CN100536836C - 预防和治疗微生物介导的上皮紊乱的物质和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物的形式为诸如聚乙二醇等相对高分子量的生物相容性聚合物，任选添加诸如右旋糖苷等保护性聚合物和/或诸如L-谷氨酸等对病原体必要的营养物。本发明还提供了一种对肠源性败血症进行预防或治疗的方法，所述肠源性败血症是由于诸如绿脓杆菌等肠道病原体所引发的，所述方法包括施用高分子量聚乙二醇；本发明还提供了对高分子量聚乙二醇的施用进行监测的方法，例如在对肠源性败血症等微生物介导的上皮紊乱进行预防、改善或治疗的方法中进行所述监测。肠源性败血症通常为手术恢复期的哺乳动物的并发症或者由一种疾病或紊乱所引起，为接受预防性治疗的适宜动物提供指征。最后，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含婴儿配方奶粉以及聚乙二醇，本发明还提供了该组合物的使用方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于对诸如肠源性败血症(gut-derived sepsis)等微生物介导的上皮紊乱进行预防或治疗的物质和方法。
背景技术
微生物介导的上皮紊乱，或者异常状态，对人类和动物的健康具有重大威胁，并对世界范围内的卫生保健系统造成负担。该类紊乱的一个实例是肠源性败血症，其是诸如人类患者等生物体由于罹患烧伤、新生儿小肠结肠炎、严重嗜中性白血球减少症、炎性肠疾病、以及移植后器官排斥等多种疾病、紊乱、以及病痛等中的任一种病症而造成死亡的一个主要原因。长期以来已经认识到肠道囊池有可能成为诸如患有严重疾病的住院病人中的微生物介导的败血症的致死病灶。诸如假单胞菌(例如，绿脓杆菌)等微生物病原体具有扰乱小肠上皮屏障的调节功能的能力，这种能力可能是在能引致肠源性败血症的条件性生物体之中的定义性特征。在许多该类感染中，已经鉴别出绿脓杆菌为致病性病原体。值得注意的是，已经证实肠道为诸如绿脓杆菌等条件性病原体建群的首要位点。
对诸如肠源性败血症等微生物介导的上皮紊乱进行预防和治疗的常规治疗方法并不完全成功。基于抗生素的方法的缺陷在于难以为小肠病原体定制抗生素而不使抗生素影响其余肠道菌群。此外，以绿脓杆菌为代表的许多小肠病原体通常对抗生素具有抗性，从而使得预防或治疗该类病原体的方法具有费用昂贵、进行性以及不完全成功等特点。免疫治疗方法也存在问题。特别地，诸如绿脓杆菌等许多小肠病原体具有免疫回避性，从而使得该种治疗方法疗效极微。
用于治疗或预防诸如肠源性败血症等紊乱的另一种方法为肠道灌洗。在过去的几年里，曾尝试采用聚乙二醇(PEG)溶液来进行肠道灌洗，并有一些轶事性报道指出，PEG在多种临床和实验性环境下治疗肠源性败血症时显示出些许前景。这些溶液中PEG的平均分子量为3,500道尔顿，并且该溶液可以商购(例如，Golytely)。这些较低分子量(LMW)的PEG溶液在预防或治疗肠源性败血症时表现出疗效的机理尚不清楚。一般说来，这些溶液用于对生物体中处于可能发展为肠源性败血症危险之中的肠道或者罹患有肠源性败血症的肠道进行洗涤或冲洗。对所述肠道施用所述LMW PEG溶液可使受治疗肠道的菌群组成发生不定的改变，所述改变依赖于方法中所用化合物的浓度和分子量等。例如，浓度高于约20％的PEG溶液可产生杀灭微生物的作用，从而会清除应激宿主的肠道中具有潜在保护性的微生物。而且，低分子量PEG的溶液尽管保护了肠道但在削弱特定生物体的毒性时可能会失去功效。因此，现有技术中需要一种溶液，该溶液能够抑制微生物的毒性表达(微生物的有害特性)，并且同时不杀灭微生物或者相邻的微生物，从而能够提供保持肠道微生物群落的自然生态系统的益处。例如，对天然菌群组成的保持将带来其与条件性病原体的竞争，如无该竞争，则所述病原体会在肠道中建群。
随着菌群组成的改变，生物体发生生理学改变。这些生理学改变可通过对诸如乳酸脱氢酶水平等许多特征性酶活性进行检测而得到监控。因此，对肠道进行LMW PEG治疗将在受治疗生物体的生理学方面产生很大的变化，并对受治疗生物体的健康安宁产生不可预料的、由此可能有害的、长期的后果。而且，该治疗在如住院病人等重病生物体中会激发大量肠道排泄(massive intestinalvoiding)形式的生理需求反应。
因此，现有技术中仍然需要提供一种可有效预防或治疗微生物介导的上皮紊乱(例如，肠源性败血症)和/或与该类紊乱相关症状的组合物，以及能够达到所述预防/治疗效果的方法，所述方法应不显著改变受治疗生物体的生理状况，因此不会产生继发的并发症。
发明内容
本发明通过提供一种高分子量(HMW)的聚乙二醇组合物而满足了现有技术中的前述需求，所述组合物可提供对异常状态的有效保护，所述异常状态的特征在于，上皮表面处于可能发展为微生物介导的紊乱的危险之中。所述异常状态的实例包括肠源性败血症，以及其它由肠道病原体导致的与肠道菌群相关的肠内紊乱/疾病，所述肠道病原体包括，但不限于绿脓杆菌。HMW PEG抑制或阻断诸如绿脓杆菌等病原体与肠道上皮表面相接触。此外，高分子量PEG还能够抑制这些病原体(例如，绿脓杆菌)在响应可能涉及群体感应信号网络的多种信号时的毒性表达。HMW PEG在肠道病原体和肠内上皮之间的感染性界面处的阻断能力为预防或治疗肠源性败血症(例如在代谢应激后)提供了一种替代方法。更重要的是，采用HMW PEG进行治疗将节省费用，其施用方法对人类患者以及诸如有农业价值的家畜(例如，牛、猪、山羊、绵羊、马、鸡、火鸡、鸭、鹅等)、宠物、动物园内动物等其它各种生物体相对简单。
本发明一方面提供了一种降低呈异常状态的动物的死亡率的方法，所述异常状态包括疾病状态，该疾病状态包括上皮表面处于可能发展为微生物介导的紊乱的危险之中，所述微生物介导的紊乱选自肠源性败血症、烧伤、新生儿小肠结肠炎、严重嗜中性白血球减少症、毒性大肠炎、炎性肠疾病、肠病、移植排斥、慢性肠炎以及猪腹病(pig belly)等，所述方法包括给需要给药的动物施用有效量的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的平均分子量至少为5,000道尔顿。适宜的动物包括但不限于：狗、猫、绵羊、山羊、牛、猪以及人。在前述方法中，所述PEG的平均分子量优选为至少15,000道尔顿，优选在5,000道尔顿～20,000道尔顿之间，或者在15,000道尔顿～20,000道尔顿之间。还优选PEG的平均分子量为6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000以及25,000道尔顿。另外，所述PEG可以为包含5％-20％PEG的水溶液，优选为包含10％-20％PEG(例如，10％PEG)的水溶液。在该方法的一个实施方案中，所述状态与肠中绿脓杆菌生物体的存在相关，并且这种绿脓杆菌的细胞膜完整性并未发生可检测的改变。在该方法的另一实施方案中，所述绿脓杆菌的生长模式未发生可检测的改变。
本发明另一方面涉及抑制肠源性败血症的方法，所述方法包括使哺乳动物的上皮例如肠，与聚乙二醇(PEG)相接触，其中所述PEG的平均分子量至少为5,000道尔顿，优选至少为15,000道尔顿。在该方法的一个实施方案中，所述哺乳动物的肠与所述PEG相接触至少30分钟。
本发明进一步包括：对诸如肠道病原体等上皮细胞病原体中的PA-I凝集素/粘附素的表达进行抑制的方法，所述方法包括给需要给药的动物施用有效量的聚乙二醇；对PA-I凝集素/粘附素的上皮诱导(例如，肠道上皮诱导)活化进行抑制的方法，该方法包括给需要给药的动物施用有效量的聚乙二醇；对上皮细胞病原体(例如，肠道病原体)的由C4-HSL诱导的形态变化进行抑制的方法，该方法包括给需要给药的动物施用有效量的聚乙二醇；减少上皮细胞病原体(例如，肠道病原体)中的毒性表达的方法，该方法包括给需要给药的动物施用有效量的聚乙二醇；减少或防止上皮表面与微生物毒性因子相互作用的方法，该方法包括给需要给药的动物施用有效量的聚乙二醇；通过防止致病性群体感应活化的形成来改善上皮(例如，肠道)发病机理的方法，该方法包括给需要给药的动物施用有效量的聚乙二醇；以及对脊椎动物的上皮(例如，肠道上皮)和诸如假单胞菌(例如，绿脓杆菌)等细菌之间的相互作用进行抑制的方法，该方法包括使上皮与聚乙二醇相接触。在本发明的所有这些方面中，所述PEG的平均分子量至少为5,000道尔顿，优选至少15,000道尔顿。
本发明另一方面提供了对诸如肠道上皮层等哺乳动物上皮层的由绿脓杆菌诱导的跨上皮电阻降低进行抑制的方法，该方法包括使(肠道)上皮层与聚乙二醇相接触，其中所述PEG的平均分子量至少为5,000道尔顿，优选至少15,000道尔顿。PEG优选具有15,000道尔顿～20,000道尔顿的平均分子量。在优选的实施方案中，微生物(诸如绿脓杆菌)膜的完整性未发生可检测的变化。
本发明又一方面提供了抑制细菌细胞粘附于诸如哺乳动物的肠等哺乳动物的上皮的方法，所述方法包括使所述肠与聚乙二醇相接触，其中所述PEG的平均分子量至少为5,000道尔顿，优选至少15,000道尔顿。采用该方法时，还优选PEG的平均分子量为15,000道尔顿～20,000道尔顿。所述PEG可以为包含5％-20％PEG的水溶液，优选为包含5％～10％PEG的水溶液。以本方法对细菌细胞的粘附进行抑制时，预期可抑制的示例性细菌细胞是假单胞菌，例如绿脓杆菌。
本发明另一方面涉及减少细菌细胞中PA-I凝集素/粘附素的表达的方法，所述方法包括使所述细菌细胞与聚乙二醇相接触，其中所述PEG的平均分子量至少为5,000道尔顿，优选至少15,000道尔顿，还优选PEG的平均分子量为15,000道尔顿～20,000道尔顿。所述PEG可以为包含5％-20％PEG的水溶液，优选为包含5％～10％PEG的水溶液。
本发明另一方面提供了一种降低患有微生物介导的上皮紊乱的动物的死亡率的方法，所述微生物介导的上皮紊乱选自肠源性败血症、烧伤、新生儿小肠结肠炎(NEC)、严重嗜中性白血球减少症、毒性大肠炎、炎性肠疾病、肠病(例如，在重病患者中)、移植排斥、慢性肠炎以及猪腹病等，所述方法包括施用有效量的化合物(例如，PEG)，该化合物能够粘附于选自哺乳动物肠道上皮细胞和肠道细菌细胞的细胞，其中所述化合物以形态不对称(topographically asymmetrical)的方式粘附于细胞，从而抑制哺乳动物的肠道上皮细胞与细菌细胞之间的相互作用。优选的化合物为表面活性剂。在该方法的一个实施方案中，所述化合物为PEG，优选该PEG具有至少15,000道尔顿的平均分子量。在该方法的另一实施方案中，通过原子力显微镜来确定所述抑制作用。在该方法的另一实施方案中，所述细菌细胞为肠道病原体，并且其生长特性未发生可检测的变化。在相关方面，该方法进一步包括向该动物的肠道中引入有效量的右旋糖苷和/或引入有效量的L-谷氨酰胺、右旋糖苷包衣的L-谷氨酰胺、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、一种或多种果糖-低聚糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖和半乳糖、乳果糖、以及现有技术已知的平衡缓冲液和稳定剂。当以单一组合物一同施用时，施用这种多成分的单一溶液将处理该肠道，并使该肠道作好对预期将要发生的肠道菌群和肠的屏障功能受破坏的准备，所述肠道菌群和肠道屏障功能受破坏是例如在严重分解代谢型应激、外科手术型应激以及创伤型应激后发生的情况。
