ES2203072T3 - Composiciones farmaceuticas que comprenden peg-asparaginasa para el tratamiento de infecciones por vih. - Google Patents
Composiciones farmaceuticas que comprenden peg-asparaginasa para el tratamiento de infecciones por vih.Info
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Abstract
El uso de un compuesto de PEG-ASNasa junto con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos inhibidores de proteasa, compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido y compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, en el que dichos compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido son seleccionados entre hidroxiurea (HU), BW-348U87, tiosemicarbazona de 3-aminopiridina-2-carboxaldehído (3- AP), Amidox (VF 236; NSC-343341; N, 3, 4- trihidroxibencencarboximidamida), BILD 1257 (2-bencil-3- fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4, N4- tetrametilen) asparaginil-L-(3, 3-tetrametilen) aspartil-L- (4-metil)leucina), BILD 1357 (1-[1(R)-etil-2, 2- dimetilpropilamida] de ácido 2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N- metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4, N4- tetrametilen)asparaginil-L-(3, 3-tetrametilen)aspártico), BILD 1633, BILD 733 (3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-(3- metil)valil-L- [3-(pirrolidin-1- ilcaronil)]alanil-L- (1- carboxiciclopentil)glicil-L-(4-metil) leucinol, BILD 1263 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3- (metil)valil-L-(N4, N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3, 3- tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol), BILD 1351 (ácido 1-[1(S)- [5(S)- [3-[todo-cis) -2, 6- dimetilciclohexil] ureido]- 2(S)-(3, 3-dimetil-2-oxobutil)- 6, 6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2, 2- dimetilpropilcarbamol]metil] ciclopentanocarboxílico), Cl-F- araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabino furanosil) adenina, DDFC (2¿-desoxi-2¿, 2¿- difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 324360; N, 3, 4- trihidroxibenzamida), Eurd (3¿-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N¿- aminoguanina), LY 207702 (2¿, 2¿-difluoro-2¿-desoxi ribofuranosil-2, 6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3, 4- diclorofenil)amino]carbonil]2, 3-dihidro-5- benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2¿- desoxi-2¿-(fluorometilencitidina), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil) amino]carbonil]-2, 3-dihidro-IH- inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3¿-etinilcitidina), Triapina (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N, 3-4, 5- tetrahidroxibencen carboximidamida), en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) o para inhibir la producción, o limitar la propagación, del VIH en una población de células expuestas al medicamento.
Description
Composiciones farmacéuticas que comprenden
PEG-Asparaginasa para el tratamiento del VIH.
La invención está dirigida al uso de una
composición farmacéutica que comprende un compuesto
PEG-ASNasa y al menos un compuesto seleccionado del
grupo que consiste en compuestos inhibidores de proteasa,
determinados compuestos ribonucleótidos inhibidores de reductasa y
compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, y un
vehículo aceptable farmacéuticamente para inhibir o tratar la
infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH).
El Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) es un
retrovirus y es el agente de la enfermedad compleja que incluye la
destrucción progresiva del sistema inmune (síndrome de
inmunodeficiencia adquirida; SIDA) y la degeneración del sistema
nervioso central y periférico. Este retrovirus era conocido
previamente como LAV, HTLV-III, o ARV. Ha habido
diversas terapias para tratar la infección por VIH, incluyendo
terapias en combinación con regímenes de fármacos. Los compuestos
inhibidores de proteasa en combinación con compuestos inhibidores de
transcriptasa inversa (RT, del inglés "Reverse Transcriptasa")
han tenido éxito tanto in vitro como in vivo en
pacientes infectados con el virus. Los compuestos inhibidores de
proteasa interfieren con la producción de nuevos virus infecciosos.
Una característica común de la replicación del retrovirus del VIH
es el procesado post-translacional de poliproteínas
precursoras mediante una proteasa codificada víricamente para
generar las proteínas víricas maduras requeridas para la formación
y la función de los virus. La inhibición de este procesado evita la
producción de nuevos virus infecciosos.
La inhibición de la proteasa de VIH por
inhibidores de proteasa puede impedir la integración de linfocitos T
infectados durante la primera fase del ciclo vital del
VIH-1, así como inhibir el procesado proteolítico
del virus durante su etapa final. Los inhibidores de proteasa de
VIH han sido revisados de forma amplia (A. Tomasselli y col.,
Chimica Oggi, 6-27 20 (1991) y T. Meek, J. Enzyme
Inhibition 6: 65-98 (1992)). De forma rutinaria, la
replicación retrovírica presenta un procesado
post-translacional de poliproteínas. Este procesado
se lleva a cabo mediante enzimas de proteasa de HTV codificadas
víricamente. Este proceso post-translacional da como
resultado polipéptidos maduros que posteriormente ayudarán en la
formación y en la función de virus infecciosos. Si este procesado
molecular es inhibido, entonces la producción normal de VIH se
interrumpe. Por lo tanto, se ha descubierto que los inhibidores de
proteasa de VIH pueden funcionar como agentes víricos
anti-VIH.
Los retrovirus están ampliamente extendidos en
vertebrados y son conocidos por causar una variedad de enfermedades
en el hombre y en animales, incluyendo el VIH, leucemias y
linfomas. Toda la familia de retrovirus se caracteriza por la
presencia de una única enzima, la transcriptasa inversa (RT), que
transcribe el ARN genómico del virus en una copia de ADN de cadena
doble. Por lo tanto, se están dirigiendo considerables esfuerzos
hacia el control del VIH por medio de la inhibición de la
transcriptasa inversa de VIH, requerida para la replicación del
virus. (V. Merluzzi y col., "Inhibition of the
HIV-1 Replication by a Nonnucleoside Reverse
Transcriptase Inhibitor", Science, 25, 1411 (1990)). Por
ejemplo, un compuesto terapéutico usado actualmente, el AZT, es un
inhibidor de la transcriptasa inversa del virus (Patente de EE.UU.
Nº 4 724 232). Desafortunadamente, muchos de estos compuestos sufren
problemas de toxicidad, falta de biodisponibilidad o tienen una
vida in vivo demasiado corta, resistencia vírica, o
combinaciones de ellos.
También se conoce que la inhibición de
transcriptasa inversa de VIH (en inglés, HIV-RT) por
combinaciones de fármacos análogos a nucleósidos indica que no
pueden inhibir por sí solos la función RT por completo, sino que en
vez de eso pueden conducir a la aparición de cepas víricas
resistentes al fármaco. Estas cepas de mutantes de fuga repueblan y
hacen que la terapia de análogos de nucleósido no sea eficaz. La
adición de compuestos inhibidores de proteasa a terapias de
combinación de análogos de nucleósidos ha ayudado a reducir la carga
vírica durante un periodo de tiempo prolongado.
La reductasa de ribonucleótidos es una enzima
regulada alostéricamente que convierte los difosfatos de nucleósido
en sus correspondientes difosfatos desoxinucleósidos a través de un
mecanismo regulador complejo que incluye una o varias rutas de
transferencia de electrones. (Holmgren A. Hydrogen donor system for
E. Coli Ribonucleoside diphosphate reductase dependent upon
glutathione, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1976, 73,
2275-9; Therlander L., Reductase of Ribonucleotides,
Ann. Rev. Biochem. 1979, 46, 133-58; Ashley G. W.,
Stubbe, J., Current ideas on the chemical mechanism of
ribonucleotide reductase, Pharmac. Ther. 1985, 30,
301-29; Stubbe J., Ribonucleotide Reductase:
Amazing and confusing, J. Biol. Chem. 1990, 265,
5329-32). La reducción del ribonucleótido mediante
reductasa de ribonucleótido permite a las polimerasas de ADN
utilizar los desoxiribonucleótidos (dNTPs) durante el proceso de
replicación de ADN. La actividad de la reductasa de ribonucleótido
está bien coordinada con el proceso de proliferación celular y se
ve marcadamente incrementada en la fase final G1 y en la fase
inicial S cuando tiene lugar la síntesis de ADN en masa. (Corey J.
G., Whitford Jr., T. W., Ribonucleotide reductase and DNA synthesis
in Ehrlich ascites tumor cancer cells, Cancer Res., 1972, 32,
1301-6; Hammerstan E., Reichard P., Saluste E.,
Pyrimidine nucleosides as precursors of pyrimidines in
polynucleotides, J. Biol. Chem., 1950, 183,
105-109). El importante papel de la reductasa de
ribonucleótido en la síntesis de ADN la convierte en un objetivo de
los agentes quemoterapéuticos. Recientemente se ha descubierto una
de clase de
2-hidroxi-1H-isoindol-1,3-diona
(HISID) que ha demostrado tener actividad inhibidora de la reductasa
de ribonucleótido (Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Acta
Oncológica, 33, 8, 953-61, 1994; Nandy P., Lien E.
J., Avramis V. I., Rec. Adv. Chemoth 1: 995-996,
1994; Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Med. Chem. Res. 1995, 5:
664-679).
La PEG-asparaginasa (la forma de
polietileno glicosilado del E. coli-ASP) ha demostrado ser
útil como agente quemoterapéutico. En particular, se ha descubierto
que la PEG-aspariginasa es una preparación
alternativa con una vida media de circulación más larga que el
E. coli L-asparaginasa y ha sido útil en la
quemoterapia multiagente para la leucemia linfoblástica aguda
infantil. (Ettinger L. J., Ettinger A. G., Avramis V. I., Gaynon P.
S., BioDrugs, 7, 1, 30-39, 1997). También, la
PEG-ASNasa puede incrementar el efecto
antileucémico en la recaída de CNS aislado. (Malgolowkin M., Ortega
S., Carcich D. A., Steele D., Tischer D., Franklin J., Nandy P.,
Periclou A., Cohen L. J., Avramis V. I., Proceedings of ASCO, 17,
1998).
La PEG-ASNasa es un conjugado de
asparaginasa con polietilenglicol. Esta conjugación se produce a
través de pegilación, un proceso en el que los polipéptidos, tales
como las enzimas o las hormonas, se acoplan a polietilénglicol de
tal forma que se produce una composición de polipéptidos soluble en
agua no inmunogénica activa fisiológicamente. El polietilénglicol
protege al polipéptido frente a la pérdida de actividad y la
composición puede ser inyectada en el sistema circulatorio de un
mamífero con una respuesta sustancialmente no inmunogénica. El
proceso de pegilación se describe en detalle en la Patente de
EE.UU. Nº 4 179 337, titulada "Non-Immunogenic
Polypeptide", presentada el 28 de Julio de 1997, y publicada el
18 de Diciembre de 1979, que se incorpora aquí al completo como
referencia. El enlace covalente entre el polímero y el péptido se
ve afectado a menudo haciendo reaccionar derivados de
PEG-succinimida con grupos amino sobre el exterior
de las moléculas de proteína. También se describen otros métodos en
la Patente de EE.UU. Nº 4 179 337, en Pollack y col., JACS, 98, 289
(1976), en la Patente de EE.UU. Nº 4 847 325 y en cualquier otro
dentro de la técnica.
Los solicitantes han descubierto que la
PEG-asparaginasa (PEG-ASNasa)
funciona eficazmente por sí sola y sinérgicamente funciona en
combinación con uno o más de los siguientes, compuestos inhibidores
de proteasa, compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de
VIH, o determinados compuestos inhibidores de reductasa de
ribonucleótido, para tratar la infección de VIH.
Por consiguiente, en su aspecto principal, la
invención está dirigida a un uso de un compuesto de
PEG-ASNasa y de al menos un compuesto seleccionado
del grupo que consiste en: compuestos inhibidores de proteasa,
determinados compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido
y compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, como se
establece en la Reivindicación 1.
La Figura 1 representa la inhibición de RT de VIH
en células T CEM/0 (\pm PHA) tratadas sólo con concentraciones
IC_{50} de PEG-ASNasa o sólo con Saquinavir (SAQ)
o con una combinación.
La Figura 2 representa la citotoxicidad de
Saquinavir sobre células T (CEM/0), después de 72 horas, para
diferentes concentraciones de fármaco.
La Figura 3 representa la citotoxicidad sobre
células T de la PEG-ASNasa y del Saquinavir por sí
solos, y en una combinación secuencial (PEG-ASNasa
seguida de Saquinavir), para diferentes concentraciones de
fármaco.
La Figura 4 representa la citotoxicidad sobre
células T de la PEG-ASNasa y del Saquinavir por sí
solos, y en una combinación secuencial (Saquinavir seguido de
PEG-ASNasa), para diferentes concentraciones de
fármaco.
La Figura 5 representa la citotoxicidad sobre
células T de la PEG-ASNasa y del Saquinavir por sí
solos, y en combinación simultánea, para diferentes concentraciones
de fármaco.
La Figura 6 representa el sinergismo sobre
células T de la PEG-ASNasa y del Saquinavir en
combinación simultánea para diferentes concentraciones de
fármaco.
La Figura 7 representa el índice de combinación
(IC) en CEM/0 de la combinación secuencial de Saquinavir seguido de
PGE-ASNasa, y de la combinación secuencial de
PEG-ASNasa seguida de Saquinavir, y de la
combinación simultánea de PEG-ASNasa y
Saquinavir.
La Figura 8 representa el agotamiento de las
concentraciones de Asparagina, Glutamina y ácido Aspártico en
células T CEM/0 tras exposición a diferentes concentraciones de
PEG-ASNasa durante 24 horas.
La Figura 8a una curva de calibrado de la
densidad óptica (DO) de diferentes concentraciones de
HTV-1 RT.
La Figura 9 representa el número de copias de ARN
de VIH por pelets de células tras exposición de las células a
PEG-ASNasa y Saquinavir por sí solos y en
combinación.
La Figura 9a representa el Log_{10} del número
de copias de ARN de VIH por pelets de células tras exposición de las
células a PEG-ASNasa y Saquinavir por sí solos y en
combinación.
La Figura 10 representa las curvas de calibrado
para el ensayo Elisa de RT de VIH.
La Figura 11 representa el ensayo cuantitativo de
ARN de VIH-1 de células T CEM tratadas con regímenes
sencillos de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y MISID, y
con regímenes combinados de Saquinavir y PEG-ASNasa,
AZT, Saquinavir y PEG-ASNasa, y MISID, AZT,
Saquinavir y PEG-ASNasa.
Como se han usado anteriormente, y a lo largo de
la descripción de la invención, deberá entenderse que los siguientes
términos, a no ser que se indique lo contrario, tienen los
siguientes significados:
"Análogo" significa un compuesto que
comprende una forma químicamente modificada de un compuesto
específico o de una clase suya, y que mantiene las actividades
farmacéutica y/o farmacológica características de dicho compuesto o
clase.
