DE69909747T2 - Pharmazeutische zusammensetzung, enthaltend peg-asparaginase, für die behandlung von hiv infektionen - Google Patents

Pharmazeutische zusammensetzung, enthaltend peg-asparaginase, für die behandlung von hiv infektionen Download PDF

Info

Publication number
DE69909747T2
DE69909747T2 DE69909747T DE69909747T DE69909747T2 DE 69909747 T2 DE69909747 T2 DE 69909747T2 DE 69909747 T DE69909747 T DE 69909747T DE 69909747 T DE69909747 T DE 69909747T DE 69909747 T2 DE69909747 T2 DE 69909747T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
hiv
methyl
peg
valyl
asnase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69909747T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69909747D1 (de
Inventor
I. Vassilios AVRAMIS
Lewis Cohen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Enzon Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Enzon Pharmaceuticals Inc filed Critical Enzon Pharmaceuticals Inc
Publication of DE69909747D1 publication Critical patent/DE69909747D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69909747T2 publication Critical patent/DE69909747T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung richtet sich auf die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine PEG-ASNase-Verbindung und mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteaseinhibitor-Verbindungen, gewissen Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen und HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, zur Inhibition oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV).
  • Das Humane Immundefizienzvirus (HIV) ist ein Retrovirus und bildet den Wirkstoff für die komplexe Erkrankung, die mit einer progressiven Zerstörung des Immunsystems (erworbenes Immundefektsyndrom; AIDS) und dem Abbau des zentralen und peripheren Nervensystems einhergeht. Dieses Virus war früher unter den Bezeichnungen LAV, HTLV-III oder ARV bekannt. Es hat verschiedene Therapien zur Behandlung der HIV-Infektion gegeben, darunter Arzneimittel-Kombinationstherapien. Proteaseinhibitor-Verbindungen in Kombination mit Reverse Transkriptase (RT)-Inhibitor-Verbindungen haben sowohl in vitro als auch in vivo bei mit dem Virus infizierten Patienten zu Erfolgen geführt. Proteaseinhibitor-Verbindungen greifen in die Produktion neuer infektiöser Viren ein. Die Replikation des HIV-Retrovirus ist allgemein mit einer extensiven post-translationalen Verarbeitung von Vorläufer-Polyproteinen zu reifen Virusproteinen durch viral codierte Protease verbunden. Diese Virusproteine werden für den Aufbau und die Funktion des Virus benötigt. Durch eine Inhibition dieses Prozesses wird die Produktion neuer infektiöser Viren verhindert.
  • Wenn die HIV-Protease durch Proteaseinhibitoren gehemmt wird, kann die provirale Integration infizierter T-Lymphozyten während der Frühphase des HIV-1-Lebenszyklus verhindert werden. Außerdem kann die proteolytische virale Verarbeitung im späteren Stadium inhibiert werden. HIV-Protease-Inhibitoren sind umfassend geprüft worden (A. Tomasselli et al., Chimica Oggi, 6–27 20 (1991) and T. Meek, J. Enzyme Inhibition 6: 65–98 (19.92). Zu der retroviralen Replikation gehört routinemäßig die post-translationale Verarbeitung von Polyproteinen durch viral codierte HIV-Proteasen. Durch diesen post-translationalen Prozess werden reife Polypeptide erzeugt, die nachfolgend an der Bildung und Funktion infektiöser Viren beteiligt sind. Wenn es gelingt, diesen molekularen Prozess zu inhibieren, wird die normale Produktion des HIV-Virus gestoppt. Somit können HIV-Protease-Inhibitoren als Wirkstoff gegen das HIV-Virus fungieren.
  • Retroviren sind unter Vertebraten weit verbreitet und für eine Vielzahl von Erkrankungen bei Mensch und Tier verantwortlich, unter anderem für HIV, Leukämien und Lymphome. Die gesamte Familie der Retroviren ist durch das Vorhandensein eines bestimmten Enzyms, der Reversen Transkriptase (RT), gekennzeichnet. Mit diesem Enzym wird die RNS, die das virale Genom trägt, in eine doppelsträngige DNS-Kopie transkribiert. Daher werden beträchtliche Anstrengungen darauf verwandt, die HIV-Erkrankung über die Inhibition der für die Replikation des Virus benötigten HIV-Reversen Transkriptase zu steuern (V. Merluzzi et al., "Inhibition of the HIV-1 Replication by a Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor", Science, 25, 1411 (1990)). Beispielsweise handelt es sich bei dem derzeit verwendeten Therapeutikum AZT um einen solchen Inhibitor der viralen Reversen Transkriptase (US-Patent Nr. 4,724,232). Leider gibt es bei vielen dieser Substanzen Schwierigkeiten aufgrund ihrer Toxizität, mangelnden Bioverfügbarkeit, Kurzlebigkeit in vivo, Virusresistenz oder einer Kombination dieser Faktoren.
  • Wie man weiß, kann es bei der Inhibition der HIV-Reversen Transkriptase (HIV-RT) durch nucleosidanaloge Arzneimittelkombinationen statt zur vollständigen Hemmung der RT-Funktion auch zum Auftauchen medikamentenresistenter Virusstämme kommen. Diese Escape-Mutanten bauen eine neue Population auf, so dass die Nucleosidanaloga-Therapie unwirksam wird. Durch Zugabe von Proteaseinhibitor-Verbindungen zu bekannten Nucleosidanaloga konnte die Viruslast für eine längere Zeitdauer reduziert werden.
  • Das allosterisch geregelte Enzym Ribonucleotidreduktase wandelt Nucleosid-Diphosphate über einen komplexen Regelmechanismus, an dem ein oder mehrere Elektronenübertragungswege beteiligt sind, in die entsprechenden Desoxynucleosid-Diphosphate um (Holmgren A. Hydrogen donor system for E. Coli Ribonucleoside diphosphate reductase dependent upon glutathione, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, 73, 2275–9; Therlander L., Reductase of Ribonucleotides, Ann. Rev. Biochem. 1979, 46, 133–58; Ashley GW, Stubbe J., Current ideas on the chemical mechanism of ribonucleotide reductase, Pharmac. Ther. 1985, 30, 301–29; Stubbe J., Ribonucleotide Reductase: Amazing and confusing, J. Biol. Chem. 1990, 265, 5329–32). Die Reduktion des Ribonucleotids durch Ribonucleotidreduktase ermöglicht den DNS-Polymerasen, während der DNS-Replikation die Desoxyribonucleotide (dNTP) zu verwerten. Die Aktivität von Ribonucleotidreduktase ist mit dem Prozess der Zellproliferation gut koordiniert und in der späten G1- und frühen S-Phase, während des Hauptteils der DNS-Synthese, deutlich erhöht (Corey J. G., Whitford Jr. T. W., Ribonucleotide reductase and DNA synthesis in Ehrlich ascites tumor cancer cells, Cancer Res., 1972, 32, 1301-6; Hammerstan E., Reichard P., Saluste E., Pyrimidine nucleosides as precursors of pyrimidines in polynucleotides, J. Biol. Chem., 1950, 183, 105–109). Dadurch, dass Ribonucleotidreduktase bei der DNS-Synthese eine wichtige Rolle spielt, wird das Enzym zur Zielscheibe bei der Entwicklung chemotherapeutischer Wirkstoffe. Kürzlich wurde für eine Klasse der Verbindung 2-Hydroxy-1H-isoindol-1,3-dion (HISID) nachgewiesen, dass sie über Ribonucleotidreduktaseinhibierende Aktivität verfügt (Nandy P, Lien EJ, Avramis VI, Acta Oncologica, 33, 8, 953–61, 1994; Nandy P, Lien EJ, Avramis VI, Rec Adv Chemoth 1:995-996, 1994; Nandy P, Lien EJ, Avramis VI, Med. Chem. Res. 1995, 5: 664–679).
  • PEG-Asparaginase (die polyethylenglykolisierte Form von E. coli-ASP) hat sich als nützlicher chemotherapeutischer Wirkstoff erwiesen. Insbesondere hat sich PEG-Asparaginase als alternatives Präparat mit längerer Halbwertszeit im Blutkreislauf als E. coli-L-Asparaginase und als vielseitig wirksames Chemotherapeutikum für akute Lymphoblastenleukämie im Kindesalter herausgestellt. (Ettinger U, Ettinger AG, Avramis VI, Gaynon PS, BioDrugs, 7, 1, 30–39, 1997). PEG-ASNase kann außerdem die antileukämische Wirkung beim isolierten ZNS-Rezidiv erhöhen. (Malgolowkin M, Ortega S, Carcich DA, Steele D, Tischer D, Franklin J, Nandy P, Periclou A, Cohen LJ, Avramis VI, Proceedings of ASCO, 17, 1998.)
  • PEG-ASNase ist ein Konjugat von Asparaginase mit Polyethylenglykol. Diese Konjugation wird durch Pegylierung bewerkstelligt, einen Prozess, bei dem Polypeptide, z. B. Enzyme oder Hormone, so an Polyethylenglykol gekoppelt werden, dass dabei eine physiologisch aktive, nicht immunogene wasserlösliche Polypeptidverbindung entsteht. Polyethylenglykol schützt das Polypeptid vor dem Verlust der Aktivität, und die Substanz kann in das Kreislaufsystem von Säugern eingespritzt werden, ohne dass eine wesentliche Immunreaktion erfolgt. Der Pegylierungsprozess wird ausführlich beschrieben in US-Patent Nr. 4,179,337 mit dem Titel "Non-immunogenic Polypeptide", angemeldet am 28. Juli 1977 und erteilt am 18. Dezember 1979, welches durch die Bezugnahme gänzlich in das vorliegende Dokument integriert ist. Die kovalente Bindung des Polymers an das Peptid wird oft durch reagierende PEG-Succinimid-Derivate vermittelt, bei denen sich Aminogruppen an den Außenseiten der Proteinmoleküle befinden. Weitere Methoden werden in US-Patent Nr. 4,179,337, in Pollack et al., JACS, 98, 289 (1976), US-Patent Nr. 4.847.325 sowie an anderer Stelle im Artikel veröffentlicht.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Antragsteller haben entdeckt, dass PEG-Asparaginase (PEG-ASNase) sowohl allein als auch synergistisch in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Partner bei der Behandlung einer HIV-Infektion wirksam ist: Proteaseinhibitor-Verbindungen, HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen sowie gewisse Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen.
  • Entsprechend ist die Erfindung in erster Linie auf eine Anwendung der PEG-ASNase-Verbindung und mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteaseinhibitor-Verbindungen, gewissen Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen sowie HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen, gerichtet, wie in Antrag 1 ausgeführt.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1 zeigt die Inhibition von HIV-RT in CEM/0-T-Zellen (± PHA), die mit IC50-Konzentrationen von PEG-ASNase bzw. Saquinavir (SAQ allein oder in Kombination behandelt wurden.
  • 2 zeigt die CEM/0-T-Zellen-Zytotoxizität von Saquinavir nach 72 Stunden für verschiedene Konzentrationen des Arzneimittels.
  • 3 zeigt die T-Zellen-Zytotoxizität von PEG-ASNase und Saquinavir jeweils allein und in sequentieller Kombination (PEG-ASNase gefolgt von Saquinavir) für verschiedene Arzneimittelkonzentrationen.
  • 4 zeigt die T-Zellen-Zytotoxizität von PEG-ASNase und Saquinavir allein und in sequentieller Kombination (Saquinavir gefolgt von PEG-ASNase) für verschiedene Arzneimittelkonzentrationen.
  • 5 zeigt die T-Zytotoxizität von PEG-ASNase und Saquinavir allein und in gleichzeitiger Kombination für verschiedene Arzneimittelkonzentrationen.
  • 6 zeigt den T-Zellen-Synergismus von PEG-ASNase und Saquinavir in gleichzeitiger Kombination für verschiedene Arzneimittelkonzentrationen.
  • 7 zeigt den Kombinationsindex (C1) in CEM/0 der sequentiellen Kombination von Saquinavir gefolgt von PEG-ASNase, der sequentiellen Kombination von PEG-ASNase gefolgt von Saquinavir sowie der gleichzeitigen Kombination von PEG-ASNase und Saquinavir.
  • 8 zeigt die Erschöpfung der Asparagin-, Glutamin- und Asparaginsäure-Konzentration in den CEM/0-T-Zellen, nachdem diese 24 Stunden lang verschiedenen Konzentrationen von PEG-ASNase ausgesetzt wurden.
  • 8a zeigt eine Kalibrationskurve der optischen Dichte (OD) verschiedener Konzentrationen von HIV-1-RT.
  • 9 zeigt die Anzahl der HIV-RNS-Kopien pro Zellpellet, nachdem die Zellen PEG-ASNase und Saquinavir allein und in Kombination ausgesetzt wurden.
  • 9a zeigt Log10 der Anzahl der HIV-RNS-Kopien pro Zellpellet, nachdem die Zellen PEG-ASNase und Saquinavir allein und in Kombination ausgesetzt wurden.
  • 10 zeigt die Kalibrationskurven für den HIV-RT-Elisa-Test.
  • 11 zeigt den quantitativen HIV-1-RNS-Test von CEM-T-Zellen, die jeweils mit einem Einzelregime von PEG-ASNase, Saquinavir, AZT oder MISID oder einem Kombinationsregime von Saquinavir und PEG-ASNase, AZT, Saquinavir und PEG-ASNase oder MISID, AZT, Saquinavir und PEG-ASNase behandelt wurden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die nachstehenden Begriffe werden in dieser gesamten Beschreibung, wenn nicht anders vermerkt, unter den folgenden, schon oben gebrauchten Bedeutungen verstanden:
  • "Analogon" bedeutet eine Substanz, die eine chemisch modifizierte Form einer speziellen Verbindung oder Verbindungsklasse darstellt und die gleichen pharmazeutischen und/oder pharmakologischen Aktivitäten aufweist, die für die genannte Verbindung oder Verbindungsklasse charakteristisch sind.
  • "Carboxy" bezeichnet eine HO(O)C- (Carbonsäure)-Gruppe.
  • "Verbindungen der Erfindung" und äquivalente Ausdrücke bezeichnen die Verbindungen der Erfindung, wie im Vorangegangenen beschrieben. Der Ausdruck umfasst auch die Prodrugs, die pharmazeutisch akzeptablen Salze sowie die Solvate, z. B. Hydrate, wenn dies der Zusammenhang erlaubt. In gleicher Weise werden mit Zwischenprodukten, ob sie Gegenstand des Anspruchs sind oder nicht, auch deren Salze und Solvate angesprochen, wenn dies der Zusammenhang erlaubt. Aus Gründen der Klarheit werden im Text manchmal, wenn es der Zusammenhang erlaubt, besondere Ausprägungen des Produkts genannt. Dies dient lediglich zur Illustration und schließt andere Ausprägungen nicht aus, wenn es der Zusammenhang erlaubt.
  • "Derivat" bezeichnet eine chemisch modifizierte Verbindung, bei der es sich für einen Chemiker von gewöhnlichem Kenntnisstand um eine Routinemodifikation handelt, wie etwa einen Ester oder ein Amid einer Säure, Schutzgruppen, z. B. eine Benzylgruppe für einen Alkohol oder ein Thiol, und die tert-Butoxycarbonyl-Gruppe für ein Amin.
  • "Wirksame Menge" bezeichnet die Menge einer Verbindung/Zusammensetzung, die nach der vorliegenden Erfindung geeignet ist, die gewünschte therapeutische Wirkung hervorzurufen.
  • "Formulierungen zur Verabreichung auf nasalem Wege oder durch Inhalation" sind Formulierungen, die eine solche Form aufweisen, dass sie geeignet sind, einem Patienten auf nasalem Wege oder durch Inhalation verabreicht zu werden. Die Formulierung kann einen Träger in Pulverform enthalten, dessen Partikelgröße beispielsweise zwischen 1 und 500 Mikron beträgt (einschließlich Partikelgrößen im Bereich von 20 bis 500 Mikron, die jeweils in Schritten von 5 Mikron erhöht werden, d. h. 30 Mikron, 35 Mikron usw. betragen). Geeignete Formulierungen mit flüssigem Träger, die z. B. als Nasenspray oder Nasentropfen zu verabreichen sind, enthalten wässrige oder ölige Lösungen des aktiven Bestandteils. Formulierungen, die zur Verabreichung als Aerosol geeignet sind, können mit herkömmlichen Methoden zubereitet und mit anderen Wirkstoffen zusammen abgegeben werden. Die Inhalationsbehandlung wird problemlos mit gezielt dosierbaren Inhalationsgeräten vorgenommen.
  • "Formulierungen zur oralen Verabreichung" sind Formulierungen, die eine solche Form aufweisen, dass sie geeignet sind, einem Patienten auf oralem Wege verabreicht zu werden. Die Formulierungen können in folgenden Formen dargereicht werden: in diskreten Einheiten wie Kapseln, Päckchen oder Tabletten, wo jede Einheit eine bestimmte Menge des Wirkstoffes enthält; als Pulver oder Granulat; als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit; als flüssige Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsion. Der Wirkstoff kann auch als Bolus, Electuarium oder Paste dargereicht werden.
  • "Formulierungen zur parenteralen Verabreichung" sind Formulierungen, die eine solche Form aufweisen, dass sie geeignet sind, einem Patienten auf parenteralem Wege verabreicht zu werden. Die Formulierungen sind steril, weisen einen geeigneten, an das Blut des vorgesehenen Empfängers angepassten pH-Wert auf und umfassen Emulsionen, Suspensionen sowie wässrige und nicht-wässrige Injektionslösungen, die Suspensionsmittel, Verdickungsmittel, Antioxidantien, Puffer, Bakteriostate sowie Stoffe zur Isotonisierung der Formulierung enthalten können.
