PT1567117E - Prevenção e tratamento de distúrbios epiteliais mediados por micróbios - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
"PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS EPITELIAIS MEDIADOS POR MICRÓBIOS"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a materiais para a prevenção ou tratamento de distúrbios epiteliais mediados por micróbios, tal como septicemia de origem intestinal.
ANTECEDENTES
Os distúrbios epiteliais mediados por micróbios, ou estados anómalos, constituem uma ameaça significativa à saúde do homem e animais, impondo um fardo nos sistemas de saúde a nível mundial. Um exemplo desses distúrbios, a septicemia de origem intestinal, é uma causa muito importante de mortalidade entre os organismos, tal como doentes humanos, que sofrem de qualquer de uma variedade de doenças, distúrbios ou padecimentos, tais como lesões de queimaduras, enterocolite neonatal, neutropenia grave, doença inflamatória intestinal e rejeição de órgãos após transplantação. 0 reservatório do tracto intestinal vem de há muito a ser reconhecido como um foco de septicemia mediada por bactérias potencialmente letal em, e. g., doentes hospitalizados em estado crítico. A capacidade dos patógenos microbianos, tal como as Pseudomonas (e. g., Pseudomonas aeruginosa) , para perturbarem a função regulatória da barreira epitelial intestinal pode ser uma característica definidora entre os 1 organismos oportunistas capazes de causarem septicemia de origem intestinal. Em muitas destas infecções, a Pseudomonas aeruginosa foi identificado como o patógeno causador. Significativamente, mostrou-se que o tracto intestinal é o principal local de colonização de patógenos oportunistas, tal como P. aeruginosa.
As abordagens terapêuticas convencionais à prevenção ou tratamento de distúrbios epiteliais mediados por micróbios, tal como septicemia de origem intestinal, depararam-se com um sucesso incompleto. As abordagens baseadas em antibióticos estão comprometidas pela dificuldade em adequar os antibióticos ao patógeno intestinal, num modo que não afecte a restante flora intestinal. Além disso, muitos dos patógenos intestinais, como tipificados por P. aeruginosa, tornam-se, frequentemente, resistentes às acções com antibióticos, resultando numa abordagem dispendiosa, continuada e não totalmente bem-sucedida à prevenção ou tratamento. Os problemas também atormentam as abordagens imunoterapêuticas. Particularmente, muitos patógenos intestinais, tal como P. aeruginosa, são imunoevasivos, tornando essas abordagens minimamente eficazes.
Outra abordagem à prevenção ou tratamento de distúrbios, tal como septicemia de origem intestinal, é a lavagem intestinal. Nos últimos anos, foi tentada a lavagem intestinal utilizando soluções de polietilenoglicol (PEG), com alguns relatos anedóticos sugerindo que o PEG pode mostrar sinais prometedores no tratamento da septicemia de origem intestinal numa variedade de circunstâncias clínicas e experimentais. 0 PEG nestas soluções tem um peso molecular médio de 3500 daltons e as soluções estão comercialmente disponíveis (e. g., Golytely). Os mecanismos pelos quais estas soluções de PEG de peso molecular relativamente baixo (LMW) proporcionam um benefício terapêutico 2 no tratamento ou prevenção de septicemia de origem intestinal são desconhecidos. Tipicamente, estas soluções são utilizadas para lavar ou limpar o tracto intestinal de organismos em risco de desenvolverem ou sofrerem de septicemia de origem intestinal. Como resultado da administração destas soluções de PEG LMW ao tracto intestinal, há uma alteração variável na composição da flora do intestino tratado, dependendo do método de concentração e do peso molecular dos compostos utilizados. Por exemplo, as soluções que têm concentrações de PEG superiores a cerca de 20% podem resultar numa acção microbicida, resultando na eliminação de microrganismos potencialmente protectores no tracto intestinal de um hospedeiro sob stress. Do mesmo modo, as soluções de PEG de baixo peso molecular podem perder a sua eficácia na atenuação da capacidade de virulência de determinados organismos, apesar de os preservar. Por conseguinte, existe uma necessidade na técnica para uma solução que iniba a expressão de virulência microbiana (as propriedades nocivas de um micróbio), embora não matando o micróbio ou micróbios vizinhos, proporcionando, desse modo, o beneficio de preservar o ecossistema natural da microflora intestinal. Por exemplo, a preservação da composição da flora nativa proporcionaria competição para patógenos oportunistas que, de outro modo, poderiam colonizar o intestino.
Concomitante com uma alteração na composição da flora é uma alteração na fisiologia do organismo. Estas alterações fisiológicas podem ser monitorizadas através do ensaio de qualquer número de actividades enzimáticas caracteristicas, tal como os níveis de lactato desidrogenase. Consequentemente, os tratamentos do intestino com PEG LMW produzem alterações significativas na fisiologia dos organismos tratados, com consequências de prazo mais longo imprevisíveis e, deste modo, 3 potencialmente prejudiciais para a saúde e bem-estar do organismo tratado. Além disso, esses tratamentos provocam reacções fisicamente exigentes, na forma de evacuação intestinal maciça, em organismos doentes em estado critico, tal como doentes humanos hospitalizados.
Deste modo, permanece uma necessidade na técnica para proporcionar uma composição eficaz na prevenção ou tratamento, de um distúrbio epitelial mediado por micróbios (e. g., septicemia de origem intestinal) e/ou de um sintoma associado a esse distúrbio, juntamente com métodos para alcançar esses benefícios, sem criar o potencial para complicações adicionais, através de alteração significativa da fisiologia do organismo tratado. 0 documento WO99/08514 divulga composições contendo PEG (polietilenoglicol), de um modo muito preferido, a molécula baseada em PEG linear, com peso molecular de 20000 daltons. O PEG inibe a apoptose, protege, preserva ou restaura a função celular, de tecido ou órgão.
As composições do documento WO99/08514 são utilizadas no tratamento da perturbação gastrointestinal que pode ser causada pelo vírus da imunodeficiência humana, agentes quimioterapêuticos, radiação e doenças infecciosas, tal como a doença inflamatória intestinal. A perturbação gastrointestinal inclui a lesão do revestimento intestinal, úlceras crónicas graves, colite e a perturbação do tracto gastrointestinal causada por parasitas e diarreia de qualquer outra causa. As composições podem ser administradas por estados dermatológicos, tal como por cicatrização de feridas. 4
Além disso, Desai N P et al., Biomaterials 1992, vol. 13, n° 7, 1992, páginas 417-420, divulgam filmes modificados por PET com PEG que têm 18500 daltons de peso molecular. O PEG reduz a adesão bacteriana de S. aureus, S. epidermis e P. aeruginosa a implantes e reduz o risco de infecções associadas a implantes.
SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO A presente divulgação satisfaz a acima mencionada necessidade na técnica, proporcionando uma composição de polietilenoglicol de elevado peso molecular (HMW) que proporciona protecção eficaz contra um estado anormal, caracterizado por uma superfície epitelial em risco de desenvolver um distúrbio mediado por micróbios. Os estados anómalos exemplificativos incluem septicemia de origem intestinal e outros distúrbios/doenças intestinais associados à flora intestinal, devido a patógenos intestinais incluindo, mas não limitados a, P. aeruginosa. O PEG HMW inibe ou previne o contacto desses patógenos, tal como P. aeruginosa, com a superfície epitelial intestinal. Além disso, o PEG de elevado peso molecular suprime a expressão de virulência nestes patógenos (e. g., P. aeruginosa) responsivos a uma variedade de sinais que podem envolver redes de sinalização por detecção de quórum. A capacidade dos PEG HMW interditarem a interface infecciosa entre o patógeno intestinal e o epitélio intestinal proporciona uma abordagem alternativa à prevenção ou tratamento de septicemia de origem intestinal, e. g., após stress catabólico. Facto importante, os tratamentos com PEG HMW seriam eficazes em termos de custos e relativamente simples de realizar em doentes humanos, assim como numa variedade de outros organismos, tais como gado pecuariamente significativo (e. g., 5 gado bovino, porcos, ovelhas, cabras, cavalos, galinhas, perus, patos, gansos e semelhantes), animais de estimação e animais de jardim zoológico.
Um aspecto da divulgação proporciona um método de redução da probabilidade de mortalidade num animal com um estado anómalo, incluindo um estado de doença, compreendendo uma superfície epitelial em risco de desenvolver um distúrbio mediado por micróbios, seleccionado do grupo consistindo em septicemia de origem intestinal, uma lesão de queimadura, enterocolite necrosante neonatal, neutropenia grave, colite tóxica, doença inflamatória intestinal, enteropatia, rejeição de transplante, pouchite e pig-bel, compreendendo a administração de uma dose eficaz de polietilenoglicol (PEG) a um animal que dela necessita, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons.
Os animais adequados incluem, mas não estão limitados, a cão, gato, ovelha, cabra, vaca, porco e humano. No método acima mencionado, o PEG tem, de um modo preferido, um peso molecular médio de, pelo menos, 15000 daltons e tem, de um modo preferido, entre 5000 e 20000 daltons ou entre 15000 e 20000 daltons. Também é preferido PEG que tem um peso molecular médio de 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000 e 25000 daltons. Adicionalmente, o PEG pode estar numa solução aquosa compreendendo PEG a 5-20% e, de um modo preferido, PEG a 10-20% (e. g., PEG a 10%). Numa forma de realização do método, o estado está associado à presença de um organismo Pseudomonas aeruginosa no intestino e a integridade da membrana celular desse P. aeruginosa não está alterada de um modo detectável. Noutra forma de realização do método, o padrão de crescimento de Pseudomonas aeruginosa não está alterado de um modo detectável. 6 É outro aspecto da divulgação um método de inibição de septicemia de origem intestinal, compreendendo a colocação de um epitélio mamífero, tal como um intestino, em contacto com polietilenoglicol (PEG) , em gue o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons e, de um modo preferido, pelo menos, 15000 daltons. Numa forma de realização deste método, o intestino mamífero contacta o PEG durante, pelo menos, 30 minutos.
Aspectos adicionais da divulgação incluem um método de inibição da expressão de lectina PA-I/adesina num patógeno dos epitélios, e. g. , um patógeno intestinal, compreendendo a administração de uma dose eficaz de polietilenoglicol a um animal que dela necessita; um método de inibição da activação induzida por epitélio (e. g., induzida por epitélio intestinal) de lectina PA-I/adesina, compreendendo a administração de uma dose eficaz de polietilenoglicol a um animal que dela necessita; um método de inibição de alteração morfológica induzida por C4-HSL de um patógeno dos epitélios (e. g., um patógeno intestinal), compreendendo a administração de uma dose eficaz de polietilenoglicol a um animal que dela necessita; um método de redução da expressão de virulência num patógeno dos epitélios (e. g., um patógeno intestinal), compreendendo a administração de uma dose eficaz de polietilenoglicol a um animal que dela necessita; um método de redução ou prevenção da interacção de uma superfície epitelial com um factor de virulência microbiano, compreendendo a administração de uma dose eficaz de polietilenoglicol a um animal que dela necessita; um método de melhoramento da patogénese epitelial (e. g., intestinal) através da prevenção da formação da activação patogénica por detecção de quórum, compreendendo a administração de uma dose eficaz de 7 polietilenoglicol a um animal que dele necessita e um método de inibição da interacção entre epitélio (e. g., epitélio intestinal) de um vertebrado e uma bactéria, tal como uma Pseudomona (e. g., Pseudomonas aeruginosa), compreendendo a colocação do epitélio em contacto com polietilenoglicol. Em todos estes aspectos da invenção, o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons e, de um modo preferido, pelo menos, 15000 daltons. É ainda um aspecto adicional da divulgação um método de inibição de uma redução induzida por Pseudomonas aeruginosa na resistência eléctrica transepitelial de uma camada epitelial mamífera, tal como uma camada epitelial intestinal, compreendendo a colocação da camada epitelial (intestinal) em contacto com polietilenoglicol, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons e, de um modo preferido, pelo menos, 15000 daltons. De um modo preferido, o PEG tem um peso molecular médio de 15000 a 20000 daltons. Numa forma de realização preferida, a integridade da membrana microbiana (e. g. , P. aeruginosa) não está alterada de um modo detectável. É ainda outro aspecto da divulgação um método de inibição da aderência de uma célula bacteriana a um epitélio mamífero, tal como um intestino mamífero, compreendendo a colocação do intestino em contacto com polietilenoglicol, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons e, de um modo preferido, pelo menos, 15000 daltons. Com este método prefere-se, igualmente, que o PEG tenha um peso molecular médio de 15000 a 20000 daltons. 0 PEG pode estar numa solução aquosa compreendendo PEG a 5-20% e, de um modo preferido, PEG a 5-10%. Uma célula bacteriana exemplificativa contemplada como receptiva à inibição de aderência por este método é uma Pseudomona, tal como P. aeruginosa. É outro aspecto da divulgação um método de redução da expressão de lectina PA-I/adesina numa célula bacteriana, compreendendo a colocação da célula bacteriana em contacto com polietilenoglicol, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons e, de um modo preferido, 15000 daltons e tem, de um modo preferido, entre 15000 e 20000 daltons. De novo, o PEG pode estar numa solução aquosa compreendendo PEG a 5-20% e, de um modo preferido, PEG a 5-10%.