"Carboxi" significa un grupo
HO(O)C- (ácido carboxílico).
"Compuestos de la invención", y expresiones
equivalentes, están dirigidas a abarcar compuestos de la invención
como los descritos aquí con anterioridad, expresión que incluye los
profármacos, las sales farmacéuticamente aceptables, y los
solvatos, por ejemplo hidratos, donde el contexto lo permita. Del
mismo modo, las referencias a intermedios, tanto si ellos por sí
mismos están reivindicados o no, están dirigidas a abarcar sus
sales, y solvatos, donde el contexto lo permita. En aras de la
claridad, de vez en cuando se indican en el texto ejemplos
particulares cuando el contexto lo permita, pero estos ejemplos son
puramente ilustrativos y no se pretende que excluyan otros ejemplos
cuando el contexto lo permita.
"Derivado" significa un compuesto modificado
químicamente en el que la modificación se considera rutinaria para
el químico con conocimientos ordinarios en la técnica, tales como
un éster o una amida de un ácido, grupos protectores, tales como el
grupo bencilo para un alcohol o para un tilo, y como el grupo
terc-butoxicarbonilo para una amina.
"Cantidad efectiva" significa una cantidad
de un compuesto/composición de acuerdo con la presente invención
efectiva para producir el efecto terapéutico deseado.
"Formulaciones adecuadas para administración
nasal o por inhalación" significa formulaciones que están en una
forma adecuada para ser administradas a un paciente nasalmente o
por inhalación. La formulación puede contener un vehículo, en forma
de polvo, que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el
intervalo de 1 a 500 micrómetros (incluyendo los tamaños de
partícula en un intervalo entre 20 y 500 micrómetros en incrementos
de 5 micrómetros tal como 30 micrómetros, 35 micrómetros, etc.).
Las formulaciones adecuadas en las que el vehículo es un líquido,
para la administración en la forma de, por ejemplo, un spray nasal o
una gotas nasales, incluyen disoluciones acuosas o aceitosas del
ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la
administración en aerosol pueden ser preparadas de acuerdo con los
métodos convencionales y puede ser suministradas junto con otros
agentes terapéuticos. La terapia por inhalación es fácilmente
administrada mediante inhaladores de dosis medida.
"Formulaciones adecuadas para la administración
oral" significa formulaciones que están en una forma adecuada
para ser administradas oralmente a un paciente. Las formulaciones
pueden ser presentadas como unidades discretas tales como cápsulas,
caches o pastillas cada una conteniendo una cantidad predeterminada
del ingrediente activo; como un polvo o gránulos; en disolución o
en una suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuoso; o
como una emulsión líquida aceite en agua o una emulsión líquida
agua en aceite. El ingrediente activo también puede presentarse como
un bolo, un electuario o una pasta.
"Formulaciones adecuadas para la administración
parenteral" significa formulaciones que están en una forma
adecuada para ser administradas parenteralmente a un paciente. Las
formulaciones son estériles e incluyen emulsiones, suspensiones,
disoluciones de inyección acuosas y no acuosas, que pueden contener
agentes suspendedores y agentes espesantes y antioxidantes,
tampones, bacteriostats y solutos que hacen isotónica a la
formulación, y que tienen un pH adecuadamente ajustado, con la
sangre del recipiente pretendido.
"Formulaciones adecuadas para administraciones
rectales" significa formulaciones que están en una forma adecuada
para ser administradas rectalmente a un paciente. Preferiblemente,
la formulación está en la forma de supositorios que pueden ser
preparados mezclando los compuestos útiles de acuerdo con esta
invención con excipientes o vehículos no irritantes adecuados tales
como manteca de cacao, polietilénglicol o una cera de supositorio,
que son sólidos a las temperaturas ordinarias pero líquidos a la
temperatura del cuerpo y, por lo tanto, se funden en la cavidad
rectal o vaginal y liberan su componente activo.
"Formulaciones adecuadas para la administración
sistémica" significa formulaciones que están en una forma
adecuada para ser administradas sistémicamente a un paciente.
Preferiblemente, la formulación se administra por inyección, que
incluye transmuscular, intravenosa, intraperitoneal, y subcutánea.
Para la inyección, los compuestos útiles de acuerdo con la
invención se formulan en disoluciones líquidas, preferiblemente en
tampones fisiológicamente compatibles tales como la disolución de
Hank o la disolución de Ringer. Además, los compuestos pueden estar
formulados en forma sólida y ser redisueltos o suspendidos
inmediatamente antes de su uso. También se incluyen las formas
liofilizadas. La administración sistémica también puede ser por
medios transmucosales o transdermales, o los compuestos pueden ser
administrados oralmente. Para la administración transmucosal o
transdermal, se usan en la formulación penetrantes apropiados para
la barrera que han de permear. Dichos penetrantes son generalmente
conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, sales de bilis y
derivados de ácido fusídico para la administración transmucosal.
Además, se pueden usar detergentes para facilitar la permeación. La
administración transmucosal puede ser a través del uso de sprays
nasales, por ejemplo, o de supositorios. Para la administración
oral, los compuestos son formulados en las formas convencionales
para la administración oral tales como cápsulas, pastillas, y
tónicos.
"Las formulaciones adecuadas para
administración tópica" significa formulaciones que están en una
forma adecuada para ser administradas tópicamente a un paciente. La
formulación puede ser presentada como un ungüento tópico, pomadas,
polvos, sprays e inhalantes, geles (basados en agua o en alcohol),
cremas, como se conoce generalmente en la técnica, o puede estar
incorporada en una matriz base para la aplicación en un parche, que
permitiría una liberación controlada del compuesto a través de la
barrera transdermal. Si se formulan como un ungüento, los
ingredientes activos pueden ser empleados tanto con una base
ungüento parafínica como con una miscible con agua.
Alternativamente, los ingredientes activos pueden ser formulados en
una crema con una base de crema aceite en agua. Las formulaciones
adecuadas para la administración tópica en el ojo incluyen gotas de
ojo en las que el ingrediente activo se disuelve y se suspende en
un vehículo apropiado, especialmente un disolvente acuoso para el
ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la
administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden
el ingrediente activo en una base con sabor, usualmente sacarosa o
acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo
en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y
acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en
un vehículo líquido adecuado.
"Formulaciones adecuadas para la administración
vaginal" significa formulaciones que están en una forma adecuada
para ser administradas vaginalmente a una paciente. La formulación
puede presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas,
espumas o formulaciones en spray que contienen además del
ingrediente activo vehículos tales como los conocidos en la técnica
por ser apropiados.
"Forma de dosis líquida" significa que la
dosis de compuesto activo a administrar al paciente está en forma
líquida, por ejemplo, emulsiones, disoluciones, suspensiones,
jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los
compuestos activos, las formas de dosis líquida pueden contener
diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como agua
u otros disolventes, agentes solubilizadores y emulgentes, como por
ejemplo, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo,
acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo,
propilenglicol, 1,3-butilenglicol,
dimetilformamida, aceites, en particular, aceite de semilla de
algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de
oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo, glicerol, alcohol
tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos
de sorbitán o mezclas de estas sustancias, y otros parecidos.
"Paciente" incluye tanto humanos como otros
mamíferos.
"PEG-ASNasa" significa el
compuesto inhibidor de la síntesis de proteína, asparaginasa,
conjugado con polietilénglicol (PEG). Preferiblemente, el
polietilénglicol tiene un peso molecular medio entre aproximadamente
1000 y 100000 daltons, más preferiblemente entre 4000 y 40000
daltons, dependiendo, por ejemplo, del peso molecular del compuesto
inhibidor de la síntesis de proteína empleado en particular. Puesto
que el objetivo de la modificación es obtener una proteína conjugada
con actividad biológica retenida, con una vida media in vivo
incrementada en comparación con el compuesto inhibidor de la
síntesis de proteína sin conjugar, y con una inmunogenicidad
reducida, el peso molecular del polímero se elegirá para optimizar
estas condiciones. Preferiblemente, el homopolímero PEG está
sustituido en un extremo con un grupo alquilo pero también puede
estar sin sustituir. Preferiblemente el grupo alquilo es un grupo
alquilo C_{1}-C_{4}, y más preferiblemente un
grupo metilo. Preferiblemente, el polímero es un homopolímero de
PEG sustituido con un metilo y tiene un peso molecular de
aproximadamente 4000 a 40000 daltons. Más preferiblemente, la
PEG-ASNnasa es un compuesto vendido bajo el nombre
de ONCASPAR por Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer.
"Composición farmacéutica" significa una
composición que comprende un compuesto de la invención y al menos un
componente seleccionado del grupo que consiste en portadores,
diluyentes, adyuvantes, excipientes, o vehículos farmacéuticamente
aceptables, tales como agentes conservantes, rellenos, agentes
desintegrantes, agentes de mojado, agentes emulgentes, agentes de
suspensión, agentes edulcorantes, agentes de sabor, agentes de
perfume, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes
lubricantes y agentes dispersantes, dependiendo de la naturaleza
del modo de administración y de las formas de dosis. Ejemplos de
agentes de suspensión incluyen alcoholes isostearílicos etoxilados,
polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa
microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar agar y
tragacanto, o mezclas de estas sustancias. La prevención de la
acción de microorganismos puede asegurarse mediante diversos agentes
antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos,
clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y otros parecidos. También
puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo
azúcares, cloruro sódico y otros parecidos. Se puede provocar la
absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable por el uso
de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato
de aluminio y gelatina. Ejemplos de portadores, diluyentes,
disolventes o vehículos aceptables incluyen agua, etanol, polioles,
mezclas suyas adecuadas, aceites vegetales (tales como el aceite de
oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.
Ejemplos de excipientes incluyen lactosa, azúcar de leche, citrato
de sodio, carbonato de calcio, fosfato de dicalcio. Ejemplos de
agentes desintegrantes incluyen almindón, ácidos algínicos y
determinados silicatos compuestos. Ejemplos de lubricantes incluyen
estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio, talco, así como
polietilenglicoles de alto peso molecular.
\newpage
"Farmacéuticamente aceptable" significa que
es, dentro del alcance del juicio médico, adecuado para uso en
contacto con las células de humanos y animales inferiores sin una
toxicidad, una irritación, una respuesta alérgica y otros parecidos
no justificados, y están de acorde con una relación
beneficio/riesgo razonable.
"Formas de dosis farmacéuticamente
aceptables" significa formas de dosis del compuesto de la
invención, e incluye, por ejemplo, pastillas, polvos, elixires,
jarabes, preparaciones líquidas, que incluyen suspensiones, sprays,
pastillas para inhalación, lozenges, emulsiones disoluciones,
gránulos, cápsulas y supositorios, así como preparaciones líquidas
para inyecciones, que incluyen preparaciones de liposomas. De forma
general, las técnicas y las formulaciones pueden encontrarse en
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton,
PA, última edición.
"Profármacos farmacéuticamente aceptables"
como se usa aquí significa aquellos profármacos de los compuestos
útiles de acuerdo con la invención que son, dentro del alcance del
juicio médico, adecuados para el uso en contacto con los tejidos de
humanos y animales inferiores sin una toxicidad, una irritación, una
respuesta alérgica, y otros parecidos sin justificar, acordes con
una relación beneficio/riesgo razonable, y eficaces para el uso que
les pretende, así como de las formas zwitteriónicas, si es posible,
de los compuestos de la invención. El término "profármaco"
significa compuestos que se transforman fácilmente in vivo
para dar lugar el compuesto padre de la invención, por ejemplo por
hidrólisis en la sangre. Los grupos funcionales que pueden ser
transformados in vivo fácilmente, mediante ruptura
metabólica, forman una clase de grupos reactiva frente al grupo
carbonilo de los compuestos de esta invención. Incluyen, pero no se
limitan a, grupos tales como alcanoilos (tal como acetilo,
propionilo, butirilo, y otros parecidos), aroilos sustituidos y sin
sustituir (tales como benzoilo y benzoilo sustituido),
alcoxicarbonilos (tales como etoxicarbonilo), trialquilsililos
(tales como trimetil y trietilsililo), monoésteres formados con
ácidos dicarboxílicos (tales como succinilo), y otros parecidos.
Debido a la facilidad con la que se rompen in vivo los grupos
metabólicamente rompibles de los compuestos útiles según esta
invención, los compuestos que portan dichos grupos actúan como
profármacos. Los compuestos que portan los grupos metabólicamente
rompibles tienen la ventaja de que pueden presentar una
biodisponibilidad mejorada como resultado de una mayor solubilidad
y/o de una mayor velocidad de absorción conferida al compuesto
padre en virtud de la presencia del grupo metabólicamente rompible.
Las siguientes referencias proporcionan una profunda discusión sobre
profármacos: Design of Prodrugs, H. Bundgaard, ed. Elsevier, 1985;
Methods in Enzymology, K. Widder y col., ed. Academic Press, 42, p.
309-396, 1985; A Textbook of Drug Design and
Development, Krogsgaard-Larsen y H. Bundgaard, ed.
Chapter 5; "Design and Applications of Prodrugs" p.
113-191, 1991; Advanced Drug Delivery Reviews, H.
Bundgaard, 8, p. 1-38, 1992; Journal of
Pharmaceutical Sciences, 77, p. 285, 1988; Chem. Pharm. Bull., N.
Nakeya y col., 32, p. 692, 1984; Pro-drugs as Novel
Delivery Systems, T. Higuchi y V. Stella, Vol. 14 de la A.C.S.
Symposium Series, y Bioreversible Carriers in Drug Design, Edward
B. Roche, ed. American Pharmaceutical Association y Pergamon Press,
1987, que se incorporan aquí como referencia.
"Sales farmacéuticamente aceptables"
significa las sales ácidas de adición o las sales básicas de adición
inorgánicas y orgánicas relativamente no tóxicas, de los compuestos
de la presente invención. Estas sales pueden ser preparadas in
situ durante el aislamiento y la purificación final de los
compuestos. En particular, las sales ácidas de adición pueden ser
preparadas haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado
en su forma base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado y
aislando la sal formada de ese modo. Sales ácidas de adición
ejemplares incluyen las sales de hidrobromuro, de hidrocloruro, de
sulfato, de bisulfato, de fosfato, de nitrato, de acetato, de
oxalato, de valerato, de oleato, de palmitato, de estearato, de
laurato, de borato, de benzoato, de lactato, de fosfato, de
tosilato, de citrato, de maleato, de fumarato, de succinato, de
tartrato, de naftilato, de mesilato, de glucoheptonato, de
lactiobionato, de sulfamatos, de malonatos, de salicilatos, de
propionatos, de
metilen-bis-b-hidroxinaftoatos,
de gentisatos, de isetionatos, de
di-p-toluoiltartratos,
demetanosulfonatos, de etanosulfonatos, de bencenosulfonatos, de
p-toluensulfonatos, de ciclohexilsulfamatos y de
quinateslaurilsulfonato, y otras parecidas. (Véase, por ejemplo, S.
