KR102455753B1 - 암치료를 위한 ａｄｉ-ｐｅｇ 20 항체에 대해 감소된 교차반응성을 지니는 아르기닌 탈이민효소 - Google Patents

암치료를 위한 ａｄｉ-ｐｅｇ 20 항체에 대해 감소된 교차반응성을 지니는 아르기닌 탈이민효소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 ADI-PEG 20에 비해 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖지만, ADI-PEG 20과 비슷하거나 또는 더 양호한 기능적 특징을 가질 수 있는 단리된 아르기닌 탈이민효소(ADI) 단백질, ADI 단백질을 포함하는 조성물 및 암과 같은 아르기닌-의존성 질환 또는 관련 질환을 치료하는 관련된 방법에 관한 것이다.

Description

암치료를 위한 ＡＤＩ-ＰＥＧ 20 항체에 대해 감소된 교차반응성을 지니는 아르기닌 탈이민효소{ARGININE DEIMINASE WITH REDUCED CROSS-REACTIVITY TOWARD ADI-PEG 20 ANTIBODIES FOR CANCER TREATMENT}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/790,833호에 대해 미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e)) 하에 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열목록에 대한 언급
본 출원과 관련된 서열목록은 종이 복사물 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참고로 포함된다. 서열목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 POLA_003_01WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 약 117 KB이며, 2014년 3월 11일에 생성되었고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되어 있다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 ADI 단백질을 포함하는, 아르기닌 탈이민효소(arginine deiminase: ADI)에 관한 것이다. 이러한 ADI 단백질은 아르기닌-의존성 또는 관련 질환, 예컨대 암을 치료하는데 유용하다.
아미노산 박탈 요법(deprivation therapy)은 일부 형태의 암의 효과적인 치료일 수 있다. 지금까지, 아스파라긴의 순환 수준을 낮추고 단백질 합성을 저해하기 위해 아스파라기나제를 이용하는 이 접근에 적절한 하나의 공지된 임상예가 있다. 이 치료는 급성 림프구성 백혈병에 특히 효과적이다(Avramis 2005, Viera Pinheiro 2004). 급성 림프구성 백혈병 세포는 성장 및 증식을 위해 아미노산 아스파라긴을 필요로 한다. 대조적으로, 대부분의 정상 인간 세포는 아스파라긴을 합성할 수 있고, 아스파라긴 고갈에 의해 영향받지 않는다. 따라서 아스파라기나제를 이용하여 혈청 아스파라긴을 감소시키는 것은 정상 세포, 조직 및 숙주를 해하는 일 없이 암 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 아스파라기나제의 이콜라이(E. coli) 유래 형태는 인간용으로 승인되었다. 그러나, 아스파라기나제는 미생물에서만 발견되는데; 이는 인간에서 고도로 면역원성이 되게하며, 또한 주사 후에 짧은 혈청 반감기를 가진다(Avramis 2005). 아스파라기나제를 더 효과적인 약물로 만들기 위해, 이들 문제점은 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol: PEG)을 이용하여 이콜라이 유래 아스파라기나제를 제형화하여 이 효소의 면역원성 및 관련된 알레르기 반응을 감소시킴으로써 최소화되었다. 추가로, PEG는 아스파라기나제의 순환 반감기를 크게 연장시키는데, 이는 치료 빈도와 요법의 총 비용을 둘 다 감소시킨다. PEG 제형화 아스파라기나제는 용도가 승인되어 있고, 상표명 온카스파르(Oncaspar)(등록상표) 하에 시판되고 있다(Oncaspar® 2011, Avramis 2005, Viera Pinheiro 2004, Fu 2007, Zeidan 2008).
아르기닌은 인간 및 마우스에 대한 다른 비필수 아미노산이다(검토를 위해 문헌[Rogers 1994] 참조). 인간에서, 아르기닌은 시트룰린으로부터 크렙스(유레아) 회로 효소 아르기니노숙시네이트 합성효소(ASS, L-시트룰린:L-아스파테이트 리가제[AMP-형성], EC 6.3.4.5) 및 아르기니노숙시네이트 리가제(ASL, L-아르기니노숙시테이트 아르기닌-리가제, EC 4.3.2.)를 통해 2 단계로 합성될 수 있다(Haines 2011, Wu 2009, Morris 2006, Husson 2003, Tapiero 2002, Rogers 1994). ASS는 시트룰린 및 아스파트산의 아르기니노숙시네이트로의 전환을 촉매하고, 이어서 ASL에 의해 아르기닌 및 푸마르산으로 전환된다. 인간에서 아르기닌 결여 식이요법은 항암모니아혈증, 오로트산 산성뇨증을 유발하지도 않고, 성인에서 전체 일산화질소(NO) 합성 속도를 변경하지도 않는다(Tapiero 2002, Castillo 1995, Rogers 1994, Carey 1987, Barbul 1986, Snyderman 1959, Rose 1949). 미숙아는 아르기닌을 필요로 하지만(Wu 2004), 아르기닌 수준은 영아, 소아 및 청소년 중에서 연령과 상관관계가 없다(
Figure 112021063736293-pat00001
2007). 1992년에, 타카쿠(Takaku)와 수기무라(Sugimura)는 인간 흑색종 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma: HCC) 세포주가 성장을 위해 아르기닌을 필요로 하는 것으로 나타났다는 것을 개별적으로 보고하였다. 다른 연구는 페길화된 ADI가 이상 반응이 거의 없이 흑색종 및 간세포암의 치료에 효과적이었다는 것을 나타내었다.
ADI-PEG 20 치료는 일정 시간에 걸쳐 다회 용량을 필요로 한다. 다수의 치료 후에, 항-ADI-PEG 20 항체는 그의 계속된 유효성을 제한할 수 있도록 개발될 수 있다. 따라서, 아르기닌 고갈 요법의 효능을 개선시키고 연장시키기 위해, 치료에서 사용하기 위한 항-ADI-PEG20 항체에 대해 교차-반응성이 감소된 ADI에 대한 당업계의 필요가 있다. 본 발명은 이를 제공하며, 암 치료를 위한 다른 이점을 제공한다.
참고문헌: [Avramis VI, Panosyan EH. 2005. Clin Pharmacokinet 44:367-393; Barbul A. 1986. J Parenteral Enteral Nutr 10:227-238; Carey GP, et al. 1987. J Nutr 117:1734-1739; Castillo L, et al. 1995. Am J Physiol 268 (Endocrinol Metab 31):E360-367; Fu CH, Sakamoto KM. 2007. Expert Opin Pharmacother 8:1977-1984; Haines RJ, et al. 2011. Int J Biochem Mol Biol 2:8-23; Husson A, et al. 2003. Eur J Biochem 270:1887-1899;
Figure 112021063736293-pat00002
T, et al. 2007. Clin Chem Lab Med 45:1525-1530; Morris SM Jr. 2006. Am J Clin Nutr 83(Suppl):598S-512S; Rogers QR. 1994. In Proceedings from a Symposium Honoring Willard J. Visek - from Ammonia to Cancer and Gene Expression. Special Publication 86 - April, 1994, Agriculture Experiment Station, University of Illinois, 211 Mumford Hall, Urbana, IL 61801, pp. 9-21; Tapiero H, et al. 2002. Biomed Pharmacother 56:439- 445, 2002; Viera Pinheiro JP, Boos J. 2004. Br J Haematol 125: 117-127; Wu G, et al. 2009. Amino Acids 37:153-168; Wu G, et al. 2004. J Nutr Biochem 15:442-451; Zeidan A, et al. 2008. Expert Opin Biol Ther 9:111-119)].
본 발명의 일 양태는 단리된 아르기닌 탈이민효소를 제공하되, 단리된 아르기닌 탈이민효소는 항-ADI-PEG 20 항체를 이용하여 환자와의 교차-반응성을 감소시켰다. 또한 단리된 아르기닌 탈이민효소 또는 ADI 활성을 갖는 이의 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료적 또는 약제학적 조성물이 포함된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 멸균이고/이거나 내독소와 같은 발열원이 실질적으로 없다. 일 실시형태에서, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소는 마이코플라스마 호미니스(M. hominis)로부터 유래되지 않는다. 다른 실시형태에서, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소는 표 1에 열거된 유기체로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소는 ADI-PEG 20의 특성과 비슷하거나 또는 더 양호한 하나 이상의 특성을 가진다. 이와 관련하여, 하나 이상의 특성은, Kcat, Km, 최적 pH, 안정성, 생체내 단백질 분해 안정성, 또는 혈액 중에 이미 존재하고 있지 않은 이온 또는 보조인자에 대한 필요 없음, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소는 마이코플라스마 호미니스 아르기닌 탈이민효소에 비해 적어도 20개의 표면 잔기 변화를 가진다. 다른 실시형태에서, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소는 마이코플라스마 호미니스 아르기닌 탈이민효소에 비해 20 내지 135개의 표면 잔기 변화, 40 내지 100개의 표면 잔기 변화, 30 내지 60개의 표면 잔기 변화, 80 내지 100개의 표면 잔기 변화, 또는 100 내지 120개의 표면 잔기 변화를 가진다.
다른 실시형태에서, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소는 마이코플라스마 아르기니니(M. arginini), 마이코플라스마 아스리티디스(M. arthritidis), 마이코플라스마 포시세레브랄레(M. phocicerebrale), 마이코플라스마 가테아(M. gateae), 마이코플라스마 포시다(M. phocidae), 마이코플라스마 칼럼비늄(M. columbinum), 마이코플라스마 아이오와(M. iowae), 마이코플라스마 크로코딜리(M. crocodyli), 마이코플라스마 알리가토리스(M. alligatoris), 할로테르모트릭스 오레니(H. orenii) 또는 모락셀라 보비스(M. bovis)로부터 유래된다. 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 예시적 아르기닌 탈이민효소는 서열번호 2 내지 32 중 어느 하나에서 제시되는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소는 적어도 하나의 페길화 부위를 제거하도록 변형되었다. 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 아르기닌 탈이민효소의 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 라이신 잔기는 아미노산 치환에 의해 변형되었다. 이와 관련하여, 특정 실시형태에서, 적어도 5개 라이신 잔기, 적어도 10개 라이신 잔기, 또는 적어도 20개 라이신 잔기는 아미노산 치환에 의해 변형되었다.
다른 실시형태에서, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 아르기닌 탈이민효소는 PEG 분자에 대한 링커를 통해 공유적으로 결합된다. 이와 관련하여, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 아르기닌 탈이민효소는 하나 이상의 PEG 분자, 예컨대 약 1 내지 약 10 또는 약 2 내지 약 8 PEG 분자에 공유적으로 결합될 수 있다. PEG 분자는 직쇄 또는 분지쇄 PEG 분자일 수 있고, 약 1,000 내지 약 40,000의 총 중량 평균 분자량, 또는 약 10,000 내지 약 30,000의 총 중량 평균 분자량을 가질 수 있다. PEG가 링커를 통해 본 발명의 ADIr에 공유적으로 결합되는 해당 실시형태에서, 링커는 숙시닐기, 아마이드기, 이미드기, 카바메이트기, 에스터기, 에폭시기, 카복실기, 하이드록실기, 탄수화물, 타이로신기, 시스테인기, 히스티딘기, 메틸렌기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 숙시닐기의 공급원은 숙신이미딜 숙시네이트이다.
본 발명의 다른 양태는 본 명세서에 기재된 단리된 아르기닌 탈이민효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 추가적인 양태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 추가로 화학치료제를 포함한다. 예시적 화학치료제는 도세탁셀, 카보플라틴, 사이클로포스파마이드, 겜시타빈, 시스플라틴, 소라페닙, 수니티닙, 및 에베로리무스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태는 치료가 필요한 환자에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여함으로써, 암의 증상을 치료, 개선시키거나 또는 암의 진행을 저해하는 단계를 포함하는, 암의 증상을 치료, 개선시키거나 또는 암의 진행을 저해하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 치료가 필요한 환자는 항-ADI-PEG 20 항체를 갖는 것으로 결정되었다. 다른 실시형태에서, 암은 간세포 암종, 전이성 흑색종을 포함하는 흑색종, 췌장암, 전립선암, 소세포 폐암, 중피종, 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 간세포암, 육종, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 재발된 급성 골수성 백혈병, 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암, 신경교종, 교모세포종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 신장암, 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 자궁경부암, 고환암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태는 치료가 필요한 환자에게 ADI-PEG 20을 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하고, 일정 시간 후에 본 명세서에 기재된 바와 같은 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써, 암의 증상을 치료, 개선시키거나 또는 암의 진행을 저해하는 단계를 포함하는, 암의 증상을 치료, 개선시키거나 또는 암의 진행을 저해하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 일정 시간은, 예를 들어, 환자에서 항-ADI-PEG 20 항체의 사전 결정된 수준을 검출하는 단계 및/또는 환자에서 ADI 활성을 측정하거나 또 다르게는 관찰하는 단계에 의해 결정될 수 있되, 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 단리된 아르기닌 탈이민효소를 포함하는 조성물은 상기 항-ADI-PEG 20 항체의 사전 결정된 수준의 검출 후에 및/또는 환자에서 ADI의 사전 결정된 수준의 측정 또는 관찰 후에 투여된다.
또한 암의 증상을 치료, 개선하거나, 또는 암의 진행을 저해하기 위한 의약의 준비 또는 제조에서 사용을 위한 본 명세서에 기재된 단리된 아르기닌 탈이민효소 단백질이 포함된다.
본 발명의 실시형태는 일부 실시형태에서 소수의 표면 라이신 잔기를 갖도록 유전자 조작되고, 안정한 링커를 통해 PEG와 컨쥬게이트되는, 선택된 ADI 효소에 관한 것이다. 선택된 ADI 효소는 그들의 유익한 특성에 기반하여, 상이한 유기체로부터의 다수의 ADI 효소로부터 선택된다. 이들 특성은 아르기닌의 시트룰린 및 암모니아로의 ADI 전환을 통해 인간 혈액에서 낮은 아르기닌 농도를 확립 및 유지하는 효소의 능력을 포함한다. 추가로, 선택된 ADI 분자는 ADI-PEG 20에 비해 항-ADI-PEG 20 항체에 대해 감소된 교차-반응성을 가지며, 이러한 항체는 ADI-PEG 20을 이용하는 환자의 사전 치료로부터 가능하게 생성된다.
특정 실시형태에서, 본 발명에서 효소는 신장 클리어런스(clearance) 및 단백질 분해에 대한 보호뿐만 아니라 감소된 면역원성 또는 항원성을 제공하도록 페길화된다. 페길화의 유효성을 증가시키기 위해, 효소에 대한 변형은 표면 라이신 잔기의 수를 감소시키도록 유전자 조작될 수 있고, 따라서 이용가능한 PEG 부착 부위의 수를 제한한다. 이는 남아있는 라이신 부착 잔기에서 더 완전하고 균일한 페길화를 제공한다.
ADI에 메톡시-PEG를 부착시키기 위해 선택되는 PEG 링커는 화학적으로 안정한 결합을 제공하도록 선택된다. 이는 분자의 생활성 수명을 증가시킬 것으로 기대된다. 화학적으로 안정한 링커는 또한 가수분해를 제거하고, 효소 표면에 부착되는 탈페길화된 링커가 생길 수 있는 면역 반응을 감소시킬 것이다.