Noutro aspecto, a divulgação proporciona um método de redução da probabilidade de mortalidade num animal que apresenta um distúrbio epitelial mediado por micróbios, seleccionado do grupo consistindo em septicemia de origem intestinal, uma lesão de queimadura, enterocolite necrosante neonatal (NEC), neutropenia grave, colite tóxica, doença inflamatória intestinal, enteropatia (e. g., nos doentes em estado critico), rejeição de transplante, pouchite e pig bei, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto (e. g., PEG) que adere a uma célula, seleccionada do grupo consistindo numa célula epitelial intestinal de mamífero e uma célula intestinal bacteriana, em que o composto adere à célula num modo topograficamente assimétrico inibindo, desse modo, a interacção da célula epitelial intestinal de mamífero e da célula bacteriana. Um tensioactivo é um composto preferido. Numa forma de realização deste método, o composto é PEG, de um modo preferido, que tem um peso molecular médio de, pelo menos, 15000 daltons. Noutra forma de realização deste método, a inibição é determinada por microscopia de força atómica. Ainda noutra forma de realização deste método, a célula bacteriana é um patógeno 9 das suas intestinal e não há modificação detectável caracteristicas de crescimento. Em aspectos relacionados, este método compreende, adicionalmente, a introdução de uma quantidade eficaz de dextrano no intestino do animal e/ou a introdução de uma quantidade eficaz de L-qlutamina, L-glutamina revestida com dextrano, inulina revestida com dextrano, ácido butírico revestido com dextrano, um ou mais fruto- oligossacáridos, N-acetil-D-galactosamina, manose revestida com dextrano e galactose, lactulose e tampões de equilíbrio e agentes estabilizantes, conhecidos na técnica, no intestino do animal. Quando administrada em conjunto como uma única composição, esta administração de solução única multicomponente irá tratar e preparar o tracto intestinal em antecipação de uma disrupção na flora intestinal e da função de barreira do intestino, tal como ocorre após stresses graves de tipo catabólico, cirúrgico e traumático. É outro aspecto da divulgação um método de melhoramento de um sintoma associado a qualquer doença ou estado que surge ou é característico de um estado anómalo do epitélio, tal como septicemia de origem intestinal, compreendendo a administração de polietilenoglicol ao intestino, em que o PEG tem um peso molecular médio de pelo menos, 5000 daltons, de um modo preferido , pelo menos, 15000 daltons e tem, de um modo preferido , entre 15000 e 20000 daltons. 0 PEG pode estar numa solução aquosa compreendendo PEG a 5 — 2 0 % Θ r de um modo preferido, PEG a 5-10%. A invenção compreende o melhoramento de um sintoma associado a qualquer doença ou estado aqui divulgado. É ainda outro aspecto da divulgação um método de prevenção da perda da capacidade lactante num animal exibindo um estado anormal, na forma de um superfície epitelial de uma glândula 10 mamária em risco de desenvolver um distúrbio mediado por micróbios afectando a produção de leite, compreendendo a administração, e. g. , topicamente, de uma dose eficaz de um poliet ilenoglicol de, pelo menos, 5000 daltons e, de um modo preferido, pelo menos, 15000 daltons, à superfície epitelial de uma glândula mamária. Os animais exemplificativos incluem mamíferos, tais como ovelhas, cabras, vacas, porcos, cavalos e humanos. Num aspecto relacionado, a invenção proporciona um método de tratamento de uma perda de capacidade lactante num animal, caracterizada por um distúrbio mediado por micróbios de uma superfície epitelial de uma glândula mamária afectando a produção de leite, compreendendo a administração, e. g., topicamente, de uma dose eficaz de um polietilenoglicol de, pelo menos, 5000 daltons e, de um modo preferido, pelo menos, 15000 daltons, a uma glândula mamária. Noutro aspecto relacionado, a invenção proporciona um método de prevenção do desenvolvimento de um distúrbio epitelial mediado por micróbios num animal em idade de aleitamento, compreendendo a administração ao animal de uma dose eficaz de polietilenoglicol de, pelo menos, 5000 daltons e, de um modo preferido, pelo menos, 15000 daltons. Os animais adequados incluem mamíferos, tais como humanos, gado, animais de estimação domesticados e animais de jardim zoológico. Numa forma de realização, o PEG é misturado com qualquer fórmula para lactentes conhecida na técnica. É um aspecto relacionado da divulgação uma composição compreendendo fórmula para lactentes e polietilenoglicol (PEG), em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons. De novo, pode ser utilizada qualquer fórmula para lactentes conhecida na técnica, incluindo fórmulas à base do leite de um mamífero, tais como leite de vaca, leite de cabra e 11 semelhantes, assim como fórmulas à base de leite de soja. A fórmula também pode ser enriquecida com qualquer vitamina e/ou elemento, incluindo fortificação com ferro. 0 PEG tem, de um modo preferido, um peso molecular médio de, pelo menos, 15000 daltons e está, de um modo preferido, presente na gama de 5-20%, após reconstituição ou hidratação da fórmula para lactantes ou bebés. A invenção proporciona, adicionalmente, um método para proporcionar nutrição a um animal, de um modo preferido em idade de aleitamento, compreendendo a administração ao animal de uma dose eficaz da composição compreendendo fórmula para lactentes e PEG. É ainda outro aspecto da divulgação uma composição farmacêutica compreendendo polietilenoglicol de, pelo menos, 5000 daltons e, de um modo preferido, 15000 daltons, de peso molecular médio e um adjuvante, transportador ou diluente adequado. Num aspecto relacionado, a composição compreende, adicionalmente, um composto seleccionado do grupo consistindo em L-glutamina revestida com dextrano, inulina revestida com dextrano, ácido butirico revestido com dextrano, um ou mais fruto-oligossacáridos, N-acetil-D-galactosamina, manose revestida com dextrano e galactose, lactulose e tampões de equilíbrio e agentes estabilizantes conhecidos na técnica. É um aspecto adicional da divulgação um kit para o tratamento terapêutico ou prevenção de um estado anormal, caracterizado por uma superfície epitelial em risco de desenvolver um distúrbio de mediação microbiana, tal como septicemia de origem intestinal, compreendendo uma das composições farmacêuticas descritas acima e um protocolo descrevendo a utilização da composição no tratamento terapêutico ou prevenção do estado anormal. Os protocolos adequados para 12 inclusão no kit descrevem qualquer um dos métodos terapêuticos ou de prevenção aqui divulgados.
Ainda outros aspectos da divulgação são dirigidos a métodos de prevenção de um estado anormal, caracterizado por uma superfície epitelial em risco de distúrbio mediado por micróbios, incluindo doenças. Por exemplo, a invenção compreende um método de prevenção de uma doença ou um estado anormal, compreendendo a administração de uma composição compreendendo uma dose eficaz de polietilenoglicol (PEG) a um animal, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons. Uma doença ou estado anormal adequado, receptivo aos métodos preventivos da invenção, é seleccionado do grupo consistindo em ouvido de nadador, otite média aguda, otite média crónica, pneumonia associada a ventilador, septicemia de origem intestinal, enterocolite necrosante, diarreia induzida por antibiótico, colite pseudomembranosa, uma doença inflamatória intestinal, doença do intestino irritável, enterocolite neutropénica, pancreatite, síndrome de fadiga crónica, síndrome de disbiose, colite microscópica, uma infecção crónica do aparelho urinário, uma doença sexualmente transmitida e infecção. Um animal adequado como um indivíduo para esses métodos preventivos é seleccionado do grupo consistindo em cão, gato, ovelha, cabra, vaca, porco, galinha, cavalo e humano. O PEG tem, de um modo preferido, um peso molecular médio de, pelo menos, 15000 daltons; é também preferido PEG tendo um peso molecular médio entre 15000 e 20000 daltons. Adicionalmente, O PEG pode estar numa solução aquosa compreendendo PEG a 10-20% e, de um modo preferido, PEG a 10%. A composição sendo administrada pode compreender, adicionalmente, um veículo seleccionado do grupo consistindo numa solução líquida, um gel tópico e uma solução adequada para nebulização. Adicionalmente, a composição 13 pode compreender, adicionalmente, um composto seleccionado do grupo consistindo em L-glutamina revestida com dextrano, inulina revestida com dextrano, ácido butirico revestido com dextrano, um fruto-oligossacárido, N-acetil-D-galactosamina, manose revestida com dextrano, galactose e lactulose. Numa forma de realização, a composição compreende PEG, L-glutamina revestida com dextrano, inulina revestida com dextrano, ácido butirico revestido com dextrano, um fruto-oligossacárido, N-acetil-D-galactosamina, manose revestida com dextrano, galactose e lactulose. É ainda outro aspecto da divulgação um método de prevenção de infecção de pele, compreendendo a etapa de aplicação de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de polietilenoglicol (PEG) a um animal, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons. A composição pode compreender, adicionalmente, um veículo seleccionado do grupo consistindo numa pomada, um creme, um gel e uma loção. A invenção contempla que um agente causando a infecção é seleccionado do grupo consistindo em Bacillus anthracis, Vírus da Varíola, E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa, (EAEC), Closfridium difficile, rotavírus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Klebsiella oxytocia, Enterobacteria cloacae, Candida albicans e Candida globrata. É outro aspecto da divulgação um método de prevenção de infecção respiratória, compreendendo a etapa de administração de uma quantidade eficaz de polietilenoglicol (PEG) a um animal, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons. Uma infecção respiratória receptiva aos métodos preventivos da invenção pode surgir do contacto com um agente 14 infeccioso, por meio de qualquer via conhecida na técnica, incluindo pneumonias associadas a ventiladores (e. g. , pneumonia associada a ventilador), agentes infecciosos transportados pelo ar, agentes infecciosos dispersos num fluido nebulizado, tal como por espirro e semelhantes. Em algumas formas de realização, o método previne a infecção respiratória por um agente seleccionado do grupo consistindo em Bacillus anthracis e Virus da Variola. É ainda outro aspecto da divulgação um método para a irrigação de, pelo menos, uma porção do aparelho urinário, de modo a prevenir uma infecção crónica do aparelho urinário, compreendendo a etapa de distribuição de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo PEG a uma uretra, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons. Numa forma de realização, a composição é administrada a uma porção do aparelho urinário que inclui, pelo menos, a bexiga. É outro aspecto da divulgação um método de prevenção de uma doença sexualmente transmitida, compreendendo a etapa de aplicação de um polietilenoglicol (PEG) a um preservativo, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons. É um aspecto relacionado da invenção um preservativo compreendendo, pelo menos, um revestimento parcial com PEG tendo um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons. É ainda outro aspecto relacionado um kit compreendendo um preservativo e polietilenoglicol (PEG) tendo um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons. A divulgação também compreende um método de prevenção de um distúrbio do aparelho digestivo, compreendendo a administração de uma dose eficaz de uma composição compreendendo 15 polietilenoglicol (PEG) a um animal que dela necessita, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons. Os distúrbios do aparelho digestivo exemplificativos receptivos aos métodos preventivos da invenção podem ser seleccionados do grupo consistindo em enterocolite necrosante neonatal, diarreia induzida por antibiótico, colite pseudomembranosa, uma doença inflamatória intestinal, doença do intestino irritável, enterocolite neutropénica, pancreatite, sindrome de disbiose e colite microscópica. É outro aspecto da divulgação um método para monitorização da administração de polietilenoglicol (PEG) a um animal que dele necessita, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo PEG marcado, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons, a um animal que dele necessita e a detecção do PEG marcado, pelo que a quantidade e/ou localização do PEG marcado (e. g., associado com um micróbio) proporciona informação útil na avaliação da eficácia de administração. Numa forma de realização do método de monitorização, o marcador é um fluoróforo (e. g. , fluoresceina, rodamina, Cy3, Cy5). Noutra forma de realização do método, a detecção do PEG marcado compreende inspecção endoscópica. O método de monitorização também contempla que o PEG marcado é detectado numa amostra de fezes (i. e., o PEG marcado associa-se a um componente, tal como um micróbio, cuja fonte é uma amostra de fezes). Além disso, o método de monitorização pode compreender, adicionalmente, a administração de um segundo marcador específico para um micróbio e a detecção do segundo marcador. "Específico", como utilizado neste contexto, significa que o marcador é, de um modo detectável, associável com, pelo menos, um micróbio. 16 É outro aspecto da divulgação um método para monitorização da administração de polietilenoglicol (PEG) a um animal gue dele necessita, compreendendo a obtenção de uma amostra de um animal recebendo polietilenoglicol, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons, a colocação da amostra em contacto com uma célula epitelial e a medição da aderência de um micróbio na amostra à célula epitelial, pelo que a quantidade e/ou localização do PEG proporciona informação útil na avaliação da eficácia de administração. A medição pode ser alcançada por examinação microscópica. É outro método de monitorização, de acordo com a divulgação, um método para monitorização da administração de polietilenoglicol (PEG) a um animal que dele necessita, compreendendo a obtenção de uma amostra de um animal recebendo polietilenoglicol, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons, a colocação da camada celular epitelial em contacto com a amostra e a medição de uma resistência eléctrica transepitelial da camada epitelial, pelo que a administração eficaz é indicada por uma reduzida diminuição na resistência eléctrica transepitelial em relação a um valor de controlo. O valor de controlo pode ser interno (i. e., medição da TEER antes da administração de PEG) ou externo (i. e., um valor desenvolvido em outros estudos que é utilizado de modo fiável para comparação). É ainda outro método de monitorização da divulgação um método para monitorização da administração de polietilenoglicol (PEG) a um animal que dele necessita, compreendendo a obtenção de uma amostra de um animal recebendo polietilenoglicol, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons, o isolamento de um micróbio da amostra e a medição da 17 hidrofobicidade da superfície celular do micróbio, pelo que a hidrofobicidade de qualquer micróbio na amostra proporciona informação útil na avaliação da eficácia de administração. "Isolamento", como utilizado neste contexto, significa suficientemente separado de outros componentes da amostra (e. g., matéria sólida) para permitir medições de hidrofobicidade, como seria compreendido na técnica. É um aspecto relacionado da divulgação um kit para monitorização da administração de polietilenoglicol, compreendendo um PEG marcado e um protocolo descrevendo a utilização do PEG marcado na monitorização da sua administração. Os protocolos adequados incluem quaisquer dos métodos aqui divulgados ou conhecidos na técnica, referentes à administração, distribuição ou aplicação de PEG. Em algumas formas de realização deste aspecto da invenção, o kit compreende, adicionalmente, um marcador livre. É ainda outro método de monitorização da divulgação um método para monitorização da administração de polietilenoglicol (PEG) a um animal que dele necessita, compreendendo a obtenção de uma amostra de um animal recebendo polietilenoglicol, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 5000 daltons e a detecção de actividade de lectina PA-I/adesina na amostra, pelo que a actividade de lectina PA-I/adesina proporciona informação útil na avaliação da eficácia de administração. Numa forma de realização deste método, a lectina PA-I/adesina é detectada através da ligação a um parceiro de ligação de lectina PA-I/adesina, tal como qualquer forma conhecida de um anticorpo anti-lectina PA-I/adesina específico ou um hidrato de carbono ao qual a lectina/adesina se liga especificamente. É um aspecto relacionado da invenção um kit para monitorização da 18 administração de polietilenoglicol (PEG) , compreendendo um parceiro de ligação de lectina PA-I/adesina e um protocolo descrevendo a utilização do parceiro de ligação, para detectar a lectina PA-I/adesina na amostra. Os protocolos adequados incluem quaisquer dos métodos aqui divulgados ou conhecidos na técnica, referentes à utilização de PEG.
