxotróficos para arginina. Esta diferença metabólica pode ser capitalizada para desenvolver uma terapia segura e eficaz para o tratamento destas formas de cancro. A arginina deiminase cataliza a conversão da arginina em citrulina e pode ser utilizada para eliminar a arginina. Assim, a arginina deiminase pode ser utilizada como um tratamento para melanomas, hepatomas e alguns sarcomas. 6 A arginina deiminase nativa pode ser encontrada em microrganismos e é antigénica e é rapidamente eliminada da circulação num paciente. Estes problemas podem ser ultrapassados por meio da modificação covalente da arginina deiminase com polietilenoglicol (PEG). A arginina deiminase com modificação covalente com polietilenoglicol (com um grupo de ligação) pode ser doravante referida como "ADI-PEG". Quando comparada com a arginina deiminase nativa, a ADI-PEG retém a maior parte da sua actividade enzimática, é muito menos antigénica, tem uma semivida de circulação muito maior e é muito mais eficaz no tratamento de tumores. 0 "polietilenoglicol" ou "PEG" refere-se a misturas de polímeros de condensação de óxido de etileno e água, numa cadeia ramificada ou linear, representados pela fórmula geral H (OCH2CH2) n0H, em que n é pelo menos 4. "Polietilenoglicol" ou "PEG" é utilizado em combinação com um sufixo numérico para indicar o seu peso molecular médio em peso aproximado. Por exemplo, PEG20.000 refere-se ao polietilenoglicol com um peso molecular médio em peso total de cerca de 20.000. "Melanoma" pode ser um tumor maligno ou benigno originário do sistema melanocítico da pele e outros órgãos, incluindo a cavidade oral, esófago, canal anal, vagina, leptomeninges e/ou conjuntiva do olho. O termo "melanoma" inclui, por exemplo, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma benigno juvenil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungual e melanoma superficial disseminado. "Hepatoma" pode ser um tumor maligno ou benigno do fígado, incluindo, por exemplo, o carcinoma hepatocelular. 7 "Paciente" refere-se a um animal, de preferência um mamífero, mais de preferência um humano. "Biocompatível" refere-se materiais ou compostos que geralmente não são prejudiciais às funções biológicas e que não irão ter como resultado qualquer grau de toxicidade inaceitável, incluindo estados alérgicos ou de doença.

Ao longo da presente descrição serão utilizadas as seguintes abreviaturas: PEG, polietilenoglicol; ADI, arginina deiminase; SS, succinimidil succinato; SSA, succinimidilo succinamida, SPA, succinimidil propionato e NHS, N-hidroxisuccinimida. A presente invenção baseia-se na descoberta inesperada de que ADI modificada com polietilenoglicol proporciona excelentes resultados no tratamento de certos tipo de cancro e inibição de metástases de cancro. ADI pode ter ligação covalente ao polietilenoglicol com um grupo de ligação, apesar de uma forma de realização preferida utilizar um grupo ligação.

Na presente invenção, o gene arginina deiminase pode ser derivado, clonado ou produzido a partir de qualquer fonte, incluindo, por exemplo microrganismos, biotecnologia recombinante ou qualquer combinação destas. De preferência, a arginina deiminase é clonado a partir de microrganismos da espécie Mycoplasma. Mais de preferência, a arginina deiminase é clonada a partir de Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominus, Mycoplasma arthritides ou qualquer combinação destes. Em particular, a arginina deiminase utilizada na presente invenção pode ter uma ou mais das sequências de aminoácidos descritas na Figura 1.

