KR20150131864A - 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 약학 조성물을 회전근개 파열을 진단받은 병변에 주입함으로써 통증의 감소 뿐만 아니라 상처의 회복 속도를 높이고 기능의 회복을 촉진하게 되는 효과가 있다.

Description

어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition comprising mixture of DNA fragments separated from fish's semen or testis for the prevention or treatment of rotator cuff tear}

본 발명은 회전근개 파열의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

회전근개 파열이란, 어깨의 안정성과 회전운동을 담당하는 4개 근육(극상근, 극하근, 소원근, 견갑하근) 및 힘줄(건, tendon)이 여러 가지의 원인에 의해 기능이 저하되고 굳어지거나 손상을 입게 되면서 심한 경우 찢어져 통증을 유발시키는 질환을 말한다. 회전근개 파열은 주로 운동이나 업무에 따른 과부하나 과사용으로 인한 염증성 반응의 발생과 자연스러운 노화에 따른 퇴행성 변화의 결과로 일어나는 경우가 흔하며 일반적으로 힘줄 손상이 일어나고, 특히, 극상근의 힘줄(극상건)이 파열되는 경우가 많다.

주된 증상은 해당 부위를 움직일 때 통증이 나타나거나, 국소 압통을 보이는 것으로 시작해서 더 악화되는 경우 완전 파열에 이르기도 한다.

종래 회전근개 파열의 치료를 위해 다양한 비수술적 치료방법이 사용되어 왔다. 예컨대, 약물치료로서 비스테로이드성 소염진통제(NSAID)를 경구투여하거나 국소적용하는 방법, 또는 스테로이드 주사요법이 사용되어 왔으나, 이러한 약물치료법은 단기적인 효과는 크나 재발률이 높고 부작용을 수반하는 문제가 있었다. 이외에도, 수동적 관절가동범위 회복을 위한 스트레칭 및 견갑안정화를 위한 근력강화운동과 같은 운동치료법, 관절강 주사를 주입해서 관절활액의 히알루론산 보충을 통해 윤활 작용을 보강하는 방법, 초음파 온열치료, 전기치료와 같은 물리치료 방법 등의 종래 비수술적 치료방법들의 경우, 통증을 감소시키는 등의 증상 완화에 국한되어, 원인을 적극적으로 해결하기 위한 치료법이 되지 못하는 한계가 있었다.

회전근개 파열의 치료에 있어서, 위와 같은 비수술적 치료방법에도 호전되지 않거나, 회전근개 파열의 부위가 커지는 경우, 결국 병소절제술, 회전근개봉합술과 같은 수술을 시행하는 것이 일반적인 경과였다.

이에, 최근 비수술적 치료방법의 일환으로서, 혈소판풍부혈장(platelet-rich plasma) 주사치료와 같은 조직 재생 효과에 기반을 둔 새로운 치료법이 소개되고 있으며 실제로 회전근개 파열에서 치료효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

한편, 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물은 A2 purinergic receptor에 작용하여 VEGF(vascular endothelial growth factor), IGF-1(insulin-like growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor)의 발현을 증가시킨다고 보고 되었으며, 혈소판풍부혈장과 유사하게 조직재생에 필요한 성장인자를 유도하는 작용을 가진다. A2A 및 A2B agonist는 혈관 내피세포 및 fibroblast의 migration 촉진에 관여하는 것으로 보고 되었다. 또한, DNA 단편 혼합물은 fibroblast의 분화 및 활성을 촉진하여 상처주위조직에 콜라겐 및 비콜라겐성 단백질 분비를 촉진하고 정상적인 조직으로 유도하여 상처를 치료한다. 열손상에 의한 조직수복 연구에서 DNA 단편 혼합물을 투여한 동물 조직은 투여하지 않는 군에 비해 조직의 수축 등이 없고 모세혈관 및 조직의 재생 정도가 정상에 가깝게 회복된 것을 확인할 수 있었으며, 상처에 대하여 규격화된 임상이 가능한 자가피부이식 시 조직공여 부위에 대한 임상에서 DNA 단편 혼합물은 상처치유 및 조직수복과정을 향상시켜 준다고 보고되었다.