Outras características e vantagens da presente divulgação serão mais bem compreendidas por referência à seguinte descrição detalhada, incluindo os desenhos e os exemplos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 proporciona taxas de mortalidade em murganhos às 48 horas, submetidos a laparotomia simulada ou 30% de hepatectomia cirúrgica, seguida de injecção directa de PA27853 de P. aeruginosa dentro do cécum. Os murganhos sofreram, imediatamente, uma hepatectomia de 30% do lobo esquerdo exangue, seguida de injecção cecal directa de 1 x 107 cfu/mL de PA27853. Cada grupo continha 7 murganhos. Os murganhos de controlo sofreram laparotomia simulada, seguida de injecção de quantidades iguais de PA27853 dentro do cécum. Para murganhos nos grupos de PEG, 1 x 107 cfu/mL de PA27853 foram suspensos em PEG 3.35 (PEG LMW 3350) ou PEG 15-20 (PEG HMW 15000 a 20000 daltons) antes de injecção cecal. As curvas de dose-resposta para PEG 15-20 encontram-se no painel b. a. Um efeito protector estatisticamente significativo de PEG 15-20 foi determinado pelo Teste Exacto de Fisher (P< 0,001). b. A concentração mínima protectora de PEG 15-20 foi determinada como sendo 5% (P<0,05). c. Culturas bacterianas quantitativas de conteúdo cecal (fezes) , mucosa cecal lavada, fígado e sangue, 24 horas após hepatectomia 19 cirúrgica de 30% e injecção cecal directa de 1 x 107 cfu/mL de PA27853. A ANOVA unidireccional demonstrou um aumento estatisticamente significativo nas contagens bacterianas em conteúdo cecal, mucosa, fígado e sangue em murganhos após hepatectomia (P<0,001). Foi observada uma diminuição significativa (P<0,05) nas contagens bacterianas de fígado e sangue para PEG 3350, enquanto o PEG 15-20 preveniu completamente ο PA27853 de se disseminar no fígado e sangue de murganhos. A Figura 2 mostra o efeito protector de PEG 15-20 contra a disfunção da barreira epitelial induzida por PA27853, como avaliada por resistência eléctrica transepitelial (TEER). a. Os dados representam a média ± SEM da queda máxima percentual na TEER desde a linha de base de culturas em triplicado (n=7) observada durante 8 horas de exposição apical a 1 x 107 cfu/mL de PA27853. Foi demonstrada uma diminuição estatisticamente significativa na TEER (ANOVA unidireccional (P<0,001)) em células Caco-2 expostas a PA27853. Foi demonstrado um efeito protector estatisticamente significativo na queda em TEER induzida por PA27853 para PEG 15-20 (P<0,001) . b. Imagem de células Caco-2 na presença de PEG 3.35 e exposição apical a PA27853. As imagens tiradas após 4 horas de co-cultura demonstraram perda de integridade de monocamada, com as células a flutuarem 30-40 mícrones acima das estruturas celulares, exibindo aderência de PA27853 a membranas celulares, c. As células Caco-2 apicalmente expostas a PA27853, após 4 horas na presença de PEG 15-20, não mostraram evidência de células a flutuarem em qualquer dos planos examinados.
A Figura 3 ilustra o efeito inibitório de PEG na expressão de PA-I em PA27853. a. Análise de transferência Western. A 20 exposição de PA27853 a 1 mM da molécula de sinalização de detecção de quórum C4-HSL resultou num aumento estatisticamente significativo (P<0,001, ANOVA com um factor) na expressão de proteína PA-I que foi parcialmente inibida na presença de PEG 3.35 a 10% e muito mais inibida com PEG 15-20 a 10%. a' . A concentração mínima inibitória de PEG 15-20 na expressão de PA-I induzida por C4-HSL foi 5% (P<0,01). b. A microscopia electrónica de células bacterianas individuais expostas a C4-HSL, na presença e ausência de PEG, demonstrou que o C4-HSL causou uma alteração morfológica na forma e expressão de pili de P. aeruginosa. O efeito morfológico induzido por C4-HSL foi completamente eliminado na presença de PEG 15-20, mas não PEG 3.35. Um efeito do tipo halo pode ser verificado rodeando PA27853 exposta a PEG 15-20. c. Hibridação Northern. A exposição de PA27853 a 0,1 mM de C4-HSL resultou num aumento estatisticamente significativo (P<0,001, ANOVA com um factor) na expressão de ARNm de PA-I que foi grandemente inibida com PEG 15-20 a 10%. d. O aumento no ARNm de PA-I induzido por exposição de 4 horas a células Caco-2 foi inibido na presença de PEG 15-20, mas não PEG 3.35 (P<0,001, ANOVA com um factor). A Figura 4 mostra o efeito de soluções de PEG na integridade de membrana bacteriana e padrões de crescimento de PA27853. a. O efeito das duas soluções de PEG na integridade de membrana bacteriana foi avaliado por um método de coloração consistindo em SYTO 9 e iodeto de propídio. Nenhuma solução de PEG teve qualquer efeito na permeabilidade de membrana bacteriana. b. Os padrões de crescimento de PA27853 pareceram idênticos nas duas soluções de PEG em relação ao meio TSB isento de PEG (controlo). 21 A Figura 5 apresenta imagens de Microscopia de Força Atómica (AFM) de células Caco-2 e células bacterianas expostas aos PEG. a-c. Imagens de AFM de células Caco-2 na presença de meio isoladamente (a), meio com PEG 3.35 (b) e meio com PEG 15- 20. Verificou-se que o PEG 3.35 forma um tapete liso sobre as células Caco-2 (b), ao passo que o PEG 15-20 formou uma cobertura mais topograficamente definida (c) . d-f. Imagens de AFM de PA27853 em PEG 3.35 e PEG 15-20. O PEG 3.35 formou um envelope liso em torno de células bacterianas individuais (e) , ao passo que o PEG 15-20 não apenas se cingiu compactamente às células individuais (f), mas também aumentou o diâmetro polimérico/bacteriano (g,h) distanciando, desse modo, bactérias individuais umas das outras. A Figura 6 mostra o efeito da solução PEG no padrão de dispersão/aglutinação de PA27853. O padrão de dispersão das células bacterianas em placas dTC3 foi observado directamente com um microscópio invertido de fluorescência Axiovert 100 TV, utilizando filtros de fluorescência de DIC e GFP, a uma ampliação de objectiva de 63 X. A temperatura foi ajustada com um sistema de controlo de temperatura de termostato Bioptechs. Foram utilizadas lâmpadas de tungsténio (100 V) para a excitação de DIC e GFP. O software de imagiologia 3D (Slidebook), da Intelligent Imaging Innovations, foi utilizado para imagiar o padrão de dispersão de célula bacteriana no plano Z utilizando o filtro de GFP. As células de P. aeruginosa planctónicas uniformemente dispersas no meio sem células Caco- -2 foram observadas em imagem de DIC (6ai) e reconstrução de plano Z (6a2) · Na presença de células Caco-2, as células bacterianas desenvolveram uma aparência aglutinada (6b!) e verificaram-se aderentes às células Caco-2 (6b2) . O PEG 3350 a 10% diminuiu a motilidade de bactérias e induziu a formação 22 imediata de microcolónias bacterianas em forma de cogumelo (6ci) aderindo ao fundo do poço (6c2) . Na presença de células Caco-2, as microcolónias bacterianas estavam na ordem de 8 mícrones acima do plano das células epiteliais (6di,2) · 0 PEG 15-20 a 10% diminuiu grandemente a motilidade de células de P. aeruginosa. Não obstante, durante as primeiras 0,5-1 horas de incubação em meio contendo PEG 15-20, as células bacterianas formaram microcolónias em forma de aranha que estavam próximo do fundo do poço (6ei,2). No espaço de várias horas, as microcolónias em forma de perna de aranha ocuparam todo o espaço/volume do meio (não mostrado) . Na presença de células Caco-2, as células de P. aeruginosa perderam a configuração semelhante a aranha e verificaram-se elevadas muito acima do plano do epitélio (30-40 mícrones) (6fi,2) .
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é definida nas reivindicações anexas. A invenção proporciona produtos que, colectivamente, apresentam abordagens simples e económicas ao tratamento e/ou prevenção de uma variedade de distúrbios epiteliais mediados por micróbios, i. e., estados anómalos e doenças que afligem muitos mamíferos, incluindo humanos. Através da administração de polietilenoglicol HMW a um animal necessitado, incluindo aqueles em risco, qualquer de um número de estados anómalos que ameaçam a saúde ou a vida, i. e., distúrbios e doenças epiteliais, incluindo septicemia de origem intestinal, podem ser tratados com custo mínimo e treino mínimo dos médicos. Sem se desejar o vínculo a uma teoria, os benefícios proporcionados pela invenção são consistentes com o princípio de que o distúrbio epitelial mediado por micróbios pode ser prevenido, melhorado ou tratado 23 com sucesso através da facilitação de um ambiente conducente à sobrevivência desses micróbios. Uma compreensão da descrição mais detalhada da invenção que se segue é facilitada através do estabelecimento inicial dos seguintes significados para termos utilizados nesta divulgação.
Um "estado anormal" é, de um modo amplo, definido de molde a incluir doenças mamíferas, distúrbios mamíferos e qualquer estado anormal de saúde mamífera que seja caracterizado por uma superfície epitelial em risco de desenvolver um distúrbio de mediação microbiana. Os estados anómalos caracterizados por uma superfície epitelial em risco de desenvolver um distúrbio de mediação microbiana incluem estados nos quais a superfície epitelial desenvolveu um distúrbio de mediação microbiana. Os estados exemplificativos incluem doenças humanas e distúrbios humanos requerendo ou resultando de intervenção médica, tal como uma lesão de queimadura, enterocolite neonatal, neutropenia grave, doença inflamatória intestinal, enteropatia (e. g., dos doentes em estado crítico) e rejeição de transplante (e. g., órgão) . "Lesão de queimadura" significa lesão a tecido mamífero resultante de exposição do tecido ao calor, por exemplo, na forma de uma chama aberta, vapor, fluido quente e uma superfície quente. À neutropenia "grave" é dado o seu significado comum e habitual de uma diminuição marcada no número de neutrófilos em circulação. "Rejeição de transplante" refere-se a qualquer desenvolvimento de material transplantado (e. g., um órgão) reconhecido como estando associado à rejeição derradeira desse material pelo organismo hospedeiro. A "administração" é dado o seu significado comum e habitual de distribuição por qualquer meio adequado reconhecido na técnica. As formas de administração exemplificativas incluem distribuição oral, distribuição anal, punção ou injecção directa, aplicação tópica e spray (e. g., spray nebulizador), aplicação de gel ou fluido a um olho, ouvido, nariz, boca, ânus ou abertura uretral.