Numa forma de realização da presente invenção o polietilenoglicol (PEG) tem um peso molecular médio em peso total de 16.000 a 40.000; com maior preferência entre 16.000 e 30.000; com maior preferência desde 16.000 a 28.000; ainda com maior preferência desde 16.000 a 24.000; ainda com maior preferência desde 18.000 a 22.000, ainda com maior preferência desde 19.000 a 21.000, e o mais preferido cerca de 20.000. Geralmente, o polietilenoglicol com um peso molecular de 30.000 ou mais é de difícil dissolução e os rendimentos do produto formulado são muito reduzidos. O polietilenoglicol pode ser de cadeia ramificada ou linear, de preferência uma cadeia linear. Geralmente, o aumento do peso molecular do polietilenoglicol diminui a imunogenicidade da ADI. O polietilenoglicol com um peso molecular descrito nesta forma de realização pode ser utilizado em conjunto com a ADI e um grupo de ligação biocompatível para tratar o cancro, incluindo, por exemplo, melanomas, hepatomas e sarcomas, de preferência melanomas. O grupo de ligação utilizado para ligar covalentemente ADI a PEG pode ser qualquer grupo de ligação biocompatível. Tal como discutido anteriormente, "biocompatível" indica que o composto ou grupo não é tóxico e pode ser utilizado in vitro ou in vivo sem causar lesões, enjoo, doença ou morte. PEG pode ser ligado ao grupo de ligação, por exemplo, via uma ligação éter, uma ligação éster, uma ligação tiol ou uma ligação amida. Grupos de ligação biocompatíveis adequados, por exemplo um grupo éster, um grupo amida, um grupo imida, um grupo carbamato, um grupo carboxilo, um grupo hidroxilo, um hidrato de carbono, um grupo maleimido (incluindo por exemplo succinato de succinimidilo (SS), propionato de succinimidilo (SPA), carboximetilato de 9 succinimidilo (SCM), succinamida de succinimidilo (SSA) ou succinimida N-hidroxi (NHS)) um grupo epóxido, um grupo oxicarbonildimidazol (incluindo, por exemplo carbonildimidazol (CDI)), um grupo nitro fenilo (incluindo por exemplo carbonato de nitrofenilo (NPC) ou carbonato de triclorofenilo (TPC)), um grupo trisilato, um grupo aldeído, um grupo isocianato, um grupo vinilsulfona, um grupo tirosina, um grupo cisteína, um grupo histidina ou uma amina primária. De preferência, o grupo de ligação biocompatível é um grupo éster e/ou um grupo maleimido. Com maior preferência, o grupo de ligação é SS, SPA, SCM, SSA ou NHS, sendo SS, SPA ou NHS mais preferidos e sendo SS ou SPA os mais preferidos. ADI pode ter ligação covalente a PEG através de um grupo de ligação biocompatível, utilizando métodos conhecidos na técnica, tal como descrito, por exemplo, por Park et al. (1981) Anticancer Res. 1:373-376; e Zaplipsky e Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris, ed., Plenum Press, NI, Capítulo 21 (1992). A ligação de PEG e ADI aumenta a semivida de circulação da ADI. Geralmente, PEG é ligado a uma amina primária ou ADI. A selecção do sítio de ligação do polietilenoglicol na arginina deiminase é determinada pelo papel de cada um dos sítios dentro do mesmo domínio activo da proteína, tal como seria conhecido pelo artesão especializado. PEG pode ser ligado às aminas primárias da arginina deiminase sem perda substancial de actividade enzimática. Por exemplo, a ADI clonada de Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritides e Mycoplasma hominus tem cerca de 17 lisinas que podem ser modificadas por este processo. Por outras palavras, as 17 10 lisinas são todas possíveis pontos em que a ADI pode ser ligada ao PEG via um grupo de ligação biocompatível tal como SS, SPA, SCM, SSA e/ou NHS. O PEG pode também ser ligado a outros sítios na ADI tal como seria evidente para o especialista na técnica, perante a presente descrição.

Entre 1 a 30 moléculas de PEG podem ser ligadas covalentemente a ADI. De preferência, ADI é modificada com 7 a 15 moléculas PEG, com maior preferência entre 9 e 12 moléculas PEG. Por outras palavras, 30% a 70% dos grupos amino primários em arginina deiminase são modificados com PEG, de preferência 40% a 60%, com maior preferência 45% a 55% e ainda com maior preferência cerca de 50% dos grupos amino primários em arginina deiminase são modificados com PEG. Quando estabelece uma ligação covalente ao terminal final da ADI, de preferência só é utilizada uma molécula PEG. Aumentar o número de unidades PEG em ADI aumenta a semivida de circulação da enzima. No entanto, aumentar o número de unidades PEG em ADI diminui a actividade específica da enzima. Assim, é necessário atingir um ponto de equilíbrio entre os dois tal como seria evidente para o especialista na técnica, perante a presente descrição.

Na presente invenção, um aspecto comum dos grupos de ligação biocompatíveis mais preferidos consiste no facto de ligarem a uma amina primária da arginina deiminase por um grupo maleimido. Uma vez acoplado à arginina deiminase, SS-PEG tem uma ligação éster a seguir ao PEG que pode tornar este sítio sensível à esterase no soro, o que pode libertar o PEG da ADI no corpo. SPA-PEG e PEG2-NHS não têm uma ligação éster, de forma que não são sensíveis à esterase no soro. 11

Na presente invenção, os grupos de ligação especiais não parecem influenciar a semivida de circulação de PEG-ADI ou a sua actividade enzimática especifica. No entanto, é fundamental utilizar um grupo de ligação biocompatível na presente invenção. 0 PEG que é ligado à proteína tanto pode ser de cadeia simples, tal como é o caso de SS-PEG, SPA-PEG e SC-PEG ou pode ser utilizada uma cadeia ramificada de PEG tal como é o caso de PEG2-NHS. As fórmulas estruturais dos grupos de ligação preferidos na presente invenção são apresentadas em seguida. SS-PEG: SPA-PEG:

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Uma quantidade com eficácia terapêutica de um dos compostos da presente invenção é uma quantidade que é eficaz para inibir o crescimento do tumor. Em geral o tratamento é iniciado com pequenas doses que podem ir aumentando aos poucos até se atingir um efeito óptimo nas circunstâncias. Em geral, uma dose terapêutica de compostos da presente invenção pode oscilar entre 1 e 200 mg/kg, duas vezes por semana a cerca de uma vez a cada duas semanas. Por exemplo, a dosagem pode ser cerca de 1 mg/kg uma vez por semana sob a forma de uma injecção intravenosa de 2 ml até cerca de 20 mg/kg a cada 3 dias. A dosagem óptima com ADI-SS-PEG5.000 pode ser cerca de duas vezes por semana, enquanto que a dosagem óptima com ADI-SS-PEG20.000 pode ser desde cerca de uma vez por semana até cerca de uma vez a cada duas semanas. PEG-ADI pode ser misturado com uma solução salina com tampão de fosfato ou qualquer outra solução apropriada conhecida dos especialistas na técnica, antes da injecção. A formulação PEG-ADI pode ser administrada como uma formulação sólida (liofalato) ou como uma formulação liquida, conforme se desejar.