  • "Formulierungen zur rektalen Verabreichung" sind Formulierungen, die eine solche Form aufweisen, dass sie geeignet sind, einem Patienten auf rektalem Wege verabreicht zu werden. Die Formulierung hat vorzugsweise die Form eines Suppositoriums, bei dem die nach dieser Erfindung nützlichen Substanzen mit geeigneten, nicht reizenden Arzneistoffträgern oder Trägerstoffen wie Kakaobutter, Polyethylenglykol oder Suppositoriumswachs vermischt werden. Diese Träger sind bei normalen Temperaturen fest und verflüssigen sich bei Körpertemperatur, so dass sie im Rektum oder in der Vagina schmelzen und die aktive Komponente freisetzen.
  • "Formulierungen zur systemischen Verabreichung" sind Formulierungen, die eine solche Form aufweisen, dass sie geeignet sind, einem Patienten auf systemischem Wege verabreicht zu werden. Die Formulierung wird vorzugsweise durch Injektion verabreicht, insbesondere transmuskulär, intravenös, intraperitoneal und subkutan. Für die Injektion werden die nach dieser Erfindung nützlichen Substanzen in flüssigen Lösungen formuliert, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern wie einer Hank's- oder Ringer-Lösung. Zusätzlich können die Verbindungen in fester Form formuliert und unmittelbar vor der Anwendung aufgelöst oder suspendiert werden. Lyophilisierte Formen sind ebenfalls möglich. Die systemische Verabreichung kann auch transmukosal oder transdermal erfolgen, oder die Substanzen werden oral verabreicht. Im Falle der transmukosalen oder transderrmalen Verabreichung enthält die Formulierung zur Durchdringung der entsprechenden Barriere geeignete Penetriermittel. Solche Penetriermittel sind einschlägig bekannt und umfassen Gallensalze und Fusidinsäurederivate für die transmukosale Verabreichung. Zur Erleichterung der Permeation können auch Detergenzien eingesetzt werden. Die transmukosale Verabreichung kann durch Nasensprays oder beispielsweise Suppositorien erfolgen. Im Falle der oralen Verabreichung sind die Substanzen in den herkömmlichen Verabreichungsformen wie Kapseln, Tabletten und Tonika formuliert.
  • "Formulierungen zur topischen Verabreichung" sind Formulierungen, die eine solche Form aufweisen, dass sie geeignet sind, einem Patienten auf topischem Wege verabreicht zu werden. Die Formulierung kann in folgenden Formen dargereicht werden: als topische Salbe, Puder, Spray, Inhalat, Gel (auf Wasser- oder Alkoholbasis), Creme, wie einschlägig bekannt, oder in eine Matrix eingelagert für die Anwendung als Pflaster, welches eine kontrollierte Freisetzung der Substanz durch die transdermale Barriere ermöglicht. Im Falle der Formulierung als Salbe können die Wirkstoffe entweder auf Paraffinbasis oder mit einer mit Wasser mischbaren Salbengrundlage eingesetzt werden. Alternativ können die Wirkstoffe in einer Creme auf Öl-in-Wasser-Basis formuliert werden. Bei Formulierungen zur topischen Verabreichung im Auge handelt es sich insbesondere um Augentropfen, in denen der Wirkstoff gelöst oder in einem geeigneten Trägerstoff suspendiert ist, besonders in einem wässrigen Lösungsmittel für den Wirkstoff. Formulierungen zur topischen Verabreichung im Mund umfassen folgende Darreichungsformen: Pastillen, die den Wirkstoff in einer mit Geschmackseigenschaften versehenen Grundsubstanz enthalten, gewöhnlich Saccharose und Gummi arabicum oder Tragantgummi; Pastillen, die den Wirkstoff in einer inaktiven Grundsubstanz enthalten wie Gelatine und Glyzerin oder Saccharose und Gummi arabicum; Mundspülungen, die den Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger enthalten.
  • "Formulierungen zur vaginalen Verabreichung" sind Formulierungen, die eine solche Form aufweisen, dass sie geeignet sind, einem Patienten auf vaginalem Wege verabreicht zu werden. Die Formulierung kann in folgenden Formen dargereicht werden: als Pessar, Tampon, Creme, Gel, Paste, Schaum oder Spray, wobei zusätzlich zum Wirkstoff Trägerstoffe enthalten sind, die einschlägig als geeignet anerkannt sind.
  • "Flüssigdosierungsform" bedeutet, dass die Wirkstoffdosis dem Patienten in flüssiger Form verabreicht wird, beispielsweise als pharmazeutisch akzeptable Emulsion, Lösung, Suspension, Sirup und Elixiere. Flüssigdosisformen können außer den aktiven Verbindungen die üblicherweise verwendeten inaktiven Verdünnungsmittel enthalten. Dazu gehören Wasser und andere Lösungsmittel, Lösungshilfsmittel und Emulgatoren, wie z. B. Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Diethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butandiol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Rizinusöl und Sesamöl, Glyzerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitan oder Mischungen dieser und ähnlicher Substanzen.
  • "Patient" bezeichnet sowohl Menschen als auch andere Säugetiere.
  • "PEG-ASNase" bezeichnet die Proteinsynthese-Inhibitor-Verbindung Asparaginase konjugiert mit Polyethylenglykol (PEG). Das durchschnittliche Molekulargewicht von Polyethylenglykol liegt vorzugsweise zwischen etwa 1000 und 100.000 Dalton, besser zwischen 4000 and 40.000 Dalton. Dies hängt beispielsweise vom Molekulargewicht der speziellen zum Einsatz kommenden Proteinsynthese-Inhibitor-Verbindung ab. Ziel der Modifikation ist ein konjugiertes Protein mit unveränderter biologischer Aktivität, einer gegenüber der unkonjugierten Proteinsynthese-Inhibitor-Verbindung verlängerten Halbwertszeit in vivo und reduzierter Immunogenität. Das Molekulargewicht des Polymers wird so gewählt, dass diese Bedingungen optimal erfüllt sind. Vorzugsweise ist das PEG-Homopolymer an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert, es kann aber auch unsubsituiert sein. Bei dieser Alkylgruppe handelt es sich vorzugsweise um eine C1-C4-Alkylgruppe und am besten um eine Methylgruppe. Das Polymer ist vorzugsweise ein Monomethyl-substituiertes PEG-Homopolymer und hat ein Molekulargewicht zwischen etwa 4000 bis 40.000 Dalton. Im Idealfall ist PEG-ASNase die unter dem Namen ONCASPAR von Rhône-Poulenc Rorer vertriebene Verbindung.
  • "Pharmazeutische Zusammensetzung" bezeichnet eine Zusammensetzung, die eine Verbindung der Erfindung und mindestens eine Komponente, ausgewählt aus folgender Gruppe, umfasst: Pharmazeutisch annehmbare Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Hilfsstoffe, Arzneistofflräger oder andere Träger wie Konservierungsstoffe, Füllstoffe, Aufschlussmittel, Benetzungsmittel, Emulgatoren, Suspensionsmittel, Süßungsmittel, Geschmacksstoffe, Duftstoffe, antibakterielle Wirkstoffe, Fungizide, Gleitmittel und Dispensiemittel je nach der Verabreichungsund Dosierungsart. Beispiele für Suspensionsmittel sind ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylen-Sorbitol- und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminum-Metahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant sowie Mischungen dieser Substanzen. Mikroorganismentätigkeit kann durch den Einsatz verschiedener antibakterieller Mittel und Fungizide, z. B. Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Sorbinsäure und ähnliche wirksam verhütet werden. Es kann außerdem wünschenswert sein, isotonisierende Stoffe wie Zucker und Natriumchlorid und ähnliche miteinzubeziehen. Durch die Anwendung absorptionsverzögernder Stoffe kann eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form erreicht werden. Solche Stoffe sind z. B. Aluminiummonosterat und Gelatine. Beispiele für geeignete Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Trägersubstanzen und Lösungsmittel sind Wasser, Ethanol, Polyole, geeignete Mischungen davon, Pflanzenöle (z. B. Olivenöl) sowie injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Beispiele für Arzneistoffträger sind Laktose, Milchzucker, Natriumcitrat, Calciumcarbonat, Dicalciumphosphat. Beispiele für Aufschlussmittel sind Stärke, Alginsäuren sowie gewisse komplexe Silikate. Beispiele für Gleitmittel sind Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat, Talkum sowie Polyethylenglykole von hohem Molekulargewicht.
  • "Pharmazeutisch akzeptabel" ist eine Substanz, die nach fundiertem medizinischem Urteil für den Gebrauch in Kontakt mit menschlichen Zellen und den Zellen niedererer Tiere geeignet ist, ohne dass ungebührliche Toxizitäten, Irritationen, allergische Reaktionen u. ä. auftreten, und ein vernünftiges Verhältnis von Nutzen und Risiko aufweist.
  • "Pharmazeutisch akzeptable Dosierungsformen" bezeichnet Dosierungsformen der Verbindung der Erfindung. Dazu gehören z. B. Tabletten, Dragees, Pulver, Elixiere, Sirups, flüssige Zubereitungen, einschließlich Suspensionen, Sprays, Inhalate, Pastillen, Emulsionen, Lösungen, Granulate, Kapseln und Suppositorien sowie flüssige Zubereitungen für Injektionen, einschließlich Liposomenpräparate. Die Techniken und Formulierungen sind in der letzten Ausgabe von Pharmaceutical Sciences von Remington, Mack Publishing Co., Easton, PA, beschrieben.
  • "Pharmazeutisch akzeptable Prodrugs" bezeichnet hier solche Prodrugs der gemäß dieser Erfindung nützlichen Substanzen, die nach fundiertem medizinischen Urteil für den Gebrauch in Kontakt mit menschlichen Geweben und den Geweben niedererer Tiere geeignet sind, ohne dass ungebührliche Toxizitäten, Irritationen, allergische Reaktionen u. ä. auftreten, ein vernünftiges Verhältnis von Nutzen und Risiko aufweisen und ihren Verwendungszweck erfüllen, sowie, soweit möglich, die Zwitterionenformen der Verbindungen der Erfindung. Der Begriff "Prodrug" bezeichnet Substanzen, die in vivo rasch in die Ausgangsverbindung der Erfindung transformiert werden, beispielsweise durch Hydrolyse im Blut. Die funktionellen Gruppen, die im Stoffwechsel schnell gespalten werden können, bilden in vivo eine Klasse von Stoffgruppen, die mit der Carboxylgruppe der Verbindungen dieser Erfindung reagieren. Dazu gehören unter anderen folgende Gruppen: Alkanoyl (wie Acetyl, Propionyl, Butyryl und ähnliche), unsubstituiertes und substituiertes Aroyl (wie Benzoyl und substituiertes Benzoyl), Alkoxycarbonyl (wie Ethoxycarbonyl), Trialkylsilyl (wie Trimethyl- und Triethylsilyl), mit Dicarbonsäuren gebildete Monoester (wie Succinyl) und ähnliche. Aufgrund der Leichtigkeit, mit der die metabolisch spaltbaren Gruppen von gemäß dieser Erfindung nützlichen Substanzen in vivo gespalten werden, agieren die Verbindungen, die solche Gruppen tragen, als Prodrugs. Die Verbindungen mit metabolisch spaltbaren Gruppen haben den Vorteil einer eventuell verbesserten Bioverfügbarkeit. Dies ist das Ergebnis der verbesserten Löslichkeit und/oder Absorptionsrate, die dank der Gegenwart der metabolisch spaltbaren Gruppe auf die Ausgangsverbindung übertragen wird. Prodrugs werden in folgenden Arbeiten ausführlich besprochen: Design of Prodrugs, H. Bundgaard, ed., Elsevier, 1985; Methods in Enzymology,. K. Widder et al., Ed., Academic Press, 42, p.309–396,1985; A Textbook of Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen and H. Bundgaard, ed., Chapter 5; "Design and Applications of Prodrugs" p.113–191, 1991; Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgard, 8, p.1–38,1992; Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, p. 285,1988; Chem. Pharm. Bull., N. Nakeya et al, 32, p. 692,1984; Pro-drugs as Novel Delivery Systems, T. Higuchi and V. Stella, Vol. 14 of the A. C. S. Symposium Series, and Bioreversible Carriers in Drug Design, Edward B. Röche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987. Diese Artikel werden durch Referenz in das vorliegende Dokument integriert.
  • "Pharmazeutisch akzeptable Salze" bezeichnet die relativ nicht-toxischen organischen und anorganischen, sauren und basischen Salze, die den Verbindungen der vorliegenden Erfindung hinzugefügt werden. Diese Salze können in situ während der endgültigen Isolierung und Reinigung der Verbindungen hergestellt werden. Insbesondere können saure Zusatzsalze hergestellt werden, indem die gereinigte Verbindung in ihrer freien basischen Form mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure separat zur Reaktion gebracht und das so gebildete Salz isoliert wird. Beispiele für saure Zusatzsalze sind: Hydrobromide, Hydrochloride, Sulfate, Bisulfate, Phosphate, Nitrate, Acetate, Oxalate, Valerate, Oleate, Palmitate, Stearate, Laurate, Borate, Benzoate, Laktate, Phosphate, Tosylate, Citrate, Maleate, Fumarate, Succinate, Tartrate, Naphthylate, Mesylate, Glucoheptonate, Lactobionate, Sulfamate, Malonate, Salicylate, Propionate, Methylen-bis-b-hydroxynaphthoate, Gentisate, Isethionate, Di-p-toluoyltartrate, Methansulfonate, Ethansulfonate, Benzolsulfonate, p-Toluolsulfonate, Cyclohexylsulfamate, Chinatlaurylsulfonat-Salze und ähnliche (Siehe z. B. den Artikel S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 66: p.1–19 (1977), der durch Referenz in das vorliegende Dokument integriert ist.). Basische Zusatzsalze können auch hergestellt werden, indem die gereinigte Verbindung in ihrer sauren Form mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Base separat zur Reaktion gebracht und das so gebildete Salz isoliert wird. Basische Zusatzsalze umfassen pharmazeutisch akzeptable Metall- und Aminsalze. Die geeigneten Metallsalze umfassen Natrium-, Kalium-, Calcium-, Barium-, Zink-, Magnesium- und Aluminumsalze. Den Natriumund Kaliumsalzen wird der Vorzug gegeben. Geeignete anorganische basische Zusatzsalze werden aus Metallbasen hergestellt, zu denen die folgenden gehören: Natriumhydrid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Aluminiumhydroxid, Lithiumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Zinkhydroxid. Geeignete Zusatzsalze aus Aminbasen werden aus Aminen hergestellt, die basisch genug sind, um ein stabiles Salz zu bilden, und vorzugsweise zu denjenigen Aminen gehören, die in der medizinischen Chemie aufgrund ihrer geringen Toxizität und Verträglichkeit mit medizinischer Anwendung häufig gebraucht werden. Ammoniak, Ethylendiamin, N-methylglucamin, Lysin, Arginin, Ornithin, Cholin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chlorprocain, Diethanolamin, Procain, N-Benzylphenethylamin, Diethylamin, Piperazin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Tetramethylammoniumhydroxid, Triethylamin, Dibenzylamin, Ephenamin, Dehydroabietylamin, N-Ethylpiperidin, Benzylamin, Tetramethylammonium, Tetraethylammonium, Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Ethylamin, basische Aminosäuren, z. B. Lysin und Arginin, Dicyclohexylamin und ähnliche.
  • "Feste Dosierungsform" heißt, dass die Dosierungsform der gemäß der Erfindung nützlichen Verbindung fest ist, d.h. beispielsweise in Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver, Dragees oder Granulat besteht. In solchen festen Dosierungsformen wird die gemäß der Erfindung nützliche Verbindung mindestens einem inaktiven, speziell geeigneten Arzneistoffträger (oder Trägerstoff) beigemischt, wie Natriumcitrat, Dicalciumphosphat oder (a) Füllstoffen oder Streckmitteln wie z. B. Stärken, Laktose, Saccharose, Glukose, Mannitol und Kieselsäure, (b) Bindemitteln wie z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und Gummi arabicum, (c) Feuchthaltemitteln wie z. B. Glycerin, (d) Aufschlussmitteln wie z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, gewisse komplexe Silikate und Natriumcarbonat, (e) Lösungsverzögerungsmitteln wie z. B. Paraffin, (f) Absorptionsbeschleunigungsmitteln wie z. B. quartäre Ammoniumverbindungen, (g) Benetzungsmitteln wie z. B. Cetylalkohol und Glycerinmonostearat, (h) Adsorptionsmitteln wie z. B. Kaolin und Bentonit, (i) Gleitmitteln wie z. B. Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat, (j) Trübungsmitteln, (k) Puffern und Wirkstoffen, welche die gemäß der Verbindung nützliche(n) Verbindungen) verzögert in einem bestimmten Teil des Magen-Darm-Traktes freisetzen.
  • "Solvat" bezeichnet eine physikalische Assoziation einer Verbindung dieser Erfindung mit einem oder mehreren Lösungsmittelmolekülen. Diese physikalische Assoziation bezieht auch die Wasserstoffbrückenbindung mit ein. In gewissen Fällen ist das Solvat zur Isolierung fähig, beispielsweise dann, wenn ein oder mehrere Lösungsmittelrmoleküle in das Kristallgitter des kristallinen Feststoffes eingebaut sind. Der Begriff "Solvat" umfasst sowohl Solvate in der Lösungsphase als auch rein darstellbare Solvate. Beispiele für Solvate sind Hydrate, Ethanolate, Methanolate und ähnliche.
  • In einer speziellen Verkörperung bedeutet der Begriff "etwa" oder "annähernd" innerhalb 20%, vorzugsweise innerhalb 10% und Idealerweise innerhalb 5% eines gegebenen Wertes oder Wertebereiches.
  • Bevorzugte Verkörperungen
  • Eine gemäß der Erfindung bevorzugte Verkörperung ist die Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) aus einer PEG-ASNase-Verbindung.