Uma "dose eficaz" é aquela quantidade de uma substância que proporciona um efeito benéfico no organismo recebendo a dose e pode variar, dependendo do objectivo de administração da dose, do tamanho e estado do organismo recebendo a dose e outras variáveis reconhecidas na técnica como relevantes para uma determinação de uma dose eficaz. 0 processo de determinação de uma dose eficaz envolve processos de optimização de rotina que estão dentro da especialidade na técnica. A um "animal" é dado o seu significado convencional de um ser vivo não vegetal, não protista. Um animal preferido é um mamífero, tal como um humano.
No contexto da presente divulgação, uma "necessidade" é um organismo, órgão, tecido ou estado celular que poderia beneficiar da administração de uma dose eficaz a um organismo caracterizado por esse estado. Por exemplo, um humano em risco de desenvolver septicemia de origem intestinal ou apresentar um seu sintoma, é um organismo a necessitar de uma dose eficaz de um produto, tal como uma composição farmacêutica, de acordo com a presente invenção. 25 A "peso molecular médio" é dado o seu significado comum e habitual da média aritmética dos pesos moleculares dos componentes (e. g., moléculas) de uma composição, independentemente da exactidão da determinação dessa média. Por exemplo, polietilenoglicol ou PEG, tendo um peso molecular médio de 3,5 quilodaltons pode conter moléculas de PEG de peso molecular variável, desde que a média aritmética desses pesos moleculares seja determinada como sendo 3,5 quilodaltons com algum nível de exactidão que reflicta uma estimativa da média aritmética, como seria compreendido na técnica. De modo análogo, PEG 15-20, significa PEG cujos pesos moleculares produzem uma média aritmética entre 15 e 20 quilodaltons, com essa média aritmética submetida às advertências notadas acima. Estas moléculas de PEG incluem mas não estão limitadas a polímeros de PEG simples. Por exemplo, uma pluralidade de moléculas de PEG relativamente mais pequenas (e. g., 7000 a 10000 daltons) pode ser unida, opcionalmente com uma molécula ligante, tal como um fenol, numa única molécula tendo um peso molecular médio mais elevado (e. g., 15000 a 20000 daltons). "Integridade de membrana celular" significa a ausência relativa de modificações funcionalmente significativas de uma membrana celular como um componente funcional de uma célula viva, como seria compreendido na técnica. A "alterado de um modo detectável" é dado o seu significado comum e habitual de uma alteração que é perceptível utilizando meios adequados sob as circunstâncias, como seria compreendido na técnica. "Padrão de crescimento" refere-se, colectivamente, aos valores das propriedades de uma célula ou grupo de células 26 (e. g., uma população de células), que são reconhecidos na técnica como caracterizando o crescimento celular, tais como a geração ou tempo de duplicação da célula, o surgimento de topografia de um grupo de células nascentes e outras variáveis reconhecidas na técnica como contribuindo para uma compreensão do padrão de crescimento de uma célula ou grupo de células. A "inibição" é dado o seu significado comum e habitual de inibição com redução ou prevenção. Por exemplo, inibição de alteração morfológica significa que a alteração morfológica é tornada mais difícil ou inteiramente prevenida. A expressão de "PA-I ou lectina PA-I/adesina" significa a produção ou geração de uma actividade característica de lectina PA-I/adesina. Tipicamente, a expressão de lectina PA-I/adesina envolve a tradução de um ARNm de lectina PA-I/adesina para produzir um polipéptido de lectina PA-I/adesina tendo, pelo menos, uma actividade característica de lectina PA-I/adesina. Opcionalmente, lectina PA-I/adesina inclui, adicionalmente, a transcrição de um ADN de lectina PA-I/adesina para produzir o ARNm acima mencionado. "Activação induzida por epitélio" refere-se a um aumento na actividade de um dado alvo (e. g., lectina PA-I/adesina) através da influência directa ou indirecta de uma célula epitelial. No contexto da presente invenção, por exemplo, a activação induzida por epitélio de lectina PA-I/adesina refere-se a um aumento na actividade desse polipéptido, atribuível à influência indirecta de um epitélio manifestada através do contacto directo de uma célula ou células epiteliais com um patógeno intestinal. 27 A "alteração morfológica" é dado o seu significado comum e habitual de uma alteração na forma. "Patógeno intestinal" significa um micróbio patogénico capaz de causar, no todo ou em parte, septicemia de origem intestinal num animal, tal como um humano. Estão englobados por esta definição os patógenos intestinais conhecidos na técnica, incluindo bacilos gram-negativos, tal como os Pseudomonados (e. g., Pseudomonas aeruginosa). "Melhoramento" significa redução do grau de gravidade, consistente com o seu significado comum e habitual. "Quórum patogénico" significa agregação ou associação de um número suficiente de organismos patogénicos (e. g., P. aeruginosa) para iniciar ou manter um sinal de detecção de quórum, como seria conhecido na técnica. A "interacção" é dado o seu significado comum e habitual de efeito recíproco, como no efeito recíproco entre ou no meio de dois ou mais produtos biológicos, tais como moléculas, células e semelhantes. A "Resistência Eléctrica Transepitelial" ou TEER, é dado o significado que esta expressão adquiriu na técnica, que se refere a uma medição da resistência eléctrica através de tecido epitelial, que é útil de num modo não exclusivo na avaliação do estatuto de junções compactas entre células epiteliais num tecido epitelial. A "aderência" é dado o seu significado comum e habitual de associação física para além de um período de tempo transiente. 28 "Topograficamente assimétrico" refere-se a uma imagem, mapa ou outra representação da superfície de um objecto tridimensional (e. g., uma célula) que não é simétrico. "Microscopia de força atómica", também conhecida por microscopia de força de varrimento, é uma técnica para adquirir um mapa topográfico de alta resolução de uma substância através da disposição de uma sonda em consola transversal à superfície de uma amostra num rastreio por varrimento e utilizando meios altamente sensíveis para detecção de deflexões da sonda, como seria compreendido na técnica. "Composição farmacêutica" significa uma formulação de compostos adequados para administração terapêutica a um animal vivo, tal como um doente humano. As composições farmacêuticas preferidas, de acordo com a invenção, compreendem uma solução equilibrada em viscosidade, perfil de electrólito e osmolalidade, compreendendo um electrólito, L-glutamina revestida com dextrano, inulina revestida com dextrano, lactulase, D-galactose, N-acetil-D-galactosamina e PEG a 5-20% (15000-20000). A "Adjuvantes", "veículos" ou "diluentes" são a todos dados os significados que esses termos adquiriram na técnica. Um adjuvante é uma ou mais substâncias que servem para prolongar a imunogenicidade de um imunogénio co-administrado. Um veículo é uma ou mais substâncias que facilitam a manipulação, tal como por translocação, de uma substância a ser transportada. Um diluente é uma ou mais substâncias que reduzem a concentração ou diluem uma determinada substância exposta ao diluente. 29 "PEG HMW" refere-se a PEG de peso molecular relativamente elevado definido como tendo um peso molecular médio superior a 3,5 quilodaltons. De um modo preferido, o PEG HMW tem um peso molecular médio superior a 5 quilodaltons e, em particulares formas de realização, o PEG HMW tem um peso molecular médio de, pelo menos, 8 quilodaltons, pelo menos, 15 quilodaltons e entre 15 e 20 quilodaltons.
Os exemplos seguintes ilustram aspectos da divulgação. O Exemplo 1 descreve a protecção contra septicemia de origem intestinal proporcionada a murganhos hepatectomizados por PEG de elevado peso molecular. O Exemplo 2 divulga como o PEG HMW previne a aderência de patógenos a células epiteliais intestinais. O Exemplo 3 revela como o PEG HMW inibe a expressão de virulência patogénica em geral e a expressão de lectina PA-I/adesina especificamente. O Exemplo 4 mostra que o PEG não afecta o crescimento ou integridade da membrana celular de patógenos. O Exemplo 5 ilustra a conformação topográfica única de patógenos revestidos com PEG HMW utilizando Microscopia de força atómica. O Exemplo 6 descreve as interacções célula-célula afectadas por PEG HMW. O Exemplo 7 descreve métodos preventivos utilizando as composições da invenção. O Exemplo 8 (de referência) divulga métodos para monitorização da administração de PEG HMW, tal como nos métodos de tratamento da divulgação e kits correspondentes. 30 EXEMPLO 1 O PEG HMW protege contra septicemia de origem intestinal após hepatectomia de 30%
Os murganhos Balb/c macho foram anestesiados e submetidos a hepatectomia utilizando um protocolo convencional. Foi realizada uma excisão exangue de 30% do fígado ao longo do lobo esquerdo mole. Os murganhos de controlo sofreram manipulação do fígado sem hepatectomia. Os grupos de controlo e experimental continham, cada, sete murganhos. Em todos os murganhos, um volume de 200 pL de 107 cfu/mL de PA27853 de Pseudomonas aeruginosa foi injectado dentro do ceco por punção directa com agulha diluída em solução salina, PEG 3.350 ou PEG 15-20 (PEG). Os PEG de peso molecular relativamente baixo estão comercialmente disponíveis; o PEG 15-20, tendo um peso molecular médio de 15000 a 20000 daltons, é uma combinação de PEG 7-8 e PEG 8-10 covalentemente unidos a um anel de fenol. O PEG 7-8 tem um peso molecular médio de 7000 a 8000 daltons e o PEG 8-10 tem um peso molecular médio de 8000 a 10000 daltons. Um especialista na técnica compreenderá que os PEG HMW incluem compostos tendo qualquer de uma variedade de subunidades de PEG, com cada subunidade tendo qualquer de uma variedade de pesos moleculares médios unidos, de um modo preferido, covalentemente entre si, ou a uma ou mais moléculas ligantes, que são moléculas relativamente pequenas tendo grupos funcionais adequados para unir as moléculas de PEG. Os ligantes adequados preservam substancialmente a actividade biológica de PEG HMW (preservação de actividade biológica suficiente para realizar um efeito profiláctico ou terapêutico benéfico, como aqui divulgado). 31
De modo a proporcionar uma fonte de PEG constante, para a duração de 48 horas da experiência, a agulha foi dirigida para dentro do intestino delgado (íleo) e 1 mL de solução salina, PEG 3.35 ou PEG 15-20 foi injectado de modo retrógrado dentro do intestino proximal. O local de punção foi atado com uma sutura de seda e o ceco limpo com álcool. Os murganhos foram devolvidos às suas gaiolas e, durante as 48 horas seguintes, receberam apenas H2O.