M. Berge y col., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66: p.
1-19 (1997) que se incorpora aquí como referencia).
Las sales de adición básicas también pueden ser preparadas haciendo
reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma ácida
con una base orgánica o inorgánica adecuada y aislando la sal
formada de ese modo. Las sales de adición básicas incluyen sales
metálicas y de amina farmacéuticamente aceptables. Las sales
metálicas adecuadas incluyen las sales de sodio, de potasio, de
calcio, de bario, de cinc, de magnesio y de aluminio. Se prefieren
las sales de sodio y de potasio. Las sales de adición básicas
inorgánicas adecuadas se preparan a partir de bases metálicas que
incluyen hidruro de sodio, hidróxido de sodio, hidróxido de
potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio, hidróxido de
litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de cinc. Las sales de
adición básicas de amina adecuadas se preparan a partir de aminas
que tienen una basicidad suficiente para formar una sal estable, y
preferiblemente incluyen aquellas aminas que se usan frecuentemente
en la química de la medicina debido a su baja toxicidad y a su
aceptabilidad para el uso médico, amoníaco, etilendiamina,
N-metil-glucamina, lisina, arginina,
omitina, colina, N,N'-dibenciletilendiamina,
cloroprocaína, dietanolamina, procaína,
N-bencilfenetilamina, dietilamina, piperacina,
tris(hidroximetil)-aminometano, hidróxido de
tetrametilamonio, trietilamina, dibencilamina, efenamina,
dehidroabietilamina, trimetilamina, etilamina, aminoácidos básicos,
por ejemplo, lisina y arginina, y diciclohexilamina, y otros
parecidos.
"Forma de dosis sólida" significa que la
forma de dosis del compuesto útil de acuerdo con la invención es en
forma sólida, por ejemplo, cápsulas, pastillas, píldoras, polvos, o
gránulos. En dichas formas de dosis sólidas, el compuesto útil de
acuerdo con la invención es mezclado con al menos un excipiente (o
vehículo) inerte habitual tal como el citrato de sodio o el fosfato
de dicalcio o (a) rellenos o extensores, como por ejemplo,
almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico,
(b) ligantes, como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alignatos,
gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y acacia, (c) humectantes,
como por ejemplo, glicerol, (d) agentes desintegrantes, como por
ejemplo, agar agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de
tapioca, ácido algínico, determinados silicatos compuestos y
carbonato sódico, (e) retardantes de disolución, como por ejemplo
parafina, (f) aceleradores de absorción, como por ejemplo
compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes de mojado, como por
ejemplo alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, (h)
adsorbentes, como por ejemplo, caolín y bentonita, (i) lubricantes,
como por ejemplo talco, estearato de calcio, estearato de magnesio,
polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, (j) agentes
opacifizantes, (k) agentes tamponantes, y agentes que liberan
el(los) compuesto(s) útil(es) de acuerdo con
la invención en una determinada parte del tracto intestinal de una
forma retardada.
"Solvato" significa una asociación física de
un compuesto de esta invención con una o más moléculas de
disolvente. Esta asociación física incluye enlaces de hidrógeno. En
determinados ejemplos será posible aislar el solvato, por ejemplo
cuando una o más moléculas de disolvente se incorporan en la
estructura cristalina del sólido cristalino. "Solvato" abarca
tanto los solvatos en fase disolución como los solvatos aislables.
Ejemplos de solvatos incluyen hidratos, etanolatos, metanolatos, y
otros parecidos.
En una realización específica, el término
"aproximadamente" o "en torno a" significa dentro de un
20%, preferiblemente dentro de un 10%, y más preferiblemente dentro
de un 5% de un valor o intervalo dado.
Una realización preferida de acuerdo con la
invención es un uso en la fabricación de un medicamento para
inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia
Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa.
Otra realización preferida de acuerdo con la
invención es un uso en la fabricación de un medicamento para
inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia
Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa y al
menos un compuesto inhibidor de la proteasa.
Otra realización preferida de acuerdo con la
invención es un uso en la fabricación de un medicamento para
inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia
Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa y al
menos un compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH.
Otra realización preferida de acuerdo con la
invención es un uso en la fabricación de un medicamento para
inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia
Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa y al
menos un compuesto inhibidor de la reductasa de ribonucleótido a
partir del grupo definido más adelante.
Otra realización preferida de acuerdo con la
invención es un uso en la fabricación de un medicamento para
inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia
Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa, al menos
un compuesto inhibidor de la proteasa y al menos un compuesto
inhibidor de la reductasa de ribonucleótido.
Otra realización preferida de acuerdo con la
invención es un uso en la fabricación de un medicamento para
inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia
Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa, al menos
un compuesto inhibidor de la proteasa y al menos un compuesto
inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH.
Otra realización preferida de acuerdo con la
invención es un uso en la fabricación de un medicamento para
inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia
Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa, al menos
un compuesto inhibidor de la reductasa de ribonucleótido y al menos
un compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH.
Otra realización preferida de acuerdo con la
invención es un uso en la fabricación de un medicamento para
inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia
Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa, al menos
un compuesto inhibidor de la proteasa, al menos un compuesto
inhibidor de la reductasa de ribonucleótido y al menos un compuesto
inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH.
Otra realización preferida de acuerdo con la
invención es un uso en la fabricación de un medicamento para
inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia
Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa y al
menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos
inhibidores de la proteasa, dichos compuestos inhibidores de la
reductasa de ribonucleótido y compuestos inhibidores de la
transcriptasa inversa de VIH.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, los compuestos inhibidores de la proteasa son
seleccionados entre Saquinovir, Nelfinavir, Endinovere, Indinavir,
Ritonavir, Crixivan, Viracept, Norvir, y VX-478.
De acuerdo con una realización más preferida de
la invención, el compuesto inhibidor de la proteasa en
Saquinovir.
De acuerdo con otra realización preferida de la
invención, los compuestos inhibidores de la transcriptasa inversa de
VIH son seleccionados entre AZT (Retrovir, zidovudine), ddl (Videx,
didanosine), ddC (Hivid, zalcitabine), d4T (Zerit, stavudine) y 3TC
(Epivir, lamivudine).
De acuerdo con otra realización preferida de la
invención, el compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de
VIH es AZT.
\newpage
Los compuestos inhibidores de la reductasa de
ribonucleótido son seleccionados entre Hidroxiurea (HU),
BW-348U87,
3-aminopiridina-2-carboxaldehído
tiosemicarbazona (3-AP) Amidox (VF 236;
NSC-343341;
N,3,4-trihidroxibencencarboxi midamida), BILD 1257
(2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametileno)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-4-metil)leucina),
BILD 1357
(1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilamida]
de ácido
2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametileno)
asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspártico),
BILD 1633, BILD 733
(3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-[3-metil)valil-L-[3-(pirrolidin-1-ilcarbonil)]alanil-L-(1-carboxiciclopentil)glicil-1-(4-metil)leucinol),
BILD 1263 (ácido
2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol),
BILD 1351 (1-[1(S)-[5(S)-[3-[(all-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclopentanocarboxílico]), CI-F-araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 3243
60; N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-iso-quinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil)amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilen)histidina), Parabactin, Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil)amino]carbonil]-2,3-dihidro-1H-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapine (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidrobencen carboximidamida), y un compuesto de fórmula I.
BILD 1351 (1-[1(S)-[5(S)-[3-[(all-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclopentanocarboxílico]), CI-F-araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 3243
60; N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-iso-quinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil)amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilen)histidina), Parabactin, Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil)amino]carbonil]-2,3-dihidro-1H-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapine (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidrobencen carboximidamida), y un compuesto de fórmula I.
Otra realización preferida de la invención es una
composición que comprende una combinación de un compuesto de
PEG-ASNasa y al menos un compuesto inhibidor de la
reductasa de ribonucleótido como se ha definido con anterioridad y
al menos un compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de
VIH.
Un objetivo adicional de la invención es
proporcionar kits que tienen una pluralidad de ingredientes activos
(con o sin vehículo) que, en conjunto, pueden ser utilizados
eficazmente para llevar a cabo las nuevas terapias de combinación de
la invención.
Otro objetivo de la invención es proporcionar una
nueva composición farmacéutica que es eficaz, por sí misma, para la
utilización en una terapia de combinación beneficiosa debido a que
incluye una pluralidad de ingredientes activos que pueden ser
utilizados en concordancia con la invención.
Sin estar limitado a la teoría, se cree que la
invención opera con el siguiente mecanismo. Las células T son las
células principales en el cuerpo de un mamífero que está infectado
con el virus VIH. Se considera que las células T son las fábricas
víricas para la infección de VIH. Con el objetivo de reinfectar
nuevas células T, el virus de VIH debe entrar en la célula T y debe
ser capaz de replicarse. La replicación vírica y el proceso de
encapsulación requiere la participación de enzimas intracelulares.
La PEG-ASNasa, un compuesto inhibidor de la
síntesis de proteínas específico para células de linaje tímico, se
muestra muy útil en la inhibición de la síntesis de las enzimas
requeridas para la replicación y el montaje de componentes del virus
de VIH y para proporcionar otros efectos antiproliferativos
relacionados con el virus VIH. Además, una combinación de
PEG-ASNasa y uno o más compuestos seleccionados del
grupo que consiste en un compuesto inhibidor de la proteasa, un
compuesto inhibidor de la RT de VIH, y un compuesto inhibidor de la
reductasa de ribonucleótido, tiene un efecto sinérgico en la
reducción de la carga vírica durante prolongados periodos de tiempo.
El mecanismo intracelular por el cual se cree que la
PEG-ASNasa opera es evitar que una célula T
infectada con el virus VIH sintetice proteínas víricas e
intracelulares afectando de forma adversa el suministro del
aminoácido asparagina (Asn). De este modo, tratando las células T
infectadas con una asparaginasa tal como la
PEG-ASNasa, se inhibe la síntesis de proteínas
celulares y víricas. Estas proteínas son necesarias para la
transcripción y la traducción de los genes codificados víricamente a
partir del provirus, ADN de origen vírico integrado en ADN de
mamífero. Una vez que el ARN de origen vírico es transcrito
mediante polimerasas de ARN a partir del provirus, hay dos rutas que
pueden ser seguidas. Este ARN puede ser usado por ribonucleótidos
para producir proteínas de origen vírico, tales como la RT de VIH.
Después, el mismo ARN puede ser procesado por
proteína-rev en ARN genómico de
HTV-1. Este ARN estará unido a una RT de VIH ya
sintetizada y cuando dos de dichas moléculas están presentes juntas
constituyen el material genómico de un nuevo virus VIH, las
proteasas de VIH participan en el procesado de las proteínas de
origen vírico para dar lugar al paquete vírico final. El nuevo
virus VIH-1 puede entonces salir de la célula T como
un nuevo y completo virus. De este modo, un compuesto inhibidor de
la proteasa en combinación con una asparaginasa tal como la
PEG-ASNasa, puede inhibir los procesos requeridos
para la replicación vírica del VIH-1 de un modo
sinérgico.
Las composiciones y métodos de terapia de la
presente invención son útiles en la inhibición de la proteasa de
VIH, en la prevención o el tratamiento de la infección por VIH y en
el tratamiento de las condiciones patológicas posteriores tales como
el SIDA. El tratamiento del SIDA o la prevención o el tratamiento
de la infección por VIH se define incluyendo, pero sin limitarlo,
por el tratamiento de un amplio abanico de estados de infección por
VIH; SIDA, complejo relacionado ARC (SIDA), tanto sintomáticos como
asintomáticos y exposiciones reales o potenciales a VIH. Por
ejemplo, los compuestos de la invención son útiles en el
tratamiento de la infección por VIH después de que se sospeche una
exposición pasada a VIH por, por ejemplo, transfusión de sangre,
intercambio de fluidos corporales, mordiscos, pinchazos accidentales
con agujas, y exposición a la sangre de un paciente durante la
cirugía.
En el método de tratamiento o de prevención de
acuerdo con la invención el compuesto de PEG-ASNasa
y opcionalmente un compuesto seleccionado del grupo que consiste en
un compuesto inhibidor de la proteasa, un compuesto inhibidor de la
transcriptasa inversa de VIH y un compuesto inhibidor de la
reductasa de ribonucleótidos, puede ser administrado de diferentes
modos, tal como en terapias de combinación empleando opcionalmente
procedimientos médicos. Por ejemplo, un compuesto de
PEG-ASNasa y opcionalmente uno o más compuestos del
grupo que consiste en compuestos inhibidores de la proteasa,
compuestos inhibidores de la transcriptasa inversa de VIH y
compuestos inhibidores de la reductasa de ribonucleótidos, puede ser
administrado a un paciente concomitantemente o a tiempos diferentes
puesto que son administrados de tal modo que en determinados
periodos de tiempo hay presentes en el paciente cantidades
farmacéuticamente efectivas de ambos compuestos de tal modo que se
produce un efecto terapéutico de acuerdo con la invención.
De este modo, un objetivo adicional de la
invención es proporcionar un kit para tratar o prevenir un estado
fisiológico asociado al VIH, comprendiendo dicho kit una pluralidad
de recipientes separados, en los que al menos uno de dichos
recipientes contiene un compuesto de PEG-ASNasa y al
menos otro de dichos contenedores contiene uno o más compuestos
seleccionados del grupo que consiste en compuestos inhibidores de la
proteasa, compuestos inhibidores de la transcriptasa inversa de VIH
y compuestos inhibidores de la reductasa de ribonucleótidos, y
dichos recipientes contienen opcionalmente un vehículo
farmacéutico, kit que puede ser utilizado eficazmente para llevar a
cabo terapias de combinación de acuerdo con la invención.