本发明另一方面涉及一种改善以下所述症状的方法，所述症状是与由上皮的异常状态所引起或以上皮的异常状态为特征的任何疾病或病症有关的症状，诸如肠源性败血症，所述方法包括给肠道施用聚乙二醇，其中所述PEG的平均分子量至少为5,000道尔顿，优选至少15,000道尔顿，还优选PEG的平均分子量为15,000道尔顿～20,000道尔顿。所述PEG可以为包含5％-20％PEG的水溶液，优选为包含5％～10％PEG的水溶液。本发明包括改善与本文公开的任何疾病或病症相关的症状的方法。
本发明又一方面涉及一种预防呈异常状态的动物丧失产乳能力的方法，所述异常状态为乳腺上皮表面处于可能发展为微生物介导的紊乱的危险之中，该紊乱影响产奶量，所述方法包括给乳腺上皮表面(例如局部)施用有效量的至少5,000道尔顿、优选至少15,000道尔顿的聚乙二醇。动物的实例包括诸如绵羊、山羊、母牛、猪、马以及人等哺乳动物。在相关方面中，本发明提供了一种对动物产乳能力的丧失进行治疗的方法，所述产乳能力的丧失以乳腺上皮表面发生微生物介导的紊乱而影响产奶量为特征，所述方法包括对乳腺(例如局部)施用有效量的至少5,000道尔顿、优选至少15,000道尔顿的聚乙二醇。在另一相关方面中，本发明提供了一种预防微生物介导的上皮紊乱在喂乳期动物中发展的方法，所述方法包括给该动物施用有效量的至少5,000道尔顿、优选至少15,000道尔顿的聚乙二醇。适宜的动物包括诸如人、家畜、家养宠物以及动物园动物等哺乳动物。在一个实施方案中，将PEG与本领域公知的任意婴儿配方奶粉相混合。
本发明的一个相关方面是包含婴儿配方奶粉和聚乙二醇(PEG)的组合物，其中所述PEG的平均分子量至少为5,000道尔顿。此外，可使用本领域公知的任何婴儿配方奶粉，包括基于诸如牛奶、山羊奶等哺乳动物奶的配方奶粉，也包括基于豆奶的配方奶粉。所述配方奶粉可以富含任意的维生素和/或元素，包括以铁强化的配方奶粉。PEG的平均分子量优选为至少15000道尔顿，其与婴儿或儿童配方奶粉重新配合或水合时优选以5％～20％的范围存在。本发明进一步提供了一种为动物、优选为喂乳期动物提供营养的方法，所述方法包括给动物施用有效量的包含婴儿配方奶粉和PEG的组合物。
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，所述组合物包含平均分子量为至少5000道尔顿、优选为至少15000道尔顿的聚乙二醇以及适宜的佐剂、载体或者稀释剂。在一个相关方面中，所述组合物进一步包含选自下述物质的化合物：右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、一种或多种果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖和半乳糖、乳果糖以及现有技术已知的平衡缓冲液和稳定剂。
本发明的另一方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于对异常状态进行治疗或预防，所述异常状态的特征在于，上皮表面处于可能发展为诸如肠源性败血症等微生物介导的紊乱的危险之中，所述试剂盒包括上述的药物组合物之一，以及描述所述组合物在治疗或预防所述异常状态时的用法的方案。试剂盒中适宜包括的方案可描述本文公开的任何一种治疗或预防方法。
本发明另一方面描述了对异常状态以及疾病进行预防的方法，所述异常状态以及疾病的特征在于，上皮表面处于可能发展为微生物介导的紊乱的危险之中。例如，本发明包括对疾病或异常状态进行预防的方法，该方法包括给动物施用一种组合物，所述组合物包括有效量的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG具有至少5000道尔顿的平均分子量。适用于本发明的预防方法的疾病或者异常状态选自：游泳耳、急性中耳炎、慢性中耳炎、呼吸器相关性肺炎、肠源性败血症、坏死性小肠结肠炎、抗生素诱导的腹泻、假膜性结肠炎、炎性肠疾病、过敏性肠疾病、嗜中性小肠结肠炎、胰腺炎、慢性疲劳综合症、菌群失调综合症、微小结肠炎、慢性尿道感染、性传播疾病以及感染等。适合作为该类预防方法对象的动物选自狗、猫、绵羊、山羊、牛、猪、鸡、马以及人。PEG的平均分子量优选为至少15000道尔顿；还优选PEG的平均分子量介于15,000道尔顿～20,000道尔顿之间。而且，所述PEG可以为包含10％-20％PEG的水溶液，优选为包含10％PEG的水溶液。待施用的组合物可以进一步包含赋形剂，所述赋形剂选自液态溶液、局部用凝胶以及适于喷雾的溶液。另外，所述组合物可以进一步包含选自下述物质的化合物：右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。在一个实施方案中，所述组合物包含PEG、右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。
本发明另一方面公开了一种预防皮肤感染的方法，所述方法包括将一种组合物施用至动物的步骤，所述组合物包含有效量的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的平均分子量至少为5000道尔顿。所述组合物可以进一步包含选自下述物质的赋形剂：软膏、霜剂、凝胶以及洗液。本发明中预计的导致感染的作用物可以选自：炭疽杆菌、天花病毒、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、艰难梭菌、轮状病毒、绿脓杆菌、粘质沙雷氏杆菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌(Enterobacteria cloacae)、白色念珠菌以及光滑假丝酵母等。
本发明另一方面涉及预防呼吸性传染的方法，所述方法包括对动物施用有效量的聚乙二醇(PEG)的步骤，其中所述PEG的平均分子量至少为5000道尔顿。本发明预防方法适用的呼吸性传染可由传染物通过本领域公知的任意途径所引起，其包括呼吸器相关性肺炎、空气传播的传染物、通过诸如喷嚏等散布在雾化液体中的传染物等。在一些实施方案中，所述方法可预防由选自炭疽杆菌和天花病毒的作用物导致的呼吸性传染。
本发明另一方面提供了一种对尿道的至少一部分进行冲洗来预防慢性尿道感染的方法，所述方法包括将有效量的包含PEG的组合物输送至尿道的步骤，其中所述PEG的平均分子量至少为5000道尔顿。在一个实施方案中，将所述组合物施用于尿道中至少包括膀胱的一部分。
本发明又一方面提供了一种预防性传播疾病的方法，所述方法包括在避孕套上施用聚乙二醇(PEG)的步骤，其中所述PEG的平均分子量至少为5000道尔顿。本发明的一个相关方面涉及一种避孕套，所述避孕套至少包括局部的PEG涂层，所述PEG的平均分子量至少为5000道尔顿。本发明的另一相关方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括避孕套和平均分子量至少为5000道尔顿的聚乙二醇(PEG)。
本发明还包括一种预防消化道紊乱的方法，所述方法包括对需要给药的动物施用有效量的组合物，所述组合物包含聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的平均分子量至少为5000道尔顿。本发明的预防方法适用的消化道疾病的实例选自：新生儿坏死性小肠结肠炎、抗生素诱导的腹泻、假膜性结肠炎、炎性肠疾病、过敏性肠疾病、嗜中性小肠结肠炎、胰腺炎、菌群失调综合症以及微小结肠炎等。
本发明另一方面涉及对向需要给药的动物施用聚乙二醇(PEG)进行监测的方法，所述方法包括给需要给药的动物施用有效量的包含带标记的PEG的组合物，其中所述PEG的平均分子量至少为5000道尔顿，然后检测所述带标记的PEG，由此，所述带标记的PEG的量和/或位置(例如，与微生物相连)为施用效能的评估提供了有用的信息。在该监测方法的一个实施方案中，所述标记为一荧光团(例如，荧光素、罗丹明、Cy3、Cy5)。在该方法的另一实施方案中，检测带标记的PEG包括内窥镜检测。所述监测方法还包括检测大便样品中的带标记的PEG(即，与诸如微生物等成分相连的带标记的PEG，其来源为大便样品)。此外，所述监测方法可以进一步包括施用微生物特异性的第二标记物，并对第二标记物进行检测。本文所用的“特异性”指的是，该标记物与至少一种微生物具有可检测的相关性。
本发明另一方面涉及对向需要给药的动物施用聚乙二醇(PEG)进行监测的以下方法，所述方法包括从被施用了平均分子量至少为5000道尔顿的聚乙二醇的动物中获得样品，使该样品与上皮细胞相接触，然后测定样品中的微生物对上皮细胞的粘附，由此，PEG的量和/或位置为施用效能的评估提供了有用的信息。所述测定可通过显微镜检查来完成。
本发明的另一监测方法为对向需要给药的动物施用聚乙二醇(PEG)进行监测的以下方法，所述方法包括从被施用了平均分子量至少为5000道尔顿的聚乙二醇的动物中获得样品，使该样品与上皮细胞层相接触，然后测定所述上皮层的跨上皮电阻，由此，通过跨上皮电阻相对对照值的降低程度来指示有效施用。所述对照值可为内源性的(即，在施用PEG之前测量TEER)，或者为外源性的(即，其它研究中得到的可用于比较的可靠数值)。
本发明的另一监测方法是对向需要给药的动物施用聚乙二醇(PEG)进行监测的方法，所述方法包括从被施用了平均分子量至少为5000道尔顿的聚乙二醇的动物中获得样品，从该样品中分离微生物，然后测量所述微生物的细胞表面的疏水性，由此，该样品中任意微生物的疏水性为施用效能的评估提供了有用的信息。本文所述“分离”指的是与样品的其它成分(例如，固态物质)相分离，从而足以进行疏水性检测，如本领域所公知的那样。