이들 누적된 사항은 환자의 혈액으로부터 아르기닌을 효과적으로 제거하고 이전의 아르기닌 고갈 요법으로부터 항-ADI-PEG 20 항체에 의해 중화 또는 클리어런스되지 않는 하나 이상의 분자를 초래한다. 분자는 그들 자체의 면역원성에 기인하여 중화 및 클리어런스를 지연시키기 위해 페길화된다. 이들 인자는 ADI-PEG 20 대신 또는 ADI-PEG 20에 추가로(예를 들어, 후속 약물로서) 그들을 사용하게 하여 아르기닌 고갈 요법을 연장시키고, 따라서 항-암 치료제로서 아르기닌 고갈 치료의 유효성을 증가시킬 것이다.
정상 세포는 성장을 위해 아르기닌을 필요로 하지 않는데, 그들은 ASS 및 ASL에 의해 촉매된 2 단계 공정에서 시트룰린으로부터 아르기닌을 합성할 수 있기 때문이다. 대조적으로, 특정암은 ASS를 발현시키지 않는다. 특정암은 ASL을 발현시키지 않으며, 다른 암은 ASS 및/또는 ASL의 발현을 감소시킬 수 있거나, 또는 발현시키지 않을 수도 있다. 따라서, 이들 암은 아르기닌에 대해 영양 요구성이다. 이 대사적 차이는 이들 형태의 암을 치료하기 위해 안전하고 효과적인 요법을 개발하는데 이용될 수 있다. ADI는 아르기닌 다이하이드롤라제 경로를 통해 아르기닌의 시트룰린으로의 전환을 촉매하고, 따라서 아르기닌을 제거하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 실행은, 달리 대조적으로 구체적으로 표시되지 않는 한, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학의 전통적인 방법 및 당업계 기술 내의 재조합 DNA 기법을 사용할 것이고, 이들 중 다수는 예시의 목적을 위해 이하에 기재된다. 이러한 기법은 문헌에서 완전하게 설명된다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Protein Science, Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)] 및 다른 유사한 참고문헌 참조.
본 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 바와 같은, 단수 형태는 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다.
본 명세서 전체적으로, 달리 문맥에서 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다" 또는 변형, 예컨대 "포함하다" 또는 "포함하는"은 언급된 구성요소 또는 정수 또는 구성요소들 또는 정수들의 그룹을 포함하는 것을 의미하지만, 임의의 다른 구성요소 또는 정수 또는 구성요소들 또는 정수들의 그룹의 제외를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다.
"약"은 기준 정량, 수준, 값, 수치, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 많이 다른 정량, 수준, 값, 수치, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
"통계적으로 유의한"은 결과가 우연히 생겼을 가능성이 없었던 것을 의미한다. 통계적 유의도는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 통상적으로 사용되는 유의도의 측정은 p-값을 포함하는데, 이는 귀무가설이 참이라면 관찰된 사건이 일어날 빈도 또는 확률이다. 관찰된 p-값이 유의 수준보다 더 작으면, 귀무가설은 기각된다. 간단한 사례에서, 유의 수준은 0.05 이하의 p-값에서 정의된다.
본 명세서에서 각각의 실시형태는 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 필요한 부분만 수정하여 모든 다른 실시형태에 적용된다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양 및 형질전환을 위해 표준 기법이 사용될 수 있다(예를 들어, 전기천공법, 리포펙션). 효소 반응 및 정제 기법은 제조업자의 명세서에 따라 또는 당업계에서 통상적으로 수행되는 바와 같이 또는 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같이 수행될 수 있다. 이들 및 관련된 기법 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전체적으로 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 더 구체적인 참고문헌에 기재되어 있는 바와 같이 수행될 수 있다. 달리 구체적 정의가 제공되지 않는 한, 본 명세서에 기재되어 있는 분자생물학, 분석화학, 합성 유기 화학, 및 의학적 및 약제학적 화학의 실험 절차 및 기법과 관련하여 이용되는 명명법은 잘 공지되어 있고 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이다. 표준 기법은 재조합 기법, 분자 생물학, 미생물학, 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제조, 제형 및 전달 및 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.
"환자" 또는 "대상체"는 동물, 특정 실시형태에서, 포유류 및 구체적 실시형태에서 인간을 지칭한다.
"생체에 적합한"은 일반적으로 생물학적 기능에 대해 손상을 주지 않고 알레르기 및 질환 상태를 포함하는 임의의 정도의 허용가능하지 않은 독성을 초래하지 않을 물질 또는 화합물을 지칭한다.
용어 "기준 서열"은 다른 서열과 비교되는 핵산 암호 서열 또는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다. 본 명세서에 기재된 모든 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 표 및 서열 목록에 기재되어 있는 것들 및 명칭에 의해 기재되는 것을 포함하여 기준 서열로서 포함된다.
본 명세서 전체적으로, 다음의 약어가 사용될 수 있다: PEG, 폴리에틸렌 글라이콜; ADI, 아르기닌 탈이민효소; SS, 숙신이미딜 숙시네이트; SSA, 숙신이미딜 숙신이미드; SPA, 숙신이미딜 프로피오네이트; NHS, N-하이드록시-숙신이미드; ASS1 또는 ASS, 아르기니노숙시네이트 합성효소; ASL, 아르기니노숙시네이트 분해효소.
본 발명에서, ADI를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 미생물유기체, 재조합 생물공학 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래, 클로닝, 단리, 합성 또는 제조될 수 있다. 예를 들어, 아르기닌 탈이민효소는 마이코플라스마속(Mycoplasma), 클로스트리디움속(Clostridium), 바실러스속(Bacillus), 보렐리아속(Borrelia), 엔테로코커스속(Enterococcus), 스트렙토코커스속(Streptococcus), 락토바실러스속(Lactobacillus) 및/또는 지아르디아속(Giardia)의 미생물유기체로부터 클로닝될 수 있다. 특정 실시형태에서, 아르기닌 탈이민효소는 마이코플라스마 아스리티디스, 마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라스마 호미니스, 마이코플라스마 아르기니니, 스트렙토코커스 피오게네스(Steptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아(Steptococcus pneumoniae), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 아프젤리(Borrelia afzelii), 지아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 사케, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 클로닝된다. 다른 실시형태에서, 아르기닌 탈이민효소는 표 1에 열거된 종으로부터 클로닝된다. 특히, 본 발명에서 사용되는 ADI는 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 ADI 활성을 갖는 이들의 변이체 또는 단편 또는 연장(예를 들어, 아르기닌을 시트룰린 및 암모니아로 대사할 수 있음)을 포함할 수 있다. 서열목록에 제공되는 서열의 일부는 전장 ADI 단백질 서열을 나타내지 않는다. 따라서, 특정 실시형태에서, 추가적인 아미노산 잔기는 ADI 활성을 갖는 전장 단백질을 생성하기 위해 본 명세서에 제공된 서열의 말단 중 하나에 첨가될 수 있다. 첨가될 구체적 아미노산은 공지된 ADI 서열의 정렬에 기반하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이러한 ADI 분자는 공지된 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 예시적인 "연장된" ADI(r)은, 예를 들어 서열번호 26 내지 32에서 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADI 효소는 마이코플라스마 호미니스로부터 유래된 기준점 ADI-PEG 20 분자와 비교된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "ADI-PEG 20"은 당업계에 공지된 ADI 분자를 지칭하며, 예를 들어 미국 특허 제6183738호; 미국 특허 제6635462호; 문헌[Ascierto PA, et al. (2005) Pegylated arginine deiminase treatment of patients with metastatic melanoma: results from phase I and II studies. J Clin Oncol 23(30): 7660-7668; Izzo F, et al. (2004) Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma: results from phase I/II studies. J Clin Oncol 22(10): 1815-1822; Holtsberg FW, et al. (2002), Poly(ethylene glycol) (PEG) conjugated arginine deiminase: effects of PEG formulations on its pharmacological properties. J Control Release 80(1-3): 259-271; Kelly et al., (2012) British Journal of Cancer 106, 324 - 332]에 기재되어 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 이 분자는 마이코플라스마 호미니스로부터 유래된 페길화된(PEG 20,000) ADI 효소이며, 야생형 마이코플라스마 호미니스 ADI 효소에 대해 2개의 치환(K112E; P210S)을 가진다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 아르기닌 탈이민효소는 다수의 ADI 효소로부터 선별되었고, 환자로부터의 항-ADI-PEG 20 항체와 감소된 수준의 반응성을 가진다. 항-ADI-PEG 20 항체는 ADI-PEG 20으로 처리된 대상체에서 나타날 수 있고, 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 항-ADI-PEG 20 항체에 대한 반응성은, 예를 들어 ELISA 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 유사한 분석을 이용하여 결정될 수 있다.
이와 관련하여, ADI-PEG 20은 환자 항-ADI-PEG 20 항체에 대한 교차-반응성 수준을 평가하기 위한 비교로서 사용될 수 있다. 환자 항-ADI-PEG 20 항체에 대한 ADI-PEG 20의 교차 반응성 수준보다 통계적으로 유의하게 낮은 교차-반응성 수준이 본 명세서에서 유용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같은 아르기닌 탈이민효소 효소는 항-ADI-PEG 20 항체에 대한 교차-반응성이 낮거나 또는 없다. 다른 실시형태에서, ADI-PEG 20과의 반응성에 비해 항-ADI-PEG 20 항체에 대한 반응성에서의 임의의 감소는 이러한 ADI 효소가 아르기닌 고갈 요법이 필요한 환자에 대한 치료 선택사항을 개선시킬 것이기 때문에 유리할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같은 아르기닌 탈이민효소 효소는 이러한 항체에 대한 ADI-PEG 20 반응성에 비해 환자 항-ADI-PEG 20 항체에 대해 감소된 교차-반응성을 가진다.
"ADIr"은 본 명세서에서 이러한 항체에 대한 ADI-PEG 20 반응성에 비해 항-ADI-PEG 20 항체에 대해 감소된 교차-반응성을 갖는 본 발명의 ADI 효소를 지칭하기 위해 사용된다. "ADIr" 명명법은 본 명세서에서 동정되는 분자를 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 ADI 및 ADI-PEG 20과 구별하기 위해 사용된다.
본 발명의 ADIr 효소는 효과적인 암 치료를 위해 낮은 혈액 아르기닌 수준을 감소 및 유지하기 위하여, ADI-PEG 20의 특징 또는 특성과 유사하거나 또는 더 양호한 특징 또는 특성을 가진다. 이러한 특성은 Kcat, Km, 최적 pH, 안정성, 생체내 단백질 분해 안정성, 또는 혈액 중에 이미 존재하고 있지 않은 이온 또는 보조인자에 대한 필요 없음, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재되어 있는 바와 같은 ADIr은 ADI-PEG 20과 유사한 특성보다 약 또는 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 높은 특성을 가진다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADIr은 비교될 ADI-PEG 20의 구체적 특성보다 약 또는 적어도 약 100%, 105%, 110%, 120%, 140%, 150%, 160%, 180%, 200%, 220%, 240%, 250%, 260%, 280%, 300%, 320%, 340, 350%, 360%, 400%, 420%, 450%, 460%, 500%, 520%, 550% 또는 더 높은 특성을 가진다.
따라서, 특정 실시형태에서, ADIr은 ADI-PEG 20의 Kcat의 약 또는 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 양호한 Kcat를 가진다. 특정 실시형태에서, ADIr은 ADI-PEG 20 Kcat의 약 또는 적어도 약 100%, 105%, 110%, 120%, 125%, 140%, 150%, 160%, 180%, 200%, 220%, 240%, 250%, 260%, 280%, 300%, 320%, 340, 350%, 360%, 400%, 420%, 450%, 460%, 500%, 520%, 550% 또는 더 높은 Kcat를 가진다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADIr 효소, 이를 포함하는 조성물의 Kcat의 약 0.5초-1 내지 약 15초-1이고, 추가 실시형태에서, 약 1초-1 내지 약 12초-1, 약 1초-1 내지 약 10초-1, 약 1.5초-1 내지 약 9초-1, 약 2초-1 내지 약 8초-1 또는 약 2.5초-1 내지 약 7초-1이다. 특정 실시형태에서, 조성물에서 ADIr 또는 ADIr-PEG은 약 2.5초-1 내지 약 7.5초-1의 Kcat를 가진다. 일부 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 2.5초-1, 약 3초-1, 약 3.5초-1, 약 4초-1, 약 4.5초-1, 약 5초-1, 약 5.5초-1, 약 6초-1, 약 6.5초-1, 약 7초-1, 약 7.2초-1, 약 7.5초-1, 약 8초-1, 약 10초-1, 약 15초-1, 약 20초-1, 약 25초-1, 약 30초-1, 약 35초-1, 약 40초-1, 약 45초-1, 약 50초-1, 약 55초-1, 약 60초-1, 약 65초-1, 약 70초-1, 약 75초-1, 약 80초-1, 약 85초-1, 약 90초-1, 약 95초-1 또는 약 100초-1의 Kcat를 가진다.
따라서, 특정 실시형태에서, ADIr은 ADI-PEG 20의 Km의 약 또는 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 양호한 Km을 가진다. 따라서, 특정 실시형태에서, ADIr은 ADI-PEG 20의 Km의 약 또는 적어도 약 100%, 105%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 180%, 200%, 220%, 240%, 또는 250%인 Km을 가진다. 일 실시형태에서, ADIr, 또는 이들의 페길화된 제형은 약 0.5μM 내지 약 50μM, 또는 약 1.6μM 내지 약 48μM, 또는 약 0.5μM 내지 약 15μM의 Km을 가지며, 추가 실시형태에서, 약 1μM 내지 약 12μM, 약 1μM 내지 약 10μM, 약 1.5μM 내지 약 9μM, 약 1.5μM 내지 약 8μM 또는 약 1.5μM 내지 약 7μM이다. 특정 실시형태에서, 조성물에서 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 1.5μM 내지 약 6.5μM의 Km을 가진다. 일부 실시형태에서, ADIr 또는 이의 페길화된 제형은 약 1.5μM, 약 1.6μM, 약 2μM, 약 2.5μM, 약 3μM, 약 3.5μM, 약 4μM, 약 4.5μM, 약 5μM, 약 5.5μM, 약 6μM, 약 6.5μM, 약 7μM, 약 8μM, 약 9μM, 약 10μM, 약 12μM, 약 14μM, 약 15μM, 약 16μM, 약 18μM, 약 20μM, 약 22μM, 약 24μM, 약 25μM, 약 26μM, 약 28μM, 약 30μM, 약 32μM, 약 34μM, 약 35μM, 약 36μM, 약 38μM, 약 40μM, 약 42μM, 약 44μM, 약 45μM, 약 46μM, 약 48μM 또는 약 50μM의 Km을 가진다.
특정 실시형태에서, ADIr은 인간 혈액의 생리적 pH에 가까운 pH에서 작용한다. 따라서, 일 실시형태에서, ADIr은 약 4 내지 약 10.8, 또는 약 6 내지 약 8, 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH에서 작용한다. 일 실시형태에서, ADIr은 약 pH 7.4에서 양호한 효소 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, ADIr은 장기간 저장 동안 안정성 및 인간 신체에서 치료 동안 온도 및 단백질 분해 안정성을 가진다. 추가 실시형태에서, ADIr은 혈액 중에 이미 존재하고 있지 않은 활성을 위한 이온 또는 보조인자를 필요로 하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADIr은 일반적으로 마이코플라스마 호미니스와 충분히 상이한 아미노산 서열을 가지며, 따라서 항-ADI-PEG 20 항체에 대한 항원 부위를 감소 또는 제거할 표면 잔기 변화가 있다. 일 실시형태에서, 선택된 ADIr 분자와 대상체에서 존재하는 항-ADI-PEG 20 항체 간의 교차 반응성은 없을 것이며, 마이코플라스마 호미니스 ADI에 대해 존재하는 반응의 성숙보다는 완전히 새로운 면역 반응이 대상체에서 생성될 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 마이코플라스마 호미니스 ADI에 대해 20% 내지 85% 서열 동일성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr은 마이코플라스마 호미니스 ADI에 대해 훨씬 더 낮은 서열 동일성%, 예컨대 10% 또는 15% 동일성을 가진다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr은 마이코플라스마 호미니스 ADI에 대해 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82% 또는 심지어 83% 동일성을 가지며, 또한 항-ADI-PEG 20 항체에 대해 감소된 교차-반응성을 가진다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr은 마이코플라스마 호미니스 ADI에 비해 약 25 내지 140개의 표면 잔기 변화를 가진다. 표면 잔기는 마이코플라스마 호미니스 ADI의 결정 구조로부터 동정될 수 있고, 다른 유기체로부터의 ADI에 대한 표면 잔기는 서열 상동성에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr은 마이코플라스마 호미니스 ADI에 비해 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 또는 약 140개의 표면 잔기 변화를 가질 수 있다(서열번호 1 참조).