  • Eine andere gemäß der Erfindung bevorzugte Verkörperung ist die Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) aus einer PEG-ASNase-Verbindung und mindestens einer Proteaseinhibitor-Verbindung.
  • Eine andere gemäß der Erfindung bevorzugte Verkörperung ist die Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Imniundefizienzvirus (HIV) aus einer PEG-ASNase-Verbindung und mindestens einer HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung.
  • Eine andere gemäß der Erfindung bevorzugte Verkörperung ist die Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV aus einer PEG-ASNase-Verbindung und mindestens einer Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung aus der unten definierten Gruppe.
  • Eine andere gemäß der Erfindung bevorzugte Verkörperung ist die Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) aus einer PEG-ASNase-Verbindung, mindestens einer Proteaseinhibitor-Verbindung und mindestens einer solchen Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung.
  • Eine andere gemäß der Erfindung bevorzugte Verkörperung ist die Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) aus einer PEG-ASNase-Verbindung, mindestens einer Proteaseinhibitor-Verbindung und mindestens einer HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung.
  • Eine andere gemäß der Erfindung bevorzugte Verkörperung ist die Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus(HIV) aus einer PEG-ASNase-Verbindung, mindestens einer Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung und mindestens einer HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung.
  • Eine andere gemäß der Erfindung bevorzugte Verkörperung ist die Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) aus einer PEG-ASNase-Verbindung, mindestens einer Proteaseinhibitor-Verbindung, mindestens einer solchen Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung und mindestens einer HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung.
  • Eine andere gemäß der Erfindung bevorzugte Verkörperung ist die Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung der Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) aus einer PEG-ASNase-Verbindung und mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteaseinhibitor-Verbindungen, solchen Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen und HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen.
  • Gemäß einer bevorzugten Verkörperung der Erfindung werden die Proteaseinhibitor-Verbindungen ausgewählt aus Saquinavir, Nelfinavir, Endinovere, Indinavir, Ritonavir, Crixivan, Viracept, Norvir und VX-478.
  • Gemäß einer stärker bevorzugten Verkörperung der Erfindung ist die Proteaseinhibitor-Verbindung Saquinavir.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Verkörperung der Erfindung werden die HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen ausgewählt aus AZT (Retrovir, Zidovudin) ddI (Videx, Didanosin) ddC (Hivid, Zalcitabin), d4T (Zerit, Stavudin) und 3TC (Epivir, Lamivudin).
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Verkörperung der Erfindung ist die HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung AZT.
  • Die Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen werden ausgewählt aus Hydroxyharnstoff (HU), BW-348U87, 3-Aminopyridin-2-carboxaldehydthiosemicarbazon (3-AP) Amidox (VF 236; NSC-343341; N,3,4-Trihydroxybenzolcarboximidamid), BILD 1257 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L-(3,3-tetramethylen)aspartyl-L-(4-methyl)leucin), BILD 1357 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L-(3,3-tetramethylen)asparaginsäure 1-[1(R)-ethyl-2,2-dimethylpropylamid]), BILD 1633, BILD 733 (3-Phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-[3-methyl)valyl-L-[3-(pyrrolidin-1-ylcarbonyl)]alanyl-L-(1-carboxycyclopentyl)glycyl-L-(4-methyl)leucinol), BILD 1263 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L-(3,3-tetramethylen)aspartyl-L-(4-methyl)leucinol), BILD 1351 (1-[1(S)-[5(S)-[3-[(all-cis)-2,6-dimethylcyclohexyl]ureido]-2(S)-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-6,6-dimethyl-4-oxoheptanoylamino]-1-[1(R)-ethyl-2,2-dimethylpropylcarbamol]methyl]cyclopentancarbonsäure]), Cl-F-araA (2-Chlor-9-(2-desoxy-2-fluor-beta-D-arabinofuranosyl)adenin), DDFC (2'-Desoxy-2',2'-difluorcytidin), Didox (VF 147; NSC 324360; N,3,4-Trihydroxybenzamid), Eurd (3'-Ethynyluridin), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-Isochinolylmethan-N-hydroxy-N'-aminoguanin), LY 207702 (2',2'-Difluor-2'desoxyribofuranosyl-2,6-diaminopurin), LY 295501 N-[[3,4-Dichlorphenyl)amino]carbonyl]2,3-dihydro-5-benzofuransulfonamid), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-Desoxy-2'(fluormethylen)cytidin), Parabactin, Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-Chlorphenyl)amino]carbonyl]-2,3-dihydro-1H-inden-5-sulfonamid), TAS 106 (Ecyd; 3'-Ethynylcytidin),Triapin (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-Tetrahydroxybenzolcarboximidamid) und einer Verbindung aus Formel I.
  • Eine andere bevorzugte Verkörperung der Erfindung ist eine Zusammensetzung,umfassend eine Kombination aus einer PEG-ASNase-Verbindung und mindestens einer Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung wie oben definiert und mindestens einer HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung.
  • Ein weiterer Zweck der Erfindung ist es, Bausätze mit einer Vielzahl aktiver Bestandteile (mit oder ohne Träger) zur Verfügung zu stellen, die zusammen wirksam zur Durchführung der neuen Kombinationstherapien der Erfindung verwendet werden können.
  • Ein weiterer Zweck der Erfindung ist es, eine neue pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die in sich selbst und aus sich selbst heraus in einer nützlichen Kombinationstherapie wirksam ist, weil sie eine Vielzahl von aktiven Bestandteilen enthält, die gemäß der Erfindung verwendet werden können.
  • Ohne Einschränkungen durch die Theorie besteht die Überzeugung, dass die Erfindung mit dem nachfolgend beschriebenen Mechanismus arbeitet. T-Zellen sind diejenigen Zellen im Körper eines Säugetiers, die hauptsächlich mit dem HIV-Virus infiziert werden. Die T-Zellen werden als die viralen Fabrikationsstätten für die HIV-Infektion angesehen. Um neue T-Zellen infizieren zu können, muss das HIV-Virus in die T-Zelle eindringen und in der Lage sein, sich zu replizieren. Für den viralen Replikations- und Einkapselungsprozess ist die Mitwirkung intrazellulärer Enzyme erforderlich. Es wurde gezeigt, dass PEG-ASNase, eine spezielle Verbindung, die die Proteinsynthese in Thymus-Zelllinien hemmt, sehr gut dazu geeignet ist, die Synthese der für eine ausreichende Replikation und den Aufbau des HIV-Virus erforderlichen Enzyme zu inhbieren und weitere antiproliferative Wirkungen gegenüber dem HIV-Virus zu entwickeln. Weiterhin hat eine Kombination aus PEG-ASNase und einer oder mehreren Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Proteaseinhibitor-Verbindung, einer HIV-RT-Inhibitor-Verbindung und einer Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung, eine synergistische Wirkung dahingehend, dass die Viruslast für längere Zeitperioden reduziert wird. Der intrazelluläre Mechanismus, mit dem PEG-ASNase der Überzeugung nach arbeitet, besteht darin, eine mit dem HIV-Virus infizierte T-Zelle daran zu hindern, intrazelluläre und virale Proteine zu synthetisieren, indem die Versorgung mit der Aminosäure Asparagin (Asn) beeinträchtigt wird. Daher wird durch die Behandlung infzierter T-Zellen mit einer Asparaginase wie PEG-ASNase die Synthese des Zell- und Virusproteins gehemmt. Diese Proteine sind notwendig für die Transkription und Translation der viral codierten Gene von der in das Provirus integrierten DNS viralen Ursprungs in die DNS des Säugetiers. Wenn die RNS viralen Ursprungs durch vom Provirus stammende RNS-Polymerasen transkribiert ist, können zwei Wege beschritten werden. Die RNS kann durch Ribonucleotide dazu verwendet werden, Virusproteine wie HIV-RT zu produzieren. Später kann dieselbe RNS durch Rev-Protein in genomische HIV-1-RNS verarbeitet werden. Die RNS wird an eine bereits synthetisierte HIV-RT angefügt, und wenn zwei solche Moleküle vorhanden sind, bilden sie gemeinsam das genomische Material eines neuen HIV-Virus. HIV-Proteasen sind an der Verarbeitung der Virusproteine in die endgültige Verpackung des Virus beteiligt. Danach kann die Knospung des neuen HIV-1-Virus aus der T-Zelle als ein neues, vollständiges Virus stattfinden. Daher kann eine Proteaseinhibitor-Verbindung in Kombination mit einer Asparaginase wie PEG-ASNase die zur Replikation des HIV-1-Virus benötigten Prozesse auf synergistische Weise hemmen.
  • Die Zusammensetzungen und Therapiemethoden der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei der Inhibition von HIV-Protease, der Verhütung oder Behandlung der Infektion durch HIV und der Behandlung nachfolgender pathologischer Zustände wie AIDS. Die Behandlung von AIDS oder Verhütung oder Behandlung der Infektion durch HIV ist insbesondere, aber nicht ausschließlich, definiert durch die Behandlung einer breiten Palette von Zuständen der HIV-Infektion; von AIDS, von im Zusammenhang mit ARG (AIDS) stehender komplexer, sowohl symptomatischer als auch asymptomatischer, tatsächlicher oder potenzieller Exposition gegenüber HIV. Die Verbindungen dieser Erfindung sind beispielsweise nützlich bei der Behandlung der Infektion durch HIV nach einer vermuteten Exposition gegenüber HIV in der Vergangenheit durch z. B. Bluttransfusion, den Austausch von Körperflüssigkeiten, Bisse, unbeabsichtigte Nadelstiche sowie Exposition gegenüber Patientenblut während einer Operation.
  • Bei der Behandlungs- oder Verhütungsmethode gemäß der Erfindung kann die PEG-ASNase-Verbindung und bei Bedarf eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Proteaseinhibitor-Verbindung, einer HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung und einer Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung, auf verschiedene Weisen verabreicht werden, wie z. B. in Kombinationstherapien, die bei Bedarf medizinische Verfahren einsetzen. Beispielsweise können eine PEG-ASNase-Verbindung und bei Bedarf eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteaseinhibitor-Verbindungen, HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen und Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen einem Patienten gemeinsam oder zu verschiedenen Zeiten verabreicht werden, vorausgesetzt, sie werden so verabreicht, dass während einer gewissen Zeitperiode pharmazeutisch wirksame Mengen beider Verbindungen im Patienten vorhanden sind, so dass die therapeutische Wirkung gemäß der Erfindung eintreten kann.
  • Daher ist es ein weiterer Gegenstand der Erfindung, einen Bausatz für die Behandlung oder Verhütung eines mit HIV assoziierten physiologischen Zustandes bereitzustellen, wobei der genannte Bausatz aus einer Vielzahl separater Behälter besteht, von denen mindestens einer eine PEG-ASNase-Verbindung und mindestens ein weiterer der genannten Behälter eine oder mehrere Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteaseinhibitor-Verbindungen, HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen und Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen, enthält und die genannten Behälter bei Bedarf einen pharmazeutischen Träger enthalten, wobei der genannte Bausatz wirksam zur Ausführung von Kombinationstherapien gemäß der Erfindung genutzt werden kann.
  • Daher ist es ein weiterer Gegenstand der Erfindung, einen Bausatz für die Behandlung oder Verhütung eines mit HIV assoziierten physiologischen Zustandes bereitzustellen, wobei der genannte Bausatz aus einer Vielzahl separater Behälter besteht, von denen mindestens einer eine Verbindung aus Formel I und mindestens ein weiterer eine oder mehrere Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PEG-ASNase-Verbindungen, Proteaseinhibitor-Verbindungen, HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen und Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen, enthält und die genannten Behälter bei Bedarf einen pharmazeutischen Träger enthalten, wobei der genannte Bausatz wirksam zur Ausführung von Kombinationstherapien gemäß der Erfindung genutzt werden kann.
  • Es versteht sich, dass die Erfindung alle angemessenen Kombinationen der hier genannten besonderen und bevorzugten Gruppierungen abdeckt.
  • Die der Erfindung entsprechenden Verbindungen, beispielsweise Ausgangsmaterialien, Zwischenprodukte und Produkte, werden wie hier beschrieben oder durch Anwendung oder Anpassung bekannter Methoden hergestellt, worunter bis dahin benutzte oder in der Literatur beschriebene Methoden zu verstehen sind.
  • Die gemäß der Erfindung nützlichen Verbindungen werden bei Bedarf als Salze bereitgestellt. Diejenigen Salze, die pharmazeutisch akzeptabel sind, sind von besonderem Interesse, da sie nützlich zur Verabreichung der vorhergenannten Verbindungen für medizinische Zwecke sind. Salze, die nicht pharmazeutisch akzeptabel sind, dienen in Herstellungsprozessen zu Isolations- und Reinigungszwecken sowie in manchen Fällen zur Trennung stereoisomerer Formen der Verbindungen dieser Erfindung. Letzteres gilt besonders für Aminsalze, die aus optisch aktiven Aminen hergestellt werden.
  • Wenn die gemäß der Erfindung nützliche Verbindung eine Carbonsäuregruppe oder ein ausreichend saures Bioisoster enthält, können basische Zusatzsalze gebildet werden, die einfach eine angenehmer anzuwendende Form bilden; in der Praxis läuft die Anwendung der Salzform auf das gleiche hinaus wie die Anwendung der freien sauren Form.
  • Wenn die gemäß der Erfindung nützliche Verbindung eine basische Gruppe oder ein ausreichend basisches Bioisoster enthält, können saure Zusatzsalze gebildet werden, die einfach eine angenehmer anzuwendende Form bilden; in der Praxis läuft die Anwendung der Salzform auf das gleiche hinaus wie die Anwendung der freien basischen Form.
  • Die oben genannten gemäß der Erfindung nützlichen Verbindungen können auch mit einer anderen therapeutischen Verbindung zu pharmazeutischen Zusammensetzungen gemischt werden (mit oder ohne Verdünnungsmittel oder Träger), die, wenn verabreicht, die gleichzeitige Verabreichung einer Kombination von aktiven Bestandteilen darstellen und damit eine Kombinationstherapie der Erfindung liefern.
  • Obgleich die gemäß der Erfindung nützlichen Verbindungen allein verabreicht werden können, ist ihre Darreichung als pharmazeutische Zusammensetzungen vorzuziehen. Die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlichen pharmazeutischen Zusammensetzungen, sowohl für den Einsatz am Menschen als auch am Tier, bestehen aus mindestens einer Verbindung der Erfindung, wie oben definiert, zusammen mit einem oder mehreren dafür akzeptablen Trägern und bei Bedarf weiteren therapeutischen Inhaltsstoffen.
  • In gewissen vorzuziehenden Verkörperungen können die in einer Kombinationstherapie notwendigen aktiven Bestandteile in einer einzigen pharmazeutischen Zusammensetzung zur gleichzeitigen Verabreichung kombiniert werden.
  • Die Wahl des Trägers und der Gehalt an aktiver Substanz im Träger werden im Allgemeinen in Übereinstimmung mit den Löslichkeits- und chemischen Eigenschaften der aktiven Verbindung, der besonderen Verabreichungsart und den in der pharmazeutischen Praxis zu beobachtenden Vorkehrungen bestimmt. Zum Beispiel können Arzneistoffträger wie Laktose, Natriumcitrat, Calciumcarbonat, Dicalciumphosphat und Aufschlussmittel wie Stärke, Alginsäuren sowie gewisse komplexe Silikate kombiniert mit Gleitmitteln wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talkum zur Zubereitung von Tabletten verwendet werden. Zur Zubereitung einer Kapsel ist es vorteilhaft, Laktose und Polyethylenglykole von hohem Molekulargewicht zu verwenden. Werden wässrige Suspensionen verwendet, können sie emulgierende oder suspensionserleichternde Stoffe enthalten. Es können auch Verdünnungsmittel wie Saccharose, Ethanol, Polyethylenglykol, Propylenglykol, Glycerin und Chloroform oder Mischungen davon verwendet werden.
  • Die ölige Phase der Emulsionen dieser Erfindung kann aus den bekannten Bestandteilen in bekannter Weise hergestellt werden. Obgleich die ölige Phase lediglich aus einem Emulgator (andererseits bekannt als Reinigungsmittel) bestehen kann, ist es wünschenswert, dass sie aus einer Mischung aus mindestens einem Emulgator mit einem Fett oder einem Öl oder beiden besteht. Vorzugsweise wird ein hydrophiler Emulgator zusammen mit einem lipophilen Emulgator, der als Stabilisator wirkt, zugesetzt. Es ist außerdem vorzuziehen, sowohl ein Öl als auch ein Fett zuzusetzen. Zusammen bilden die Emulgatoren mit oder ohne Stabilisatoren das Emulgierwachs und so zusammen mit dem Öl und dem Fett die emulgierende Salbengrundlage, welche die ölige disperse Phase einer Creme-Formulierung darstellt. Folgende Emulgatoren und Emulsionsstabilisatoren sind für die Formulierung der vorliegenden Erfindung geeignet: Tween® 60, Span® 80, Cetostearylalkohol, Benzylalkohol, Myristylalkohol, Glycerylmonostearat und Natriumlaurylsulfat.
  • Wenn gewünscht, kann die wässrige Phase der Creme auch mindestens 30% w/w eines mehrwertigen Alkohols enthalten, d. h. eines Alkohols mit zwei oder mehr Hydroxylgruppen wie Propylenglykol, Butan-1,3-diol, Mannitol, Sorbitol, Glyzerin und Polyethylenglykol (einschließlich PEG 400) und Mischungen davon. Bei topischen Formulierungen ist es möglicherweise wünschenswert, dass eine Verbindung enthalten ist, welche die Absorption bzw. Penetration des aktiven Bestandteils durch die Haut oder andere betroffene Bereiche fördert. Beispiele für solche dermalen Penetrationsförderer sind Dimethylsulfoxid und verwandte Analoga.