本发明的一个相关方面是提供一种试剂盒，该试剂盒用于对聚乙二醇的施用进行监测，所述试剂盒包括带标记的PEG以及一份方案，所述方案描述了带标记的PEG在监测PEG施用时的用法。适宜的方案包括本文公开的或者本领域公知的涉及PEG的施用、递药或者涂布的任何方法。在本发明这一方面涉及的一些实施方案中，所述试剂盒还进一步包括游离的标记物。
本发明的另一监测方法是对向需要给药的动物施用聚乙二醇(PEG)进行监测的以下方法，所述方法包括从被施用了平均分子量至少为5000道尔顿的聚乙二醇的动物中获得样品，检测该样品中的PA-I凝集素/粘附素的活性，由此，PA-I凝集素/粘附素的活性为施用效能的评估提供了有用的信息。在该方法的一个实施方案中，通过将所述PA-I凝集素/粘附素与PA-I凝集素/粘附素的结合伴侣(binding partner)相结合而对其进行检测，所述结合伴侣是例如特异性对抗-PA-I凝集素/粘附素的抗体的任意已知形式或者与凝集素/粘附素特异性结合的碳水化合物等。本发明的相关方面是一种试剂盒，所述试剂盒用于对聚乙二醇(PEG)的施用进行监测，该试剂盒包括PA-I凝集素/粘附素的结合伴侣以及一份方案，所述方案描述了结合伴侣在检测样品中的PA-I凝集素/粘附素时的用法。适宜的方案包括本文所公开的或者本领域公知的与使用PEG相关的任意方法。
通过下述详细描述并结合附图以及实施例将更好地理解本发明的其它特点以及优点。
附图说明
图1为将绿脓杆菌PA27853直接注射至经历假剖腹手术或30％外科肝切除手术后的小鼠的盲肠内直至48小时的死亡率。在小鼠经历30％不流血左侧肝切除手术后，立即直接盲肠注射1×107cfu/ml的PA27853。每组有7只小鼠。对照组小鼠接受假剖腹手术，然后向盲肠中注射等量的PA27853。对于PEG组的小鼠，在盲肠注射前，将1×107cfu/ml的PA27853悬浮于PEG 3.35(LMWPEG 3,350)或PEG 15-20(HMW PEG 15,000道尔顿～20,000道尔顿)中。在b图中观察到了PEG15-20的剂量反应曲线。a.采用精确概率法检验(Fisher ExactTest)确定了PEG15-20的保护作用的统计学显著性(P<0.001)。b.确定了PEG15-20的最低保护浓度为5％(P<0.05)。c.进行30％外科肝切除手术并直接盲肠注射1×107cfu/ml的PA27853，24小时后盲肠内含物(粪便)、洗涤后的盲肠粘膜、肝脏以及血液的定量细菌培养结果。单因素ANOVA检测结果显示，肝切除手术后小鼠的盲肠内含物、盲肠粘膜、肝脏以及血液中的细菌数均有统计学显著性增加(P<0.001)。对于PEG 3350，观察到肝脏和血液中的细菌数有显著性降低(P<0.05)，而PEG15-20完全抑制了PA27853在小鼠肝脏和血液中的扩散。
图2显示了PEG15-20对PA27853诱导的上皮屏障功能障碍的保护作用，该保护作用是通过跨上皮电阻(TEER)来评估的。a.图中的数据表示，在三份平行培养物(n＝7)顶端(apical)与1×107cfu/ml的PA27853接触8小时期间，观察到的从其基线开始的TEER最大下降的平均值±SEM％。证实了与PA27853接触的Caco-2细胞中的TEER下降具有统计学显著性(单因素ANOVA(P<0.001))。证实PEG 15-20对PA27853诱导的TEER下降的保护作用具有统计学显著性(P<0.001)。b.在PEG 3.35存在下顶端与PA27853接触的Caco-2细胞的图像。该图像采集自共培养4小时后，其显示在细胞骨架上30微米～40微米处漂浮的细胞丧失了单层完整性，所述细胞支架显示了PA27853对细胞膜的粘附。c.在PEG 15-20存在下顶端与PA27853接触4小时后的Caco-2细胞，在任何检查平面均无漂浮细胞的迹象。
图3显示了PEG对PA27853中PA-I的表达的抑制作用。a.蛋白质印迹法(Western blot)分析。将PA27853与1mM的群体感应信号分子C4-HSL相接触，结果PA-I蛋白的表达中产生了统计学显著性增加(单因素ANOVA，P<0.001)，所述PA-I蛋白的表达在10％的PEG3.35存在下受到部分抑制，而且在10％的PEG15-20存在下受到强得多的抑制作用。a’.PEG15-20对C4-HSL诱导的PA-I表达的最小抑制浓度为5％(P<0.01)。b.在有或无PEG存在下，与C4-HSL相接触的单个细菌细胞的电镜图，该图显示C4-HSL引起了绿脓杆菌在外形以及菌毛表达上的形态学变化。在PEG15-20存在下，完全消除了C4-HSL诱导的形态效应，但是PEG 3.35无此效果。与PEG 15-20相接触的PA27853的周围可以看到光晕式效应(halo-type effect)。c.Northern杂交。使PA27853与0.1mM的C4-HSL相接触，结果PA-ImRNA表达产生统计学显著性增加(单因素ANOVA，P<0.001)，但是10％PEG 15-20显著抑制了该增加。d.在PEG15-20存在下，与Caco-2细胞接触4小时所诱导的PA-ImRNA的增加被抑制，但是PEG3.35并无此作用(单因素ANOVA，P<0.001)。
图4显示了PEG溶液对干旱生长模式的PA27853的细菌膜完整性的影响。a.利用含有SYTO 9和碘化丙锭的染色方法来评估两种PEG溶液对细菌膜完整性的影响。两种PEG溶液对细菌膜渗透性都没有任何影响。b.两种PEG溶液中所显示的PA27853生长模式与不含PEG的TSB培养基(对照组)完全相同。
图5显示了与PEG接触的Caco-2细胞和细菌细胞的原子力显微镜(AFM)图像。a-c.在培养基单独存在下(a)、培养基和PEG3.35存在下(b)、以及培养基和PEG15-20存在下Caco-2的AFM图像。观察到PEG3.35在Caco-2细胞上形成了平滑的毯状物(b)，而PEG15-20形成了形态更为清晰的覆盖物(c)。d-f.在PEG 3.35和PEG 15-20存在下PA27853的AFM图像。PEG 3.35在单个的细菌细胞周围形成光滑的被膜(e)，而PEG15-20不仅紧密抱住单个细胞(f)，而且增加了聚合物/细菌的直径(g，h)，从而隔开了单个细菌彼此之间的距离。
图6显示了PEG溶液对PA27853的分散/聚集模式的影响。利用Axiovert100TV荧光倒置显微镜，采用DIC和GFP作为荧光滤光片，所用物镜放大率为63×，在此条件下可以直接观察dTC3培养皿中细菌细胞的分散模式。利用Bioptechs恒温控制系统来调节温度。利用钨灯(100V)来激发DIC和GFP。利用intelligent Imaging Innovations的3D成像软件(Slidebook)使用GFP滤光片对在Z平面的细菌细胞分散模式进行成像。在DIC图像(6a1)和Z平面重新构建(6a2)中观察到绿脓杆菌细胞均匀分散浮游在没有Caco-2细胞的培养基中。在Caco-2细胞存在的情况下，细菌细胞发展成凝集的外观(6b1)并观察到其与Caco-2细胞相粘附(6b2)。10％PEG 3350降低了细菌的运动性，并诱导粘附于孔底(6c2)的蘑菇状的细菌微菌落的即时生成(6c1)。在Caco-2细胞存在下，细菌微菌落位于上皮细胞平面上方约8微米处(6d1，2)。10％的PEG 15-20显著降低了绿脓杆菌细胞的运动性。但是，在含有PEG 15-20的培养基中进行孵育的最初0.5-1小时中，细菌细胞形成接近于孔底的蛛状微菌落(6e1，2)。在几小时内，蛛腿状的微菌落占据了培养基的全部空间/体积(未显示)。在Caco-2细胞存在下，绿脓杆菌细胞丧失了蛛样构型，观察到其升高至上皮平面上方(30-40微米)(6f1，2)。
具体实施方式
本发明为治疗和/或预防多种微生物介导的上皮紊乱提供了简单经济的产品和方法，其中所述微生物介导的上皮紊乱为困扰包括人的许多哺乳动物的异常状态和疾病。通过给需要给药(包括处在危险中)的动物施用诸如HMW聚乙二醇等高分子量极性聚合物，可利用最小花费和最少的从业者培训对许多威胁健康或生命的异常状态，即，包括肠源性败血症等的上皮紊乱和疾病进行治疗。不希望束缚于任何理论，本发明所提供的益处与下述原则相一致，即，可通过促进一种有益于该类微生物存活的环境来成功预防、改善或治疗这种微生物介导的上皮紊乱。首先明确本文中所用的下述术语的含义将有利于理解本发明下述的详细描述。
“异常状态”具有宽泛的定义，其包括哺乳动物的以上皮表面处于可能发展为微生物介导的紊乱的危险之中为特征的疾病、紊乱以及哺乳动物健康的任何异常状态。以上皮表面处于发展为微生物介导的紊乱的危险之中为特征的异常状态包括上皮表面已经发展为微生物介导的紊乱时的状态。所述状态的实例包括需要医疗介入或者由于医疗介入导致的人类疾病以及人类的紊乱，诸如烧伤、新生儿小肠结肠炎、严重的嗜中性白血球减少症、炎性肠疾病、肠病(例如，重病患者的肠病)、以及移植(例如，器官)排斥等。
“烧伤”指的是由于哺乳动物的组织与诸如明火、蒸汽、热流体以及热表面等形式的热源相接触而对该组织造成的损伤。
“严重的”嗜中性白血球减少症一词取其常规惯用含义，即，循环嗜中性白细胞的数目显著减少。
“移植排斥”指的是移植物(例如，器官)被视为与宿主生物体对该移植物的最终排斥相关的任何发展。
“施用”这一词取其常规惯用含义，即，采用本领域公认的任何适宜的手段进行给药。施用形式的实例包括：口腔给药、肛门给药、直接穿刺或注射、局部施用、以及喷射(例如，雾化喷射)、还有针对眼、耳、鼻、口、肛门或尿道口的凝胶施用或液体施用等。
“有效量”指的是一种物质能为接受该剂量的生物体提供有益效果的用量，该用量可根据施用所述剂量的目的、接受该剂量的生物体的大小和状态、以及本领域公知的与确定有效剂量相关的其它变量而变化。确定有效剂量的方法包括本领域技术人员公知的常规优化步骤。
“动物”这一词取其常规含义，即，非植物、非原生生物的活生物体。优选的动物是哺乳动物，例如人。
在本发明公开的内容中，“需要(给药)的”指的是，生物体、器官、组织或细胞的一种状态，该状态可通过对具有这种状态特征的生物体施用有效剂量而获得益处。例如，可能发展为肠源性败血症的高危人群或具有肠源性败血症症状的人类，即是需要有效剂量的诸如本发明的药物组合物等产品的生物体。
“平均分子量”这一词取其常规惯用含义，即，组合物的成分(例如，分子)的分子量的算术平均值，无论该平均值的测定方法的精确度如何。例如，平均分子量为3.5千道尔顿的聚乙二醇或者说PEG可以含有多种分子量的PEG分子，只要以某种程度的精确度确定这些分子量的算术平均值为3.5千道尔顿即可，本领域技术人员可以理解，这可能反映的是算术平均值的估算。类似地，PEG15-20指的是分子量的算术平均值介于15千道尔顿～20千道尔顿之间的PEG，所述算术平均值遵从上述的特殊声明。这些PEG分子包括但不限于简单的PEG聚合物。例如，多个相对较小的PEG分子(例如，7000道尔顿～10000道尔顿)可以任选与诸如苯酚等连接分子一起结合成具有更高平均分子量(例如，15000道尔顿～20000道尔顿)的单分子。