De este modo, un objetivo adicional de la
invención es proporcionar un kit para tratar o prevenir un estado
fisiológico asociado con el VIH, comprendiendo dicho kit una
pluralidad de recipientes separados, en los que al menos uno de
dichos recipientes contiene un compuesto de fórmula I y al menos
otro de dichos recipientes contiene uno o más compuestos
seleccionados del grupo que consiste en compuestos de
PEG-ASNasa, compuestos inhibidores de la proteasa,
compuestos inhibidores de la transcriptasa inversa de VIH y
compuestos inhibidores de la reductasa de ribonucleótidos, y dichos
recipientes contienen opcionalmente un vehículo farmacéutico, kit
que puede ser utilizado eficazmente para llevar a cabo terapias de
combinación de acuerdo con la invención.
Debe entenderse que esta invención cubre todas
las combinaciones apropiadas de los agrupamientos particulares y
preferidos referidos hasta ahora.
Los compuestos de acuerdo con la invención, por
ejemplo, los materiales de partida, los intermedios o los productos,
se preparan como se describe aquí o mediante la aplicación o
adaptación de métodos conocidos, por los que se entiende métodos
usados hasta ahora o descritos en la bibliografía.
Los compuestos útiles de acuerdo con la invención
son suministrados opcionalmente en la forma de sales. Aquellas sales
que son farmacéuticamente aceptables son de particular interés
puesto que son útiles en la administración de los compuestos
precedentes con fines médicos. Las sales que no son
farmacéuticamente aceptables son útiles en los procesos de
fabricación, para fines de aislamiento y purificación, y en algunos
casos, para su uso en la separación de formas estereoisméricas de
los compuestos de esta invención. Esto último es particularmente
válido para sales de amina preparadas a partir de aminas ópticamente
activas.
Cuando el compuesto útil de acuerdo con la
invención contiene un grupo carboxi, o un bioisóstero
suficientemente ácido, se pueden formar sales de adición básicas y
son sencillamente una forma más conveniente para el uso; y en la
práctica, el uso de la forma en sal equivale inherentemente a usar
la forma ácida libre.
También, si el compuesto útil de acuerdo con la
invención contiene un grupo básico, o un bioisóstero suficientemente
básico, se pueden formar las sales de adición básicas y son
sencillamente una forma más conveniente para el uso; y en la
práctica, el uso de la forma en sal equivale inherentemente a usar
la forma básica libre.
Los compuestos precedentes útiles de acuerdo con
la invención también pueden ser mezclados con otro compuesto
terapéutico para formar composiciones farmacéuticas (con o sin
diluyente o vehículo) que, cuando son administradas, proporcionan
una administración simultánea de una combinación de ingredientes
activos dando como resultado una terapia de combinación de la
invención.
Siempre que sea posible que los compuestos útiles
de acuerdo con la invención sean administrados solos es preferible
presentarlos como composiciones farmacéuticas. Las composiciones
farmacéuticas útiles de acuerdo con la presente invención, tanto
para uso veterinario como para uso humano, comprenden al menos un
compuesto de la invención, como se ha definido anteriormente, junto
con uno o más vehículos aceptables y opcionalmente otros
ingredientes terapéuticos.
En determinadas realizaciones preferidas, los
ingredientes activos necesarios en terapias de combinación pueden
ser combinados en una única composición farmacéutica para la
administración simultánea.
La elección del vehículo y el contenido de la
sustancia activa en el vehículo se determinan generalmente en
concordancia con la solubilidad y las propiedades químicas del
compuesto activo, el modo particular de administración y la
provisiones a observar en la práctica farmacéutica. Por ejemplo,
excipientes tales como la lactosa, el citrato sódico, el carbonato
cálcico, el fosfato dicálcico y agentes desintegrantes tales como
el almidón, ácidos algínicos y determinados silicatos complejos
combinados con lubricantes tales como el estearato de magnesio, el
laurilsulfato de sodio y el talco pueden ser usados para preparar
pastillas. Para preparar una cápsula, es ventajoso usar lactosa y
polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se usan
suspensiones acuosas pueden contener agentes emulgentes o agentes
que faciliten la suspensión. También pueden usarse diluyentes tales
como la sacarosa, el etanol, el polietilénglicol, el
propilenglicol, el glicerol y el cloroformo o mezclas de ellos.
La fase aceitosa de las emulsiones de esta
invención puede estar constituida por ingredientes conocidos en una
forma conocida. Puesto que la fase aceitosa puede comprender
simplemente un emulgente (también conocido como un emulsificante),
deseablemente comprende una mezcla de al menos un emulgente con una
grasa o un aceite o con ambos, una grasa y un aceite.
Preferiblemente, se incluye un emulgente hidrofílico junto con un
emulgente lipofílico que actúa como un estabilizante. También se
prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Juntos,
el(los) emulgente(s) con o sin
estabilizante(s) forman la cera emulsificante, y la cera
junto con el aceite y la grasa forman el ungüento emulsificante
base que forma la fase aceitosa dispersa de una formulación de una
crema. Emulgentes y estabilizantes de emulsión adecuados para el
uso en la formulación de la presente invención incluyen Tween® 60,
Span® 80, alcohol cetostearilíco, alcohol bencílico, alcohol
miristílico, monoestearato de glicerilo y laurilsulfato de
sodio.
Si se desea, la fase acuosa de la crema base
puede incluir, por ejemplo, al menos 30% p/p de un alcohol
polihídrico, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos
hidroxilos tales como el propilenglicol, el
butano-1,3-diol, el manitol, el
sorbitol, el glicerol y el polietilénglicol (incluyendo el PEG400) y
mezclas de ellos. Deseablemente, las formulaciones tópicas pueden
incluir un compuesto que potencie la absorción o la penetración del
ingrediente activo a través de la piel o de otras áreas afectadas.
Ejemplos de dichas potenciadores de penetración dermal incluyen
dimetilsulfóxido y otros análogos relacionados.
La elección de aceites o grasas adecuados para la
formulación se basa en alcanzar las propiedades cosméticas deseadas.
De este modo, preferiblemente la crema no debería ser grasienta, no
debería manchar y debería ser un producto lavable de consistencia
adecuada para evitar el derrame desde tubos u otros recipientes. Se
pueden usar ésteres mono o dibásicos de alquilo de cadena lineal o
ramificada, tales como miristato de diisopropilo, oleato de decilo,
palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de
2-etilhexilo o una mezcla de ésteres de cadena
ramificada conocida como Cromadol CAP, siendo los tres últimos los
ésteres preferidos. Estos pueden ser usados solos o en combinación
dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, se
pueden usar lípidos de elevado punto de fusión tales como parafina
blanca suave y/o parafina líquida u otros aceites minerales.
También se pueden emplear composiciones sólidas
como relleno en cápsulas de gelatina rellenas duras y blandas usando
excipientes tales como la lactosa o azúcar de leche así como
polietilenglicoles de alto peso molecular, y otros parecidos.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser
administradas en una formulación adecuada a animales y a humanos
mediante administración tópica o sistémica, incluyendo oral, por
inhalación, rectal, nasal, bucal, sublingual, vaginal, parenteral
(incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradermal,
intratecal y epidural), intracisternal y intraperitoneal. Se
apreciará que la ruta preferida puede variar, por ejemplo, con la
condición del recipiente.
Las formulaciones pueden prepararse en forma de
dosis unitaria por cualquiera de los métodos bien conocidos en la
técnica de la farmacia. Dichos métodos incluyen la etapa de asociar
el ingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más
ingredientes accesorios. En general, las formulaciones son
preparadas asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo y
los vehículos líquidos o los vehículos sólidos finamente divididos
o ambos, y a continuación, si es necesario, afinando el
producto.
Se puede hacer una pastilla por compresión o
moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las
pastillas comprimidas se pueden preparar comprimiendo el ingrediente
activo en una máquina adecuada en una forma de flujo libre tal como
un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un ligante, un
lubricante, un diluyente inerte, un conservante, un agente activo
superficialmente o un agente dispersante. Se pueden hacer pastillas
moldeadas moldeando una mezcla de compuestos en polvo humedecidos
con un diluyente inerte líquido en una máquina adecuada.
Opcionalmente, las pastillas pueden recubrirse o marcarse y pueden
ser formuladas de tal modo que proporcionen una liberación del
ingrediente activo de su interior de una forma lenta y
controlada.
Las composiciones sólidas para la administración
rectal incluyen supositorios, formulados de acuerdo con métodos
conocidos, y que contienen al menos un compuesto de la
invención.
Si se desea, y para una distribución más eficaz,
los compuestos pueden ser microencapsulados en, o unidos a, un
sistema de liberación lenta o de entrega dirigida tal como una
matriz de polímero biodegradable y biocompatible (por ejemplo,
poli(d,1-lactido
co-glicólido)), liposomas, y microesferas, y ser
inyectados subcutáneamente o intramuscularmente mediante una
técnica denominada depósito subcutáneo o intramuscular para
proporcionar una lenta liberación continua del compuesto(s)
durante un periodo de 2 semanas o más. Los compuestos pueden ser
esterilizados, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de
retención de bacterias, o por incorporación de agentes
esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que
pueden ser disueltas en agua esterilizada, o algún otro medio
estéril inyectable inmediatamente antes de su uso.
Los niveles de dosis reales del ingrediente
activo en las composiciones de la invención pueden variarse de tal
modo que se obtenga una cantidad de ingrediente activo que es
eficaz para obtener la respuesta terapéutica deseada para una
composición particular y un método de administración particular. Por
tanto, el nivel de dosis seleccionado depende del efecto
terapéutico deseado, de la ruta de administración, de la duración
deseada para el tratamiento y de otros factores.
La dosis diaria total de los compuestos útiles de
acuerdo con esta invención administrada a un hospedante en dosis
única o dividida puede ser en cantidad, por ejemplo, desde
aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal
diariamente y preferiblemente de 0,01 a 10 mg/kg\cdotdía. Las
composiciones de dosis unitaria pueden contener dichas cantidades
de dichos submúltiplos así como pueden ser usadas para constituir
la dosis diaria. Deberá entenderse, sin embargo, que el nivel de
dosis específico para cualquier paciente en particular dependerá de
una variedad de factores que incluyen el peso corporal, la salud
general, el sexo, la dieta, el tiempo y la ruta de administración,
las velocidades de absorción y excreción, la combinación con otros
fármacos y la gravedad de la enfermedad en particular que se esté
tratando.
La cantidad de cada componente administrado es
determinada por el personal clínico teniendo en consideración la
etiología y la gravedad de la enfermedad, el estado y la edad del
paciente, la potencia de cada componente y otros factores.
Las formulaciones pueden presentarse en
recipientes de dosis unitarias o de multidosis, por ejemplo,
ampollas selladas y viales con tapones elastoméricos, y pueden ser
almacenadas en un estado congelado-secado
(liofilizado) que requiere sólo la adición del vehículo líquido
estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de
su uso. Las disoluciones y las suspensiones de inyección
extemporánea pueden ser preparadas a partir de polvos estériles,
gránulos y pastillas del tipo descrito anteriormente.
Los compuestos de la invención, sus métodos o
preparación y su actividad biológica aparecerán más claramente a
partir del examen de los siguientes ejemplos que se presentan sólo
a modo ilustrativo y que no deben considerarse limitantes de la
invención en cuanto a su alcance.
Los procedimientos para evaluar la actividad
biológica de los compuestos o composiciones de acuerdo con la
invención son llevados a cabo como describe aquí o mediante la
aplicación o adaptación de procedimientos conocidos, por los que se
entiende procedimientos usados hasta ahora o descritos en la
bibliografía.
El siguiente es un procedimiento general para el
ensayo de transcriptasa inversa de VIH:
Día
Uno
- \bullet
- Las muestras son sobrenadantes y pelets obtenidos de los matraces de fármaco \pm virus (incubación durante siete días). No son desactivados por el calor.
- \bullet
- Centrifugar las muestras a 2000 g durante 30 minutos a 4ºC. Usar 2500 rpm para alcanzar 2000 g.
- \bullet
- Transferir el sobrenadante a un tubo etiquetado estéril.
- \bullet
- Añadir 0,5 ml de disolución de PEG
- Usar NaCl 1,2 M como diluyente de PEG.
- Disolución de PEG: 30% p/v, 30 g en 100 ml.
- \bullet
- Mezclar vigorosamente.
- \bullet
- Incubar o/n a 0ºC (sobre hielo en el refrigerador).
Días
Dos
- \bullet
- Centrifugar 500 \mul de las muestras a 8000 g durante 10 minutos a 4ºC. Usar 8000 rpm para alcanzar 8000 g.
- \bullet
- Eliminar el sobrenadante. Ser cuidadoso al eliminar todas las gotas de PEG de las muestras.
- \bullet
- Añadir 40 \mul de disolución tampón de lisis.
- \bullet
- Resuspender el pelet completamente.
- \bullet
- Transferir la suspensión a un tubo de reacción fresco.
- \bullet
- Incubar a temperatura ambiente (25ºC) durante 30 minutos.
- \bullet
- Hacer las diluciones estándar:
\newpage
| Etapa | VIH-1-RT | Tampón de Lisis | Conc. de VIH-1-RT (ng/pocillo) |
| 0 | 0 | 150 MI | 0 |
| 1 | 10 \mul (Disolución 1) | 390 MI | 2,0 |
| 2 | 150 \mul De la Etapa 1 | 150 MI | 1,0 |
| 3 | 150 \mul De la Etapa 2 | 150 MI | 0,5 |
| 4 | 150 \mul De la Etapa 3 | 150 MI | 0,25 |
| 5 | 150 \mul De la Etapa 4 | 150 MI | 0,125 |
| 6 | 150 \mul De la Etapa 5 | 150 MI | 0,0625 |
- \bullet
- Transferir 40 \mul de los patrones a los tubos de reacción (n = 7 x 2).
- \bullet
- Hacer la disolución tampón de reacción:
- Reconstituir el molde (vial 4) en 430 \mul de agua en autoclave.
- Añadir 1 ml de tampón de incubación por vial de nucleótidos (vial 3).
- Añadir 100 \mul del molde reconstituido (vial 4) al vial de la disolución de nucleótidos (vial 3).
- \bullet
- Añadir 20 \mul de tampón de reacción a todos los tubos, desconocidos y patrones.
- \bullet
- Incubar durante hasta 15 horas a 37ºC en una rejilla en la incubadora.
Día
Tres
- \bullet
- Crear un molde para el ensayo Elisa usando wordperfect.
- \bullet
- Abrir los paquetes de hojas de metal y construir un módulo de mtp (placa de microtitulación) usando el marco y las tiras proporcionadas en el kit.
- Desconocidos n =
- Patrón n =
- por tanto, especimenes totales n =
- Tiras que tienen 8 pocillos cada una, por tanto se necesitan _____tiras
Nota
Tienes que redondear hacia arriba hasta el
múltiplo de 8 más próximo.