이에 따라, 본 발명자들은, 혈관 신생 및 조직재생을 촉진하여 상처를 치료하는 DNA 단편 혼합물이 어깨의 회전근개 파열의 경우에도 적용될 수 있다고 생각하였고, 이에 대한 조직재생 및 안전성을 확인하고, 조직의 재생에서 우수한 효과를 나타냄을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

상기 어류 정액 또는 정소 유래의 DNA 단편 혼합물이란, 인산, 4종류의 염기, 데옥시리보오스로 이루어진 생체고분자에 해당하는 DNA가 어류의 정액 또는 정소로부터 추출, 정제된 후 그 분자량이 저감된 단편 형태의 상태로 혼합되어 존재하는 것을 지칭한다.

한편, 국제공개특허 제2010-049898호에는 어류 유래의 폴리데옥시리보뉴클레오티드로서, 분자량이 20~2500kDa, 더 바람직하게는 20~240kDa의 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 골관절 치료용 주사제로 이용할 수 있음이 개시되어 있다. 그러나, 상기 선행문헌에는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 골관절 치료용 주사제로 이용할 수 있음이 개시되어 있을 뿐, 회전근개 파열부위의 치료에 적용할 수 있음에 관해서는 전혀 언급되어 있지 않다.

본 발명자들에 의한 한국공개특허 제2013-0044195호 발명은, 어류 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 포함하는 연골 재생용 조성물에 관한 발명으로서, 3,000~10,000kDa의 분자량을 갖는 DNA 단편 혼합물을 관절 내로 투여시 연골의 윤화 또는 완충작용을 상승시키면서 연골세포의 증식효과, 관절염 개선효과가 있는 점이 개시되어 있으나, 회전근개 파열의 치료에 적용할 수 있음에 관해서는 개시된 바 없다.

또한, 비특허문헌으로서, Kim WJ, et al.은 좌골대퇴골충돌증후군(Ischioremoral Impingement Syndrome) 환자로서 대퇴골과 좌골 사이에 있는 대퇴방형근(quadratus femoris muscle)에 염증으로 인한 부기(swelling)가 확인된 환자에 있어서, 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 투여하는 것에 의해 염증이 가라앉음으로써 통증을 치유했다는 점이 개시되어 있으나, 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 투여함으로써 세포증식능 등 재생기능을 통해 파열된 힘줄 조직이 수복되고 이처럼 조직이 수복됨으로 인해 통증이 사라지는 효과에 대해서는 개시된 바 없다.

국제공개특허 제2010-049898호(INJECTABLE POLYDEOXYRIBONUCLEOTIDE COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF OSTEOARTICULAR DISEASES, 2009.10.28. 공개) 한국공개특허 제2013-0044195호(어류 정소로부터 분리된 디엔에이 단편 혼합물을 포함하는 연골 재생용 조성물)

Kim WJ, et al. "Ultrasound-guided Prolotherapy with Polydeoxyribonucleotide Sodium in Ischiofemoral Impingement Syndrome. Pain Pract. 2014 Apr 16. doi: 10.1111/papr.12215.[Epub ahead of print]

본 발명의 목적은 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은 회전근개 파열에 대한 비수술적 치료 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 어류는 연어과의 어류인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 연어 또는 송어이며, 가장 바람직하게는 연어이다.

상기 어류의 정액 또는 정소 유래의 DNA 단편 혼합물의 분자량은 40kDa~2000kDa인 것이 바람직하고, 50kDa~1500kDa인 것이 보다 바람직하다.

이하, 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 살펴본다.

본 발명은, 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물이란, 인산, 4종류의 염기, 데옥시리보오스로 이루어진 생체고분자에 해당하는 DNA가 어류의 정액 또는 정소로부터 추출, 정제된 후 그 분자량이 저감된 단편 형태의 상태로 혼합되어 존재하는 것을 지칭한다.