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr은 마이코플라스마 호미니스 ADI에 비해 약 25 내지 140개의 잔기 변화를 가진다. 이러한 잔기 변화는 단지 표면 아미노산 잔기를 가질 필요가 없다. 이러한 잔기 변화(또는 첨가 또는 결실)는, 변형된 ADI가 본 명세서에 기재된 바와 같은 목적으로 하는 ADI 활성을 갖도록, 분자의 끝에 있을 수 있고 또는 ADI의 임의의 잔기에 있을 수 있다. 변화될 잔기는 마이코플라스마 호미니스 ADI의 결정구조로부터 동정될 수 있고, 다른 유기체로부터의 ADI에 대한 잔기는 서열 상동성에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr은 마이코플라스마 호미니스 ADI에 비해 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 또는 약 140개의 아미노산 잔기 변화를 가질 수 있다(서열번호 1 참조).
다수의 ADI 효소로부터, 표 1은 마이코플라스마 호미니스 ADI에 대해 서열 동일성%를 지니는 24종의 ADIr 효소를 열거한다. 문헌으로부터, 마이코플라스마 호미니스, 마이코플라스마 아르기니니, 및 마이코플라스마 아스리티디스 ADI 아미노산 서열은 밀접하게 관련되고, 이들 효소는 양호한 촉매적 특성을 가진다. 더 최근에, 이들 셋과 밀접하게 관련된 서열을 갖는 추가적인 ADI 효소가 발견되었다. 더 멀리 관련된 마이코플라스마 ADI 효소는, 그들에 관해 더 적게 공지되어 있지만, 동정되었다. 그리고 박테리아 및 다른 공급원으로부터 훨씬 더 멀리 관련된 ADI 효소가 존재한다.
특정 실시형태에서, 다수의 선택된 종으로부터 본 명세서에서 동정된 ADIr 효소는 표면 라이신 잔기(특정 실시형태에서, 30개 이상까지)를 가진다. 그러나, 특정 실시형태에서 ADIr 효소는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) ADI의 경우와 같이, 또는 심지어 라이신 잔기가 없는 경우와 같이 다소 적은 표면 라이신 잔기, 예컨대 단지 2개의 라이신 잔기를 가질 수 있다(예를 들어, 마이코박테리움 종 MCS로부터의 ADI; 젠뱅크 번호 ABG10381 참조). 따라서, 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 갖는 본 명세서에 동정된 ADIr 효소는 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58개 이상의 표면 라이신 잔기를 가진다.
용어 "폴리펩타이드", "단백질" 및 "펩타이드"는 상호호환적으로 사용되며, 임의의 특정 길이로 제한되지 않는 아미노산의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 미리스토일화, 황산화, 글라이코실화, 인산화 및 신호 서열의 첨가 또는 결실과 같은 변형을 제외하지 않는다. 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 하나 이상의 아미노산 쇄를 의미하되, 각각의 쇄는 펩타이드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산을 포함하고, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 자연적으로 생기고 구체적으로는 비재조합 세포 또는 유전자 조작된 세포 또는 재조합 세포에 의해 생성된 단백질인 본래의 단백질 서열을 갖는 펩타이드 결합에 의해 함께 비공유적으로 및/또는 공유적으로 연결되는 복수의 쇄를 포함하고, 본래 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자 또는 본래 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 아미노산에 대한 첨가 및/또는 아미노산의 치환을 갖는 분자를 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 개시내용의 ADIr 단백질, 또는 ADIr 단백질의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 아미노산에 대한 첨가 및/또는 아미노산의 치환을 갖는 서열을 특이적으로 포함한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 전형적으로 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 세포에서 달리 발견되지 않는 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합으로 구성되는 하나 이상의 재조합 DNA 분자를 포함하는 재조합 세포에 의해 생성된 "재조합" 폴리펩타이드이다.
본 명세서에서 지칭되는 용어 "단리된 단백질"은 대상 단백질이 (1) 천연에서 전형적으로 발견되는 적어도 일부의 다른 단백질이 없고, (2) 동일한 공급원으로부터의, 예를 들어, 동일종으로부터의 다른 단백질이 본질적으로 없으며, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되고, (4) 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 자연에서 결합되는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리되었고, (5) "단리된 단백질"이 자연에서 결합되는 단백질의 일부와 (공유적 또는 비공유적 상호작용에 의해) 결합되지 않고, (6) 자연에서 결합되지 않는 (공유적 또는 비공유적 상호작용에 의해) 폴리펩타이드와 작동가능하게 결합되거나, 또는 (7) 자연에서 생기지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 단리된 단백질은 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA에 의해 암호화될 수 있고, 합성 유래 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 단리된 단백질은 그의 용도(치료적, 진단적, 예방적, 연구 또는 기타)를 방해하지 않는 그의 천연 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다른 오염물질이 실질적으로 없다.
용어 "변이체"는 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에 의해 본 명세서에 구체적으로 개시된 기준 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 1 내지 32)와 상이한 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체 폴리펩타이드는 생물학적으로 활성이며, 즉, 그들은 기준 폴리펩타이드의 효소 활성 또는 결합 활성을 계속해서 소유한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 유전자 다형체로부터 및/또는 인간 조작으로부터 초래될 수 있다.
다수의 예에서, 생물학적으로 활성인 변이체는 하나 이상의 보존적 치환을 함유할 것이다. "보존적 치환"은, 펩타이드 화학의 기술분야에서 당업자가 폴리펩타이드의 2차 구조 및 소수성(hydropathic) 특성이 실질적으로 변하지 않는 것을 예상하도록 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 상기 기재한 바와 같이, 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조에서 만들어질 수 있고, 또한 목적으로 하는 특징을 지니는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 기능적 분자를 얻을 수 있다.
예를 들어, 특정 아미노산은, 예를 들어, 항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자에 대한 결합 부위와 같은 구조와 상호작용을 하는 결합 능력의 주목할 만한 상실 없이 단백질 구조 내 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 이는 해당 단백질의 생물학적 기능 활성을 정하는 단백질의 상호작용 능력 및 특성이기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환이 단백질 서열에서, 물론, 그의 근본적인 DNA 암호 서열에서 만들어질 수 있고, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 지니는 단백질을 얻을 수 있다. 따라서 다양한 변화가 개시된 조성물의 펩타이드 서열 또는 효용의 주목할 만한 상실이 없는 상기 펩타이드를 암호화하는 대응하는 DNA 서열에서 만들어질 수 있다는 것이 상정된다.
이러한 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 소수성 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 대해 상호작용적 생물 기능을 수여함에 있어 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Kyte & Doolittle, 1982]). 아미노산의 상대적 소수성 특징은 얻어진 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 받아들여지는데, 이는 결국 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 단백질의 상호작용을 정한다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 하전 특징에 기반하여 소수성 지수가 부여되었다(Kyte & Doolittle, 1982). 이들 값은: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다. 특정 아미노산은 유사한 소수성 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 또한 유사한 생물학적 활성을 지니는 단백질을 초래할 수 있고, 즉, 여전히 생물학적으로 기능적으로 동일한 단백질을 얻을 수 있는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 이러한 변화를 생성함에 있어서, 소수성 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 훨씬 더 특히 바람직하다.
또한 유사한 아미노산의 치환은 친수성에 기반하여 효과적으로 생성될 수 있다는 것이 당업계에서 이해된다. 미국 특허 제4,554,101호(구체적으로는 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)는 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성이 그의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이 단백질의 생물학적 특성과 상호관련된다는 것을 언급한다. 미국 특허 제4,554,101호에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성값을 갖는 다른 것으로 치환되고 또한 생물학적으로 동일한, 특히 면역학적으로 동일한 단백질을 얻을 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 훨씬 더 특히 바람직하다.
상기 약술한 바와 같이, 아미노산 치환은 따라서 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등의 상대적 유사성에 기반한다. 다양한 앞서 언급한 특징을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 잘 공지되어 있으며 아르기닌과 라이신; 글루타메이트와 아스파테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 아이소류신을 포함한다.
아미노산 치환은 추가로 잔기의 극성, 하전, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 특성에 기반하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며; 유사한 친수성값을 갖는 비하전 극성 헤드기를 지니는 아미노산은 류신, 아이소류신과 발린; 글라이신과 알라닌; 아스파라긴과 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 타이로신을 포함한다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 다른 그룹의 아미노산은: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his을 포함한다.
변이체는 또한, 또는 대안적으로 비보존적 변화를 함유할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 변이체 폴리펩타이드는 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2개 이하의 아미노산, 또는 심지어 1개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 본래의 서열과 상이하다. 변이체는 또한(또는 대안적으로), 예를 들어 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조, 효소 활성 및/또는 소수성 특성에 대해 최소의 영향을 갖는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해 변형될 수 있다.
일반적으로, 변이체는 기준 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 1 내지 32)에 대해 약 또는 적어도 약 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 유사성 또는 서열 동일성 또는 서열 상동성을 나타낼 것이다. 추가로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 아미노산의 첨가(예를 들어, C-말단 첨가, N-말단 첨가, 둘 다), 결실, 절단, 삽입 또는 치환에 의해 천연 또는 모 서열과 상이하지만, 모 또는 기준 폴리펩타이드 서열의 특성 또는 활성을 보유하는 서열이 상정된다.
일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩타이드는 적어도 1개만큼 그러나 50, 40, 30, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 아미노산 잔기(들)만큼 기준 서열과 상이하다. 다른 실시형태에서, 변이체 폴리펩타이드는 약 또는 적어도 0.5% 또는 1%만큼 그러나 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만의 잔기만큼 기준서열과 상이하다. (이 비교가 정렬을 필요로 한다면, 서열은 최대 유사성을 위해 정렬되어야 한다. 결실 또는 삽입 또는 미스매치로부터의 "루프" 서열은 차이를 고려한다.)
용어 "폴리펩타이드 단편"은 자연적으로 생기는 폴리펩타이드 또는 재조합으로 생기는 폴리펩타이드의 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 단편은 적어도 5 내지 약 400개 아미노산 길이의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350 또는 400개 아미노산 길이인 것으로 인식될 것이다. 특히 유용한 폴리펩타이드 단편은 본 명세서에 기재되는 ADIr의 촉매적 ADI 도메인을 포함하는 기능성 도메인을 포함한다. ADIr의 경우에, 유용한 단편은 촉매적 도메인 및 α-나선 도메인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
ADI에 컨쥬게이션을 위해 사용되는 다수의 활성화된 PEG는 라이신 잔기와 공유적으로 결합된다. 보통 라이신 잔기에 대해서보다 ADI에 대해 부착되는 다소 적은 PEG 분자가 있다. 부착 수와 분포는 둘 다 분자간에 이질적일 수 있다. 임의의 특정 라이신 잔기는 소분획의 ADI 분자에서만 변형될 것이다. 이 부위 변형 이질성 및 낮은 PEG 점유는 약물 특성규명과 항원성 부위에서 PEG 차폐(shielding)의 유효성 둘 다에 의한 문제를 초래할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 선택된 ADIr 효소는 라이신 잔기의 수를 감소시키기 위한 다른 잔기 유형으로의 라이신 대체에 의해 변형된다. 이는 더 균일하게 페길화된 단백질을 생성하고, 남아있는 라이신 잔기에서 PEG 점유를 증가시킨다. 다른 잔기로 변형되도록 선택되는 구체적 라이신 잔기는 효소 활성을 보존하기 위해 선택될 것이다. 이런 더 균일한 페길화는 혈액 중의 단백질 분해에 대해 증가된 보호 및 환자 항체로부터 항원성 부위의 증가된 차폐를 제공하는 것으로 예상된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 ADIr은 미국 특허 제6,635,462호에 기재되어 있는 바와 같이 변형될 수 있다. 특히, ADIr의 자연적으로 생기는 아미노산 잔기 중 하나 이상의 변형은 더 용이하게 재생되고 제형화되는 효소를 제공함으로써 ADIr 및 이를 포함하는 치료적 조성물의 제조를 개선시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 ADIr은 하나 이상의 라이신 잔기를 제거하도록 변형된다(예를 들어, 라이신은 다른 아미노산 또는 이의 유사체, 또는 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다). 특히, 일 실시형태에서, ADIr은 서열번호 1(마이코플라스마 호미니스 ADI)의 112, 374, 405 또는 408과 동일한 위치, 또는 이들 위치 중 하나 이상의 조합에서 라이신이 없도록 변형된다. 추가 실시형태에서, ADIr은 하나 이상의 라이신이 없도록 변형되며, 예를 들어, 그들이 존재하여야 하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 이상의 라이신 잔기는 다른 아미노산 또는 이의 유사체 또는 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 일 실시형태에서, ADIr은, 예를 들어 서열번호 1의 위치 7, 88, 137, 209 및 380과 동일한 위치에서 치환되는 5개의 라이신을 가진다. 다른 실시형태에서, ADIr은, 예를 들어 서열번호 1의 위치 7, 9, 59, 88, 115, 116, 137, 178, 209 및 380과 동일한 위치에서 치환되는 10개의 라이신을 가진다. 또 다른 실시형태에서, ADIr은, 예를 들어 서열번호 1의 위치 7, 9, 59, 66, 88, 91, 93, 115, 116, 137, 141, 178, 209, 279와 동일한 위치에서 및 위치 380에서 치환되는 15개의 라이신을 가진다. 일 실시형태에서, ADIr은, 예를 들어 서열번호 1의 위치 7, 9, 56, 59, 66, 88, 91, 93, 96, 115, 116, 137, 141, 178, 209, 254, 279, 325, 326, 380 및 406과 동일한 위치에서 치환되는 21개의 라이신을 포함한다.
본래의 ADIr은 미생물유기체에서 발견될 수 있으며, 면역원성이고 환자에서의 순환으로부터 빠르게 클리어런스된다. 이들 문제는 ADIr을 변형시킴으로써 극복될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 거대분자 중합체, 단백질, 펩타이드, 다당류 또는 다른 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 변형제에 의해 변형되는 ADIr을 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 아르기닌 탈이민효소 및 변형제는 공유 결합 또는 비공유 상호작용 중 하나에 의해 연결되어 목적으로 하는 효과를 달성하기 위한 안정한 컨쥬게이트 또는 안정한 조성물을 형성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 ADIr은 비변형 ADIr의 생물학적 활성을 보유하며, 비변형 ADIr보다 더 긴 생체내 반감기 및 더 낮은 항원성을 가진다. 특정 실시형태에서, 변형된 ADIr은 비변형 ADIr의 생물학적 활성의 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 보유한다. 일반적으로, 변형된 ADIr은 치료적 용도에 충분한 생물학적 활성을 보유한다.