- \bullet
- Transferir 60 \mul desde los tubos de reacción hasta los correspondientes pocillos del módulo mtp como para el molde.
- \bullet
- Cubrir el mtp con la tira de cobertura proporcionada.
- \bullet
- Incubar a 37ºC en la incubadora durante 1 hora.
- \bullet
- Si es necesario, hacer la disolución de lavado:
Nota
La disolución proporcionada es una disolución
10x, por tanto debe ser diluida usando agua de autoclave.
- Hacer una botellas de disolución de lavado añadiendo 225 ml de agua de autoclave a la botella proporcionada. Mezcla bien. Mantener en hielo durante el ensayo.
- \bullet
- Eliminar la disolución completamente por decantación.
- \bullet
- Lavar la placa 5x usando 250 \mul por aclarado con un tiempo de remojo de 30 segundos antes de decantar.
- \bullet
- Hacer la disolución de trabajo anti-excavación de vaina
- Hacer la disolución de anti-excavación de vaina.
- Añadir 500 \mul de agua de autoclave al vial de anti-excavación de vaina (vial nº 6) almacenado a 4ºC, no congelar.
- Hacer la disolución de anti-excavación de vaina de trabajo.
- Calcular el volumen necesario:
_____ pocillos x 200 \mul =
_____
ml
- Usar 50 \mul de disolución de anti-excavación de vaina (vial nº 6) para cada 4,95 ml de tampón de dilución conjugado (disolución nº 8).
- Añadir ____ ml de disolución de anti-excavación de vaina (vial nº 6)
- A ____ ml de tampón de dilución conjugado (disolución nº 8).
- \bullet
- Añadir 200 \mul de disolución de trabajo anti-excavación de vaina por pocillo de la mtp.
- \bullet
- Cubrir la mtp con la tira de cobertura proporcionada.
- \bullet
- Incubar a 37ºC en la incubadora durante 1 hora.
- \bullet
- Eliminar completamente la disolución por decantación.
- \bullet
- Lavar la placa 5x usando 250 \mul por aclarado con un tiempo de remojo de 30 segundos antes de decantar.
- \bullet
- Hacer la disolución de sustrato abts con potenciador
- Hacer la disolución de substrato abts
- Disolver la mezcla de polvo de abts (vial nº 10) en la botella del tampón de sustrato (botella nº 9)
- Calcular el volumen necesario:
____ pocillos x 200 \mul =
_____
ml
- Añadir la cantidad apropiada de potenciador a la disolución. Usar 1 mg de potenciador de sustrato (vial nº 11) para cada 1 ml de disolución de sustrato de abts (botella nº 9).
- Añadir _____ mg de potenciador de sustrato (vial nº 11) a ____ ml de disolución de sustrato de abts (botella nº 9).
- \bullet
- Añadir 200 \mul de disolución de sustrato de abts con potenciador por pocillo de la mtp.
- \bullet
- Hacer la lectura de la placa a 405 nm (longitud de onda de referencia 490 nm) a 10, 20, y 30 minutos.
La línea de células usada para estos estudios es
CCRF/CEM/O, una línea de células humanas
T-leucémicas. La PEG-ASNasa
(ONCASPAR) es proporcionada por
Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer. El Saquinavir está
disponible comercialmente. Se enriquece un medio
RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) con 10% de
suero fetal de ternero (Gemini Biosource, Calabazas, CA), 5% de
disolución tampón Hepes y 5% de aminoácidos no esenciales (Irvine
Scientific, Irvine, CA). Las concentraciones de fármaco son como
sigue:
\newpage
| PEG-ASNasa IC_{50} sola | 0,4 UI/ml |
| Saquinavir IC_{50} solo | 25 \muM |
| Combinación PEG/SAQ IC_{50}: 0,233 UI/ml +15,52 \muM |
Brevemente, se estimulan 2 x 10^{6} células/ml
con medio PHA+ durante 48 horas a 37ºC con 5% CO_{2}. También, el
mismo número de células es incubadas en un medio libre de PHA
(fitohemaglutinina) durante 48 horas para servir como control
negativo. En este punto, las células son inoculadas con el virus
VIH-1 como en el protocolo estándar. Se añade
PEG-ASNasa y/o Saquinavir a las células en las
concentraciones apropiadas (véase anteriormente). Las células de
control son resuspendidas en un medio libre de fármacos durante lo
que dure la exposición que duró siete días. En el quinto día, se
retiraron dos alícuotas de 1 ml del medio de los matraces y fueron
almacenadas en nitrógeno líquido. En el séptimo día, otras dos
alícuotas de 1 ml de medio fueron retiradas de los matraces y
almacenadas en nitrógeno líquido. Además, las células que quedan
son peletizadas y almacenadas a -80ºC.
Las muestras producidas en este experimento son
numeradas y a continuación se les evalúa la RT de VIH usando el
Ensayo de Transcriptasa Inversa, no radiactivo (Boehringer
Mannheim). Se determina la curva del patrón y se calculan los
niveles de RT de VIH de las muestras experimentales.
La observación principal a partir de los ensayos
de RT de VIH es estos especimenes de células T es que no hay RT de
VIH/virus en el sobrenadante de las células T CEM/O después del
tratamiento. Los resultados de este experimento se muestran en la
Figura 1.
Los pelets de células T en sí mismos son
examinados para evaluar la RT de VIH intracelular. La
PEG-ASNasa a una concentración de 0,4 UI/ml
(concentración IC_{50} aproximada) demostró aproximadamente un
30% de inhibición de RT de VIH. El Saquinavir, el compuesto
inhibidor de la proteasa de VIH, por sí solo a una concentración 25
\muM (concentración IC_{50} aproximada) agotó la actividad de RT
de VIH en aproximadamente un 70% en comparación con la RT de VIH
del control de cultivos de células sin tratar. Por último, hemos
demostrado que la combinación simultánea de
PEG-ASNasa y de Saquinavir es sinérgica, por tanto
las concentraciones IC_{50} de estos fármacos en combinación son
de 0,233 UI/ml y de 14,5 \muM, respectivamente. Estas
concentraciones son mucho menores que sus respectivos valores
IC_{50} en células T CEM/O. El régimen de combinación de
PEG-ASNasa y Saquinavir inhibió intracelularmente la
RT de VIH en aproximadamente un 82,3% en comparación con los
valores de control sin tratar.
Puesto que las células T no liberaron
VIH-1 en el sobrenadante después de estos
tratamientos con fármacos, parece que la PEG-ASNasa
y el Saquinavir no sólo son sinérgicos contra las células T, sino
que también son selectivamente sinérgicos contra el
VIH-1. Estos fármacos son suficientemente supresores
de la liberación de nuevas partículas de VIH-1 al
medio (suero equivalente o plasma de los pacientes). El hecho de
que menores concentraciones de la combinación sean más supresoras de
la RT de VIH que el más activo de los dos fármacos Saquinavir a una
concentración mayor, sugiere firmemente que la combinación está
inhibiendo al VIH de forma selectiva a un nivel de
pro-virus.
Debido a que estos fármacos y su combinación
suprime/inhibe intracelularmente la RT de VIH, esto sugiere que
inhiben al VIH-1 a un nivel de
pro-virus. En otras palabras, el provirus de HIV
integrado está produciendo mARN, el cual no se traduce en proteínas
víricas, y, por tanto, la inhibición de la producción de RT o de las
partículas de virus completas a ser liberadas en el medio. De este
modo, sobre una base teórica, no se podría alcanzar una infección
adicional por VIH-1 de las células no
infectadas.
Experimento
2
Para este experimento se usa una línea de células
T humanas leucémicas, denominadas a partir de aquí como CEM/O. La
PEG-ASNasa se obtiene a partir de
Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc.
bajo el nombre comercial Oncaspar®. El Saquinavir se obtiene a
partir de Roche Laboratories bajo el nombre comercial de Invirase®.
El medio RPMI-1640 obtenido a partir de Irvine
Scientific, Irvine CA, es enriquecido con un 10% con Suero Fetal de
Ternero obtenido a partir de Gemini Biosource, Calabazas, CA, con un
5% de disolución tampón Hepes 1M y con un 5% de aminoácidos no
esenciales obtenidos a partir de Irvine Scientific, Irvine CA.
Se lleva a cabo un experimento para determinar la
citotoxicidad del Saquinavir y de la PEG-ASNasa.
Para determinar la citotoxicidad de cualquiera de los compuestos
por sí solo, se incuban 2 x 10^{5} células/ml en placas de 24
pocillos con las siguientes concentraciones de fármaco:
\newpage
| PEG-ASNasa | 1,0; 0,75; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1; 0,03 UI/ml |
| Saquinavir | 10^{-4}, 10^{-5}, 10^{-6}, 10^{-7} y 10^{-8} M |
La concentración de PEG-ASNasa
que produce una estado citostático en las células CEM/O in
vitro es aproximadamente de 0,5 UI/ml. Las concentraciones de
PEG-ASNasa de 1 y 0,75 UI/ml produjeron una muerte
celular significativa y son citotóxicas para las células CEM/O tras
72 horas. Las concentraciones de 0,03, 0,1, 0,2, 0,3 y 0,4 UI/ml
son ligeramente efectivas para evitar el crecimiento celular en
comparación con el ritmo de crecimiento del control (células sin
tratar). Sin embargo, las células tratadas con
PEG-ASNasa a 0,5 UI/ml mostraron una línea de
crecimiento celular relativamente plana. De este modo, se produce
un efecto citostático con esta concentración tras 72 horas. Por lo
tanto, se usa un intervalo de concentraciones de
PEG-ASNasa que incluye 0,5 UI/ml en las
investigaciones del régimen de combinación. Se muestra un efecto
citotóxico de la PEG-ASNasa, dependiente del
fármaco, de la concentración y del tiempo, sobre esta línea de
células T.
Se determina que la IC_{50} del Saquinavir en
las células CEM/O es 26 \muM después de un periodo de incubación
de 72 horas. Los resultados se muestran en la Figura 2.
Experimentos múltiples independientes con Saquinavir establecieron
una IC_{50} entre 21 y 28 \muM. Concentraciones de Saquinavir
entre 0,001 y 1 \muM no produjeron muerte celular.
Concentraciones de 10 \muM produjeron sólo un 8,76% de muerte
celular en comparación con las muestras de control sin tratar. La
concentración más alta probada, 100 \muM, mató al 99,50% de las
células en comparación con las células de control. De este modo, se
usa un intervalo de concentraciones de Saquinavir entre 1 y 40
\muM en los experimentos posteriores para investigar la terapia
de combinación de Saquinavir y PEG-ASNasa en
células CEM/O.
Experimento
3
En este experimento, el intervalo de
concentraciones descrito se usa para investigar el régimen de
combinación de Saquinavir y PEG-ASNasa. Para los
estudios de combinación secuencial de PEG-ASNasa
seguida de Saquinavir, se incuba células con las concentraciones de
PEG-ASNasa proporcionadas más adelante durante 24
horas. A continuación se añade Saquinavir, en las concentraciones
proporcionadas más adelante, a las células apropiadas durante otras
veinticuatro (24) horas más, llevando el tiempo total de exposición
a cuarenta y ocho (48) horas. La exposición involucró 2 x 10^{5}
células/ml que son incubadas en un matraz de cultivo de tejido con
las concentraciones de los fármacos investigados como se muestra
más adelante. Los resultados se presentan en la Figura 3. Las
concentraciones de fármaco usadas son como sigue:
| PEG-ASNasa | 1,020; 0,765; 0,510; 0,255 y 0,0255 UI/ml |
| Saquinavir | 40, 30, 20, 10 y 1 \mu M |
En todos los estudios in vitro, las
células de control negativo son incubadas en un medio libre de
fármacos durante el mismo periodo y bajo las mismas condiciones que
las muestras experimentales. La densidad de células se mide por
conteo de células usando un Contador Coulter acoplado con un
Canalizador Coulter para cada uno de los matraces experimentales a
24, 48 y 72 horas después de la incubación. Adicionalmente, se
llevan a cabo pruebas de Exclusión de Azul Trypan para cada una de
estas condiciones experimentales. Los números de células son
corregidos para la viabilidad determinada por la prueba de Azul
Trypan y son presentados como un porcentaje del control sin
tratar.
También se probó la secuencia inversa. Los
resultados son presentados en la Figura 4. Se administra Saquinavir
y se incuban las células durante veinticuatro (24) horas seguido de
la adición de PEG-ASNasa y un periodo de incubación
adicional de veinticuatro (24) horas, llevando el tiempo total de
exposición a cuarenta y ocho (48) horas. Diferente de la secuencia
de fármacos, la metodología es la misma que se ha mencionado
inmediatamente antes. También se ha ensayado el régimen de
combinación simultánea usando la misma metodología. Los resultados
se presentan en las Figuras 5, 6 y 7. El experimento de la
metodología combinada simultánea tenía una exposición de las
muestras de cuarenta y ocho (48) horas de exposición combinada
simultánea.
Cada régimen probado mostró efectos sinérgicos
para determinados intervalos ensayados. El régimen combinado
secuencial de PEG-ASNasa seguido de Saquinavir
mostró a sinergia de 1,72 después de cuarenta y ocho horas de
exposición. Esta es similar a las sinergias mostradas en el otro
régimen secuencial y en el régimen simultáneo. La invención muestra
el muy deseable resultado de producir un sinergismo óptimo a un
nivel que permite la supervivencia de algunas células.
Experimento
4
Se llevan a cabo experimentos para determinar el
nivel de aminoácidos en suspensiones de células y en el medio
celular para determinar el efecto de la PEG-ASNasa
sobre los niveles de aminoácidos, particularmente los niveles de
asparagina, glutamina, y ácido aspártico.
Se añaden muestras de 50 \mul de medio y 10
\mul de ácido aminoadópico 1 mM a 450 \mul de metanol frío en
tubos de microfuga de 1,5 ml. Las mezclas se llevan a esta de
vórtice y son centrifugadas a 8700 g durante dos minutos. Los
sobrenadantes son transferidos a tubos de ensayo de vidrio de
borosilicato (13 x 100 mm) y son liofilizados. Los especimenes son
almacenados a -20ºC hasta que son analizados mediante HPLC. Antes
del análisis de HPLC, las muestras son disueltas en un tampón que
contiene un 95% de hidrogenofosfato de disodio 7 nM y un 5% de
acetonitrilo.