“细胞膜完整性”指的是，作为活细胞的功能性成分的细胞膜相比较而言在功能上没有发生显著改性，这一含义与本领域所理解的一致。
“可检测的改变”这一术语取其常规惯用含义，即，采用所处环境下适宜的检测手段可以感知的改变，这一含义与本领域所理解的一致。
“生长模式”笼统地指单个细胞或者细胞组(例如，细胞群)的性质的值，这些性质是本领域公认作为表征细胞生长的性质，例如细胞的传代或者倍增时间、新生细胞组的形态的外观以及本领域所公认的有助于理解细胞或者细胞组的生长模式的其它变量。
“抑制”这一术语取其常规惯用含义，即，利用降低或者阻止来进行约束。例如，对形态变化的抑制指的是，使形态变化难于进行或者完全阻止了形态变化。
“PA-I，或PA-I凝集素/粘附素表达”指的是PA-I凝集素/粘附素的活性特征的产生或者发生。通常，PA-I凝集素/粘附素表达涉及PA-I凝集素/粘附素编码mRNA的翻译以生成具有至少一个PA-I凝集素/粘附素活性特征的PA-I凝集素/粘附素多肽。作为选择，PA-I凝集素/粘附素进一步包括PA-I凝集素/粘附素编码DNA用以产生前述mRNA的转录。
“上皮诱导活化”指的是通过上皮细胞的直接或间接影响而增加给定目标物(例如，PA-I凝集素/粘附素)的活性。在本发明的说明书中，例如，PA-I凝集素/粘附素的由上皮诱导的活化指的是由于上皮的间接影响增加了所述多肽的活性，这种间接影响是通过一个或多个上皮细胞与肠道病原体的直接接触而显现的。
“形态改变”这一术语取其常规惯用含义，即，形态上的改变。
“肠道病原体”指的是能够在诸如人等动物中引起全身性的或局部的肠源性败血症的病原微生物。这一定义包括本领域公知的肠道病原体，包括诸如假单胞菌(例如，绿脓杆菌)等革兰氏阴性细菌。
“改善”指的是降低程度或者严重性，与其常规惯用含义相一致。
“致病群体”指的是病原生物体(例如，绿脓杆菌)的聚集或者联合且其数量足以引发或保持群体感应信号，这一含义与本领域所公知的一致。
“相互作用”这一术语取其常规惯用含义，即指相互影响，例如在诸如分子、细胞等两个或多个生物物质之间的相互影响。
“跨上皮电阻”，或者“TEER”这一措词取其在本领域中已获得的含义，其指的是测定横跨上皮组织的电阻，其非排他性地用于对上皮组织中的上皮细胞间的紧密接合的状况进行评定。
“粘附”这一术语取其常规惯用含义，即，指的是持续时间比瞬变周期的时间更长的物理结合。
“形态不对称性”指的是不对称的三维物体(例如，细胞)表面的图像、地图或其它表示法。
“原子力显微镜”亦称作扫描力显微镜，其是一种获得物质的高分辨率形态图的技术，其在光栅扫描上具有横跨样品表面的悬臂探针，并使用高敏感性的用于检测探针的偏转的装置，这一含义与本领域理解的一致。
“药物组合物”是一种适于治疗性地施用至诸如人类患者等活体动物中的化合物制剂。本发明优选的药物组合物包括在粘度、电解特性以及重量克分子渗透压浓度上取得平衡的溶液，其包含电解液、右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、乳果糖、D-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖胺以及5-20％PEG(15,000-20,000)。
“佐剂”、“载体”或者“稀释剂”均为含义已由本领域公知的术语。佐剂是能够延长所共同施用的免疫原的免疫原性的一种或多种物质。载体是通过诸如改变待负载物质的位置以利于操作的一种或多种物质。稀释剂是通过使给定物质与稀释剂接触来降低给定物质的浓度或者对该给定物质进行稀释的一种或多种物质。
“HMW PEG”指的是平均分子量限定为大于3.5千道尔顿的分子量较高的PEG。优选HMW PEG具有大于5千道尔顿的平均分子量，在特殊的实施方案中，HMW PEG的平均分子量至少为8千道尔顿、至少15千道尔顿、以及在15千道尔顿～20千道尔顿之间。
下面实施例对本发明的实施方案进行阐述。实施例1描述了高分子量PEG对肝切除小鼠所患有的肠源性败血症的保护作用。实施例2公开了HMW PEG是如何阻止病原体粘附于肠道上皮细胞的。实施例3揭示了HMW PEG是如何一般性地抑制致病毒性的表达，特异性地抑制凝集素/粘附素的表达的。实施例4说明了PEG并不影响病原体的生长，或者细胞膜的完整性。实施例5利用原子力显微镜阐述了HMW PEG包被的病原体独特的形态构象。实施例6描述了受HMW PEG影响的细胞—细胞间相互作用。实施例7阐述了采用本发明组合物的预防方法。实施例8公开了对诸如在本发明的治疗方法中HMWPEG的施用进行监测的方法，以及相应的试剂盒。
实施例1
HMW PEG对30％肝切除之后的肠源性败血症的保护作用
采用常规方案将雄性Balb/c小鼠麻醉，进行肝切除。沿着松软的左叶进行不出血的30％肝脏切除。对照组小鼠经受肝处理但不作肝切除。试验组和对照组各包括7只小鼠。对所有小鼠，将分别以生理盐水、PEG 3.350或PEG 15-20稀释的200μl 107cfu/ml绿脓杆菌PA27853通过直接针刺注射至盲肠的底部。相对较低分子量的PEG可通过商购获得；平均分子量在15,000道尔顿～20,000道尔顿之间的PEG15-20为PEG7-8和PEG8-10通过苯酚环共价连接的结合物。PEG 7-8的平均分子量在7,000道尔顿～8,000道尔顿之间，PEG 8-10的平均分子量在8,000道尔顿～10,000道尔顿之间。本领域技术人员将意识到，HMWPEG包括具有各种PEG亚单位中的任何PEG亚单位的化合物，每一亚单位具有多种平均分子量中的任一平均分子量，它们彼此之间或者它们与一种或多种连接分子之间优选共价连接，所述连接分子为具有适于PEG分子相连接的官能团的较小分子。适宜的连接分子充分地保持了HMW PEG的生物活性(保持足以实现本文公开的有益的预防或治疗效果的生物活性)。
为了在48小时试验期内提供PEG的恒定来源，将针直接插入小肠(回肠)，将1ml生理盐水、PEG 3.35或PEG 15-20逆行注射进入近端肠内。利用缝合丝线将刺穿位点结扎，然后用酒精擦拭盲肠。将小鼠放回笼中，在接下来的48小时内仅饲喂水。
在图1的b图中观察到了PEG 15-20的剂量反应曲线。a.采用精确概率检验确定了PEG15-20的保护作用的统计学显著性(P<0.001)。b.确定了PEG15-20的最低保护浓度为5％(P<0.05)。c.进行30％外科肝切除手术并直接盲肠注射1×107cfu/ml的PA27853，24小时后盲肠内含物(粪便)、洗涤后的盲肠粘膜、肝脏以及血液的定量细菌培养结果。单因素ANOVA检测结果显示肝切除手术后小鼠的盲肠内含物、盲肠粘膜、肝脏以及血液中的细菌数均有统计学显著性增加(P<0.001)。对于PEG 3350，观察到肝脏和血液中的细菌数有显著性降低(P<0.05)，而PEG15-20完全抑制了PA27853在小鼠肝脏和血液中的扩散。
绿脓杆菌菌株ATCC 27853(PA27853)是从血液培养物得到的非黏液样临床分离物。对小鼠进行30％不出血的外科肝切除后直接盲肠注射PA27853菌株将导致临床败血症状态并且48小时后无生还动物。对于不进行肝切除但也注射了绿脓杆菌的假剖腹手术小鼠(对照)，所有动物都存活，并且未观察到败血症的任何临床体征(图1a)。为了确定PEG溶液在该模型中抑制或者降低死亡率的作用，将200μl浓度为1×107cfu/ml的PA27853分别悬浮于两种10％(w/v)的聚乙二醇溶液中(PEG-3.35与PEG-15-20)。选择PEG-3.35是由于其代表了在过去的25年中已在临床上使用的PEG的分子量(Golytely
)。与之相比较，本发明所用的PEG溶液具有15kDa～20kDa的分子量。将悬浮的菌株通过直接刺穿引入盲肠。PEG3.35对于肝切除后的小鼠的死亡率没有影响，而PEG15-20却具有完全的保护作用。实际上，如精确概率检验法所确定，PEG15-20的保护作用具有统计学显著性(P<0.001)。剂量反应实验证实了5％溶液是PEG15-20发挥完全保护作用的最小浓度(P<0.05，参见图1b)，本领域技术人员认可的是，低于5％的HMW PEG溶液也可能起到一些保护作用，因此这也在本发明的保护范围之内。对于实验小鼠和对照小鼠中的细菌数目，采用单因素方差分析(ANOVA)证明，肝切除后小鼠的盲肠内含物、盲肠粘膜、肝脏以及血液中的细菌数均有统计学显著性增加(P<0.001)。对于PEG3350，观察到肝脏和血液中的细菌数有显著性降低(P<0.05)，而PEG15-20完全抑制了PA27853在小鼠肝脏和血液中的传播。PEG 15-20完全抑制了肠道中PA27853向肝脏和血流中的扩散(图1c)。这些数据表明PEG溶液的作用涉及非杀灭微生物机制。采用对哺乳动物细胞无毒的PEG浓度(即：≤约10％)时，对细菌的生长模式没有影响。
该实施例证实了HMW PEG降低了以部分肝切除的形式接受外科手术的小鼠中由肠源性败血症导致的死亡率。该小鼠模型说明HMW PEG治疗可用于降低经历诸如侵害性手术(例如，部分肝切除)等生理应激的动物物种的死亡率(即，降低任何给定生物体中的死亡可能性)，所述动物物种有例如人等哺乳动物。在生理应激后(例如，手术后护理)实施HMW PEG治疗时，预计该治疗可有效用于对与败血症相关的死亡或者严重疾病进行预防的方法。另外，可在生理应激前(例如，术前护理)、并且在所述应激的引入为可预料的情况下使用HMW PEG治疗，以降低发生严重疾病或者死亡的风险。HMWPEG治疗还可用于改善与肠源性败血症相关的疾病或者异常状态的症状。
实施例2
HMW PEG阻止病原体粘附于肠道上皮细胞
紧密连接是上皮细胞中细胞骨架的动态元件，这些动态元件在哺乳动物肠道的屏障功能中起到关键作用。如通过Caco-2细胞和T-84细胞的跨上皮电阻(TEER)进行测定的结果所示，绿脓杆菌对于紧密连接的渗透性产生了意义深远的改变。Caco-2细胞为特征明确的人类结肠上皮细胞，其在培养时保持稳定的TEER，并且该细胞系为肠道病原体的体内行为提供了一个公认的体外模型。为了确定PEG对Caco-2单层培养细胞的由绿脓杆菌PA27853诱导的TEER降低的保护作用，在10％PEG3.35或者10％PEG 15-20存在下向两个Caco-2细胞单层上顶端接种1×107cfu/ml的PA27853。连续8小时测定TEER并记录TEER的最大下降。