일 실시형태에서, 변형제는 생체에 적합하고 혈액 중의 ADIr의 반감기를 증가시킬 수 있는 중합체 또는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 변형제는 ADIr에 화학적으로 결합되거나, 또는 적용가능하다면 융합 단백질 발현을 통해 ADIr에 연결될 수 있다.
거대분자 중합체는, 특정 실시형태에서, 그 자체의 생체 활성을 가질 수 있는 비펩타이드 거대분자 중합체를 포함할 수 있다. 적합한 중합체는 폴리엔올 화합물, 폴리에터 화합물, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아미노산, 다이비닐에터와 말레산 무수물의 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아마이드, 다당류, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 헤파린 또는 그의 단편, 폴리-알킬-에틸렌 글라이콜 및 그의 유도체, 폴리-알킬-에틸렌 글라이콜과 그의 유도체의 공중합체, 폴리(비닐 에틸 에터), a,P-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파트아마이드], 폴리카복실레이트, 폴리옥시에틸렌-옥시메틸렌, 폴리아크릴로일 모폴린, 아미노 화합물과 옥시올레핀의 공중합체, 폴리하이알루론산, 폴리옥시란, 에탄다이온산 및 말론산의 공중합체, 폴리(1,3-다이옥솔란), 에틸렌과 말레산 하이드라자이드 공중합체, 폴리시알산, 사이클로덱스트린 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 중합체는 폴리에틸렌 글라이콜이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 폴리엔올 화합물은 폴리에틸렌 글라이콜(모노메톡시 폴리에틸렌 글라이콜, 모노하이드록실 폴리에틸렌 글라이콜을 포함함), 폴리비닐 알코올, 폴리알릴 알코올, 폴리부테놀 등, 및 지질과 같은 이들의 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
폴리에터 화합물은 폴리 알킬렌 글라이콜(HO((CH2)xO)nH), 폴리프로필렌 글라이콜, 폴리옥시에틸렌 (HO((CH2)2O)nH), 폴리비닐 알코올((CH2CHOH)n)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
폴리아미노산은 1가지 유형의 아미노산 또는 2가지 이상의 유형의 아미노산의 공중합체, 예를 들어, 폴리알라닌 또는 폴리라이신, 또는 이들의 블록 공중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다당류는 글루코산 및 그의 유도체, 예를 들어 덱스트란 설페이트, 셀룰로스 및 그의 유도체(메틸 셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함), 전분 및 그의 유도체, 폴리수크로스 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체적 실시형태에서, ADIr은 단백질 또는 펩타이드와 결합함으로써 변형되되, 하나 이상의 단백질 또는 펩타이드는 ADIr에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다. 단백질은 자연적으로 존재하는 인간 혈청 단백질 또는 그들의 단편, 예컨대 티록신-결합 단백질, 트랜스사이레틴, a1-산 당단백질, 트랜스페린, 피브리노겐, 면역글로불린, Ig Fc 영역, 알부민 및, 이들의 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 자연적으로 존재하는 단백질 또는 그들의 단편일 수 있다. "단편"은 전체 단백질보다 작지만 단백질의 요망되는 기능을 보유하는 단백질의 임의의 부분을 의미한다. 본 명세서에 기재되는 바와 같은 ADIr은 공유 결합을 통해 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 직접적 연결은 ADIr의 하나의 아미노산이 펩타이드 결합 또는 이황화 브릿지를 통해 변형 단백질의 하나의 아미노산에 직접적으로 연결되는 것을 의미한다. 간접적 연결은 ADIr과 변형 단백질 간의 그 사이에 본래 존재하는 화학적 기 또는 생물학적 또는 화학적 수단을 통해 첨가된 화학적 기를 통한 결합, 또는 상기 언급한 결합의 조합을 지칭한다.
일 특정 실시형태에서, ADIr은 PEG와의 공유적 부착에 의해 변형된다. (링커와 함께 또는 링커 없이) PEG로 공유적으로 변형된 ADIr은 본 명세서에서 "ADIr-PEG"로서 지칭될 수 있다. 미변형 ADIr과 비교할 때, ADIr-PEG는 대부분의 그의 효소적 활성을 보유하고, 면역원성 또는 항원성이 훨씬 더 적으며, 크게 연장된 순환 반감기를 가지고, 종양 치료에서 훨씬 더 효능이 있다.
"폴리에틸렌 글라이콜" 또는 "PEG"는 화학식 H(OCH2CH2)nOH(n은 적어도 4임)에 의해 표시되는 분지쇄 또는 직쇄로 에틸렌 옥사이드와 물의 축합 중합체의 혼합물을 지칭한다. "폴리에틸렌 글라이콜" 또는 "PEG"는 이의 대략의 중량 평균 분자량을 나타내는데 충분한 수치와 조합하여 사용된다. 예를 들어, PEG5,000은 약 5,000의 총 중량 평균 분자량을 갖는 PEG를 지칭하고; PEG12,000은 약 12,000의 총 중량 평균 분자량을 갖는 PEG를 지칭하며; PEG20,000는 약 20,000의 총 중량 평균 분자량을 갖는 PEG를 지칭한다.
본 발명의 일 실시형태에서, PEG는 약 1,000 내지 약 50,000; 일 실시형태에서 약 3,000 내지 약 40,000, 및 다른 실시형태에서 약 5,000 내지 약 30,000; 특정 실시형태에서 약 8,000 내지 약 30,000; 다른 실시형태에서, 약 11,000 내지 약 30,000; 추가적인 실시형태에서, 약 12,000 내지 약 28,000; 또 다른 실시형태에서, 약 16,000 내지 약 24,000; 및 다른 실시형태에서, 약 18,000 내지 약 22,000; 다른 실시형태에서, 19,000 내지 약 21,000의 총 중량 평균 분자량을 가지며, 일 실시형태에서, PEG는 약 20,000의 총 중량 평균 분자량을 가진다. 일반적으로, 30,000 이상의 분자량을 지니는 PEG는 용해가 어려우며, 제형화된 생성물의 수율은 감소될 수 있다. PEG는 분지쇄 또는 직쇄일 수 있다. 일반적으로, PEG 분자량의 증가는 ADIr의 면역원성을 감소시킨다. 본 실시형태에 기재된 분자량을 갖는 PEG는 ADIr, 및 선택적으로 생체에 적합한 링커와 함께 사용되어, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 예컨대 재발된 급성 골수성 백혈병, 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암, 신경교종, 교모세포종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 신장암, 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 자궁경부암, 고환암, 위암 및 식도암을 포함하는 암을 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, PEG는 약 1,000 내지 약 50,000; 특정 실시형태에서, 약 3,000 내지 약 30,000; 다른 실시형태에서, 약 3,000 내지 약 20,000; 일 실시형태에서, 약 4,000 내지 약 12,000; 또 다른 실시형태에서, 약 4,000 내지 약 10,000; 추가 실시형태에서, 약 4,000 내지 약 8,000; 또한 추가 실시형태에서, 약 4,000 내지 약 6,000; 다른 실시형태에서 약 5,000의 총 중량 평균 분자량을 가진다. PEG는 분지쇄 또는 직쇄일 수 있고, 특정 실시형태에서 직쇄이다. 본 실시형태에 기재된 분자량을 갖는 PEG는 ADIr, 및 선택적으로 생체에 적합한 링커와 함께 사용되어 이식편대숙주병(graft versus host disease: GVHD) 또는 암을 치료할 수 있다.
ADIr-PEG는 본 명세서에 기재된 예시적인 변형 ADIr이지만, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, ADIr은 목적으로 하는 효과, 특히 항원성 감소 및 혈청 반감기 증가를 위해 다른 중합체 또는 적합한 분자를 이용하여 변형될 수 있다.
ADIr은, 바람직한 실시형태가 링커를 이용함에도 불구하고 링커와 함께 또는 링커 없이 PEG와 같은 변형제에 공유적으로 결합될 수 있다.
변형제, 예를 들어 PEG에 ADIr를 공유적으로 부착시키기 위해 사용되는 링커는 임의의 생체에 적합한 링커일 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, "생체에 적합한"은 화합물 또는 기가 비독성이고, 손상, 질병, 질환 또는 사망을 야기하는 일 없이 시험관내 또는 생체내에서 이용될 수 있다는 것을 나타낸다. 변형제, 예컨대 PEG는, 예를 들어 에터 결합, 티올 결합 또는 아마이드 결합을 통해 링커에 결합될 수 있다. 링커기는, 예를 들어, 숙시닐기, 아마이드기, 이미드기, 카바메이트기, 에스터기, 에폭시기, 카복실기, 하이드록실기, 탄수화물, 타이로신기, 시스테인기, 히스티딘기, 메틸렌기, 및 이들의 조합을 포함한다. 일 실시형태에서, 생체에 적합한 링커의 공급원은 숙신이미딜 숙시네이트(SS)이다. 링커의 다른 적합한 공급원은 옥시카보닐이미다졸기(예를 들어, 카보닐이미다졸(CDI)을 포함함), 나이트로 페닐기(예를 들어, 나이트로페닐 카보네이트(NCP) 또는 트라이클로로페닐 카보네이트(TCP)를 포함), 트리실레이트기, 알데하이드기, 아이소사이아네이트기, 비닐설폰기 또는 1차 아민을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 링커는 SS, SPA, SCM 또는 NHS로부터 유래되고; 특정 실시형태에서, SS, SPA 또는 NHS가 사용되며, 다른 실시형태에서, SS 또는 SPA가 사용된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 잠재적 링커는 메톡시-PEG 숙신이미딜 숙시네이트(SS), 메톡시-PEG 숙신이미딜 글루타레이트(SG), 메톡시-PEG 숙신이미딜 카보네이트(SC), 메톡시-PEG 숙신이미딜 카복시메틸 에스터(SCM), 메톡시-PEG2 N-하이드록시 숙신이미드(NHS), 메톡시-PEG 숙신이미딜 뷰타노에이트(SBA), 메톡시-PEG 숙신이미딜 프로피오네이트(SPA), 메톡시-PEG 숙신이미딜 글루타르아마이드, 및 메톡시-PEG 숙신이미딜 숙신아마이드로부터 형성될 수 있다.
대안적으로, ADIr은 아미노기, 설프하이드릴기, 하이드록실기 또는 카복실기를 통해 PEG와 같은 변형제에 직접적으로(즉, 링커 없이) 결합될 수 있다.
ADIr은, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 문헌[Park et al, Anticancer Res., 1:373-376 (1981); 및 Zaplipsky and Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, ed., Plenum Press, NY, Chapter 21 (1992)]에 기재되어 있는 바와 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생체에 적합한 링커를 통해 PEG에 공유적으로 결합될 수 있다.
ADIr에 대한 PEG의 부착은 ADIr의 순환 반감기를 증가시킨다. 일반적으로, PEG는 ADIr의 1차 아민에 부착된다. ADIr 상에서 PEG 또는 다른 변형제의 부착 부위의 선택은 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 단백질의 활성 도메인 내에서 각각의 부위의 역할에 의해 결정된다. PEG는 효소 활성을 실질적으로 상실하는 일 없이 ADIr의 1차 아민에 부착될 수 있다. 예를 들어, ADIr에 존재하는 라이신 잔기는, 본 명세서에 기재되는 바와 같은 ADIr이 생체에 적합한 링커, 예컨대 SS, SPA, SCM, SSA 및/또는 NHS를 통해 PEG에 부착되는 모든 가능한 지점이다. PEG는 또한 본 개시내용의 관점에서 당업자에게 명백한 바와 같이 ADIr의 다른 부위에 부착될 수 있다.
1 내지 약 30개의 PEG 분자는 ADIr에 공유적으로 결합될 수 있다. 특정 실시형태에서, ADIr은 하나의 PEG 분자를 이용하여 변형된다. 다른 실시형태에서, ADIr은 1개 이상의 PEG 분자를 이용하여 변형된다. 일 실시형태에서, ADIr은 약 1 내지 약 10, 또는 약 7 내지 약 15개 PEG 분자, 및 일 실시형태에서 약 2 내지 약 8 또는 약 9 내지 약 12개 PEG 분자를 이용하여 변형된다. 다른 실시형태에서, ADIr은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 PEG 분자를 이용하여 변형된다. 일 구체적 실시형태에서, ADIr은 ADIr 당 4.5 내지 5.5개의 PEG 분자를 이용하여 변형된다. 다른 실시형태에서, ADIr은 5 ± 1.5 PEG 분자를 이용하여 변형된다.
다른 실시형태에서, ADIr에서 1차 아미노기의 약 15% 내지 약 70%는 PEG를 이용하여, 일 실시형태에서 약 20% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 60%, 또는 특정 실시형태에서 약 30% 내지 약 55%, 또는 45% 내지 약 50% 변형되고, 다른 실시형태에서, 아르기닌 탈이민효소 내 1차 아미노기의 약 50%는 PEG를 이용하여 변형된다. PEG가 ADIr의 말단에 공유적으로 결합될 때, 이용되는 단지 1개의 PEG 분자를 갖는 것이 바람직할 수 있다. ADIr 상에서 PEG 단위 수의 증가는 효소의 순환 반감기를 증가시킨다. 그러나, ADIr 상에서 PEG 수의 증가는 효소의 특이적 활성을 감소시킨다. 따라서, 본 개시내용의 관점에서 당업자에게 명백할 바와 같이 둘 사이에 달성될 균형이 필요하다.
본 발명에서, 생체에 적합한 링커의 통상적인 특징은 그들이 숙신이미드기를 통해 아르기닌 탈이민효소의 1차 아민에 부착된다는 점이다. 일단 ADIr과 결합되면, SS-PEG는 PEG 다음에 에스터 결합을 가지는데, 이는 혈청 에스터라제에 민감한 이런 부위를 제공할 수 있고, 신체 내 ADIr로부터 PEG를 방출시킬 수 있다. SPA-PEG 및 PEG2-NHS는 에스터 결합을 갖지 않으며, 따라서 그들은 혈청 에스터라제에 민감하지 않다.
특정 실시형태에서, 생체에 적합한 링커는 본 발명에서 사용된다. 단백질에 부착되는 PEG는 SS-PEG, SPA-PEG 및 SC-PEG로서 직쇄일 수 있거나, 또는 PEG의 분지쇄는 PEG2-NHS로서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 효소의 촉매적 영역에 위치되거나 또는 인접한 ADIr과 결합된 페길화 부위는 변형된다. 본 발명의 목적을 위해, 어구 "페길화 부위"는 폴리에틸렌 글라이콜에 의해 공유적으로 변형될 수 있는 ADI 또는 ADIr의 임의의 부위 또는 위치로서 정의될 수 있다. "페길화 부위"는, 부위의 페길화가 효소의 촉매적 활성에서 유의한 감소를 초래하는 경우 효소의 촉매적 영역에서 또는 인접하여 위치되는 것으로 고려될 수 있다. 이러한 부위의 페길화는 전통적으로 효소의 불활성화를 초래하였다. 예를 들어, 마이코플라스마 호미니스로부터의 ADI는 효소의 촉매적 영역에서 또는 인접하는 것으로 고려될 수 있는 112 위치에서 라이신을 가진다. 112 위치에서 이 라이신에 대한 PEG의 부착은 효소를 불활성화시킬 수 있다. 추가로, 마이코플라스마 호미니스로부터의 ADI는 효소의 촉매적 영역에서 또는 인접한 것으로 고려될 수 있는 397 위치에서 시스테인을 가진다. 397 위치에서 시스테인으로의 아미노산 치환은 효소를 불활성화시킬 수 있다. 특히, 397 위치에서 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 세린, 라이신 또는 타이로신의 시스테인으로의 치환은 모든 검출가능한 효소 활성의 상실을 초래할 수 있다. 마이코플라스마 호미니스로부터의 ADI는 또한 이 보존된 시스테인 근처에 위치된 3개의 라이신, 특히 Lys374, Lys405 및 Lys408을 가진다. Lys374, Lys405, Lys408 또는 이들의 조합에 대한 PEG의 부착은 효소를 불활성화시킬 수 있다.