Después de una exposición de 24 horas de células
CEM/O a varias concentraciones de PEG-ASNasa, se
observa un agotamiento significativo de asparagina (Asn). El nivel
de asparagina es inferior al 3,0% del control sin tratar. También
se observa en el experimento que usa la mayor concentración de
PEG-ASNasa un agotamiento de glutamina (gln)
dependiente de la dosis hasta niveles que son inferiores al 3,0%
del control sin tratar. Los niveles de ácido aspártico (Asp) son
elevados en comparación con el control sin tratar hasta niveles que
representan un incremento del 200 hasta el 300%. Los resultados se
muestran en la Figura 8. La curva de calibrado usada para calcular
la cantidad de RT de VIH se muestra en la Figura 8a.
Incluso a los niveles más bajos de
PEG-ASNasa ensayados, se observa un agotamiento de
Asn después de veinticuatro horas. Este es consistente con la
capacidad de la PEG-ASNasa para matar células T
ilícitas por agotamiento de aminoácidos vitales, particularmente la
asparagina. La PEG-ASNasa también agota los niveles
de Gln lo que puede ser importante en el mecanismo de destrucción
de las células T.
Experimento
5
Este experimento se lleva a cabo usando un
procedimiento similar, y las mismas concentraciones de materiales
que en el Experimento 1, sin embargo se mide la exposición de ARN de
VIH en pelets de células T a una combinación de
PEG-ASNasa y Saquinavir. Los resultados de este
experimento se muestran en las Tablas 1 y 2 y en las gráficas 9 y
9a. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 2 representa
PEG-ASNasa.
Estos resultados muestran que la
PEG-ASNasa no tuvo un efecto aparente sobre la
producción de ARN de VIH-1, mientras que tuvo un
efecto moderado inhibiendo la RT de VIH del mismo cultivo de
células en el día 7 (véase experimento 5a). Por tanto, la
PEG-ASNasa está inhibiendo la biosíntesis de
proteínas incluso al nivel de la RT de VIH (véase experimento 5a).
El Saquinavir por sí solo tiene un efecto inhibidor sobre la
producción de ARN de VIH-1, inhibiendo
aproximadamente el 36% en comparación con el control (figuras 9 y
9a). La combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir, en
concentraciones sinérgicamente reducidas, dio como resultado la
inhibición de aproximadamente el 12% de la RT de VIH (véase
experimento 5a). Es más, en los mismos cultivos, la combinación de
PEG-ASNasa y Saquinavir, en concentraciones
reducidas, produjo ARN de HTV-1 no detectable hasta
los límites inferiores del ensayo de 400 copias de ARN por pelet.
Estos datos demuestran que el inhibidor de proteína
(PEG-ASNasa) más el inhibidor de proteasa de
HTV-1 (Saquinavir) actúan no sólo de forma
sinérgica sino también de forma selectiva contra la RT de VIH y, más
importante, de forma selectiva contra la producción de ARN de
VIH-1.
Experimento
5a
Este experimento se lleva a cabo usando un
procedimiento similar, y las mismas concentraciones de materias que
en el Experimento 7, sin embargo se mide la exposición del virus
VIH de los pelets de células T a PEG-ASNasa y a
Saquinavir por sí solos, y en combinación. Los resultados de este
experimento se muestran en la Tabla 2a. Debería resaltarse que
"PEG" en la Tabla 2a representa
PEG-ASNasa.
Estos resultados muestran que la
PEG-ASNasa tenía un efecto moderado en la inhibición
de RT de VIH. Por tanto, la PEG-ASNasa está
inhibiendo la biosíntesis de proteínas incluso a nivel de RT de
VIH. El Saquinavir por sí solo también tiene un efecto inhibidor
sobre la RT de VIH-1, inhibiendo aproximadamente el
15% en comparación con el control. La combinación de
PEG-ASNasa y Saquinavir, en concentraciones
sinérgicamente reducidas, dio como resultado la inhibición de
aproximadamente el 12% de la RT de VIH.
Experimento
6
El Experimento 5 ilustra los resultados de la
exposición de ARN de VIH en pelets de células T a una combinación de
PEG-ASNasa y Saquinavir. Sin embargo, el
procedimiento experimental no eliminó la partícula de
HTV-1 del sobrenadante para simular la exposición
continua de las células T al virus VIH-1. De este
modo, siempre hay virus VIH-1 en el sobrenadante de
los cultivos de células T.
Se ha descubierto que la combinación de
PEG-ASNasa y Saquinavir inhibía en un grado
significativo el ARN de VIH en los pelets de células, y, en algunos
pocillos, el ARN de VIH no podía ser cuantificado después de los
tratamientos con la combinación de fármacos PEG + SAQ, por tanto,
habíamos alcanzado la completa inhibición del ARN de VIH.
Se analiza el ARN de VIH de los sobrenadantes de
las células T del experimento 5 y los resultados se muestran en las
Tablas 3 y 4. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 3
representa PEG-ASNasa. La PEG por sí sola inhibió el
ARN de VIH en los sobrenadantes en aproximadamente el 60% y el SAQ
en aproximadamente el 68%. La combinación de PEG + SAQ redujo el ARN
de VIH en el sobrenadante en aproximadamente el 75% en comparación
con el control sin tratar. Este modelo de inhibición de ARN se
ajusta bien con los indicados en los experimentos previos que
presentaban inhibición de RT de VIH y de ARN de VIH en el mismo
experimento.
Puesto que estos fármacos no "matan" el
virus VIH en el sobrenadante, la reducción del ARN de VIH solo se
puede lograr mediante "pérdida" debida a la infección y a la
no regeneración, vía replicación, debido a la inhibición del ciclo
de replicación del virus originada por estos fármacos,
específicamente no se produce ARN de VIH intracelularmente para ser
exportado al medio como partículas de virus VIH completas.
Experimento
7
La línea de células usada para este experimento
es CEM/O, una línea de células T leucémicas humanas. La
PEG-ASNasa (ONCASPAR) es suministrada por
Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer. El Saquinavir está
disponible comercialmente. El AZT se compra a Sigma. El MISID, un
inhibidor de la reductasa de ribonucleótido, es sintetizado
siguiendo el procedimiento descrito en Nandy P., Lien E. J., Avramis
V. I., Med. Chem. Res. 1995, 5: 664-679. Se
enriquece el medio RPMI-1640 (Irvine Scientific,
Irvine, CA) con un 10% de Suero Fetal de Ternero (Gemini Biosource,
Calabazas, CA), con un 5% de disolución tampón Hepes 1M y con un 5%
de aminoácidos no esenciales (Irvine Scientific, Irvine, CA). Las
concentraciones usadas son las siguientes:
| PEG-ASNasa IC_{50} sola | 0,40 UI/ml |
| Saquinavir IC_{50} solo | 25 \muM |
| AZT | 1 \muM |
| MISID (PL-7) | 0,685 \muM |
| Combinación PEG IC_{50} | 0,23 UI/ml |
| Combinación SAQ IC_{50} | 14,52 \muM |
Brevemente, 3 x 10^{6} células/ml son
estimuladas con un medio PHA+ durante 48 horas a 37ºC con un 5% de
CO_{2}. También, el mismo número de células es incubado en un
medio libre de PHA durante 48 horas para servir como control
negativo. En este punto se inocula las células con el virus
VIH-1 según el protocolo estándar. Nótese que en
este experimento, el sobrenadante que contiene VIH de células
mononucleares periféricas (PBMC, del inglés "Peripheral
Mononuclear Cells") sanas humanas estimuladas por PHA no es
eliminado del cultivo de células CEM/O estimulado por PHA. Por
tanto, el virus VIH-1 siempre está presente en el
sobrenadante, un estado experimental que simula el estado clínico
in vivo de las células T sin infectar recién producidas, que
están siempre bajo una exposición constante a las partículas de
VIH-1. Estas partículas de virus son liberadas por
células T ya infectadas y/o por nodos linfáticos de pacientes.
Los fármacos experimentales se añaden a las
células en las concentraciones apropiadas al mismo tiempo que la
inoculación vírica o 90 minutos después de la incubación vírica,
tiempo suficiente para que las células T sean infectadas y
comiencen a producir nuevas partículas del virus
VIH-1. Las células de control son resuspendidas en
un medio libre de fármacos por la duración de la exposición que duró
siete días. Sólo se obtienen alícuotas del medio de los matraces de
control en el 5º día tras Rx. En el 7º día, se eliminan tres
alícuotas del medio de los matraces, de 1 ml cada una, y se
almacenan en nitrógeno líquido. Además, las células que quedan son
divididas en tres partes y a continuación son peletizadas y
almacenadas a -80ºC.
Las muestras producidas a partir de este
experimento son numeradas. Se ensayan los pelets celulares de los
matraces de incubación vírica de 90 minutos para evaluar la RT de
VIH usando un kit ELISA para el Ensayo de Transcriptasa Inversa, no
radiactivo (Boehringer Mannheim). Se determina la curva patrón
(véase Figura 10) y se calculan los niveles de RT de VIH de las
muestras experimentales. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 5 representa
PEG-ASNasa.
Resultados y Discusión: La primera observación a
partir de los ensayos ELISA de la RT de VIH en estos especimenes
procedentes de los pelets celulares de células T CEM/O es que hay
una actividad de RT de VIH disminuida debido al tratamiento con
fármacos, en comparación con las células de control sin tratar. La
inhibición más dramática de la RT de VIH es causada por AZT, un
inhibidor de transcriptasa inversa análoga a nucleósido. Realmente,
nuestro diseño experimental inicial y la búsqueda de una partícula
vírica de VIH de tipo natural, sin mutaciones sobre la RT de VIH
que confieran resistencia al AZT, se muestra con estos resultados de
que el AZT por sí solo es muy activo contra esta cepa vírica.
La PEG-ASNasa o el Saquinavir,
usados como monoterapia en concentraciones IC_{50}, inhibieron la
RT de VIH en un 54% y en un 83%, respectivamente. Estos valores son
similares a los determinados en experimentos anteriores.
El MISID (PL-7), un nuevo
inhibidor de reductasa de ribonucleótido (RR), usado por sí solo en
concentración IC_{50} (0,685 \muM), también demostró una
inhibición del 73% de la RT de VIH. Esta es la primera evidencia de
que un miembro de esta clase de inhibidores RR ha demostrado
actividad anti-VIH además de su actividad
antileucémica. La razón bioquímica para la inhibición de VIH por
esta clase de compuestos es el agotamiento intracelular de los focos
de dNTP. La escasez o la reducción de los focos de dNTP inhibirá la
función de la RT de VIH, convirtiendo el ARN de VIH en ADN
provírico antes de la integración en el ADN genómico de un
mamífero.
Las combinaciones de PEG + SAQ dieron como
resultado una completa inhibición de la RT de VIH en este
experimento. Las combinaciones de tres fármacos, AZT + PEG + SAQ,
dieron como resultado la completa inhibición de la RT de VIH en dos
de los tres pocillos, y el valor del tercer pocillo es inhibido en
un 95,3% del control. La explicación bioquímica de esta combinación
de fármacos es que el AZT inhibirá la infección adicional por RT de
VIH y que esta inhibición será potenciada por el ya muy eficaz
efecto anti-RT de VIH del régimen de PEG + SAQ.
Puesto que los números están próximos al 100% de inhibición de RT
de VIH es extremadamente difícil demostrar una mejora en la
inhibición de los tres fármacos sobre el régimen de dos fármacos en
este sistema modelo de células T infectadas con un virus VIH de tipo
natural. En experimentos con VIH parcialmente resistente a AZT, como
aparece en los pacientes, el régimen puede demostrar la validez del
anterior silogismo bioquímico.
Combinaciones de cuatro fármacos, MISID + AZT +
PEG + SAQ, dieron como resultado una completa inhibición de la RT de
VIH en dos de los tres pocillos, y el valor del tercer pocillo es
inhibido en un 95% del control. Estos valores son superponibles al
régimen de tres fármacos, debido al máximo de inhibición de RT de
VIH. La explicación bioquímica para esta combinación es que el
MISID, el inhibidor RR, agotará los focos de dNTP y esto potenciará
la actividad del trifosfato de AZT (AZTTP) contra la RT de VIH.
Este efecto inhibidor aumentado será o aditivo o sinérgico con
respecto al ya selectivamente sinérgico efecto de una proteína junto
con inhibidores de proteasa contra ente virus. Puesto que el MISID
por sí solo parece tener una considerable actividad
anti-RT de VIH, creemos que este silogismo
demostrará ser correcto en experimentos con partículas de VIH
resistentes a uno o más de estos tipos de fármacos o en pacientes
que estén infectados con variantes de VIH multirresistentes.
Por lo tanto, estos resultados muestran que los
siguientes regímenes de 3 ó 4 fármacos, de AZT + PEG + SAQ o MISID +
AZT + PEG + SAQ, actúan de forma sinérgica contra la RT de VIH.
Experimento
8
La línea de células usada para este experimento
es CEM/O, una línea de células T humanas leucémicas. La
PEG-ASNasa (ONCASPAR) es suministrada por
Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer. El Saquinavir (SQ) está
disponible comercialmente. El AZT se compra a Sigma. El MISID, un
inhibidor de reductasa de ribonucleótido, es como se ha descrito en
Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Med. Chem. Res. 1995, 5:
664-679. Se enriquece el medio
RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) con un
10% de Suero Fetal de Ternero (Gemini Biosource, Calabazas, CA), con
un 5% de disolución tampón Hepes 1M y con un 5% de aminoácidos no
esenciales (Irvine Scientific, Irvine, CA). Las concentraciones
usadas son las siguientes:
\newpage
| PEG-ASNasa IC_{50} sola | 0,40 UI/ml |
| Saquinavir IC_{50} solo | 25 \muM |
| AZT | 1 \muM |
| MISID | 0,685 \muM |
| Combinación PEG IC_{50} | 0,23 UI/ml |
| Combinación SAQ IC_{50} | 14,52 \muM |
Brevemente, 3 x 10^{6} células/ml son
estimuladas con un medio PHA+ durante 48 horas a 37ºC con un 5% de
CO_{2}. También, el mismo número de células es incubado en un
medio libre de PHA durante 48 horas para servir como control
negativo. En este punto se inocula las células con el virus
VIH-1 según el protocolo estándar. Nótese que en
este experimento, el sobrenadante que contiene VIH de células
mononucleares periféricas (PBMC, del inglés "Peripheral
Mononuclear Cells") sanas humanas estimuladas por PHA no es
eliminado del cultivo de células CEM/O estimulado por PHA. Por
tanto, el virus VIH-1 siempre está presente en el
sobrenadante, una estado experimental que simula el estado clínico
in vivo de las células T sin infectar recién producidas, que
están siempre bajo una exposición constante a las partículas de
VIH-1. Estas partículas de virus son liberadas por
células T ya infectadas y/o por nodos linfáticos de pacientes.