As curvas de dose-resposta para PEG 15-20 encontram-se no painel b da Fig. 1. a. Um efeito protector estatisticamente significativo de PEG 15-20 foi determinado pelo Teste Exacto de Fisher (P< 0,001). b. A concentração mínima protectora de PEG 15-20 foi determinada como sendo 5% (P<0,05). c. Culturas bacterianas quantitativas de conteúdo cecal (fezes), mucosa cecal lavada, fígado e sangue, 24 horas após hepatectomia cirúrgica de 30% e injecção cecal directa de 1 x 107 cfu/mL de PA27853. A ANOVA com um factor demonstrou um aumento estatisticamente significativo nas contagens bacterianas em conteúdo cecal, mucosa, fígado e sangue em murganhos após hepatectomia (P<0,001). Foi observada uma diminuição significativa (P<0,05) nas contagens bacterianas de figado e sangue para PEG 3350, enquanto o PEG 15-20 preveniu completamente ο PA27853 de se disseminar no fígado e sangue de murganhos. A estirpe ATCC 27853 (PA27853) de Pseudomonas aeruginosa é um isolado clínico não mucóide de uma cultura de sangue. A injecção cecal directa da estirpe PA27853 em murganhos anteriormente submetidos a hepatectomia cirúrgica exangue de 30% resultou num estado de septicemia clínica e sem sobreviventes às 48 horas. Os murganhos submetidos a laparotomia simulada, sem 32 hepatectomia (controlos), que são injectados, de modo semelhante, com P. aeruginosa, sobrevivem completamente sem quaisquer sinais clínicos de septicemia (Fig. la) . Para determinar a capacidade de as soluções de PEG prevenirem ou diminuírem a mortalidade neste modelo, 200 pL de PA27853, a uma concentração de 1 X 107 cfu/mL, foram suspensos numa de duas soluções a 10% (p/v) de polietilenoglicol (PEG-3.35 versus PEG-15-20). O PEG-3.35 foi escolhido por representar o peso molecular de PEG que têm estado disponíveis para utilização clínica durante os últimos 25 anos (Golytely®) . Em comparação, as soluções de PEG de acordo com a invenção que foram utilizadas tinham pesos moleculares variando entre 15-20 kDa. As estirpes suspensas foram introduzidas no ceco por punção directa. O PEG 3.35 não teve efeito na mortalidade em murganhos após hepatectomia, ao passo que o PEG 15-20 foi completamente protector. De facto, o PEG 15-20 teve um efeito protector estatisticamente significativo, como determinado pelo Teste Exacto de Fisher (P< 0,001). As experiências de dose-resposta demonstraram que uma solução a 5% é a concentração mínima de PEG 15-20 que era completamente protectora (P<0,05; ver a Fig. lb) , embora um especialista na técnica reconhecesse que seria de esperar que soluções de PEG HMW inferiores a 5% proporcionem alguma protecção e, deste modo, encontram-se abrangidas pelo âmbito da presente invenção. Com respeito a contagens bacterianas nos murganhos experimentais e de controlo, uma análise de variância com um factor (ANOVA) demonstrou um aumento estatisticamente significativo nas contagens bacterianas em conteúdo cecal, mucosa, fígado e sangue em murganhos após hepatectomia (P<0,001). Foi observada uma diminuição significativa (P<0,05) nas contagens bacterianas de fígado e sangue para PEG 3350, enquanto o PEG 15-20 preveniu completamente ο PA27853 de se disseminar no fígado e sangue de 33 murganhos. 0 PEG 15-20 inibiu completamente a disseminação de PA27853 intestinal no fígado e corrente sanguínea (Fig. lc). Os dados indicam que a acção de soluções de PEG envolve mecanismos que são não microbicidas. Administradas a concentrações de PEG não tóxicas a células mamíferas (i. e., < cerca de 10%), não pode ser demonstrado efeito nos padrões de crescimento bacteriano. O exemplo demonstra que o PEG HMW reduz a taxa de mortalidade atribuível a septicemia de origem intestinal em murganhos submetidos a intervenção cirúrgica na forma de uma hepatectomia parcial. Este modelo de murganho indica que a terapia de PEG HMW é útil na redução da taxa de mortalidade de uma espécie animal (i. e., redução da probabilidade de mortalidade em qualquer organismo), tal como um mamífero como o homem, submetido a stress fisiológico, tal como cirurgia invasiva (e. g., hepatectomia parcial). Espera-se que a terapia de PEG HMW seja eficaz na prevenção da morte ou enfermidade séria associada a septicemia, quando implementada após o stress fisiológico (e. g., durante cuidado pós-operatório). Adicionalmente, a terapia de PEG HMW pode ser utilizada antes do stress fisiológico (e. g., cuidado pré-operatório), sob circunstâncias onde a introdução do stress seja previsível, para diminuir o risco de enfermidade séria ou morte. A terapia de PEG HMW também é útil no melhoramento de um sintoma associado a uma doença ou estado anormal associado a septicemia de origem intestinal. 34 EXEMPLO 2 O PEG HMW previne a aderência de patógenos a epitélios intestinais
As junções compactas são elementos dinâmicos do citoesqueleto celular epitelial que desempenham um papel chave na função de barreira do tracto intestinal mamífero. A P. aeruginosa resulta numa alteração profunda na permeabilidade de junção compacta, como medida pela resistência eléctrica transepitelial (TEER) de células Caco-2 e células T-84. As células Caco-2 são células epiteliais de cólon humano bem caracterizadas que mantêm uma TEER estável em cultura e esta linha celular proporciona um reconhecido modelo in vitro do comportamento in vivo dos patóqenos intestinais. Para determinar 0 efeito protector de PEG nas diminuições induzidas por PA27853 de P. aeruginosa em TEER de monocamadas de Caco-2 cultivadas, 1 X 107 cfu/mL de PA27853 foram inoculados de forma apical em duas monocamadas de células Caco-2 na presença de PEG 3.35 a 10% ou PEG 15-20 a 10%. A TEER foi serialmente medida, durante 8 horas e a queda máxima em TEER registada.
Apenas o PEG 15-20 protegeu significativamente contra a diminuição na TEER induzida por P. aeruginosa (Fig 2a). Os dados apresentados na Fig. 2 representam a média ± SEM da queda máxima percentual na TEER desde a linha de base de culturas em triplicado (n=7) observada durante 8 horas de exposição apical a 1 x 107 cfu/mL de PA27853. Uma diminuição estatisticamente significativa na TEER, como demonstrada em células Caco-2 expostas a PA27853, foi revelada por ANOVA com um factor (P<0,001)). Foi demonstrado um efeito protector estatisticamente significativo na queda em TEER induzida 35 por PA27853 para PEG 15-20 (P<0,001). A Fig. 2b mostra células Caco-2 na presença de PEG 3.35 e com exposição apical a PA27853. Após 4 horas de co-cultura na presença de PEG 3.35, foi observada disrupção das monocamadas de células Caco-2 exibindo bactérias focalmente aderentes, com células flutuando 30-40 micrones acima dos esqueletos das monocamadas (Fig 2b). Em contraste, a Fig. 2c, mostrando imagens de células Caco-2 apicalmente expostas, durante 4 horas, a PA27853 na presença de PEG 15-20, não mostra evidência de células a flutuarem em qualquer dos planos examinados. O efeito protector de PEG 15-20 na integridade de células Caco-2 estava associado a menos aderência bacteriana, reflectido por uma recuperação 15 vezes superior de bactérias nos sobrenadantes celulares, após uma exposição de 4 horas a 1 X 106 cfu/mL de PA27853. A resistência de células epiteliais intestinais humanas cultivadas com PEG aos efeitos de disrupção de barreira de P. aeruginosa, como avaliada pela manutenção da TEER, oferece uma abordagem prática para a estabilização da função de barreira de junção compacta perante uma provocação de patógenos invasores. A evidência adicional do valor terapêutico de PEG 15-20 é que a função de transporte epitelial (permuta de Na+/H+, transporte de glucose) não é afectada por este composto.
Deste modo, o PEG HMW é relativamente inerte e tem um efeito estabilizante na barreira epitelial intestinal. A divulgação compreende métodos de tratamento de anormalidades de barreira intestinal associadas a patógenos intestinais, tal como P. aeruginosa, através da administração de PEG HMW a um animal, tal como um mamífero e, de um modo preferido, um humano. Uma anormalidade de barreira intestinal pode ser revelada por qualquer técnica de diagnóstico ou outro meio, conhecida na 36 técnica. Contudo, antes do tratamento com PEG HMW, não é necessário identificar uma anormalidade de barreira intestinal. 0 baixo custo e elevado grau de segurança associados ao tratamento com PEG HMW tornam esta abordagem adequada para aplicações profilácticas, de um modo preferido, dirigidas para organismos em risco, assim como tratamentos aplicados a animais exibindo, pelo menos, um sintoma caracteristico de uma anormalidade de barreira intestinal. Os tratamentos com PEG HMW melhorariam um sintoma associado a uma anormalidade de barreira intestinal; de um modo preferido, os tratamentos reduziriam ou eliminariam os efeitos da septicemia de origem intestinal de um organismo tratado. EXEMPLO 3 O PEG HMW inibe a expressão de virulência em patógenos A expressão de lectina PA-I/adesina em PA27853 de P. aeruginosa foi aumentada no ceco de murganhos após hepatectomia e desempenhou um papel chave no efeito letal de P. aeruginosa no intestino do murganho. 0 PA-I funciona como um determinante de virulência significativo no intestino de murganho, através da facilitação da aderência de PA27853 ao epitélio, assim como através da criação de um significativo defeito de barreira às citotoxinas, exotoxina A e elastase. A expressão de PA-I em P. aeruginosa é regulada pelo regulador RhIR transcricional e seu activador C4-HSL correlacionado. A expressão de PA-I em PA27853 foi, não apenas aumentada por exposição a C4-HSL, mas também por contacto com células Caco-2, preparações de membranas de células Caco-2 e sobrenadantes de culturas de células Caco-2. 37 A hibridação Northern foi utilizada para analisar a expressão de PA-I ao nível transcricional. 0 ARN total de P. aeruginosa foi isolado pelo método de três detergentes modificado. As sondas foram geradas por PCR utilizando os iniciadores de PA-I: F(ACCCTGGACATTATTGGGTG) (SEQ ID N° 1), R(CGATGTCATTACCATCG-TCG) (SEQ ID N° 2) e iniciadores de 16S: F(GGACGGGTGAGTAATGCCTA) (SEQ ID N° 3), R(CGTAAGGGCCATGATGACTT) (SEQ ID N° 4) e clonadas dentro do vector pCR2.1 (Invitrogen, Inc.). Os insertos eram sequências que correspondiam à sequência de PA-I ou 16S. As sondas específicas de ADNc para PA-I e 16S foram marcadas radioactivamente com a32P-dCTP. A radioactividade específica foi medida por um fosforoimageador Storm 860 (Molecular Dynamics, CA) e as alterações percentuais relativas comparadas com o controlo foram calculadas com base na razão de intensidade de PA-I e 16S. A transferência Western foi utilizada para análise de proteína de PA-I, utilizando anticorpos anti-PA-I policlonais de coelho purificados por afinidade. Um mL de células de P. aeruginosa foi lavado com PBS e aquecido a 100 °C em tampão de lise (SDS a 4%, Tris-HCl a 50 mM, pH 6,8); a análise de imunotransferência foi realizada por electrotransferência de proteínas após SDS-PAGE de Tricina. A lectina PA-I foi detectada pelo reagente ECL (Amersham, NJ). A exposição de PA27853 de P. aeruginosa a 1 mM da molécula de sinalização de detecção de quórum C4-HSL resultou num aumento estatisticamente significativo (P<0,001, ANOVA com um factor), na expressão de proteína PA-I que foi parcialmente inibida na presença de PEG 3.35 a 10% e inibida numa extensão muito superior por PEG 15-20 a 10% (Fig. 3) . A concentração completamente inibitória mínima de PEG 15-20 na expressão de PA-I induzida por C4-HSL foi 5% (P<0, 01, ANOVA com 38 um factor). A examinação de microscopia electrónica de células bacterianas individuais expostas a C4-HSL, na presença e ausência de PEG, demonstrou que o C4-HSL causou uma alteração morfológica na forma e expressão de pili de P. aeruginosa (Fig. 3b) . 0 efeito morfológico induzido por C4-HSL foi completamente eliminado na presença de PEG 15-20, mas não completamente eliminado na presença de PEG 3.35. Um efeito do tipo halo foi verificado rodeando PA27853 exposta a PEG 15-20 (Fig. 3b). A exposição de PA27853 a 0,1 mM de C4-HSL resultou num aumento estatisticamente significativo (P<0,001, ANOVA unidireccional) na expressão de ARNm de PA-I utilizando transferências Northern. A expressão de PA-I foi grandemente inibida por PEG 15-20 a 10%. A Fig. 3d mostra que o aumento no ARNm de PA-I induzido por uma exposição de 4 horas a células Caco-2 foi inibido por PEG 15-20, mas não por PEG 3.35 (P<0,001, ANOVA com um factor).
Os dados aqui apresentados mostram que foi observada uma atenuação significativa (diminuição de 3-4 vezes) da expressão de PA-I (proteína e ARNm) em PA27853, induzida por 100 μΜ-l mM de C4-HSL, quando as bactérias foram pré-tratadas com PEG 15-20 a 10%. Este efeito não foi observado com PEG 3.35 (Fig 3a). A atenuação da expressão de PA-I induzida por C4-HSL também foi observada para PEG 3.35 a 10%, embora o grau de atenuação fosse significativamente menor do que aquele para PEG 15-20 a 10%. A concentração mínima de PEG 15-20 que inibiu a expressão de proteína PA-I induzida por C4-HSL foi 5% (Fig 3b). A microscopia electrónica de células bacterianas individuais expostas a C4-HSL demonstrou que o C4-HSL causou uma alteração morfológica na forma e expressão de pili de PA27853 (Fig 3b). O efeito morfológico induzido por C4-HSL foi completamente eliminado na presença de PEG 15-20, mas não PEG 3.35 (Fig 3b). A expressão de 39 PA-I (ARNm), induzida por exposição de 4 horas a células Caco-2, foi inibida na presença de PEG 15-20, mas não PEG 3.35 (Fig 3b). O efeito protector da expressão de PA-I induzida por células Caco-2 com PEG 15-20 persistiu nas experiências de exposição de um dia para o outro. O PEG HMW também afecta a expressão de virulência de P. aeruginosa em resposta a estímulos conhecidos. A atenuação da expressão de PA-I induzida por C4-HSL em PA27853 pode ser um efeito protector muito importante de PEG 15-20, dado que a sinalização de detecção de quórum é um mecanismo bem estabelecido de expressão de virulência para este patógeno.