Os métodos da presente invenção podem envolver aplicações in vitro como in vivo. No caso das aplicações in vitro, incluindo aplicações em culturas de células, os compostos descritos presentemente podem ser adicionados a células em culturas e depois incubados. Os compostos da presente invenção podem também ser utilizados para facilitar a produção de anticorpos monoclonais e/ou policlonais utilizando técnicas de produção de anticorpos bem conhecidas na técnica. Os anticorpos monoclonais e/ou policlonais podem então ser utilizados numa vasta variedade de aplicações, tal como será evidente para um perito na especialidade. 13

Os meios de administração in vivo dos compostos da presente invenção irão variar conforme a aplicação pretendida. Tal como um perito na especialidade irá reconhecer, a administração da composição PEG-ADI da presente invenção pode ser realizada, por exemplo, por via oral, intranasal, intraperitoneal, parentérica, intravenosa, intralinfática, intratumoral, intramuscular, intersticial, intra-arterial, subcutânea, intraocular, intrasinuvial, intra-epitelial e transdérmica.

Exemplos A presente invenção é demonstrada em maior profundidade nos exemplos apresentados em seguida, destinados a ilustrar sem intenção de limitar o âmbito da presente invenção.

Exemplo 1: Produção de ADI recombinante

Culturas de Mycoplasma arginini (ATCC 23243), Mycoplasma hominus (ATCC 23114) e Mycoplasma arthritides (ATCC 23192) foram obtidos a partir da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. A arginina deiminase foi clonada a partir de Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominus e Mycoplasma arthritides e expressa em E. coli tal como anteriormente arginina por S. Misawa et al, J. Biotechnology, 3_6:145-155 (1994), cuja descrição é presentemente incorporada na integra como referência. As sequências de aminoácidos de arginina deiminase de cada uma das espécies anteriores são apresentadas na Figura 1. A principal sequência de aminoácidos, identificada como ADIPROT, é de Mycoplasma arginini; a sequência de aminoácidos do meio, identificada 14 como ARTADI PRO, é de Mycoplasma arthritides e a sequência de aminoácidos de baixo, identificada como HOMADIPRO, é de Mycoplasma hominus. Cada uma das sequências de aminoácidos está conservada em mais de 96%. A caracterização, por meio de métodos conhecidos dos especialistas na técnica, de cada uma das proteínas no que se refere a actividade enzimática específica, Km, Vmax e pH óptimo revelou que eram indistinguíveis entre si, do ponto de vista bioquímico. 0 pH óptimo foi determinado por meio de um tampão citrato (pH 5 a 6,5), um tampão fosfato (pH 6,5 a 7,5) e um tampão borato (pH 7,5 a 8,5). 0 Km e Vmax foram determinados por meio de incubação da enzima com várias concentrações de arginina e quantificação da produção de citrulina. 0 Km para as várias enzimas foi de cerca de 0,02 a 0,06 μΜ e o Vmax foi cerca de 15 a 20, cujos valores estão dentro do erro padrão de cada um.

Os genes de arginina deiminase são amplificados por meio de reacção em cadeia de polimerase, utilizando o par iniciador seguinte derivado da sequência publicada de M. arginini, conforme descrito, por exemplo por T. Ohno et al, Infect. Immun., 5_8: 3788-3795 (1990). 5'-GCAATCGATGTGTATTTGACAGT-3' (SEQ ID No:4) 5'-TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3' (SEQ ID No:5) O produto da reacção em cadeia de polimerase foi clonado como fragmento Barn Hl-Hind III no plasmídeo de expressão pQEl6. A análise da sequência de ADN indica que este fragmento tem a mesma sequência para o gene arginina deiminase, tal como descrito por Ohno et al, Infect. Immun., supra. Os cinco codões TGA no gene ADI, que 15 codificam triptofano em Mycoplasma foram modificados em codões TGG por meio de mutagénese dirigida ao oligonucleótido, antes da expressão do gene em E. coli, tal como explicado, por exemplo por J.R. Sayers et al, Biotechniques, _13g592-596 (1992). 0 ADI recombinante foi expresso em corpos de inclusão a níveis de 10% da proteína de célula total.

As proteínas de cada uma das três espécies de Mycoplasma anteriores têm aproximadamente 95% de homologia e são prontamente purificadas por meio de cromatografia em coluna. Aproximadamente, 1,2 g de proteína pura pode ser isolada a partir de 1 litro de caldo de fermentação. O ADI recombinante é estável por cerca de 2 semanas a 37 °C e durante pelo menos 8 meses quando guardado a 4 °C. Tal como determinado por meio de métodos conhecidos dos especialistas na técnica, as proteínas tinham uma elevada afinidade para a arginina (0,04 μΜ) e um pH óptimo fisiológico de cerca de 7,2 a cerca de 7,4.