只有PEG 15-20对于绿脓杆菌诱导的TEER降低具有明显的保护作用(图2a)。图2的数据显示的是，在三份平行培养物(n＝7)顶端与1×107cfu/ml的PA27853接触8小时期间，观察到的从其基线开始的TEER最大下降的平均值±SEM％。如接触PA27853的Caco-2细胞中所示，单因素ANOVA的数据显示，其TEER的降低具有统计学显著性(P<0.001)。PEG 15-20对PA27853诱导的TEER下降的保护作用具有统计学显著性(P<0.001)。图2b显示了在PEG3.35存在下顶端与PA27853接触的Caco-2细胞的图像。在PEG3.35存在下共培养4小时后，观察到Caco-2细胞单层的破裂，这显示有病灶性粘附的细菌，细胞在单层细胞骨架上30微米～40微米处漂浮(图2b)。与之相对应，图2c显示了在PEG 15-20存在下尖端与PA27853接触4小时后的Caco-2细胞的图像，在任何检查平面均无漂浮细胞的迹象。PEG15-20对Caco-2细胞完整性的保护作用与细胞粘附性的降低相关，这是通过在细胞与1×107cfu/ml的PA27853接触4小时后细胞上清液中细菌的回收率升高至15倍而体现出来的。
通过TEER的保持判断出PEG培养的人肠道上皮细胞对于绿脓杆菌的屏障破坏作用具有抵抗性，这为面对来自侵袭性病原体的挑战时提供了一种使紧密连接性屏障功能稳定化的可行方法。上皮转运功能(Na+/H+交换、葡萄糖运输)未受该化合物影响为PEG 15-20治疗价值提供了进一步的证据。
因此，HMW PEG对于肠道上皮屏障是相对惰性的，并且具有使肠道上皮屏障稳定化的作用。本发明包括对肠道屏障异常进行治疗的方法，所述肠道屏障异常与诸如绿脓杆菌等肠道病原体相关，所述方法包括给动物施用HMWPEG，所述动物有例如哺乳动物，优选人。肠道屏障异常可以通过本领域公知的任何的诊断技术或者其它手段来揭示。但是，不必在进行HMW PEG治疗前对肠道屏障异常进行确定。与HMW PEG治疗相关的低成本和高度安全性使得该方法不仅适于优选针对高危生物体的预防性应用，而且还可适用于对以下动物实施的治疗方法，所述动物是表现出肠道屏障异常的至少一种症状特征的动物。所述HMW PEG治疗方法将改善与肠道屏障异常相关的症状；优选该方法将从受治疗生物体上降低或消除肠源性败血症的影响。
实施例3
HMW PEG对病原体毒性表达的抑制
肝切除后小鼠的盲肠中绿脓杆菌PA27853的PA-I凝集素/粘附素的表达增多，该表达在小鼠肠道中绿脓杆菌的致死效应中起到了关键作用。PA-I在小鼠肠道中是一个重要的毒性确定要素，其通过促进PA27853对上皮的粘附以及通过造成对细胞毒素、外毒素A和弹性蛋白酶等的重要的屏障缺陷而发挥作用。绿脓杆菌中PA-I的表达通过转录调节子RhIR及其同族活化子C4-HSL而得到调节。PA27853中PA-I的表达不仅因与C4-HSL接触而增多，而且与Caco-2细胞、Caco-2细胞膜制备物以及来自Caco-2细胞培养物的上清液相接触也会造成该表达增多。
采用Northern杂交在转录水平分析PA-I的表达。利用改良的三次洗涤法(three-detergent method)来分离绿脓杆菌的总RNA。采用PA-I引物：F(ACCCTGGACATTATTGGGTG)(SEQ ID NO：1)、R(CGATGTCATTACCATCG-TCG)(SEQ ID NO：2)，以及16S引物：F(GGACGGGTGAGTAATGCCTA)(SEQID NO：3)、R(CGTAAGGGCCATGATGACTT)(SEQ ID NO：4)，通过PCR来生成探针，并将其克隆至pCR2.1载体中(Invitrogen，Inc.)。插入物为与PA-I或者16S序列相匹配的序列。利用α32P-dCTP来对PA-I和16S的特异性cDNA探针进行放射标记。利用Storm 860磷屏成像仪(Molecular Dynamics，CA)来测量特异性放射活性，以PA-I和16S的强度比率为基础，计算与对照相比的相对百分变化。
采用兔亲和纯化多克隆抗-PA-I抗体将蛋白质印迹法用于PA-I蛋白分析。利用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤一毫升的绿脓杆菌细胞，并在溶菌缓冲液(4％SDS，50mM Tris-HCl，pH6.8)中于100℃进行加热。三(羟甲基)甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)分析后，通过蛋白的电转移，进行免疫印迹分析。利用ECL试剂(Amersham，NJ)来检测PA-I凝集素。
将绿脓杆菌PA27853与1mM的群体感应信号分子C4-HSL相接触，该接触导致PA-I的蛋白表达发生统计学显著性的增加(单因素ANOVA，P<0.001)，在10％PEG 3.35存在下，该蛋白表达受到部分的抑制作用，相比之下，10％PEG 15-20对该蛋白表达具有大得多的抑制作用(图3)。PEG 15-20对于C4-HSL诱导的PA-I表达的最小完全抑制浓度为5％(单因素ANOVA，P<0.01)。对于在有或无PEG存在下与C4-HSL相接触的个体细菌细胞进行电镜检查，结果证实C4-HSL引起了绿脓杆菌在外形上的形态变化以及菌毛表达(图3b)。在PEG15-20存在下，完全消除了C4-HSL诱导的形态学效应，但是在PEG 3.35存在下却没有完全消除该效应。与PEG 15-20相接触的PA27853的周围可以看到光晕式效应(图3b)。利用Northern印迹法评估，使PA27853与0.1mM的C4-HSL相接触，结果使PA-I mRNA表达发生统计学显著性的增加(单因素ANOVA，P<0.001)。10％PEG 15-20显著抑制了PA-I的表达。图3d显示了与Caco-2细胞接触4小时所诱导的PA-I mRNA的增加受到PEG15-20的抑制，但是PEG3.35并无此作用(单因素ANOVA，P<0.001)。
此处所示数据显示了当以10％PEG 15-20对细菌进行预处理后，观察到由100μM-1mM的C4-HSL诱导的PA27853中，PA-I的表达(蛋白质和mRNA)显著减弱(3-4倍的减弱)。但这一效果并未在PEG3.35中观察到(图3a)。对于10％PEG 3.35，同样也观察到了C4-HSL诱导的PA-I表达的减弱，尽管其减弱程度要明显低于10％PEG 15-20的程度。PEG15-20对C4-HSL诱导的PA-I蛋白表达的最小抑制浓度为5％(图3b)。与C4-HSL相接触的个体细菌细胞的电镜结果证实，C4-HSL引起了PA27853在外形上的形态变化以及菌毛表达(图3b)。在PEG 15-20存在下，完全消除了C4-HSL诱导的形态学效应，但是PEG3.35却无该作用(图3b)。在PEG 15-20存在下，抑制了因与CaCo-2细胞接触4小时而被诱导的PA-I表达(mRNA)，但是PEG 3.35却无该作用(图3b)。在相互接触过夜的试验中，PEG 15-20保持着对Caco-2细胞诱导的PA-I表达的保护作用。
响应已知刺激时，HMW PEG也对绿脓杆菌的毒性表达有影响。由于群体感应信号传输是PA27853这种病原体毒性表达的公知机制，因此减弱PA27853中C4-HSL诱导的PA-I表达这一作用可能是PEG 15-20的一个主要的保护作用。预计PEG15-20诱导的对由Caco-2细胞诱导的PA-I表达的干扰作用将成为PEG 15-20的保护作用的一个重要方面。已经发现PEG 15-20对宿主动物具有保护作用，这种保护作用通过减弱绿脓杆菌(PA27853)中的PA-I表达来实现，这种PA-I表达是作为对30％肝切除后小鼠的经过滤的盲肠内含物(粪便)的响应而发生的。PEG 15-20具有屏蔽绿脓杆菌的能力，这种能力使绿脓杆菌不受增加其毒性表达的宿主因素的影响，预计这一能力是其对生物体进行保护使之免患肠源性败血症的另一机制。
相应地，本发明包括试剂盒形式的物质，以及对动物施用HMW PEG的相应方法，所述方法可对具有以下特征的状态进行预防或治疗，所述状态的特征在于，诸如某种假单胞菌等肠道病原体进行毒性因子或者决定子的表达。毒性决定子可直接或者间接地对毒性作出贡献。间接贡献的一个实例就是绿脓杆菌中的PA-I凝集素/粘附素对肠道病原体粘附于肠道上皮的作用和/或对细胞毒素、外毒素A和弹性蛋白酶产生屏障缺陷的作用。
实施例4
PEG不影响病原体的细胞生长或者细胞膜的完整性
利用含有SYTO 9和碘化丙锭的染色方法来评估两种PEG溶液(PEG 3.35和PEG 15-20)对细菌膜完整性的影响。两种PEG溶液对细菌膜渗透性都没有任何影响(图4a)。利用活的/死的细菌存活力试剂盒L-3152(Molecular Probes)来确定膜的完整性。将在不同的孵育时间采集的样品稀释10倍，通过涂覆所述稀释液来对细菌进行定量，数目以cfu/ml(菌落形成单位/毫升)来表示。使绿脓杆菌在含有这两种PEG溶液中任何一种的TSB培养基中培养过夜，由该绿脓杆菌的生长曲线可以看出，两种PEG溶液对细菌数量都未表现出抑制作用(图4b)。实际上，在每种含有PEG的培养基中的生长模式都与不含PEG的TSB培养基的生长模式完全相同。分别测定在指数生长期和生长静止期的多个时间点的乳酸脱氢酶(LDH)的活性，该酶是与能量代谢有关的管家酶。利用CytoTox 96(Promega)的底物混合物通过偶联硫辛酰胺脱氢酶检测来测定LDH的活性。利用基于双缩脲反应的蛋白检测(BCA Protein Assay)(Pierce)来确定蛋白浓度。在PEG存在下生长的绿脓杆菌的无细胞上清液中，没有观察到LDH的活性变化。该实验的结果说明HMW PEG对于细菌生长模式的作用是微不足道的。
本发明的方法及其相应产品(例如，试剂盒)提供了预防或治疗与肠源性败血症相关的疾病或者异常状态的益处，并且所述预防或治疗对肠道菌群组成没有显著影响。类似地，本发明的方法及产品可用于改善与上述疾病或异常状态相关的症状而不显著改变肠道的微生物组成。如本领域技术人员所知，迄今为止，希望能有不显著干扰肠道菌群组成的方法(及试剂盒)，因为它们不会引起由上述干扰所致的第二并发症。
实施例5
PEG包被的病原体的原子力显微镜分析