Los fármacos experimentales se añaden a las
células en las concentraciones apropiadas al mismo tiempo que la
inoculación vírica o 90 minutos después de la incubación vírica,
tiempo suficiente para que las células T sean infectadas y
comiencen a producir nuevas partículas del virus
VIH-1. Las células de control son resuspendidas en
un medio libre de fármacos por la duración de la exposición que duró
siete días. Sólo se obtienen alícuotas del medio de los matraces de
control en el 5º día tras Rx. En el 7º día, se eliminan tres
alícuotas del medio de los matraces, de 1 ml cada una, y se
almacenan en nitrógeno líquido. Además, las células que quedan son
divididas en tres partes y a continuación son peletizadas y
almacenadas a -80ºC.
Las muestras producidas a partir de este
experimento son numeradas. Se evalúa cuantitativamente el ARN de VIH
de los pelets de células de los cultivos celulares (véase el
Experimento 7) de los matraces de incubación vírica de 90 minutos
usando un kit de ensayo, no radiactivo. Se determina la curva
patrón y se calculan los niveles de ARN de HTV de las muestras
experimentales como se ha descrito previamente.
Estos especimenes sobrenadantes son los
procedentes de los cultivos de los pelets de células T del
Experimento 7. Estos resultados se describen en el Experimento
7.
La primera observación a partir de los ensayos
ELISA de RT de VIH en estos especimenes de los sobrenadantes de las
células T CEM/O es que hay una actividad de RT de VIH disminuida en
el séptimo día debido al tratamiento con fármacos, en comparación
con las células de control sin tratar del mismo día. Es de
importancia que los controles sin tratar para el 5º día (un valor)
tuvieran una O.D. de RT de VIH mayor que para el 7º día. Examinamos
los valores de O.D., que son todos inferiores que las
concentraciones mínimas cuantificadas basadas en la linealidad de
la curva de calibrado. Sólo uno de los especimenes sobrenadantes
(nº 7), tratado sólo con PEG-ASNasa, obtuvo un valor
O.D. en el ensayo superior al control negativo, y aún así inferior
a la media de los tres sobrenadantes de cultivo de control sin
tratar.
El SAQ (Especimenes nº 9 y nº 10), el AZT
(Especimenes nº 11 y nº 13) y el MISID (Especimenes nº 15 y nº 16),
como agentes sencillos (Véase la Tabla 6. Debería resaltarse que
"PEG" en la Tabla 6 representa PEG-ASNasa)
causan una gran inhibición de la RT de VIH en términos cuantitativos
(menos del 66% del valor del control Negativo de 0,075 O.D. o de
0,05 O.D.). Se observa una inhibición de la RT de VIH incluso mayor
con la combinación de SAQ + PEG-ASNasa, tres
especimenes nº 17, 18 y 19, en un espécimen del régimen de
combinación de tres fármacos de PEG-ASNasa + SAQ +
AZT, espécimen nº 22, y en todos los tres especimenes tratados con
el régimen de combinación de cuatro fármacos de
PEG-ASNasa + SAQ + AZT + MISID, nº 23, 24 y 25.
Nuestro diseño de experimentos inicial y nuestra
búsqueda de una partícula de virus VIH de tipo natural, sin
mutaciones de la RT de VIH que le confieran resistencia al AZT, se
muestra de hecho con estos resultados de que el AZT por sí solo es
muy activo contra esta cepa vírica.
El MISID, un nuevo inhibidor de reductasa de
ribonucleótido (RR), usado por sí solo en la concentración IC_{50}
(0,685 \muM), también demostró una inhibición significativa de la
RT de VIH como agente sencillo y en combinación con los otros tres
fármacos. Este es también el resultado en los pelets de células
(véase el experimento 7) y es la primera evidencia de un miembro de
esta clase de inhibidores de RR que demuestra actividad
anti-VIH además de su actividad antileucémica tanto
intracelularmente como en los especimenes sobrenadantes de estos
cultivos de células T.
Las combinaciones de PEG + SAQ dieron como
resultado la completa inhibición de la RT de VIH en este y en el
anterior experimento en los pelets de células. En los experimentos
previos hay un 96% de inhibición de la RT de VIH (véase el
experimento 7). Las combinaciones de tres fármacos, AZT + PEG + SAQ,
dieron como resultado la completa inhibición de la RT de VIH en dos
de los tres pocillos, y el valor del pocillo es inhibido en un
95,3% del control, mientras que en los sobrenadantes se observa un
comportamiento idéntico, especimenes nº 20-22.
Las combinaciones de cuatro fármacos, MISID + AZT
+ PEG + SAQ, dieron como resultado una completa inhibición de la RT
de VIH en todos los tres especimenes sobrenadantes, cuyos valores se
corresponden con los valores determinados en los pelets de células
del mismo experimento. Estos valores son superponibles a los del
régimen de tres fármacos, debido a la máxima inhibición de la RT de
VIH, como se ha determinado anteriormente.
La explicación bioquímica para esta combinación
es que el MISID, el inhibidor de RR, agotará los focos de dNTP y
esto potenciará la actividad del trifosfato de AZT (AZTTP), contra
la RT de VIH. Este efecto inhibidor aumentado será o bien aditivo o
bien sinérgico con los efectos ya selectivamente sinérgicos de una
proteína más inhibidores de proteasa contra este virus. Puesto que
el MISID por sí solo parece tener una considerable actividad
anti-RT de VIH creemos que este silogismo se
demostrará ser correcto en los experimentos con partículas de VIH
resistentes a uno o más de estos tipos de fármacos o en pacientes
que están infectados con variantes de VIH multirresistentes.
Experimento
9
La línea de células usada para este experimento
es CEM/O, una línea de células T humanas leucémicas. La
PEG-ASNasa (ONCASPAR) es suministrada por
Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer. El Saquinavir (SQ)
está disponible comercialmente. El AZT se compra a Sigma. El MISID,
un inhibidor de reductasa de ribonucleótido, es como se ha descrito
en Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Med. Chem. Res. 1995, 5:
664-679. Se enriquece el medio
RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) con un 10%
de Suero Fetal de Ternero (Gemini Biosource, Calabazas, CA), con un
5% de disolución tampón Hepes 1M y con un 5% de aminoácidos no
esenciales (Irvine Scientific, Irvine, CA). Las concentraciones
usadas son las siguientes:
| PEG-ASNasa IC_{50} sola | 0,40 UI/ml |
| Saquinavir IC_{50} solo | 25 \muM |
| AZT | 1 \muM |
| MISID | 0,685 \muM |
| Combinación PEG IC_{50} | 0,23 UI/ml |
| Combinación SAQ IC_{50} | 14,52 \muM |
Brevemente, 3 x 10^{6} células/ml son
estimuladas con un medio PHA+ durante 48 horas a 37ºC con un 5% de
CO_{2}. También, el mismo número de células es incubado en un
medio libre de PHA durante 48 horas para servir como control
negativo. En este punto se inocula las células con el virus
VIH-1 según el protocolo estándar. Nótese que en
este experimento, el sobrenadante que contiene VIH de células
mononucleares periféricas (PBMC, del inglés "Peripheral
Mononuclear Cells") sanas humanas estimuladas por PHA no es
eliminado del cultivo de células CEM/O estimulado por PHA. Por
tanto, el virus VIH-1 siempre está presente en el
sobrenadante, una estado experimental que simula el estado clínico
in vivo de las células T sin infectar recién producidas, que
están siempre bajo una exposición constante a las partículas de
VIH-1. Estas partículas de virus son liberadas por
células T ya infectadas y/o por nodos linfáticos de pacientes.
Los fármacos experimentales se añaden a las
células en las concentraciones apropiadas al mismo tiempo que la
inoculación vírica o 90 minutos después de la incubación vírica,
tiempo suficiente para que las células T sean infectadas y
comiencen a producir nuevas partículas del virus
VIH-1. Las células de control son resuspendidas en
un medio libre de fármacos por la duración de la exposición que duró
siete días. Sólo se obtienen alícuotas del medio de los matraces de
control en el 5º día tras Rx. En el 7º día, se eliminan tres
alícuotas del medio de los matraces, de 1 ml cada una, y se
almacenan en nitrógeno líquido. Además, las células que quedan son
divididas en tres partes y a continuación son peletizadas y
almacenadas a -80ºC.
Las muestras producidas a partir de este
experimento son numeradas. Se evalúa cuantitativamente el ARN de VIH
de los pelets de células de los cultivos celulares (véase el
Experimento 7) de los matraces de incubación vírica de 90 minutos
usando un kit de ensayo, no radiactivo. Se determina la curva
patrón y se calculan los niveles de ARN de HTV de las muestras
experimentales como se ha descrito previamente.
Los especimenes proceden de los cultivos de
pelets de células T y son del mismo experimento que aquellos que
presentamos para los resultados de RT de VIH. Estos resultados se
discuten en el Experimento 7 (pelets de células) y en el
Experimento 8 (sobrenadante).
La primera observación a partir de los ensayos
cuantitativos de ARN de VIH en estos especimenes de células T CEM/O
es que hay una actividad de ARN de VIH disminuida en el séptimo día
debido al tratamiento con fármacos, en comparación con las células
de control sin tratar en el mismo día. Los resultados cuantitativos
se muestran en la Tabla 7 y en la Figura 11. Debería resaltarse que
"PEG" en la Tabla 7 representa PEG-ASNasa.
La inhibición de ARN de VIH en términos
cuantitativos causada por el AZT solo (especimenes nº 11 a 13) es
superior (virus VIH-1 sensible a AZT), seguida por
SAQ y MISID como agentes sencillos. Se observa una mayor inhibición
de ARN de VIH por la combinación de SAQ +
PEG-ASNasa, 38% del control, y a partir de la
combinación de tres fármacos, PEG-ASNasa + SAQ +
AZT, 30% del control. Los tres especimenes tratados con el régimen
de combinación de cuatro fármacos, PEG-ASNasa + SAQ
+ MISID + AZT, nº 23, 24 y 25, presentan las mayores inhibiciones de
ARN de VIH de este experimento, 20% del control, demostrando
claramente la significativa contribución del inhibidor de reductasa
de ribonucleótido, MISID.
El MISID, un nuevo inhibidor de reductasa de
ribonucleótido (RR), usado por sí solo en la concentración IC_{50}
(0,685 \muM), también demostró una significativa inhibición de
ARN de VIH como agente sencillo y, más importante, en combinación
con los otros tres fármacos. Este es también el resultado en los
pelets de células (Experimento 6) y es la evidencia repetida de que
un miembro de esta clase de inhibidores de RR ha demostrado una
actividad anti-VIH además de su actividad
antileucémica tanto intracelularmente como en los especimenes del
sobrenadante de estos cultivos de células T.
La explicación bioquímica de esta combinación es
que el MISID, el inhibidor de RR, agotará los focos de dNTP y esto
potenciará la actividad del trifosfato de AZT (AZTTP), contra la
integración y replicación del VIH, reduciendo de este modo el ARN
de VIH. Este efecto inhibidor aumentado será o bien aditivo o bien
sinérgico con el efecto ya selectivamente sinérgico de una proteína
más inhibidores de proteasa contra este virus. Puesto que el MISID
por sí solo parece tener una considerable actividad inhibidora
anti-ARN de VIH, creemos que el silogismo demostrará
ser correcto en experimentos con partículas de VIH resistentes a
uno o más de estas clases de fármacos o en pacientes que están
infectados con variantes de VIH multirresistentes.
Experimento
10
La línea de células usada para este experimento
es CEM/O, una línea de células T humanas leucémicas. La
PEG-ASNasa (ONCASPAR) es suministrada por
Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer. El Saquinavir (SQ) está
disponible comercialmente. El AZT se compra a Sigma. El MISID, un
inhibidor de reductasa de ribonucleótido, es como se ha descrito en
Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Med. Chem. Res. 1995, 5:
664-679. Se enriquece el medio
RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) con un
10% de Suero Fetal de Ternero (Gemini Biosource, Calabazas, CA), con
un 5% de disolución tampón Hepes 1M y con un 5% de aminoácidos no
esenciales (Irvine Scientific, Irvine, CA). Las concentraciones
usadas son las siguientes:
| PEG-ASNasa IC_{50} sola | 0,40 UI/ml |
| Saquinavir IC_{50} solo | 25 \muM |
| AZT | 1 \muM |
| MISID | 0,685 \muM |
| Combinación PEG IC_{50} | 0,23 UI/ml |
| Combinación SAQ IC_{50} | 14,52 \muM |
Brevemente, 3 x 10^{6} células/ml son
estimuladas con un medio PHA+ durante 48 horas a 37ºC con un 5% de
CO_{2}. También, el mismo número de células es incubado en un
medio libre de PHA durante 48 horas para servir como control
negativo. En este punto se inocula las células con el virus
VIH-1 según el protocolo estándar. Nótese que en
este experimento, el sobrenadante que contiene VIH de células
mononucleares periféricas (PBMC, del inglés "Peripheral
Mononuclear Cells") sanas humanas estimuladas por PHA no es
eliminado del cultivo de células CEM/O estimulado por PHA. Por
tanto, el virus VIH-1 siempre está presente en el
sobrenadante, un estado experimental que simula el estado clínico
in vivo de las células T sin infectar recién producidas, que
están siempre bajo una exposición constante a las partículas de
VIH-1. En este experimento hemos observado títulos
de VIH-1 mucho mayores que para nuestro ARN de VIH
de control en las células T (véase el Experimento 9). Estas
partículas de virus son liberadas por células T ya infectadas y/o
por nodos linfáticos de pacientes.