  • Die für die Formulierung geeigneten Öle oder Fette werden so ausgewählt, dass die gewünschten kosmetischen Eigenschaften erreicht werden. Daher sollte die Creme vorzugsweise nicht-fettend, nicht-fleckend und abwaschbar sein und eine solche Konsistenz aufweisen, dass Auslaufen aus Tuben und anderen Behältern verhindert wird. Es können mono- oder dibasische Alkylester mit unverzweigten oder verzweigten Ketten wie Diisopropylmyristat, Decyloleat, Isopropylpalmitat, Butylstearat, 2-Ethylhexylpalmitat oder ein Gemisch von verzweigtkettigen Estern, das unter dem Namen Crodamol CAP bekannt ist, verwendet werden, wobei die drei letztgenannten bevorzugte Ester sind. Diese können je nach den geforderten Eigenschaften allein oder in Kombination eingesetzt werden. Alternativ können Lipide mit hohem Schmelzpunkt, z. B. weißes, weiches Paraffin und/oder flüssiges Paraffin, oder andere Mineralöle verwendet werden.
  • Feste Zusammensetzungen können auch als Füllstoffe in Gelatinekapseln mit weicher oder harter Füllung eingesetzt werden. Dabei werden Arzneistoffträger wie Laktose oder Milchzucker sowie Polyethylenglykole von hohem Molekulargewicht und ähnliche verwendet.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können Mensch und Tier in einer geeigneten Formulierung topisch oder systemisch verabreicht werden, insbesondere oral, durch Inhalation, rektal, nasal, buccal, sublingual, vaginal, parenteral (einschließlich subkutan, intramuskulär, intravenös, intradermal, intrathekal und epidural), intracisternal und intraperitoneal. Günstigerweise können verschiedene Wege beschritten werden, beispielsweise je nach Zustand des Empfängers.
  • Die Formulierungen können in Einheitsdosisforn mit den in der Pharmazie wohlbekannten Methoden hergestellt werden. Bei diesen Methoden besteht ein Schritt darin, den aktiven Bestandteil mit dem Träger zu assoziieren, der einen oder mehrere Hilfsbestandteile darstellt. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem der aktive Bestandteil mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden gleichmäßig und innig vereinigt und danach, falls nötig, das Produkt in Form gebracht wird.
  • Eine Tablette kann durch Pressen oder Gießen hergestellt werden, bei Bedarf mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen. Gepresste Tabletten können hergestellt werden, indem der aktive Bestandteil in einer geeigneten Maschine in frei fließender Form gepresst wird, z. B. als Pulver oder Granulat, bei Bedarf gemischt mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inaktiven Verdünnungsmittel, Konservierungsstoff, oberflächenaktiven oder dispergierenden Mittel. Gegossene Tabletten können hergestellt werden, indem eine Mischung der pulverisierten Substanzen, die mit einem inaktiven flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet ist, in einer geeigneten Maschine gegossen wird. Bei Bedarf können die Tabletten beschichtet oder gekerbt werden. Sie können auch so formuliert werden, dass der darin enthaltene Wirkstoff langsam oder kontrolliert freigesetzt wird.
  • Feste Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung umfassen Suppositorien, die in Übereinstimmung mit bekannten Methoden formuliert werden und mindestens eine Verbindung der Erfindung enthalten.
  • Falls dies gewünscht ist, und um für eine wirksamere Verteilung zu sorgen, können die Verbindungen in Systemen zur langsamen oder gezielten Freisetzung mikroverkapselt oder damit verbunden werden. Dazu gehören z. B. biokompatible und biologisch abbaubare Polymermatrizen (wie Poly(d,l-lactid-co-glycolid)), Liposomen und Mikrosphären. Die Verbindungen können auch subkutan oder intramuskulär mit einer Technik, die als subkutanes oder intramuskuläres Depot bezeichnet wird, injiziert werden, wodurch eine kontinuierliche langsame Freisetzung der Verbindungen) über einen Zeitraum von 2 Wochen oder mehr erreicht wird. Die Sterilisation der Verbindungen kann beispielsweise durch Filtern mit einem Bakterien zurückhaltenden Filter oder durch Hinzufügen von Sterilisationsmitteln in Form steriler fester Zusammensetzungen, die in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor der Anwendung aufgelöst werden, erfolgen.
  • Die tatsächlichen Dosiskonzentrationen des aktiven Bestandteils in den Zusammensetzungen der Erfindung können so variiert werden, dass eine Menge des Wirkstoffes erreicht wird, die zur Erzielung einer gewünschten therapeutischen Reaktion mit einer besonderen Zusammensetzung und Verabreichungsmethode geeignet ist. Die gewählte Dosiskonzentration ist daher abhängig vom gewünschten therapeutischen Effekt, dem Verabreichungsweg, der gewünschten Behandlungsdauer und anderen Faktoren.
  • Die tägliche Gesamtdosis der gemäß dieser Erfindung nützlichen Verbindungen, die einem Wirt in einzelnen oder geteilten Dosen verabreicht wird, kann beispielsweise zwischen etwa 0,001 und etwa 100 mg/kg Körpergewicht täglich und vorzugsweise zwischen 0,01 und 10 mg/kg/Tag liegen. Einheitsdosis-Zusammensetzungen können eine solche Anzahl von Teilern dieser Menge enthalten, dass die Tagesdosis erreicht wird. Es versteht sich jedoch, dass die spezielle Dosishöhe für einen bestimmten Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, darunter dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, den Nahrungsgewohnheiten, dem Zeitpunkt und der Art der Verabreichung, der Absorptions- und Exkretionsrate, der Kombination mit anderen Arzneimitteln und der Schwere der jeweiligen zu behandelnden Erkrankung.
  • Die Menge jeder einzelnen verabreichten Komponente wird durch den behandelnden Arzt bestimmt, wobei die Ätiologie und Schwere der Erkrankung, der Zustand und das Alter des Patienten, die Wirkungsstärke jeder Komponente und andere Faktoren zu berücksichtigen sind.
  • Die Formulierungen können in Behältern mit Einzel- oder Mehrfachdosen dargereicht werden, beispielsweise in versiegelten Ampullen und Arzneifläschchen mit Elastomerverschlüssen, und können in gefriergetrocknetem (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, wobei lediglich die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, z. B. Wasser für Injektionszwecke, unmittelbar vor der Anwendung erforderlich ist. Injektionslösungen und Suspensionen für nicht zeitgebundene Verabreichung können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der oben beschriebenen Art zubereitet werden.
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Verbindungen der Erfindung, ihre Methoden oder ihre Herstellung und ihre biologische Aktivität klarer herauszustellen. Diese Beispiele sind nur zur Illustration gedacht und nicht als Einschränkung des Geltungsbereiches der Erfindung zu betrachten.
  • Die Verfahren zur Auswertung der biologischen Aktivität der Verbindungen oder Zusammensetzungen gemäß der Erfindung werden ausgeführt wie hier beschrieben oder durch Anwendung oder Anpassung bekannter Verfahrensweisen, worunter bisher verwandte oder in der Literatur beschriebene Verfahrensweisen zu verstehen sind.
  • Methodik
  • Allgemeine Methodik für den HIV-Reverse Transkriptase-Test, nicht-radioaktiv (Boehringer Mannheim)
  • Es folgt eine allgemeine Verfahrensweise für den HIV-Reverse Transkriptase-Test: Tag eins
    • – Die Proben sind Überstände und Pellets aus den Gefäßen mit Viren ± Medikament (sieben Tage Inkubation). Sie sind nicht hitzeinaktiviert.
    • – Zentrifugieren Sie die Proben mit 2000 g 30 Minuten lang bei 4°C. Verwenden Sie 2500 U/min, um 2000 g zu erreichen.
    • – Übertragen Sie den Überstand in ein steriles beschriftetes Röhrchen.
    • – Fügen Sie 0,5 ml PEG-Lösung hinzu. Verwenden Sie 1,2 m NaCl als Verdünnungsmittel für PEG. PEG-Lösung: 30% w/v, 30 g in 100 ml.
    • – Gründlich mischen.
    • – Bei 0°C über Nacht inkubieren (auf Eis im Kühlschrank).
  • Tag zwei
    • – Zentrifugieren Sie 500 μl der Proben mit 8000 g 10 Minuten lang bei 4°C. Verwenden Sie 8000 U/min, um 8000 g zu erreichen.
    • – Entsorgen Sie den Überstand. Achten Sie darauf, alle Tropfen PEG von den Proben zu entfernen.
    • – Fügen Sie 40 μl Lyse-Pufferlösung hinzu.
    • – Suspendieren Sie das Pellet völlig neu.
    • – Übertragen Sie die Suspension in ein frisches Reaktionsröhrchen.
    • – Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (25°C).
    • – Stellen Sie die Standard-Verdünnungen her:
      Figure 00220001
    • – Übertragen Sie 40 μl der Standards in Reaktionsröhrchen (n = 7 × 2).
    • – Stellen Sie die Reaktionspufferlösung her:
    • – Rekonstituieren Sie die Matrize (Fläschchen 4) in 430 μl autoklaviertem Wasser.
    • – Geben Sie 1 ml Inkubationspuffer pro Fläschchen Nucleotide (Fläschchen 3) hinzu.
    • – Geben Sie dem Fläschchen mit der Nucleotidlösung (Fläschchen 3) 100 μl der rekonstituierten Matrize (Fläschchen 4) hinzu.
    • – Geben Sie in alle Röhrchen, Unbekannten und Standards 20 μl Puffer hinzu.
    • – Inkubieren Sie in einem Rack des Inkubators bis zu 15 Stunden bei 37°C.
  • Tag drei
    • – Erstellen Sie mit Wordperfect eine Schablone für den ELISA-Test.
    • – Öffnen Sie die Folienpakete und konstruieren Sie aus dem Rahmen und den Streifen ein MTP-Modul (Mikrotiterplattenmodul). Unbekannte n = daher Gesamtzahl der Proben n = Standard n = Jeder Streifen hat 8 Wells, daher werden ... Streifen benötigt. Hinweis: Sie müssen auf das nächstgelegene Vielfache von 8 aufrunden.
    • – Übertragen Sie 60 μl aus den Reaktionsröhrchen in die entsprechenden Wells des MTP-Moduls, wie es durch die Schablone angegeben ist.
    • – Bedecken Sie das MTP mit dem mitgelieferten Deckstreifen.
    • – Inkubieren Sie im Inkubator eine Stunde lang bei 37°C.
    • – Wenn nötig, stellen Sie die Waschlösung her: Hinweis: Es handelt sich bei der mitgelieferten Lösung um eine 10 × -Lösung, daher muss sie mit autoklaviertem Wasser verdünnt werden.
    • – Stellen Sie eine Flasche Waschlösung her, indem Sie 225 ml autoklaviertes Wasser in die mitgelieferte Flasche hinzugeben. Gut mischen. Halten Sie die Waschlösung während des Tests auf Eis.
    • – Entfernen Sie die Lösung vollständig durch Dekantieren.
    • – Waschen Sie die Platte 5 × mit 250 μl pro Spülung, und lassen Sie die Lösung vor dem Dekantieren 30 Sekunden lang einwirken.
    • – Stellen Sie die Anti-DIG-POD-Arbeitslösung her:
    • – Herstellen der Anti-DIG-POD-Lösung Geben Sie dem Anti-DIG-POD-Fläschchen (Fläschchen 6) 500 μl autoklaviertes Wasser hinzu; bei 4°C lagern, nicht einfrieren.
    • – Herstellen der Anti-DIG-POD-Arbeitslösung Berechnen Sie das benötigte Volumen: ... Wells × 200 μl = ... ml Verwenden Sie jeweils 50 μl Anti-DIG-POD-Lösung (Fläschchen 6) für 4,95 ml Konjugat-Verdünnungspuffer (Lösung 8). Geben Sie ... ml Anti-DIG-POD-Lösung (Fläschchen 6) zu ... ml Konjugat-Verdünnungspuffer (Lösung 8) hinzu.
    • – Fügen Sie 200 μl Anti-DIG-POD-Arbeitslösung pro Well des MTP hinzu.
    • – Bedecken Sie das MTP mit dem mitgelieferten Deckstreifen.
    • – Inkubieren Sie im Inkubator eine Stunde lang bei 37°C.
    • – Entfernen Sie die Lösung vollständig durch Dekantieren.
    • – Waschen Sie die Platte 5 × mit 250 μl pro Spülung, und lassen Sie die Lösung vor dem Dekantieren 30 Sekunden lang einwirken.
    • – Stellen Sie die ABTS-Lösung mit Verstärker her:
    • – Herstellen der ABTS-Substratlösung Lösen Sie die ABTS-Pulvermischung (Fläschchen 10) in der Flasche des Substratpuffers (Flasche 9) auf. Berechnen Sie das benötigte Volumen: ... Wells × 200 μl = ... ml
    • – Geben Sie die entsprechende Menge Verstärker zur Lösung hinzu. Verwenden Sie jeweils 1 mg Substratverstärker (Fläschchen 11) für 1 ml ABTS-Substratlösung (Flasche 9). Geben Sie ... mg Substratverstärker (Fläschchen 11) zu ... ml ABTS-Substratlösung (Flasche 9) hinzu.
    • – Fügen Sie 200 μl ABTS-Substratlösung mit Verstärker pro Well des MTP hinzu.
    • – Lesen Sie die Platte bei 405 nm (Referenzwellenlänge 490 nm) nach 10, 20 und 30 Minuten ab.
  • Beispiel 1 - Kombinationsreime einer PEG-ASNase-Verbindung mit Saquinavir
  • Materialen und Methoden:
  • Die für diese Studien verwendete Zelllinie ist CCRF/CEM/O, eine Linie leukämischer T-Zellen. PEG-ASNase (ONCASPAR) wird von Rhône-Poulenc Rorer bereitgestellt. Saquinavir ist im Handel erhältlich. Das Medium RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) wird mit 10% fötalem Kälberserum (Gemini Biosource, Calabasas, CA), 5% 1 M-Hepes-Pufferlösung und 5% nicht-essentiellen Aminosäuren (Irvine Scientific, Irvine, CA) angereichert. Die verwendeten Arzneimittelkonzentrationen sind die folgenden:
    PEG-ASNase IC50 allein: 0,4 IU/ml
    Saquinavir IC50 allein: 25 μM
    PEG/SAQ combo IC50: 0,233 IU/ml + 15,52 μM
  • Kurze Beschreibung des Verfahrens: 2 × 106 Zellen/ml werden mit dem Medium PHA + 48 Stunden lang bei 37°C mit 5% CO2 stimuliert. Die gleiche Anzahl von Zellen wird außerdem mit PHA(Phytohämagglutinin)-freiem Medium 48 Stunden lang inkubiert und als negative Kontrolle herangezogen. An diesem Punkt werden die Zellen nach der üblichen Vorgehensweise mit dem HIV-1-Virus inokuliert. PEG-ASNase und/oder Saquinavir werden den Zellen in den entsprechenden Konzentrationen zugesetzt (siehe oben). Die Kontrollzellen werden in arzneimittelfreiem Medium für die Dauer der Expositionszeit, die sieben Tage betrug, resuspendiert. An Tag fünf werden zwei 1-ml-Aliquots des Mediums aus den Gefäßen entfernt und unter flüssigem Stickstoff gelagert. An Tag sieben werden zwei weitere 1-ml-Aliquots des Mediums aus den Gefäßen entfernt und unter flüssigem Stickstoff gelagert. Zusätzlich werden die verbleibenden Zellen pelletiert und bei –80°C gelagert.
  • Die mit diesem Experiment produzierten Proben werden einzeln spezifiziert und dann mit dem Reverse Transkriptase-Test, nicht-radioaktiv (Boehringer Mannheim), auf HIV-RT getestet. Es wird die Standardkurve bestimmt, und die HIV-RT-Konzentrationen für die experimentellen Proben werden berechnet.
  • Ergebnisse:
  • Die wichtigste Beobachtung aus den HIV-RT-Tests mit diesen Proben aus T-Zellen besteht darin, dass sich im Überstand aus den CEM/0 T-Zellen nach der Behandlung kein HIV-RTNirus befindet. Die Ergebnisse dieses Experimentes werden in 1 dargestellt.
  • Die T-Zellpellets selbst werden dann auf intrazelluläre HIV-RT untersucht. PEG-ASNase zeigte bei 0,4 IU/ml (annähernd IC50-Konzentration) etwa 30% Inhibition von HIV-RT. Saquinavir, die HIV-Proteaseinhibitor-Verbindung, verminderte, allein zugegeben in einer Konzentration von 25 μM (annähernd IC50), die HIV-RT-Aktivität um etwa 70% im Vergleich zu unbehandelten HIV-RT-Zellkulturen. Abschließend haben wir gezeigt, dass die gleichzeitige Kombination von PEG-ASNase und Saquinavir synergistisch wirkt, so betrugen die IC50-Konzentrationen dieser Arzneimittel in Kombination 0,233 IU/ml bzw. 14,5 μM. Diese Konzentrationen sind weitaus niedriger als die entsprechenden IC50-Werte in CEM/0 T-Zellen. Das Kombinationsregime von PEG-ASNase und Saquinavir inhibierte HIV-RT intrazellulär um etwa 82,3% im Vergleich zu unbehandelten Kontrollwerten.
  • Diskussion:
  • Da die T-Zellen nach dieser Arzneimittelbehandlung kein HIV-1 in den Überstand sezernierten, scheint es, dass PEG-ASNase und Saquinavir nicht nur synergistisch gegenüber T-Zellen, sondern auch selektiv synergistisch gegenüber HIV-1 wirken. Diese Arzneimittel weisen eine ausreichende Suppression bei der Freisetzung neuer HIV-1-Partikel in das Medium (äquivalent zu Patientenserum oder -plasma) auf. Die Tatsache, dass niedrigere Konzentrationen der Kombination sich als suppressiver gegenüber HIV-RT erwiesen als das aktivere der beiden Arzneimittel (Saquinavir bei höherer Konzentration), weist stark darauf hin, dass die Kombination HIV auf Provirus-Ebene selektiv inhibiert.