Espera-se que a interferência induzida por PEG 15-20 com expressão de PA-I induzida por células Caco-2 seja um aspecto importante do efeito protector de PEG 15-20. Verificou-se que o PEG 15-20 tem um efeito protector em animais hospedeiros, através da atenuação da expressão de PA-I de P. aeruginosa (PA27853) em resposta a conteúdo cecal filtrado (fezes) de murganhos após hepatectomia de 30%. Espera-se que a capacidade de o PEG 15-20 proteger P. aeruginosa de factores de hospedeiro que aumentam a sua expressão de virulência seja ainda outro mecanismo pelo qual os organismos são protegidos da septicemia de origem intestinal.
Consequentemente, a divulgação inclui materiais na forma de kits e métodos correspondentes de administrar um PEG HMW a um animal para prevenir ou tratar um estado caracterizado pela expressão de um factor ou determinante de virulência por um patógeno intestinal, tal como uma Pseudomonas. Um determinante de virulência pode contribuir para a virulência directa ou indirectamente. Um exemplo de uma contribuição indirecta é o efeito de lectina PA-I/adesina de P. aeruginosa na adesão de 40 patógeno intestinal aos epitélios intestinais e/ou a geraçao de um defeito de barreira às citotoxinas, exotoxina A e elastase. EXEMPLO 4 O PEG não afecta o crescimento celular ou a integridade da membrana celular de patógenos 0 efeito das duas soluções de PEG (PEG 3.35 e PEG 15-20) na integridade de membrana bacteriana foi avaliado por um método de coloração consistindo em SYTO 9 e iodeto de propídio. Nenhuma solução de PEG teve qualquer efeito na permeabilidade de membrana bacteriana (Fig 4a) . A integridade de membrana foi determinada utilizando um kit de viabilidade bacteriana viva/morta L-3152 (Molecular Probes). As bactérias foram quantificadas e as contagens expressas como cfu/mL, através do plaqueamento de diluições de 10 vezes de amostras retiradas em diferentes tempos de incubação. As curvas de crescimento para P. aeruginosa cultivadas, de um dia para o outro, em meios TSB contendo uma das duas soluções de PEG não demonstraram efeito inibitório por qualquer solução de PEG na quantidade bacteriana (Fig 4b) . De facto, o padrão de crescimento em cada dos meios contendo PEG era indistinguível do padrão de crescimento em meio TSB isento de PEG. A actividade de uma enzima doméstica envolvida no metabolismo de energia, lactato desidrogenase (LDH), foi medida em diversos intervalos de tempo durante as fases exponencial e estacionária de crescimento. A actividade de LDH foi medida num ensaio enzimático de ligação de diaforase, utilizando uma mistura de substrato de CytoTox 96 (Promega). A concentração de proteína foi determinada utilizando o Ensaio de Proteína BCA (Pierce). Não foi observada alteração na actividade 41 de LDH em sobrenadantes isentos de células de P. aeruginosa cultivada na presença de PEG. Os resultados desta experiência indicam que o PEG HMW tem um efeito negligenciável no padrão de crescimento bacteriano.
Os métodos aqui divulgados e produtos correspondentes (e. g., kits) proporcionam o beneficio de prevenção ou tratamento de doenças ou estados anómalos, associados a septicemia de origem intestinal, sem influenciarem significativamente a composição da flora intestinal. De modo semelhante, os métodos e produtos aqui divulgados podem ser utilizados para melhorar um sintoma associado a essas doenças ou estados anómalos, sem alteração significativa na composição microbiana do intestino. Um especialista na técnica reconhece que os métodos (e kits) que não perturbem significativamente a composição da flora intestinal são desejáveis, na medida em que não seja previsível que esses métodos conduzam a complicações secundárias para a saúde que resultam dessa perturbação. EXEMPLO 5
Microscopia de força atómica de patóqeno revestido com PEG
Alíquotas de um por cento de uma cultura de PA27853 cultivada, de um dia para o outro, foram subcultivadas em caldo tríptico de soja (TSB) , com ou sem PEG HMW a 10%, durante 4 horas, a 37 °C. Uma gota de cada subcultura foi retirada e as células de PA27853 de P. aeruginosa foram extensivamente lavadas com PBS, secas sobre mica em ar soprado, durante 10 minutos e imediatamente imagiadas. A imagiologia das bactérias secas com AFM em modo de contacto intermitente foi realizada em ar, com um 42
Microscópio de Varrimento Multimode Nanoscope IIIA (MMAFM, Digital Instruments). As células Caco-2 subconfluentes foram tratadas com PEG HMW a 10% durante 4 horas e extensivamente lavadas com PBS. A imagiologia de AFM das células foi realizada em PBS sem a utilização de um O ring. Para a microscopia electrónica, a PA27853 foi inoculada em TSB, com ou sem C4-HSL a 1 mM e PEG HMW a 10% e incubada de um dia para o outro. Uma gota de P. aeruginosa a 1% foi corada com acetato de uranilo e lavada com NaCl a 0,5 M, antes de examinação sob o microscópio electrónico. A microscopia de força atómica de células Caco-2 demonstrou uma superfície não uniforme clássica com microvilosidades em forma de orla em escova, enquanto as células Caco-2 expostas a PEG 3.35 demonstraram uma aparência planar lisa na superfície das células epiteliais (Fig. 5a, c) . O PEG 15-20 parece atapetar as células Caco-2 através do preenchimento das assimetrias ao longo de um plano topograficamente definido (Fig. 5e) , produzindo uma cobertura topograficamente definida mais complexa. Numa forma algo semelhante, as células de PA27853 expostas a PEG 3.35 demonstram um padrão de revestimento liso do polímero para células bacterianas num padrão achatado difuso (Fig 6d) , ao passo que o PEG 15-20 parece rodear e cingir as bactérias num modo circunferencial numa forma mais topograficamente assimétrica. A análise de secção transversal da medição de força atómica do diâmetro bacteriano em PEG 15-20 demonstra um aumento significativo nas bactérias/envelope de PEG dentro da solução de PEG (Fig 5e, f) . Por outras palavras, o PEG 3.35 forma um envelope liso em torno de células bacterianas individuais (Fig. 5e) , ao passo que o PEG 15-20 cinge compactamente células individuais (Fig. 5f) e aumenta o diâmetro 43 polimérico/bacteriano (Fig. 5g, 5h) distanciando, desse modo, células bacterianas individuais umas das outras.
Sem se desejar o vinculo a uma teoria, o PEG HMW pode exercer o seu efeito benéfico pelo mero distanciamento físico de P. aeruginosa para longe do epitélio intestinal. Alternativamente, o PEG HMW pode proporcionar benefícios através da prevenção da formação de um sinal de activação patogénica por detecção de quórum surgindo da interacção célula-célula das células patogénicas. De novo, sem se desejar o vínculo a uma teoria, é possível que o revestimento de superfícies biológicas com PEG HMW resulte em perda de liberdade de conformação das cadeias de PEG de revestimento e da repulsão de proteínas em aproximação. As interacções polar-polar entre PEG HMW e células Caco-2 poderia afectar a elasticidade das cadeias de PEG, constrangendo determinadas cadeias laterais de PEG HMW a uma construção molecular que repele proteína. Os dados aqui apresentados suportam a conclusão de que as células Caco-2 revestidas com PEG HMW são mais repelentes para P. aeruginosa do que células Caco-2 não revestidas, talvez devido a uma perda de "entropia conformacional", como resultado de alguma interacção dinâmica de PEG HMW com células Caco-2.
Os resultados desta experiência estabelecem que o tratamento com PEG HMW tem um efeito nas células tratadas afectando, de um modo notável, a topologia de superfície dessas células. Além disso, o efeito da exposição de PEG HMW nessas células é diferente do efeito que o PEG 3.35 tem nessas células. Embora não se deseje o vínculo a uma teoria, os resultados aqui divulgados proporcionam, de facto, uma correlação física para o efeito vincadamente diferente em células exibido por PEG HMW em relação a PEG de peso molecular mais baixo, tal como PEG 3.35. 44 EXEMPLO 6 O PEG HMW afecta as interacções célula-célula
Para observar directamente o efeito de soluções de PEG na orientação espacial de P. aeruginosa, foram realizadas experiências com estirpes vivas de PA27853/EGFP de P. aeruginosa albergando o gene egfp codificando a proteína verde fluorescente. As experiências foram realizadas na presença e ausência de células Caco-2. De modo a imagiar o efeito dos PEG nas bactérias e sua interacção com os epitélios cultivados utilizou-se microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e imagiologia de GFP. 0 gene EGFP codificando a proteína verde fluorescente foi amplificado utilizando o plasmídeo pBI-EGFP (Clontech) como um molde. Os sítios de restrição Xfoal e PstI foram introduzidos utilizando os iniciadores TCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGGATG (SEQ ID N° 5) e GCAGACTAGGTCGACAAGCTTGATATC (SEQ ID N° 6) . 0 produto de PCR foi clonado directamente dentro do vector pCR 2.1, utilizando um kit de clonagem TA (Invitrogen), seguido de transformação da construção pCR2.1/EGFP dentro de DH5a de E. coli. 0 gene EGFP foi excisado desta construção por digestão com XbaI e PstI e o fragmento contendo o gene excisado foi clonado dentro do vector vaivém pUCP24 de P. aeruginosa de E. coli que tinha sido digerido com as mesmas enzimas de restrição. A construção resultante (i. e., pUCP24/EGFP), contendo o gene EGFP no vector vaivém, foi electroporada, a 25 pF e 2500 V, para dentro de células electrocompetentes PA27583. As células contendo PA27853/EGFP foram seleccionadas em placas de LB-ágar contendo gentamicina a 100 pg/mL (Gm). 45
As células albergando PA27853/EGFP foram cultivadas, de um dia para o outro, em LB contendo Gm a 100 pg/mL e 1% da cultura foi utilizado para inocular LB fresco contendo Gm a 50 pg/mL. Após 3 horas de crescimento, foi adicionado ispropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para uma concentração final de 0,5 mM e as culturas foram incubadas durante 2 horas adicionais. 100 pL da cultura bacteriana foram misturados com 1 mL de meios HDMEM (Gibco BRL) tamponados com HEPES e contendo soro bovino fetal a 10% (HDMEM HF) e PEG HMW a 10%. Um mL de suspensão bacteriana foi vertido para dentro de uma placa dTC3 de 0,15 mm de espessura (Bioptech) . As células Caco-2 de quatro dias (pl0-p30), cultivadas em placas dTC3 de 0,15 mm de espessura (Bioptech) em HDMEM HF, foram lavadas uma vez em HDMEM HF, com ou sem PEG HMW. Um mL de suspensão bacteriana, preparada como acima, foi adicionado a uma placa dTC3 contendo células Caco-2. O padrão de dispersão das células bacterianas em placas dTC3 foi observado directamente com um microscópio invertido de fluorescência Axiovert 100 TV, utilizando filtros de fluorescência de DIC e GFP, a uma ampliação de objectiva de 63 X. A temperatura foi ajustada com um sistema de controlo de temperatura de termostato Bioptechs. Foram utilizadas lâmpadas de tungsténio (100 V) para a excitação de DIC e GFP. O software de imagiologia 3D (Slidebook), da Intelligent Imaging Innovations, foi utilizado para imagiar o padrão de dispersão de célula bacteriana no plano Z utilizando o filtro de GFP. As células de P. aeruginosa planctónicas uniformemente dispersas no meio sem células Caco-2 foram observadas numa imagem de DIC (Fig. 6ai) e reconstrução de plano Z (Fig. 6a2) . Na presença de células Caco-2, as células bacterianas desenvolveram uma aparência aglutinada (Fig. 6bi) e verificaram-se aderentes às células Caco-2 (Fig. 6b2). Uma solução de PEG 3350 a 10% diminuiu a motilidade bacteriana e induziu a formação imediata de 46 microcolónias bacterianas em forma de cogumelo (Fig. 6ci) aderindo ao fundo do poço (Fig. 6c2) . Na presença de células Caco-2, as microcolónias bacterianas estavam, aproximadamente, 8 mícrones acima do plano das células epiteliais (Fig. 6di,2) · Uma solução de PEG 15-20 a 10% diminuiu grandemente a motilidade de células de P. aeruginosa. Não obstante, durante as primeiras 0,5-1 horas de incubação em meio contendo PEG 15-20, as células bacterianas formaram microcolónias em forma de perna de aranha que estavam próximo do fundo do poço (Fig. 6ei,2). No espaço de várias horas, as microcolónias em forma de perna de aranha ocuparam todo o espaço/volume do meio. Na presença de células Caco-2, as células de P. aeruginosa perderam a configuração semelhante a perna de aranha e verificaram-se elevadas muito acima do plano do epitélio (30-40 mícrones) (Fig. 6fi,2) ·
Para determinar a orientação espacial das interacções de célula bacteriana-epitelial nas três dimensões, foram realizadas reconstruções de plano Z. As imagens demonstraram que as duas soluções de PEG tiveram efeitos diferentes no comportamento de aglutinação de P. aeruginosa e afectaram, de modo diferencial, a orientação espacial das bactérias, dependendo da presença ou ausência das células Caco-2. Em experiências apenas com meio, verificou-se que P. aeruginosa exibe um padrão uniformemente disperso (Fig 6a). Contudo, as células bacterianas examinadas na presença de células Caco-2, desenvolveram uma aparência aglutinada e verificaram-se adjacentes ao plano das células epiteliais no fundo dos poços (Fig 6b) . As células bacterianas examinadas na presença de PEG 3.35 isoladamente formaram grandes agregados aglutinados e permaneceram no fundo do poço de cultura (Fig 6c), ao passo que as células bacterianas examinadas com células Caco-2 em meio contendo PEG 3.35 permaneceram suspensas acima do plano das células epiteliais (cerca de 8 mícrones), 47 mantendo a sua aparência aglutinada (Fig 6d). As células bacterianas examinadas na presença de PEG 15-20 isoladamente exibiram um padrão uniforme de microaglutinação (Fig 6e) , ao passo que as células bacterianas examinadas na presença de Caco-2 em meio contendo PEG 15-20 estavam suspensas muito acima do plano do epitélio (~ 32 micrones) em formação aglutinada (Fig 6f) . Em experiências temporizadas, a motilidade bacteriana foi observada como sendo diminuída por PEG 3,35 e, a um grau ainda maior, com PEG 15-20.