다른 유기체로부터 유래된 ADIr은 또한 마이코플라스마 호미니스로부터의 ADI의 112 위치에 대응하는 페길화 부위를 가질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 일부 유기체로부터의 ADI는 마이코플라스마 호미니스로부터의 ADI의 112 위치와 동일한 일반적 위치에 대응하는 라이신을 가질 수 있다. 이러한 유기체로부터의 ADI에서 라이신의 위치는 당업자에게 공지되어 있고, 미국 특허 제6,635,462호에 기재되어 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 ADIr의 폴리펩타이드 쇄에서 특정 아미노산 치환을 제공한다. 이들 아미노산 치환은 변형제에 의해 변형될 때, 예를 들어 페길화 시 활성을 덜 상실하는 변형된 ADIr을 제공한다. 효소의 촉매적 영역에서 또는 인접하여 페길화 부위 또는 다른 공지된 변형 부위를 제거함으로써, 최적의 변형, 예를 들어 페길화는 활성을 상실하는 일 없이 달성될 수 있다.
이는 본 발명의 다른 실시형태가 아르기닌 탈이민효소의 특정 구조적 특징이 재조합 기법을 통해 생성될 때 적절하고 빠른 복원(renaturation)을 방지 또는 방해할 수 있다는 것을 이해하는 것에 기반하여 이해되어야 한다. 특히, 이들 구조적 특징은 효소가 재조합 생성 동안 활성 형태를 추정하는 것을 방해 또는 방지한다. 본 발명의 목적을 위해, 어구 "활성 입체구조"는 비변형 또는 변형 아르기닌 탈이민효소에 의한 효소 활성을 감안하는 3차원 구조로서 정의될 수 있다. 활성 입체구조는, 특히, 아르기닌의 시트룰린으로의 전환을 촉매하는데 필요할 수 있다. 어구 "구조적 특징"은 특정 아미노산 또는 아미노산의 조합으로부터 초래되는 폴리펩타이드쇄의 임의의 특성, 품질 또는 특성으로서 정의될 수 있다. 예를 들어, 아르기닌 탈이민효소는 정상 펩타이드쇄에서 만곡부 또는 킹크(kink)를 야기하는 아미노산을 야기하고 따라서 효소의 복원 동안 효소가 활성 입체구조를 추정하는 것을 방해하는 아미노산을 함유할 수 있다. 특히, 마이코플라스마 호미니스로부터의 아르기닌 탈이민효소는 펩타이드 쇄 내의 만곡부 또는 킹크를 야기할 수 있는 210 위치에서 프롤린을 갖는데, 이는 재조합 생성 동안 효소가 재생하는 것을 더 어렵게 만든다. 다른 유기체로부터 유래된 아르기닌 탈이민효소는 또한 마이코플라스마 호미니스의 아르기닌 탈이민효소의 210 위치에 대응하는 부위를 가질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 따라서 또한 야생형 아르기닌 탈이민효소의 폴리펩타이드 쇄 내 특정 아미노산 치환을 제공한다. 이러한 아미노산 치환은 아르기닌 탈이민효소의 펩타이드 쇄에서의 문제가 있는 구조적 특징을 제거할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 변형된 아르기닌 탈이민효소의 개선된 복원을 제공한다. 이들 아미노산 치환은 감소된 양의 완충제를 사용하여 변형된 아르기닌 탈이민효소의 빠른 복원을 가능하게 한다. 이들 아미노산 치환은 또한 증가된 수율의 복원된 변형된 아르기닌 탈이민효소를 제공할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 변형된 아르기닌 탈이민효소는 P210 또는 동등한 잔기에서 아미노산 치환을 가진다. 상기 언급한 바와 같이, 마이코플라스마 호미니스로부터 유래된 아르기닌 탈이민효소는 210 위치에서 위치된 아미노산 프롤린을 가진다. 본 발명을 제한하려는 것은 아니지만, 위치 210에서 아미노산 프롤린의 존재는 복원되는(즉, 재폴딩) 아르기닌 탈이민효소의 어려움을 증가시키는 정상 폴리펩타이드쇄에서의 만곡부 또는 킹크를 초래하는 것으로 현재 믿어진다. 위치 210에서 프롤린으로의 치환은 감소된 양의 완충제를 사용하여 변형된 아르기닌 탈이민효소의 빠른 복원을 가능하게 한다. 위치 210에서 프롤린으로의 치환은 또한 증가된 수율의 복원된 변형된 아르기닌 탈이민효소를 제공할 수 있다. 일 실시형태에서, 위치 210에서 프롤린은 세린으로 치환된다. 본 발명의 이 양태에 따르면, 위치 210에서 다른 치환이 만들어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 다른 치환의 예는 Pro210의 Thr210으로, Pro210의 Arg210으로, Pro210의 Asn210으로, Pro210의 Gln210으로 또는 Pro210의 Met210으로를 포함한다. 야생형 아르기닌 탈이민효소의 위치 210의 아미노산과 결합된 해당 구조적 특징을 제거함으로써, 효소의 적절한 재폴딩이 달성될 수 있다.
본 발명의 방법은 시험관내 또는 생체내 적용 중 하나를 수반할 수 있다. 세포 배양 적용을 포함하는 시험관내 적용의 경우에, 본 명세서에 기재된 화합물은 배양물 중의 세포에 첨가될 수 있고, 이어서 인큐베이션될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 당업계에 잘 공지된 항체 생성 기법을 사용하여 단클론성 및/또는 다클론성 항체의 생성을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 단클론성 및/또는 다클론성 항체는 당업자에게 명백한 바와 같이 매우 다양한 진단적 적용분야에서 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물 투여의 생체내 수단은 의도되는 적용에 따라서 다를 것이다. 순수한 형태로 또는 적절한 약제학적 조성물로 본 명세서에 기재되는 ADIr 조성물의 투여는 유사한 효용을 제공하기 위한 작용제의 임의의 허용되는 투여 방식을 통해 수행될 수 있다. 약제학적 조성물은 ADIr, 예를 들어, ADIr-PEG, ADIr-PEG 20을 적절한 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합함으로써 제조될 수 있고, 고체, 반고체, 액체 또는 가스 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 현탁액, 주사, 흡입, 겔, 미소구체 및 에어로졸로 제형화될 수 있다. 추가로, 다른 약제학적 활성 성분(본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있는 바와 같은 다른 항암제를 포함) 및/또는 적합한 부형제, 예컨대 염, 완충제 및 안정제는, 필요한 것은 아니지만, 조성물 내에 존재할 수 있다. 투여는 경구, 비경구, 비강, 정맥내, 피내, 피하 또는 국소를 포함하는 다양한 상이한 경로에 의해 달성될 수 있다. 투여 방식은 치료 또는 예방될 병태의 특성에 의존한다. 따라서, ADIr-PEG, 예를 들어, ADIr-PEG 20은 경구로, 비강내, 복강내, 비강내, 정맥내, 림프절내, 종양내, 근육내, 세포 사이, 동맥내, 피하, 안구내, 활액내, 상피내 및 경피로 투여될 수 있다. 투여 후에 암의 진행 및/또는 전이를 감소, 저해, 예방 또는 지연시키는 양이 유효한 것으로 고려된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서의 ADIr 조성물은 통계적으로 유의한 양만큼 환자의 중앙값 생존 시간을 증가시킨다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADIr 치료는 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 15주, 20주, 25주, 30주, 40주 이상만큼 환자의 중앙값 생존시간을 증가시킨다. 특정 실시형태에서, ADIr 치료는 1년, 2년, 3년 이상만큼 환자의 중앙값 생존 시간을 증가시킨다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADIr 치료는 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 이상만큼 무진행 생존을 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ADIr 치료는 1년, 2년, 3년 이상만큼 무진행 생존을 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 투여되는 양은 생존 종양의 양에서의 통계적으로 유의한 감소, 예를 들어, 종양 덩어리의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 이상의 감소에 의해, 또는 변용된(예를 들어, 통계학적 유의도가 감소된) 스캔 치수에 의해 나타나는 바와 같이, 종양 퇴행을 초래하는데 충분하다. 특정 실시형태에서, 투여되는 양은 안정한 질환을 초래하는데 충분하다. 다른 실시형태에서, 투여되는 양은 당업자에게 공지된 특정 질환 적응증의 증상에서의 임상적으로 적절한 감소를 초래하는데 충분하다.
특정 실시형태에서, 투여되는 양은 NO 합성을 저해하고, 신생혈관 생성을 저해하는데 충분하고 하거나 종양 세포의 세포자멸사 또는 이들의 임의의 조합을 유도하는데 충분하다. NO 합성, 신생혈관 생성 및 세포자멸사는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다, 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Immunology or Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009 및 이에 대한 개정판); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995]; 및 다른 유사한 참고문헌 참조. 일 특정 실시형태에서, 투여되는 양은 NO 합성을 저해하고, 흑색종 및 상보체의 성장을 저해하며, 시스플라틴과 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 화학치료제에 첨가되거나 또는 상승작용을 한다. 따라서, 본 개시내용의 일 실시형태는 시스플라틴과 조합하여 ADIr-PEG 20을 투여함으로써 흑색종을 치료하는 방법을 제공하되, 치료는 내인성 일산화질소(NO)를 고갈시킨다.
정확한 투약량 및 치료의 지속기간은 치료 중인 질환의 작용이며, 공지된 시험 프로토콜을 이용하여 또는 당업계에 공지된 모델 시스템에서 조성물을 시험하고 그로부터 추론함으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 통제 임상 시험이 또한 수행될 수 있다. 투약량은 또한 완화될 질환의 중증도에 따라 다를 수 있다. 약제학적 조성물은 일반적으로 제형화되고, 투여되는 치료적으로 유용한 효과를 발휘하는 한편 원치않는 부작용을 최소화한다. 조성물은 1회 투여될 수 있거나, 또는 시간 간격을 두고 투여될 다수의 더 적은 용량으로 분할될 수 있다. 임의의 특정 대상체에 대해, 구체적 투약 요법은 개개 필요에 따라 시간에 따라서 조절될 수 있다.
ADIr 조성물은 단독으로 또는 다른 공지된 암치료, 예컨대 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광역동 요법(photodynamic therapy) 등과 조합하여 투여될 수 있다. 조성물은 또한 항생제와 조합하여 투여될 수 있다.
ADIr 조성물은 단독으로 또는 ADI-PEG 20 요법과 조합하여 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재되는 바와 같은 ADIr은 ADI-PEG 20으로 치료된 적이 있는 환자에서 및 항-ADI-PEG 20 항체가 발생한 적이 있는 환자에서 사용된다. 이러한 환자는 효소가 항체에 의해 중화되기 때문에 더 이상 ADI-PEG 20 치료로부터 유익을 얻지 못한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명은 ADI-PEG 20을 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계, 및 일정 시간 후에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 암의 증상을 치료, 개선시키거나 또는 암의 진행을 저해하는 단계를 포함하는, 암의 증상을 치료, 개선시키거나 또는 암의 진행을 저해하는 방법을 제공한다.
상기 방법의 일 실시형태에서, 일정 시간은 환자에서 사전 결정된 수준의 항-ADI-PEG 20 항체를 검출함으로써 결정되되, ADIr을 포함하는 조성물은 사전 결정된 수준의 상기 항-ADI-PEG 20 항체 다음에 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ADI-PEG 20 및 ADIr로 치료될 환자에서 항-ADI-PEG 20 항체의 역치 수준(들) 또는 사전 결정된 수준은 확립될 수 있다. 항-ADI-PEG 20 항체의 사전결정된 컷 오프로서도 때때로 지칭되는, "사전결정된 역치 수준"(또한 "사전 결정된 수준" 또는 "사전결정된 컷-오프 값"으로서 지칭됨)은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 리시버 오퍼레이터 특징적 곡선(Receiver Operator Characteristic curve) 또는 "ROC" 곡선을 사용하여 확립될 수 있다. 일 실시형태에서, 심지어 매우 낮은 수준의 항-ADI-PEG 20 항체는 ADI-PEG 20으로부터 본 발명의 ADIr-PEG로 치료를 전환하는 것을 보장하기에 충분한 것으로 여겨진다. 특정 실시형태에서, ADI-PEG 20 치료를 종결시키고 본 발명의 ADIr-PEG로 치료를 시작할 때 결정될 적절한 수준의 항-ADI-PEG 20은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 일정 시간은 환자에서 ADI 활성을 검출하거나 또는 달리 관찰함으로써 결정되되, 조성물은 ADI 활성의 사전 결정된 수준의 검출 또는 관찰 후에 투여된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 환자에서 감소된 수준의 ADI 활성을 검출 또는 관찰한 후에 투여된다. ADI 활성은, 예를 들어 ADI 활성의 적어도 하나의 지표에 대한 생물학적 샘플을 분석함으로써 직접적으로, 또는 ADI-PEG 20 치료의 목적으로 하는 또는 의도된 효과를 관찰함으로써 간접적으로 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, ADI-PEG 20 치료를 종결하고 본 발명의 ADIr-PEG로 치료를 시작할 때 결정될 ADI 활성의 적절한 수준은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다.
이들 및 관련된 약제학적 조성물을 투여하는 전형적인 경로는 따라서 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질 및 비경구를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기법을 포함한다.
특정 본 발명의 실시형태에 따른 약제학적 조성물은 그 안에 함유된 활성 성분이 환자에게 조성물의 투여 시 생체이용가능하게 되도록 제형화된다. 대상체 또는 환자에게 투여될 조성물은, 예를 들어, 정제가 단일 투약량 단위일 수 있는 경우, 하나 이상의 투약량 단위 형태를 취할 수 있고, 에어로졸 형태로 본 명세서에 기재된 ADIr 조성물의 용기는 복수의 투약량 단위를 보유할 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 명확할 것이다; 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)] 참조. 투여될 조성물은, 아무튼, 본 명세서의 교시에 따라 관심 대상의 질환 또는 병태의 치료를 위해 치료적 유효량의 본 개시내용의 ADIr-PEG, 예컨대 ADIr-PEG 20을 함유할 것이다. 특정 실시형태에서, 약제학적 또는 치료적 조성물은 멸균 및/또는 무발열원이다.
약제학적 조성물은 고체 또는 액체의 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 담체(들)는 미립자이고, 따라서 조성물은, 예를 들어, 정제 또는 분말 형태이다. 담체(들)는 액체일 수 있으며, 조성물은, 예를 들어, 아노랄 오일, 주사용 액체 또는, 예를 들어 흡입 투여에서 유용한 에어로졸이다. 경구 투여용으로 의도될 때, 반고체, 반액체, 현탁액 및 겔 형태가 고체 또는 액체로서 본 명세서에서 고려되는 형태 내에 포함되는 경우, 약제학적 조성물은 일반적으로 고체 또는 액체 형태 중 하나이다.