  • Da diese Arzneimittel und ihre Kombinationen HIV-RT intrazellulär unterdrücken bzw. inhibieren, liegt es nahe, dass sie HIV-1 auf Provirus-Ebene hemmen. Mit anderen Worten produziert das integrierte HIV-Provirus mRNS, die nicht in Virusproteine übersetzt wird, und somit wird die Produktion von RT bzw. vollständiger Virus-Partikel, die dann ins Medium sezerniert werden, inhibiert. Damit ist auf theoretischer Ebene keine weitere HIV-1-Infektion nicht-infizierter T-Zellen möglich.
  • Experiment 2: Bestimmung der Zytotoxizität
  • Materialien und Methoden:
  • Für dieses Experiment wird eine Linie menschlicher leukämischer T-Zellen, im Folgenden als CEM/0 bezeichnet, eingesetzt. Es wird PEG-ASNase von Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. mit dem Handelsnamen Oncaspar® verwendet. Saquinavir stammt von Roche Laboratories und trägt den Handelsnamen InviraseTM. Das Medium RPMI-1640 von Irvine Scientific, Irvine, CA, wird mit 10% fötalem Kälberserum von Gemini Biosource, Calabasas, CA, 5% IM-Hepes-Pufferlösung und 5% nicht-essentiellen Aminosäuren von Irvine Scientific, Irvine, CA angereichert.
  • Es wird ein Experiment zur Bestimmung der Zytotoxizität von Saquinavir und PEG-ASNase durchgeführt. Zur Bestimmung der Zytotoxizität jeder Verbindung allein werden 2 × 105 Zellen/ml in Mikrotiterplatten mit 24 Wells mit folgenden Konzentrationen des jeweiligen Arzneimittels inkubiert:
    PEG-ASNase: 1,0, 0,75, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,03 IU/ml
    Saquinavir: 10–4,10–5,10–6 10–7 und 10–8 M
  • Ergebnisse:
  • Die PEG-ASNase-Konzentration, die in CEM/0-Zellen in vitro einen zytostatischen Zustand erzeugt, beträgt annähernd 0,5 IU/ml. PEG-ASNase-Konzentrationen von 1 und 0,75 IU/ml führten in signifikantem Ausmaß zum Absterben von Zellen und erwiesen sich als zytotoxisch für CEM/0-Zellen innerhalb von 72 Stunden. Bei Konzentrationen von 0,03, 0,1, 0,2, 0,3 und 0,4 IU/ml wird das Zellwachstum im Vergleich zur Wachstumsrate der Kontrolle (unbehandelte Zellen) geringfügig gehemmt. Die mit 0,5 IU/ml PEG-ASNase behandelten Zellen wiesen jedoch eine relativ flache Wachstumskurve auf. Somit wird mit dieser Konzentration für 72 Stunden eine zytostatische Wirkung erzielt. Daher werden bei den Untersuchungen zum Kombinationsregime PEG-ASNase-Konzentrationen aus einem Bereich um 0,5 IU/ml eingesetzt. Es wurde ein zytotoxischer Effekt von PEG-ASNase auf diese T-Zelllinie gezeigt, der vom Arzneimittel, von der Konzentration und von der Zeit abhängig ist.
  • Nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden wurde für Saquinavir in CEM/0-Zellen eine IC50-Konzentration von 26 μM festgestellt. Die Ergebnisse werden in 2 dargestellt. Mehrere unabhängige Experimente mit Saquinavir lieferten IC50-Werte zwischen 21 und 28 μM. Bei Saquinavir-Konzentrationen zwischen 0,001 und 1 μM trat kein Zelltod auf. Konzentrationen von 10 μM führten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollproben nur zum Absterben von 8,76% der Zellen. Die höchste getestete Konzentration betrug 100 μM und tötete im Vergleich zu den Kontrollzellen 99,50% der Zellen. Daher werden in den nachfolgenden Experimenten für die Kombinationstherapie Saquinavir/PEG-ASNase in CEM/0-Zellen Saquinavir-Konzentrationen zwischen 1 und 40 μM eingesetzt.
  • Experiment 3: Erste sequenzielle Kombinationsstudien von Saquinavir und PEG-ASNase
  • Materialien und Methoden
  • In diesem Experiment werden kombinierte Regime von Saquinavir und PEG-ASNase in den oben genannten Konzentrationen untersucht. In den sequenziellen Kombinationsstudien mit PEG-ASNase gefolgt von Saquinavir wurden die Zellen mit den unten genannten PEG-ASNase-Konzentrationen 24 Stunden lang inkubiert. Danach wurde den entsprechenden Zellen Saquinavir in den unten genannten Konzentrationen für weitere 24 (vierundzwanzig) Stunden zugesetzt, so dass die gesamte Expositionszeit 48 (achtundvierzig) Stunden betrug. 2 × 105 Zellen/ml wurden in einem Gewebekulturgefäß mit den unten genannten Konzentrationen der untersuchten Arzneimittel inkubiert. Die Ergebnisse werden in 3 dargestellt. Die verwendeten Arzneimittelkonzentrationen sind die folgenden:
    PEG-ASNase: 1,020, 0,765, 0,510, 0,255 und 0,0255 IU/ml
    Saquinavir: 40, 30, 20, 10 und 1 μM
  • In allen In-vitro-Studien wurden die Zellen der negativen Kontrolle in einem arzneimittelfreien Medium für die gleiche Zeitdauer und unter den gleichen Bedingungen wie die Versuchsproben inkubiert. Danach wurde die Zelldichte bestimmt, indem die Zellen in allen Probengefäßen mit einem Coulter-Counter, der mit einem Coulter-Channelizer gekoppelt war, jeweils 24, 48 und 72 Stunden nach der Inkubation gezählt wurden. Zusätzlich wurden für alle Versuchsbedingungen Trypanblau-Ausschlusstests durchgeführt. Die Zellzahlen wurden um die mit dem Trypanblau-Test bestimmte Überlebensrate korrigiert und als Prozentsatz der unbehandelten Kontrolle dargestellt.
  • Die umgekehrte Sequenz wurde ebenfalls getestet. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Nach der Zugabe von Saquinavir wurden die Zellen 24 (vierundzwanzig) Stunden lang inkubiert. Dann wurde PEG-ASNase hinzugefügt und die Probe weitere 24 (Stunden) lang inkubiert, so dass die Gesamtexpositionszeit 48 (achtundvierzig) Stunden betrug. Bis auf die Arzneimittelsequenz war das Verfahren das gleiche wie oben. Mit derselben Methode wurde auch das Kombinationsregime mit gleichzeitiger Verabreichung getestet. Die Ergebnisse sind in den 5, 6 und 7 dargestellt. In diesem Experiment wurden die Proben 48 (achtundvierzig) Stunden lang den kombinierten Wirkstoffen ausgesetzt.
  • Ergebnisse
  • Jedes getestete Regime zeigte in gewissen Bereichen synergistische Wirkungen. Das sequenzielle Kombinationsregime von PEG-ASNase gefolgt von Saquinavir zeigte nach einer Exposition von 48 Stunden eine 1,72-fache Synergie. Dies entspricht der in dem anderen sequenziellen Regime und im gleichzeitigen Regime erhaltenen Synergie. Die Erfindung liefert das sehr erfreuliche Ergebnis, dass bei einer Konzentration, die eine gewisse Zellüberlebensrate erlaubt, eine optimale Synergie auftritt.
  • Experiment 4: Bestimmung der Aminosäure-Konzentrationen
  • Materialien und Methoden
  • Es werden Experimente zur Bestimmung der Aminosäure-Konzentration in Zellsuspensionen und Zellmedien durchgeführt, um die Wirkung von PEG-ASNase auf die Konzentration von Aminosäuren, insbesondere von Asparagin, Glutamin und Asparaginsäure festzustellen.
  • Proben aus 50 μ1 Medium und 10 μl von 1 mM Aminoadipinsäure werden 450 μl kaltem Methanol in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zugesetzt. Die Mischungen werden mit dem Vibrationsmischer gemischt und bei 8700 g zwei Minuten lang zentrifugiert. Die Überstände werden in Borsilikat-Glasteströhrchen (13 × 100 mm) übertragen und lyophilisiert. Die Proben werden bis zur Analyse mit HPLC bei –20°C gelagert. Vor der HPLC-Analyse werden sie in einem Puffer aus 95% 7 nM Dinatriumhydrogenphosphat und 5% Acetonitril gelöst.
  • Ergebnisse
  • Nach einer 24-stündigen Exposition der CEM/0-Zelen gegenüber verschiedenen Konzentrationen von PEG-ASNase wird ein signifikanter Rückgang der Asparagin (Asn)-Menge beobachtet. Die Asparagin-Konzentration beträgt weniger als 3,0% der unbehandelten Kontrolle. Außerdem ist ein dosisabhängiger Rückgang von Glutamin (Gln) zu beobachten. Der Wert beträgt im Experiment mit der höchsten PEG-ASNase-Konzentration weniger als 3,0% der unbehandelten Kontrolle. Die Werte von Asparaginsäure (Asp) sind im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle um 200 bis 300% erhöht. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Die Kalibrationskurve, mit der die Menge von HIV-RT berechnet wird, ist in 8a dargestellt.
  • Selbst bei den niedrigsten getesteten PEG-ASNase-Konzentrationen wurde nach 24 Stunden eine Verarmung an Asn beobachtet. Dies entspricht der Fähigkeit von PEG-ASNase, bösartige T-Zellen durch Eliminierung lebensnotwendiger Aminosäuren, besonders Asparagin, abzutöten. PEG-ASNase senkt auch die Konzentration von Glutamin ab, welches bei der Zerstörung der T-Zellen möglicherweise eine wichtige Rolle spielt.
  • Experiment 5: Die Wirkung der Exposition von HIV-RNS in T-Zellpellets gegenüber einer Kombination von PEG-ASNase und Saquinavir.
  • Dieses Experiment wird mit einem ähnlichen Verfahren und den gleichen Materialkonzentrationen wie Experiment 1 durchgeführt, jedoch wird die Exposition von HIV-RNS in T-Zellpellets gegenüber einer Kombination von PEG-ASNase und Saquinavir gemessen. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in den Tabellen 1 und 2 sowie in den Grafiken 9 und 9a dargestellt. Hinweis: "PEG" in Tabelle 2 bedeutet PEG-ASNase.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass PEG-ASNase keinen sichtbaren Effekt auf die RNS-Produktion von HIV-1 ausübte, aber bei der Inhibition von HIV-RT in derselben Zellkultur an Tag 7 eine mäßige Wirkung zeigte (siehe Experiment 5a). Somit hemmt PEG-ASNase die Protein-Biosynthese sogar auf HIV-RT-Ebene (siehe Experiment 5a). Saquinavir allein wies eine inhibitorische Wirkung auf die HIV-1-RNS-Produktion von annähemd 36% im Vergleich mit der Kontrolle auf (9 und 9a). Die Kombination von PEG-ASNase und Saquinavir führte bei synergistisch reduzierten Konzentrationen zur Inhibition von etwa 12% von HIV-RT (siehe Experiment 5a). In denselben Kulturen lieferte die Kombination von PEG-ASNase und Saquinavir in den reduzierten Konzentrationen außerdem keine feststellbare HIV-1-RNS bis zum unteren Grenzwert des Tests von 400 RNS-Kopien pro Pellet. Diese Daten zeigen, dass der Proteininhibitor (PEG-ASNase) im Verein mit dem HIV-1-Proteaseinhibitor (Saquinavir) nicht nur synergistisch, sondern auch selektiv gegen HIV-RT und, was noch entscheidender ist, auch selektiv gegen die HIV-I-RNS-Produktion wirkt.
  • Experiment 5a: Die Wirkung von PEG-ASNase ± Saquinavir auf die HIV-RT-Konzentrationen von HIV-1-infizierten Zellpellets
  • Dieses Experiment wird mit einem ähnlichen Verfahren und den gleichen Materialkonzentrationen wie Experiment 7 durchgeführt, jedoch wird die Exposition des HIV-Virus in T-Zellpellets gegenüber PEG-ASNase und Saquinavir jeweils allein und in Kombination gemessen. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in Tabelle 2a dargestellt. Hinweis: "PEG" in Tabelle 2a bedeutet PEG-ASNase.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass PEG-ASNase einen mäßigen Effekt auf die Inhibition von HIV-RT ausübt. Somit hemmt PEG-ASNase die Protein-Biosynthese sogar auf HIV-RT-Ebene. Saquinavir allein weist ebenfalls eine inhibitorische Wirkung auf HIV-I-RT von annähernd 15% im Vergleich mit der Kontrolle auf. Die Kombination von PEG-ASNase und Saquinavir führte bei synergistisch reduzierten Konzentrationen zur Inhibition von etwa 12% von HIV-RT.
  • Experiment 6: Die Inhibition von HIV-RNS im Überstand von CEM/O-T-Zellen durch ein Kombinationsreime von PEG-ASNase und Saquinavir
  • Experiment 5 zeigt die Ergebnisse der Exposition von HIV-RNS in T-Zellpellets gegenüber einer Kombination von PEG-ASNase und Saquinavir. Das Versuchsverfahren beinhaltete jedoch nicht die Entfernung der HIV-1-Partikel vom Überstand, um die fortdauernde Exposition der T-Zellen gegenüber dem HIV-1-Virus zu simulieren. Somit war das HIV-1-Virus im Überstand der T-Zellkulturen ständig präsent.
  • Es wurde entdeckt, dass die Kombination von PEG-ASNase und Saquinavir die HIV-RNS in den Zellpellets in beträchtlichem Maße inhibierte. In einigen Wells konnte die HIV-RNS nach der Behandlung mit der Arzneimittelkombination PEG + SAQ nicht mehr nachgewiesen werden, so dass eine vollständige Inhibition der HIV-RNS erzielt worden war.
  • Die Überstände der T-Zellen von Experiment 5 wurden auf HIV-RNS untersucht, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und 4 dargestellt. Hinweis: "PEG" in Tabelle 3 bedeutet PEG-ASNase. PEG allein inhibierte HIV-RNS in den Überständen um annähernd 60% und SAQ etwa um 68%. Die Kombination von PEG und SAQ reduzierte die HIV-RNS im Überstand um ca. 75% im Vergleich mit der unbehandelten Kontrolle. Dieses RNS-Inhibitionsmuster fügt sich nahtlos in die in den früheren Experimenten erhaltenen Ergebnisse ein, wo die Inhibition von HIV-RT und HIV-RNS im selben Experiment berichtet wurde.
  • Da die Arzneimittel das HIV-Virus im Überstand nicht "töten", kann die Reduzierung der HIV-RNS nur durch den "Verlust" aufgrund von Infektion und Nicht-Regeneration über Replikation zustande gekommen sein, der auf die Inhibition des Virus-Replikationszyklus durch diese Arzneimittel zurückzuführen ist. Insbesondere wird intrazellulär keine HIV-RNS produziert, die als solche oder in Form vollständiger HIV-Virus-Partikel in das Medium exportiert werden kann.
  • Experiment 7: Die Wirkung von PEG-ASNase ± Saquinavir + AZT + MISID (PL-7) auf die HIV-RT-Konzentrationen von HIV-1-infizierten Zellpellets
  • Materialen und Methoden: Die für dieses Experiment verwendete Zelllinie ist CEM/0, eine menschliche leukämische T-Zelllinie. PEG-ASNase (ONCASPAR) wird von Rhone-Poulenc Rorer bereitgestellt. Saquinavir ist im Handel erhältlich. AZT wird von Sigma erworben. MISID, ein Ribonucleotidreduktase-Inhibitor, wird synthetisch hergestellt, wie beschrieben in Nandy P, Lien EJ, Avramis VI, Med. Chem. Res. 1995, 5: 664–679. Das Medium RPMI-I640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) wird mit 10% fötalem Kälberserum (Gemini Biosource, Calabasas, CA), 5 % 1 M-Hepes-Pufferlösung und 5% nicht-essentiellen Aminosäuren (Irvine Scientific, Irvine, CA) angereichert. Die verwendeten Arzneimittelkonzentrationen sind die folgenden:
    PEG-ASNase IC50 allein: 0,4 IU/ml
    Saquinavir IC50 allein: 25 μM
    AZT 1 μM
    MISID (PL-7) 0,685 μM
    PEG IC50 Kombination: 0,23 IU/ml
    SAQ IC50 Kombination: 14,52 μM
  • Kurze Beschreibung des Verfahrens: 3 × 106 Zellen/ml werden mit dem Medium PHA + 48 Stunden lang bei 37°C mit 5% CO2 stimuliert. Die gleiche Anzahl von Zellen wird außerdem mit PHA-freiem Medium 48 Stunden lang inkubiert und als negative Kontrolle herangezogen. An diesem Punkt werden die Zellen nach der üblichen Vorgehensweise mit dem HIV-1-Virus inokuliert. Es ist zu beachten, dass der HIV-enthaltende Überstand aus gesunden menschlichen peripheren mononuklearen Zellen (PBMC), die mit PHA stimuliert wurden, in diesem Experiment nicht von der PHA-stimulierten CEM/0-Zellkultur entfernt wird. Somit ist das HIV-1-Virus im Überstand stets präsent. Dies stellt eine Versuchsbedingung dar, die den klinischen In-vivo-Zustand frisch produzierter und nicht infizierter T-Zellen, die ständig HIV-1-Partikeln ausgesetzt sind, simuliert. Diese Viruspartikel werden durch bereits infizierte T-Zellen oder die Lymphknoten des Patienten freigesetzt.