取培养过夜的PA27853培养物百分之一等分，在有或无10％HMW PEG存在的情况下在37℃利用胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基对其进行次培养4小时。从各次培养物中取一滴，用PBS充分洗涤绿脓杆菌PA27853细胞，通过鼓入空气10分钟而使之在云母顶部干燥，然后立即成像。利用MultimodeNanoscope IIIA扫描探针显微镜(MMAFM，Digital Instruments)在空气中采用轻敲式AFM(tapping-mode AFM)对干燥的细菌进行成像。将次汇合的Caco-2细胞以10％HMW PEG处理4小时，然后用PBS充分洗涤。不使用O型垫圈(O-ring)在PBS中对细胞进行AFM成像。对于电镜，在使用或不使用1mMC4-HSL和10％HMW PEG的情况下将PA27853接种至TSB中，并孵育过夜。将1滴1％的绿脓杆菌用醋酸双氧铀染色，用0.5M的NaCl洗涤，然后进行电镜检查。
Caco-2的原子力显微镜结果显示了典型的带有刷状边界微绒毛的不均匀表面，而与PEG3.35相接触的Caco-2细胞在上皮细胞的表面具有平滑的平面外观(图5a、c)。PEG 15-20通过沿着形态明确的平面填充不对称处而铺在Caco-2细胞上(图5e)，从而形成为更加复杂的形态明确的覆盖物。类似地，与PEG3.35相接触的PA27853细胞展示了通过平坦扩散的模式覆盖在细菌细胞上的光滑的聚合物覆层图案(图6d)，而PEG15-20则以形态更加不对称的方式从四周紧密围抱着细菌。对原子力显微镜测量的PEG15-20中的细菌直径的横截面分析表明，在PEG溶液中的细菌/PEG包被物显著增大(图5e，f)。换言之，PEG3.35在单独的细菌细胞周围形成了光滑的包被(图5e)，而PEG15-20紧密围抱着单独的细胞(图5f)并且增加了聚合物/细菌的直径(图5g，5h)，从而隔开了个体细菌细胞彼此之间的距离。
不希望束缚于任何理论，HMW PEG可以通过纯物理性地隔开绿脓杆菌与肠道上皮的距离而发挥其有益效果。作为选择，HMW PEG也可通过阻止由致病细胞的细胞—细胞间相互作用而产生的致病性群体感应活化信号的形成而提供有益效果。不希望束缚于任何理论，采用HMW PEG对生物学表面进行包被将使得包被的PEG链丧失构象自由度并排斥所接近的蛋白。HMW PEG和Caco-2之间的极性—极性相互作用能够对PEG链的弹性产生影响，将某些HMW PEG的侧链限制在排斥蛋白的分子结构体中。本处提供的数据支持下述结论，即，HMW PEG包被的Caco-2细胞要比未包被的Caco-2细胞更加排斥绿脓杆菌，这也许是由于HMW PEG与Caco-2细胞的某种动力学相互作用导致了“构象熵”损失。
该实验的结果证实了HMW PEG处理可对所处理的细胞产生影响，特别是可以对该细胞表面形态产生影响。而且，HMW PEG接触对这类细胞的影响不同于PEG3.35对这类细胞所施加的影响。尽管不希望束缚于任何理论，但是，此处公开的结果确实为HMW PEG与诸如PEG3.35等低分子量PEG对细胞产生的明显不同的效果提供了一种物理学上的关联。
实施例6
HMW PEG对细胞—细胞间相互作用的影响
为了直接观察PEG溶液对绿脓杆菌空间定向的影响，利用携带有编码绿色荧光蛋白的egfp基因的绿脓杆菌活菌株PA27853/EGFP来进行实验。在有或无Caco-2细胞存在下进行实验。为了采用培养的上皮细胞将PEG对细菌及其相互作用的影响成像，使用了微分干涉对比(DIC)显微镜和GFP成像。
采用pB1-EGFP质粒(Clontech)作为模板扩增所述编码绿色荧光蛋白的EGFP基因。利用引物TCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGGATG(SEQ ID NO：5)和GCAGACTAGGTCGACAAGCTTGATATC(SEQ ID NO：6)引入Xbal和Pstl限制性位点。利用TA-克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物直接克隆至pCR2.1载体中，然后将pCR2.1/EGFP结构体转化至大肠杆菌DH5a中。采用Xbal和Pstl进行消化，以此从该结构体上切离EGFP基因，然后将含有切离基因的片段克隆至大肠杆菌-绿脓杆菌穿梭载体pUCP24中，该载体是已采用同样的限制性酶消化的载体。使所得的在穿梭载体上包含EGFP基因的结构体(即，pUCP24/EGFP)在25μF和2500V的条件下通过电穿孔进入至PA27583电穿孔法胜任(electrocompetent)细胞中。在含有100μg/ml庆大霉素(Gm)的LB-琼脂培养板上选择含有PA27853/EGFP的细胞。
使携带有PA27853/EGFP的细胞在含有100μg/mlGm的LB中培养过夜，然后用1％的培养物接种至含有50μg/ml Gm的新鲜LB中。培养3小时后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使之最终浓度为0.5mM，然后将培养物再孵育2小时。取100μl细菌培养物与1ml的HDMEM培养基(Gibco BRL)相混合，其中所述培养基以HEPES缓冲并且含有10％的胎牛血清(HDMEMHF)和10％ HMW PEG。取一毫升细菌悬液将其倒入0.15mm厚的dTC3培养皿(Bioptech)中。利用有或没有HMW PEG的HDMEM HF将在0.15mm厚dTC3培养皿中的HDMEM HF中培养4天的Caco-2细胞(p10-p30)洗涤一次。将一毫升上述制备的细菌悬液加入装有Caco-2细胞的dTC3培养皿中。通过采用DIC和GFP荧光滤光片的Axiovert 100TV荧光倒置显微镜直接观察dTC3培养皿中细菌细胞的分散图案，物镜放大率为63×。利用Bioptechs恒温控制系统来调节温度。利用钨灯(100V)来激发DIC和GFP。利用Intelligent ImagingInnovations的3D成像软件(Slidebook)在使用GFP滤光片的Z平面对细菌细胞分散图案进行成像。在DIC图像(图6a1)和Z平面重新构建图像(图6a2)中观察到绿脓杆菌细胞均匀分散浮游在没有Caco-2细胞的培养基中。在Caco-2细胞存在的情况下，细菌细胞发展成凝集的外观(6b1)并观察到其与Caco-2细胞相粘附(6b2)。10％PEG 3350溶液降低了细菌的运动性，并诱导了粘附于孔底(图6c2)的蘑菇状的细菌微菌落的即可生成(图6c1)。在Caco-2细胞存在下，细菌微菌落位于上皮细胞平面上方约8微米处(6d1，2)。10％的PEG15-20溶液显著降低了绿脓杆菌的运动性。尽管如此，在含有PEG15-20的培养基中进行孵育的最初0.5-1小时中，细菌细胞形成接近于孔底的蛛腿状微菌落(图6e1，2)。在几小时内，蛛腿状的微菌落占据了培养基的全部空间/体积。在Caco-2细胞存在下，绿脓杆菌细胞丧失了蛛样构型，观察到其升高至上皮平面上方(30-40微米)(图6f1，2)。
为了确定细菌-上皮细胞间相互作用在三维上的空间定位，进行Z平面重新构建。图像显示两种PEG溶液对于绿脓杆菌的凝集具有不同的作用，并且取决于是否有Caco-2细胞存在，两种PEG溶液对细菌的空间定位有不同的影响。在仅使用培养基的实验中，观察到绿脓杆菌显示出均匀分散的图案(图6a)。但是，在Caco-2细胞存在下，受检细菌细胞发展成凝集的外观，并观察到其在孔底处靠近上皮细胞平面(图6b)。在仅有PEG3.35存在下，受检细菌细胞形成大量凝集的聚集物，并停留在培养孔的底部(图6c)，而受检的细菌细胞与含有PEG3.35的培养基中的Caco-2细胞共存时，受检细菌细胞停留而悬浮在上皮细胞平面的上方(约8微米)，并保持其凝集的外观(图6d)。在仅有PEG15-20存在下，受检细菌细胞呈现出微小凝集的均匀图案(图6e)，而在含有PEG15-20的培养基中的Caco-2存在下，受检细菌细胞以凝集的形式高高悬浮于上皮平面上方(约32微米)(图6f)。在计时实验中，观察到PEG3.35降低了细菌的运动性，PEG 15-20对细菌运动性的降低程度更大。
通过与实施例5中所公开的试验类似的方法，本实施例为所观测到的HMW PEG对细胞-细胞间相互作用的影响提供了物理学上的关联，这与本文公开的其有益的预防和治疗活性相一致。预计采用HMW PEG将能降低或消除肠道中有害的细胞—细胞间相互作用(例如，肠道上皮细胞与诸如假单胞菌等肠道病原体之间的相互作用)，降低罹患与肠源性败血症相关的疾病和/或异常状态的可能性。
实施例7
预防疾病/异常状态的方法
本发明还提供了对人和其它动物、尤其是其它哺乳动物的多种疾病和/或异常状态进行预防的方法。在这些方法中，将有效量的HMW PEG施用至需要给药的人类患者或动物个体中。可采用本领域公知的常规优化程序来确定施用进度表，以便使用该进度表来施用PEG。优选PEG的平均分子量为5,000道尔顿～20,000道尔顿，进一步优选在10,000道尔顿～20,000道尔顿之间。预期施用至少5％的HMW PEG。可采用适宜的形式来施用HMW PEG，所述适宜的形式为例如作为溶液、作为凝胶或霜剂、作为适于喷雾的溶液(例如，用于吸入)、含有HMW PEG的药物组合物和适于注射至动物体内的无菌、等渗溶液等。可利用任何常规途径来完成施用；特别希望通过口服或者局部方式来施用HMW PEG。在一些实施方案中，待施用的HMW PEG组合物还进一步包含选自以下的物质：右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。在另一个实施方案中，所施用的HMW PEG组合物还进一步包含右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、一种或多种果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。
本发明提供了预防多种疾病和异常状态的方法，所述疾病和异常状态有例如游泳耳、急性或慢性中耳炎、呼吸器相关性肺炎、肠源性败血症、坏死性小肠结肠炎、抗生素诱导的腹泻、假膜性结肠炎、炎性肠疾病、过敏性肠疾病、嗜中性小肠结肠炎、胰腺炎、慢性疲劳综合症、菌群失调综合症、微小结肠炎、慢性尿道感染、性传播疾病以及感染(例如，暴露于受生物恐怖试剂污染的环境中，所述生物恐怖试剂为例如炭疽杆菌、天花病毒、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、艰难梭菌、轮状病毒、绿脓杆菌、粘质沙雷氏杆菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、白色念珠菌以及光滑假丝酵母等)。在预防或治疗慢性尿道感染的一个优选实施方案中，所述HMW PEG以膀胱冲洗的方式施用。为预防性传播疾病，优选将本发明组合物用于润滑避孕套。在预防生物恐怖试剂感染的优选实施方案中，本发明组合物可为适于局部施用的凝胶剂或霜剂的形式。预计这种局部施用将能用于预防与任一生物恐怖试剂相关的各种疾病/异常状态，或能用于预防与对人类或动物的生存、健康或舒适造成威胁的各种化学或者物理化学试剂相关的各种疾病/异常状态。所述化学或物理化学试剂包括能够烧伤或者损伤皮肤的试剂，这些试剂在本发明的组合物中失去活性或者几乎不溶解。