Exemplo 2: Renaturação e purificação de ADI recombinante A proteína ADI foi renaturada com modificações mínimas, tal como descrito por Misawa et al., J. Biotechnology, 3_6: 145 a 155 (1994), cuja descrição é presentemente incorporada na íntegra como referência. 100 g de pasta de células foi ressuspensa em 800 ml de 10 mM de K2PO4 pH 7,0, 1 mM de EDTA (tampão 1) e as células foram desagregadas com duas passagens num Microfluidificador (Microfluidics Corporation, Newton, MA). Adicionou-se Triton X-100 para se atingir a concentração final de 4% (v/v). O homogeneizado foi agitado durante 30 min a 4 °C, depois foi centrifugado durante 30 min a 13.000 g. Os grânulos foram recolhidos e 16

ressuspensos num litro de tampão 1 com 0,5% de Triton X-100. A solução foi diafiltrada contra 5 volumes de tampão de desnaturação (50 mM Tris HC1, pH 8,5, 1 mM DTT) com cartuchos de fibras ocas com 100 kD de nivel de retenção (Microgon Inc., Laguna Hills, CA) . A guanidina HC1 foi adicionada para se atingir a concentração final de 6 M e a solução foi agitada durante 15 min a 4 °C. A solução foi diluída 100 vezes em tampão de refolding 1,10 mm K2PO4, PH 7.0 e foi agitada durante 48 agitada a 15 °C, os particulados foram removidos por meio de centrifugação a 15.000 x g. O sobrenadante resultante foi concentrado numa coluna de Q Sepharose Past Flow (Pharmacia Inc. Piscataway, NJ) , pré equilibrada num tampão de refolding. A ADI foi eluída com tampão de refolding com 0,2 M NaCl. O procedimento de purificação rendeu a proteína ADI, que tinha um grau de pureza >95%, conforme estimado por meio de análise de SDS-PAGE. 8 g de proteína ADI renaturada pura foi produzida a partir de 1 kg de paste de células, o que corresponde a 200 mg de ADI purificado por litro de fermentação. A actividade ADI foi determinada por meio de micro-modificação do método descrito por Oginsky et al, Meth. Enzymol., (1957) _3:639-642. Amostras de 10 μΐ em 0,1 m

Na2P04, pH 7,0 (tampão de análise BUN) foram colocadas em placas de microtitulação de 96 alvéolos, adicionaram-se 40 μΐ de arginina 0,5 mM em tampão de análise BUN e a placa foi coberta e incubada a 37 °C durante 15 minutos. Adicionou-se 20 μΐ de reagente BUN completo (Sigma Diagnostics) e a placa foi incubada durante 10 minutos a 100 °C. A placa foi então arrefecida a 22 °C e analisada a 490 nm por um leitor de placas de microtitulação (Molecular 17

Devices, Inc) . 1,0 UI é a quantidade de enzima que cobre 1 pmole de L-arginina a L-citrulina por minuto. As concentrações de proteína foram determinadas por meio do Pierce Coomassie Blue Protein Assay Reagent (Pierce Co., Rockford, IL) com albumina de soro de bovino como padrão. A actividade enzimática das preparações de ADI purificadas foi de 17 a 25 Ul/mg.

Exemplo 3: Ligação de PEG a ADI PEG foi ligado covalentemente a ADI num tampão de fosfato de 100 mM, pH 7,4. Rapidamente, a ADI em tampão de fosfato foi misturada com um excesso molar de PEG de 100. A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, depois a mistura foi dializada extensivamente para remover PEG não incorporado.

Foi realizada uma primeira experiência, onde se avaliou o efeito do grupo de ligação utilizado nas composições PEG-ADI. PEG e ADI foram ligados covalentemente através de diferentes grupos de ligação. Um grupo éster ou um grupo maleimido, incluindo SS, SSA, SPA e SSPA, possuindo o PEG um peso molecular médio em peso total de 5.000, 10.000, 12.000, 20.000, 30.000 e 40.000; um grupo epoxi, epoxi PEG em que o PEG tinha um peso molecular médio em peso total de 5.000; e um grupo PEG ramificado, PEG2-NHS, em que PEG tinha um peso molecular médio em peso total de 10.000, 20.000 e 40.000. 5.0 UI das composições resultantes foram injectados em ratinhos (5 ratinhos por cada grupo) Para determinar os níveis de arginina no soro, os ratinhos foram sangrados do 18 plexo retro-orbital (100 μΐ). Imediatamente depois da recolha, adicionou-se um volume igual de 50% (p/v) de ácido tricloroacético. O precipitado foi removido por meio de centrifugação (13.000 x g durante 30 minutos) e o sobrenadante foi removido e guardado congelado a -70 °C. As amostras foram então analisadas com um analisador de aminoácidos automático e os reagentes da Beckman Instruments, utilizando protocolos fornecidos pelo fabricante. Os limites de sensibilidade da citrulina, por meio deste método foi aproximadamente de 2 a 6 uM e a capacidade de reprodução das medições foi cerca de 8%. A quantidade de arginina no soro foi determinada por meio de análise de aminoácidos. Tal como se pode ver pelos resultados na Figura 3, o grupo de ligação que estabelece a ligação covalente entre PEG e ADI não tinha um efeito apreciável na capacidade da ADI para reduzir a arginina no soro in vivo. Por outras palavras, o grupo de ligação pode não ser critico para os resultados da experiência, com excepção da necessidade de utilizar um grupo de ligação não tóxico para aplicações in vivo.