본 발명의 DNA 단편 혼합물은, 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된다. 어류의 정액 또는 정소로부터 DNA 단편 혼합물을 분리하는 방법은 하기 공정을 따르며, 이에 한정되지 않는다.

(1공정) 어류 정액 또는 정소를 해동하고, 혈액 및 이물질을 제거하는 단계;

(2공정) 해동된 정액 또는 정소에 정제수를 넣어 정액 또는 정소 분쇄액을 제조하는 단계;

(3공정) 상기 2공정의 정액 또는 정소 분쇄액과 염화나트륨 수용액을 혼합한 후, 교반하면서 반응시켜 냉각하는 단계;

(4공정) 상기 3공정의 냉각된 반응액에 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH 10~12가 되도록 한 후 교반 및 여과하여 여과액을 얻는 단계;

(5공정) 상기 4공정의 여과액에 pH 6.5~8.5가 되도록 염산을 첨가하여 반응시키고 냉각한 후 이를 여과하여 DNA 단편 혼합물이 포함된 여과액을 얻는 단계;

(6공정) 상기 5공정의 여과액을 겔여과를 통해 분획하여 분자량이 바람직하게는 40~2,000kDa, 더 바람직하게는 50~1,500kDa의 DNA 단편 혼합물의 분획액을 얻는 단계;

(7공정) 상기 6공정의 분획액에 이소프로필 알코올 또는 에탄올을 첨가한 후 교반하여 DNA 단편 혼합물을 침전시키는 단계; 및

(8공정) 상기 7공정의 DNA 단편 혼합물을 이소프로필 알코올 또는 에탄올로 세척하고 이를 탈수 및 건조하는 단계.

상기 DNA 단편 혼합물은 백색 또는 미황색의 결정형 파우더로서 물과 알칼리에 조금 녹고, 알콜에 매우 녹기 어렵고, 에테르와 아세톤에 거의 녹지 않는 특성을 갖는다.

본 발명에 있어서, 상기 어류의 정액 또는 정소 유래의 DNA 단편 혼합물의 분자량은 40kDa~2000kDa인 것이 바람직하고, 50kDa~1500kDa인 것이 가장 바람직하다. 상기 DNA 단편 혼합물의 분자량 범위가 40kDa~2000kDa인 경우에 약효가 즉시 발휘되어 통증을 경감시킬 수 있음은 물론 파열된 힘줄 조직이 효과적으로 재생될 수 있어 바람직하다. 상기 DNA 단편 혼합물의 분자량이 40kDa 미만이면 회전근개의 파열 치료 효과가 미흡하고, 2000kDa을 초과하면 속효성이 문제가 있어 오히려 약효가 떨어지므로 바람직하지 않다.

본 발명에 따른, 어류의 정액 또는 정소에서 분리된 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한 상기 DNA 단편 혼합물은 바람직하게는 생리식염수(saline, 인산염 완충액으로 pH 7.0)에 녹여 멸균 주사용액으로 이용될 수 있다.

회전근개 파열을 치료할 수 있는 통상의 약제를, 본 발명의 약학 조성물에 추가로 포함하거나, 본 발명의 약학 조성물과 병용하여 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은, 통상적으로 주사제에 사용되는 약제학적 부형제를 추가로 포함하여 주사제로 제조되어, 회전근개 파열의 치료를 위해 파열 부위에 직접 주사할 수 있다.

본 발명의 DNA 단편 혼합물을 함유한 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 어류 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은, 회전근개 파열의 예방 또는 치료에 우수한 효과가 있다.