경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 약제학적 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 알약, 캡슐, 츄잉검, 웨이퍼 등으로 제형화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 비활성 희석제 또는 식용 담체를 함유할 것이다. 추가로, 다음 중 하나 이상이 존재할 수 있다: 결합제, 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 트래거캔스검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분, 락토스 또는 덱스트린, 붕해제, 예컨대 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔, 옥수수 전분 등; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로텍스; 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대, 수크로스 또는 사카린; 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지향; 및 착색제. 약제학적 조성물이 캡슐 형태, 예를 들어, 젤라틴 캡슐일 때, 상기 유형의 물질에 추가로, 폴리에틸렌 글라이콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 액체, 예를 들어 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀전 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 2가지 예로서 경구투여용 또는 주사에 의한 전달용일 수 있다. 경구 투여용으로 의도될 때, 바람직한 조성물은 본 화합물에 추가로 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 향미 향상제 중 하나 이상을 함유한다. 주사에 의해 투여될 것으로 의도되는 조성물에서, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정제 및 등장제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
액체 약제학적 조성물은 그들이 용액이든, 현택액이든 또는 다른 유사 형태이든, 다음의 보조제 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 특정 실시형태에서, 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예컨대 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 다이글라이세라이드, 폴리에틸렌 글라이콜, 글라이세린, 프로필렌 글라이콜 또는 다른 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성의 조절을 위한 작용제. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 다회 용량 바이알에 동봉될 수 있다. 생리 식염수가 바람직한 보조제이다. 주사가능한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균이다.
비경구 또는 경구 투여용으로 의도되는 액체 약제학적 조성물은, 적합한 투약량이 얻어지도록 ADIr-PEG 20과 같은 본 명세서에 개시된 바와 같은 ADIr의 양을 함유하여야 한다. 전형적으로, 이 양은 조성물 중에서 적어도 0.01%의 ADIr이다. 경구 투여용으로 의도될 때, 이 양은 조성물 중량의 0.1 내지 약 70%가 되도록 변할 수 있다. 특정 경구 약제학적 조성물은 ADIr-PEG의 약 4% 내지 약 75%를 함유한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 및 제제는 비경구 투약 단위가 희석 전 ADIr-PEG의 0.01 내지 10중량%를 함유하도록 제조된다.
약제학적 조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있으며, 이 경우에 담체는 용액, 에멀전, 연고 또는 겔 베이스를 적절하게 포함할 수 있다. 베이스는, 예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 페트롤라툼, 라놀린, 폴리에틸렌 글라이콜, 밀납, 광유, 희석제, 예컨대 물 및 알코올, 및 유화제 및 안정제. 증점제는 국소 투여용으로 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있다. 경피 투여용으로 의도된다면, 조성물은 경피 패치 또는 이온도입법 장치를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들어 직장에서 용융되고 약물을 방출할 좌약의 형태로 직장 투여용으로 의도될 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적합한 비자극 부형제로서 유성 베이스를 함유할 수 있다. 이러한 베이스는 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글라이콜을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
약제학적 조성물은 고체 또는 액체 투약 단위의 물리적 형태를 변형시키는, 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분 주위의 코팅 껍질을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 껍질을 형성하는 물질은 전형적으로 비활성이며, 예를 들어, 당, 셸락 및 다른 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 젤라틴 캡슐에서 감싸질 수 있다. 고체 또는 액체 형태로 약제학적 조성물은 ADIr-PEG에 결합하는 작용제를 포함할 수 있고, 이에 의해 화합물의 전달을 보조한다. 이 능력에서 작용할 수 있는 적합한 작용제는 단클론성 또는 다클론성 항체, 하나 이상의 단백질 또는 리포좀을 포함한다. 약제학적 조성물은 본질적으로 에어로졸로서 투여될 수 있는 투약 단위로 이루어질 수 있다. 용어 에어로졸은 콜로이드 특성의 시스템으로부터 압축 패키지로 이루어진 시스템까지의 범위에 있는 다양한 시스템을 정의하기 위해 사용된다. 전달은 액화 또는 압축 가스에 의하거나 또는 활성 성분을 제공하는 적합한 펌프에 의할 수 있다. 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위해 단일상, 2상, 또는 3상 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸의 전달은 키트를 함께 형성할 수 있는 필요한 용기, 활성제, 밸브, 하위 밸브를 포함한다. 과도한 실험 없이 당업자는 바람직한 에어로졸을 결정할 수 있다.
약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 잘 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의해 투여될 것으로 의도되는 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 ADIr-PEG 및 선택적으로 하나 이상의 염, 완충제 및/또는 안정제를 포함하는 조성물을 용액을 형성하기 위해 멸균, 증류수와 조합함으로써 제조될 수 있다. 계면활성제는 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 용이하게 하기 위해 첨가될 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에서 ADIr-PEG의 용해 또는 균질한 현탁액을 용이하게 하기 위해 ADIr-PEG 조성물과 비공유적으로 상호작용하는 화합물이다.
조성물은 사용되는 구체적 화합물(예를 들어, ADIr-PEG)의 활성; 화합물의 대사 안정성 및 작용 길이; 환자의 연령, 체중, 일반적 건강상태, 성별 및 식이요법; 투여 방식 및 시간; 배출 속도; 약물 조합; 특정 장애 또는 병태의 중증도; 및 요법을 겪고 있는 대상체를 포함하는 다양한 인자에 따라서 다를 수 있는 치료적 유효량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물 중 하나의 치료적 유효량은 종양 성장을 저해하는데 효과적인 양이다. 일반적으로, 치료는 환경 하에서 최적의 효과가 달성될 때까지 적은 증분으로 증가될 수 있는 적은 투약량으로 개시된다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 치료적 투약량은 1주 2회 내지 약 2주 1회로 약 1 내지 약 200㎎/㎏일 수 있다. 예를 들어, 투약량은 2㎖ 정맥내 주사로서 1주 1회로 약 1㎎/㎏ 내지 3일마다 1회로 약 20㎎/㎏일 수 있다. 추가 실시형태에서, 용량은 3일마다 약 1회, 1주 약 1회, 1주 약 2회 또는 2주마다 약 1회로 투여되는 약 50IU/㎡ 내지 약 700IU/㎡일 수 있다. 특정 실시형태에서, 용량은 3일마다 약 1회, 1주 약 1회, 1주 약 2회 또는 2주마다 약 1회로 투여되는, 약 50IU/㎡, 60IU/㎡, 70IU/㎡, 80IU/㎡, 90IU/㎡, 100IU/㎡, 110IU/㎡, 120IU/㎡, 130IU/㎡, 140IU/㎡, 150IU/㎡, 160IU/㎡, 170IU/㎡, 180IU/㎡, 190IU/㎡, 200IU/㎡, 210IU/㎡, 220IU/㎡, 230IU/㎡, 240IU/㎡, 250IU/㎡, 260IU/㎡, 270IU/㎡, 280IU/㎡, 290IU/㎡, 300IU/㎡, 310IU/㎡, 약 320IU/㎡, 약 330IU/㎡, 340IU/㎡, 약 350IU/㎡, 360IU/㎡, 370IU/㎡, 380IU/㎡, 390IU/㎡, 400IU/㎡, 410IU/㎡, 420IU/㎡, 430IU/㎡, 440IU/㎡, 450IU/㎡, 500IU/㎡, 550IU/㎡, 600IU/㎡, 620IU/㎡, 630IU/㎡, 640IU/㎡, 650IU/㎡, 660IU/㎡, 670IU/㎡, 680IU/㎡, 690IU/㎡ 또는 약 700IU/㎡일 수 있다. 특정 실시형태에서, 용량은 당업자에 의해 목적으로 되는 바와 같이 변형될 수 있다.
ADIr-SS-PEG5,000을 이용하는 최적의 투약량은 1주 약 2회일 수 있는 반면, ADIr-SS-PEG20,000을 이용하는 최적의 투약량은 1주 약 1회 내지 2주마다 약 1회일 수 있다. 특정 실시형태에서, ADIr-SS-PEG20,000을 이용하는 최적의 투약량은 1주 약 2회일 수 있다.
ADIr-PEG는 주사 전에 인산염 완충 식염수 용액, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 용액과 혼합될 수 있다. 일 실시형태에서, ADIr-PEG를 포함하는 액체 조성물은 약 6.6 내지 약 7의 pH에서; 적절한 양의 주사용수(예를 들어, 약 1㎖ 또는 약 2㎖) 중에서 약 10 내지 약 12㎎의 ADIr, 약 20 내지 약 40㎎의 폴리에틸렌 글라이콜, 1.27㎎ + 5% 1염기성 인산나트륨, USP; 약 3㎎ + 5% 2염기성 인산나트륨, USP; 7.6㎎ + 5% 염화나트륨, USP를 포함한다. 일 실시형태에서, ADIr-PEG를 포함하는 액체 조성물은 히스티딘-HCl을 포함하고, 특정 실시형태에서, 조성물 완충제는 약 0.0035 M 히스티딘-HCl 내지 약 0.35 M 히스티딘-HCl이다. 일부 특정 실시형태에서, 조성물은 0.13M 염화나트륨을 이용하여 pH 6.8에서 0.035M 히스티딘-HCl을 포함하는 완충제 중에서 제형화된다. 다른 실시형태에서, 조성물은 0.13 M 염화나트륨을 이용하여 pH 6.8에서 0.02M 인산나트륨 완충제를 포함하는 완충제 중에서 제형화된다.
일 실시형태에서, ADIr 또는 ADIr-PEG를 포함하는 조성물은 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 8, 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가진다. 일부 실시형태에서, ADIr을 포함하는 조성물은 약 6.8 ± 1.0의 pH를 가진다.
일 실시형태에서, ADIr-PEG를 포함하는 조성물 중의 유리 PEG는 1 내지 10%이고, 추가 실시형태에서, 총 PEG의 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만이다. 특정 실시형태에서, ADIr-PEG를 포함하는 조성물 중의 비변형 ADIr은 약 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만이다. 일반적으로, ADIr-PEG를 포함하는 조성물은 총 불순물을 내지 약 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1% 또는 0.5% 이하로 가진다. 일 실시형태에서, 내독소는 USP에서 언급된 필요조건, 즉, ≤50 EU/㎖를 충족시킨다.
일 실시형태에서, ADIr 또는 ADIr-PEG를 포함하는 조성물 중의 유리 설프하이드릴은 약 90% 초과이다. 일부 실시형태에서, ADIr 또는 ADIr-PEG를 포함하는 조성물 중의 유리 설프하이드릴은 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 이상이다.
일 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 0.1μM 또는 0.5μM 내지 약 15μM의 Km을 가지며, 추가 실시형태에서, 약 1μM 내지 약 12μM, 약 1μM 내지 약 10μM, 약 1.5μM 내지 약 9μM, 약 1.5μM 내지 약 8μM 또는 약 1.5μM 내지 약 7μM이다. 특정 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 1.0μM 내지 약 10μM 또는 약 1.5μM 내지 약 6.5μM의 Km을 가진다. 일부 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약, 적어도 약, 또는 약 0.1μM, 약 0.5μM, 약 1.0μM, 약 1.5μM, 약 2μM, 약 2.5μM, 약 3μM, 약 3.5μM, 약 4μM, 약 4.5μM, 약 5μM, 약 5.5μM, 약 6μM, 약 6.5μM, 또는 약 7μM, 또는 약 8μM, 또는 약 9μM, 또는 약 10μM 미만의 Km을 가진다.
일 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 0.5초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 0.5초-1 내지 약 70초-1, 또는 약 0.5초-1 내지 약 60초-1, 또는 약 0.5초-1 내지 약 50초-1, 또는 약 0.5초-1 내지 약 40초-1, 또는 약 0.5초-1 내지 약 30초-1, 또는 약 0.5초-1 내지 약 20초-1, 또는 약 0.5초-1 내지 약 15초-1의 Kcat를 가지고, 추가 실시형태에서, 약 0.5초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 1초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 5초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 10초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 20초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 30초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 40초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 50초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 60초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 70초-1 내지 약 80초-1, 또는 약 1초-1 내지 약 12초-1, 약 1초-1 내지 약 10초-1, 약 1.5초-1 내지 약 9초-1, 약 2초-1 내지 약 8초-1 또는 약 2.5초-1 내지 약 7초-1이다. 특정 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 2.5초-1 내지 약 7.5초-1의 Kcat를 가진다. 일부 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 또는 적어도 약 2.5초-1, 약 3초-1, 약 3.5초-1, 약 4초-1, 약 4.5초-1, 약 5초-1, 약 5.5초-1, 약 6초-1, 약 6.5초-1, 약 7초-1, 약 7.5초-1 또는 약 8초-1, 약 10초-1, 약 15초-1, 약 20초-1, 약 25초-1, 약 30초-1, 약 35초-1, 약 40초-1, 약 45초-1, 약 50초-1, 약 55초-1, 약 60초-1, 약 65초-1, 약 70초-1, 약 75초-1, 약 80초-1, 약 85초-1, 약 90초-1, 약 95초-1, 또는 약 100초-1의 Kcat를 가진다.
일 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 5mS/㎝ 내지 약 20mS/㎝, 및 추가 실시형태에서, 약 5mS/㎝ 내지 약 15mS/cM, 약 7mS/㎝ 내지 약 15mS/cM, 약 9mS/㎝ 내지 약 15mS/㎝ 또는 약 10mS/㎝ 내지 약 15mS/㎝의 전도도(또한 당업계에서 도전율로서 지칭됨)를 가진다. 일부 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG은 약 9mS/cM, 약 10mS/cM, 약 11mS/cM, 약 12mS/㎝ 또는 약 13mS/cM, 약 14mS/㎝ 또는 약 15mS/㎝의 전도도를 가진다. 특정 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 13mS/㎝ ± 1.0mS/㎝의 전도도를 가진다.
일 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 50mOsm/㎏ 내지 약 500mOsm/㎏, 약 100mOsm/㎏ 내지 약 400mOsm/㎏, 약 150mOsm/㎏ 내지 약 350mOsm/㎏, 약 200mOsm/㎏ 내지 약 350mOsm/㎏ 또는 약 250mOsm/㎏ 내지 약 350mOsm/㎏의 삼투압 몰농도를 가진다. 특정 실시형태에서, 조성물 중의 ADIr 또는 ADIr-PEG는 약 300 ± 30mOsm/㎏의 삼투압 몰농도를 가진다.
일 실시형태에서, 단백질 농도는 약 11.0 ± 1.0㎎/㎖이다. 특정 실시형태에서, 단백질 농도는 약 8 내지 약 15㎎/㎖이다. 다른 실시형태에서, 단백질 농도는 약 8, 9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 또는 15㎎/㎖이다.
일 실시형태에서, 구체적 효소 활성은 약 5.0 내지 90 IU/㎎ 또는 약 5 내지 55 IU/㎎이며, 여기서 1 IU는 37℃에서 1분에 1μ㏖의 아르기닌을 1μ㏖의 시트룰린 및 1μ㏖의 암모니아로 전환시키는 효소의 양으로서 정의되고, 효능은 100 ± 20IU/㎖이다. 다른 실시형태에서, 구체적 효소 활성은 약 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 30.5, 35, 40, 45, 50, 55, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ± 2.0IU/㎎이다. 일부 특정 실시형태에서, 구체적 효소 활성은 9 ± 2.0IU/㎎이다.
본 개시내용의 ADIr-PEG를 포함하는 조성물은 또한 ADI-PEG 20을 포함하는, 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 투여 전에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 이러한 투여 요법은 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 추가적인 활성제를 함유하는 단일 약제학적 제형의 투여뿐만 아니라 그 자체가 별개의 약제학적 제형인 본 발명의 ADIr-PEG(예를 들어, ADIr-PEG 20) 및 각각의 활성제를 포함하는 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되는 바와 같은 ADIr-PEG 및 다른 활성제는 정제 또는 캡슐로서 단일 경구 투약량 조성물에서 함께, 또는 별개의 경구 제형으로 투여되는 각각의 작용제로 환자에게 투여될 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr-PEG 및 다른 활성제는 식염수 용액 또는 다른 생리적으로 허용가능한 용액 중에서와 같은 단일 비경구 투약 조성물 중에서 함께, 또는 동일 또는 상이한 경로에 의해(예를 들어, 하나는 주사에 의해, 하나는 경구에 의해) 별개의 비경구 제형으로 투여되는 각각의 작용제로 환자에게 투여될 수 있다. 별개의 제형이 사용되는 경우, ADIr-PEG 및 하나 이상의 추가적인 활성제를 포함하는 조성물은 본질적으로 동시에, 즉, 일제히 또는 별개로 시차를 둔 시간에, 즉, 순차적으로 및 임의의 순서로 투여될 수 있고; 병용 요법은 모든 이들 요법을 포함하는 것으로 이해된다.