Foi realizada uma segunda experiência em que foi avaliado o efeito do grupo de ligação e o peso molecular do PEG nos níveis de citrulina no soro in vivo. Deu-se a ratinhos (5 em cada grupo) várias composições de ADI e PEG-ADI, numa quantidade de 5,0 UI. Para determinar os níveis de citrulina no soro, os ratinhos foram sangrados do plexo retro-orbital (100 ul). Imediatamente depois da recolha, adicionou-se um volume igual de 50% (p/v) de ácido tricloroacético. O precipitado foi removido por meio de centrifugação (13.000 x g durante 30 minutos) e o sobrenadante foi removido e guardado congelado a -70 °C. As amostras foram então analisadas com um analisador de 19 aminoácidos automático e os reagentes da Beckman Instruments, utilizando protocolos fornecidos pelo fabricante. Os limites de sensibilidade da citrulina, por meio deste método foram aproximadamente de 2 a 6 uM e a capacidade de reprodução das medições foi cerca de 8%. A quantidade de citrulina foi determinada e a área sob a curva foi aproximada e expressa em gmol dias.

Na Figura 4, os círculos abertos indicam a quantidade de citrulina produzida por ADI nativo, os círculos a cheio são ADI-SC-PEG, os quadrados a aberto são ADI-SS-PEG, os triângulos a aberto são ADI-SPA-PEG e os triângulos a cheio são PEH-NHs-PEG2 de cadeia ramificada. Os resultados da Figura 4 demonstram que o peso molecular do PEG determina a eficácia da composição PEG-ADI. A eficácia das composições PEG-ADI não se baseia necessariamente no método ou meios de ligação do PEG ao ADI, excepto por um grupo de ligação biocompatível ter de ser utilizado para aplicações in vivo.

Os resultados na Figura 4 demonstram também que o peso molecular óptimo de PEG é 20.000. Apesar de PEG30.000 parecer ser superior ao PEG20.000, em termos da sua farmacodinâmica, o PEG30.000 é menos solúvel o que torna mais difícil de utilizar. Os rendimentos, que se baseavam na recuperação da actividade enzimática, eram de cerca de 90% para PEG5.000 e PEG12.000, cerca de 85% para PEG20.000 e cerca de 40% para PEG30.000. Por conseguinte, PEG20.000 é o melhor compromisso entre o rendimento e a semivida de circulação tal como determinado pela produção de citrulina.

Numa terceira experiência, foi determinada a resposta da dosagem ao esgotamento da arginina no soro e a produção de citrulina comADI-SS-PEG5.000 e ADI-SS-PEG20.000. Deu-se a 20 ratinhos (5 em cada grupo) uma única injecção de 0,005 UI, 0,5 UI ou 5,0 UI de ADI-SS-PEG5,000 ou de ADI-SS-PEG20.000. Em momentos indicados recolheu-se soro, tal como anteriormente descrito, e realizou-se uma análise dos aminoácidos para quantificar a arginina no soro (Figuras 5A e 5C) e a citrulina no soro (Figuras 5B e 5D) . Ambas as formulações induziram uma diminuição dependente da dose na arginina no soro e um aumento na citrulina no soro. No entanto, os efeitos induzidos por ADI-SS-PEG20.000 foram mais pronunciados e de maior duração que os efeitos induzidos por ADI-SS-PEG5,000.

Exemplo 4: Selectividade da citotoxicidade mediada por ADI A selectividade da citotoxicidade mediada pela arginina deiminase foi demonstrada foi demonstrada com vários tumores humanos. Especificamente, os tumores humanos foram testados in vitro quanto à sensibilidade ADI-SS-Peg5.000 (50 ng/ml). A viabilidade das culturas foi determinada passados 7 dias. Para que uma cultura seja definida como "inibida", mais de 95% das células devem absorver corante azul Trypan. Foram também testadas múltiplas células normais, incluindo células endoteliais, células musculares lisas, células epiteliais e fibroblastos e nenhumas foram inibidas pelo ADI-SS-PEG5, 000. Apesar de a arginina deiminase não possuir uma toxicidade apreciável em relação a células normais e maioria das células de cancro, o ADI-SS-PEG5,000 inibiu em muito todos os melanomas e hepatomas humanos que se encontravam disponíveis no comércio de ATCC, MSKCC e Europa.

Quadro 1: Especificidade da citotoxicidade da arginina deiminase 21

Tipo de tumor Número de tumores Tumores inibidos analisados (%) Cérebro 16 0 Cólon 34 0 Bexiga 3 0 Mama 12 0 Rim 5 0 Sarcoma 11 64 Hepatoma 17 100 Melanoma 37 100

Num conjunto paralelo de experiências, isolou-se o mARN de tumores. As análises da mancha de Northern com amostra de cADN de arginosuccinato sintase humana indicaram uma completa concordância entre a sensibilidade em relação ao tratamento com arginina deiminase e uma incapacidade de exprimir arginosuccinato sintase. Estes dados sugerem que a toxicidade da ADI resulta de uma incapacidade para induzir arginosuccinato sintase. Por conseguinte, estas células não podem sintetizar arginina a partir de citrulina e são incapazes de sintetizar as proteínas necessárias para o crescimento.