Los fármacos experimentales se añaden a las
células en las concentraciones apropiadas al mismo tiempo que la
inoculación vírica o 90 minutos después de la incubación vírica,
tiempo suficiente para que las células T sean infectadas y
comiencen a producir nuevas partículas del virus
VIH-1. Las células de control son resuspendidas en
un medio libre de fármacos por la duración de la exposición que duró
siete días. Sólo se obtienen alícuotas del medio de los matraces de
control en el 5º día tras Rx. En el 7º día, se eliminan tres
alícuotas del medio de los matraces, de 1 ml cada una, y se
almacenan en nitrógeno líquido. Además, las células que quedan son
divididas en tres partes y a continuación son peletizadas y
almacenadas a -80ºC. Los especimenes del sobrenadante se obtienen de
estos cultivos de células T y son congelados a -80ºC. Las muestras
producidas a partir de este experimento son numeradas. Se evalúa
cuantitativamente el ARN de VIH de los pelets de células de los
cultivos celulares (véase el Experimento 9) de los matraces de
incubación vírica de 90 minutos usando un kit de ensayo, no
radiactivo. Aquí describimos los resultados cuantitativos de ARN de
VIH procedentes de los sobrenadantes de estas células T. Se
determina la curva patrón y se calculan los niveles de ARN de HTV
de las muestras experimentales como se ha descrito previamente.
Estos especimenes proceden de los cultivos de
pelets de células T del mismo experimento que aquellos de los que
hemos presentado los resultados de RT de VIH (véase el Experimento
8) y de ARN de VIH cuantitativo en células T (véase el Experimento
9).
La primera observación a partir de los ensayos
cuantitativos de ARN de VIH en los especimenes de sobrenadante de
células T CEM/O es que hay una actividad de ARN de HTV disminuida
en el séptimo día debido al tratamiento con fármacos, en
comparación con las células de control sin tratar para el mismo día.
Los resultados cuantitativos se muestran en la tabla adjunta (Tabla
8). Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 8 representa
PEG-ASNasa. Los niveles de ARN de HTV de control
cuantitativos (copias genómicas de virus/ml) son superiores a los
de los experimentos previos y son similares a los niveles del
control sin tratar (214445 en pelets de células T frente a 195483
en los sobrenadantes).
La inhibición de ARN de VIH en términos
cuantitativos causada por SAQ, AZT o MISID por sí solos (Especimenes
nº 8 a 12), no es estadísticamente significativa entre ellos
(virus HTV-1 sensible a AZT). Se observan
porcentajes de inhibición similares de ARN de VIH en los
sobrenadantes tanto para la combinación SAQ +
PEG-ASNasa, como para la combinación de tres
fármacos PEG-ASNasa + SAQ + AZT, en comparación con
el control sin tratar. Sin embargo, todos los tres especimenes
tratados con el régimen de combinación de cuatro fármacos, MISID +
AZT + PEG-ASNasa + SAQ, nº 23, 24 y 25, tienen la
mayor inhibición de ARN de VIH de este experimento, 50% del control,
demostrando claramente la significativa contribución del inhibidor
de reductasa de ribonucleótido, el MISID. Este último conjunto de
datos confirma la observación anterior de la inhibición de ARN de
VIH mostrada en los pelets de células T de un 20% del control
(Experimento 9). Los datos procedentes de experimentos previos y
esta evidencia indican que a mayor título de VIH restante en el
sobrenadante, menor sería la inhibición del virus tanto en las
células T como en el sobrenadante. En otras palabras, los datos
sugieren que a) estos regímenes de combinación deben darse de forma
continua en estas condiciones, es decir, en pacientes con un elevado
número de copia de ARN de VIH y/o viremia, y b) se requiere la
potenciación de AZT + SAQ tanto por un tercer inhibidor de RT, tal
como 3TC, como por un inhibidor de RR, tal como MISID o hidroxiurea,
para potenciar la actividad del trifosfato de AZT (AZTTP) contra la
RT de VIH.
El MISID, un nuevo inhibidor de reductasa de
ribonucleótido (RR), usado por sí solo en la concentración IC_{50}
(0,685 \muM), también demostró una inhibición significativa del
ARN de VIH como agente sencillo que es aproximadamente igual a la
inhibición tanto de SAQ como de AZT. Más importante, el MISID
mostró su significativa utilidad en combinación con los otros tres
fármacos tanto contra RT de VIH en pelets de células T como en
sobrenadantes (véase los Experimentos 7 y 8), respectivamente, y en
la supresión el ARN de VIH restante en el sobrenadante (Tabla 8).
Éste es también el resultado en los pelets de células T (véase los
Experimentos 6 y 9) y es una evidencia repetida de que un miembro
de esta clase de inhibidores de RR ha demostrado actividad
anti-VIH además de su actividad antileucémica tanto
intracelularmente como en los especimenes del sobrenadante de estos
cultivos de células T.
La explicación bioquímica para esta combinación
es que el MISID, el inhibidor de RR, agotará los focos de dNTP y
esto potenciará la actividad del AZTTP, contra la transcripción
inversa, la integración y la replicación de VIH-1,
reduciendo de este modo el ARN de VIH. Este efecto inhibidor
aumentado será o bien aditivo o bien sinérgico con el efecto ya
selectivamente sinérgico de una proteína más inhibidores de
proteasa contra este virus. Puesto que el MISID por sí solo parece
tener una considerable actividad inhibidora
anti-ARN de VIH, creemos que este silogismo se
mostrará correcto en experimentos con partículas de VIH resistentes
a una o más de estas clases de fármacos o en pacientes que están
infectados con variantes de VIH multirresistentes.
Experimento
10
Este experimento se lleva a cabo usando un
procedimiento similar, y las mismas concentraciones de materias que
en el Experimento 9, sin embargo se usa 3TC en lugar de MISID. En
este experimento se mide la exposición de RT de VIH en pelets de
células T a una combinación de PEG-ASNasa,
Saquinavir, AZT y 3TC. Los resultados de este experimento se
muestran en la Tabla 9. Debería resaltarse que "PEG" en la
Tabla 9 representa PEG-ASNasa. Se muestra en la
Tabla 9 que hay algo de inhibición de RT de HTV debida al
Saquinavir y a la PEG-ASNasa por sí solos. Sin
embargo, la combinación de PEG-ASNasa, Saquinavir,
AZT y 3TC da como resultado la completa inhibición de la RT de
VIH.
\newpage
Experimento
11
Este experimento se lleva a cabo usando un
procedimiento similar, y las mismas concentraciones de materias que
en el Experimento 10, sin embargo se mide la exposición de ARN de
VIH en sobrenadantes de células T a una combinación de
PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y 3TC. Los resultados de
este experimento se muestran en la Tabla 10. Debería resaltarse que
"PEG" en la Tabla 10 representa PEG-ASNasa. Se
muestra en la Tabla 10 que hay algo de inhibición de ARN de VIH
debida al Saquinavir y a la PEG-ASNasa por sí solos
(aproximadamente 55% y 73% del control, respectivamente). La
combinación de PEG-ASNasa, Saquinavir, y AZT da como
resultado una mayor inhibición del ARN de VIH (aproximadamente 21%
del control). Sin embargo, la combinación de
PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y 3TC da como resultado
la completa inhibición del ARN de VIH (0% del control) (véase la
Tabla 10).
La presente invención puede ser manifestada en
otras formas específicas sin distanciarse de su espíritu ni de sus
atributos esenciales.
Claims (17)
1. El uso de un compuesto de
PEG-ASNasa junto con al menos un compuesto
seleccionado del grupo que consiste en compuestos inhibidores de
proteasa, compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido y
compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, en el que
dichos compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido son
seleccionados entre hidroxiurea (HU), BW-348U87,
tiosemicarbazona de
3-aminopiridina-2-carboxaldehído
(3-AP), Amidox (VF 236; NSC-343341;
N,3,4-trihidroxibencencarboximidamida), BILD 1257
(2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucina),
BILD 1357
(1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilamida]
de ácido
2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspártico),
BILD 1633, BILD 733
(3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-(3-metil)valil-L-[3-(pirrolidin-1-ilcaronil)]alanil-L-(1-carboxiciclopentil)glicil-L-(4-metil)leucinol,
BILD 1263 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol), BILD 1351 (ácido 1-[1(S)-[5(S)-[3-[todo-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclo-
pentanocarboxílico), Cl-F-araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabino furanosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 324360; N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil)amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilencitidina), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil) amino]carbonil]-2,3-dihidro-IH-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapina (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidroxibencen carboximidamida), en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) o para inhibir la producción, o limitar la propagación, del VIH en una población de células expuestas al medicamento.
BILD 1263 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol), BILD 1351 (ácido 1-[1(S)-[5(S)-[3-[todo-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclo-
pentanocarboxílico), Cl-F-araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabino furanosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 324360; N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil)amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilencitidina), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil) amino]carbonil]-2,3-dihidro-IH-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapina (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidroxibencen carboximidamida), en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) o para inhibir la producción, o limitar la propagación, del VIH en una población de células expuestas al medicamento.
2. El uso de un compuesto de
PEG-ASNasa, comprendiendo dicho compuesto de
PEG-ASNasa asparaginasa conjugada con el
polietilenglicol y vendido con el nombre de ONCASPAR®, como único
ingrediente activo en la fabricación de un medicamento para inhibir
o tratar la infección del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) o
para inhibir la producción, o limitar la propagación, del VIH en
una población de células expuestas al medicamento.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que dicho compuesto de PEG-ASNasa está en
combinación con al menos un compuesto inhibidor de proteasa.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que dicho compuesto de PEG-ASNasa está en
combinación con al menos un compuesto inhibidor de reductasa de
ribonucleótido.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que dicho compuesto de PEG-ASNasa está en
combinación con al menos un compuesto inhibidor de transcriptasa
inversa de VIH.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que los compuestos inhibidores de proteasa son seleccionados
entre Saquinovir, Nelfinavir, Indinavir, Endinovere, Ritonavir,
Crixivan, Viracept, Norvir, y VX-478.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el compuesto inhibidor de proteasa es Saquinavir o
Endinovere.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el compuesto inhibidor de proteasa es Saquinavir.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que los compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH
son seleccionados entre AZT (Retrovir, zidovudina), ddl (Videx,
didanosina), ddC (Hivid, zalcitabina), d4T (Zerit, estavudina) y 3TC
(Epivir, lamivudina).
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en
el que los compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH
son AZT (Retrovir, zidovudina) y 3TC (Epivir, lamivudina).
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el compuesto inhibidor de transcriptasa inversa de VIH es
AZT (Retrovir, zidovudina).
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o
con la reivindicación 2, en el que dicho medicamento es para
inhibir la producción, o limitar la propagación, del VIH en una
población de células expuestas a la composición.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o
con la reivindicación 2, en el que dicho medicamento es para la
inhibición o el tratamiento de VIH.
14. Un kit para tratar o prevenir un estado
fisiológico asociado al VIH, comprendiendo dicho kit una pluralidad
de recipientes separados, en el que al menos uno de dichos
recipientes contiene una compuesto de PEG-ASNasa y
al menos otro de dichos recipientes contiene uno o más compuestos
seleccionados del grupo que consiste en un compuesto inhibidor de
proteasa, un compuesto inhibidor de transcriptasa inversa de VIH y
un compuesto inhibidor de reductasa de ribonucleótido, y
opcionalmente dichos recipientes contienen un vehículo farmacéutico,
en el que dichos compuestos inhibidores de reductasa de
ribonucleótido son seleccionados entre hidroxiurea (HU),
BW-348U87, tiosemicarbazona de
3-aminopiridina-2-carboxaldehído
(3-AP), Amidox (VF 236; NSC-343341;
N,3,4-trihidroxibencen carboximidamida), BILD 1257
(2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucina),
BILD 1357
(1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilamida]
de ácido
2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)
asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)
aspártico), BILD 1633, BILD 733
(3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-(3-metil)valil-L-[3-(pirrolidin-1-ilcaronil)]alanil-L-(1-carboxiciclopentil)glicil-L-(4-metil)leucinol,
BILD 1263
(2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol),
BILD 1351 (ácido
1-[1(S)-[5(S)-[3-[todo-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclopentanocarboxílico),
Cl-F-araA
(2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)adenina,
DDFC
(2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina),
Didox (VF 147; NSC 324360;
N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd
(3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG
(1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina),
LY 207702
(2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina),
LY 295501
(N-[[3,4-diclorofenil)amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida),
MDL 101731 (FMdC; KW 2331;
(2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilencitidina),
Parabactin Sulofenur (LY 186641;
N-[[(4-clorofenil)amino]
carbonil]-2,3-dihidro-IH-inden-5-sulfonamida),
TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapina (OCX
191; OCX 0191), Trimidox (VF 233;
N,3-4,5-tetrahidroxibencen
carboximidamida).
15. Una composición farmacéuticamente aceptable
que comprende un compuesto de PEG-ASNasa, un
compuesto inhibidor de reductasa de ribonucleótido, y al menos un
compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos
inhibidores de proteasa y compuestos inhibidores de transcriptasa
inversa de VIH, en la que dicho compuesto inhibidor de reductasa de
ribonucleótido es seleccionado entre hidroxiurea (HU),
BW-348U87, tiosemicarbazona de
3-aminopiridina-2-carboxaldehído
(3-AP), Amidox (VF 236; NSC-343341;
N,3,4-trihidroxibencencarboximidamida), BILD 1257
(2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucina),
BILD 1357
(1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilamida]
de ácido
2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspártico),
BILD 1633, BILD 733
(3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-(3-metil)valil-L-[3-(pirrolidin-1-ilcaronil)]alanil-L-(1-carboxiciclopentil)glicil-L-(4-metil)leucinol,
BILD 1263
(2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol),
BILD 1351 (ácido
1-[1(S)-[5(S)-[3-[todo-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclopentanocarboxílico),
Cl-F-araA
(2-cloro-9-(2-desoxi-2-
fluoro-beta-D-arabinofuranosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 324360;
N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil) amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331;(2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilencitidina), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil)amino]carbonil]-2,3-dihidro-IH-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapina (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidroxi bencencarboximidamida).
fluoro-beta-D-arabinofuranosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 324360;
N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil) amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331;(2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilencitidina), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil)amino]carbonil]-2,3-dihidro-IH-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapina (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidroxi bencencarboximidamida).
16. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 15, en la que dicho compuesto de
PEG-ASNasa y dicho compuesto inhibidor de reductasa
de ribonucleótido están en combinación con al menos un compuesto
inhibidor de proteasa.
17. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 15, en la que dicho compuesto de
PEG-ASNasa y dicho compuesto inhibidor de reductasa
de ribonucleótido están en combinación con al menos un compuesto
inhibidor de transcriptasa inversa de VIH.
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|---|---|---|---|---|
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| CA2574719A1 (en) * | 2004-09-13 | 2006-03-23 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Health Canada | Inhibition of feline calicivirus replication by asparaginase |
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| CN115671102A (zh) * | 2022-11-17 | 2023-02-03 | 中国科学院大学 | 3-ap在制备抑制痘病毒的药物中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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