Num modo análogo à experiência divulgada no Exemplo 5, este Exemplo proporciona uma correlação física para o efeito observado de PEG HMW na interacção célula-célula, consistente com as suas actividades profilácticas e terapêuticas benéficas, como aqui divulgadas. Espera-se que a utilização de PEG HMW reduza ou elimine interacções célula-célula deletérias no intestino (e. g. , entre células epiteliais intestinais e patógenos intestinais, tal como os Pseudomonados) , reduzindo o risco de doenças e/ou estados anómalos associados a septicemia de origem intestinal. EXEMPLO 7
Prevenção de doença/estados anómalos A divulgação também proporciona métodos de prevenção de uma variedade de doenças e/ou estados anómalos em humanos e outros animais, particularmente outros mamíferos. Nestes métodos da divulgação, uma quantidade eficaz de PEG HMW é administrada a um doente humano ou um indivíduo animal que dela necessita. O PEG pode ser administrado utilizando um programa de administração 48 que é determinado utilizando processos de optimização de rotina conhecidos na técnica. De um modo preferido, o PEG tem um peso molecular médio de 5000-20000 daltons e, de um modo mais preferido, entre 10000-20000 daltons. Está contemplado que é administrado, pelo menos, PEG HMW a 5%. O PEG HMW pode ser administrado em qualquer forma adequada, e. g., como uma solução, como um gel ou creme, com uma solução adequada para nebulização (e. g., para utilização de inalação), numa composição farmacêutica compreendendo o PEG HMW e numa solução estéril, isotónica, adequada para injecção num animal. A administração pode ser alcançada utilizando qualquer via convencional; está particularmente contemplado que o PEG HMW é administrado oralmente ou topicamente. Em alguns aspectos, a composição de PEG HMW sendo administrada compreende, adicionalmente, um composto seleccionado do grupo consistindo em L-glutamina revestida com dextrano, inulina revestida com dextrano, ácido butírico revestido com dextrano, um fruto-oligossacárido, N-acetil-D-galactosamina, manose revestida com dextrano, galactose e lactulose. Noutro aspecto, a composição de PEG HMW administrada compreende, adicionalmente, L-glutamina revestida com dextrano, inulina revestida com dextrano, ácido butírico revestido com dextrano, um ou mais fruto-oligossacáridos, N-acetil-D-galactosamina, manose revestida com dextrano, galactose e lactulose. A divulgação proporciona métodos de prevenção de uma variedade de doenças e estados anómalos, tais como ouvido de nadador, otite média aguda ou crónica, pneumonia associada a ventilador, septicemia de origem intestinal, enterocolite necrosante, diarreia induzida por antibiótico, colite pseudomembranosa, doenças inflamatórias intestinais, doença do intestino irritável, enterocolite neutropénica, pancreatite, 49 síndrome de fadiga crónica, sindrome de disbiose, colite microscópica, infecção crónica do trzcto urinário, doença sexualmente transmitida e infecção (e. g., exposição a um ambiente contaminado por um agente de bioterrorismo, tais como Bacillus anthracis, Vírus da Varíola, E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), Clostridium difficile, rotavírus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Klebsiella oxytocia, Enterobacteria cloacae, Candida albicans, Candida globrata e semelhantes) . Num aspecto preferido do método de prevenção de infecção crónica do tracto urinário, ou tratamento dessa infecção, o PEG HMW é distribuído na forma de um irrigante de bexiga. Para prevenção de doença sexualmente transmitida, uma composição da invenção é utilizada, de um modo preferido, para lubrificar um preservativo. Num aspecto preferido de um método de prevenção de infecção por um agente de bioterrorismo, a composição de acordo com a invenção é proporcionada na forma de um gel ou creme, adequado para aplicação tópica. Espera-se que essa aplicação tópica seja útil na prevenção de uma variedade de doenças/estados anómalos associados a qualquer dos agentes de bioterrorismo ou associados a uma variedade de agentes químicos ou físico-químicos que colocam uma ameaça ao homem ou animal em termos de sobrevivência, saúde ou conforto. Esses agentes químicos ou físico-químicos incluem os agentes capazes de queimarem ou, outro modo, lesarem a pele e que são tornados inactivos ou são fracamente solúveis nas composições da invenção.
Num aspecto dos métodos preventivos, murganhos Balb/c machos são anestesiados e uma solução aquosa a 5% de PEG 15-20 é injectada dentro da base do cécum por punção directa com agulha. De modo a proporcionar uma fonte de PEG constante, para a 50 duração de 48 horas da experiência, a agulha é dirigida para dentro do intestino delgado (íleo) e 1 mL do PEG 15-20 é injectado de modo retrógrado dentro do intestino proximal. O local de punção é atado com uma sutura de seda e o ceco limpo com álcool. Os murganhos são devolvidos às suas gaiolas e é-lhes administrada apenas H20. Quarenta e oito horas mais tarde, os murganhos são submetidos a um processo de hepatectomia convencional, envolvendo uma excisão exangue a 30% do figado ao longo do lobo esquerdo mole. Os murganhos de controlo sofrerão manipulação do figado sem hepatectomia. Espera-se que o tratamento preventivo envolvendo administração de PEG HMW reduza ou elimine a incidência de septicemia de origem intestinal associada a cirurgia em murganhos.
Estes métodos são aplicáveis para além do cuidado preventivo de animais de estimação, tais como murganhos, porquinhos-da-índia, cães e gatos, até animais agricolamente significativos, tais como gado vacum, cavalos, cabras, ovelhas, porcos, galinhas, perus, patos, gansos e qualquer outro animal domesticado. Além disso, espera-se que estes métodos preventivos sejam aplicáveis a humanos, melhorando a saúde e esperança de vida de muitos doentes ou candidatos em risco de desenvolver uma doença e/ou um estado anormal, tais como ouvido de nadador, otite média aguda ou crónica, pneumonia associada a ventilador, septicemia de origem intestinal, enterocolite necrosante, diarreia induzida por antibiótico, colite pseudomembranosa, uma doença inflamatória intestinal, doença do intestino irritável, enterocolite neutropénica, pancreatite, síndrome de fadiga crónica, síndrome de disbiose, colite microscópica, infecções crónicas do aparelho urinário, doenças sexualmente transmitidas e agentes infecciosos (e. g., composições de bioterrorismo) que incluem mas não estão limitados a antraz e varíola. Como notado 51 acima, os métodos preventivos compreendem a administração de uma composição compreendendo, pelo menos, PEG HMW a 5% (5-20 kDa) , por qualquer via de administração conhecida ou convencional, ao homem ou outro animal. De um modo preferido, os métodos preventivos são praticados nos indivíduos em risco de desenvolver uma ou mais das supramencionadas doenças e/ou estados anómalos, mas está contemplado que as composições e métodos da invenção serão úteis num papel profiláctico ou terapêutico para, de um modo amplo, tratar ou prevenir essas doenças ou estados anómalos em populações integrais ou subpopulações do homem ou outros animais. EXEMPLO 8 (DE REFERENCIA)
Métodos de monitorização da administração de PEG HMW A divulgação também contempla métodos para monitorização da administração de PEG HMW, e. g., num método de tratamento. Nesses métodos de monitorização, o PEG HMW marcado é administrado, isoladamente ou em combinação com PEG HMW não marcado e o marcador é detectado durante o tratamento num programa contínuo ou intermitente, incluindo determinações de valores-limite simples. O termo PEG HMW "marcado" significa que um marcador, ou composto detectável, é directamente ou indirectamente conjugado a PEG HMW, ou o PEG HMW é conjugado a um composto repórter que é capaz de se associar a um marcador com PEG HMW (certamente, os marcadores não conjugados a PEG HMW ou concebidos para lhes estarem associados também estão contemplados pela invenção, como notado abaixo) . 0 PEG HMW é marcado utilizando qualquer marcador detectável conhecido na técnica e o PEG é marcado a um nível suficiente para o detectar. 52
Os especialistas na técnica reconhecerão que o nível variará, dependendo do marcador e do método de detecção. Um especialista na técnica será capaz de optimizar o grau de marcação utilizando processos de optimização de rotina. 0 marcador é quimicamente ligado ao PEG HMW por uma ligação não covalente ou covalente que é estável em utilização e, de um modo preferido, em armazenamento. Prefere-se o marcador covalentemente ligado a PEG HMW. A densidade de conjugação de marcador é ajustada para substancialmente preservar a actividade biológica de PEG HMW (preservação de actividade biológica suficiente para realizar um efeito profiláctico ou terapêutico benéfico, como aqui divulgado). Isto é alcançado, tipicamente, através do ajuste da razão PEG HMW:marcador, como seria conhecido na técnica. Dado o tamanho relativo da molécula média de PEG HMW, espera-se que uma ampla variedade de marcadores seja adequada para conjugação a PEG HMW, com preservação substancial da sua actividade biológica.
Os marcadores contemplados pela divulgação são os marcadores conhecidos na técnica, que incluem um marcador radioactivo, um cromóforo, um fluoróforo e um repórter (incluindo uma que catalisa a produção de um composto detectável e um parceiro de ligação, tal como um anticorpo, que localiza um composto detectável na vizinhança do repórter. Os repórteres enzimáticos exemplificativos incluem um componente enzimático de um sistema de luminescência e um catalisador de uma reacção colorimétrica. De um modo mais particular, as moléculas repórter exemplificativas incluem biotina, avidina, estreptavidina e enzimas (e. g., peroxidase de rábano, luciferase, fosfatases alcalinas, incluindo fosfatases alcalinas segregadas (SEAP); β-galactosidase; β-glucuronidase; cloranfenicol acetiltransferase). A utilização desses repórteres é bem 53 conhecida dos especialistas na técnica e é descrita em, e. g., Patente U.S. N° 3817837, Patente U.S. N° 3850752, Patente U.S. N° 3996345 e Patente U.S. N° 4277437. Os substratos enzimáticos exemplificativos, que podem ser convertidos em compostos detectáveis por enzimas repórter, incluem 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido ou Xgal e Bluo-gal. Os substratos enzimáticos, como compostos capazes da conversão em compostos detectáveis, também podem ser marcadores em determinadas formas de realização, como seria compreendido na técnica. As patentes U.S. ensinando marcadores e suas utilizações incluem a Patente U.S. N° 3817837; Patente U.S. N° 3850752; Patente U.S. N° 3939350 e Patente U.S. N° 3996345. São marcadores radioactivos exemplificativos 3H, 14C, 32P, 33P, 35S e 125I; são fluoróforos exemplif icativos fluoresceina (FITC), rodamina, Cy3, Cy5, aequorina e proteína verde fluorescente. Um marcador preferido é um fluoróforo, tal como fluoresceina.
Os métodos de monitorização da divulgação também podem envolver mais de um marcador. Num aspecto, um marcador serve para identificar a localização do PEG HMW após ou durante o tratamento, enquanto um segundo marcador é específico para um ou mais micróbios, na medida em que o marcador, de um modo detectável, se associa a, pelo menos, um micróbio. Por exemplo, um método de monitorização pode incluir fluoresceina conjugada a PEG HMW num modo que preserve, substancialmente, a actividade biológica do PEG HMW e Xgal ou bluo-gal livres (i. e., não conjugados) para detecção de actividade de β-galactosidase específica de procariota. A fluoresceina localiza o PEG HMW, enquanto um produto colorido (azul) indica a presença de um micróbio procariótico que metaboliza lactose, tal como uma Pseudomona. A divulgação também inclui métodos de monitorização, 54 em que um único marcador proporciona esta informação (i. e., a localização de PEG HMW e uma indicação da presença de um micróbio).
Qualquer técnica de detecção conhecida na técnica pode ser utilizada nos métodos de monitorização da divulgação. Vários factores influenciarão a técnica de detecção escolhida, incluindo o tipo de marcador, o biomaterial submetido a monitorização (e. g., células epidérmicas da pele, canal auditivo ou intestino; amostras de fezes, muco ou tecido), o nível de discriminação desejada, se é esperada quantificação e semelhantes. As técnicas de detecção adequadas incluem inspecção visual simples à vista desarmada, inspecção visual com um instrumento, tal como um endoscópio, opcionalmente equipado com uma fonte de luz adequada e/ou máquina fotográfica para gravação, a utilização convencional de contadores Geiger, filme de raios X, contadores de cintilação e semelhantes, e qualquer outra técnica de detecção conhecida na técnica.