Exemplo 5: Semivida de circulação

Ratinhos Balb C (5 em cada grupo) foram injectados por via intravenosa com uma dose única de 5,0 UI de arginina deiminase nativa ou várias formulações de arginina deiminase modificada com polietilenoglicol, tal como indicado nas Figuras 3A e 3B. Para determinar os níveis de arginina e citrulina no soro, os ratinhos foram sangrados do plexo retro-orbital (100 ul). Imediatamente depois da recolha, adicionou-se um volume igual de 50% (p/v) de ácido 22 tricloroacético. 0 precipitado foi removido por meio de centrifugação (13.000 x g durante 30 minutos) e o sobrenadante foi removido e guardado congelado a -70 °C. As amostras foram então analisadas com um analisador de aminoácidos automático e os reagentes da Beckman Instruments, utilizando protocolos fornecidos pelo fabricante. Os limites de sensibilidade da arginina, por meio deste método foram aproximadamente de 6 pM e a capacidade de reprodução das medições foi cerca de 8%.

Uma diminuição dependente da dose dos níveis de arginina, tal como demonstrado pelos círculos a cheio na Figura 2A e um aumento na citrulina no soro, tal como demonstrado pelos triângulos abertos na Figura 2B, foram detectados com a administração de uma única dose de ADI nativo (círculos a cheiro) ou ADI-SS-PEG (triângulos abertos). No entanto, a diminuição na arginina no soro e aumento na citrulina no soro foi de curta duração e rapidamente voltaram ao normal. A semivida do esgotamento da arginina encontra-se resumida no quadro em seguida.

Quadro 2: Semivida do esgotamento da arginina no soro

Composto Semivida em dias ADI nativo 1 ADI-SS-PEG5,000 5 ADI-SS-PEG12,000 15 ADI-SS-PEG20,000 20 ADI-SS-PEG30,000 22

Esta experiência demonstra que células e tecidos normais são capazes de converter a citrulina de novo em arginina por via intracelular, enquanto que melanomas e hepatomas não conseguem porque lhes falta arginosuccinato sintase. 23

Exemplo 6: Antigenicidade de ADI modificado com PEG

Para determinado a antigenicidade de ADI nativo, ADI-SS-PEG5.000, e ADI-SS-PEG20.000 foram seguidos os procedimentos descritos em, por exemplo Park, Anticancer Res., supra, e Kamisaki, J. Pharmacol. Exp. Ther., supra. Resumidamente, ratinhos Balb C (5 em cada grupo) foram injectados por via intravenosa, semanalmente durante 12 semanas com aproximadamente 0,5 UI (100 ug de proteína) de ADI, ADI-SS-PEG5.000 ou ADI-SS-PEG20.000 . Os animais foram sangrados (0,05 ml) do plexo retro-orbital no início da experiência e nas semanas 4, 8 e 12. O soro foi isolado e armazenado a -70 °C. Os títulos de IgG anti ADI foram determinados por ELISA. 50 uG de ADI foram adicionados a cada alvéolo de uma placa de microtitulação de 96 alvéolos e incubou-se à temperatura ambiente durante 4 horas. As placas foram lavadas com SFB e depois foram revestidas com albumina de soro de bovino (1 mg/ml) para bloquear locais de ligação de proteína não específicos e foram guardadas de um dia para outro a 4 °C. No dia seguinte, diluiu-se o soro de ratinhos e adicionou-se aos alvéolos. Depois de 1 hora as placas foram lavadas com PBS e adicionou-se aos alvéolos IgG de coelho anti-rato acoplado a peroxidase. As placas foram incubadas durante 30 min e depois mediu-se a absorvência de UV resultante com um leitor de placa de micro-titulação. O título foi definido como sendo a maior diluição do soro que resultou num aumento para o dobro a partir da absorvência de fundo (aproximadamente 0,50 OD).

Os resultados são apresentados na Figura 6. Os círculos a aberto representam os dados obtidos a partir de animais injectados com ADI nativo, o qual foi muito antigénico. Os círculos a cheio representam os dados obtidos a partir de 24 animais injectados com ADI-SS-PEG5.000, enquanto que os triângulos a aberto representam os dados obtidos a partir de animais injectados com ADI-SS-PEG20.000. Tal como se pode constatar a partir da Figura 6, ADI-SS-PEG5.000 e ADI-SS-PEG20.000 são significativamente menos antigénicos que o ADI nativo. Por exemplo, apenas 4 injecções de ADI nativo tiveram como resultado um titulo de cerca de 106, enquanto que 4 injecções de qualquer uma das formulações de PEG-ADI não conseguiram apresentar qualquer anticorpo mensurável. No entanto, após 8 injecções, ADI-PEG5.000 tinha um titulo de cerca de 102, enquanto que ADI-PEG20.000 não induziram tanta resposta imunitária antes de 12 injecções. Os resultados demonstram que a ligação de PEG a ADI enfraquece a resposta imunitária à proteína.