在本发明方法的一个实施方案中，将雄性Balb/c小鼠麻醉，通过直接针刺向盲肠底部注射5％的PEG15-20水溶液。为了在48小时的试验期内提供PEG的恒定来源，将针直接插入小肠(回肠)，将1ml PEG 15-20逆行注射进入近端肠内。利用缝合丝线将刺穿位点结扎，然后用酒精擦拭盲肠。将小鼠放回笼中，仅饲喂水。48小时后，对小鼠实施常规的肝切除程序，该程序包括沿着松软的左叶进行不出血的30％肝脏切除。对照组小鼠经历肝处理但不作肝切除。包括施用HMW PEG的预防性处理预计可降低或消除小鼠与外科手术相关的肠源性败血症的出现。
这些方法不仅适用于对如小鼠、豚鼠、狗以及猫等宠物进行预防性护理，而且还适用于对如牛、马、绵羊、山羊、猪、鸡、火鸡、鸭、鹅等有农业价值的动物以及其它任何豢养动物的预防性护理。此外，预计该预防性方法还可用于人类，以改善许多患有下述疾病和/或异常状态的患者或者可能发展成下述疾病和/或异常状态的高危人群的健康和预期寿命：游泳耳、急性或慢性中耳炎、呼吸器相关性肺炎、肠源性败血症、坏死性小肠结肠炎、抗生素诱导的腹泻、假膜性结肠炎、炎性肠疾病、过敏性肠疾病、嗜中性小肠结肠炎、胰腺炎、慢性疲劳综合症、菌群失调综合症、微小结肠炎、慢性尿道感染、性传播疾病以及感染性试剂(例如，生物恐怖组合物)所致的疾病，所述感染性试剂所致疾病包括但不限于炭疽热以及天花。如上所述，该预防方法包括采用任何公知或常规的施用途径给人类或其它动物施用含有至少5％HMW PEG(5kDa～20kDa)的组合物。该预防方法优选用于可能发展为前述一种或多种疾病和/或状态的高危个体中，但是本发明的组合物和方法预计可在对人类或其它动物的整个种群或亚种群中的该类疾病或异常状态进行广泛的预防或治疗时起到预防性或治疗性的作用。
实施例8
对HMW PEG的施用进行监测的方法
本发明还设计了对诸如治疗方法中HMW PEG的施用进行监测的方法。在这种监测方法中，将带标记的HMW PEG单独施用或者与未标记的HMWPEG一同施用，并且在以连续或间歇的时间表进行治疗期间，对标记物进行检测，该检测包括简单终点确定。术语“带标记的”HMW PEG指的是，将标记物或者可检测化合物与HMW PEG直接或者间接相连，或者将HMW PEG与一报道化合物相连接，所述报道化合物能够将标记物与HMW PEG联系起来(当然，如下所述，本发明也考虑了未与HMW PEG相连的标记物或者设计为与之相连的标记物)。利用本领域公知的任何可检测的标记物对HMWPEG进行标记，并将该PEG标记至足以被检测到的水平。本领域技术人员应该知道，该水平将随着标记物以及检测方法的不同而发生变化。本领域技术人员应该能够采用常规的优化方法对标记的程度进行优化。标记物通过非共价键或者共价键与HMW PEG化学连接，所述非共价键或者共价键为使用时稳定、优选储藏时稳定的化学键。优选标记物与HMW PEG共价连接。调节标记物连接的密度使得HMW PEG的生物活性能够基本得到保持(保持足以实现如本文公开的预防或治疗效果的生物活性)。如本领域公知，这通常通过调节HMW PEG：标记物的比率来完成。当给定HMW PEG平均分子的相对尺寸时，则预计各种各样的标记物都能适于与HMW PEG相连接，并能基本保持HMW PEG的生物活性。
本发明考虑的标记物为本领域公知的标记物，其包括放射性标记物、发色团、荧光团以及报道物(包括能够催化可检测化合物的生成的酶以及诸如抗体等结合伴侣，该抗体使可检测化合物定域在该报道物的附近)等。酶报道物的实例包括发光体系的酶成分和比色反应催化剂。更具体地说，报道分子的实例包括生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白以及酶(例如，辣根过氧化物酶、荧光素酶以及碱性磷酸酶，包括分泌性碱性磷酸酶(SEAP)；β-半乳糖苷酶；β-葡萄糖苷酶；氯霉素乙酰转移酶)。对本领域技术人员来说，该类报道物的使用是公知的，并且在例如美国专利No.3,817,837、美国专利No.3,850,752、美国专利No.3,996,345以及美国专利No.4,277,437中都有描述。可通过报道酶转化为可检测化合物的酶底物的实例包括5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷或者Xgal和Bluo-gal等。在特定的实施方案中，作为可以转化为可检测化合物的酶底物也可作为标记物，本领域技术人员应能理解这一点。教导过标记物及其应用的美国专利包括美国专利No.3,817,837；美国专利3,850,752；美国专利No.3,939,350；以及美国专利No.3,996,345。放射性标记物的实例包括3H、14C、32P、33P、35S以及125I；荧光团的实例包括荧光素(FITC)、罗丹明、Cy3、Cy5、发光蛋白质以及绿色荧光蛋白。优选的标记物为诸如荧光素等荧光团。
本发明的监测方法还可以涉及一种以上的标记物。在一个实施方案中，一个标记物用于识别治疗后或者治疗过程中HMW PEG的位置，同时第二标记物对一种或多种微生物具有特异性，以至于该标记物可以与至少一种微生物进行可检测的连接。例如，监测方法可以包括以基本保持HMW PEG的生物活性的方式与HMW PEG相连的荧光素，以及用于检测原核生物特异性β-半乳糖苷酶活性的游离(即，未连接的)Xgal或bluo-gal。荧光素使HMW PEG定域化，而有色(蓝色)产物说明存在诸如假单胞菌等可代谢乳糖的原核微生物。本发明还包括以下的监测方法，其中，单个标记物提供该信息(即，HMW PEG的定位以及指示微生物的存在)。
本领域公知的任何检测技术都可用于本发明的监测方法。有一些因素会对所选择的检测技术产生影响，这些因素包括标记物的类型、受到监测的生物物质(例如，皮肤、耳道或肠道的表皮细胞；粪便、粘膜或组织的样品)、所需的识别水平以及是否需要定量等。适宜的检测技术包括以肉眼进行简单目视检查、利用诸如选择性地装备有适宜的光源和/或用于记录的相机的内窥镜等器械来进行的目视检查以及盖革(Geiger)计数器、X-射线膜、闪烁计数器等的常规使用方法和本领域公知的任何其它检测技术。
本领域技术人员可以知道，本发明的监测方法可用于对所述治疗方法进行优化。例如，可采用监测方法来对输送至上皮细胞的HMW PEG的量和/或浓度进行优化(例如，为了使HMW PEG溶液或混合物达到所需的粘度)，所述上皮细胞是例如耳道上皮细胞，该输送可用于预防或治疗游泳耳。作为另外的实例，通过对与带标记的HMW PEG接触的肠道进行内窥镜检查或者通过监测大便样品，可利于对肠或肠内的治疗进行优化。
本发明的监测方法包括用于检测能够粘附于肠道上皮细胞的微生物的大便检测，该方法包括使微生物和肠道上皮细胞相接触，然后采用本领域公知的任意技术来检测微生物对该上皮细胞的粘附。在优选的实施方案中，将肠道上皮细胞固定于诸如微量滴定孔的底面和/或侧面等适宜的表面上。在另一优选的实施方案中，在检测步骤前或者检测步骤中，加入直接标记物或者诸如能够生成可检测产物的报道物等间接标记物。所述监测方法可以进一步包括加入游离标记物的步骤。例如，在怀疑含有可代谢乳糖的原核微生物的样品中加入游离的Bluo-gal；如果存在，则微生物酶β-半乳糖苷酶将裂解Bluo-gal，产生可检测的蓝色产物。
在一个实施方案中将商购获得的肠道上皮细胞(例如，Caco-2细胞，ATCCHTB 37和/或IEC-6细胞，ATCC CRL 1952)通过常规技术固定于微量滴定培养皿的孔中。收集大便样品并与诸如磷酸盐缓冲盐水等液体相混合。获得含有悬浮微生物的混合物的液相(例如，通过适宜的过滤(即，将粗固体与液态悬液中的细菌分离)或倾析等方法)，并用PBS以1∶100进行稀释。向活的微生物悬液中加入Bluo-gal。将悬液加至微量滴定孔中，于24℃保持1小时，然后用适宜的液体(例如，PBS)洗涤这些孔，以除去未结合的微生物。通过诸如偏振光显微镜计数等方法检测未结合的微生物和/或与固定的上皮细胞结合的微生物。在另外的实施方案中，以适宜的免疫试剂将免疫测定用于检测粘附，所述适宜的免疫试剂为微生物特异性的单克隆或者多克隆抗体，其选择性地与诸如放射标记物、荧光团或者发色团等标记物相连接。
本领域技术人员应该知道，肠道上皮细胞或肠道微生物都无需固定，但所述固定会利于精确检测粘附于上皮细胞的微生物。例如，在一个实施方案中，将固定的大便微生物与未固定的肠道上皮细胞相接触。此外，本领域技术人员应该知道，可采用本领域公知的任意合适的液体来获得微生物悬液，优选所述液体为已知的任何等渗缓冲液。而且，如上所述，任何已知的标记物都可用于检测细胞粘附。
在相关方面，本发明提供了一种用于检测微生物细胞的粘附的试剂盒，所述试剂盒包括上皮细胞以及一份用于检测微生物细胞对该上皮细胞的粘附的实验方案。所述方案对检测微生物的已知方法进行了描述。优选的试剂盒包括肠道上皮细胞。本发明的其它试剂盒进一步包括诸如荧光团或者报道物等标记物。
本发明考虑的另一监测方法为微生物疏水性的检测。在该方法中，利用任何常规技术来确定微生物细胞的相对或绝对疏水性。所用技术的一个实例包括如本领域所公知的对任何微生物进行疏水相互作用色谱。参见Ukuku等，J.Food Prot.65：1093-1099(2002)，将其全文引入作为参考。所用技术的另一实例为对任何微生物进行非极性液体：极性液体分配法(例如，1-辛醇：水或者二甲苯：水)。参见Majtan等，Folia Microbiol(Praha)47：445-449(2002)，将其全文引入作为参考。
在采用疏水性检测对PEG的施用进行监测的一个实施方案中，将大便样品悬浮于50mM的磷酸钠缓冲液(含有0.15M NaCl，pH7.4)中。通过离心收集悬液中的微生物，用相同的缓冲液进行重悬，并重复离心-重悬的循环。如果可能，用相同的缓冲液将微生物重悬至660nm处的吸光率为0.4，此时可不使用带标记的PEG而通过分光光度法进行监测。用二甲苯(Merck)处理微生物悬液(微生物悬液：二甲苯的体积比为2.5∶1)，将悬液剧烈混合2分钟，然后将悬液在室温下沉降20分钟。测定水相中微生物的存在，可通过例如分光光度法测定660nm处的吸光率来进行测定。用含有磷酸钠缓冲液的空白样品来消除背景。