또한, 본 발명은 어류 정액 또는 정소로부터 유래된 DNA 단편 혼합물을 사용함으로써, 장기간 투여에도 안전하고 부작용이 적은 장점이 있을 뿐만 아니라, 회전근개 파열을 비수술적 시술에 의해 회복시킬 수 있는 효과가 있다. 특히, 본 발명은, 파열된 힘줄 조직을 재생시킴으로써, 통증 감소 뿐만 아니라 원래의 기능을 수복할 수 있는 효과가 있다

도 1은, VAS(Visual Analogue Scale)로 평가한, 활동시 통증(VAS active) 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는, 시술부위의 변화를 측정한 초음파사진이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1. 회전근개 파열의 치료 효과 확인을 위한 임상시험>

1. 시험 대상

회전근개 부분파열과 관련 가능성이 있는 통증을 호소하는 환자 중 문진, 이학적 검사, 단순방사선검사 및 초음파검사를 통하여 다른 질환을 배제하고 회전근개 부분파열을 진단받은 환자로 초음파 검사상 회전근개 부분파열의 깊이가 회전근개 전체의 1/2이하, 파열부위의 넓이 및 길이가 각각 1cm 이하인 환자를 대상으로 하여, 회전근개 파열의 진단이 명확하며 이에 의해 일상적인 생활에 큰 지장을 받고 있는 환자를 대상으로 치료를 시행하였다.

회전근개 파열은 존재하였으나 해당 부위에 스테로이드나 다른 주사치료를 6주 이내에 시행한 환자, 치료중인 감염성 질환이 있는 환자, 영양결핍 환자, 최근 3개월 내에 다른 임상연구를 위한 약을 투여한 자 등에 대해서는 대상에서 제외하였다.

이에 따라, 총 7명(남자 5명, 여자 2명)의 환자에 대하여, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 주입하는 시술이 진행되었다. 이 환자들은 시술 전 3개월 이전에 회전근개 파열이 발생하여 물리치료를 받긴 하였으나 주사치료 또는 약물 투여를 받지 않은 상태로서, 물리치료와 같은 보존적 치료에 반응하지 않아 지속적인 통증, 및 상지(upper limb)와 어깨 움직임의 불편을 호소하는 환자들이었다.

시술 대상 환자의 평균 연령은 57.66세였고, 환자에게는 시술 전에 시술의 모든 과정에 대하여 자세히 설명하였으며 이에 대한 동의를 받았다.

2. DNA 단편 혼합물의 제조

연어의 정액으로부터 DNA 단편 혼합물을 다음과 같은 공정을 통해 제조하였다.

(1) 정액 준비, 및 단백질과 및 지방 제거 공정

냉동된 정액 10g을 해동한 다음 탈혈 및 이물질을 제거하고 나서, 정제수 400㎖을 넣고 분쇄기로 분쇄하여 정액 분쇄액을 제조하였다. 이후, 정제수 500㎖에 200g의 염화나트륨을 녹여 염화나트륨 용액을 제조하였고, 상기 염화나트륨 용액 500㎖과 상기 정액 분쇄액을 혼합한 다음, 100℃에서 1시간 동안 교반하면서 반응시킨 후에 냉각하였다. 상기 냉각된 반응액에 30% 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 pH 11.0이 되도록 한 후 이를 1시간 동안 교반시키고 여과하여 단백질과 지방이 제거된 여과액을 얻었다.

(2) 분자량 저감 공정

상기 여과액에, pH 7.0이 되도록 염산을 첨가하여 100℃에서 10분간 반응시킨 후, 이를 냉각한 뒤 다시 여과를 실시하여 DNA 단편 혼합물을 포함하는 여과액을 얻었다.

(3) 분자량 분획 공정

여과액에 30%(w/v) 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 다시 pH 10가 되도록 한 후 겔여과를 통해 50~1,500kDa의 분자량을 가지는 DNA 단편 혼합물의 분획액을 얻은 다음 35%(w/v) 염산을 사용하여 pH7.0으로 조정한다.

(4) 침전 및 건조 공정

상기 분획액에 냉각된 에탄올(여과액 부피의 2배)을 첨가한 다음 10분간 교반하고 원심분리한 뒤, 침전된 침전물을 회수하여 이를 70% 에탄올로 세척하였다. 진공 하에서 건조시켜 DNA 단편 혼합물을 수득하였으며, 분말화된 DNA 단편 혼합물의 균일성을 확보하기 위하여 1mm 체에 거르는 과정을 반복하였다. 상기 DNA 단편 혼합물의 분자량은 겔 이미지 분석 시스템으로 측정한 결과, 50~1,500kDa에 주로 분포하였으며, 평균분자량은 350kDa이었다.