따라서, 특정 실시형태에서, 또한 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 본 개시내용의 ADIr 조성물의 투여가 상정된다. 이러한 치료제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 질환 상태, 예컨대 특정 암 또는 GVHD에 대한 표준 치료로서 당업계에서 허용될 수 있다. 상정되는 예시적 치료제는 사이토카인, 성장인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항-염증제, 화학치료제, 방사선치료제, 자가소화작용 저해제 또는 다른 활성제 및 보조제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 ADIr 조성물은 임의의 수의 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파마이드(사이톡산(CYTOXAN)(상표명)); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민 및 알트레타민을 비롯한 메틸아멜라민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아마이드, 트라이에틸렌티오포스포르아마이드 및 트라이메틸롤로멜라민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 유라실 머스터드; 니트로소유레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-놀류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 예컨대, 메토트렉세이트 및 5-플루오로유라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신성, 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글라이코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK.RTM.; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 네누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2"-트라이클로로트라이에틸아민; 유레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴;미노브로니톨; 밀토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)(등록상표), 뉴저지주 프린스톤에 소재한 브리스톨-마이어 스큅 옹콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)) 및 도세탁셀(탁소텔(TAXOTERE)(등록상표)., 프랑스 안토니에 소재한 론-폴렌 로리(Rhne-Poulenc Rorer)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오미틴(DMFO); 레티노산 유도체, 예컨대 타르그레틴(Targretin)(상표명)(벡사로텐), 판레틴(Panretin)(상표명)(알리트레티노인); 온타크(ONTAK)(상표명)(데니류킨 디프티톡스); 에스퍼라마이신; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토르에미펜(파레스톤)을 포함하는 항-에스트로겐; 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타마이드, 닐루타마이드, 비칼루타마이드, 류프롤라이드 및 고세렐린과 같이 종양 상에서 호르몬 작용을 조절 또는 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제가 본 정의에 포함된다. 추가 화학치료제는 소라페닙 및 다른 단백질 키나제 저해제, 예컨대 아파티닙, 악시티닙, 베바시주맙, 세툭시맙, 크리조티닙, 다사티닙, 에를로티닙, 포스타마티닙, 게피티닙, 이마티닙, 라파티닙, 렌바티닙, 무브리티닙, 닐로티닙, 파니투무맙, 파조파닙, 페갑타닙, 라니비주맙, 룩소리티닙, 트라스투주맙, 반데타닙, 베무라페닙 및 수니티닙; 시롤리무스(라파마이신), 에베로리무스 및 다른 mTOR 저해제를 포함한다. 상기 중 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 또한 본 명세서에서 사용을 위해 상정된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 개시되는 ADIr 조성물은 다수의 자가소화작용 저해제와 함께 투여될 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 자가소화작용 저해제는 클로로퀸, 3-메틸아데닌, 하이드록시클로로퀸(플라쿠에닐(Plaquenil)(상표명)), 바필로마이신 A1, 5-아미노-4-이미다졸 카복사마이드 리보사이드(AICAR), 오카다산, 2A형 또는 1형의 단백질 포스파타제를 저해하는 자가소화작용-억제성 미세조류 독소, cAMP의 유사체, 및 cAMP 수준을 상승시키는 약물, 아데노신, N6-머캅토퓨린 리보사이드, 보르트만닌 및 빈블라스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로, 예를 들어 ATG5와 같은 자가소화작용에 필수적인 단백질의 발현을 저해하는 안티센스 또는 siRNA가 또한 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 치료제와 ADIr-PEG의 조합은 상보적으로, 상가적으로 또는 상승 효과적으로 작용한다. 이와 관련하여, 본 명세서에 제공된 바와 같은 ADIr-PEG와 상보적 또는 상승효과적으로 작용할 수 있는 치료제(예를 들어, 화학치료제, 자가소화작용 저해제, mTOR 저해제, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 암, GVHD, 또는 염증성 장 질환을 위해 사용되는 임의의 다른 치료제)를 포함하는 상보적 또는 상승 효과적 작용제는 본 명세서에 기재되어 있으며, 이러한 상보성 또는 상승효과는 화학치료제가 존재하지만 ADIr-PEG 조성물이 없을 때 및/또는 ADIr-PEG가 존재하지만 화학치료제가 없을 때 검출될 수 있는 효과보다 규모가 더 큰 검출가능한 효과로서(즉, 적절한 대조군 조건에 비해 통계학적으로 유의한 방식으로) 나타난다. 상승효과 및 상보성을 측정하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Cancer Res January 15, 2010 70; 440] 참조).
본 명세서에 기재되는 바와 같이 ADIr, 및 선택적으로 다른 치료제를 포함하는 조성물은 암 치료를 위한 치료적 방법 및 암의 전이를 예방하는 방법에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 상이한 암을 치료하거나, 암의 증상을 개선시키거나, 암의 진행을 저해하거나 또는 암을 예방하기 위한 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 GVHD를 치료하거나, 증상을 개선시키거나 또는 진행을 저해하기 위한 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 환자에게 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 ADIr 조성물을, 선택적으로 ADI-PEG 20을 이용한 치료 후에 투여함으로써, 특히 환자가 항-ADI-PEG 20 항체가 생긴 경우에, 암 또는 GVHD를 치료하거나, 증상을 개선시키거나 또는 진행을 저해하는 단계를 포함하는, 암 또는 GVHD를 치료하거나, 증상을 개선시키거나 또는 진행을 저해하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 ADIr 조성물은 염증성 장질환(예를 들어, 크론병; 궤양성 대장염), GVHD 또는 간세포 암종, 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병 및 재발된 급성 골수성 백혈병), 전이성 흑색종을 포함하는 흑색종, 육종(전이성 육종, 자궁 평활근육종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 췌장암, 전립선암(예컨대, 호르몬 불응성 전립선암을 포함하지만 이것으로 제한되지 않음), 중피종, 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 소세포 폐암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암(위선암을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 신경교종, 다형성교아종, 망막아세포종, 신경아세포종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 신장암(신세포암을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암(두경부의 편평세포암; 혀암을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 자궁경부암, 고환암, 담낭, 담관암 및 위암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 암으로 고통받는 개체에게 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr 및 선택적으로 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하거나, 암의 증상을 개선시키거나, 또는 암의 진행을 저해하는 방법을 제공하되, 암은 ASS, ASL 또는 둘 다가 없다. 이와 관련하여, ASS 또는 ASL 결핍은 mRNA 발현 또는 단백질 발현에 의해 측정되는 바와 같은 발현에서의 감소일 수 있거나, 또는 단백질 활성에서의 감소일 수 있고, 일반적으로 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 발현 또는 활성에서 통계학적으로 유의한 감소를 포함한다. 감소된 ASS 또는 ASL 발현 또는 활성은 암이 없는 것으로 알려진 적절한 대조군 샘플에서의 발현 또는 활성에 비해 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 이상의 발현 또는 활성에서의 감소가 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, ASS 또는 ASL 발현 또는 활성은 비암 대조군 샘플에서의 발현 또는 활성에 비해 적어도 2배만큼 감소된다.
특정 실시형태에서, ASS 또는 ASL의 감소된 발현 또는 활성은 ASS 또는 ASL 프로모터의 메틸화 또는 ASS 또는 ASL 프로모터의 저해로부터 초래된다. 다른 실시형태에서, ASS 또는 ASL의 발현 또는 활성에서의 감소는 DNA 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 점 돌연변이, 작은 결실, 삽입 등) 또는 유전자 결실을 초래하는 염색체 이상으로부터 초래된다. 일 실시형태에서, 암은 ASS 또는 ASL 음성을 의미하는데, 이는 발현 또는 활성이 관찰된다는 것을 의미한다.
ASS 또는 ASL 발현 또는 활성에서의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 정량적 PCR, 면역조직화학, 효소 활성 분석(예를 들어, 시트룰린의 아르기니노숙시네이트로의 전환 또는 아르기니노숙시네이트의 아르기닌 및 푸마르산염으로의 전환을 측정하는 분석) 등을 사용하여 측정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 암을 치료하거나, 암의 증상을 개선시키거나, 암의 진행을 저해하기 위한 방법을 제공하되, 암은 ASS 또는 ASL, 또는 둘 다의 감소된 발현 또는 활성을 나타내고, 암은 간세포 암종, 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병 및 재발된 급성 골수성 백혈병), 전이성 흑색종을 포함하는 흑색종, 육종(전이성 육종, 자궁 평활근육종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 췌장암, 전립선암(예컨대, 호르몬 불응성 전립선암을 포함하지만 이것으로 제한되지 않음), 중피종, 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 소세포 폐암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암(위선암을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 신경교종, 다형성교아종, 망막아세포종, 신경아세포종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 신장암(신세포암을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암(두경부의 편평세포암; 혀암을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않음), 자궁경부암, 고환암, 담낭, 담관암 및 위암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
문헌에서의 다양한 연구는 ASS가 다음의 종양: 급성 골수성 백혈병(AML), 방광암, 유방암, 결장직장암, 위암, 교모세포종, HCC, 림프종, 흑색종, 중피종, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 육종, 및 소세포폐암에서의 결여라는 것을 나타낸다. 따라서, 이들 ASS-결여암의 치료는 ADIr-PEG 단독으로 또는 처음에 ADI-PEG 20을 이용하는 치료를 포함하는 다른 치료와 병행하여 본 명세서에서 구체적으로 상정된다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr(예를 들어, ADIr-PEG 및 특히 ADIr-PEG 20)을 자가소화작용 저해제와 조합하여 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 암을 치료하거나, 암의 증상을 개선하거나 또는 암의 진행을 저해하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 자가소화작용 저해제와 조합하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 ADIr을 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공하되, 암은 췌장암 또는 소세포 폐암이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 ADIr을 포함하는 조성물의 투여가 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이상 동안 혈장 내 아르기닌을 고갈시키는 치료방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 ADIr을 포함하는 조성물의 투여가 항-ADI-PEG 20 항체의 검출 후 ADI-PEG 20을 이용하는 치료를 종결한 후에 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이상 동안 혈장 내 아르기닌을 고갈시키는 치료방법을 제공한다.
실시예
실시예 1
환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 낮은 교차반응성을 갖는 ADI 효소의 선별 및 선택
본 실시예는 환자 항-ADI-PEG 20 항체와의 낮은 교차반응성을 갖는 ADI 효소의 선별 및 선택을 기재한다.
다수의 ADI 효소로부터, 표 1은 마이코플라스마 호미니스 ADI에 대한 그들의 서열 동일성%에 대해 선택한 24종의 ADI 효소를 열거한다. 문헌으로부터, 마이코플라스마 호미니스, 마이코플라스마 아르기니니 및 마이코플라스마 아스리티디스 ADI 아미노산 서열은 밀접하게 관련되어 있고, 이들 효소는 양호한 촉매적 특성을 가진다. 더 최근에, 이들 셋과 밀접하게 관련된 서열을 갖는 추가적인 ADI 효소가 발견되었다. 더 멀리 관련된 마이코플라스마 ADI 효소를, 그들에 관해 덜 알려져 있음에도 불구하고 동정하였다. 박테리아 및 다른 공급원으로부터 훨씬 더 멀리 관련된 ADI 효소가 존재한다.
마이코플라스마 호미니스 ADI에 대해 다른 정도의 유사성을 지니는 선택된 ADI 서열
유기체 백분율 동일성 서열 등록 번호 서열번호
마이코플라스마 호미니스 100.0% gi | 728876 1
마이코플라스마 포시세레브랄레 82.1% gi | 154184333 2
마이코플라스마 아르기니니 82.1% gi | 728875 3
마이코플라스마 아스리티디스 80.4% gi | 238692486 4
마이코플라스마 오랄(Mycoplasma orale) 77.8% gi | 2170494 5
마이코플라스마 가테아 76.8% gi | 148361415 6
마이코플라스마 포시다 75.3% gi | 154184335 7
마이코플라스마 칼럼비늄 58.2% gi | 343491689 8
마이코플라스마 아이오와 55.2% gi | 350546321 9
마이코플라스마 크로코딜리 52.3% gi | 291600396 10
마이코플라스마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans) 52.0% gi | 238809916 11
마이코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans) 51.7% gi | 26554060 12
마이코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum) 51.5% gi | 31544533 13
마이코플라스마 알리가토리스 50.8% gi | 292552899 14
마이코플라스마 뉴모니아 50.7% gi | 440453687 15
마이코플라스마 모빌(Mycoplasma mobile) 47.3% gi | 47458387 16
스트렙토코커스 피오게네스 37.7% gi | 15675444 17
엔테로코커스 패칼리스 37.1% gi | 60389809 18
마이코플라스마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum) 36.6% gi | 83319656 19
할로테르모트릭스 오레니(Halothermothrix orenii) 34.8% gi | 254803235 20
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 33.8% gi | 123549453 21
슈도모나스 플레코글로시시다(Pseudomonas plecoglossicida) 28.7% gi | 154183755 22
슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 27.5% gi | 431801013 23
슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 27.0% gi | 452183609 24
마이코박테리움 보비스 26.8% gi | 378770764 25
공용 데이터베이스에서 입수가능한 몇몇 단백질 서열은 전장 ADI 서열이 아닐 수도 있다. 해당 경우에, 공지된 ADI 서열에 기반하여 전장 ADI를 만들 필요가 있는 경우 공공연하게 입수가능한 서열을 연장하였다. 특정 경우에, ADI 단백질을 다른 곳에서 변형시켰다(예를 들어, C251S 치환). 이들 합성 ADI 서열을 서열번호26 내지 32에서 제공하고, 마이코플라스마 아르기니니(C251S), 마이코플라스마 아스리티디스(C251S), 마이코플라스마 포시세레브랄레, 마이코플라스마 가테아, 마이코플라스마 포시다, 할로테르모트릭스 오레니, 및 마이코박테리움 보비스의 연장 및/또는 변형된 ADI 서열에 대응한다. 효소가 항-ADI-PEG 20 항체의 존재에서조차 환자 혈액 중의 아르기닌을 제거하고 낮은 농도로 유지한다는 것을 결정하기 위해 다수의 유기체로부터의 다수의 ADI 효소를 특성규명하였다. 표 2(이하)는 연구한 표 1로부터의 ADI 효소의 선택한 서브세트를 열거한다. 이하에 상세하게 설명하는 바와 같이, 이들 연구로부터의 데이터는 서열 동일성에 기반하여 마이코플라스마 호미니스와 밀접하게 관련된 다수의 종으로부터의 ADI는 충분히 양호한 효소 촉매적 특성 및 항-ADI-PEG 20 항체와의 감소된 교차-반응성을 가진다는 것을 나타낸다.
ADI 제조. 재조합 ADI 효소를, 예를 들어 문헌[Gallego et al., PLOS One, 7(10):e47886, 2012; Monstadt and Holldorf, Biochem. J. 273:739-745, 1990; Joo Noh et al., Molecules and Cells. 13:137-143, 2002; 및 Sugimura et al., Infection and Immunity. 58:2510-2515, 1990]에 기재한 바와 같이 표준 프로토콜에 따라 클로닝하고, 발현시키고, 정제하였다.