Um especialista reconhecerá que os métodos de monitorização da divulgação são úteis na optimização dos métodos de tratamento. Por exemplo, um método de monitorização pode ser utilizado para optimizar a quantidade e/ou concentração de PEG HMW (e. g., para alcançar uma viscosidade desejada para uma solução ou mistura de PEG HMW) que é distribuída a uma célula epitelial, tal como as células epiteliais do canal auditivo, para prevenir ou tratar o ouvido de nadador. A título de exemplos adicionais, a optimização de tratamentos do intestino ou intestinais pode ser facilitada por inspecção endoscópica de um tracto intestinal exposto a PEG HMW marcado ou através da monitorização de amostras de fezes. 55
Os métodos de monitorização da divulgação incluem um ensaio de fezes para um micróbio capaz de aderir a uma célula epitelial intestinal, compreendendo a colocação em contacto de um micróbio e uma célula epitelial intestinal e a detecção da aderência do micróbio à célula epitelial, utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Num aspecto preferido, a célula epitelial intestinal está imobilizada numa superfície adequada, tal como o fundo e/ou lados de um poço de microtitulação. Noutro aspecto preferido, um marcador directo, ou um marcador indirecto, tal como um repórter capaz de gerar um produto detectável, é adicionado antes ou durante a etapa de detecção. Os métodos de monitorização podem compreender, adicionalmente, a adição de marcadores livres. Por exemplo, o Bluo-gal livre é adicionado a uma amostra suspeita de conter um micróbio procariótico que metaboliza lactose; se presente, a enzima microbiana β-galactosidase clivará o Bluo-gal para produzir um produto azul detectável.
Num aspecto, as células epiteliais intestinais comercialmente disponíveis (e. g., células Caco-2, ATCC HTB 37 e/ou células IEC-6, ATCC CRL 1952) são fixas aos poços de uma placa de microtitulação utilizando uma técnica convencional. Uma amostra de fezes é recolhida e misturada com um fluido, tal como solução salina tamponada com fosfatos. A fase líquida da mistura, contendo micróbios suspensos, é obtida (e. g., por filtração adequado (i. e., separação de sólidos grosseiros de bactérias em suspensão fluida), decantação ou semelhantes) e diluída 1:100 em PBS. O Bluo-gal é adicionado à suspensão microbiana viva. A suspensão microbiana é adicionada a poços de microtitulação, durante 1 hora, a 24 °C, seguida de lavagem dos poços com um fluido adequado (e. g., PBS) para remover micróbios não ligados. Os micróbios não ligados e/ou ligados às células 56 epiteliais imobilizadas são detectados, e. g., através de contagem, utilizando microscopia óptica polarizada. Em aspectos alternativos, um imunoensaio é utilizado para detectar aderência, com os reagentes imunológicos adequados sendo um anticorpo monoclonal ou policlonal específico de micróbio(s), opcionalmente conjugado a um marcador, tal como um marcador radioactivo, um fluoróforo ou um cromóforo.
Um especialista na técnica reconhecerá que nem a célula epitelial intestinal nem o micróbio necessitam de estar imobilizados, embora essa imobilização possa facilitar a detecção precisa de micróbios aderindo a células epiteliais. Por exemplo, num aspecto, um micróbio de fezes imobilizado é colocado em contacto com uma célula epitelial intestinal que não está imobilizada. Adicionalmente, um especialista reconheceria que qualquer fluido adequado conhecido na técnica pode ser utilizado para se obter a suspensão microbiana, com os fluidos preferidos sendo quaisquer dos tampões isotónicos conhecidos. Do mesmo modo, como notado acima, qualquer marcador conhecido pode ser utilizado para detectar a aderência celular.
Num aspecto relacionado, a divulgação proporciona um kit para o ensaio para aderência celular microbiana, compreendendo uma célula epitelial e um protocolo para o ensaio de aderência celular microbiana à célula epitelial. 0 protocolo descreve um método conhecido para detecção de um micróbio. Um kit preferido inclui uma célula epitelial intestinal. Outros kits da invenção compreendem, adicionalmente, um marcador, tal como um fluoróforo ou um repórter.
Outro método de monitorização contemplado pela divulgação é um ensaio para hidrofobicidade microbiana. Neste método, a 57 hidrofobicidade relativa ou absoluta de uma célula microbiana é determinada utilizando qualquer técnica convencional. Uma técnica exemplificativa envolve a exposição de qualquer micróbio a cromatoqrafia de interacção hidrófoba, como seria conhecido na técnica. Ukuku et ai., J. Food Prot. 65:1093-1099 (2002). Outra técnica exemplificativa é a partição de fluido não polar:polar (e. g., 1-octanol:água ou xileno:água) de qualquer micróbio. Ver Majtan et al., Folia Microbiol (Praha) 47:445-449 (2002).
Num aspecto de um ensaio de hidrofobicidade para monitorização da administração de PEG, uma amostra de fezes é suspensa em tampão de fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,4) contendo NaCl a 0,15 M. Os micróbios na suspensão são recolhidos por centrifugação e ressuspensos no mesmo tampão e o ciclo de centrifugação-ressuspensão é repetido. Se exequível, os micróbios são ressuspensos no mesmo tampão para uma absorvência de 0,4, a 660 nm, que permitirá a monitorização espectrofotométrica, sem utilizar PEG marcado. A suspensão microbiana é tratada com xileno (2,5:1, v/v, Merck), a suspensão é vigorosamente misturada durante dois minutos e a suspensão é deixada assentar, durante 20 minutos, à temperatura ambiente. A presença de micróbios na fase aquosa é, depois, determinada, por exemplo por determinação espectrofotométrica da absorvência a 660 nm. Um branco contendo o tampão de fosfato de sódio é utilizado para eliminar o fundo.
Na obtenção de células microbianas a partir de amostras de fezes para utilização nestes métodos, prefere-se que o PEG HMW seja relativamente insolúvel no fluido utilizado para obter a suspensão microbiana e qualquer fluido utilizado para diluir a suspensão microbiana. 58 A divulgação proporciona, adicionalmente, um kit para a realização do método de monitorização, compreendendo um ensaio para hidrofobicidade microbiana, que compreende uma célula epitelial intestinal e um protocolo descrevendo a determinação de hidrofobicidade microbiana. Um kit preferido inclui uma célula epitelial intestinal. Os kits relacionados compreendem, adicionalmente, um marcador, tal como um fluoróforo ou um repórter.
Ainda mais, a divulgação proporciona um método de monitorização compreendendo a obtenção de uma amostra de flora intestinal e a detecção de actividade de lectina PA-I/adesina. Pode ser utilizada qualquer técnica conhecida na técnica para detecção de actividade de lectina PA-I/adesina. Por exemplo, a lectina PA-I/adesina pode ser detectada utilizando um anticorpo (policlonal, monoclonal, fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fab, cadeia única, quimera, humanizado ou qualquer outra forma de anticorpo conhecida na técnica) que reconhece especificamente lectina PA-I/adesina. 0 imunoensaio adopta a forma de qualquer formato de imunoensaio conhecido na técnica, e. g. , ELISA, Western, imunoprecipitação e semelhantes. Alternativamente, pode detectar-se uma capacidade de ligação de hidratos de carbono de lectina PA-I/adesina ou a actividade de ruptura de barreira epitelial intestinal de lectina PA-I/adesina pode ser medida, e. g. , através da monitorização da resistência eléctrica transepitelial ou TEER, de uma camada epitelial antes e/ou durante a exposição a uma amostra. Em kits relacionados, a divulgação proporciona um parceiro de ligação de lectina PA-I/adesina e um protocolo para detecção da actividade de lectina PA-I/adesina (e. g., actividade de ligação). Outros kits de acordo com a divulgação incluem qualquer hidrato de carbono conhecido por se ligar a lectina PA-I/adesina e um 59 protocolo para detecçao de actividade de lectina PA-I/adesina (e. g., actividade de ligação).
Lisboa, 24 de Abril de 2012 60

Claims (26)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de polietilenoglicol (PEG) , em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 15000 daltons, na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio da barreira epitelial, através da inibição da aderência de uma célula bacteriana a um epitélio de mamifero.
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a aderência de uma célula bacteriana a um epitélio de mamífero é sintomática de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo em septicemia de origem intestinal, uma lesão de queimadura, enterocolite necrosante neonatal, neutropenia grave, colite tóxica, doença inflamatória intestinal, enteropatia e pouchite.
  3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o animal é seleccionado do grupo consistindo em cão, gato, ovelha, cabra, vaca, porco, galinha, cavalo e humano.
  4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o animal é um humano.
  5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o PEG é uma solução aquosa compreendendo PEG a 10-20%.
  6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a solução aquosa compreende PEG a 10%. 1 7. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para o tratamento de um distúrbio da barreira epitelial, através da inibição da expressão de lectina PA-I/adesina num patógeno intestinal.
  7. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para o tratamento de um distúrbio da barreira epitelial, através da inibição da activação de lectina PA-I/adesina induzida pelo intestino.
  8. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para o tratamento de um distúrbio da barreira epitelial, através da inibição da alteração morfológica induzida por C4-HSL de um patógeno intestinal.
  9. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para o tratamento de um distúrbio da barreira epitelial, através da redução da expressão de virulência num patógeno intestinal.
  10. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para o melhoramento da patogénese intestinal, através da prevenção da formação da activação patogénica por detecção de quórum.
  11. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a célula bacteriana é uma Pseudomona.
  12. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a Pseudomona é Pseudomonas aeruginosa. 2
  13. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para o tratamento de um distúrbio da barreira epitelial, através da redução da expressão de lectina PA-I/adesina numa célula bacteriana.
  14. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o PEG adere a uma célula epitelial intestinal ou uma célula bacteriana num modo topograficamente assimétrico.
  15. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a célula bacteriana é um patógeno intestinal e não há modificação detectável das características de crescimento do patógeno intestinal.
  16. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento compreende, adicionalmente, uma quantidade eficaz de um composto seleccionado do grupo consistindo em dextrano, L-glutamina revestida com dextrano e inulina revestida com dextrano, para ser introduzido no intestino.
  17. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento compreende, adicionalmente, uma quantidade eficaz de L-glutamina, para ser introduzida no do intestino.
  18. 19. Kit para utilização no tratamento terapêutico ou prevenção de septicemia de origem intestinal, compreendendo: (i) uma composição farmacêutica compreendendo polietilenoglicol de, pelo menos, 15000 daltons de peso molecular médio e um adjuvante, veiculo ou diluente adequado e (ii) um protocolo descrevendo a utilização da composição no tratamento 3 terapêutico ou prevenção de septicemia de origem intestinal.
  19. 20. Utilização de polietilenoglicol (PEG) , em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 15000 daltons, na preparação de um medicamento para a prevenção de infecção respiratória.
  20. 21. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que a infecção respiratória é seleccionada do grupo consistindo em pneumonia associada a ventilador e infecção.
  21. 22. Utilização de uma composição compreendendo PEG, em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 15000 daltons, na preparação de um medicamento para a irrigação de, pelo menos, uma porção do tracto urinário, de modo a prevenir uma infecção crónica do tracto urinário.
  22. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 22, em que a porção do tracto urinário inclui, pelo menos, a bexiga.
  23. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para a prevenção de uma doença sexualmente transmitida, compreendendo a etapa de aplicação de polietilenoglicol (PEG) a um preservativo.
  24. 25. Preservativo compreendendo, pelo menos, um revestimento parcial com polietilenoglicol (PEG) , em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 15000 daltons. 4
  25. 26. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para a prevenção de um distúrbio do tracto digestivo, 27. 28. 29. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para o tratamento de um distúrbio seleccionado do grupo consistindo em enterocolite necrosante neonatal, diarreia induzida por antibiótico, colite pseudomembranosa, uma doença inflamatória intestinal, doença do intestino irritável, enterocolite neutropénica, pancreatite, sindrome de disbiose, colite microscópica, ouvido de nadador, otite média aguda ou crónica, pneumonia associada a ventilador, septicemia de origem intestinal, sindrome de fadiga crónica, infecção crónica do aparelho urinário, doença sexualmente transmitida e infecção. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para a prevenção da perda da capacidade lactante num animal que apresente uma superfície epitelial de uma glândula mamária em risco de desenvolver um distúrbio mediado por micróbios afectando a produção de leite. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para a prevenção do desenvolvimento da disfunção da barreira epitelial num animal em idade de amamentação. Utilização de acordo com a reivindicação 29, em que o PEG é misturado com fórmula para lactentes. 5 30.
  26. 31. Composição compreendendo fórmula para lactentes e polietilenoglicol (PEG), em que o PEG tem um peso molecular médio de, pelo menos, 15000 daltons. Lisboa, 24 de Abril de 2012 6
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