为从大便样品中获得微生物细胞以用于所述方法中，优选HMW PEG在用于获得微生物悬液的液体中以及在用于对微生物悬液进行稀释的任何液体中相对不溶解。
本发明进一步提供了一种用于包括对微生物疏水性进行检测的监测方法的试剂盒，所述试剂盒包括肠道上皮细胞以及一份叙述微生物疏水性检测的实验方案。优选的试剂盒包括肠道上皮细胞。相关的试剂盒进一步包括诸如荧光团或者报道物等标记物。
本发明更进一步提供了一种监测方法，所述方法包括获得肠道菌落样品以及检测PA-I凝集素/粘附素的活性。可采用本领域公知的用来检测PA-I凝集素/粘附素的活性的任何技术。例如，可利用特异性识别PA-I凝集素/粘附素的抗体(多克隆抗体、单克隆抗体、诸如Fab片段等抗体片段、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及本领域公知的任何其它形式的抗体)来对PA-I凝集素/粘附素进行检测。免疫检测采用本领域公知的任何免疫检测方法，例如，ELISA、蛋白印迹法和免疫沉淀反应法等。作为选择，可以检测PA-I凝集素/粘附素与碳水化合物的结合能力或者PA-I凝集素/粘附素对肠道上皮屏障的破坏活性，所述检测可通过例如在与样品接触前和/或与样品接触期间监测上皮层的跨上皮电阻或者说TEER来进行。在相关的试剂盒中，本发明提供了PA-I凝集素/粘附素结合伴侣以及用于检测PA-I凝集素/粘附素的活性(例如，结合活性)的实验方案。本发明的其它试剂盒包括已知可与PA-I凝集素/粘附素结合的任意的碳水化合物以及用于检测PA-I凝集素/粘附素的活性(例如，结合活性)的方案。
根据上述教导可对本发明作出多种修饰以及变化，这些修饰和变化也在本发明的保护范围之内。本文引用的所有出版物都全文引用作为参考。
Claims (53)
1、聚乙二醇在制备用于降低处于异常状态的动物的死亡率的药物中的应用，所述异常状态包括上皮表面处于可能发展为微生物介导的紊乱的危险之中，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
2、如权利要求1所述的应用，其中所述异常状态选自肠源性败血症、烧伤、肠病和移植排斥。
3.如权利要求2所述的应用，其中所述肠病为炎性肠疾病。
4、如权利要求1所述的应用，其中所述异常状态选自由新生儿坏死性小肠结肠炎、严重嗜中性白血球减少症、毒性大肠炎和慢性肠炎组成的组。
5、如权利要求1所述的应用，其中所述动物选自由狗、猫、绵羊、山羊、牛、猪、鸡、马和人组成的组。
6、如权利要求5所述的应用，其中所述动物为人。
7、聚乙二醇在制备用于抑制肠道病原体中PA-I凝集素/粘附素表达的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
8、聚乙二醇在制备用于抑制由肠道诱导的PA-I凝集素/粘附素活化的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
9、聚乙二醇在制备用于抑制由C4-HSL诱导的肠道病原体的形态变化的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
10、聚乙二醇在制备用于减少肠道病原体的毒性表达的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
11、聚乙二醇在制备用于通过抑制致病性群体感应活化的形成来改善肠道发病的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
12、聚乙二醇在制备用于抑制细菌细胞粘附于哺乳动物的肠道的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
13、如权利要求12所述的应用，其中所述细菌细胞为假单胞菌。
14、如权利要求13所述的应用，其中所述假单胞菌为绿脓杆菌。
15、聚乙二醇在制备减少细菌细胞中PA-I凝集素/粘附素表达的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
16、聚乙二醇在制备用于降低罹患有微生物介导的上皮紊乱的动物的死亡率的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
17、如权利要求16所述的应用，其中所述微生物介导的上皮紊乱选自肠源性败血症、烧伤、肠病和移植排斥。
18.如权利要求17所述的应用，其中所述肠病为炎性肠疾病。
19、如权利要求16所述的应用，其中所述微生物介导的上皮紊乱选自由新生儿坏死性小肠结肠炎、严重嗜中性白血球减少症、毒性大肠炎和慢性肠炎组成的组。
20、如权利要求16所述的应用，其中所述聚乙二醇以形态不对称方式粘附至肠道上皮细胞或者细菌细胞。
21、如权利要求20所述的应用，其中所述细菌细胞为肠道病原体。
22、如权利要求16所述的应用，所述药物还包含选自右旋糖苷、右旋糖苷包衣的L-谷氨酸或右旋糖苷包衣的菊粉的化合物。
23、如权利要求16所述的应用，所述药物还包含L-谷氨酸。
24、用于治疗或预防肠源性败血症的试剂盒，其包括下述的药物组合物以及描述所述组合物在治疗或者预防异常状态时的用法的方案，所述组合物包含平均分子量为15,000～20,000道尔顿的聚乙二醇以及适宜的佐剂、载体或稀释剂。
25、聚乙二醇在制备用于预防微生物介导的上皮疾病或者上皮紊乱的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
26、如权利要求25所述的应用，其中所述上皮疾病或上皮紊乱选自：游泳耳、急性中耳炎、慢性中耳炎、呼吸器相关性肺炎、肠源性败血症、抗生素诱导的腹泻、炎性肠病、过敏性肠病、胰腺炎、慢性疲劳综合症、菌群失调综合症、慢性尿道感染、性传播疾病或炭疽杆菌感染。
27、如权利要求26所述的应用，其中所述炎性肠病选自：坏死性小肠结肠炎、假膜性结肠炎、嗜中性小肠结肠炎和微小结肠炎。
28、如权利要求26所述的应用，其中所述药物用于预防动物中的微生物介导的上皮疾病或者上皮紊乱，所述动物选自由狗、猫、绵羊、山羊、牛、猪、鸡、马和人组成的组。
29、如权利要求28所述的应用，其中所述动物为人。
30、如权利要求25所述的应用，其中所述药物进一步被制成选自由液态溶液和局部用凝胶组成的组中的剂型。
31、如权利要求25所述的应用，其中所述药物进一步被制成适于喷雾的溶液。
32、如权利要求25所述的应用，其中所述药物还包含选自以下的化合物：右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖或乳果糖。
33、如权利要求25所述的应用，其中所述药物还包含右旋糖苷包衣的L-谷氨酸、右旋糖苷包衣的菊粉、右旋糖苷包衣的丁酸、果糖-低聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、右旋糖苷包衣的甘露糖、半乳糖以及乳果糖。
34、聚乙二醇在制备用于预防皮肤感染的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
35、如权利要求34的应用，其中所述药物进一步被制成选自由软膏、霜剂、凝胶和洗剂组成的组中的剂型。
36、如权利要求34的应用，其中导致所述感染的作用物选自：炭疽杆菌、天花病毒、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌、艰难梭菌、轮状病毒、绿脓杆菌、粘质沙雷氏杆菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、白色念珠菌或光滑假丝酵母。
37、聚乙二醇在制备用于预防呼吸性传染的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
38、如权利要求37所述的应用，其中所述呼吸性传染是呼吸器相关性肺炎。
39、如权利要求38所述的应用，其中引起所述呼吸性传染的所述作用物选自炭疽杆菌或天花病毒。
40、聚乙二醇在制备用于对尿道的至少一部分进行冲洗来预防慢性尿道感染的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
41、如权利要求40所述的应用，其中尿道的所述部分至少包括膀胱。
42、避孕套，所述避孕套至少包括局部的聚乙二醇涂层，所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
43、聚乙二醇在制备用于对消化道紊乱进行预防的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
44、如权利要求43所述的应用，其中所述消化道紊乱选自炎性肠病和过敏性肠病。
45、如权利要求43所述的应用，其中所述消化道紊乱选自由新生儿坏死性小肠结肠炎、抗生素诱导的腹泻、假膜性结肠炎、嗜中性小肠结肠炎、胰腺炎、菌群失调性综合症和微小结肠炎组成的组。
46、带标记的聚乙二醇在制备用于监测聚乙二醇向处于发展为微生物介导的上皮紊乱的危险中的动物中所进行的施用的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
47、如权利要求46所述的应用，其中所述标记为荧光团。
48、如权利要求46所述的应用，其中所述药物进一步包括对微生物具有特异性的第二标记。
49、用于监测聚乙二醇向处于发展为微生物介导的上皮紊乱的危险中的动物中所进行的施用的试剂盒，所述试剂盒包括平均分子量为15,000～20,000道尔顿的带标记的聚乙二醇以及实验方案，所述方案描述了带标记的聚乙二醇在监测聚乙二醇的施用中的使用方法。
50、聚乙二醇在制备用于预防动物丧失产乳能力的药物中的应用，所述动物的乳腺上皮表面处于可能发展为微生物介导的紊乱的危险之中，而且所述微生物介导的紊乱为影响产奶量的紊乱，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
51、聚乙二醇在制备用于预防微生物介导的上皮紊乱在喂乳期动物中发展的药物中的应用，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
52、如权利要求51所述的应用，其中所述药物进一步包含婴儿配方奶粉。
53、包含婴儿配方奶粉和聚乙二醇的组合物，其中所述聚乙二醇的平均分子量为15,000～20,000道尔顿。
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