인간 항-ADI-PEG20 항체 정제. 항-ADI-PEG20 항체를 임상 연구 동안 ADI-PEG20을 받은 환자의 혈장 샘플로부터 정제하였다. 총 60㎖의 혈장을 ELISA 분석에 의해 결정하여 ADI-PEG20에 대해 고 역가에 도달한 (역가 >/= 4) 8명의 상이한 환자로부터 모았다. 2-단계 정제, 즉, 단백질 "A" 크로마토그래피(GE 헬스케어(GE Healthcare)) 다음에 ADI 친화도 크로마토그래피를 사용하였다. ~20㎎의 항체를 얻고 나서, 필요할 때까지 알리쿼트 중에서 -80℃에서 저장하였다.
ADI 효소 분석. 아르기닌 탈이민효소(ADI)는 L-아르기닌의 L-시트룰린 및 암모니아로의 전환을 촉매한다. L-시트룰린의 양을 비색 종말점 분석에 의해 검출할 수 있고(예를 들어, 문헌[Knipp and Vasak, Analytical Biochem. 286:257-264, 2000] 참조), 단백질의 IU/㎎으로서 표현하는 ADI의 구체적 활성을 계산하기 위해 알려진 양의 L-시트룰린의 표준 곡선과 비교하였다. 1IU의 효소 활성을 pH의 분 당 1μ㏖의 시트룰린을 생성하는 효소의 양으로서 정의한다. 37℃에서 생리적 HEPES 완충제(PHB) 50mM HEPES, 160mM NaCl pH 7.4(Lang and Zander, Clin Chem Lab Med. 37:563-571, 1999) + 0.1% BSA 중에서 표준 분석 조건을 수행하였다. 조건이 허용된다면, 모든 샘플 및 표준을 2회 또는 3회 중복으로 실행하였다.
상기 기재한 활성 분석의 변형을 사용함으로써 Km 및 Kcat 값을 결정하였다. 활성 분석에 따라, 모든 반응을 PHB + 0.1% BSA 중에서 37℃에서 실행하였다. 효소 농도, 반응 시간 및 기질 농도 범위를 활성에서의 그들의 차이를 고려하여 각각의 ADI 또는 ADIr 작제물에 대해 조절하였다. 일반적으로, 2nM 효소, 5분 반응 시간 및 0 내지 160μM 아르기닌을 시작 조건으로서 사용하였다. 조건을 최적화할 때, 반응에 첨가한 총 기질의 백분율로서 소모된 기질의 양에 특히 주목하였다. 검출의 하한은 1μM의 시트룰린이고, 정량화의 하한은 2μM이다. 시트룰린 표준 곡선을 모든 플레이트 상에서 실행하고 나서, 효소 반응에 의해 생성되는 시트룰린을 정량화하는데 사용하였다.
항-ADI-PEG20의 존재 하에 효소 활성을 평가하기 위한 활성 분석을 또한 수행하였다(항체 중화 프로파일). 상기 기재한 바와 같이 그리고 800nM, 400nM, 200nM, 100nM, 50nM, 25nM, 12.5nM 및 0nM의 항-ADI-PEG20 항체의 존재 하에 이들 분석을 수행하였다.
계산. 각각의 반응 웰에서 생성된 시트룰린 농도(μM)를 계산하고, 시트룰린 표준 곡선을 이용하여 평균을 내었다. 이어서, 각각의 반응의 속도를 μM/분/50nM ADI로 계산하였다. 구체적 활성(IU/㎎ 또는 μ㏖ 생성물/분/㎎ ADI)을 이 값에 "IU" 인자를 곱함으로써 계산하였다(IU 인자를 ADI 및 반응 용적의 분자량으로부터 계산하였다). 결과를 이하의 표 2에 요약한다.
선택된 ADI 서열 및 특성
유기체 서열 백분율 동일성 구체적 활성 (IU/mg)*** 표면 잔기 변화의 수* 감소된 Ab 교차 반응성****
마이코플라스마 호미니스 100.0 + 0 -
마이코플라스마 포시세레브랄레 82.1 + 33 Y
마이코플라스마 아르기니니 82.1 + 50 Y
마이코플라스마 아스리티디스 80.4 + 53 Y
마이코플라스마 가테아 76.8 + 48 Y
마이코플라스마 포시다 75.3 + 51 Y
마이코플라스마 칼럼비늄 58.2 + 93 Y
마이코플라스마 아이오와 55.2 - 107 ND
마이코플라스마 크로코딜리 52.3 - 107 ND
마이코플라스마 갈리셉티쿰 51.5 - 108 ND
마이코플라스마 알리가토리스 50.8 + 111 Y
마이코플라스마 모빌 47.3 ND 111 ND
할로테르모트릭스 오레니 34.8 - 122 ND
모락셀라 보비스 26.8 - 132 ND
* 표면 잔기를 마이코플라스마 호미니스 ADI로부터 동정하였고, 다른 유기체로부터의 ADI에 대한 표면 잔기를 서열 상동성에 의해 결정하였다.
** ND: 결정되지 않음.
*** "+"는 생리적 조건 하에 그리고 항-ADI-PEG20 항체 없이 8 IU/㎎의 특이적 효소 활성을 나타낸다.
**** "Y"는 항-ADI-PEG20 항체의 존재 하에 특이적 효소 활성에 의해 측정하여, 마이코플라스마 호미니스 ADI에 대해 감소된 항-ADI-PEG20 교차-반응성을 나타낸다.
이들 데이터는 마이코플라스마 호미니스 ADI에 대해 고도로 상동성인(약 50 내지 100% 상동성) ADI 효소가 우수한 촉매적 활성을 유지하였다는 것을 나타낸다. 그들은 또한 항-ADI-PEG 20 항체의 존재 하에 효소 활성에 의해 측정하여, 예를 들어 마이코플라스마 호미니스의 효소 활성에 비해, 환자 항-ADI-PEG 20 항체에 대해 감소된 친화도를 나타내었다. 따라서, 이들 ADI 효소는 단독으로 또는 ADI-PEG 20 치료 후에 암치료에 대한 요법에서의 사용에 대해 아르기닌 고갈 요법의 유효성을 연장 및/또는 증가시키는 치료적 효용을 가질 수 있다.
상기 기재한 다양한 실시형태는 추가적인 실시형태를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 명세서에 언급하고/하거나 출원 데이터 시트에 열거한 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 출원은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 또 다른 실시형태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 사용하는데 필요하다면, 실시형태의 양태는 변형될 수 있다.
이들 및 다른 변화가 상기 상세한 설명에 비추어 실시형태로 만들어질 수 있다. 일반적으로, 다음의 특허청구범위에서, 사용한 용어는 본 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적 실시형태로 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되지만, 이러한 청구범위에 부여되는 동등물의 완전한 범주에 따라 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Polaris Group <120> ARGININE DEIMINASE WITH REDUCED CROSS-REACTIVITY TOWARD ADI - PEG 20 ANTIBODIES FOR CANCER TREATMENT <130> POLA-003/01WO <150> US 61/790,833 <151> 2013-03-15 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 409 <212> PRT <213> Mycoplasma hominis <400> 1 Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu 1 5 10 15 Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile 20 25 30 Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile 35 40 45 Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile 50 55 60 Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala 65 70 75 80 Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu 85 90 95 Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys 100 105 110 Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu 115 120 125 Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu 130 135 140 Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met 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<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 24 Met Ser Thr Glu Lys Thr Lys Leu Gly Val His Ser Glu Ala Gly Lys 1 5 10 15 Leu Arg Lys Val Met Val Cys Ser Pro Gly Leu Ala His Gln Arg Leu 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Cys Asp Glu Leu Leu Phe Asp Asp Val Ile Trp Val 35 40 45 Asn Gln Ala Lys Arg Asp His Phe Asp Phe Val Thr Lys Met Arg Glu 50 55 60 Arg Gly Ile Asp Val Leu Glu Met His Asn Leu Leu Thr Glu Thr Ile 65 70 75 80 Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp Ile Leu Asp Arg Lys Ile Thr Ala 85 90 95 Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu Arg Ser Trp Leu Glu 100 105 110 Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu Ile Gly Gly Val Ala 115 120 125 Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn Ile Leu Lys Met Tyr 130 135 140 Arg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn 145 150 155 160 Thr Gln Phe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp Ile Tyr Gly Gly Val Thr 165 170 175 Leu Asn Pro Met Tyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr 180 185 190 Thr Ala Ile Tyr Lys Phe His Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe 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Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Ile Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly 325 330 335 Ala Ser Gln Ile Asp Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn 340 345 350 Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu 355 360 365 Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe 370 375 380 His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser 385 390 395 400 Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp 405 410 <210> 30 <211> 410 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mycoplasma phocidae arginine deiminase with flanking synthesized residues added <400> 30 Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu 1 5 10 15 Ile Gly Glu Leu Gln Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile 20 25 30 Glu Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile 35 40 45 Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Glu Phe Val Ala Glu 50 55 60 Leu Lys Lys Asn Asn Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ser 65 70 75 80 Glu Thr Tyr Asp Met Val Ser Lys Glu Lys Gln Glu Lys Leu Ile Glu 85 90 95 Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Lys Gly 100 105 110 Leu Val Arg Lys Phe Leu Lys Ser Leu Lys Ser Ser Lys Glu Leu Ile 115 120 125 Gln Tyr Met Met Ala Gly Ile Thr Lys His Asp Leu Asn Ile Glu Ala 130 135 140 Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg 145 150 155 160 Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg 165 170 175 Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Ile Phe Ala 180 185 190 Asn His Pro Lys Leu Met Asn Thr Pro Leu Tyr Tyr Asn Pro Asp Met 195 200 205 Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Val Tyr Asn Asn Glu Thr 210 215 220 Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu 225 230 235 240 Leu Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Arg Glu Phe Lys Arg Ile 245 250 255 Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr 260 265 270 Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala 275 280 285 Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Asp 290 295 300 Glu Pro Gln Pro Lys Val Asn Gly Leu Pro Leu Glu Lys Leu Leu Glu 305 310 315 320 Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Ile Leu Ile Pro Ile Ala Gly Thr Ser 325 330 335 Ala Ser Asn Ile Asp Val Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn 340 345 350 Tyr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Val 355 360 365 Lys Thr Asn Glu Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe 370 375 380 Lys Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser 385 390 395 400 Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp 405 410 <210> 31 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mycoplasma H.orenii arginine deiminase with flanking synthesized residues added <400> 31 Met Ser Phe Lys Lys Ser Pro Leu Asn Val Thr Ser Glu Ile Gly Lys 1 5 10 15 Leu Lys Lys Val Leu Leu His Arg Pro Gly His Glu Ile Glu Asn Leu 20 25 30 Thr Pro Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu 35 40 45 Lys Val Ala Gln Glu Glu His Asp Ala Phe Ala Gln Thr Leu Arg Asp 50 55 60 Asn Gly Val Glu 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Phe Thr Met Val Asp Tyr Asp Lys Phe Thr 275 280 285 Ile His Ala Glu Ile Glu Gly Pro Leu Lys Val Tyr Ser Ile Thr Lys 290 295 300 Gly Asp Asn Asp Glu Leu Lys Ile Asp Glu Glu Lys Ala Thr Leu Glu 305 310 315 320 Asp Thr Leu Lys Lys Tyr Leu Gly Leu Asp Glu Val Thr Leu Ile Arg 325 330 335 Cys Ala Gly Gly Asp Tyr Ile Asp Ala Gly Arg Glu Gln Trp Asn Asp 340 345 350 Gly Ser Asn Thr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Glu Val Val Val Tyr Asn 355 360 365 Arg Asn His Thr Thr Asn Arg Leu Leu Glu Glu His Gly Ile Lys Leu 370 375 380 His Val Ile Pro Ser Ser Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg 385 390 395 400 Cys Met Ser Met Pro Leu Val Arg Glu Asp Ile 405 410 <210> 32 <211> 404 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mycobacterium bovis arginine deiminase with flanking synthesized residues added <400> 32 Met Ser Val Gly Val Glu Leu Gly Ser Asn Ser Glu Val Gly Ala Leu 1 5 10 15 Arg Val Val Ile Leu His Arg Pro Gly Ala Glu Leu Arg Arg Leu Thr 20 25 30 Pro Arg Asn Thr Asp Gln Leu Leu Phe Asp Gly Leu Pro 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245 250 255 Val Leu Ala Val Pro Ile Ala Gln Gln Arg Ala Gln Met His Leu Asp 260 265 270 Thr Val Cys Thr Met Val Asp Thr Asp Thr Met Val Met Tyr Ala Asn 275 280 285 Val Val Asp Thr Leu Glu Ala Phe Thr Ile Gln Arg Thr Pro Asp Gly 290 295 300 Val Thr Ile Gly Asp Ala Ala Pro Phe Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala 305 310 315 320 Met Gly Ile Asp Lys Leu Arg Val Ile His Thr Gly Met Asp Pro Val 325 330 335 Val Ala Glu Arg Glu Gln Trp Asp Asp Gly Asn Asn Thr Leu Ala Leu 340 345 350 Ala Pro Gly Val Val Val Ala Tyr Glu Arg Asn Val Gln Thr Asn Ala 355 360 365 Arg Leu Gln Asp Ala Gly Ile Glu Val Leu Thr Ile Ala Gly Ser Glu 370 375 380 Leu Gly Thr Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met Ser Cys Pro Ala Ala 385 390 395 400 Arg Asp Pro Leu

Claims (26)

  1. (i) 서열번호 2, 6, 8 또는 14 중 어느 하나에 제시되거나, 서열번호 2, 6, 8 또는 14 중 어느 하나에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 아르기닌 탈이민효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합적으로 발현시키는 단계; 및
    (ii) 치료적 유효량의 단리된 아르기닌 탈이민효소를 생리학적으로 허용가능한 담체와 조합하는 단계;
    를 포함하는 아르기닌-의존성 질환을 갖는 환자의 치료를 위한 치료적 조성물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단리된 아르기닌 탈이민효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에 포함되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되는 것인 방법.
  4. 암을 치료하거나, 암의 증상을 개선시키거나, 또는 암의 진행을 저해하는 방법에서 사용되기 위한 치료적 조성물로서, 상기 방법은 상기 치료적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 치료적 조성물은
    (i) 서열번호 2, 6, 8 또는 14 중 어느 하나에 제시되거나, 서열번호 2, 6, 8 또는 14 중 어느 하나에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2, 6, 8 또는 14 중 어느 하나에 제시되거나, 서열번호 2, 6, 8 또는 14 중 어느 하나에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 서열번호 2, 6, 8 또는 14 중 어느 하나에 제시되거나, 서열번호 2, 6, 8 또는 14 중 어느 하나에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포; 및
    (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 도세탁셀, 카보플라틴, 사이클로포스파마이드, 겜시타빈, 시스플라틴, 소라페닙, 수니티닙 또는 에베로리무스에서 선택되는 화학 치료제를 추가로 포함하는 치료적 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 이를 필요로 하는 환자는 항-ADI-PEG 20 항체를 갖는 것으로 결정된 것인 치료적 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 암은 간세포 암종, 흑색종, 전이성 흑색종, 췌장암, 전립선암, 소세포 폐암, 중피종, 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프종, 간세포암, 육종, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 재발된 급성 골수성 백혈병, 유방암, 난소암, 결장직장암, 위암, 신경교종, 다형성교아종, 비-소세포 폐암(NSCLC), 신장암, 방광암, 자궁암, 식도암, 뇌암, 두경부암, 자궁경부암, 고환암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 이를 필요로 하는 환자는 항-ADI-PEG 20 항체를 갖는 것으로 결정된 것인 치료적 조성물.
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