Exemplo 7: Inibição de tumor de melanomas humanos

Foi determinado o efeito de PEG-ADI no crescimento do melanoma humano (SK-Mel 28) em ratinhos nus. Os ratinhos nus (5 em cada grupo) foram injectados com células de melanoma humano 106 SK-mel 2 que foram deixadas desenvolver-se até os tumores atingirem um diâmetro de cerca de 3 a 5 mm. Os ratinhos foram deixados sem tratamento (círculos abertos) ou foram tratados uma vez por semana, durante 12 semanas, com 5,0 UI de ADI-SS-PEG5.000 (triângulos a cheio), ADI-SS-PEG12.000 (triângulos a aberto) ou ADI-SS-PEG20.000 (círculos a cheio). O tamanho do tumor foi medido semanalmente e o diâmetro médio do tumor encontra-se apresentado na Figura 7. A Figura 8 mostra a eficácia de ADI-SS-PEG20,000 em três melanomas humanos (SK-mel 2, SK-mel 28, M24-met) desenvolvidos in vivo em ratinhos nus. Os ratinhos nus (5 25 em cada grupo) foram injectados com células de melanoma humano 106 SK-mel 2, SK-mel 28 ou M24-met. Os tumores foram deixados crescer até ter aproximadamente 3 a 5 mm de diâmetro. Em seguida, os animais foram injectados uma vez por semana com 5,0 UI de ADI-SS-PEG20.000. Os resultados são apresentados na Figura 8 e mostram que PEG-ADI inibiu o crescimento do tumor e eventualmente os tumores começara a regredir e desaparecer. Dado que os tumores não tinham argininosuccinato sintetase foram incapazes de sintetizar proteínas (porque a ADI eliminava a arginina e os tumores não a podiam produzir) de forma que as células "morreram à fome".

Uma vez que o melanoma humano M24-met é muito metástico, os animais injectados com células do melanoma humano M24-met foram sacrificados após 4 semanas de tratamento e determinou-se o número de metástases nos pulmões dos animais. Os animais de controlo tinham uma média de 32 metástases enquanto que os animais tratados com ADI-SS-PEG20.000 não tinham quaisquer metástases. Os resultados parecem indicar que ADI-SS-PEG20.000 não só inibiu o crescimento do tumor de melanoma primário como também inibiu a formação de metástases. É interessante notar que em mais de 200 animais testados, o número médio de metástases no grupo de controlo foi 49 ± 18, enquanto que só foi observada uma única metástase em 1 animal tratado.

Exemplo 8: Inibição de tumor de hepatomas humanos

Foi testada a capacidade de PEG5.000-ADI inibir o crescimento de um hepatoma humano in vivo. Ratinhos nus (5 26 por cada grupo) foram injectados com 106 células de hepatoma humano SK-Hel. Os tumores foram deixados crescer durante 2 semanas e depois os animais foram tratados uma vez por semana com 5,0 UI de SS-PEG5.000-ADI (círculos a cheio), SS-PEG12.000-ADI (triângulos a cheio) ou SS-PEG20.000-ADI (triângulos a cheio). Os resultados são apresentados na Figura 9. Os animais não tratados (círculos abertos) morreram todos no espaço de 3 semanas. Em contraste, os animais tratados com ADI tiveram uma esperança de vida muito maior tal como se pode constatar na Figura 9. Todos os ratinhos sobreviventes foram eutanizados após 6 meses e a necropsia indicou que não tinham tumores.

Surpreendentemente, PEG5.000-ADI é mais eficaz na inibição do crescimento do hepatoma in vivo. O mecanismo exacto deste fenómeno é desconhecido. Sem limitar a qualquer teoria do funcionamento da presente invenção, parece que as proteínas formuladas com SS-PEG5.000-ADI ficam sequestradas no fígado. Pesos moleculares maiores de PEG não, o que se pode dever à singularidade do endotélio hepático e ao tamanho dos espaços (aberturas) que excluem conjugados PEG-ADI de peso molecular maior.

Exemplo 9: Aplicação em seres humanos PEG5.000-ADI e PEG20.000-ADI foram incubados ex vivo com soro humano normal e determinou-se os efeitos na concentração da arginina por meio de análise de aminoácidos, onde se verificou que a enzima estava completamente activa e capaz de degradar toda a arginina detectável com a mesma cinética que na experiência que envolvia ratinhos. A reacção foi conduzida a um volume de 0,1 ml durante 1 hora a 37 °C. Adicionalmente, os níveis de 27 arginina e de citrulina no soro humano são idênticos aos encontrados nos ratinhos. As proteínas PEG circulam durante mais tempo em seres humanos do que em ratinhos. Por exemplo, a semivida de circulação da adenosina deiminase, asparaginase, glucocerbrocidase, uricase, hemoglobulina e superóxido dismutase conjugadas com PEG é em todos os casos uma semivida de circulação 5 a 10 vezes mais longa do que as mesmas formulações em ratinhos. No passado este facto significava que a dose humana é muito frequentemente 1/5 a 1/10 da utilizada em ratinhos. Assim, PEG-ADI deverá circular durante mais tempo em seres humanos do que em ratinhos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Phoenix Pharmacologics, Inc. <120> Arginina Deiminase modificada <130> PHOE0037 <140> 98 922 197.3 <141> 1998-05-12 <150> USSN 09/023,809 <151> 1998-02-13 <150> USSN 60/046,200 <151> 1997-05-12 <160> 5 <170> Patenteln versão 3,0 28