  • Die Versuchsmedikamente werden den Zellen in den entsprechenden Konzentrationen gleichzeitig mit der Virusinokulation oder 90 Minuten nach der Virusinkubation zugesetzt. Diese Zeit reicht aus, die T-Zellen zu infizieren und die Produktion neuer HIV-1-Viruspartikel in Gang zu setzen. Die Kontrollzellen werden in arzneimittelfreiem Medium für die Dauer der Expositionszeit, die sieben Tage betrug, resuspendiert. An Tag 5 nach Rx werden Aliquots des Mediums nur aus den Kontrollgefäßen entnommen. An Tag sieben werden je drei 1-ml-Aliquots des Mediums aus den Gefäßen entfernt und unter flüssigem Stickstoff gelagert. Weiterhin werden die restlichen Zellen in drei Teile aufgeteilt, pelletiert und bei –80°C gelagert.
  • Die mit diesem Experiment produzierten Proben werden einzeln spezifiziert. Die Zellpellets aus den Gefäßen, die einer 90-minütigen Virusinkubation unterworfen wurden, werden mit dem ELISA-Reverse Transkriptase-Assay, nicht radioaktiv (Boehringer Mannheim), auf HIV-RT getestet Es wird die Standardkurve bestimmt (siehe 10), und die HIV-RT-Konzentrationen für die experimentellen Proben werden berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 dargestellt. Hinweis: "PEG" in Tabelle 5 bedeutet PEG-ASNase.
  • Ergebnisse und Diskussion: Die erste Beobachtung aus den HIV-RT-ELISA-Tests bei diesen Proben aus den Zellpellets aus CEM/O-T-Zellen besteht darin, dass aufgrund der Arzneimittelbehandlung die HIV-RT-Aktivität im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen vermindert ist. Am dramatischsten wird HIV-RT durch den Reverse Transkriptase-Inhibitor AZT, ein Nucleosidanalog, inhibiert. Mit diesem Ergebnis, dass AZT allein gegen diesen Virusstamm sehr aktiv ist, wird das ursprüngliche Ziel unseres Versuchsaufbaus und unserer Suche nach einem unveränderten HIV-Viruspartikel, das keine Mutationen der HIV-RT aufweist, die eine Resistenz gegenüber AZT mit sich bringen, bereits erreicht.
  • Wenn PEG-ASNase oder Saquinavir als Monotherapie in IC50-Konzentrationen zum Einsatz kamen, wurde HIV-RT um 54% bzw. 83% inhibiert. Diese Werte entsprechen den Ergebnissen früherer Experimente.
  • MISID (PL-7), ein neuer Ribonucleotidreduktase (RR)-Inhibitor, zeigte bei Einzelanwendung in IC50-Konzentration (0,685 μM) ebenfalls eine Inhibition von HIV-RT um 73%. Hierbei handelt es sich um den ersten Nachweis einer Anti-HIV-Aktivität zusätzlich zur antileukämischen Aktivität bei einem Mitglied dieser Klasse von RR-Inhibitoren. Das biochemische Prinzip der HIV-Inhibition besteht bei dieser Substanzklasse in der intrazellulären Entleerung der dNTP-Pools. Bei nicht vorhandenen oder reduzierten dNTP-Pools wird die Funktion der HIV-RT gehemmt, indem HIV-RNS vor der Integration in die genomische DNS des Säugetiers in provirale DNS umgewandelt wird.
  • Kombinationen von PEG und SAQ führten in diesem Experiment zur vollständigen Inhibition von HIV-RT. Kombinationen der drei Arzneimittel AZT, PEG und SAQ hemmten HIV-RT vollständig in zwei der drei Wells; der Wert des dritten Wells entsprach einer Inhibition von 95,3% im Vergleich zur Kontrolle. Das biochemische Prinzip dieser Arzneimittelkombination besteht darin, dass AZT die weitere Infektion durch HIV-RT hemmt und dass diese Inhibition durch die bereits sehr starke Anti-HIV-RT-Wirkung des PEG-SAQ-Regimes potenziert wird. Da sich die Zahlen einer 100-prozentigen Inhibition der HIV-RT nähern, ist es sehr schwierig, eine verbesserte Inhibition des Drei-Arzneimittel-Regimes gegenüber dem Zwei-Arzneimittel-Regime in diesem mit einem unveränderten HIV-Virus infizierten Modellsystem aus T-Zellen nachzuweisen. Möglicherweise lässt sich in Experimenten mit gegenüber AZT teilweise resistenten HIV-Viren, wie sie in Patienten vorkommen, die Gültigkeit des oben beschriebenen biochemischen Prinzips mit diesem Regime zeigen.
  • Kombinationen aus vier Arzneimitteln, MISID + AZT + PEG + SAQ, hemmten HIV-RT vollständig in zwei der drei Wells; der Wert des dritten Wells entsprach einer Inhibition von 95% im Vergleich zur Kontrolle. Diese Werte werden durch das Drei-Arzneimittel-Regime aufgrund der maximalen HIV-RT-Inhibition überlagert. Das biochemische Prinzip dieser Kombination besteht darin, dass MISID, der RR-Inhibitor, die dNTP-Pools entleert, was zur Potenzierung der Aktivität von AZT-Triphosphat (AZTTP) gegen HIV-RT führt. Diese verstärkte inhibitorische Wirkung verhält sich entweder additiv oder synergistisch gegenüber dem bereits selektiv synergistischen Effekt eines Protein- und eines Proteaseinhibitors auf das Virus. Da MISID allein über eine beträchtliche Anti-HIV-RT-Aktivität zu verfügen scheint, glauben wir, dass sich die obige Schlussweise in Experimenten mit HIV-Partikeln, die gegenüber einer oder mehreren dieser Arzneimittelklassen resistent sind, oder in Patienten, die mit multiresistenten HIV-Varianten infiziert sind, als richtig erweisen wird.
  • Somit zeigen die Ergebnisse, dass das Drei- bzw. Vier-Arzneimittelregime AZT + PEG + SAQ oder MISID + AZT + PEG + SAQ synergistisch gegen HIV-RT wirkt.
  • Experiment 8: Die Bestimmung der synergistischen Wirkung von PEG-ASNase, Saquinavir, AZT und MISID (PL-7) im CEM/0-Zell-Überstand
  • Materialien und Methoden: Die für dieses Experiment verwendete Zelllinie ist CEM/0, eine menschliche leukämische T-Zelllinie. PEG-ASNase (ONCASPAR) wird von Rhone-Poulenc Rorer bereitgestellt. Saquinavir (SQ ist im Handel erhältlich. AZT wird von Sigma erworben.
  • MISID, ein Ribonucleotidreduktase-Inhibitor, ist wie beschrieben in Nandy P, Lien EJ, Avramis VI, Med. Chem. Res. 1995, 5: 664–679. Das Medium RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) wird mit 10% fötalem Kälberserum (Gemini Biosource, Calabasas, CA), 5% 1 M-Hepes-Pufferlösung und 5% nicht-essentiellen Aminosäuren (Irvine Scientific, Irvine, CA) angereichert. Die verwendeten Arzneimittelkonzentrationen sind die folgenden:
    PEG-ASNase IC50 allein: 0,4 IU/ml
    Saquinavir IC50 allein: 25 μM
    AZT 1 μM
    MISID 0,685 μM
    PEG IC50 Kombination: 0,23 IU/ml
    SAQ IC50 Kombination: 14,52 μM
  • Kurze Beschreibung des Verfahrens: 3 × 106 Zellen/ml werden mit dem Medium PHA + 48 Stunden lang bei 37°C mit 5% CO2 stimuliert. Die gleiche Anzahl von Zellen wird außerdem mit PHA-freiem Medium 48 Stunden lang inkubiert und als negative Kontrolle herangezogen. An diesem Punkt werden die Zellen nach der üblichen Vorgehensweise mit dem HIV-1-Virus inokuliert. Es ist zu beachten, dass der HIV-enthaltende Überstand aus gesunden menschlichen peripheren mononuklearen Zellen (PBMC), die mit PHA stimuliert wurden, in diesem Experiment nicht von der PHA-stimulierten CEM/0-Zellkultur entfernt wird. Somit ist das HIV-1-Virus im Überstand stets präsent. Dies stellt eine Versuchsbedingung dar, die den klinischen Invivo-Zustand frisch produzierter und nicht infizierter T-Zellen, die ständig HIV-1-Partikeln ausgesetzt sind, simuliert. Diese Viruspartikel werden durch bereits infizierte T-Zellen oder die Lymphknoten des Patienten freigesetzt.
  • Die Versuchsmedikamente werden den Zellen in den entsprechenden Konzentrationen gleichzeitig mit der Virusinokulation oder 90 Minuten nach der Virusinkubation zugesetzt. Diese Zeit reicht aus, die T-Zellen zu infizieren und die Produktion neuer HIV-1-Viruspartikel in Gang zu setzen. Die Kontrollzellen werden in arzrneimittelfreiem Medium für die Dauer der Expositionszeit, die sieben Tage betrug, resuspendiert. An Tag 5 nach Rx werden Aliquots des Mediums nur aus den Kontrollgefäßen entnommen. An Tag sieben werden je drei 1-ml-Aliquots des Mediums aus den Gefäßen entfernt und unter flüssigem Stickstoff gelagert. Weiterhin werden die restlichen Zellen in drei Teile aufgeteilt, pelletiert und bei –80°C gelagert.
  • Die mit diesem Experiment produzierten Proben werden einzeln spezifiziert. Die Zellpellets der Zellkulturen (siehe Experiment 7) aus den Gefäßen, die einer 90-minütigen Virusinkubation unterworfen wurden, werden mit einem nicht radioaktiven, quantitativen Assay auf HIV-RNS getestet. Es wird die Standardkurve bestimmt, und die HIV-RNS-Konzentrationen für die experimentellen Proben werden wie oben beschrieben berechnet.
  • Diese Überstandproben stammen aus den Kulturen der T-Zellpellets von Experiment 7. Die Ergebnisse werden in Experiment 7 angegeben.
  • Die erste Beobachtung aus den HIV-RT-ELISA-Tests bei diesen Proben aus den Überständen der CEM/O-T-Zellen besteht darin, dass aufgrund der Arzneimittelbehandlung die HIV-RT-Aktivität an Tag 7 im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen des gleichen Tages vermindert ist.
  • Bedeutsam ist, dass die unbehandelten Kontrollen an Tag 5 (ein Wert) einen höheren OD-Wert für HIV-RT aufweisen als an Tag 7. Wir untersuchten OD- Werte, die sämtlich kleiner als die basierend auf der Linearität der Kalibrationskurve festgestellten Minimalkonzentrationen waren. Nur eine Überstandsprobe (Nr. 7), die mit PEG-ASNase allein behandelt worden war, hatte im Test einen höheren OD-Wert als die negative Kontrolle, der aber immer noch kleiner als der Mittelwert der Überstände aus den drei unbehandelten Zellkulturen war.
  • Eine starke Inhibition von HIV-RT wird in quantitativer Hinsicht (kleiner als 66% des negativen Kontrollwertes von 0,075 OD oder 0,05 OD) durch SAQ (Proben 9 und 10), AZT (Proben 11 und 13) sowie MISID (Proben 15 und 16), jeweils als Einzelwirkstoffe, geliefert (siehe Tabelle 6; Hinweis: "PEG" in Tabelle 6 bedeutet PEG-ASNase). Noch stärker wurde HIV-RT in folgenden Fällen inhibiert: in den drei Proben 17, 18 und 19 durch die Kombination SAQ + PEG-ASNase, in Probe 22 durch die Kombination PEG-ASNase + SAQ + AZT sowie in allen drei Proben, die mit dem Vier-Arzneimittel-Kombinationsregime PEG-ASNase +SAQ + MISID + AZT behandelt worden waren (23, 24, 25).
  • Mit diesem Ergebnis, dass AZT allein gegen diesen Virusstamm sehr aktiv ist, wird das ursprüngliche Ziel unseres Versuchsaufbaus und unserer Suche nach einem unveränderten HIV-Viruspartikel,das keine Mutationen der HIV-RT aufweist, die eine Resistenz gegenüber AZT mit sich bringen, bereits erreicht.
  • MISID, ein neuer Ribonucleotidreduktase (RR)-Inhbitor, der allein in der IC50-Konzentration (0,685 μM) eingesetzt wurde, zeigte sowohl als Einzelwirkstoff als auch in Kombination mit den drei anderen Arzneimitteln ebenfalls eine signifikante Inhibition von HIV-RT. Dieses Ergebnis ergibt sich auch in den Zellpellets (siehe Experiment 7) und bildet den ersten Nachweis, dass ein Mitglied dieser Klasse von RR-Inhibitoren zusätzlich zur antileukämischen Aktivität eine Anti-HIV-Aktivität sowohl intrazellulär als auch in den Überstandsproben dieser T-Zellkulturen aufweist.
  • Kombinationen von PEG und SAQ führten zur vollständigen Inhibition von HIV-RT in diesem und dem vorher berichteten Experiment mit den Zellpellets. In vorherigen Experimenten trat eine 96-prozentige Inhibition von HIV-RT auf (siehe Experiment 7). Kombinationen der drei Arzneimittel AZT, PEG und SAQ bewirkten eine vollständige Inhibition von HIV-RT in zwei der drei Wells; der Wert des dritten Wells entsprach einer Inhibition von 95,3% im Vergleich zur Kontrolle, wobei in den Überständen bei den Proben 20–22 ein identisches Muster auftrat.
  • Kombinationen aus vier Arzneimitteln, MISID + AZT + PEG + SAQ, hemmten HIV-RT vollständig in allen drei Überstandsproben. Diese Werte entsprechen den Werten, die im gleichen Experiment in den Zellpellets gemessen wurden. Diese Werte werden, wie schon oben festgestellt, durch das Drei-Arzneimittel-Regime aufgrund der maximalen HIV-RT-Inhibition überlagert.
  • Das biochemische Prinzip dieser Kombination besteht darin, dass MISID, der RR-Inhibitor, die dNTP-Pools entleert, was zur Potenzierung der Aktivität von AZT-Triphosphat (AZTTP) gegen HIV-RT führt. Diese verstärkte inhibitorische Wirkung verhält sich entweder additiv oder synergistisch gegenüber dem bereits selektiv synergistischen Effekt eines Protein- und eines Proteaseinhibitors auf das Virus. Da MISID allein über eine beträchtliche Anti-HIV-RT-Aktivität zu verfügen scheint, glauben wir, dass sich diese Schlussweise in Experimenten mit HIV-Partikeln, die gegenüber einer oder mehreren dieser Arzneimittelklassen resistent sind, oder in Patienten, die mit multiresistenten HIV-Varianten infiziert sind, als richtig erweisen wird.
  • Experiment 9: Die Bestimmung der synergistischen Wirkung von PEG-ASNase Saquinavir AZT und MISID (PL-7) in CEM/0-Zellpellets
  • Die fitr diese Studien verwendete Zelllinie ist CEM/0, eine Linie menschlicher leukämischer T-Zellen. PEG-ASNase (ONCASPAR) wird von Rhone-Poulenc Rorer bereitgestellt. Saquinavir (SQ ist im Handel erhältlich. AZT wird von Sigma erworben. MISID, ein Ribonucleotidreduktase-Inhibitor, wird synthetisch hergestellt, wie beschrieben in Nandy P, Lien EJ, Avramis VI, Med. Chem. Res. 1995, 5: 664–679. Das Medium RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) wird mit 10% fötalem Kälberserum (Gemini Biosource, Calabasas, CA), 5% 1 M-Hepes-Pufferlösung und 5% nicht-essentiellen Aminosäuren (Irvine Scientific, Irvine, CA) angereichert. Die verwendeten Arzneimittelkonzentrationen sind die folgenden:
    PEG-ASNase IC50 allein: 0,4 IU/ml
    Saquinavir IC50 allein: 25 μM
    AZT 1 μM
    MISID 0,685 μM
    PEG IC50 Kombination: 0,23 IU/ml
    SAQ IC50 Kombination: 14,52 μM
  • Kurze Beschreibung des Verfahrens: 3 × 106 Zellen/ml werden mit dem Medium PHA + 48 Stunden lang bei 37°C mit 5% CO2 stimuliert. Die gleiche Anzahl von Zellen wird außerdem mit PHA-freiem Medium 48 Stunden lang inkubiert und als negative Kontrolle herangezogen. An diesem Punkt werden die Zellen nach der üblichen Vorgehensweise mit dem HIV-1-Virus inokuliert. Es ist zu beachten, dass der HIV-enthaltende Überstand aus gesunden menschlichen peripheren mononuklearen Zellen (PBMC), die mit PHA stimuliert wurden, in diesem Experiment nicht von der PHA-stimulierten CEM/0-Zellkultur entfernt wird. Somit ist das HIV-1-Virus im Überstand stets präsent. Dies stellt eine Versuchsbedingung dar, die den klinischen In-vivo-Zustand frisch produzierter und nicht infizierter T-Zellen, die ständig HIV-1-Partikeln ausgesetzt sind, simuliert. Diese Viruspartikel werden durch bereits infizierte T-Zellen oder die Lymphknoten des Patienten freigesetzt.
  • Die Versuchsmedikamente werden den Zellen in den entsprechenden Konzentrationen gleichzeitig mit der Virusinokulation oder 90 Minuten nach der Virusinkubation zugesetzt. Diese Zeit reicht aus, die T-Zellen zu infizieren und die Produktion neuer HIV-1-Viruspartikel in Gang zu setzen. Die Kontrollzellen werden in arzneimittelfreiem Medium für die Dauer der Expositionszeit, die sieben Tage betrug, resuspendiert. An Tag 5 nach Rx werden Aliquots des Mediums nur aus den Kontrollgefäßen entnommen. An Tag sieben werden je drei 1-ml-Aliquots des Mediums aus den Gefäßen entfernt und unter flüssigem Stickstoff gelagert. Weiterhin werden die restlichen Zellen in drei Teile aufgeteilt, pelletiert und bei –80°C gelagert.