3. 시술 방법

먼저 초음파 검사로 대상자의 회전근개 부분파열이 있는 부위를 확인한다. 힘줄 손상 크기는 초음파로 손상부위의 크기를 측정하여 결정한다. 손상된 부위를 타원형 구라고 가정하고 병변 내 투여된 물질이 주변 조직으로 일부 새어나갈 것을 고려하여 추정된 부피의 150%에 해당하는 용량의 DNA 단편 혼합물을 함유하는 치료용 조성물을 초음파 유도하에 힘줄 주위에 주사하였고, 이때 상기 DNA 단편 혼합물을 함유하는 치료용 조성물은, DNA 단편 혼합물을 생리식염수에 녹여 1.875mg/ml의 농도로 제조한 것을 사용하였다.

4. 평가 분석

각각의 환자에 대하여 치료 부위에 2주 간격으로 3번, 즉, 0, 2, 4주째 주사하여 6주 후에 1차 follow up을 시행하고, 3개월 후 2차 follow up을 시행한다. 환자의 방문 횟수는 총 5번이 된다. 환자의 주관적인 통증 정도에 대해서는 Shoulder pain by VAS(activity VAS) 를 이용하였으며, 초음파 검사를 사용하였다.

5. 통계적 분석

실험군의 전후 치료 효과를 비교하기 위하여 Mann-Whitney U 를 사용하였다. Mann-Whitney U는 서로 다른 두 집단 차이를 분석하는 가장 일반적인 방법이다.

6. 병용 요법의 유무

다른 물리적 양식(physical modality) 및 운동적 치료(exercise therapy)에는 제한을 두지 않는다. 약물 중 NSAIDs, 스테로이드 등의 사용은 주사 후 3개월 동안은 제한한다. 또한 같은 기간 동안 병소에 대한 주사치료 등의 국소적인 치료는 시행하지 않는다.

7. 실험 결과

(1) 활동시 통증 변화

회전근개 파열환자의 시술 후 동통 및 기능의 평가를 위해 사용된 평가 방법에서 수술 후 시간의 경과에 따라 유의하게 동통 및 기능의 호전이 있었다. 우선, 통증의 변화 확인을 위한 VAS(Visual Analogue Scale, 시각적통증척도) 평가에서 상지를 사용하는 동작에서도 유발되는 활동시 통증은 처음 5.6250/10→6주 후 5.1429/10→ 3개월 후 3.5714/10으로 유의하게 감소한 결과를 보인다(표 1 및 도 1 참조). 상기 VAS는 통증이 없을 때를 0, 통증이 가장 심할 때를 10으로 해서 치료 전, 후의 통증 변화를 비교하는 측정법이다.

활동시 통증(VAS) 변화
활동시	평균
Initial (시술전)	5.6250
6주 후	5.1429
3개월 후	3.5714

(2) 초음파 검사

초음파 검사를 통해 일부 환자의 회전근개 파열 부위의 변화를 확인한 결과, 12주가 지난 후 둘레 0.22cm/깊이 0.12cm의 힘줄 파열 병변은 모두 완치되었고(도 2(a) 참조), 둘레 0.44cm/ 깊이 0.20cm의 힘줄 파열 병변은 12주가 지난 후 둘레 0.20cm/ 깊이 0.19cm로 축소(도 2(b))되었다는 점에 의해 회전근개 파열의 치료에 있어서, DNA 단편 혼합물이 파열된 조직을 재생하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

<사용예 1. 약학적 제제예>

1-1. 주사액제의 제조

본 발명의 DNA 단편 혼합물 0.2g을 pH 7.0의 생리식염수(saline) 용액에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 121℃에서 20분간 가열하여 멸균시켰다.

Claims (4)

1. 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 함유하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 어류는 연어과의 어류인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물의 분자량은 40~2000kDa인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 어류의 정액 또는 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물의 분자량은 50~1500kDa인 것을 특징으로 하는 회전근개 파열의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   

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