<210> 1 <211> 410 <212> PRT <213> Mycoplasma arginini <40 A o 1 Ktet Vai Fte Ãsp 3sr lys Phé ΐ 5 íle eiu 0b.5 Sêr Vai La a 20 âsp Tyr Jiè Τϊΐιτ ΫΖΟ Alá Arg b£S 35 eo C4á fiis .Asp Alá »1-3 Lys 50 55 1*1.5 Sys Ala Asn Asp He .S.-srs. Vai tS 70 Thr fyr A3p Lesi »1.3 Se r 5.? L 51 05! Ciu Phe L.fiíír SIa 109 Asp Set Slu Fe» y&i Vai Arg »sa Phe Le a L.yiS Ma 115 120 Glu lie Síet Hat Ala Gly ria Ihr 130 135 Asp Sis Gla Í:.«kl 11« Vai Ãssp Pr* 1ÍS 150 £'····> Pise .»1.3 •Ssr vai Giy Asa 165 Tyr vai Ar a Ôiá &la. Vhr 180 »s® Sis Pr* Lys 5¾¾ ΙΪ8 Así* Thr

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Lisboa 28 de Setembro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto que inclui arginina deiminase com ligação covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em que o polietilenoglicol tem um peso molecular médio em peso total entre 16.000 e 40.000.

2. O composto da reivindicação 1, em que o grupo de ligação é seleccionado do grupo constituído por um grupo succinamida, um grupo amida, um grupo imida, um grupo carbamato, um grupo éster, um grupo epoxi, um grupo carboxilo, um grupo hidroxilo, um grupo hidrato de carbono, um grupo tirosina, um grupo cisterna, um grupo histidina e combinações destes.

3. O composto da reivindicação 2, em que o grupo de ligação mencionado é um grupo succinimida.

4. O composto da reivindicação 3, em que o grupo succinimida mencionado é succinato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, carboximetilato de succinimidilo, succinamida de succinimidilo, N-hidroxi succinimida ou combinações destes.

5. O composto da reivindicação 4, em que o grupo succinimida mencionado é succinato de succinimidilo, propionato de succinimidilo ou combinações destes.

6. O composto da reivindicação 1, em que a arginina deiminase mencionada é derivada de um microrganismo da espécie Mycoplasma. 2 7. 0 composto da reivindicação 6, em que o microrganismo mencionado é seleccionado do grupo constituído por Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominus, Mycoplasma arthritides e combinações destes. 8. 0 composto da reivindicação 1, em que a arginina deiminase mencionada tem uma ligação covalente a 7 a 15 moléculas de polietilenoglicol. 9. 0 composto da reivindicação 8, em que a arginina deiminase mencionada tem uma ligação covalente a 9 a 12 moléculas de polietilenoglicol.

10. O composto da reivindicação 1, em que o polietilenoglicol mencionado tem um peso molecular médio em peso total entre 16.000 e 30.000.

11. Um método de aumento da semivida de circulação da arginina deiminase que inclui modificar a arginina mencionada por meio de ligação covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em que o polietilenoglicol tem um peso molecular médio em peso total entre 16.000 e 40.000.

12. Uma utilização de um composto que inclui arginina deiminase com ligação covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em que o polietilenoglicol tem um peso total peso molecular médio entre 16.000 e 40.000 para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento de um tumor num paciente.

13. A utilização da reivindicação 12, em que o tumor mencionado é um melanoma. 3

14. A utilização da reivindicação 13, em que o polietilenoglicol mencionado tem um peso total peso molecular médio de cerca de 20.000.

15. A utilização da reivindicação 13, em que o grupo de ligação mencionado é um grupo succinimida.

16. A utilização da reivindicação 15, em que o grupo succinimida mencionado é succinato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, carboximetilato de succinimidilo, succinamida de succinimidilo, N-hidroxi succinimida ou combinações destes.

17. A utilização da reivindicação 12, em que o tumor mencionado é um hepatoma.

18. A utilização da reivindicação 17, em que o grupo de ligação mencionado é um grupo succinimida.

19. A utilização da reivindicação 18, em que o grupo succinimida mencionado é succinato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, carboximetilato de succinimidilo, succinamida de succinimidilo, N-hidroxi succinimida ou combinações destes.

20. A utilização da reivindicação 12, em que o tumor mencionado é um sarcoma.

21. A utilização de um composto da reivindicação 1 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento e inibição de metástases num paciente.

22. Um método de aumento da actividade tumoricida da 4 arginina deiminase que inclui a modificação da arginina deiminase mencionada por meio de ligação covalente da arginina deiminase mencionada através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, possuindo o polietilenoglicol um peso molecular médio em peso total de 16.000 a 40.000 e sendo o grupo de ligação seleccionado do grupo constituído por um grupo amida, um grupo imida, um grupo carbamato, um grupo éster, um grupo epoxi, um grupo carboxilo, um grupo hidroxilo, um grupo hidrato de carbono, um grupo tirosina, um grupo cisteína, um grupo histidina e combinações destes Lisboa, 28 de Setembro de 2006