  • Die mit diesem Experiment produzierten Proben werden einzeln spezifiziert. Die Zellpellets der Zellkulturen (siehe Experiment 7) aus den Gefäßen, die einer 90-minütigen Virusinkubation unterworfen wurden, werden mit einem nicht radioaktiven, quantitativen Assay auf HIV-RNS getestet. Es wird die Standardkurve bestimmt, und die HIV-RNS-Konzentrationen für die experimentellen Proben werden wie oben beschrieben berechnet und aufgezeichnet.
  • Die Proben stammen aus den Kulturen der T-Zellpellets und wurden im gleichen Experiment untersucht wie diejenigen, über die wir die HIV-RT-Ergebnisse berichtet haben. Diese Ergebnisse werden in Experiment 7 (Zellpellets) und Experiment 8 (Überstand) besprochen.
  • Die erste Beobachtung aus den quantitativen HIV-RNS-Tests bei diesen Proben aus CEM/O-T-Zellen besteht darin, dass aufgrund der Arzneimittelbehandlung die HIV-RNS-Aktivität an Tag 7 im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen des gleichen Tages vermindert ist. Die quantitativen Ergebnisse werden in Tabelle 7 und 11 dargestellt. Hinweis: "PEG" in Tabelle 7 bedeutet PEG-ASNase.
  • Die durch AZT allein (Proben 11–13) in quantitativer Hinsicht bewirkte Inhibition von HIV-RNS ist größer (gegenüber AZT sensitives HIV-1-Virus), wenn SAQ und MISID als Einzelwirkstoffe folgen. Eine größere Inhibition von HIV-RNS ergibt sich durch die Kombination SAQ + PEG-ASNase (38% der Kontrolle) und durch die Drei-Arrneimittel-Kombination PEG-ASNase +SAQ + AZT (30% der Kontrolle). Alle drei Proben, die mit dem Vier-Arzneimittel-Kombinationsregime PEG-ASNase + SAQ + MISID + AZT behandelt wurden (23, 24, 25), wiesen die stärkste Inhibition von HIV-RNS dieses Experimentes (20% der Kontrolle) auf. Dies zeigt klar den wesentlichen Beitrag des Ribonucleotidreduktase-Inhibitors MISID.
  • MISID, ein neuer Ribonucleotidreduktase (RR)-Inhibitor, der allein in der IC50-Konzentration (0,685 müM) eingesetzt wurde, zeigte sowohl als Einzelwirkstoff als auch, was höchst bedeutsam ist, in Kombination mit den drei anderen Arzneimitteln ebenfalls eine signifikante Inhibition von HIV-RNS. Dieses Ergebnis ergibt sich auch in den Zellpellets (Experiment 6) und bildet den wiederholten Nachweis, dass ein Mitglied dieser Klasse von RR-Inhibitoren zusätzlich zur antileukämischen Aktivität eine Anti-HIV-Aktivität sowohl intrazellulär als auch in den Überstandsproben dieser T-Zellkulturen aufweist.
  • Das biochemische Prinzip dieser Kombination besteht darin, dass MISID, der RR-Inhibitor, die dNTP-Pools entleert, was zur Potenzierung der Aktivität von AZT-Triphosphat (AZTTP) gegen die HIV-Integration und -Replikation und damit zu verminderter HIV-RNS führt. Diese verstärkte inhibitorische Wirkung verhält sich entweder additiv oder synergistisch gegenüber dem bereits selektiv synergistischen Effekt eines Protein- und eines Proteaseinhibitors auf das Virus. Da MISID allein über eine beträchtliche Anti-HIV-RNS-Aktivität zu verfügen scheint, glauben wir, dass sich diese Schlussweise in Experimenten mit HIV-Partikeln, die gegenüber einer oder mehreren dieser Arzneimittelklassen resistent sind, oder in Patienten, die mit multiresistenten HIV-Varianten infiziert sind, als richtig erweisen wird.
  • Experiment 10: Die Bestimmung der synergistischen Wirkung von PEG-ASNase, Saquinavir, AZT und MISID (PL-7) bei der Suppression von HIV-RT
  • Materialien und Methoden: Die für dieses Experiment verwendete Zelllinie ist CEM/0, eine menschliche leukämische T-Zelllinie. PEG-ASNase (ONCASPAR) wird von Rhone-Poulenc Rorer bereitgestellt. Saquinavir ist im Handel erhältlich. AZT wird von Sigma erworben. MISID, ein Ribonucleotidreduktase-Inhibitor, ist wie beschrieben in Nandy P, Lien E7, Avramis VI, Med. Chem. Res. 1995, 5: 664–679. Das Medium RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) wird mit 10% fötalem Kälberserum (Gemini Biosource, Calabasas, CA), 5% 1 M-Hepes-Pufferlösung und 5% nicht-essentiellen Aminosäuren (Irvine Scientific, Irvine, CA) angereichert. Die verwendeten Arzneimittelkonzentrationen sind die folgenden:
    PEG-ASNase IC50 allein: 0,4 IU/ml
    Saquinavir IC50 allein: 25 μM
    AZT 1 μM
    MISID 0,685 μM
    PEG IC50 Kombination: 0,23 IU/ml
    SAQ IC50 Kombination: 14,52 μM
  • Kurze Beschreibung des Verfahrens: 3 × 106 Zellen/ml werden mit dem Medium PHA + 48 Stunden lang bei 37°C mit 5% CO2 stimuliert. Die gleiche Anzahl von Zellen wird außerdem mit PHA-freiem Medium 48 Stunden lang inkubiert und als negative Kontrolle herangezogen. An diesem Punkt werden die Zellen nach der üblichen Vorgehensweise mit dem HIV-1-Virus inokuliert. Es ist zu beachten, dass der HIV-enthaltende Überstand aus gesunden menschlichen peripheren mononuklearen Zellen (PBMC), die mit PHA stimuliert wurden, in diesem Experiment nicht von der PHA-stimulierten CEM/0-Zellkultur entfernt wird. Somit ist das HIV-1-Virus im Überstand stets präsent. Dies stellt eine Versuchsbedingung dar, die den klinischen Invivo-Zustand frisch produzierter und nicht infizierter T-Zellen, die ständig HIV-1-Partikeln ausgesetzt sind, simuliert. In diesem Experiment haben wir weitaus höhere HIV-1-Titer als bei der Kontroll-HIV-RNS in den T-Zellen festgestellt (siehe Experiment 9). Diese Viruspartikel werden kontinuierlich durch bereits infizierte T-Zellen oder die Lymphknoten des Patienten freigesetzt.
  • Die Versuchsmedikamente werden den Zellen in den entsprechenden Konzentrationen gleichzeitig mit der Virusinokulation oder 90 Minuten nach der Virusinkubation zugesetzt. Diese Zeit reicht aus, die T-Zellen zu infizieren und die Produktion neuer HIV-1-Viruspartikel in Gang zu setzen. Die Kontrollzellen werden in arzneimittelfreiem Medium für die Dauer der Expositionszeit, die sieben Tage betrug, resuspendiert. An Tag 5 nach Rx werden Aliquots des Mediums nur aus den Kontrollgefäßen entnommen. An Tag sieben werden je drei 1-ml-Aliquots des Mediums aus den Gefäßen entfernt und unter flüssigem Stickstoff gelagert. Weiterhin werden die restlichen Zellen in drei Teile aufgeteilt, pelletiert und bei –80°C gelagert. Es werden Proben aus den Überständen dieser T-Zellkulturen entnommen und bei –80°C eingefroren. Die mit diesem Experiment produzierten Proben werden einzeln spezifiziert. Die Zellpellets der Zellkulturen (siehe Experiment 9) aus den Gefäßen, die einer 90-minütigen Virusinkubation unterworfen wurden, werden mit einem nicht radioaktiven, quantitativen Assay auf HIV-RNS getestet. Wir geben hier die quantitativen HIV-RNS-Ergebnisse aus den Überständen der T-Zellen bekannt. Es wird die Standardkurve bestimmt, und die HIV-RNS-Konzentrationen für die experimentellen Proben werden wie oben beschrieben berechnet und aufgezeichnet.
  • Ergebnisse und Diskussion: Die Proben stammen aus den Kulturen der T-Zellpellets des gleichen Experiments wie diejenigen, über die wir die HIV-RT-Ergebnisse (siehe Experiment 8) und die quantitativen HIV-RNS-Ergebnisse in T-Zellen (siehe Experiment 9) berichtet haben.
  • Die erste Beobachtung aus den quantitativen HIV-RNS-Tests mit den Überstandsproben aus CEM/0-T-Zellen besteht darin, dass die HIV-RNS-Aktivität an Tag 7 im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen des gleichen Tages aufgrund der Arzneimittelbehandlung vermindert ist. Die quantitativen Ergebnisse sind in der beigefügten Tabelle dargestellt (Tabelle 8). Hinweis: "PEG" in Tabelle 8 bedeutet PEG-ASNase. Die quantitativen HIV-RNS-Kontrollwerte (Kopien des Virusgenoms/ml) sind höher als die aus den vorhergehenden Experimenten und entsprechen den Werten der unbehandelten Kontrolle (214.445 in den T-Zellpellets gegenüber 195.483 in den Überständen).
  • Die HIV-RNS-Inhibition, die in quantitativer Hinsicht durch SAQ, AZT bzw. MISID allein bewirkt wird (Proben 8–16), ist jeweils nicht-statistisch signifikant (HIV-1-Virus sensitiv gegenüber AZT) Eine ähnliche prozentuale Inhibition von HIV-RNS im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle ergibt sich in den Überständen mit der Kombination SAQ + PEG-ASNase sowie mit der Drei-Arzneimittel-Kombination PEG-ASNase + SAQ + AZT. Alle drei Proben, die mit dem Vier-Arzneimittel-Kombinationsregime MISID + AZT + PEG-ASNase + SAQ behandelt wurden (23, 24, 25) wiesen jedoch die stärkste Inhibition von HIV-RNS dieses Experimentes (50% der Kontrolle) auf. Dies zeigt klar den wesentlichen Beitrag des Ribonucleotidreduktase-Inhibitors MISID. Die letzteren Daten bestätigen das frühere Ergebnis für die HIV-RNS-Inhibition, die in den T-Zellpellets 20% der Kontrollwerte betrug (Experiment 9). Dieses Resultat zeigt zusammen mit den Daten aus den vorhergehenden Experimenten, dass die Inhibition des Virus in den T-Zellen und Überständen umso geringer ist, je höher der im Überstand verbliebene HIV-Titer ist. Mit anderen Worten: a) Die Kombinationsregime müssen unter den genannten Bedingungen kontinuierlich gegeben werden, d. h. bei Patienten die eine hohe Anzahl von HIV-RNS-Kopien und/oder Virämie aufweisen; b) die Potenzierung von AZT + SAQ muss entweder durch einen dritten RT-Inhibitor, z. B. 3TC, oder einen RR-Inhibitor wie MISID oder Hydroxyharnstoff geschehen, so dass die Aktivität von AZT-Triphosphat (AZTTP) gegen HIV-RT verstärkt wird.
  • MISID, ein neuer Ribonucleotidreduktase (RR)-Inhibitor, zeigte bei Einzelanwendung in IC50-Konzentration (0,685 μM) ebenfalls eine signifikante Inhibition von HIV-RNS und erwies sich somit als Einzelwirkstoff von annähernd der gleichen Inhibition wie SAQ oder AZT. Das wichtigste Ergebnis ist, dass MISID in der Kombination mit den drei anderen Arzneimitteln eine signifikante Wirksamkeit gegenüber HIV-RT in T-Zellpellets bzw. Überständen (siehe Experimente 7 und 8) sowie bei der Suppression der im Überstand verbliebenen HIV-RNS (Tabelle 8) bewies. Dieses Resultat ergibt sich auch in den T-Zellpellets (siehe Experimente 6 und 9) und bildet den wiederholten Nachweis, dass ein Mitglied dieser Klasse von RR-Inhibitoren zusätzlich zur antileukämischen Aktivität eine Anti-HIV-Aktivität sowohl intrazellulär als auch in den Überstandsproben dieser T-Zellkulturen aufweist.
  • Das biochemische Prinzip dieser Kombination besteht darin, dass MISID, der RR-Inhibitor, die dNTP-Pools entleert, was zur Potenzierung der Aktivität von AZT-Triphosphat (AZTTP) gegen die Reverse Transkription, Integration und Replikation von HIV-1 und damit zu verminderter HIV-RNS führt. Diese verstärkte inhibitorische Wirkung verhält sich entweder additiv oder synergistisch gegenüber dem bereits selektiv synergistischen Effekt eines Proteinund eines Proteaseinhibitors auf das Virus. Da MISID allein über eine beträchtliche Anti-HIV-RNS-Aktivität zu verfügen scheint, glauben wir, dass sich diese Schlussweise in Experimenten mit HIV-Partikeln, die gegenüber einer oder mehreren dieser Arzneimittelklassen resistent sind, oder in Patienten, die mit multiresistenten HIV-Varianten infiziert sind, als richtig erweisen wird.
  • Experiment 10: Die Bestimmung der synergistischen Wirkung von PEG-ASNase, Saquinavir, AZT und 3TC auf HIV-RT in CEM/0-Zellpellets
  • Dieses Experiment wird mit einem ähnlichen Verfahren und den gleichen Materialkonzentrationen wie Experiment 9 durchgeführt, jedoch wird 3TC an Stelle von MISID verwendet. In diesem Experiment wird die Exposition von HIV-RT in T-Zellpellets gegenüber einer Kombination von PEG-ASNase, Saquinavir, AZT und 3TC gemessen. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in Tabelle 9 dargestellt. Hinweis: "PEG" in Tabelle 9 bedeutet PEG-ASNase. Tabelle 9 zeigt, dass durch Saquinavir und PEG-ASNase allein eine gewisse Inhibition von HIV-RT auftritt. Die Kombination von PEG-ASNase, Saquinavir, AZT und 3TC führt jedoch zur vollständigen Inhibition von HIV-RT.
  • Experiment 11: Die Bestimmung der synergistischen Wirkung von PEG-ASNase, Saquinavir, AZT und 3TC auf HIV-RNS in CEM/0-Zell-Überständen
  • Dieses Experiment wird mit einem ähnlichen Verfahren und den gleichen Materialkonzentrationen wie Experiment 10 durchgeführt, jedoch wird die Exposition von HIV-RNS in T-Zell-Überständen gegenüber einer Kombination von PEG-ASNase, Saquinavir, AZT und 3TC gemessen. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in Tabelle 10 dargestellt. Hinweis: "PEG" in Tabelle 10 bedeutet PEG-ASNase. Tabelle 10 zeigt, dass durch Saquinavir und PEG-ASNase allein eine gewisse Inhibition von HIV-RNS auftritt (etwa 55% bzw. 73% der Kontrolle). Die Kombination von PEG-ASNase, Saquinavir und AZT bewirkt eine größere Inhibition von HIV-RNS (etwa 21% der Kontrolle). Die Kombination von PEG-ASNase, Saquinavir, AZT und 3TC führt jedoch zur vollständigen Inhibition von HIV-RNS (0% der Kontrolle) (siehe Tabelle 10).
  • Die vorliegende Erfindung kann in anderen speziellen Formen verkörpert werden, ohne dass dadurch eine Abweichung von ihrem Geist oder ihren speziellen Attributen gegeben ist.
  • Tabelle 1
    Figure 00430001
  • Tabelle 2
    Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Tabelle 4
    Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • ERSATZBLATT (REGEL 26)
  • 1
  • Legende:
    • % of control – % der Kontrolle
    • Control – Kontrolle
    • S.Dev. – Standardabweichung
  • 2
    • Arzneimittelkonzentration, μM
    • Lebensfähige Zellen, % der Kontrolle
  • 3
    • Anteil der überlebenden CEM/0-T-Zellen
  • 4
  • Legende:
    • Fraction Cell Survival of CEM/0 T-Cells – Anteil der überlebenden CEM/0-T-Zellen
    • Additivity Drug Synergism – Synergieeffekt bei Zusatz-Arzneimittel
  • 5
  • Legende:
    • Fraction Cell Survival of CEM/0 T-Cells – Anteil der überlebenden CEM/0-T-Zellen
    • Additivity Drug Synergism – Synergieeffekt bei Zusatz-Arzneimittel
  • 6
  • Legende:
    • Fraction Cell Survival of CEM/0 T-Cells – Anteil der überlebenden CEM/0-T-Zellen
    • Additivity Drug Synergism – Synergieeffekt bei Zusatz-Arzneimittel
    • Combination Index (CI) Value – Wert des Kombinationsindex (CI)
  • 7
  • Legende:
    • Fraction Affected, Fa – Betroffener Anteil, Fa
    • Combination Index (CI) – Kombinationsindex (CI)
    • Antagonistic Effect – Antagonistische Wirkung
    • Additive Effect – Additive Wirkung
    • Synergistic Effect – Synergistische Wirkung
  • 8
  • Legende:
    • Control – Kontrolle
    • PEG-ASNase exposure in CEM/0 cells, 24 hrs – PEG-ASNase-Exposition in CEM/0-Zellen, 24 Stunden
    • Amino Acid Concentrations, Percent of Control – Aminosäure-Konzentrationen, Prozent der Kontrolle
  • 8a
  • Legende:
    • 40 minutes – 40 Minuten
    • HIV-1-RT concentration – HIV-I-RT-Konzentration
  • 9
  • Legende:
    • n of means – n der Mittelwerte
    • Number of HIV-1 RNS copies per cell (CEM/0 pellet (1 × 10), DAY 7)
    • Anzahl der HIV-1-RNS-Kopien pro Pellet (CEM/0-Pellet (1 × 10), TAG 7)
    • Control – Kontrolle
    • Alone in – allein in
  • 9a
  • Legende:
    • Log10 N. copies HIV-1 RNS per cell pellet – Log10 der Anzahl der HIV-1-RNS-Kopien pro Zellpellet
    • Control – Kontrolle
    • Alone – allein
    • combination – Kombination
  • 10
  • Legende:
    • MINUTES – MINUTEN
  • 11
  • Legende:
    • HIV-1 RNS Copies/1 × E6 cells – HIV-1-RNS-Kopien/1 × E6 Zellen

Claims (17)

  1. Verwendung einer PEG-ASNase-Verbindung zusammen mit mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteaseinhibitor-Verbindungen, Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen und HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen, wobei die genannten Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen ausgewählt sind aus Hydroxyharnstoff (HU), BW-348U87, 3-Aminopyridin-2-carboxaldehydthiosemicarbazon (3-AP) Amidox (VF 236; NSC-343341; N,3,4-Trihydroxybenzolcarboximidamid), BILD 1257 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(Nmethyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L-(3,3-tetramethylen)aspartyl-L-(4-methyl)leucin), BILD 1357 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(Nmethyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L-(3,3-tetrarnethylen)asparaginsäure-1-[1(R)-ethyl-2,2-dimethylpropylamid]), BILD 1633, BILD 733 (3-Phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-[3-methyl)valyl-L-[3-(pyrrolidin-1-ylcarbonyl)]alanyl-L-(1-carboxycyclopentyl)glycyl-L-(4-methyl)leucinol), BILD 1263 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L(3,3-tetramethylen)aspartyl-L-(4-methyl)leucinol), BILD 1351 (1-[1(S)-[5(S)-[3-[(all-cis)-2,6-dimethylcyclohexyl]ureido]-2(S)-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-6,6-dimethyl-4-oxoheptanoylamino]-1-[1(R)-ethyl-2,2-dimethylpropylcarbamol]methyl]cyclopentancarbonsäure]), Cl-F-araA (2-Chlor-9-(2-desoxy-2-fluor-beta-D-arabinofuranosyl)adenin, DDFC(2'-desoxy-2',2'-difluorcytidin), Didox (VF 147; NSC 324360; N,3,4-Trihydroxybenzamid), Eurd (3'-Ethynyluridin), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-Isochinolylmethan-N-hydroxy-N'-aminoguanin), LY 207702 (2', 2'-Difluor-2'desoxyribofuranosyl-2,6-diaminopurin), LY 295501 (N-[[3,4-Dichlorphenyl)amino]carbonyl]2,3-dihydro-5-benzofuransulfonamid), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxy-2'-(fluormethylen)cytidin), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N[[(4-Chlorphenyl)amino]carbonyl]-2,3-dihydro-1H-inden-5-sulfonamid), TAS 106 (Ecyd; 3'-Ethynylcytidin), Triapin (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-Tetrahydroxybenzolcarboximidamid), zur Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung einer Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) oder zur Hemmung der Produktion oder Beschränkung der Ausbreitung von HIV in einer Zellpopulation, die dem Medikament ausgesetzt wird.
  2. Verwendung einer PEG-ASNase-Verbindung, die Asparaginase, die mit Polyethylenglykol konjugiert ist und unter der Bezeichnung ONCASPAR® verkauft wird, als einzigen aktiven Bestandteil umfasst, zur Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung oder Behandlung einer Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) oder zur Hemmung der Produktion oder Beschränkung der Ausbreitung von HIV in einer Zellpopulation, die dem Medikament ausgesetzt wird.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die genannte PEG-ASNase-Verbindung mit mindestens einer Proteaseinhibitor-Verbindung kombiniert ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die genannte PEG-ASNase-Verbindung mit mindestens einer Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung kombiniert ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die genannte PEG-ASNase-Verbindung mit mindestens einer HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung kombiniert ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Proteaseinhibitor-Verbindungen ausgewählt sind aus Saquinavir, Nelfinavir, Indinavir, Endinovere, Ritonavir, Crixivan, Viracept, Norvir und VX-478.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Proteaseinhibitor-Verbindung Saquinavir oder Endinovere ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Proteaseinhibitor-Verbindung Saquinavir ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen ausgewählt sind aus AZT (Retrovir, Zidovudin)ddI(Videx, Didanosin)ddC (Hivid, Zalcitabin), d4T (Zerit, Stavudin) und 3TC (Epivir, Lamivudin).
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen AZT (Retrovir, Zidovudin) und 3TC (Epivir, Lamivudin) sind.
  11. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung AZT (Retrovir, Zidovudin) ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das genannte Medikament zur Hemmung der Produktion oder Beschränkung der Ausbreitung von HIV in einer Zellpopulation vorgesehen ist, die der Zusammensetzung ausgesetzt wird.
  13. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das genannte Medikament zur Hemmung oder Behandlung von HIV vorgesehen ist.
  14. Bausatz zur Behandlung oder Vorbeugung eines physiologischen Zustands in Verbindung mit HIV, wobei der genannte Bausatz eine Mehrzahl separater Behälter umfasst, wobei mindestens einer der genannten Behälter eine PEG-ASNase-Verbindung enthält und mindestens ein anderer der genannten Behälter eine oder mehrere Verbindungen enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Proteaseinhibitor-Verbindung, einer HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung und einer Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung, wobei die genannten Behälter bei Bedarf einen pharmazeutischen Träger enthalten, wobei die genannten Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindungen ausgewählt sind aus Hydroxyharnstoff (HU), BW-348U87, 3-Aminopyridin-2-carboxaldehydthiosemicarbazon (3-AP) Amidox (VF 236; NSC-343341; N,3,4-Trihydroxybenzolcarboximidamid), BILD 1257 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L(3,3-tetramethylen)aspartyl-L-(4-methyl)leucin), BILD 1357 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L(N-methyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L-(3,3-tetramethylen)asparaginsäure-1-[1(R)-ethyl-2,2-dimethylpropylamid]), BILD 1633, BILD 733 (3-Phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-[3-methyl)valyl-L-[3-(pyrrolidin-1-ylcarbonyl)]alanyl-L-(1-carboxycyclopentyl)glycyl-L-(4-methyl)leucinol), BILD 1263 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L(3,3-tetramethylen)aspartyl-L-(4-methyl)leucinol), BILD1351 (1-[1(S)-[5(S)-[3-[(all-cis)-2,6-dimethylcyclohexyl]ureido]-2(S)-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-6,6-dimethyl-4-oxoheptanoylamino]-1-[1(R)-ethyl-2,2-dimethylpropylcarbamol]methyl]cyclopentancarbonsäure]), Cl-F-araA (2-Chlor-9-(2-desoxy-2-fluor-beta-D-arabinofuranosyl)adenin, DDFC(2'-desoxy-2',2'-difluorcytidin), Didox (VF 147; NSC 324360; N,3,4-Trihydroxybenzamid), Eurd (3'-Ethynyluridin), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-Isochinolylmethan-N-hydroxy-N'-aminoguanin), LY 207702 (2', 2'-Difluor-2'desoxyribofuranosyl-2,6-diaminopurin), LY 295501 (N-[[3,4-Dichlorphenyl)amino]carbonyl]2,3-dihydro-5-benzofuransulfonamid), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxy-2'-(fluormethylen)cytidin), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N[[(4-Chlorphenyl)amino]carbonyl]-2,3-dihydro-1H-inden-5-sulfonamid), TAS 106 (Ecyd; 3'- Ethynylcytidin), Triapin (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-Tetrahydroxybenzolcarboximidamid).
  15. Pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung, umfassend eine PEG-ASNase-Verbindung, eine Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung und mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteaseinhibitor-Verbindungen, und HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindungen, wobei die genannte Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung ausgewählt ist aus Hydroxyharnstoff (HU), BW-348U87, 3-Aminopyridin-2-carboxaldehydthiosemicarbazon (3-AP) Amidox (VF 236; NSC-343341; N,3,4-Trihydroxybenzolcarboximidamid), BILD 1257 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L(N-methyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L-(3,3-tetramethylen)aspartyl-L-(4-methyl)leucin), BILD 1357 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(Nmethyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L-(3,3-tetramethylen)asparaginsäure-1-[1(R)-ethyl-2,2-dimethylpropylamid]), BILD 1633, BILD 733 (3-Phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-[3-methyl)valyl-L-[3-(pynolidin-1-ylcarbonyl)]alanyl-L-(1-carboxycyclopentyl)glycyl-L-(4-methyl)leucinol), BILD 1263 (2-Benzyl-3-phenylpropionyl-L-(N-methyl)valyl-L-3-(methyl)valyl-L-(N4,N4-tetramethylen)asparaginyl-L(3,3-tetramethylen)aspartyl-L-(4-methyl)leucinol), BILD1351 (1-[1(S)-[5(S)-[3-[(all-cis)-2,6-dimethylcyclohexyl]ureido]-2(S)-(3,3-dimethyl-2-oxobutyl)-6,6-dimethyl-4-oxoheptanoylamino]-1-[1(R)-ethyl-2,2-dimethylpropylcarbamol]methyl]cyclopentancarbonsäure]), Cl-F-araA (2-Chlor-9-(2-desoxy-2-fluor-beta-D-arabinofuranosyl)adenin, DDFC(2'-desoxy-2',2'-difluorcytidin), Didox (VF 147; NSC 324360; N,3,4-Trihydroxybenzamid), Eurd (3'-Ethynyluridin), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-Isochinolylmethan-N-hydroxy-N'-aminoguanin), LY 207702 (2', 2'-Difluor-2'desoxyribofuranosyl-2,6-diaminopurin), LY 295501 (N-[[3,4-Dichlorphenyl)amino]carbonyl]2,3-dihydro-5-benzofuransulfonamid), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxy-2'-(fluormethylen)cytidin), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N[[(4-Chlorphenyl)amino]carbonyl]-2,3-dihydro-1H-inden-5-sulfonamid), TAS 106 (Ecyd; 3'-Ethynylcytidin), Triapin (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-Tetrahydroxybenzolcarboximidamid).
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die genannte PEG-ASNase-Verbindung und die genannte Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung mit mindestens einer Proteaseinhibitor-Verbindung kombiniert sind.
  17. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die genannte PEG-ASNase-Verbindung und die genannte Ribonucleotidreduktase-Inhibitor-Verbindung mit mindestens einer HIV-Reverse Transkriptase-Inhibitor-Verbindung kombiniert sind.
DE69909747T 1998-02-09 1999-02-09 Pharmazeutische zusammensetzung, enthaltend peg-asparaginase, für die behandlung von hiv infektionen Expired - Fee Related DE69909747T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7406698P 1998-02-09 1998-02-09
US74066P 1998-02-09
PCT/US1999/002480 WO1999039732A1 (en) 1998-02-09 1999-02-09 Pharmaceutical compositions comprising peg-asparaginase for the treatment of hiv infections

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69909747D1 DE69909747D1 (de) 2003-08-28
DE69909747T2 true DE69909747T2 (de) 2004-04-15

Family

ID=22117505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69909747T Expired - Fee Related DE69909747T2 (de) 1998-02-09 1999-02-09 Pharmazeutische zusammensetzung, enthaltend peg-asparaginase, für die behandlung von hiv infektionen

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1053012B1 (de)
JP (1) JP2002502826A (de)
AT (1) ATE245444T1 (de)
AU (1) AU752434B2 (de)
CA (1) CA2319356A1 (de)
DE (1) DE69909747T2 (de)
DK (1) DK1053012T3 (de)
ES (1) ES2203072T3 (de)
WO (1) WO1999039732A1 (de)
ZA (1) ZA991029B (de)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2368230A1 (en) * 1999-04-02 2000-10-12 Children's Hospital Los Angeles Use of asparaginase and glutaminase to treat autoimmune disease and graft versus host disease
AU6894400A (en) * 1999-08-06 2001-03-05 Enzon Pharmaceuticals Inc. Composition and methods for treatment of HIV infection
CN100479862C (zh) 2000-04-03 2009-04-22 参天制药株式会社 释放物质和采用该物质的药物释放系统
WO2002085358A2 (en) * 2001-04-20 2002-10-31 Vion Pharmaceuticals, Inc. Antiviral agents and methods of treating viral infections
DK1567117T3 (da) 2002-11-26 2012-05-21 Univ Chicago Forebyggelse og behandling af mikrobe-medierede epitelsygdomme
US20080299105A1 (en) * 2004-09-13 2008-12-04 Runtao He Inhibition of Feline Calicivirus
CN101002945B (zh) 2006-01-20 2012-09-05 清华大学 一种用于肿瘤治疗的新型复合物
CN100475270C (zh) 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
GB0608876D0 (en) * 2006-05-05 2006-06-14 Medivir Ab Combination therapy
CN101219219B (zh) 2007-01-10 2013-02-13 北京普罗吉生物科技发展有限公司 包含血管抑素或其片段的复合物、其制备方法及应用
WO2015033344A1 (en) * 2013-09-05 2015-03-12 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods and kits for inhibiting pathogenicity of group a streptococcus (gas) or group g streptococcus (ggs)
JP6846574B2 (ja) * 2017-11-29 2021-03-24 大鵬薬品工業株式会社 スルホンアミド化合物およびその使用
CN115671102A (zh) * 2022-11-17 2023-02-03 中国科学院大学 3-ap在制备抑制痘病毒的药物中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2600256B1 (fr) * 1986-06-19 1988-09-16 Inst Nat Sante Rech Med Medicament et composition medicamenteuse pour le traitement des tumeurs ainsi que pour le traitement des maladies infectieuses dues aux virus
US6251388B1 (en) * 1997-06-09 2001-06-26 Childrens Hospital Los Angeles Utilization of Wolinella succinogenes asparaginase to treat diseases associated with asparagine dependence

Also Published As

Publication number Publication date
AU2658499A (en) 1999-08-23
ES2203072T3 (es) 2004-04-01
EP1053012A1 (de) 2000-11-22
AU752434B2 (en) 2002-09-19
ATE245444T1 (de) 2003-08-15
EP1053012B1 (de) 2003-07-23
DE69909747D1 (de) 2003-08-28
DK1053012T3 (da) 2003-11-17
JP2002502826A (ja) 2002-01-29
CA2319356A1 (en) 1999-08-12
WO1999039732A1 (en) 1999-08-12
ZA991029B (en) 1999-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69433953T2 (de) Neues Verfahen zur Hemmung der Replikation der virusabhängigen reversen Transkriptase durch Verwendung von Didesoxynukleotid-Synthese Inhibitoren
DE69635671T2 (de) Verwendung von roxithromycin zur herstellung eines medikaments zur verbesserung der biologischen und antiviralen aktivität von protease-inhibitoren
DE60020820T2 (de) Thiadiazolyl-harnstoffe oder -thioharnstoffe zur antiviralen behandlung
DE69909747T2 (de) Pharmazeutische zusammensetzung, enthaltend peg-asparaginase, für die behandlung von hiv infektionen
DE60037664T2 (de) Langkettige n-alkyl verbindungen und deren oxa-derivate zur verwendung als anitvirale mittel
DE60018273T2 (de) Pegyliertes interferon alpha in kombination mit einem ccr5 antagonisten für eine hiv-therapie
UA60293C2 (uk) Спосіб лікування або попередження симптомів або дії віл-інфекції та використовувані в ньому комбінація сполук (варіанти), фармацевтична композиція та продукт (варіанти)
DE60021065T2 (de) Virus behandlung
DE69727240T2 (de) Kombinationen, enthaltend VX478, Zidovudin und 3TC zur Behandlung von HIV
WO1998032442A1 (de) Chinoxaline in dreier-kombination mit proteaseinhibitoren und reverse transkriptaseinhibitoren als arzneimittel zur behandlung von aids
DE60204224T2 (de) Verwendung bestimmter substituierter pyrrolidone wie z.b. piracetam bei der behandlung von viralen und anderen erkrankungen
KR19980703829A (ko) 바이러스 및 암 성장 억제용, 엔-클로로페닐카르바메이트및 엔-클로로페닐티오카르바메이트 함유 약학 조성물
DE69830154T2 (de) Pharmazeutische zusammensetzungen
DE60032915T2 (de) Gallium komplexe von 3-hydroxy-4-pyronen zur behandlung von durch intrazelluläre prokaryoten, dns- und retro-viren verursachten infektionen
EP0214101A2 (de) Verwendung von Eisen(III)-Chelatoren vom Typ Desferrioxamin B und Desferriferrithiocin zur Behandlung von Malaria
DE69535366T2 (de) Zusammensetzung zur behandlung und vorbeugung von hiv-1 infektionen, welche mindestens zwei verschiedene hiv-1 reverse transcriptase inhibitoren enthalt
US6689762B1 (en) Composition and methods for treatment of HIV infection
DE19813802A1 (de) Anti-virale Wirkung von Propolis durch Inhibition viraler Nukleinsäure Polymerasen
JP2003506409A (ja) Ｈｉｖ感染の治療用組成物及び方法
WO1995005181A2 (en) Drug for parasitic control of animals
EP1096947B1 (de) Topisch anwendbares arzneimittel zur behandlung von virusinfektionen
CN101252925B (zh) 以逆转录酶抑制剂和美度铵为基础的药物组合物
JP2002540149A (ja) ウイルス感染治療のためのカルバミン酸エステル誘導体の使用法
DE60104288T2 (de) Antivirale therapie
RU2331420C2 (ru) Противовирусное средство (варианты) и способ лечения на его основе

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: PFENNING MEINIG & PARTNER GBR, 80339 MUENCHEN

8339 Ceased/non-payment of the annual fee